INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Informe de práctica.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.
MÉTODO DE KUNITZ

5QV2

Sección 1

MUÑOZ DOMÍNGUEZ BRENDA MILENIE

CICLO ESCOLAR ENERO- JUNIO 2019

RESULTADOS.
TABLA 1. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA TRIPSINA Y ESPECÍFICA PARA
LA DIGESTIÓN DE CASEÍNA POR TRIPSINA
A280
[ ] Tripsina Unidades
Tubo Problem A280 corregida
(mg) Testigo Trípticas
a
T1 Y 1 0.04 0.492 0.025 0.467 0.5076
T2 Y 2 0.08 0.432 0.089 0.393 1.0152
T3 Y 3 0.12 0.599 0.097 0.581 1.5228
T4 Y 4 0.16 0.680 0.096 0.658 2.0304
T5 Y 5 0.20 0.664 0.019 0.650 2.5380
PROBLEMAS
TI Y I Bromelaína 1:10 1.014 0.146 0.868
TII Y II Bromelaína 1:20 0.722 0.084 0.638
TIII Y III Papaína 1:2 0.888 0.329 0.559
TIV y
Papaína 1:4 0.388 0.122 0.266
IV
Muestra las absorbancias obtenidas por un espectrofotómetro a 280 nm a diferentes
concentraciones de la enzima tripsina y a diferentes diluciones de bromelaína y papaína,
éstas dos últimas enzimas a partir de muestras crudas. Las unidades trípticas de la
tripsina se calcularon con la ecuación modelo de la figura 1. Y las UT de las otras enzimas
a partir de una interpolación de la figura 2 tomando en cuenta sólo una dilución.

Ecuación de la recta
y=¿1.5775x + 0.3605
Donde:m=1.5775 x

MATRIZ DE CÁLCULO
Pendiente de larecta 1.5775
[ Unidades Tripticas ] caseína
mg = = =0.0788
Minutos de digestión 20

Si existen 0.0788 UT en 1 mg:

Determinar UT en 0.04 mg
0.0788UT 0.04 mg
1 mg x| |
=0.5076 UT
 0.7
f(x) = 0.06 x + 0.3
0.6 R² = 0.74

0.5

Absorbancia a 280 nm 0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
[ ] Tripsina (mg)

FIGURA 1. CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

0.7
f(x) = 0.06 x + 0.3
0.6 R² = 0.74

0.5
Absorbancia a 280 nm

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7
Unidades Trípticas (UT)

FIGURA 2. CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ESPECÍFICA. Representa

una tendencia lineal por la actividad enzimática
ECUACIÓN DE MODELO. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA TRIPSINA POR UNIDADES TRIPTICAS
y=0.1243x+0.3605

MATRIZ DE CÁLCULO.
Volumen de extractos=28ml
Peso de frutas=25g
Concentración del extracto:
25 g−28 ml x
0.8928 g=x −1ml
Interpolación para determinar la actividad proteolítica específica de las muestra problema
y −0.3605
∴ x=
20
Cálculo de UT bromelaína:
0.475−0.03592
x= =0.021954 UT
20
UT∗Factor de dilución=0.021954∗20
¿ 0.439080 UT
0.439080 UT −1.0 g/ml
0.392010 UT de bromelaína=x−0.8928 g /ml
Cálculo de UT papaína:
0.085−0.03592
x= =0.002454 UT de papaína
20
UT ∗Factor de dilución=0.021954∗4
¿ 0.009816 UT

0.009816 UT −1.0 g /ml

0.008763 UT de bromelaína=x−0.8928 g /ml
DISCUSIÓN
Las tres enzimas que estudiamos en la práctica tienen la capacidad de absorber
una longitud de onda de 280 nm a partir de las cuales al adecuarse las
condiciones para su actividad enzimática hidrolizaron la caseína, ya que contienen
aminoácidos con anillos aromáticos como lo son el triptófano, la tirosina y
fenilalanina.
Las diferencias resultan que la tripsina hidroliza los enlaces peptídicos que
posteriormente forma oligopéptidos, pero únicamente en el interior del polipéptido,
siendo así una endopeptidasa de 224 residuos, con una afinidad por los enlaces
anteriores a los aminoácidos de arginina y lisina, por lo que le da especificidad a la
actividad de la enzima.
La papaína es una enzima capaz de hidrolizar no sólo proteínas, sino también
ésteres y amidas que se encuentran en aminoácidos, constituida por 212
aminoácidos. Es la enzima más usada frecuentemente en la industria, desde una
textil hasta farmacéutica, así como cosmética, por su estabilidad bajo condiciones
de temperatura no favorables, así como de la humedad y de presión, también por
las considerables concentraciones que se logran extraer de la papaya. Su sitio
activo puede presentarse por los compuestos tiólicos y agentes reductores
PREGUNTAS ADICIONALES
1. Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica.
Se identifica como la velocidad de reacción en una cantidad de proteína
2. Escriba la clasificación de las proteasas en función de su mecanismo
de acción y diga en qué grupo se ubican las determinadas en la
práctica.
3. ¿Para qué se adiciona cisteína en las muestras de piña y papaya?
4. ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS