Universidad Industrial de Santander

Escuela de Química
Laboratorio de Bioquímica, código 24726
¿Por qué nuestra saliva ayuda a degradar tan bien los alimentos? ¿Qué
factores influyen en esto?
Laura Andrea Cuspoca Martínez, 2152510.
Cristian Danilo Vargas , 2161799
5 Fecha de la elaboración de la práctica: 2020-02-07.

Fecha de presentación del informe: 2020-03-23

Resumen
En la saliva existe una enzima denominada alfa amilasa (α-amilasa), la que se encarga de desdoblar o
romper al almidón y a otros polisacáridos ingeridos en la dieta. El objetivo general de esta práctica fue
comprender como y que factores influyen en el funcionamiento de la enzima mencionada, así mismo
10 evaluar la dependencia de la actividad catalítica con respecto a factores influyentes como la temperatura

y la concentración tanto de la enzima como del sustrato; Se pudo observar que la actividad catalítica de
la enzima depende proporcionalmente de su concentración en el medio y de la cantidad de sustrato, de
igual madera que la velocidad de reacción aumenta desde los 37°C hasta los 90°C.

15

1. Introducción El nombre químico de la AASH es α-1,4-D-glucano

Las enzimas han sido ampliamente utilizadas en la hidrolisis
industrial del almidón. Los productos comerciales de la
hidrolisis de la enzima alfa-amilasa comprenden dextrinas
de varias longitudes de cadena de glucosa. Este grupo de
20 enzimas presentan estructuras en forma de barril; se
caracterizan por presentar afinidad hacia los enlaces alfa-
glucosídicos; y presentan los aminoácidos acido glutámico
(230) y acido aspártico (206), es su centro activo 1.
glucanohidrolasa y en su clasificación numérica para las
enzimas le corresponde el código EC 3.2.1.1, lo que la
35 clasifica dentro del grupo de las enzimas como una
hidrolasa. Es monomérica y es una proteína unidora de
calcio con una simple cadena polipeptídica de 496
aminoácidos. Consiste de tres dominios: el dominio A,
formado por los residuos 1-99 y 170-404; el dominio B,
40 formado por los residuos 100-169, y el dominio C, formado
por los residuos 405-496 ( Figura 1)2 .

25 La alfa-amilasa actúa sobre los enlaces glicosídicos α(1,4),

pero la hidrólisis completa requiere de una enzima que actúe
45 además sobre los productos ramificados. La amilasa salival

resulta inactivada en el estómago por el ácido gástrico. En

el jugo gástrico a pH 3,3 la ptialina resulta totalmente
inactivada en 20 minutos a 37ºC. En contraste, luego de 150
minutos en jugo gástrico a pH 4,3, aún se retiene el 50% de
3
50 la actividad amilasa .

Condiciones óptimas para la alfa- amilasa

55
Figura 1. Representación esquemática de la estructura 3D
de la alfa-amilasa; el domino A se muestra de color verde;
Los dominios B y C, se muestran de color azul y amarillo,
30 respectivamente.
pH óptimo: 5.5 a 8.0
Temperatura óptima: 37ºC
En general la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente aumenta con la temperatura, dentro de
unos límites, porque el incremento en la energía cinética de
| 1
 las moléculas de la enzima y del sustrato, conduce a una
mayor frecuencia en las colisiones, facilitando la unión
correcta al sustrato. Sin embargo, se llega a un punto en el
que el aumento de la temperatura es contraproducente,
5 porque la molécula enzimática comienza a desnaturalizarse.
Los puentes de hidrógeno se rompen, las interacciones
hidrófobas cambian, y la integridad estructural del sitio
activo se interrumpe, causando la pérdida de la actividad. El
10 rango de la temperatura por encima del cual una enzima se
desnaturaliza varía mucho de una enzima a otra y de un
organismo a otro. En la Figura 2 se compara la dependencia
de la temperatura de una enzima típica del cuerpo humano,
con una enzima típica de una bacteria termófila4.
15
Figura 2. Efecto de la temperatura en la velocidad de una
reacción catalizada enzimáticamente.
. La velocidad de reacción de una enzima humana es
20 máxima alrededor de los 37 °C, que es la temperatura
corporal normal. A partir de ahí el descenso brusco en su
actividad refleja la progresiva desnaturalización de las
moléculas enzimáticas.
25 Las enzimas también son sensibles al pH. Muchas sólo son
activas dentro de un rango de pH de 3-4 unidades. Esta
dependencia del pH se debe, normalmente, a la presencia de
uno o más aminoácidos cargados en el sitio activo o en el
propio sustrato. La actividad depende de cómo estén estos
30 grupos, cargados o sin carga.
Figura 3. El efecto del pH en la velocidad de una reacción
catalizada enzimáticamente.
35
This journal is © The Royal Society of Chemistry [year]
La dependencia de pH de una enzima normalmente refleja
el medio ambiente en el cual la enzima está activa. La Figura
3 muestra la dependencia de pH de dos enzimas que
degradan proteínas, encontradas en el tracto digestivo
40 humano.
El mecanismo catalítico establecido para la familia α-
amilasa incluye dos tipos de reacciones SN2; los
aminoácidos que intervienen en la catálisis son Glu 230 que
45 actúa como donador de protónes seguido de un ataque
nucleofílico por el Asp 2065.
Figura 4. Mecanismo catalítico perteneciente a la enzima
alfa-amilasa.
50 La alfa- amilasa tiene múltiples funciones biológicas: como
enzima cumple un papel importante en la digestión inicial
de almidón, el glucógeno y otros polisacáridos, porque
cataliza la hidrólisis de los enlaces α-1,4-glucosídicos, lo
cual resulta en la configuración α-anómerica de los
55 oligosacáridos. Al ser la proteína de mayor abundancia en la
saliva, hace parte de la película adquirida y de la placa
dentobacteriana; adicionalmente, se une con alta afinidad a
un selecto grupo de estreptococos orales. Se ha encontrado
que su concentración se eleva, lo cual refleja un aumento en
60 la actividad del sistema nervioso simpático, por lo cual se
ha propuesto como un biomarcador sensible a cambios en el
organismo humano que están relacionados con el estrés6.
2. Metodología
Para esta práctica primeramente se hizo la preparación de la
alfa- amilasa salival (solución enzimática), esto se hizo
colectando saliva en una probeta utilizando un embudo con
algodón como filtro, se recogieron aproximadamente 10 ml
y se mantuvo primeramente a 37°C
Seguidamente se preparó la curva de calibración, esta se
realizó adicionando a 7 tubos de ensayo los volúmenes de
solución de almidón al 0,5%, NaCl al 0,9% y H2O
obteniendo así las concentraciones de almidón indicadas en
la guía de laboratorio.
Journal Name, [year], [vol], 00–00 | 2
 La grafica N°1, muestra los valores de absorbancia vs [S]
correspondientes a la curva de calibración.
5 - Variación en la concentración de la enzima

En la tabla 3, se muestran seis soluciones que contienen

diferentes concentraciones de la enzima alfa-amilasa, y sus
respectivos valores de absorbancia.
Tubo mL SustratomL Alfa-amilasa mL Agua [Enzima] Absorbancia
1 3,5 1,2 0,3 24% 0,11
2 3,5 0,6 0,9 12% 0,232
Tabla 1. Curva de calibración para evaluar el efecto de la 3 3,5 0,3 1,2 6% 0,454
concentración de la enzima sobre la actividad de la alfa 4 3,5 0,2 1,3 4% 0,822
amilasa. 5 3,5 0,1 1,4 2% 0,977
6 3,5 0 1,5 0% 0,979
A cada uno de los tubos se les adicionó 20 µL de lugol y Tabla 3. Datos correspondientes a la variación de la
determinó la absorbancia a 580nm concentración de la enzima alfa-amilasa.

La concentración de sustrato utilizada primeramente para En la gráfica N°2, se muestran los valores de absorbancia vs
realizar la evaluación de la actividad enzimática 10 concentración de la enzima (tabla 3).
dependiente de la concentración de la enzima fe de 0,1% la
recomendada por la guía de laboratorio, y se prepararon los
tubos para la evaluación de acuerdo a la tabla presentada a
continuación.

Tabla 2. Evaluación de la concentración de la enzima

A estos tubos se les adiciono 20µL de lugol y se determinó Grafica N°2. Valores de absorbancia vs concentración de
la absorbancia a 580nm enzima (tabla 3)
Los resultados obtenidos en este primer ensayo ni fueron
concluyentes por lo que se varió la concentración del
sustrato, - Variación en la concentración de sustrato
Así mismo se hicieron cambien en el tiempo de contacto de 15 En la tabla 4, se muestran seis soluciones que contienen
la enzima con el almidón y por último se hicieron los diferentes concentraciones de sustrato (almidón), y sus
ensayos para evaluar el efecto de la concentración de respectivos valores de absorbancia.
sustrato y la temperatura en la actividad enzimática de la alfa
amilasa, analizados a continuación.
Tubos mL Sustrato mL Alfa-Amilasa mL Agua [Sustrato] Absorbancia
1 3,75 0,3 0,95 0,15 0,862
3. Resultados
2 2,5 0,3 2,2 0,1 0,488
3 1,25 0,3 3,45 0,05 0,169
4 0,75 0,3 3,95 0,03 0,07
5 0,5 0,3 4,2 0,02 0,053
6 0,25 0,3 4,45 0,01 XXXX
7 0 0,3 4,75 0 XXXX

Tabla 4. Datos correspondientes a la variación de la

20 concentración del sustrato

En la gráfica N°3, se muestran los valores de absorbancia

vs concentración de sustrato (tabla 4).
Grafica N°1. Absorbancia vs [S] correspondiente a la
curva de calibración.

This journal is © The Royal Society of Chemistry [year] Journal Name, [year], [vol], 00–00 | 3

Grafica N°3. Valores de absorbancia vs concentración de
sustrato (tabla 4).
- Variación en la temperatura de contacto
5 En la tabla 5, se muestran los datos de variación de la
temperatura para una concentración de enzima y sustrato
definida; y sus respectivos valores de absorbancia.
Temperatura (°C) Absorbancia
0 0,992
10
27 0,975
37 0,509
50 0,16
60 0,04
15
Tabla 5. Valores de temperatura y absorbancia para una
concentración de enzima y sustrato definida.
Grafica N°4. Valores de absorbancia vs temperatura para
una concentración de enzima y sustrato definida.
4. Análisis de resultados
20 - Variación en la concentración de la enzima
En la primera etapa de la práctica, se tomaron seis
soluciones de diferente composición; estas contenían una
concentración fija de sustrato (0.21% [v/v]) y una variación
en la concentración de la enzima alfa-amilasa (tabla 3).
25 Luego de esto, se determinaron los valores de absorbancia
para cada una de las seis soluciones, utilizando el método
del lugol. El valor de absorbancia que presentó un mejor
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acoplamiento frente a la curva de calibración (grafica N°1),
fue de 0.454; este pertenece a una concentración de enzima
30 del 6% [v/v]. Al reemplazar el valor de la absorbancia en la
ecuación perteneciente a la gráfica N°1, se obtiene lo
siguiente:
0.454−0.3044
= 0.019% ec1
7.7537
Se obtuvo una concentración de sustrato del 0.019% [v/v],
lo que indica que la mayoría de sustrato fue hidrolizado
por la enzima alfa-amilasa; inicialmente presentaba una
concentración del 0.21%. La grafica N°2, muestra que la
actividad enzimática es directamente proporcional a la
concentración de la enzima alfa-amilasa.
35 - Variación en la concentración de sustrato
En la segunda etapa de la práctica, se realizaron siete
soluciones diferentes; estas contenían una concentración
constante de enzima (Ec.1) y una variación en la
concentración de sustrato (tabla 4). Luego de esto, se
40 determinaron los valores de absorbancia para cada una de
las siete soluciones, utilizando el método del lugol. El valor
de absorbancia que presentó un mejor acoplamiento frente a
la curva de calibración (grafica N°1), fue de 0.488; esta
pertenece a una concentración de 0.1 % (sustrato). Al
45 reemplazar el valor de la absorbancia en la ecuación
perteneciente a la gráfica N°1, se obtiene lo siguiente:
0.488−0.3044
= 0.02% ec2.
7.7537
Se obtuvo una concentración de sustrato del 0.02% [v/v], lo
que indica que las cuatro quintas partes del sustrato se
50 hidrolizaron por la acción de la enzima. La grafica N°3,
permite concluir que la actividad enzimática se ve afectada
por la presencia de una gran cantidad de sustrato, debido a
la saturación de los sitios activos de las enzimas presentes
en la reacción (alfa-amilasa).
55
- Efecto de la temperatura
Se tomaron cinco soluciones de igual composición tanto de
sustrato (0.1%) como de enzima (6%), a las cuales se les
60 realizó una variación en la temperatura de contacto. Luego
de esto, se determinaron los valores de absorbancia para
cada una de las cinco soluciones, utilizando el método del
lugol. El valor de absorbancia que presentó un mejor
acoplamiento frente a la curva de calibración (grafica N°1),
65 fue de 0.509; esta pertenece a una temperatura de 37°C. La
grafica N°4, permite concluir que la temperatura optima de
la enzima se encuentra en un rango de 37 °C-60°C; esto
concuerda con los datos reportados en la literatura (37°C-
80°C).
70
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 5. Conclusiones
 Se determinó que la actividad catalítica de la
enzima alfa-amilasa depende proporcionalmente
de la concentración de esta presente en el medio
5 (grafica N°2). Por otro lado, se observó que la
actividad enzimática se ve afectada en presencia de
una cantidad elevada de sustrato, debido a la
saturación de los sitios activos presentes en las
mismas (grafica N°3).
10  El efecto de la temperatura sobre la actividad
enzimática (grafica N°4), permite concluir que la
velocidad de reacción de la enzima aumenta desde
los 37°C hasta los 90°C; esta última, corresponde
a la temperatura de desnaturalización de la enzima.

6. Bibliografía
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general. Univ Odontol. 2013 Jul-Dic 32(69): 93-
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3 Fried, M, Abramson, S, Meyer, JH. Passage of
20 salivary amylase through the stomach in humans.
Digestive Diseases and Sciences 32:1097-1103
(1987).
4 Becker, W., Kleinsmith, L. and Hardin, J., 2007. El
Mundo De La Célula (6A. Ed.). Distrito Federal:
25 Pearson Educación.

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