EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGÍONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA

BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006

EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

TRABAJO DE GRADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE

MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIA

JOSE SALVADOR MONTAÑA DIRECTOR

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006

 NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
 EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

APROBADO

_______________________________ ______________________________
José Salvador Montaña MSc Clara Patricia Peña MSc.
Director Co-Director Instituto SINCHI

_______________________________
Gladys Ines Cardona MSc.
Asesor Instituto SINCHI

______________________________ ______________________________
Adriana Arcos Ingeniero Agronomo MSc Maria Ximena Rodríguez PhD
Jurado 1 Jurado 2

Bogota D.C. Diciembre 2006

 EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A
YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGÍONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

APROBADO

----------------------------------------- -----------------------------------------
Angela Umaña MPhil, David Gómez MSc.
Decana Académico Director de Carrera
 DEDICATORIA

Dedicada a mis padres por su amor incondicional, constante esfuerzo y dedicación durante todos
estos años.
 AGRADECIMIENTOS

A mis directores de tesis José, Gladys y Clarita por su cordinación, dirección, apoyo y por
compartir sus invaluables conocimientos conmigo.

Al Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas – SINCHI por haber permitido el desarrollo

del presente trabajo de investigación.

A las comunidades Indígenas del Sur del Trapecio Amazónico y a los propietarios de los arreglos
agroforestales del municipio de San José de Guaviare por permitir el muestreo.

A todo el personal vinculado con el laboratorio de Biotecnología del Instituto Sinchi por compartir
recursos y conocimientos.

A la Dra. María Mercedes Zambrano, Directora Científica de Corpogen por su asesoría científica.

A los eminentes científicos Dirk Redecker y Francisco de Souza por su interés, asesoría científica,
y por compartir su experiencia e información.

A Adriana Arcos por facilitarme documentación relacionada con esta investigación.

A mis hermanos Pacho, David y Lucha, y a mi Abuelita por su compañía y su apoyo durante todo
este proceso.

A mi prima Paula por su colaboración e interés.

A mi Danny por estar siempre conmigo apoyándome en todo y por su valiosa colaboración y
compañía en la realización de este proyecto.

A Fiona, Figo, Ramona y Galileo por estar siempre ahí.

 TABLA DE CONTENIDO

37 Introducción.................................................................................................................... 3
38 Marco Teórico y revisión de literatura............................................................................8
38.1 Micorrizas................................................................................................................ 8
38.2 Importancia de las micorrizas................................................................................ 11
38.3 Clasificación de HMA........................................................................................... 12
38.4 Ciclo de vida de HMA .......................................................................................... 14
38.5 Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en sistemas suelo/planta15
38.5.1 Germinación de las esporas............................................................................ 16
38.5.2 Colonización................................................................................................... 18
38.6 Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales..................................................... 19
38.7 Planta hospedera y producción de esporas ............................................................21
38.7.1 Manihoto esculenta (YUCA) y su relación con los HMA.............................. 24
38.8 Aproximaciones moleculares al estudio de HMA................................................. 25
38.8.1 Detección de HMA en raíces ........................................................................ 27
38.8.2 Espaciadores internos de trascripción (ITS)................................................... 28
38.9 Métodos de estudio de diversidad de HMA........................................................... 30
38.9.1 Métodos de cultivo de raíces y órganos de micorriza..................................... 30
38.9.2 Análisis moleculares del genoma fungal........................................................ 32
38.10 Área de Estudio.................................................................................................... 35
38.10.1 Sur del Trapecio Amazónico........................................................................ 35
38.10.2 San José del Guaviare La región Colombiana............................................. 40
38.10.4 La región amazónica de Colombia, comprende las cuencas de los ríos que tributan al
Amazonas y de algunos que lo hacen al Alto Orinoco. Limita al norte con el río Guaviare y
hacia el occidente no sobrepasa la cota de los 500 m. en la vertiente de la Cordillera Oriental
(Herrera, 1989). ......................................................................................................... 40
38.10.5 La Amazonía colombiana comparte con la cuenca hidrográfica del río Amazonas
ciertos rasgos de clima y morfología. El 70% de esta inmensa región, está cubierta de bosques
tropicales húmedos tipo hylea, para cuyo desarrollo se requiere de una temperatura media
superior a los 22ºC y una precipitación anual superior a los 2.000 mm., con lluvias constantes,
repartidas a lo largo del año y un período seco, corto y marcado (Herrera, 1989). .. 40
38.10.6 En Colombia se encuentran algunas de las áreas con mayor precipitación de la cuenca
amazónica: en los altos ríos Putumayo, Caquetá, Napo, en la región fronteriza con Venezuela y
Brasil, en el Guainía y Vaupés esta alcanza los 3.500 - 4.500 mm anuales. Estas áreas habrían
conservado la vegetación selvática durante varios períodos largos en el pleistoceno y holoceno
cuando, al bajar la temperatura y disminuir la pluviosidad por efectos de episodios glaciales,
grandes extensiones de bosque fueron transformados en sabanas. En estas áreas con mayor
pluviosidad se habrían refugiado especies de animales y de flora de adaptación selvática. El
aislamiento prolongado de estos refugios, habría permitido que sus habitantes evolucionaran en
formas distintas. Se explicaría así la amplia variación de especies de la Amazonía, donde no
hay barreras geográficas que la justifiquen. Esta hipótesis se podría aplicar, durante los últimos
episodios secos, a poblaciones humanas, para explicar la gran variación lingüística y la
distribución de algunas características culturales dentro del área; sin embargo no ha sido puesta
a prueba todavía por los arqueólogos (Herrera, 1989)............................................... 40
38.10.7 Morfológicamente la planicie amazónica es una inmensa región sedimentaria. Los
sedimentos más antiguos, depositados durante el terciario, en un mar o lago salobre, sufrieron
posteriormente procesos erosivos, de manera que el relieve es de lomeríos. Intercaladas en este
paisaje hay elevaciones mayores, superficies aún más antiguas, reductos de formaciones
montañosas del precámbrico, que forman mesetas y colinas rocosas y son parte del Escudo de
las Guayanas. También sobresale en el relieve la región de pie de monte andino, formada por
terrazas, serranías y terrenos levemente ondulados que se alinean en un cinturón al pie de la
 Cordillera Oriental. Los materiales que la constituyen provienen en su mayor parte de erosión
y lavado de la cordillera, por lo tanto, allí pueden encontrarse los mejores suelos (Herrera,
1989).......................................................................................................................... 40
38.10.8 Las superficies más recientes están formadas por los sedimentos fluviales, que forman
auténticas planicies a lo largo de los ríos más caudalosos. Se pueden distinguir en ellas tres
niveles: terrazas antiguas del plioceno-pleistoceno , que hoy se encuentran sobre el nivel actual
de los ríos, y las llanuras aluviales de inundación (várzea), con dos niveles, el más alto de los
cuales se inunda cada 5 ó 10 años cuando vienen las grandes crecientes ("conejeras") y el más
bajo, lo hace en un lapso corto de tiempo todos los años, y recibe periódicamente sedimentos
rejuvenecedores, óptimos para la agricultura (Herrera, 1989)................................... 41
38.10.9 Los ríos que forman llanuras de inundación extensas, son frecuentemente, aquellos que
nacen en las vertientes orientales de los Andes. Desde allí, arrastran sedimentos en suspensión
que les dan una apariencia barrosa; de ahí su apelativo de "ríos de aguas blancas". Los
sedimentos que cargan, propician el desarrollo de vida orgánica numerosa y variada. Otros ríos
nacen dentro del Escudo de las Guayanas o en las superficies de denudación, atraviesan suelos
empobrecidos y sus aguas cristalinas o ambarinas adquieren en gran volumen, una coloración
oscura, debida a la presencia de minúsculas porciones de ácidos húmicos; de ahí su apelativo
de "ríos de aguas negras" (Herrera, 1989).Estos se caracterizan por su extrema acidez, pobreza
de nutrientes y escasez de la fauna acuática (Herrera, 1989). ................................. 41
38.10.10 Considerados en general los suelos de la Amazonía son pobres, tanto en materia
orgánica como en minerales. Aún los del pie de monte y las vegas inundables son inferiores a
los suelos andinos fértiles. Los nutrientes para la frondosa vegetación, no se encuentran en el
delgado suelo, sino en la capa de hojarasca y detritus que lo cubre, de donde las plantas los
obtienen directamente a través de raíces "alimentadoras" y hongos micorriza (Herrera, 1989).
....................................................................................................................................41
38.10.11 Con respecto a los solidos en suspensión que transportan los rios Cotuhe, Putumayo y
Amazonas, la mayor parte esta representada por arcillas, limos y arenas finas, ademas de
algunas fracciones de plancton procedente de los lagos de sus llanuras de inundación. 41
38.10.12 Por su parte, el rio amazonas supera ampliamente el Putumayo en el transporte de
solidos en suspensión y alcanza una concentración de 116 mg/l. En contraste, los afluentes del
amazonas encontrados en la orilla colombiana presenta una concentración promedio de solidos
disueltos de 29 mg/l que corresponde a 4 veces menos que lo encontrado en el amazonas.
....................................................................................................................................41
38.11 Antecedentes del estudio .....................................................................................44
39 FORMULACIÓN del problema y justificación........................................................... 47
39.1 Formulación del problema..................................................................................... 47
39.2 Justificación........................................................................................................... 47
40 Objetivos....................................................................................................................... 49
40.1 Objetivo General.................................................................................................... 49
40.2 Objetivos Específicos.............................................................................................49
44 Materiales y Métodos.................................................................................................... 50
44.1 Muestreo ............................................................................................................... 50
44.1.1 Muestreo de raíces.......................................................................................... 52
44.1.2 Muestreo de suelo .......................................................................................... 52
44.2 Material Biológico ................................................................................................ 53
44.3 Iniciadores para PCR............................................................................................. 53
44.4 Métodos..................................................................................................................54
44.7.1 Tinción de raíces (Philips & Hayman 1970)..................................................54
44.7.2 Determinación del porcentaje de colonización............................................... 55
44.7.3 Extracción de esporas..................................................................................... 57
44.7.4 Evaluación morfológica de las esporas........................................................... 59
44.8 ExtraccionExtracción de DNA ............................................................................. 59
 44.8.1 Amplificación de la región ITS.......................................................................61
44.8.2 Purificación de los productos PCR................................................................. 63
44.8.3 5.4.5 Clonación............................................................................................... 63
44.8.4 5.4.3 Análisis de restricción de DNA ribosomal (ARDRA)Digestión de los productos
PCR............................................................................................................................ 63
44.8.6 La digestión de los productos de PCR se realizo de acuerdo a lo reportado por Redecker
et al, 1997. utilizando las enzimas de digestión Hinf I y Taq I. La digestión con Hinf I se
realizo a 37ºC durante 1 hora y la digestión con Taq I se realizo a 65ºC por 1 hora. Los
productos de las digestiones fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa
ultrapura al 3% con buffer TAE. Se utilizo dos marcadores de peso molecular (50 pb y 100
pb). ............................................................................................................................ 64
44.8.7 ........................................................................................................................64
44.8.8 5.4.4 Visualización de los productos y lectura de patrones de restricción.... 64
44.8.9 La comparación de los patrones de bandas obtenidas después de la digestión con las
respectivas enzimas (RFLP) se realizará utilizando el software Quantity one de Bio-Rad
....................................................................................................................................65
44.8.10 5.4.6 Secuenciación...................................................................................... 65
45 Resultados .................................................................................................................... 67
45.1 Porcentaje de colonización.................................................................................... 67
45.4 Recuento de esporas............................................................................................... 69
45.5 Análisis Fisicoquímicos......................................................................................... 70
45.6 Análisis morfológico.............................................................................................. 74
45.7 Extracción de DNA ............................................................................................... 79
45.8 Amplificación........................................................................................................ 80
45.11 Clonación............................................................................................................. 83
45.12 Análisis de patrones ARDRA.............................................................................. 86
45.13 Secuenciación ..................................................................................................... 94
46 Discusión de resultados.................................................................................................97
46.1 Porcentaje de colonización de HMA y su relación con recuentos de esporas y el contenido
de fósforo (ppm) en el suelo. ........................................................................................ 97
46.2 Recuento de esporas de HMA .............................................................................100
46.3 Porcentaje de colonización de HMA y su relación con los valores del pH, el contenido de
materia orgánica, acidez intercambiable y % de saturación de Aluminio................... 102
46.4 Evaluación Morfológica de Esporas.................................................................... 104
46.5 Extracción de DNA.............................................................................................. 106
46.6 Amplificaciones con primers generales y género- específicos, clonación y secuenciación
......................................................................................................................................108
47 Conclusiones............................................................................................................... 113
48 RECOMENDACIONES........................................................................................... 114
49 ...................................................................................................................................116
62 Referencias.................................................................................................................. 116
11 Anexos…………………………………………………………………………………..117
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura No 1 Clasificación de los HMA del orden Glomales…………………………………7

Figura No 2 Ciclo de vida de HMA…………………………………………………………...11
Figura No 3 Estructura morfológica de las micorrizas vesiculo arbuscular……………...12
Figura No 4 Chagra del Sur del Trapecio Amazónico……..……………………………....36
Figura No 5 Arreglo Agroforestal de San José del Guaviare……………………………...38
Figura No 6 Área de muestreo Sur del Trapecio Amazónico……………………………...43
Figura No 7 Área de muestreo San José del Guaviare…………………………………....44
Figura No 8 Tipos de muestreos empleados en campo……………………………………45
Figura No 9 Proceso de tinción de raíces……………………………………………………47
Figura No 10 Determinación del porcentaje de colonización……………………….……..48
Figura No 11 Aislamiento de esporas………………………………………………………..49
Figura No 12 Recuento de esporas…………………………………………………………..49
Figura No 13 Representaciones esquemáticas de los genes rRNA con sitios de anillamiento de los
primers……………………………………………………………………52
Figura No 14 Porcentaje de colonización total de HMA en Manihot esculenta en el Sur del
Trapecio Amazónico y San José del Guaviare…………………………………………57
Figura No 15 Porcentaje de colonización de HMA por arbúsculos y vesículas en Manihot
esculenta en el Sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare………………….57
Figura No 16 Recuentos de esporas de HMA en suelos rizosféricos de Manihot esculenta en el
Sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare………………….59
Figura No 17 Relación entre porcentaje de colonización y concentración de fósforo en suelos
rizosféricos de Manihot esculenta en dos regiones de la Amazonía Colombiana……………………
………………………………………………………………..61
Figura No 18 Porcentaje de colonización y su relación con acidez intercambiable y porcentaje de
saturación de aluminio………………………………………………………..62
Figura No 19 Esporas encontradas en suelos rizosféricos de las muestras del sur del Trapecio
Amazónico……………………………………………………………………………65
Figura No 20 Esporas encontradas en suelos rizosféricos de las muestras de San José del
Guaviare…………………………………………………………………………………….65
Figura No 21 Primera y segunda PCR anidada ……………………………………………69
Figura No 22 Clones positivos muestras Sur del Trapecio Amazónico…………………..71
Figura No 23 Clones positivos de los arreglos agroforestales 2, 7,10 y 13 del muestreo de San
José del Guaviare……………………………………………………………………..71
Figura No 24 Clones positivos para GIGA5.8R……………………………………………..72
Figura No 25 Análisis ARDRA CHTR1………………………………………………………73
Figura No 26 Análisis ARDRA CHTR3………………………………………………………73
Figura No 27 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 2……………………………………...74
Figura No 28 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 7……………………………………...74
Figura No 29 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 10…………………………………….75
Figura No 30 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 13……………………………………75
Figura No 31 Análisis ARDRA (GIGA5.8R) Arreglo Agroforestal 7………………………76
Figura No 32 Análisis ARDRA (GIGA 5.8 R) Arreglo Agroforestal 10…..………………..77
Figura No 33 Secuenciación del clon 12 del arreglo agroforestal 13…………………….78
Figura No 34 Secuencia del clon 6 del arreglo agroforestal 10…………………………...78
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla No 1 Características de los lugares de muestreo……..…………………………….44

Tabla No 2 Secuencias de iniciadores……………………………………………………….46
Tabla No 3 Enzimas de restricción usadas en los ensayos de ARDRA de los amplificados de
HMA…………………………………………………………………………..54
Tabla No 4 Porcentaje de colonización de HMA en raíces de Manihot esculenta……...56
Tabla No 5 Recuento de esporas a partir de 100g de suelo rizosférico………………….58
Tabla No 6 Análisis fisicoquímicos de las muestras de suelo rizosférico del Sur del Trapecio
Amazónico y San José del Guaviare……………………………………………...59
Tabla No 7 Características fenotipicas de las esporas encontradas en los suelos rizosféricos de
Manihot esculenta en las muestras del sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare……
……………………………………………………………………64
Tabla No 8 Morfotipos encontrados por muestra…………………………………………...66
Tabla No 9 Datos clonación…………………………………………………………………...70
 RESUMEN

Se caracterizó la población micorrítica asociada a raíces de yuca (Manihot esculenta) colectadas

en 2 regiones de la Amazonía Colombiana (Chagras del Sur del trapecio Amazónico y arreglos
agroforestales (A.AF) en San José de Guaviare). Se evaluaron diferentes variables como fueron:
porcentaje de colonización, recuento de esporas, identificación taxonómica por características
macro y microscópicas, características fisicoquímicas del suelo y caracterización molecular.
Respecto al porcentaje de colonización se observó que en todas las muestras analizadas se
encontró colonización por MA evidenciándose un valor mayor en las muestras colectadas en San
José de Guaviare. De igual forma el número de esporas por gramo de suelo fue mayor en estas
muestras con respecto a las colectadas en chagras del sur del trapecio amazónico. Los
recuentosmásbajos se encontraron en las rizósferas de yuca colectadas en chagras bajo el
paisaje de llanura aluvial en el sur del trapecio amazónico.

En la identificación taxonómica se encontraron 12 morfotipos en las muestras del sur del trapecio
amazónico y 10 morfotipos en las muestras de San José de Guaviare. Hubo predominancia de
especies del género Glomus, y en menor porcentaje especies de los géneros Acaulospora y
Gigaspora.

Para la caracterización molecular, se extrajo DNA a partir de raíces de yuca colonizadas por
diferentes géneros de hongos MA. A partir de este se realizó una PCR general utilizando primers
universales (ITS4-NS5), obteniéndose un fragmento de aproximadamente 1200 pb. Del producto
obtenido de la PCR general se realizaron PCRs anidadas con primers género específicos (GLOM
5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660, ARCH 1311, LETC 1670), reportados por (Redecker et al, (2000)
para la identificación molecular de hongos MA.

En las muestras evaluadas se observó solamente amplificación con los primers GIGA 5.8 R y
GLOM 5.8 R, específicos para amplificar secuencias de Glomus y Gigaspora respectivamente.
Dos de las seis muestras colectadas en chagras del sur del trapecio amazónico (CHTR1 y
CHTR3) amplificaron con el primer GLOM 5.8 R, evidenciándose un fragmento de
aproximadamente 200 pb, sin embargo no se observó amplificación en ninguna de las muestras
con el primer GIGA 5.8 R. De las muestras colectadas en A.AF en San José de Guaviare, 4 de las
6 amplificaron con el primer específico GLOM 5.8 R (Arreglos agroforestales 2, 7, 10 y 13)
obteniendo un fragmento de aproximadamente 200 pb y 2 con el primer específico para Gigaspora
GIGA 5.8 R (A.AF 7 y 10), obteniéndose un fragmento de aproximadamente 300 pb.

Los productos PCR con el fragmento de interés fueron clonados dentro del vector TOPO pCR2.1
de Invitrogen y transformados en células de E. coli DH5-α químicamente competentes. De cada
muestra evaluada se obtuvo un promedio entre 3 y 17 clones con el inserto de interés, 10 clones
para las muestras del sur del trapecio amazónico y 68 clones para las de San José de guaviare.
De cada clon se extrajo el DNA plasmídico, se purificó y se realizaron los análisis de ARDRA
con las enzimas de restricción Hinf I y Taq I de Invitrogen. Se construyó una matriz de presencia y
ausencia con los resultados de las 2 enzimas, agrupando los clones según su semejanza genética
por medio del coeficiente de Dice y el método de agrupamiento de UPGMA.

En las muestras del sur del trapecio amazónico se encontró en general una alta similaridad entre
los clones evaluados, a diferencia de lo encontrado en las muestras de San José de Guaviare,
donde los clones fueronmásdisímiles, encontrándose con esto una mayor diversidad. De acuerdo
a estos agrupamientos se escogieron los clones para la secuenciación. Hasta la fecha solamente
se tienen datos de 2 secuencias. La primera corresponde al clon número 3 del A.AF 10, el cuál
reportó un 94% de similitud en el alineamiento con el clon Giga 3538.1 aislado de raíces de Inga
parteno en Costa Rica. La otra secuencia corresponde al clon 12 del A.AF 13 la cual fue alineada
con el clon de Glomus Pa106 con una similitud del 92%, clon aislado de raíces colonizadas por
HMA de Prunus africana.

El mayor porcentaje de colonización y diversidad de hongos MA en las muestras colectadas en

A.AF en San José de Guaviare se relacionó con: niveles bajos de fósforo (0.61-5.51 ppm),
porcentaje de carbono orgánico con niveles medios y bajos (1.14 – 2.62 %) y valores de pH
extremadamente ácidos (4.05-5.0). Igualmente se observó que la cobertura de los A.AF
proporciona mayor oferta de recursos y por lo tanto mejores beneficios para el establecimiento de
esta simbiosis.
 ABSTRACT

A mycorrhizal population associated to yucca roots was characterized. There were collected in 2
regions of the Colombian Amazon (chagras from the South of the Amazonic trapezium and
agroforestal arrangements AF.A in San José del Guaviare). There were evaluated different
variables which were: colonization percentage, spores recount, taxonomic identification by
macroscopic and microscopic characteristics as well, physicochemical characteristics of the soil,
and molecular characterization. In reference to the colonization percentage, in all the samples
analyzed it was found that AMF colonization showed a greater value in the sample collected in San
José del Guaviare. Also, the number of spores per gram of soil was bigger in these samples than
in the samples collected in the chagras of the South of the Amazonic trapezium. The lowest spore
recounts were found in the yucca rhizospheres collected in chagras under the landscape of llanura
aluvial in the South of the Amazonic trapezium.

In the taxonomic identification there were found 12 morphotypes in the samples collected from the
South of the Amazonic trapezium and 10 morphotypes in the samples collected in San José del
Guaviare. Species of the genera Glomus were the ones which prevailed although there were also
found species from Acaulospora and Gigaspora in a lower percentage.

For the molecular characterization, DNA was extracted from yucca roots colonized by different
genera of AMF. With this DNA a general PCR was performed using ITS4-NS5 universal primers
obtaining a fragment of ca. 1200bp. From the product obtained from the general PCR there were
performed nested PCRs with genera-specific primers (GLOM 5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660,
ARCH 1311, LETC 1670) reported by (Redecker et al., 2000) for the molecular identification of
AMF.

In the samples evaluated there was only observed amplification with the specific primers GIGA 5.8
R and GLOM 5.8 R to amplify Glomus and Gigaspora sequences respectively. 2 of the 6 samples
collected in chagras of the South of the Amazonic trapezium (CHTR1 and CHTR3) amplified with
the GLOM 5.8 R primer showing a fragment of ca. 200bp. However it was not observed any
amplification in none of the samples tested with the GIGA 5.8 R primer. From the samples
collected from AF.A in San José del Guaviare, 4 of the 6 samples amplified with the GLOM 5.8 R
primer (AF.A 2, 7, 10, and 13) obtaining a fragment of ca. 200bp and 2 with the Gigaspora-specific
primer GIGA 5.8 R (AF.A 7 and 10), obtaining a fragment of ca. 300bp.

The PCR products with the intended fragment were cloned inside the TOPO pCR2.1 vector from
Invitrogen and transformed in chemical competent E. coli DH5-alpha cells. From each sample
tested it was obtained an average between 3 and 17 clones with the intended fragment, 10 clones
for the samples from the South of the Amazonic trapezium, and 68 clones for the ones from San
José del Guaviare. From each clone plasmidic DNA was extracted, purified and ARDRA analysis
were performed with the restriction enzymes Hinf I and Taq I from Invitrogen. It was built up a
presence-absence matrix simultaneously considering the results for the 2 enzymes, grouping the
clones according to their genetic resemblance by means of the Dice coefficient and the UPGMA
grouping method.

In the samples from the south of the amazonic trapezium it was found, in general, a high similarity
between the tested clones in contrast to the findings in the samples from San José del Guaviare,
where the clones were more different thus finding a greater diversity. According to these groupings
the clones to be sequenced were chosen. Until now, there only exist data from 2 sequences. The
first, corresponds to clone number 3 of the AF.A 10 which reported 94% of similarity in the
alignment with clone Giga 3538.1 isolated from roots of Inga parteno in Costa Rica. The other
sequence corresponds to clon 12 of AF.A 13 which was aligned with Glomus Pa106 clone with
92% of similarity, the clon isolated from roots colonized by Prunus aficana AMF.

The greater colonization percentage and AMF diversity in the samples collected in AF.A in San
José de Guaviare were related to: low phosphorus levels (0.61 - 5.51 ppm), low and medium levels
of organic carbon percentage (1.14 – 2.62 %) and extremely acid pH values (4.05 – 5.0). Likewise,
it was observed that the covering of the AF.A gives a higher resource offering, thus giving better
benefits for the symbiosis establishment.
 INTRODUCCIÓN

En la Amazonía Colombiana los suelos son pobres, tanto en materia orgánica como nutrientes,
estos últimos se encuentran en la capa de hojarasca y detritus de donde las plantas los obtienen a
partir de raíces alimentadoras y hongos de micorriza (Peña et al., 2006).

Los agroecosistemas de la amazonía colombiana presentan como rasgo característico la no

utilización de agroquímicos, a pesar de establecerse en suelos muy poco fértiles. La fertilidad de
los suelos en tales agroecosistemas es altamente dependiente de la participación de la microbiota
del suelo en procesos de descomposición, mineralización, solubilización y fijación simbiótica de
nutrientes. Por esta razón se afirma que las comunidades vegetales de la Amazonía se establecen
bajo un potencial de microorganismos transformadores y enriquecedores del suelo. De ahí la
importancia de conocer la riqueza microbiana presente (www.
geocities.com/RainForest/Jungla/1143/Micorrizas.htm, septiembre 2006).

En los suelos amazónicos, las micorrizas arbusculares, son casi una relación obligada para el
establecimiento de las especies vegetales tanto en condiciones naturales como en
agroecosistemas. El conocimiento de la diversidad de estos microorganismos, el estudio de la
simbiosis que establecen con la vegetación, su relación con factores fisicoquímicos del suelo y
otras poblaciones biológicas, el aporte en el establecimiento de especies vegetales, su uso en la
recuperación de zonas degradadas y en el desarrollo potencial de biofertilizantes, son algunas de
las razones que han llevado al Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi) a
abordar esta comunidad como tema de investigación.

La fase inicial de investigación sobre HMA consiste en identificar las condiciones naturales de la
simbiosis, con el fin de conocer la ocurrencia y distribución nativa de los hongos de micorriza
arbuscular. Por esto se evaluó el porcentaje de colonización, número de esporas presentes en
suelo rizosférico, morfotipos encontrados e identificación molecular a partir de raíces de plantas
micorrizadas.

Uno de los puntos más difíciles de abordar sobre este grupo de microorganismos es su
caracterización taxonómica, lo cual limita el conocimiento de su diversidad y su aplicación. La
razón básica es que estos organismos son simbiontes obligados, por lo que no pueden ser
aislados y mantenidos in vitro; además la única estructura que permite diferenciaciones
morfológicas entre géneros y especies son las esporas que producen y que pueden ser fácilmente
aisladas en el suelo (Dodd et al., 1996 citado en Antoniolli, 1999).
A pesar de que las características morfológicas de las esporas han sido usadas por años para su
determinación, no existen claves taxonómicas suficientes y actualizadas que lleven a una fácil y
correcta determinación, por lo que en muchos casos se necesita de expertos dedicados a esta
labor para la correcta determinación de un morfotipo, y aún entre ellos existen discrepancias sobre
género y especies reportadas (Peña et al., 2006).

El entendimiento de la importancia de la diversidad de HMA en los ecosistemas naturales ha sido

un gran reto. El hecho de que muchas plantas puedan ser colonizadas por la mayoría de HMA
indica una ausencia de especificidad de los hospederos, lo que puede contribuir al mantenimiento
de la diversidad fungal en los suelos. Los estudios de la diversidad de los HMA y la ecología de la
simbiosis se han soportado en datos de la ocurrencia y frecuencia de diferentes tipos de esporas y
métodos de clasificación morfológicos los cuales están limitados por la pequeña cantidad relativa
de diversidad morfológica entre especies. Los hongos se clasifican bajo una base de morfología
de las esporas y su desarrollo. Es frecuentemente difícil identificar los taxones en material de
campo de los aislamientos por la condición y preservación variables de las esporas (Antoniolli,
1999).

La sola utilización de datos de esporas puede dar origen a conclusiones erróneas sobre la
diversidad de las poblaciones de hongos ya que el número de esporas no refleja la presencia de
hongos no esporulantes ni el grado o nivel de colonización por especies particulares en las raíces
vegetales. Más aún, aunque las esporas muestran una baja diversidad morfológica estas son
altamente diversas a nivel genético. Las técnicas de biología molecular ofrecen la posibilidad de
tener métodos rápidos, sensibles y confiables para la identificación de aislamientos fungales tanto
como componentes de las poblaciones de esporas como estructuras vegetativas en raíces y
suelo. También tienen el potencial de proveer información cuantitativa en cuanto al desarrollo
vegetativo del HMA (Antoniolli, 1999).

El número de esporas presentes en el suelo no siempre está relacionado con presencia de HMA
en raíz, ya que en algunas especies la producción de esporas ocurre después de que es
alcanzado el umbral de la colonización. Además, la producción de esporas esta influenciada y
puede ser afectada por diversos factores. El porcentaje de colonización varía en diferentes
especies (Abbot y Robson, 1984 b; Ebbers et al., 1987; McGee, 1989; Gazey et al., 1992;
Tomeroup, 1983 y Gemma et al., 1989). Esto es importante en los estudios de HMA ya que un
número alto de esporas en el suelo no es criterio suficiente para decir que hay una colonización
eficiente dentro de la raíz. Por esto, con las técnicas moleculares, amplificando directamente DNA
de la raíz se puede aclarar si hay o no una colonización efectiva y conocer el genero de HMA que
esta colonizando la raíz.
En años recientes, el desarrollo de técnicas moleculares basadas en PCR ha dado una
aproximación alternativa y valiosa a la identificación morfológica. Estas técnicas moleculares
incluyen: Amplificación de regiones variables tales como los genes ribosomales espaciadores
internos de trascripción (ITS) o espaciadores intergénicos (IGS), polimorfismos en la longitud de
los fragmentos de restricción (RFLP´s) , amplificación de secuencias cortas repetidas
(microsatélites) y amplificación al azar de DNA polimorfito (RAPD). Aunque estos métodos han
sido aplicados exitosamente a estudios de HMA el uso potencial de la región ITS para diseñar
primers a ser usados para identificación de especies y cuantificación no ha sido bien explorado. La
utilización de la región ITS tiene ventajas porque los genes pueden ocurrir en copias múltiples y
las regiones son lo suficiente variables para permitir una clara discriminación entre especies
cercanamente relacionadas (Antoniolli, 1999).

En cuanto al área de estudio los inventarios de micorrizas arbusculares de la región amazónica

son escasos y en muchos casos los morfotipos aislados no han sido descritos o incluidos en las
guías taxonómicas publicadas, por lo que el conocimiento de la diversidad de estos hongos en la
región es limitada. De allí la necesidad de usar otras técnicas que apoyen estos estudios. En el
año 2001 Schüßler et al revolucionó la taxonomía de Glomales a partir del análisis molecular de
las secuencias SSU del rRNA, lo cual permitió reconocer las técnicas moleculares como una
alternativa válida para su estudio.

Con base en lo anterior, y teniendo en cuenta que no existe información detallada acerca de la
heterogeneidad de especies presentes en la región amazónica colombiana, se planteó la
realización de un trabajo de investigación, cuyo objetivo general fue: Caracterizar la población
micorrítica presente en raíces de plantas de yuca (Manihot esculenta) aisladas de dos regiones
de la Amazonía Colombiana. El análisis de la región ITS del rDNA se constituye una herramienta
molecular valiosa para la identificación de estos hongos de manera rápida y confiable,
complementando la metodología tradicional.

La yuca (Manihot esculenta) ha sido uno de los principales cultivos agrícolas de las comunidades
amazónicas, además de ser, su base alimenticia. Es empleada como ritual de intercambio cultural
y comercial. Es por esto que fue seleccionada como modelo de estudio (Arias, J et al., 2005). La
yuca es también una especie vegetal que tiene gran afinidad con la simbiosis de HMA debido a
sus necesidades nutricionales en suelos tan pobres como los de la región amazónica.
 MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA

Micorrizas

Las asociaciones simbióticas entre raíces vegetales y hongos fueron denominadas en 1885 por el
patólogo forestal alemán A. B. Fran como micorriza, derivado de la palabra en griego que traduce
raíz fungal (Aristón, 1999).

Las micorrizas, de las que hace muchos años se sabe son comunes en árboles forestales, hoy en
día se consideran como las raíces nutricias normales de la mayoría de las plantas, incluyendo
cereales, hortalizas, plantas de ornato y, por supuesto, los árboles (Agrios, 2002).

Hay tres tipos de micorrizas que se distinguen por la forma en que las hifas del hongo se
encuentran dispuestas dentro de los tejidos corticales de la raíz:

Las ectomicorrizas. Se caracterizan por formar en las células corticales una red de micelio
característica denominada red de Hartig. Estas raíces comúnmente son hinchadas y en algunas
combinaciones que se establecen dentro el hongo y su hospedante se encuentran
considerablemente más bifurcadas que las raíces no micorrizales. Las ectomicorrizas se forman
principalmente en árboles forestales debido a los basidiomicetes que forman setas y bejines y a
varios ascomicetes. Las esporas de los hongos ectomicorreicos se forman sobre el suelo y son
diseminadas por el viento. Las hifas de estos hongos frecuentemente producen un “manto
fungoso” estrechamente entretejido en torno a las raíces nutricias y dicho manto tiene un grosor
que varia desde el diámetro de una a dos hifas hasta como de treinta a cuarenta. Dichos hongos
penetran también en las raíces, pero solo crecen alrededor de las células corticales,
reemplazando a parte de la lámina media entre las células y formando la denominada red de
Hartig (Agrios, 2002).

Los árboles con asociaciones ectomicorríticas son dominantes en bosques de confieras, en

regiones boreales frías o alpinas, y muchos bosques de hoja ancha en regiones templadas o
mediterráneas, pero también se presentan en sabanas tropicales o subtropicales o en bosques
lluviosos. La mayoría de los hospederos de ectomicorrizas son los árboles o arbustos, pero
existen asociaciones formadas por unas pocas plantas herbáceas. Los hongos ectomicorriticos
contribuyen significativamente con la biomasa de los ecosistemas de bosque. Las hifas de los
hongos ectomicorriticos tienen capacidad saprofitita, pueden absorber fósforo y nitrógeno de
fuentes inorgánicas y orgánicas (Bledsoe 1992).
En las endomicorrizas el hongo crece dentro de las células corticales de la raíz y forma
estructuras características (Currah 1991). Existen dos tipos de endomicorrizas, el grupo más
común se distingue por presentar hifas aseptadas, vesículas y estructuras ramificadas que le
confieren el nombre de micorrizas vesículo-arbusculares. El segundo grupo está constituido por
hongos con hifas septadas que invaden las células de la raíz sin romper la membrana plasmática
y crecen dentro de la célula formando estructuras globosas (Richardson et al., 1993).

Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que proceden de los propágulos
existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raíz micorrizados, o plantas micorrizadas
que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la superficie de una célula epidérmica de
la raíz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa colonizadora que penetrara en
dicha célula o atravesara el espacio intercelular. En la zona externa del cortex de la raíz forma
unas estructuras intracelulares típicas que son los ovillos; en la zona media las hifas crecen
normalmente en forma longitudinal en los espacios intercelulares; Mientras que en la zona interna
las hifas penetran intracelularmente y forman los arbusculos por ramificación dicotómica repetida,
a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes.

También habría que destacar la formación de vesículas en el cortex cuya función es el

almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonización interna se produce la ramificación y
desarrollo del micelio externo, que es clave en la captación de nutrientes y da lugar a nuevos
puntos de colonización en la propia raíz o en otras próximas. Sobre la red tridimensional de hifas
que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia que, al madurar, completan el
ciclo del hongo (Bledsoe 1992). Estas micorrizas no se encuentran rodeadas por un manto
fungoso denso, sino por una masa micelial laxa que se forma sobre la superficie de la raíz a partir
de la cual se forman subterráneamente hifas y grandes zigosporas de color perla o bien
clamidosporas. Las endomicorrizas tienen una distribución mundial, encontrándose desde los
ecosistemas árticos hasta los ecosistemas desérticos (Bledsoe, 1992).

Las endomicorrizas son la simbiosis predominante tanto en coberturas naturales como en

coberturas antrópicas. Igualmente se ha observado que el fenómeno de dominancia de algunas
especies es más evidente en zonas con climas fríos que en zonas de climas templados (Bhatia et
al., 1996)

Los hongos micorriticos arbusculares son todos miembros de la división Glomeromycota del
orden de los Glomales; la clasificación actual contiene 2 subórdenes que son Glomineae y
Gigasporineae; dentro de los Glomineae se encuentras las familias Glomaceae (Glomus),
Acaulosporaceae (Acaulospora y Entrophospora), Archaeosporaceae (Archaeospora) y
Paraglomaceae (Paraglomus) y dentro del suborden Gigasporineae se encuentra la familia
Gigasporineae (Gigaspora y Scutellospora (INVAM, 2006) (Figura 1). El número de especies
dentro de los glomales actualmente es de 154 (INVAM, 2006).

Figura 1: Clasificación de los HMA del orden Glomales (INVAM, 2006)

Importancia de las micorrizas

Las micorrizas al parecer mejoran el crecimiento de la planta al aumentar la superficie de

absorción del sistema radial; al absorber selectivamente y al acumular ciertos nutrientes,
especialmente el fósforo; al solubilizar y hacer disponibles para la planta algunos minerales
normalmente insolubles; al permitir que las raíces alimentadoras funcionen durante más tiempo; y
al hacer que las raíces alimentadoras sean más resistentes a la infección que ocasionan algunos
hongos del suelo tales como Phytophthora, Pythium y Fusarium (Agrios, 2002).

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que hay muchas asociaciones distintas que se establecen
entre el hongo y su hospedante y que cada combinación puede tener efectos distintos sobre el
crecimiento de la planta. Algunos hongos micorriticos tienen un amplio rango de hospederos,
mientras que otros son más específicos. Así mismo, algunos de ellos benefician el mayor grado a
un determinado hospedante que otros hongos, y algunos hospederos sacan un mejor provecho al
asociarse con ciertos hongos micorriticos que con otros hospedantes. Los hongos micorrizales
necesitan también a un hospedante para poder crecer y reproducirse; en ausencia de
hospedantes, el hongo se mantiene en reposo en forma de esporas (Agrios, 2002).

Las micorrizas arbusculares estimulan el crecimiento, desarrollo y nutrición de las plantas,

especialmente en suelos de baja y moderada fertilidad los estudios llevados a cabo han puesto de
manifiesto que dichos efectos se deben a que la micorriza mejora sustancialmente la absorción de
nutrientes y agua por la planta y que el principal nutriente implicado es el fósforo (Barea et al.,
2002).

Se sabe que la mayor parte de los suelos naturales tienen un bajo contenido en fosfato asimilable,
e incluso la mayoría de los suelos arables productivos necesitan un aporte considerable de
fertilizante fosforado para mantener su fertilidad. En efecto, el 95-99% del fósforo de un suelo esta
integrado en compuestos orgánicos o inorgánicos insolubles. De otro lado, se conoce que el ritmo
de absorción de los iones fosfato por la planta es superior al del desplazamiento de dichos iones
desde el suelo no rizosférico hacia la raíz. Ello condiciona que se forme una zona de agotamiento
del elemento en la rizósfera. Esta zona de agotamiento, que ha podido ser puesta de manifiesto
por autorradiografía, es la base que justifica que el PO4-3 sea el factor limitante del crecimiento de
las plantas en gran número de suelos. Efectivamente, el desplazamiento del ión fosfato hacia la
raíz tiene lugar por difusión; en su camino hacia la planta se fija fácilmente a arcillas y coloides del
suelo por medio de combinaciones insolubles con calcio, hierro o aluminio (Barea et al., 2002).

Los mecanismos propuestos para explicar la mayor capacidad de absorción de fósforo por las
plantas están basados en lo siguiente: (a) que la micorrización induzca cambios morfológicos en la
planta; (b) que la micorrización induzca cambios fisiológicos, lo que provocaría un incremento de
la capacidad de la superficie de la raíz de la planta para absorber fósforo; (c que la micorrización
proporcione una superficie de absorción adicional (hifas del hongo), o más eficaz; (d) que las hifas
o las raíces micorrizadas tengan capacidad para solubilizar fuentes de fósforo no disponibles para
raíces no infectadas y (e) que la raíz micorrizada tenga más longevidad que la que no lo esta
(Barea et al., 2002).

Clasificación de HMA

La clasificación puede estar basada tanto en la identificación de una población como en la

estructura para entender las relaciones filogenéticas entre unidades taxonómicas (Bentivenga y
Morton, 1994). Todas las clasificaciones están basadas en las mismas categorías taxonómicas
lineanas (por ejemplo especie, genero). Sin embargo las clases y las causas de diversidad son
menos universales y pueden existir grandes diferencias dentro de cada uno de los organismos.

Las esporas fueron el único foco de atención en el que se centraron los primeros estudios de
taxonomía de los HMA. Los cuales no fueron formalizados utilizando la nomenclatura tradicional
hasta 1974 (Gerdemann y Trappe, 1974). Pocas áreas del mundo han sido extensivamente
muestreadas para especies silvestres de HMA y las investigaciones taxonómicas todavía
incluyen unos componentes de exploración y descripción significativo (Morton, 1993).
Hasta ahora la espora ha sido la estructura más importante usada para la identificación. El
diámetro de las esporas de HMA en el suelo se encuentra en un rango de 50-600 µm (Mosse et
al., 1981).

La primera aproximación a la clasificación de HMA fue hecha en los años 1960’s todas las
especies fueron puestas dentro del genero Endogone de los zigomicetos basándose en la
producción de esporas muy grandes multinucleadas. Después fueron agrupados los géneros
Acaulospora, Gigaspora, Glaziella, Modicella y Sclerocystis con Endogone en Endogonaceae,
Zygomycetes en ese tiempo se conocían unas pocas características, pero a medida que fueron
descritas nuevas especies, se descubrieron nuevos caracteres y la información base fue
ampliada. Glaziella y Modicella fueron transferidos a los Ascomycetes. Ames y Schneider (1979)
eligieron un nuevo genero, Entrophospora, y Walker y Sanders (1986) situaron a la especie
Gigaspora sensu lato (con paredes internas y un escudo de germinación) a un nuevo genero
Scutellospora.

Entre 1982 y 1990, el número de HMA descrito se incremento marcadamente Trappe (1982), en
su clave sinóptica para la familia Endogonaceae, describió 77 especies excluyendo Endogone, y
Hall (1984) en su clave dicotómica para Endogonaceae listo 67 especies, otra vez excluyendo a
Endogone. Luego, Schenck y Pérez catalogaron 120 especies descritas (1987) y
subsecuentemente 147 especies (1990) en el género de hongos que producen asociaciones
micorríticas. Walker (1986) y otros (Berch y Koske, 1986; Morton, 1986; Spain et al, 1989)
definieron tipos de paredes fenotípicamente diferentes y separables, representados por
murogramas (Representación grafica de tipos de paredes y sus posiciones relativas). Esta
clasificación de HMA se basa en características morfológicas de esporas (incluyendo murógrafos),
ya que los caracteres vegetativos de los hongos no varían mucho entre taxones y están también
influenciadas por especies de hospederos vegetales.

Ciclo de vida de HMA

Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que proceden de los propágulos
existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raíz micorrizados, o plantas micorrizadas
que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la superficie de una célula epidérmica de
la raíz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa colonizadora que penetrara en
dicha célula o atravesara el espacio intercelular. En la zona externa del cortex de la raíz forma
unas estructuras intracelulares típicas que son los “ovilllos”; en la zona media las hifas crecen
normalmente de forma longitudinal en los espacios intercelulares; mientras que en la zona interna
las hifas penetran intercelularmente y forman los arbusculos por ramificación dicotómica repetida,
a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes (Figura 2).

Figura 2. Ciclo de Vida de HMA (INVAM, 2006).

También habría que destacar la formación de vesículas en el cortex cuya función es el

almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonización interna se produce la ramificación y
desarrollo del micelio externo, que es clave en la captación de nutrientes y da lugar a nuevos
puntos de colonización en la propia raíz o en otras próximas. Sobre la red tridimensional de hifas
que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia que, al madurar completan el
ciclo del hongo (Figura 3).

Figura 3.

Estructura morfológica de las micorrizas vesículo arbuscular (http://www.turipana.org.co/micorrizas.htm

corredor Gloria)
Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en sistemas suelo/planta

Los Hongos de Micorriza Arbuscular (HMA) son simbiontes biotróficos obligados con un ciclo de
vida dividido en dos etapas distintas. Por un lado, los estadios de reposo y reproductivo (esporas,
esporocarpos, y posiblemente también vesículas) son independientes de la planta. Por otra parte,
los estadios vegetativos están involucrados en interacciones complejas con las plantas entre las
cuales se incluyen el reconocimiento, la colonización y el intercambio de nutrientes. Estas etapas
son representadas por el desarrollo de hifas externas en el suelo e hifas y espirales, arbusculos y
vesículas dentro de la raíz.

Esporas de HMA

Las esporas son producidas rápidamente en presencia de una planta hospedera, de manera que
a los 4 a 6 meses son producidas miles de nuevas esporas del mismo tipo. Las esporas son
formadas en el micelio extraradical o agregadas en estructuras más o menos bien definidas
llamadas esporocarpos. Aunque en algunas especies las características de los esporocarpos son
importantes, las características individuales de las esporas son las que principalmente se utilizan
para la identificación. Las esporas difieren en forma, estructura, contenido citoplasmático, color,
tamaño, número de paredes vía de germinación, morfología de esporas secundarias y presencia o
ausencia de esporocarpos (Mosse et al., 1981; Gerdemann y Trappe, 1974; Morton, 1990).

El fenotipo de la espora es el resultado de procesos de desarrollo completamente diferentes de

aquellos del talo, por lo que la espora es considerada ser autónoma en forma y función por
algunos investigadores. Sin embargo, el tubo germinal de la espora puede originarse a partir de
una red hifal filamentosa, arbusculos, vesículas o células accesorias (Morton et al., 1995b). El
compromiso de la hifa arbuscular altamente modificada en la colonización no es muy posible.
Morton (1993) considera que un individuo fungal es representado por una sola espora identificable
la cual consiste de una sola célula multinucleada. Esta célula puede dar origen a una nueva
colonia fungal con componentes del micelio dentro de una raíz y en el suelo. Esta colonia
vegetativa eventualmente dará origen a nuevos individuos en forma de nuevas esporas.

Las esporas son células morfológicamente especializadas las cuales no contribuyen directamente
ni soportan actividades del desarrollo de la micorriza e interacciones hospedero-hongo. La función
de la espora es llevar la información genética a nuevos hábitats e iniciar nuevos individuos
espacialmente separados del organismo parental. En ausencia de información sobre el ciclo
nuclear o existencia de etapas sexuales no es posible determinar si las esporas representan
realmente nuevas generaciones de nuevos individuos. Sin embargo, existe una gran variabilidad
genética entre las esporas dentro de una sola especie e incluso entre las que se originan de un
cultivo que parte de una sola espora (Lloyd-McGilp et al., 1996; Rosendahl y Taylor, 1997;
Sanders et al., 1995; Wyss y Bonfante, 1993; Zézé et al., 1997). Esto complica los factores y
resalta la necesidad de investigaciones en el ciclo de vida y la genética del hongo.

Germinación de las esporas

La germinación de esporas es una parte integral del ciclo de vida de los hongos de micorriza
arbuscular ya que representa la iniciación de la etapa vegetativa del crecimiento. Los caracteres
de germinación son importantes para la taxonomía ya que son utilizados para distinguir entre los
dos géneros de Gigasporinae, Gigaspora y Scutellospora. En Gigaspora la germinación ocurre
directamente a través de la pared celular mientras que en Scutellospora ésta ocurre a partir de un
escudo de germinación formado sobre o dentro de una capa de pared interna (Walter y Sanders,
1986).

La dormancia de esporas puede variar desde dos semanas hasta muchos meses en especies de
Acaulospora, G. intraradices y Gigaspora gigantea (Gazey et al., 1992; Tommerup. 1983). La
germinación de esporas puede también estar influenciada por el pH, la humedad, los exudados de
la raíz hospedera y otros factores (Tommerup, 1983; Hetrick, 1984; Hepper, 1984; Siquiera et al.,
1985). Por ejemplo, las esporas de Glomus mosseae germinan más rápidamente cuando son
almacenadas a bajas temperaturas (Hepper y Smith, 1976). Muchas bacterias del suelo pueden
afectar la germinación de esporas. Algunas pueden ser inhibidoras mientras otras promueven la
germinación y formación micorrizales (Fitter y Garbaye, 1994).

En presencia de factores de la raíz hospedera, el crecimiento hifal a partir de esporas no es

todavía bien comprendido. Originalmente se propuso que la falta de síntesis de DNA y
proliferación nuclear podrían ser la causa (Burggraaf y Beringer, 1989), pero las observaciones de
migración nuclear y replicación de DNA nuclear en la hifas creciendo a partir de esporas
(Bianciotto y Bonfante, 1993); Bécard y Pfeffer, 1993), han llevado al rechazo de ésta hipótesis, y
otros mecanismos deben ser los responsables de la falta de crecimiento. Estos podrían incluir
sistemas de transporte de membrana no efectivos tal que la habilidad de absorber nutrientes es
limitada (Smith y Smith, 1986).

Las esporas transportadas por el suelo de HMA son consideradas las estructuras reproductivas
más importantes, pero sus números en suelo están a menudo poco relacionadas con la formación
de micorrizas en raíz (Abbott y Robson, 1984b; Ebbers et.al, 1987; McGee, 1989). Para algunas
especies, la producción de esporas solo ocurre después de que un nivel umbral de colonización
es alcanzado (Gazey et al., 1992). Además la producción de esporas es influenciada por muchos
factores incluyendo la planta hospedera y el tipo de suelo.
Solo se pueden hacer pocas generalizaciones útiles acerca de las condiciones que llevan a la
formación de esporas a parte de la necesidad dejar pasar algunos meses desde la colonización
inicial del hospedero. En relación a otros propágalos micorríticos de MA, las esporas son
consideradas generalmente como más resistentes a condiciones adversas (Abbott y robson,
1982b) que otros fragmentos colonizados de raíz o hifas y pueden actuar como estructuras de
supervivencia a largo plazo, con alguna capacidad para la dispersión por agua y por viento (Koske
y Gemma, 1990; Friese y Allen, 1991).

Colonización

El proceso y la taza de colonización determinan la efectividad de un HMA o una asociación

micorrizal. La colonización puede originarse a partir de esporas, fragmentos de raíz infectados o
hifas (Smith y read, 1997). La red hifal y los fragmentos de raíz son dados a ser la fuente principal
por la cual las plantas son colonizadas (Smith y Walter, 1981; Jasper et al., 1992; Hepper, 1981).
Al mismo tiempo que la infección de esparce dentro de las células corticales de la raíz hospedera,
un micelio de hifas extraradicales crece afuera, hacia el suelo. Las hifas extraradicales tienen un
papel importante en la adquisición de nutrientes y forman una fuente de colonización secundaria a
lo largo de y entre las raíces (Harley y Smith, 1983; Smith y Gianiazzi-Pearson, 1988; Smith et al.,
1992).

Dentro de la corteza, las hifas crecen longitudinalmente entre las células e intracelularmente para
formar arbusculos. Utilizando a G. mosseae como modelo, Giovannetti et al., (1993) demostraron
que los primeros apresorios fueron formados dentro de las 36 horas siguientes al principio de la
interacción con Ocimum basilicum y Helianthus annuus y los primeros arbusculos fueron formados
entre las 42 y las 48 horas después de la inoculación de H. annuus. Estas observaciones
concuerdan con observaciones anteriores (Cox y Sanders, 1974; Brundrett et al., 1985). Utilizando
un sistema de materas nodriza con Glomus intraradices y Lycopersicon esculentum, Rosewarne
et al., (1997) mostraron que después de solo 4 días aproximadamente el 60% de la raíz estaba
asociada con hifas y el pico de número de arbusculos ocurrió 4 días después de que el
crecimiento hifal lograra su máximo. Es asumido por parte de muchos investigadores que los
arbusculos son la interfase principal para la toma de azúcares por parte del hongo y la
transferencia de iones desde el hongo a las células corticales de las raíces de las plantas
hospederas, aunque existen evidencias de la separación espacial de las funciones de
transferencia de Carbono y Fósforo y esta disponible una interfase hifal y arbuscular. (Gianiazzi-
Pearson, 1991; Smith y Read, 1997).

Las vesículas, que son órganos de almacenamiento que contienen gran cantidad de lípidos y
muchos núcleos, son formadas por miembros de Glominaceae después de que la unidad de
infección ha madurado. Las vesículas producidas por muchos HMA se considera que funcionan
como órganos de almacenamiento temporal. Sin embargo éstas tienen a menudo paredes con
múltiples capas, como las esporas, y pueden funcionar como propágalos cuando están aisladas
de la raíz (Biermann y Linderman, 1983).

Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales

Existe muy poca información acerca de HMA en ecosistemas naturales, sin embargo han surgido
evidencias de que la diversidad es mayor que la que se ha inferido a partir de estudios
morfológicos de esporas. Las poblaciones en diferentes ecosistemas, sobre la base de conteo de
esporas, varían entre 5 y 25 especies diferentes. Este número depende de las especies
hospederas involucradas (tabla 2.1). El número de esporas no siempre esta bien correlacionado
con el grado de formación micorrizal (Brundrett, 1991) y su porcentaje de germinación varía en
diferentes tiempos del año (Tommerup, 1983; Gemma et al., 1989)

La composición de una especie de HMA puede ser explicada como una respuesta a los cambios
en la comunidad de plantas, ya que la naturaleza obligada de los simbiontes de HMA une el
crecimiento y la reproducción tanto de la planta hospedera como del hongo a las condiciones del
suelo (Adelman y Morton, 1986; Hendrix et al., 1995; Sanders y Fitter, 1992a). En estudios de
campo, se ha mostrado que la secuencia de cosechas modifica la comunidad de HMA y la
composición de especies. La predominancia de una sola especie de HMA para cada cosecha se
desarrolló en secuencias continuas de maíz y soya (Johnson et al., 1991), favoreciendo la
especies benéficas para la cosecha y reduciendo la población de especies de HMA menos
benéficas (Johnson et al., 1992a).

Las prácticas de manejo tales como la labranza (Evans y Miller, 1988), tasa y método de
aplicación de fósforo, aplicación de pesticidas o abonar con cal se ha demostrado que también
influencian la esporulación y la colonización por HMA (Duke et al., 1994; Medeiros et al., 1994;
Ryan et al., 1994; Wang et al., 1993). En algunos casos la diversidad de la comunidad de HMA ha
sido incrementada en el manejo de sistemas que utilizan la rotación de cultivos y entradas
reducidas de herbicidas (Douds et al., 1993).

Para estudiar la contribución micorrizal a una comunidad de plantas de sucesión temprana en el

campo, Gange et al., (1990) utilizó un fungicida para reducir la colonización durante el primer año
de establecimiento de las plantas en suelo raso. Una menor cantidad de especies de plantas se
establecieron en comunidades tratadas con fungicidas, soportando la idea de que los HMA
promueven la diversidad de especies de plantas (Helgason et al., 1998; Van der Heijden et al.,
1998). Los hongos micorrizales deben también afectar el patrón de diversidad de especies y la
abundancia relativa, una vez el estatus micorrizal de la comunidad de plantas ha sido restaurado
en un ecosistema previamente perturbado (Barea y Jeffries, 1995). El HMA puede reducir la
diversidad de plantas si la simbiosis representa un beneficio relativamente más grande para la
especie dominante dentro de la comunidad Hetrick et al., 1994).

Cuando los ecosistemas son perturbados, por ejemplo por monocultivos o por utilización de
pesticidas, la dinámica de la comunidad es perturbada y se puede desarrollar un sesgo hacia
pocos e incluso un solo hongo dominante (Johnson et al., 1992a). Por ejemplo, en algunos
ambientes la labranza y el uso de fertilizantes ha llevado a que se encuentren menos especies de
HMA en el suelo (Hetrick y Bloom, 1983; Schenck y Kinloch, 1980) mientras que en otros el uso
agricultural debe promover una mayor diversidad (Abbott y Robson, 1977).

Aunque los estudios poblacionales de hongos micorrizales de MA están basados en caracteres

morfológicos de los cuerpos fructificantes, esporas, micelios vegetativos o estructuras simbióticas,
la aproximación es todavía limitada dado que los factores que influencian la esporulación de una
especie individual son poco entendidos y no pueden ser extrapolados hasta la extensión de
colonización vegetativa de diferentes especies de plantas. Las poblaciones de esporas proveen
solo una indicación relativa de la abundancia y la composición de especies de poblaciones
fungales de MA. Sin embargo, los estudios moleculares de la diversidad de los hongos (Van
Tuinen et al., 1994) en ecosistemas naturales pueden ofrecer un mejor medio de identificación
para información sobre poblaciones, especialmente cuando es difícil acumular un número
suficiente de características morfológicas.

La ocurrencia de muchas especies de HMA en suelos o dentro de raíces sugiere, que la

competencia interespecífica es posible. La variación en la producción de esporas entre endófitos
coexistentes ha sido observada (Gemma et al., 1989) y una abundante producción de esporas por
un HMA era usualmente correlacionada con niveles más bajos de producción de esporas por
otros. Esto puede deberse al antagonismo entre las especies. En experimentos de cultivo con
materas, donde muchos aislamientos de HMA son inoculados conjuntamente, se ha probado que
algunos son mejores competidores que otros (Wilson, 1984; López-Aguillon y Mosse, 1987).

Planta hospedera y producción de esporas

Casi el 90% de las especies de plantas vasculares hasta ahora examinadas pueden ser
colonizadas por HMA (Harley y Smith, 1983) y son normalmente micorrizales en el campo. La
especificidad del hospedero es aparentemente muy baja. Bajo condiciones experimentales un solo
aislamiento del hongo puede formar asociaciones con plantas hospederas taxonómicamente
diversas (Gerdemann, 1975; Smith y Read, 1997) y solo una especie de planta hospedera se
asocia con muchos aislamientos fungales, llevando a la visión ampliamente aceptada de que las
asociaciones micorríticas carecen de especificidad. Sin embargo hay algunas evidencias de que
existe un cierto grado de especificidad entre HMA y plantas, particularmente en ecosistemas
naturales (Rosendahl et al., 1994; Sanders y Fitter, 1992b; Smith y Read, 1997).

No hay duda de que las asociaciones incluyendo diferentes especies de plantas y hongos exhiben
una variabilidad funcional. Algunas plantas hospederas dan un mayor beneficio al HMA que otras,
lo cual es reflejado en las diferencias de cantidad de producción de esporas. En la mayoría de los
casos la formación de esporas esta estrechamente relacionada con la longitud total de las raíces
micorrizales producidas por determinado hospedero (Giovannetti et al., 1988; Hetrick y Bloom,
1988; Howeler et al., 1987; Simpson y Daft, 1990; Gazey et al., 1992). De este modo, la
proporción de diferentes especies en determinado lugar dependerá de la extensión a la cual
colonicen los sistemas radiculares de las plantas. Cualquier grado de especificidad o diferencia en
la efectividad será entonces reflejado en las poblaciones de esporas.

Hay evidencias que soportan esta idea. En una investigación de plantas perennes de 19 familias,
en un desierto del Sur de California, la mayoría de las plantas eran hospederos potenciales para
hongos endomicorriticos y fue mostrado que la diversidad de estos hongos esta directamente
relacionada con la diversidad de plantas (Bethlenfalvay et al., 1984). De nuevo la situación es
compleja ya que en algunos estudios de comunidades de plantas los datos han sido presentados
mostrando que toda la diversidad de hongos puede ser soportada por un gran número de
especies relacionadas (ie. en el mismo género o familia) mientras que especies de solo una planta
solo soportaban algunos de los hongos (Brundrett y Kendrick, 1988; Trappe et al., 1984). Más
aún, en un estudio de los hongos presentes en el bosque bluebell, Scutellospora, Acaulospora y
Glomus solo ocurrían cuando la planta Hyacinthoides non-scripta estaba presente (Clapp et al.,
1995), otra vez, implicando algún nivel de especificidad del hospedero.

Este resultado confirma los estudios realizados por Molina et al. (1978), los cuales mostraban que
dos o más especies pueden colonizar una planta individual. Los datos en esta área no son
extensivos y por esto los métodos que nos permiten comparar el grado de colonización de raíces
por especies individuales con producción de esporas son esenciales para comprender a cabalidad
la competencia entre especies de hongos y las especificidad de las plantas hospederas.

Las asociaciones micorrizales son normalmente benéficas, (mutualísticas) para las plantas
(Johnson et al., 1997; Smith y Read, 1977). Las micorrizas incrementan la tasa de crecimiento de
las plantas a través de un incremento en la toma de nutrientes, especialmente Fósforo bajo
condiciones controladas (Fitter, 1989; Smith et al., 1994; Jackson et al., 1972), sin embargo, bajo
condiciones naturales, no hay suficiente evidencia que muestre los incrementos en el crecimiento
de las plantas debido a micorrizas (Fitter, 1989; Newsham et al., 1995a; West et al., 1993).

Las respuestas de bajo crecimiento podrían estar asociadas con las diferencias en la efectividad
de las especies micorrizales (eg. Abbott y Robson, 1981a; Abbott y Robson, 1981b; Bevege y
bowen, 1975; Jakobsen et al., 1992).Por ejemplo, el pequeño endófito Glomus tenue no produce
una respuesta de crecimiento, aún en suelo con baja fertilidad (Powell, 1979), G. intraradices y G.
City Beach WUM 16 incrementaron el crecimiento de la planta y la toma de fósforo, pero G.
etunicatum y G. mosseae no tuvieron efectos en el crecimiento de la planta ni en la toma de
Fósforo en diferentes niveles de compactación del suelo (Nadian et al., 1998). La contribución
relativa de las raíces en la toma total de fósforo vario ampliamente entre plantas colonizadas por
S. calospora, Glomus sp. y G. caledonium en cohombro (Pearson y Jakobsen, 1993). Entonces,
las diferencias entre los HMA de sus requerimientos aparentes de eficiencia de toma de carbono o
nutrientes deberían ser evaluados para HMA de especies colectadas en campo. Mas aún, en esta
situación, las sondas moleculares harán más fácil la distinción de diferentes especies de hongos
que están actualmente presentes en las raíces.

Los efectos de los HMA en plantas son dependientes de la planta hospedera y las condiciones
ambientales (Sieverding o Howeler, 1985; Smith y Read, 1997; Smith, 1993; Newsham et al.,
1995b). Los números de esporas de HMA individuales en un ecosistema natural de sabana en
Colombia cambiaron como resultado de diferentes prácticas de manejo (Dodd et al., 1990). En los
suelos originales, doce tipos de esporas fueron identificadas y se observó que las poblaciones de
diferentes tipos de esporas cambiaron rápidamente bajo diferentes regimenes de cosecha. Por
ejemplo, las esporas de Glomus occultum y Acaulospora myriocarpa incrementaron en
subtransectos de sorgo, mientras que aquellos de Entrophospora colombiana, A. melleae y A.
morrowiae dominaron subtransectos donde cowpea (Vigna unguilata) crecía tras un cultivo de
kudzu (Pueraria phaseoloides) (Dodd et al., 1990b). Este estudio soporta la idea de que diferentes
plantas hospederas pueden producir diferentes poblaciones de HMA en el suelo alrededor de un
sistema de raíces.

En franjas de terreno de minas naturalmente revegetadas muchos tipos diferentes de esporas

fueron encontradas y 13 éstas fueron identificadas a nivel de especie (Kiernam et al., 1983). Cada
planta muestreada tenia entre una y ocho especies de micorrizas asociadas con ella. Mas
recientemente, un análisis de poblaciones de esporas bajo una pradera natural de pasto alto
(Bentivenga y Hetrick, 1992) mostró la presencia de 14 especies de HMA, con esporas de Glomus
ambisporum como las dominantes numéricamente.

No esta claro si las especie que se vuelve dominante con cada planta hospedera es también la
especie que fue más benéfica para este cultivo particular o para la estabilidad del suelo (Barea y
Jeffries, 1995). Desafortunadamente, no hay suficientes datos para entender completamente si las
plantas controlan la diversidad de los HMA para poder formar simbiosis benéficas (Van der
Heijden et al., 1998).

Manihot esculenta (YUCA) y su relación con los HMA

La yuca (Manihot esculenta Crantz), planta originaria de América tropical, es un arbusto leñoso
perenne, que pertenece a la familia Euphorbiaceae. Se cree que fue domesticada en Brasil, donde
existe el mayor número de especies Manihot y la mayor diversidad dentro de las diferentes
especies; sin embargo, existe poca evidencia arqueológica que confirme este hecho (Arismendi,
2001).

Esta especie es de gran importancia socioeconómica para los agricultores y consumidores de

pocos recursos económicos de países tropicales, ya que es un producto básico en su dieta
alimenticia y ocupa el cuarto lugar en importancia como fuente de energía, después del arroz, el
maíz y la caña de azúcar (Arismendi, 2001) .

Como ya se había mencionado la yuca (Manihot esculenta) tiene la capacidad para producirse
en suelos relativamente pobres la cual esta relacionada con alguna disposición especial de la
planta para extraer nutrimentos del suelo; el área de exploración de las raíces, que puede llegar
hasta un metro de profundidad, lo cual puede ayudar a explicar su crecimiento en suelos
marginales. Sin embargo, observaciones microscópicas indican que la yuca tiene un sistema
radical bastante burdo, con raíces relativamente gruesas y pobremente ramificadas y los pelos
radicales pueden estar presentes pero no son abundantes (Arismendi, 2001).

Recientes investigaciones han demostrado que la adaptación de la yuca a los suelos pobres esta
relacionada con la habilidad de la planta para formar micorrizas vesículo- arbusculares. En
muchas áreas productoras de yuca, en América Latina, el principal limitante del cultivo es la
deficiencia de fósforo. Se ha demostrado que la inoculación con micorrizas mejora la capacidad de
absorber fósforo a partir de suelos y soluciones nutritivas con bajas concentraciones de ese
elemento (Arismendi, 2001).

Las micorrizas arbusculares en las plantas de yuca, aumentan la superficie de absorción de las
raíces absorbentes y, con ello, la absorción de iones en el suelo, particularmente el fósforo. Las
micorrizas que afectan las raíces de yuca y de muchos otros cultivos pertenecen al grupo de las
endomicorrizas vesículo-arbusculares. Sus hifas crecen entre y dentro de las células de la corteza
de las raíces, produciendo ramificaciones dentro de ella, llamadas arbusculos y vesículas. Las
hifas también crecen en el suelo, donde pueden extenderse hasta varios centímetros de la raíz
(Howeler, 1983 citado por Cadavid, L, 2000).

Los géneros de hongos más comunes y eficientes encontrados para el cultivo de la yuca son
Glomus, Entrophospora y Acaulospora en suelos de Colombia (Cadavid, L, 2000).

Aproximaciones moleculares al estudio de HMA

La mayoría de las investigaciones moleculares en identificación y detección de HMA a nivel de

especie y aislamiento han utilizado técnicas basadas en PCR, las cuales permiten la
caracterización de ácidos nucleicos a partir de pequeñas cantidades de DNA fungal (White et al.,
1990). Un primer estudio de DNA fungal de MA utilizando técnicas de PCR involucró la
amplificación y secuenciación del gen de rRNA 18S (Simón et al., 1992). El DNA fue amplificado a
partir de pequeños números de esporas utilizando los primers universales NS1, NS2, SS38 y
NS21. Utilizando el primer VANS 1 fue posible amplificar y secuenciar el gen de rRNA 18S de
muchas diferentes especies de HMA representando todo el género de los Glomales (Simón et al.,
1993). Esto llevó al diseño de primers con alguna especificidad taxonómica a nivel de género
(VAGIGA, VAGLO y VAACAU) y estos han sido usados para detectar diferentes géneros de HMA
en raíces colonizadas (Clapp et al., 1995; Sulistyowati, 1995). Bonito et al., (1995) usaron el par
de primers VANS1-NS21 para detectar Glomus intraradices en muchas raíces diferentes. Durante
la aplicación de estos métodos un número de problemas ha sido identificado. La especificidad es
limitada al nivel de género, y puede no ser absoluta ya que Sulistyowati, (1995) mostró
amplificación de DNA de Glomus con el primer VAGIGA.

Lanfranco et al., (1995) utilizaron RAPD-PCR para generar un primer específico para la
identificación de G. mosseae que pudiera distinguir algunos aislamientos de éste hongo. Usando
PCR-RFLP y los primer universales ITS1 e ITS4, Sanders et al., (1995) obtuvieron fragmentos de
diferentes longitudes a partir de esporas de la misma especie obtenidas de una comunidad
natural. La utilización de éstos primers permitió a Sanders et al., (1995) secuenciar el rRNA 5.8S
altamente conservado revelando así considerables diferencias entre especies. Estas técnicas
tienen un claro potencial para la identificación de esporas y etapas vegetativas, pero están
actualmente limitadas por la falta de conocimiento básico de la diversidad genética en hongos y
protocolos apropiados para recuperar DNA de esporas simples. Los métodos están mejorando
todo el tiempo y muchos grupos de trabajo en micorrizas las están adaptando para aplicaciones
específicas.
Los primers que diferencian taxones a nivel de especie también han sido generados usando DNA
polimórfico amplificado al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) (Abbas et al., 1996; Lanfranco et
al., 1995). Los primers diseñados por Lanfranco et al. (1995) fueron razonablemente específicos
para G. mosseae, pero también produjeron productos de amplificación con especies de
Scutellospora. Abbas et al. (1996) diseñaron primers específicos para aislamientos y no fueron
útiles para la identificación de aislamientos de Glomus mosseae o Gigaspora margarita de sitios
diferentes a sus lugares de origen. Tales primers tan altamente específicos podrían ser útiles para
la detección de aislamientos micorrizales individuales y para el monitoreo de los resultados de la
inoculación pero tendrían limitaciones como herramientas de diagnóstico general para estudios
ecológicos en campo de hongos y a nivel de especie. También han sido diseñados primers
específicos para S. castanea a partir de secuencias altamente repetitivas de DNA (Abbas et al.,
1996; Zézé et al., 1996). Las diferencias en las secuencias de las regiones ITS de rDNA
determinadas por RFLP-PCR han probado ser útiles en la diferenciación de muchos HMA
(Redecker et al., 1997) y en el diseño de primers diagnósticos para Glomus mosseae (Millner et
al., 1998). Éstos métodos tienen sus limitaciones para la cuantificación de HMA en raíces y suelo,
pero su potencial es tal que trabajos posteriores son claramente garantizados.

Detección de HMA en raíces

Los HMA son de importancia fundamental para el crecimiento de las plantas y pueden ser
cruciales para el desarrollo de sistemas de agricultura sostenible. Para poder entender su papel es
necesario desarrollar herramientas para la detección e identificación tanto de las etapas
vegetativas como de esporas en diferentes suelos durante el desarrollo de éstos hongos. Ya que
éstos no pueden crecer en ausencia de una planta hospedera y son muy difíciles (casi imposibles)
de identificar en etapa vegetativa la utilización de tecnología de DNA ofrece la posibilidad de
detección e identificación y eventualmente de cuantificación en raíces colonizadas.

Diferentes HMA pueden colonizar el sistema radicular de una sola planta bajo condiciones de
campo (Rosendahl et al., 1990). Es posible identificar algunas especies de HMA comprando sus
patrones de colonización dentro de las raíces (Abbott, 1982; Brundrett et al., 1996; Merryweather y
Fitter, 1998b) o por medio de la utilización de isoenzimas y anticuerpos (Hepper et al., 1988b;
Rosendahl et al., 1989; Morton, 1987; Rosendahl y Sen, 1992; Sanders et al., 1992). Sin embargo,
las estructuras vegetativas dentro de las raíces colonizadas son de uso limitado dadas las
similitudes entre las especies de hongos y los efectos de la planta hospedera en la morfología del
hongo (Smith y Smith, 1996). Éstas técnicas no pueden identificar una sola especie individual
dentro de una raíz y por eso existe la necesidad de desarrollar técnicas sensibles de detección y
cuantificación.
La utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis y Falooma, 1987), asociada
con otras técnicas moleculares tales como RFLP, y RAPD, tiene la posibilidad de identificar HMA
de manera precisa. Técnicas tales como RFLP han sido utilizadas en DNA genómico extraído de
raíces colonizadas para detectar el hongo Scutellospora castanea (Zézé et al., 1996), y RAPD-
PCR fue usada para diseñar primers específicos para Glomus mosseae (Lanfranco et al., 1995).
Otras técnicas tales como PCR-RFLP y minisatélites (Zézé et al., 1997) pueden ser utilizadas para
estudiar la variación dentro y entre especies así como para diseñar primers.

La cuantificación de HMA utilizando PCR competitiva es posible (Edwards et al., 1997), pero es
difícil determinar la concentración inicial del DNA (target) o plantilla. Primers de PCR diseñados a
partir de rDNA 28S fueron utilizados para detectar la frecuencia de colonización de raíces por 4
especies de HMA con PCR anidada *Van Tuinen et al., 1998a). Estos métodos podrían ser
utilizados para identificar ‘el hongo de manera precisa, pero no pueden cuantificar la biomasa del
hongo dentro de raíces. Métodos basados en DNA para cuantificar hongos tales como
Rhizoctonia solani AG8 (Whisson et al., 1995) y Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt)
(Herdina et al., 1996; 1997), en suelo han sido exitosamente desarrolladas usando ensayos de
hibridización, y métodos similares tienen aplicaciones potenciales a HMA.

Es importante seleccionar y adaptar la herramienta más eficiente y fácil en relación a la pregunta.

La identificación de especies de HMA in planta es esencial ya que la comunidad fungal dentro de
las raíces determina la eficiencia de la relación simbiótica con la planta hospedera, e
indirectamente la composición de la comunidad de HMA en el suelo.

Espaciadores internos de trascripción (ITS)

Los genes ribosomales y sus espaciadores son targets frecuentes para la identificación de
hongos. El DNA ribosomal nuclear que codifica el altamente conservado rDNA 5.8S con los dos
espaciadores internos de trascripción flanqueantes ha sido utilizado para estudiar las relaciones
filogenéticos entre grupos de hongos y para el diseño de primers para PCR. Los genes
ribosomales están entre las secuencias diana de DNA más prometedoras ya que en muchos
organismos se encuentran en múltiples copias por genoma y tienen secuencias tanto conservadas
como variables potencialmente permitiendo altos niveles de especificidad (Cahill, 1999).

Se ha demostrado que las regiones ITS de rDNA son generalmente conservadas a nivel de
especie, pero son variables para taxones superiores (Bruns et al., 1991), haciéndolos
particularmente útiles para la identificación de especies. Se ha mostrado que las secuencias ITS
de DNA son altamente variables en muchos hongos (Carbone y Kohn, 1993; Kim, 1992; Lee y
Taylor, 1992; Levesque et al., 1994), así como para G. mosseae (Lloyd-McGlip et al., 1996) y Gi.
Margarita (Lanfranco et al., 1999; Antoniolli et al., 1998). Sin embargo, las secuencias ITS deben
no ser lo suficientemente variables para la distinción a nivel de especie en todos los casos (Turner
et al., 1998). En Glomales, cuando las regiones ITS fueron analizadas con enzimas de restricción
no se pudieron diferenciar aislamientos de la misma especie (Lanfranco et al., 1998). Por esta
razón, es importante tener un completo entendimiento sobre las secuencias ITS para estudiar la
variabilidad genética y para el diseño de sondas moleculares de HMA.

Existe un considerable interés por el desarrollo de técnicas de identificación de DNA para hongos
usando secuencias ITS de rDNA, especialmente con primers de PCR. Las secuencias ITS de
DNA ribosomal fueron utilizadas por Lee et al. (1993) para distinguir cuatro especies de
Phytophthora en un ensayo dot blot y por Levesque et al., (1998) para la identificación de varias
especies de Pythium y Phytophthora cinnamomi. En Glomales, las sondas oligonucleotídicas
específicas para taxones fueron diseñadas para G. mosseae (Millner et al., 1998) y Gi. margarita
(Lanfranco et al., 1999) usando las secuencias de las regiones ITS. Sin embargo, la variación
genética reportada en las regiones ITS para G. mosseae (Lloyd-McGlip et al., 1996; Sanders et
al., 1995) muestra que es necesario un primer robusto específico para especie o primers para la
identificación de diferentes cepas de G.mosseae.

Tecnología de PCR basada en las secuencias ITS podría ser utilizada para identificar HMA a nivel
de especie y para diferenciar entre aislamientos de la misma especie. Más aún, los primers para
PCR de estas regiones podrían permitir la investigación de la diversidad dentro de las raíces, de la
rizósfera y de la cuantificación de éstos hongos.

Métodos de estudio de diversidad de HMA

Los métodos convencionales para estudiar las comunidades y poblaciones naturales de HMA
están basados en la identificación de esporas asexuales provenientes de suelo. La taxonomía de
HMA esta todavía ampliamente basada en caracteres morfológicos de las esporas, con algunas
excepciones (Öpik, 2004).

Los estados de carácter morfológicos cambian durante el curso de desarrollo de las esporas lo
que comúnmente complica la identificación de especimenes en campo. Más aún, la presencia de
esporas en el suelo no siempre coincide con la colonización fungal de raíces, pero la morfología
de las estructuras fungales intraradiculares permite la identificación, en el mejor de los casos,
hasta nivel de familia. Esta identificación tan primaria pone los limites en cuanto al estudio
taxonómico de los HMA (Öpik, 2004).

Un factor importante que afecta los estudios de los hongos micorriticos arbusculares, incluyendo la
taxonomía, es su naturaleza biotrófica obligada; Hasta ahora, no han sido cultivados en ausencia
de un hospedero. Aunque hace falta el cultivo axénico, es posible que crezcan en un cultivo estéril
con raíces de plantas, o con los llamados pelos radiculares transformados con Agrobacterium
rhizogenes (Becard y Fortín, 1988)

Métodos de cultivo de raíces y órganos de micorriza

Raíces del hospedero: Los cultivos de órganos y raíces fueron desarrollados por White y
colaboradores (1999). Estos autores utilizaron raíces extirpadas en un medio mineral sintético
suplementado con vitaminas y una fuente de carbohidratos. Sin embargo el crecimiento profuso
de raíces, caracterizado por la formación de numerosas ramas de bajo orden, ha sido obtenido
con relativamente pocas especies vegetales. La formación de raíces de bajo orden es esencial
para el incremento rápido de la biomasa de raíz y el establecimiento de cultivos continuos (Fortin
et al., 2002).

El trabajo pionero de Mosse y Hepper (1975) utilizo cultivos de raíz obtenidos de Lycopersicum
esculentum y Trifolium pratense para establecer micorrizas in vitro con Glomus mosseae. Los
autores demostraron por primera vez que las esporas del hongo de micorriza arbuscular pudieron
ser exitosamente utilizadas para colonizar raíces extirpadas creciendo en un medio de base
mineral. Luego Strullu y Romand (1986,1987) mostraron que también es posible reestablecer
micorrizas en raíces estirpadas de fresa, cebolla y tomate utilizando la fase intraradicular
(vesículas o pedazos enteros de raíz micorrizal) de muchas especies de Glomus como inoculo
(Fortin et al, 2002).

Daucus carota y Convolvulus sepium estuvieron entre las primeras especies en ser transformadas
utilizando Agrobacterium rhizogenes. Estas raíces transformadas Ri T-DNA han servido desde
entonces en un amplio rango de estudios fundamentales y aplicados. Uno de los más importantes
ha sido el estudio de la simbiosis de micorriza arbuscular. El primer cultivo de pelos radiculares
colonizadas por un hongo de micorriza arbuscular fue logrado por Mugnier y Mosse (1987). Estos
autores colonizaron exitosamente pelos radiculares de Convolvulus sepium utilizando esporas de
G. mosseae pero, como con el caso del cultivo de raíces y órganos de trébol no transformado, no
hubo esporulación.

La primera esporulación in vitro de un hongo de micorriza arbuscular fue obtenida por Bécard y
Fortin (1988) utilizando pelos radiculares de zanahoria colonizados por Glomus intraradices. Las
producción de esporas siguió a las reducciones en la concentración de determinados nutrientes
en el medio de cultivo que permitió evitar la inhibición de la micorriza, pero que no afecto ni el
crecimiento de la raíz ni su desarrollo. Esto, llevo a la producción de cultivos monoaxénicos
reproducibles de G. intraradices que fueron caracterizados por tener grandes cantidades de
micelio y esporas (Diop et al., 1992).

El medio mínimo bajo en minerales (M) y el medio modificado Strullu-Romand (MSR) fueron
exitosamente utilizados para obtener esporulación tanto de hongo como de micorriza utilizando
cultivos de raíces de tomate no transformado. No obstante, las raíces transformadas tienen un
mayor potencial de crecimiento, lo que las hace más adaptables a diferentes condiciones
experimentales, y pueden ser generadas de la mayoría de las plantas dicotiledóneas. Sin
embargo, comparaciones rigurosas entre cultivos de raíces transformados y no transformados
nunca han sido realizados. Tales estudios deberían ser idealmente realizados utilizando raíces del
mismo material vegetal (Fortín et al., 2002).

En la mayoría de los casos 2 tipos de inoculo fungal pueden ser utilizadas para iniciar cultivos
monoxénicos: Esporas extraradicales o propágulos de la fase intraradical del hongo sin embargo,
cultivos de especies de hongo de micorriza arbuscular que no producen vesículas (por ejemplo
Scutellospora y Gigaspora) son sistemáticamente producidos utilizando esporas, las cuales
usualmente son grandes y germinan vigorosamente. Recientemente también han sido utilizados
esporocarpos de G. mosseae en un intento por establecer cultivos in vitro (Fortin et al., 2002).

Las esporas son usualmente colectadas de campo, o de matera por tamizaje húmedo con
muestras de pequeñas cantidades de esporas (decimos o cientos), las esporas pueden ser
escogidas individualmente bajo microscopia, sin embargo para grandes cantidades de esporas se
usa la separación de esporas con gradiente de centrífugación, utilizando sustancias con
concentraciones de glicerol, sucrosa o algún medio de contraste. Las esporas no deben
expuestas por mucho tiempo a estas sustancias (Fortin et al., 2002).

Adaptaciones recientes de estos métodos utilizan cajas de petri en las cuales raíz y hongo son
cultivados juntos en un compartimiento mientras que al micelio externo se le permite ramificarse a
un segúndo compartimiento separado de las raíces (ST-ARNAUD et al., 1996). Números
crecientes de especies de hongos están siendo establecidas en este sistema de cultivo, el cual
esta probando ser útil para estudios del simbionte fungal. Tales sistemas también proveen acceso
a esporas y micelio fungal puros y estériles que son esenciales para análisis moleculares y útiles
para la taxonomía de estos hongos (Chabot et al., 1992).

Análisis moleculares del genoma fungal

Existe un reporte de estructuras sexuales en hongos de micorriza arbuscular, pero permanece no
confirmado (ROSENDAHL & TAYLOR, 1997). Análisis genéticos recientes también sugieren que
los hongos son asexuales y se reproducen clonalmente. Las grandes esporas latentes formadas
por estos hongos son multinucleadas. Los núcleos en esporas quiescentes están detenidos en
fase G0/G1 y aunque los estudios iniciales sugirieron que la replicación del DNA no se llevaba a
cabo sin un hospedero, esto posteriormente se demostró que no era cierto; tanto la replicación del
DNA como la división nuclear ocurren durante el crecimiento inicial del tubo germinal de las hifas,
independientemente de la presencia o ausencia de un hospedero (Becard y Pfeffer, 1993).

Utilizando colorantes nucleares y citometría de flujo, se ha estimado que el contenido de DNA de

los núcleos varia entre 0.13 y 1.0 pg por núcleo para 12 especies examinadas. Análisis de la
composición de bases de nueve especies diferentes de hongos glomaleanos, incluyendo
representantes de 4 géneros, indicaron que los genomas de estos hongos tienen un contenido de
G-C relativamente bajo, promediando 33%, y en contraste con otros taxones fungales, un alto
nivel de Metilcitosina (2.23 – 4.26%), aunque no tan alto como el del genoma de las plantas
(Hosny et al., 1998).

Los primeros genes de hongo de micorriza arbuscular en ser secuenciados fueron los de la
subunidad pequeña del rRNA (SSU) y las regiones de los espaciadores internos de trascripción
(ITS) que fueron targets para análisis filogenéticos. De los datos de la secuencia de SSU fue
posible estimar una fecha para el origen de los hongos de micorriza arbuscular y el tiempo al cual
ocurrió una divergencia posterior dentro del grupo. El origen de los hongos de micorriza arbuscular
fue situado entre hace 462 y 353 millones de años y los hongos ancestrales fueron probablemente
como las especies extintas de Glomus. Las familias Acaulosporaceae y Gigasporaceae
emergieron después y se estimo que divergieron entre ellas hace 250 millones de años (Simón et
al., 1993).

Los datos de las secuencias de SSU e ITS también permitieron el diseño de primers específicos
que, cuando unidos con amplificación por PCR, permitieron la identificación de hongos de
micorriza arbuscular de ambas esporas y dentro de raíces vegetales en situaciones de campo.
Métodos de identificación adicionales basados en DNA fueron aplicados, incluyendo análisis de
amplificación al azar de DNA polimórfico (RAPD). Esto permitió el desarrollo de pares de primers
específicos para un número de especies incluyendo Glomus mosseae, Gigaspora margarita, y
Scutellospora castenea. Estos primers son útiles en estudios taxonómicos y en ensayos de PCR
competitiva para cuantificar la cantidad de hongos dentro de las raíces micorrizales (Harrison,
1999).

Un hallazgo particularmente interesante que surgió durante los análisis moleculares de las
regiones ITS fue la variabilidad en la composición genética dentro y entre esporas de una sola
especie de hongo. Una sola espora puede contener más de una secuencia ITS y esporas
individuales tienen secuencias ITS que difieren de otras esporas de la misma especie. Esta
variabilidad fue posteriormente confirmada por análisis de otros loci. Utilizando marcadores
basados en minisatélites, se observó que la primera generación de esporas que surgieron de
cultivos de una sola espora mostraba un alto nivel de variación, lo que sugiere que las esporas
multinucleadas son heterocarióticas. Parece ser que el reordenamiento de núcleos genéticamente
diferentes provee un mecanismo por el cual estos hongos mantienen la diversidad genética
(Lloyd-Macgilp et al., 1996).

Librerías genómicas preparadas a partir de esporas y librerías de cDNA a partir de esporas y

raíces micorrizales han sido construidas para un número limitado de especies, y los primeros
clones de cDNA representando genes diferentes a los de rRNA han sido identificados. Las
secuencias para gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), β-tubulina, ATPasa, nitrato
reductasa y proteínas de unión de DNA estuvieron entre las primeras en ser reportadas. Aunque
la mayoría de estos han sido considerados genes housekeeping, estos serán marcadores
moleculares útiles para análisis de estos hongos durante el desarrollo de la simbiosis (Harrison,
1999).

Los rasgos morfológicos de las esporas son difíciles de discernir y están sujetos a alteraciones
durante la ontogenia de las esporas y por parasitismo. Los métodos basados en DNA no se
afectan por cambios en los caracteres durante la ontogénesis. Los genes para el rRNA son
secuencias de DNA promisorias en muchos organismos (Redecker et al., 1997).

Redecker en 1997 combino las técnicas de PCR y análisis de RFLPs con el fin de generar
patrones de fragmentos de DNA específicos a partir de extractos de esporas de HMA. Utilizando
los primers universales ITS1-ITS4 los fragmentos de DNA amplificados de las especies de
Scutellospora y Gigaspora fueron de aproximadamente 500 pb. Las longitudes aparentes de los
fragmentos correspondientes de las especies de Glomus variaron entre 580-600 pb. Dentro del
género Glomus, las enzimas de restricción MboI, HinfI y TaqI fueron útiles para distinguir
especies. Dependiendo de las enzimas de restricción usadas, los grupos de especies con
patrones de fragmentos comunes pudieron ser encontrados. Cinco aislamientos tropicales y
subtropicales identificados como Glomus manihotis y G. clarum no pudieron ser diferenciados por
sus patrones de restricción, correspondiendo a la igualdad morfológica de las esporas (Redecker
et al., 1997).

Redecker en el 2000, diseño un grupo de primers para PCR enfocado a 5 grandes subgrupos
filogenéticos de HMA con el fin de facilitar la amplificación de la región ITS y fragmentos del gen
18 S rRNA de raíces colonizadas en ausencia de esporas. Los subgrupos incluyen los linajes de
glomales profundamente divergentes recientemente descubiertos, los que no pudieron ser
detectados por primers para PCR previamente reportados, y el género base Sclerocystis. Los
patrones de RFLPs presentados permiten la identificación de miembros conocidos de estos
grupos. Los productos de PCR resultantes pueden ser utilizados para identificar los simbiontes
fungales a nivel de género o especie por digestiones de restricción o secuenciación de DNA. Un
nuevo método de extracción de DNA permite el control visual de las raíces analizadas por
procedimientos de tinción después del Análisis por PCR (Redecker, 2000)

Área de Estudio

El área de estudio comprendió dos regiones de la Amazonía Colombiana: el sur del trapecio
Amazónico y en San José del Guaviare.

Sur del Trapecio Amazónico

eEl sur del Trapecio Amónico, comprende una extensión de territorio colombiano que soporta la
soberanía nacional entre Brasil y Perú, establecida precisamente en el proceso histórico de
delimitación de fronteras internacionales y de presencia activa en el rió Amazonas, que recorre
116 Km. entre Leticia y San Juan de Atacuari (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

Clima: El régimen de precipitación es de tipo monomodal, es decir, se presenta una temporada

seca y una lluviosa durante el año. El periodo seco tiene lugar en los meses de Julio y Septiembre
y el lluvioso, en términos generales, entre los meses de Octubre y Junio, presentándose los
máximos valores durante el segúndo trimestre del año, con cantidades que están entre 350 y 500
mm, en promedio (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

La temperatura del aire en esta región presenta mínimas variaciones temporales y latitudinales. La
zona selvática es isoterma, con un valor promedio cercano a los 25ºC; Sin embargo, la
distribución de la temperatura a lo largo del año presenta una leve tendencia bimodal al sur del
Ecuador. El mes de mayor temperatura esta entre enero y febrero, con valores promedio que
fluctúan entre 25,2 y 27,6ºC. El mes con temperatura más baja es Julio y en ocasiones Junio, con
cifras que varían entre 23,5 y 24°C (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

El régimen de brillo solar es consistente con la distribución a lo largo del año de la precipitación
pluvial. El valor promedio anual es de 1556 horas, es decir 4,29 horas diarias de brillo solar (IGAC,
1997 citado en Cardona, 2004). La humedad relativa es siempre superior al 75% y depende
principalmente de la temperatura; los valores máximos y mínimos mensuales son casi
coincidentes con los de precipitación.
Geología y geomorfología: La unidad que aflora en el área de estudio se caracteriza por
sedimentos no consolidados, conformado por la formación de pebas (IGAC, 1997 citado en
Cardona, 2004).

La formación de pebas consiste principalmente en lodolitas con estratificación planoparalela, de

color que varia en tonos desde gris oscuro hasta azul turquesa, intercaladas con capas de lignito
de espesores que no alcanzan a superar los 60 cm. Asociadas a estas capas de lignito se
presentan concreciones piríticas y costras ferruginosas. En general, esta formación está
constituida por sedimentos peliticos, con tamaño de grano que varían desde arcilla hasta arenisca
de grano fino, muy calibradas e inmaduras en su textura, lo que refleja un ambiente reductor de
depositación de muy baja energía (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

Los valores iónicos de las aguas y sedimentos que contiene la formación de pebas indican que
esta unidad contiene concentraciones altas de fósforo, calcio, magnesio, sodio, potasio y cloro,
comparadas con las demás aguas y sedimentos de la región. El pH y la conductividad eléctrica
también presentan valores más altos en otras unidades del ares (IGAC, 1997 citado en Cardona,
2004).

Aspectos Fisiográficos y Edafológicos: El gran paisaje dominante del área son las planicies
sedimentarias disectadas pliopleistócenicas amazónicas, ya que recubren más del 60%. Este
paisaje esta conformado por superficies onduladas y fuertemente onduladas, producto de la
disección de una antigua planicie fluvio-marina. Los materiales de origen corresponden a
sedimentos terciarios del mioplioceno, en diferentes ambientes de depositación; los materiales
más comunes son de tipo arcilloso y arcillo-arenoso de la formación de pebas (IGAC, 1997 citado
en Cardona, 2004).

Dentro del área de muestreo se encuentran terrazas antiguas pleistocénicas. Este gran paisaje
fue formado por corrientes antiguas de edad pleistocénica, previas a los ríos actuales. Estas
terrazas corresponden a superficies altas moderadamente disectadas, próximas a los ríos
Caquetá y Amazonas. Su relieve es ligeramente ondulado, con pendientes entre 3 y 15%. Esta
constituido por arenas cuarzosas y arcillas friables de composición caolinitica (IGAC, 1997 citado
en Cardona, 2004).

Las terrazas presentan una topografía supremamente plana y son por lo general mal drenadas,
presentan una extensa sedimentación que recubre gran parte de la Amazonía, que da lugar a una
gran planicie mal drenada con un patrón de drenaje de tipo rectangular y algunas veces con
presencia de lagos ya colmatados. La forma del drenaje en las terrazas. Al igual que en las dos
unidades del terciario Amazónico, puede ser un reflejo de los fracturamientos del basamento, lo
cual indica que este se puede encontrar muy próximo a la superficie (IGAC, 1997 citado en
Cardona, 2004).

Los suelos son rojizos o amarillentos, franco-arcillosos, bien drenados, moderadamente

profundos, limitados por horizontes con abundante arcilla iluvial que restringen la permeabilidad y
aireación. Además son muy ácidos y de fertilidad muy baja. La capa orgánica es delgada y poco
descompuesta, presentando poca humificación en el suelo (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

En el área de estudio los muestreos se realizaron en terrazas y llanuras aluviales. Las terrazas y
llanuras aluviales están constituidas por arenas de tamaño fino a medio, limos y arcillas. Es
abundante la presencia de moscovita fina y las intercalaciones delgadas de turba. Las arenas son
friables y arcillosas, de color blanco a gris pálido y localmente intercalaciones de costras
ferruginosas (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

Las Várzeas son formaciones vegetales que crecen sobre suelos aluviales sujetos a inundaciones
por los ríos de aguas blancas. Es un bosque continuo solo interrumpido por la presencia de lagos.
Una gran porción de sus árboles presentan contrafuertes tabulares y raíces zancos, el dosel
superior es abierto en algunos lugares y el sotobosque es denso y muy rico. Algunos géneros de
árboles presentes son Bombax, Bothriospora, Calycophyllum, Ceiba, Couroupita, Gustavia, Hevea
y Hura (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004).

Uso de la tierra: El tipo de intervención humana que mayor impacto ha causado en esta zona es la
colonización agropecuaria de áreas forestales, debido a la manera indiscriminada y radical de
transformar la cobertura vegetal. Según la clasificación de Etter (1994) citado por IGAC (1997), se
puede afirmar que el tipo de deforestación presente para el área del proyecto es el de superficie
deforestada de muy bajo tamaño, principalmente en forma de parcelas aisladas, manteniéndose la
matriz forestal dominante con presencia de rastrojos y áreas no mayores en potreros.

La producción agrícola corresponde a sistemas de producción indígena, cuyos volúmenes se

destinan fundamentalmente a la subsistencia de los diferentes asentamientos humanos en la
ribera del rió amazonas (IGAC, 1997 citado en Cardona, 2004). Estos sistemas productivos
comprenden dos grandes fases: por una parte, las chagras, en sus diferentes estadios-espaciales
y temporales de horticultura migratoria y, por otra, la extracción y recolección de especies,
conformando un conjunto base del sistema productivo, social, alimentario y cultural de los pueblos
indígenas. En el bosque humanizado o chagra, se utilizan especies de ciclo corto, medio y
perennes, que se destinan a la subsistencia de la familia indígena; algunas especies son
consideradas “tradicionales”. El promedio de extensión por unidad de chagra es de 0.5 ha, razón
por la cual el sistema completo maneja 1.5 ha puesto que cada familia debe tener como mínimo
una chagra en producción, otra en limpieza y una tercera en siembra (IGAC, 1997). Las chagras
son utilizadas durante un periodo que va de 1 a 3 años, después del cual viene el “enrastrojado”,
ciclo de descanso que puede durar generalmente entre 1 y 3 años o más de 5 en algunos casos.
Estos rastrojos son visitados periódicamente para colectar los frutos y son “escudriñados” hasta
que el lugar se limpia de nuevo para una nueva chagra o para que permanezca como un bosque
secundario para la cosecha de especies maderables usadas en la construcción (IGAC, 1997
citado en Cardona, 2004).

En términos generales, la instalación de la chagra sigue un proceso de preparación del suelo que
consiste básicamente en la socola y tumba de bosque, arrimada de materiales y su posterior
quema; se realiza a continuación la siembra de monocultivos de especies semestrales y/o de
asociaciones de especies semestrales, anuales y perennes como policultivo (Figura 4). La chagra
se caracteriza por la no utilización de insumos químicos ni de mecanización (IGAC, 1997 citado en
Cardona, 2004).

Figura 4. Chagra Sur del Trapecio Amazónico

San José del Guaviare

El departamento del Guaviare está localizado al sureste de Colombia; limita al norte con los
departamentos del Meta y del Vichada, de los que es separado por las aguas del río Guaviare; al
oriente con los departamentos del Guainía y del Vaupés; al sur, con éste último departamento y
con el del Caquetá; y al occidente, con los departamentos del Caquetá y del Meta
(http://es.wikipedia.org/wiki/Guaviare_(departamento).

En los territorios del departamento del Guaviare predominan las tierras planas o ligeramente
onduladas, que en su mayoría corresponden a la llanura Amazónica, salvo los terrenos del norte,
que hacen parte de los Llanos Orientales. Algunos sistemas montañosos sobresalen y entre ellos
están las sierras de Chibiriquete, San José y Tunahí y los cerros Campana y Otare, con alturas
cercanas a los 800 M.S.N.M. Por su conformación topográfica, los terrenos en su mayoría
presentan el piso térmico cálido y su clima es de transición entre el de la sabana periódicamente
húmedo de la Orinoquía y el súper húmedo de la selva ecuatorial del Amazonas, encontrándose
una época seca en los meses de diciembre a marzo, y otra lluviosa en el resto del año, la que
oscila entre los 2.000 y los 3.500 mm de precipitación anual
(http://es.wikipedia.org/wiki/Guaviare_(departamento).

Sus suelos son bañados por numerosos ríos, divididos principalmente en dos cuencas: la primera,
al norte, correspondiente a las aguas que van al Orinoco, que naciendo en la cordillera, presentan
aguas "blancas" o "amarillas", ricos en nutrientes minerales y en pesca, destacándose los ríos
Guaviare, Guayabero e Inírida; y la segunda, que lleva su caudal al Amazonas, naciente en las
selvas y por ello sus aguas son "negras" o "cristalinas", con bajo contenido de nutrientes
minerales y poca pesca, en la que sobresalen los ríos Apaporis, Itilla, Tunía o Macayá, Unilla y
Vaupés (http://es.wikipedia.org/wiki/Guaviare_(departamento).

Desde la época prehispánica los territorios actuales del departamento del Guaviare, han estado
ocupados por indígenas guahíbos y guayaberos de la familia lingüística guahibo, cubeos, desanos
y tucanos del grupo tukano, y carijonas, de la familia caribe
(http://es.wikipedia.org/wiki/Guaviare_(departamento).

La explotación de los suelos del actual departamento del Guaviare ha estado siempre ligada a
procesos de colonización desde finales del siglo XIX, con diferentes motivos, todos encaminados
a encontrar una rápida y "fácil" riqueza: primero fue la balata; luego, el caucho, después, las
tigrilladas y el comercio de pieles de animales salvajes; más adelante, la venta de plantas
parásitas originarias de la región y de peces ornamentales; y por último, el cultivo ilícito de la coca
(http://es.wikipedia.org/wiki/Guaviare_(departamento).

La economía del departamento del Guaviare gira alrededor del sector agropecuario. Son sus
renglones legales más importantes, los servicios, la explotación forestal, la pesca, y en los últimos
años, la ganadería y la agricultura, las que han tenido un gran impulso. Por lo anterior se han
diseñado sistemas como la agroforestería. Es el nombre colectivo para designar los sistemas de
uso del suelo, en donde se asocian las leñosas perennes (árboles, arbustos, bambúes) con los
cultivos agrícolas y y/o animales, en un arreglo espacial con rotación o ambos y en los cuales se
dan interacciones ecológicas y económicas entre los componentes arbóreos del sistema (Figura 5)

Figura 5. Arreglo Agroforestal

de San Jose del Guaviare

Antecedentes
del estudio

En el laboratorio de suelos del Instituto SINCHI-Sede Leticia, a través del proyecto

“Mantenimiento de la fertilidad del suelo y generación de tecnologías para la recuperación de
áreas degradadas en la Amazonía Colombiana” desarrollaron un trabajo dedicado a evaluar la
simbiosis micorriza arbuscular de esta zona (Peña et al, 2006).

La colecta de muestras se realizó a partir de muestras de suelo rizosférico y en algunos casos

raíces de plantas de interés, para verificar la presencia de la simbiosis (Peña et al, 2006).
En los laboratorios del Instituto SINCHI en Bogota y Leticia se realizaron los aislamientos,
cuantificación y descripción de esporas de HMA. Las esporas fueron cuantificadas y separadas
por morfotipos para determinar la riqueza de HMA como un estimativo de la abundancia y
diversidad de sus poblaciones. Los morfotipos fueron separados a partir del reconocimiento de
parámetros morfológicos de las esporas usados en taxonomía de Glomales como el color,
tamaño, forma de las esporas, las características de sus paredes (grosor, color, presencia de
ornamentaciones y reacción Melzer) siguiendo la denominación y representación sugerida por
Walker (1983), presencia de célula suspensoria y conexión hifal. Para el estudio de las
características morfológicas, las esporas se montaron en lactoglicerina, polivinil-lactoglicerina
(PVLG) y PVLG+Melzer (1:1 v/v). El color fue determinado usando la tabla de color para suelos
Munsell (Peña et al, 2006). Se diseño una base de datos en ACCESS para organizar la
información obtenida en campo y laboratorio (Peña et al, 2006).

En suelos arenosos y arcillosos del municipio del Mitú se evaluó la presencia de MA, bajo
diferentes coberturas vegetales (bosque, chagra indígena y pastizales); la mayor ocurrencia de
hongos formadores de MA se reporto en el pasto braquiaria, reportándose como un hospedero
importante de la asociación (Benavides y Arcos, 1996).

En zonas aledañas a San José del Guaviare se realizó un reconocimiento de hongos formadores
de MA asociados a especies de cacao (Theobroma) y se concluyó que las especies de micorriza
presentaron afinidad con las condiciones físico-químicas del suelo y no hubo especificidad con el
hospedero (Ochoa, 1997 citado en Arcos, 2000).

En el año 2000 Cardona, G, evaluó ocurrencia y colonización micorrítica asociada a las especies
de Capsicum spp en la amazonía Colombiana. La ocurrencia de la simbiosis se evaluó en
función a los parámetros de porcentaje de colonización micorrítica, número de propágulos
infectivos encontrados en la rizósfera y su relación con algunas características físico químicas del
suelo. Además se contribuyó con una caracterización preliminar de 10 morfotipos de esporas
encontrados en las rizósferas evaluadas. Todas las accesiones del género Capsicum evaluadas
reportaron simbiosis con hongos formadores de micorriza arbuscular, sin embargo presentaron
diferencias estadísticamente significativas en su ocurrencia, las cuales pueden deberse a las
características físico – químicas de los suelos, a la fuente de colecta (manejo agronómico del sitio
en donde se encontró la accesión) y al grado de dependencia micorrítica de las diferentes
especies del género Capsicum bajo condiciones naturales diferentes.

Redecker en el 2000 diseño un set de primers genero-específicos para la identificación de los

glomales entre los que se encuentran los géneros Glomus, Acaulospora, Gigaspora y
Archaeospora. De los productos de la amplificación con estos primers se realizaron Análisis de
RFLPs usando enzimas de restricción. De acuerdo a los patrones obtenidos se secuenciaron
estos productos. Con base a este artículo, se diseñó la metodología a seguir en el presente
trabajo de investigación.
 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Formulación del problema

La Amazonía Colombiana representa un invaluable patrimonio de recursos genéticos que deben

ser explorados. Una de las funciones que el instituto Sinchi tiene es la de realizar los inventarios
de flora y fauna de la Amazonía Colombiana, en donde se incluye el estudio de los
microorganismos. Hasta la fecha, por medio de la utilización de características morfológicas se
han podido caracterizar hasta 18 especies de los 31 morfotipos de hongos de micorriza arbuscular
colectados en esta región. Para el caso concreto de los hongos formadores de micorrizas
arbusculares, no existen claves actualizadas o completas que permitan identificar claramente los
organismos colectados en la naturaleza. Es aún más difícil esta tarea si se trabaja en zonas
altamente diversas y poco estudiadas como la Amazonía.

Justificación

Las herramientas moleculares se pueden emplear como método para incluir o excluir individuos
en un grupo. Es una de las metodologías que hoy en día tiende a ser más empleada en el estudio
taxonómico de hongos, incluyendo los Glomales. Debido a los costos de estos estudios
moleculares para incluirlos de rutina, estos se usan como complemento cuando el estudio
morfológico de las especies no es suficiente para hacer confirmación de género o especie.
Además las técnicas moleculares son adecuadas para realizar estudios filogenéticos y ecológicos.

El desarrollo de un protocolo molecular para el estudio de una población micorrítica nativa y la

aplicación del mismo es una alternativa para mejorar la descripción de los morfotipos encontrados
en esta región. También es útil para verificar las determinaciones por técnicas tradicionales y así
poder determinar si existen nuevas especies para la ciencia y tener estandarizada una
metodología para apoyar las diferentes determinaciones que se requieran con este grupo de
hongos.
 OBJETIVOS

Objetivo General

Caracterizar la población micorrítica presente en raíces de plantas de yuca (Manihot sculenta)

colectadas de dos regiones de la Amazonía Colombiana.

Objetivos Específicos

1. Evaluar la presencia de la simbiosis micorriza arbuscular en dos regiones de la Amazonía

colombiana a partir de la evaluación del porcentaje de colonización radicular en yuca, el
número de esporas presente en la rizósfera de la planta y su respectiva caracterización
morfológica determinando la riqueza de morfotipos presentes.
2. Correlacionar los resultados de colonización radicular, abundancia de esporas y riqueza de
morfotipos con las características fisicoquímicas del suelo.
3. Estandarizar un protocolo para la determinación taxonómica de Glomales con base en el
aislamiento de DNA fúngico a partir de raíces colonizadas y la amplificación de la región
ITS del rDNA.
4. Analizar las regiones ITS obtenidas para identificar polimorfismos y comparar las
respectivas secuencias de nucleótidos, que permitan obtener información sobre la riqueza
de especies de Glomales en las áreas muestreadas.
 MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo

El presente trabajo se desarrolló en el laboratorio de Biotecnología del Instituto de Investigaciones

Científicas de la Amazonía SINCHI en Bogotá D.C.

Se evaluaron 12 muestras de suelo rizosférico y raíces de yuca colectadas en el sur del Trapecio
Amazónico en los kilómetros 11 y 14 vía Tarapacá bajo el paisaje de chagra en terraza y chagra
en llanura luvial (6 muestras; 3 en cada paisaje) y en San José de Guaviare en 6 arreglos
agroforestales (figuras 6 y 7).

Los datos correspondientes a algunas características encontradas en los sitios de muestreo se

encuentran en la tabla 1.

Figura 6. Área de muestreo- Sur del Trapecio Amazónico Colombiano

 Figura 7. Área de muestreo de San José del Guaviare

Tabla 1. Características de cultivos presentes en los lugares de muestreo.

área de Muestra Edad Especies presentes Especie

muestreo del estudiada
cultivo
CHTR1 10 Yuca brava y dulce, plátano, maíz, ají, Manihot
meses ñame, caña de azúcar y coca esculenta
CTRA. 2 años Lulo, yuca, coca, plátano, piña, caña, Manihot
yarumo, cocona, canangucho esculenta
CHTR3 2 años Piña, yuca, plátano, marañón, umarí, Manihot
Sur del canangucho, asaí, mil pesos, caña y esculenta
trapecio coca
amazónico CHVR1 2 años Monocultivo de Yuca (yuca vega y Manihot
brava) esculenta
CHVR2 6 años Monocultivo de Yuca (yuca vega, Manihot
morada y brava) esculenta
CHVR3 7 años Yuca y plátano Manihot
esculenta
A.AF 2 4 años Abarco, Achapo, Caruto, Cuyubi y P. Manihot
arco esculenta
A.AF 4 7 años Abarco, Araza, Borojo, Champa, Manihot
Chontaduro, Cuyubi y Macano esculenta
A.AF 7 5 años Abarco, Anon, Araza, Borojo, Brasil, Manihot
San José Chontaduro y P. arco esculenta
del A.AF 8 5 años Brasil, Caruto, Carapa, Cedromacho, Manihot
Guaviare Cuyubi, P. arco, Vochysia esculenta
A.AF 10 5 años Abarco, Brasil, Caruto, Macano y P. Manihot
arco esculenta
A.AF 13 4 años Abarco, Achapo, Brasil, Cuyubi, Manihot
Macano, Milpo y Juan soco. esculenta

Muestreo de raíces

Se colectaron raíces y pelos absorbentes de yuca cultivada en chagras y arreglos

agroforestales en el sur del trapecio amazónico y San José de Guaviare, respectivamente. El
muestreo se realizó seleccionando plantas al azar en cada uno de los sitios seleccionados.
 Una vez en el laboratorio, las raíces de las plantas se lavaron con suficiente agua y se
almacenaron a 4ºC para su posterior tinción y evaluación.

Muestreo de suelo

Las muestras de suelo (1 Kg.) se tomaron simultáneamente con las raíces. Tomando muestras
de la rizósfera de la planta, a una profundidad entre 0-20 cm. en forma de "W" (figura 8). Las
muestras obtenidas en los diferentes puntos se mezclaron y homogenizaron completamente
(www.turipana.org.co/micorrizas.htm). Cada muestra de suelo fue procesada para aislar las
esporas nativas y fueron remitidas al laboratorio de suelos del Instituto Geográfico Agustín
Codazzi (IGAC) para su respectivo análisis químico (Q-01), el cuál comprende: pH, textura,
CIC (capacidad de intercambio catiónico), contenidos de fósforo, aluminio, potasio y materia
orgánica, etc.

Figura 8. Tipos de muestreos empleados en campo (www.turipana.org.co/micorrizas.htm

Material Biológico

Seis muestras de suelo rizosférico y raíces secundarias de yuca colectadas en chagras bajo dos
paisajes (3 muestras en chagra terraza y 3 en chagra varzéa) en el Sur del trapecio amazónico y
6 muestras bajo arreglos agroforestales en San José del Guaviare. Estas muestras se secaron
con el fin de disminuir la degradación de las esporas por exceso de humedad y almacenaron a
4°C hasta su utilización.
Iniciadores para PCR

Para la amplificación de la región ITS se utilizaron combinaciones de primers que han sido útiles
en previos estudios sobre identificación molecular de hongos formadores de micorriza arbuscular
(Redecker, 2000) (Tabla 2).

Tabla 2. Secuencias de iniciadores

PRIMER SECUENCIA
ARCH 1311 TGC TAA ATA GCC AGG CTG Y
ITS4 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC
ITSIF CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A
GLOM 5.8 R TCC GTT GTT GAA AGT GAT C
LETC 1670 GAT CGG CGA TCG GTG AGT
ACAU 1660 TGA GAC TCT CGG ATC GG
GIGA 5.8R ACT GAC CCT CAA GCA KGT G
NS5 AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G

Métodos

Tinción de raíces (Philips & Hayman 1970)

Las raíces frescas de yuca se sumergieron en KOH 10% y se calentaron a 90ºC por 1hora.
Como las raíces que se procesaron contenían muchos taninos se realizó un paso adicional de
clareo con una solución fresca de KOH 10% más H2O2 10% (v/v) hasta que se aclararon.
Posteriormente se
Lavó con agua. Se acidificaron con HCl 1% por 15 min y se tiñeron con azul de tripano al
0.05% a 90ºC por 10 minutos (Figura 9). Se retiró el colorante, se lavó y se dejó reposar toda
la noche en lactoglicerol puro. Al día siguiente se montaron las láminas. Montando 3 réplicas
por muestra, cada una de 10 fragmentos de raíz.
 Figura 9. Proceso de Tinción de Raíces (www.turipana.org.co/micorrizas.htm)

Determinación del porcentaje de colonización

Montaje en portaobjetos. Se colocaron las raíces clareadas y teñidas en cajas de petri con
suficiente lactoglicerol. En un portaobjetos y con agujas de disección, se colocaron 10
segmentos de aproximadamente 1 cm, en forma paralela. Sobre las raíces se adicionó gotas
de lactoglicerol colocando los cubreobjetos, se eliminaron las burbujas y cada laminilla se selló
con esmalte. Para realizar la evaluación se observó al microscopio con el aumento de 100X,
se efectuaron tres pasajes equidistantes por laminilla (Figura 10).

Al revisar un campo óptico donde se encuentra un segmento que contiene hifas, vesículas
y/o arbusculos, independientemente de la intensidad de la micorrización se da el valor de 1
para la evaluación total y por estructuras.

Figura 10. Determinación del porcentaje de colonización (www.turipana.org.co/micorrizas.htm)

 El porcentaje de colonización endomicorrítica por estructuras y total, se obtuvo mediante las
siguientes fórmulas

# De segmentos colonizados
Porcentaje de colonización total = --------------------------------------- X 100
# De segmentos totales

# De segmentos con vesículas

Porcentaje de colonización por vesículas = -------------------------------------------- X 100
# De segmentos totales

# De segmentos con arbusculos

Porcentaje de colonización por arbusculos = --------------------------------------------- X 100
# De segmentos totales

Extracción de esporas

Se pesó 10 g de suelo rizosférico y se dejó en remojo en agua durante 30 minutos, se agitó

fuertemente y se vertió sobre los tamices del mayor al menor tamaño de poros. Se colectó la
fracción más fina en tubos de centrífuga y se adicionó, con la ayuda de una jeringa, sucrosa
50% (p/v) en el fondo del tubo. Se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos (Figura 11). El
sobrenadante se vertió sobre el tamiz más fino y se lavó con abundante agua para retirar la
sucrosa. Lo colectado en el tamiz se colocó en una caja de petri con papel filtro marcado con
una cuadrícula de 0.5 cm para el conteo (Figura 12).

Figura 11. Aislamiento de esporas (www.turipana.org.co/micorrizas.htm)

 Figura 12. Recuento de esporas (www.turipana.org.co/micorrizas.htm)

# De esporas contadas (100 g de suelo seco)

Número de esporas en 100g de suelo seco = ----------------------------------------------------------
100 g de suelo

Evaluación morfológica de las esporas

Los morfotipos encontrados en los aislamientos de los suelos rizosféricos fueron separados a
partir del reconocimiento de parámetros morfológicos de las esporas usados en la taxonomía
de los glomales, como el color, tamaño, forma de las esporas, las características de sus
paredes (grosor, color, presencia de ornamentaciones y reacción de Melzer), presencia de
célula suspensoria y conexión hifal. Para el estudio de las características morfológicas, las
esporas se montaron en PVLG (Polivinillactoglicerol). El color fue determinado usando la tabla
de color para suelos de Munsell. La evaluación de todas estas características se realizó de
acuerdo a los parámetros usados en el catalogo ilustrado Micorrizas Arbusculares de la
Amazonía Colombiana (Peña, et al., 2006).

Extracción de DNA
Inicialmente se usaron metodologías para el aislamiento de DNA a partir de esporas
multiplicadas en cultivos axénicos de controles positivos con Glomus manihotis, Scutellospora
fulgida y Acaulospora denticulada multiplicadas. En total se evaluaron 14 protocolos
propuestos por: Sanders & Kathleen (1995), Redecker & Thierfelder (1997), Manian et al.
(2001), Dibonito et al. (1995), Tuinen & Jacquot (1998), Gadkar & Rillig (2005), Dodd et al.
(1996), Kowalchuk, et al., , De Souza & Van Veen (2002), Öpik (20, Kit ultraclean DNA soil,
Procedimiento utilizado por Francisco A De Souza (Brasil) para 1 espora, Procedimiento
utilizado por Francisco A De Souza (Brasil) 10-60 esporas y método de extracción CTAB
(Anexo 1) (Anexo 1).

Considerando que la extracción a partir de esporas no fue exitosa se procedió a realizar la

extracción del DNA a partir de raíces colonizadas por hongos de micorriza arbuscular, se
probaron 4 protocolos de extracción descritos a continuación:

1. Redecker, 2000.

Se empleó aproximadamente 1-2 cm de raííes de plantas colonizadas, las cuales fueron

cortadas en piezas de 1mm con una cuchilla de hoja. Las raíces fueron transferidas a
tubos estéerles de 1.5 ml y se adicionó inmediatamente 20 µl de NaOH (0.25 M) se
incubóo 90°C por 10 minutos. Finalmente se adicionóo 10µl de TrisHCl 0.5M y 20 µl de
HCl 0.25N. La mezcla de extracción se incubóo pr 10 minutos más. El sobrenadante fue
separado por centrifugación, diluido 1:100 en buffer TE y usado para PCR.

2. Stukenbrock y Rosendahl, 2005

Pedazos de raíz fueron macerados en tubos eppendorf de 0.5 ml en buffer TE usando un

micropistilo plástico. Para la extracción de DNA las muestras fueron denaturadas por 2
minutos a 95°C en presencia de 20 µl de Chelex 100 al 20% (Biorad®). Las muestras
fueron mezcladas en un vortex y centrífugadas a 10000g a 4°C por 5 minutos. 5 microl
sobrenadante fueron recuperados y diluidos 100 veces en 500 µl de agua estéril.

3 Annette y Pringle, 2005

De cada planta 3 puntas de raiz fueron Se clanta con una longitud aproximada de entre 1 y
3 cm. Las puntas de raíz se colocaronfueron puestas en 300 µl de buffer CTAB (100 m),
1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% CTAB cetyltrimethyl ammonium bromide). Las muestras
permanecieron en CTAB por 2 semanas a temperatura ambiente. El DNA genómico fue
aislado a partir de un subgrupo de muestras de raíz por derretimiento en frió,por
maceración en presencia dido y con poxtracción con clroformodespués a través de una
 extracción simple por cloroformo..

4. Se utilizó el kit “Ultraclean soil DNA Isolation Kit, MOBIO” según las instrucciones del
fabricante.

Amplificación de la región ITS

La amplificación de la región ITS a partir de DNA de raíz se realizó de acuerdo a la metodología

propuesta por Redecker 2000 (Figura 13).

Las reacciones de PCR se dividieron en 2 pasos: El primero consistió en una PCR general con
primers universales y el segundo paso fue una PCR anidada utilizando combinaciones de
primers específicos con primers universales y tomando como plantilla el producto de
amplificación de la primera PCR.

Figura 13. Representaciones esquemáticas de los genes rRNA con sitios de anillamiento de los primers
(Redecker, 2000).

La PCR general fue realizada utilizando el mix de dNTP's a una concentración de 0.2 mM, los
primers ITS4/NS5 cada uno a una concentración final 0.2 µM, 1 U de taq polimerasa/µl, el buffer
de reacción a una concentración de 1X y la concentración de MgCl2 fue ajustada a 1.5 mM.

La reacción se llevó a cabo en un termociclador PT 100 (MJ Research Inc) comosigue:

 Denaturación inicial a 95º.C. por 3 minutos
 5 Ciclos: 95ºC por 30 segundos; 52ºC por 30 segundos ; 72ºC por 1 minuto y medio
 25 ciclos: 95ºC por 30 segundo ;51ºC por 30 segundos ;72ºC por 1 minuto y medio
 Extensión final a 72ºC por 10 minutos.

A partir de los productos obtenidos de la PCR general se realizó la PCR anidada. Cuando las
bandas en el gel de agarosa no eran visibles se realizó una dilución 1/100 Para las bandas
visibles se realizó una dilución 1:1000 y en bandas muy fuertes 1:10000, según lo recomendado
por Redecker (2000).

Las combinaciones de primers de las reacciones de PCR anidada fueron las siguientes:
 ITS1F/ GLOM 5.8 R
 ITS1F/ GIGA 5.8R
 ITS4/ ACAU 1660
 ITS4/ ARCH 1311
 ITS4/ LETC 1670

Las reacciones de PCR anidada fueron realizadas utilizando el mix de dNTP's 0.2 mM, los
primers anteriormente mencionados cada uno a una concentración de 0.2 µM, 1 U de taq
polimerasa/µl, el buffer de reacción a una concentración de 1X y la concentración de MgCl2 fue
ajustada a 1.5 mM.

Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador PT 100 (MJ Research Inc) marca como
sigue a continuación:
 Denaturación inicial a 95ºC por 3 minutos
 5 Ciclos: 95°C por 30 segundos; 61ºC por 30 segundos ; 72ºC por 1 minuto y medio
 25 ciclos: 95ºC por 30 segundos ;60ºC por 30 segundos ;72ºC por 1 minuto y medio
 Extensión final a 72°C por 10 minutos.

Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% con
buffer TBE 1X.

Purificación de los productos PCR

Los productos obtenidos fueron purificados utilizando el kit “Concert Matrix Gel Extraction System”
(Gibco BRL Life Technologies) mediante la elución de la banda, según las instrucciones del
fabricante.
Clonación

Considerando que el DNA extraído corresponde a DNA comunitario, fue necesario separar las
mezclas de genes ribosomales presentes en cada muestra con el fin de obtener clones
individuales con el inserto de interés. Para tal fin, 4 µl del producto PCR amplificado y purificado
fue clonado dentro del vector pCR2.1 (Invitrogen, CA, USA), transformando células de E.coli cepa
DH5-α químicamente competentes con 6 µl de la mezcla de ligación, siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las colonias transformadas con el inserto de interés serán seleccionadas con base
en la presencia de una coloración blanca consecuencia de la interrupción del gen de la
βgalactosidasa. La selección se realizará en medio LBA con Kanamicina y el sustrato X-gal. De
cada una de las muestras evaluadas, se tomaron todas las colonias transformadas de color blanco
y se plaquearon en medio LB + kanamycina a una concentración de (50µg/ml-1). El inserto de
interés ~200 pb + 200 pb del vector TOPO con el primer GLOM 5.8R y ~300 pb + 200 pb del
vector TOPO con el primer GIGA 5.8R se verificó, aislando el DNA plasmídico con el método de
miniprep y amplificando los insertos de interés con la combinación de primers M13F y M13R. El
tamaño del producto de amplificación se verificó en gel de agarosa ultrafina de Invitrogen al 1.5%
y se tiñó con bromuro de etidio
…

Análisis de restricción de DNA ribosomal (ARDRA)

A partir de los amplificados con el inserto de interés se realizó un Análisis de ARDRA con las
enzimas Hinf I (GIBCO BRL) y Taq I de Invitrogen. ada del producto PCR fueron digeridos con 5
U de las enzimas de restricción: Hinf I y Taq I (GIBCO BRL), en el buffer de reacción apropiado y
en un volumen final de 20 µl. Las digestiones fueron incubadas a 37ºC por 1 hora para Hinf I y a
65°C por 1 hora para Taq I, según las recomendaciones del fabricante. Todas las incubaciones se
llevaron a cabo en un recirculador (VWR Scientific Products). Las enzimas utilizadas y su sitio de
corte se encuentran en la tabla 3.

Tabla 3. Enzimas de restricción usadas en los ensayos de ARDRA de los amplificados de HMA.
Enzima Sitio de restricción
Hinf I 5’-G↓ANTC-3’
Taq I 5’T↓CG A-3’

Visualización de los productos y lectura de patrones de restricción.

Los productos de restricción se separaron en geles de agarosa ultrapura (invitrogen) a una

concentración del 2.5% en buffer TAE 1X con 0.5 µg/ ml e bromuro de etidio. La electroforesis se
llevóo a abo en cáamar de electroforesis WIDE Mini-Sub Cell GT Bio-Rad® a 80V por 1.5 h y una
fuente de poder Power Pac 300 Bio-Rad. Se montaron 20 µl de la digestión con 2 µl de buffer de
carga Blue Juice 6X. En los carriles finales de cada gel, se incluyeron los marcadores de peso
molecular de 50 pb (Invitrogen) y 100 pb (Ready Load ladder Invitrogen).

Para el Análisis de los patrones se generó una imagen digitalizada del gel en un equipo Gel Doc
1000 de Bio-Rad conectado a un computador y se analizó con el sofware Molecular Analyst
(versión 1.5 Bio-Rad). Ce establecieron los patrones de bandas para cada una de las enzimas y
se elaboróo una matriz de presencia/ausncia (unos y ceros) de bandas que presentaba cada
muestra. Los pesos moleculares de cada banda se determinaron por medio del programa
Molecular Weight Determination del Software Molecular Analyst (Versión 1.5 Bio-Rad) teniendo
como referencia los pesos moleculares de los marcadores 50 pb y 100 pb (Invitrogen). Con la
información de la matriz básica se construyó la matriz de similitud genética utilizando el índice de
Dice a partir de la cual se realizó el análisis de agrupamiento UPGMA Sigla y el correspondiente
denma (Frguson, 1980)a región ITS

Secuenciación

La selección de los clones a secuenciar se hizo en base a los patrones únicos de ARDRA
generados con la combinación de ambas enzimas. A los clones seleccionados se les extrajo el
DNA plasmídico con el Kit “Quick plasmid miniprep” (Invitrogen, CA, USA) y se enviaron a
secuenciar a MACROGEN Korea.
 RESULTADOS

Porcentaje de colonización

Se determinó el porcentaje de colonización total, por vesículas y por arbusculos de cada una de
las muestras a partir de 100 intersecciones, dando el valor de 1 a cada campo colonizado para un
total del 100 %. Los datos sobredporcentajes de colonización se encuentran en la tabla 4.

Tabla 4. Porcentaje de colonización de HMA en raíces de yuca.

Lugar de Muestra % colonización % colonización por % colonización
muestreo total vesículas por arbusculos
CHTR1 40 % 10% 30%
CHTR2 60% 20% 40%
CHTR3 70% 20% 50%
Sur del
CHVR1 60% 0% 60%
Trapecio CHVR2 55% 0% 55%
Amazónico CHVR3 60% 5% 55%
A. AF 10 88% 10% 78%
A. AF 13 80% 20% 60%
A, AF 7 85% 30% 55%
San José
A. AF 2 70% 15% 55%
del A. AF 4 68% 20% 48%
Guaviare A. AF 8 74% 19% 55%

CHTR: Chagra Terraza Replica; CHVR: Chagra llanura aluvial Replica; A. AF: Arreglo Agroforestal

Todas las raíces de yuca evaluadas reportaron colonización por estructuras de hongos MA (hifas,
arbusculos y vesículas), evidenciando un mayor porcentaje de colonización total en las muestras
provenientes de San José del Guaviare (77, 5%) con respecto a las del Sur del Trapecio
Amazónico (57,5%) (Figura 14). En cuanto al porcentaje de colonización por vesículas y
arbusculos se observó en general que fue mayr el obtenido por arbusculos (Figura 15). El
porcentaje de colonización de HMA por vesículas fue menor en las muestras del Sur del Trapecio
Amazónico que las de Sn Josée del Guaviare. Se, obseróándoseue en las as del Sur del
Trapecio Amazóonico que correponden a chagra llanura aluvial no hubo colonización por parte de
estas estructuras.
 PORCENTAJE DE COLONIZACIÒN TOTAL
DE HMA EN Manihot esculenta

100%

% de colonizaciòn
80%
60%
Serie1
40%
20%
0%
CHTR1

CHTR3
CHTR2

CHVR1
CHVR2
CHVR3
A. AF 10
A. AF 13
A, AF 7

A. AF 4
A. AF 2

A. AF 8
Figura 14. Porcentaje de colonización total de HMA en yuca en el sur del trapecio Amazónico y San José
del Guaviare

PORCENTAJE DE COLONIZACION DE HMA POR

ARBUSCULOS Y VESICULAS

90%
80% % De colonizacion por
70% de HMA por vesiculas
60% % De colonizacion de
50% HMA por arbusculos
40%
30%
20%
10%
0%
1

9
0

A. 3

F 4
A. 2
A. 7
TR

TR

TR

VR

VR

VR

1
F1

y
F

F
F

8
A

A
H

A
A
C

A.
A.

A
A.

Figura 15. Porcentaje de colonización de HMA por arbusculos y vesículas en Manihot esculenta en el sur
del trapecio Amazónico y San José del Guaviare

Recuento de esporas

Se realizaron 3 recuentos consecutivos de esporas a partir de 100g de suelo de cada una de las
muestras. Los resultados se encuentran en la tabla numero 5.
Tabla 5. Recuento de esporas a partir de 100g de suelo rizosférico
Lugar de Muestra Primer Segundo Tercer Promedio
muestreo recuento Recuento Recuento
CHTR1 280 330 350 320
CHTR2 180 150 140 157
Sur del
CHTR3 380 410 420 403
Trapecio CHVR1 180 220 240 213
Amazónico CHVR2 180 150 160 163
CHVR3 100 60 75 78
A. AF 10 370 348 385 368
A. AF13 740 800 765 768
San José
A. AF 7 400 389 416 402
del A. AF 2 670 628 690 663
Guaviare A. AF 4 220 195 239 218
A. AF 8 900 840 872 871
CHTR: Chagra Terraza Replica; CHVR: Chagra Llanura aluvial Replica; A. AF: Arreglo Agroforestal

Todos los suelos rizosféricos analizados eportaron propágulos infectivos de hongos de micorriza;
el número más alto de esporas se encontró en la muestra correspondiente al arreglo agroforestal
8 on un valor de 871 esporas/100g de suelo seco,. sSeguido porlasmuestras de los arreglos
agroforestales 3 y 2 con 768 y 663 poras/100 g de suelo, espectivament. La muestra con menor
número de esporas fue CHVR3 con 78 esporas/100g de suelo, seguida por CHTR2 y CHVR2 con
157 y 163 esporas/100g de suelo rizosférico respectivamente, correspondientes al muestreo de
chagra en el sur del trapecio Amazónico (Figura 16)

RECUENTO DE ESPORAS DE HM A EN SUELO

RIZOSFERICO DE Manihot esculenta
1000
800
600
400
200
0
C 1

C 2
3

C 1

C 2
3
10

13

9
TR

TR
TR

VR

VR

VR

y
H

8
H

H
C

MUESTRA

Figura 16. Recuento de esporas de HMA en suelo rizosférico de Manihot esculenta en el sur del trapecio
Amazónico y San José del Guaviare

Análisis Fisicoquímicos

Los datos de los análisis fisicoquímicos de las muestras, se resumen en la tabla 6.

Tabla 6. Análisis fisicoquímico de las 12 muras de suelo rizosférico del sur del trapecio Amazóonicoy San
José del Guaviare.

Muestra Textura pH A.I S.A.I C.O% CIC Ca Mg k Na P

%
CHTR1 Franco 3.7 4.2 83.6
2.2 11.2 0.31 0.26 0.18 0.07 5.5
Arcilloso
CHTR2 Franco 3.6 9.6 77.8 1.4 17.4 1.7 0.65 0.26 0.10 3.0
arcilloso
limoso
CHTR3 Franco 3.4 3.8 85.1 2.1 9.2 0.13 0.14 0.14 0.25 14.4
Arenoso
CHVR1 Arcilloso 4.0 16.9 82.5 2.6 40.5 1.9 1.2 0.29 0.23 3.0
CHVR2 Arcilloso 3.8 15.1 86.0 5.4 46.4 1.7 0.45 0.26 0.01 19.8
CHVR3 Arcilloso 4.2 8.7 55.8 4 33.8 4.7 1.4 0.75 0.08 33.1
A.AF 10 Franco 3.64 1.74 80.9 1.35 7.10 0.08 0.12 0.11 0.10 5.51
Arenoso
A.AF13 Franco 4.05 4.67 76.1 2.62 25.52 0.87 0.77 0.35 0.09 0.61
Arcilloso
A.AF 7 Arenoso 5.00 0.09 49.8 1.33 7.66 2.38 0.57 0.20 0.07 5.51
Franco
A.AF 2 Franco 4.05 4.67 69.2 2.62 25.52 0.87 0.77 0.35 0.09 0.61
Arcilloso
A.AF 4 Arenoso 4.21 1.09 70.8 1.52 7.65 0.15 0.12 0.12 0.06 3.02
Franco
A.AF8 Franco 4.56 1.14 2.7 1.84 11.41 2.30 0.58 0.24 0.05 4.25
CHTR: Chagra Terraza Replica; CHVR: Chagra Llanura aluvial Replica; A. AF: Arreglo Agroforestal.
A.I: Acidez intercambiable; S.A.I: Porcentaje saturación acidez intercambiable; C.O%; Porcentaje de Carbón Orgánico;
CIC: Capacidad de intercambio cationico.

En las muestras de chagra terraza, colectadas en el sur del trapecio Amazónico se observó que la
clase textural de las 3 muestras fue diferente; con suelos (franco arcilloso, franco arcilloso limoso,
franco arenosos), con valores de pH extremadamente ácidos con rangos entre 3.4-3.7. Los
valores correspondientes a acidez intercambiable se encuentran dentro de los niveles de toxicidad
para la mayoría de las plantas, según tabla del IGAC (2007). El porcentaje de saturación de
aluminio se encontró dentro de los niveles tóxicos para la mayoría de cultivos ya que este valor se
encontró por encima de 60% (Tabla IGAC, 2007). El porcentaje de carbón orgánico presentó
valores entre 1.4-2.2 % encontrándose entre valores bajos y medios (Tabla IGAC, 2007). Se
evidenció que estas muestras presentaron una capacidad de intercambio cationico baja y media
(Tabla IGAC, 2007). Las relaciones entre Ca, Mg y K se encontraron por debajo del valor ideal
(Tabla IGAC, 2007). Igualmente se observó que las concentraciones de P fueron bajas en todas
las muestras (Tabla 6).

En las muestras de chagra llanura aluvial colectadas en el sur del trapecio amazónico se observó
que la clase textural de todos fue arcillosa, con un pH extremadamente ácido presentando un
rango entre 3.8 y 4.2 (Tabla IGAC, 2007). Los valores de acidez intercambiable obtenidos son
considerados en niveles tóxicos para a mayoría de cultivos (Tabla IGAC, 2007). Los porcentajes
de saturación de aluminio se encuentran dentro de los niveles tóxicos para la mayoría de los
cultivos (Tabla IGAC, 2007). El porcentaje de carbono orgánico presentó valores entre 2.6 y 5.4 %
los cuales se consideran como valores medios y altos de acuerdo con la tabla del IGAC, 2007. Se
observó que estas muestras presentaron una capacidad de intercambio cationico alta (Tabla
IGAC, 2007). Las relaciones entre Ca, Mg y K, estuvieron por debajo de la relación ideal entre
estos elementos (Tabla IGAC, 2007). Se evidenció que las concentraciones de P en la muestra
CVR1 fue baja con un valor de 3 ppm y las otras 2 muestras CVR2 y CVR3 presentaron un valor
medio ya que se encuentran en el rango de 15-40 ppm (según la tabla del IGAC, 2007) (Tabla 6).

En las muestras de los arreglos agroforestales de San José del Guaviare se evidenció que la
clase texturas vario entre Arenoso-Franco, Franco, y Franco-Arcilloso. El pH de estas muestras
fue extremadamente ácido (Tabla IGAC, 2007), se encontró entre 3,64 y 5.0. El porcentaje de
carbono orgánico se ubico entre 1.33 y 2.62, encontrándose que estos valores corresponden a
niveles bajos y medios (Tabla IGAC, 2007). En cuanto a la capacidad de intercambio catiónico se
observó que fue muy variable entre los diferentes arreglos agroforestales, ya que en los arreglos
agroforestales 7 y 4 tuvo un valor bajo, los arreglos 8 y 9 un valor medio y los arreglos 13 y 2 un
valor alto (Tabla IGAC, 2007). Las relaciones entre Ca, Mg y K, estuvieron por debajo de la
relación ideal entre estos elementos (Tabla IGAC, 2007). La acidez intercambiable y el porcentaje
de saturación de aluminio se encontraron dentro de los niveles tóxicos (Tabla IGAC, 2007) para la
mayoría de los cultivos excepto una muestra correspondiente al arreglo agroforestal 8. Se
evidenció que la concentración de fósforo en todas las muestras de los arreglos agroforestales fue
baja, ya que todos los valores fueron menores a 15 ppm (Tabla 6)

Por otro lado se observó en las 12 muestras de suelo rizosférico evaluadas, que el porcentaje de
colonización micorrítica fue inversamente proporcional a la concentración de fósforo (Figura 17).

Relación entre el porcentaje de colonización y

concentración de P (ppm)

100
90
80
70
% de colonización
60
50
40 Concentración de
30 P
20
10
0
C 1

C 2
3

C 1

C 2
A, R3

A, 7

8
A, 2

A, 4
A, 10

A, 13
TR

TR
TR

VR

VR

F
V
F

A
A

A
H

H
A

A
C

Figura 17. Relación entre porcentaje de colonización y concentración de P en suelos rizosféricos de

Manihot esculenta en 2 regiones de la Amazonía Colombiana.

Los valores de acidez intercambiable (AI) en las 12 muestras se encontraron como tóxicos para la
mayoría de los cultivos. Del mismo modo los porcentajes de saturación de aluminio en estos
suelos fueron tóxicos excepto en el arreglo agroforestal 8. El cual tuvo un porcentaje de 2.7 %
cuya apreciación según IGAC, 2007 es sin problema en general. En las muestras de San José del
Guaviare, las que tuvieron mayor porcentaje de colonización, el valor de acidez intercambiable fue
menor con respecto a las del Sur del trapecio amazónico, las que a su vez presentaron un menor
porcentaje de colonización, pero valores más altos de AI. Se observó claramente que el
porcentaje de saturación de aluminio tanto para las muestras del sur del trapecio amazónico como
para las de San José del Guaviare fue alto a excepción de la muestra del arreglo agroforestal 8
donde se vio una descendencia marcada (Figura 18).

Colonización por HMA y su relación con ácidez

intercambiable y % de saturación de aluminio

100
% DE COLONIZACIÓN
80
AI
60 % SAI
40
20
0
C R1

C R3
C R2

C R1
C R2
A, R3

A , 10

8
A, 7
A, 2

A, 4
A, 3
1

AF
AF
AF
AF
AF
HT
HT
HT
HV
HV
HV
AF
C

Muestras

Figura 18. Porcentaje de colonización y su relación con acidez intercambiable y porcentaje de saturación de
aluminio.

Análisis morfológico

En la evaluación morfológica de las esporas se analizaron algunas características, entre ellas:

forma, tamaño, rango de diámetro, color de acuerdo a la tabla de munsell, número de paredes
visibles, estructura y presencia de conexión hifal. Los datos correspondientes a cada característica
se encuentran descritos en la tabla 7.

Tabla 7. Características fenotípicas de las esporas encontradas en los suelos rizosféricos de Manihot
esculenta en las muestras del Sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare.
Variable Característica Sur del Trapecio Amazónico San José del Guaviare
M M M M M M M M M M M M M M M M M M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6
Forma Globosa + + + + + + + + +
Subglobosa + + + + + + + + +
Tamaño Mediana (50- + + + + + + + + + + +
200 µm)
Grande (200- + + + + + + +
400 µm)
Rango de Diámetro 50-100 µm + + + + + + +
100-200 µm + + + + +
200-300 µm + + + + +
300-400 µm + +
Color Amarillo +
Amarillo oliva + +
Amarillo + + +
pardo
Naranja + + + + + + + +
Rojo +
Café rojizo oscuro + + +
Número de paredes 2 + +
3 + + + + + + + + + + + + + + + +
Estructura Lisa + + + + + + + + + + +
Ornamentada + + + + + + +
Conexión hifal + +
Los colores corresponden a cada una de las características morfológicas de los morfotipos encontrados en los suelos rizosféricos de 6 muestras del Sur del Trapecio Amazónico y 6
de San José del Guaviare. Las cruces representan la presencia de esta característica. La letra M corresponde a morfotipo.
En las 6 muestras del sur del trapecio Amazónico se encontraron 12 morfotipos de esporas los
cuales corresponden en su mayoría al genero Glomus (Figura 19)

Figura 197. Esporas encontradas en Suelos rizosféricos de las muestras del Sur del Trapecio Amazónico.

En las 12 muestras de suelo rizosférico de los arreglos agroforestales se encontraron 10

morfotipos de esporas de HMA (Figura 20)

B
A C
D

F G H
E

I J K L
Figura 20. Esporas encontradas en lauelos rizosféricos de Manihot esculenta colectadas en San José del
Guaviare

En las muestras del sur del trapecio amazónico se encontraron los géneros Glomus y
Acaulospora con predominancia en número de esporas del género Glomus. Algunas de las
características encontradas en estos morfotipos podarían coincidir con especies reportadas por
Peña et al, 2006. No obstante no se puede afirmar que sea la misma especie dado que en estos
morfotipos no se pudo analizar todas las características morfológicas (Figura 19).

En las muestras de San José del Guaviare, aunque se encontró menor número de morfotipos, los
recuentos fueron mayores con respecto a los obtenidos en el sur del trapecio amazónico. Las
características morfológicas que se evaluaron coinciden con algunas características reportadas
por Peña et al, 2006; pero estos datos no son suficientes para inferir que corresponden a las
mismas especies ya que algunas características muy importantes como tipo de conexión hifal no
se pudieron observar debido a las condiciones de las esporas (Figura 20).

Para las muestras del sur del trapecio amazónico en total se encontraron 12 morfotipos. Para las
muestras de San José del Guaviare se encontraron 10. En general en todas las muestras se
encontraron entre 2 y 6 morfotipos, evidenciando claramente la presencia de diferentes géneros y
especies de HMA (Tabla 8). Solamente se encuentran datos de género ya que la morfología de
las esporas encontradas no arrojó datos suficientes para ubicarlas hasta especie.

Tabla 8. Morfotipos encontrados por muestra

Lugar de Muestra # de morfotipos géneros reportados

muestreo encontrados
CHTR1 3 Glomus
CHTR2 2 Glomus
Sur del
CHTR3 4 Glomus y Acaulospora
Trapecio CHVR1 2 Glomus
Amazónico CHVR2 3 Glomus
CHVR3 3 Glomus y Acaulospora
Lugar de Muestra # de morfotipos géneros reportados
muestreo encontrados

A. AF10 6 Glomus y Acaulospora

A.AF13 5 Glomus y Acaulospora
San José
A.AF 7 6 Glomus y Acaulospora
del A.AF 2 4 Glomus y Acaulospora
A.AF 4 5 Glomus y Acaulospora
Guaviare
A.AF 8 3 Glomus y Acaulospora

Extracción de DNA

Sóa partir eílonizd de baja calidad, observándose degradación (2 dias),aunque ng/µl) lalfue mejor.entre 3-
20
Inicialmente se realizó la estandarización de un protocolo de extracción de DNA a partir de
esporas con tres muestras de suelo rizosférico que contenían las especies de micorriza arbuscular
Glomus manihotis, Scutellospora fulgida y Acaulospora denticulada multiplicadas bajo condiciones
axénicas y que hacen parte de los controles positivos con los que cuenta el banco de micorrizas
del Instituto Sinchi en su sede de Leticia. Lo anterior con el fin de estandarizar un protocolo de
caracterización molecular de las esporas de dicho banco. En cada extracción se colectaron 200
esporas aproximadamente por cada 100 g de suelo.

Se evaluaron 14 protocolos de extracción de DNA: Sanders & Kathleen (1995), Redecker &
Thierfelder (1997), Manian et al. (2001), Dibonito et al. (1995), Tuinen & Jacquot (1998), Gadkar
& Rillig (2005), Dodd et al. (1996), Kowalchuk, De Souza & Van Veen (2002), Öpik (2004),
Antoniolli (1999), Kit ultraclean DNA soil, Procedimiento utilizado por Francisco A De Souza
(Brasil) para 1 espora, Procedimiento utilizado por Francisco A De Souza (Brasil) 10-60 esporas y
Método de extracción CTAB.

A partir de DNA extraído en cada uno de estos protocolos se realizó una electroforesis en gel de
agarosa al 0.8% en buffer TBE 1X, sembrando 10 µl de la muestra con 1 µl de buffer de carga por
cada protocolo. En ningún caso se observó banda indicando con esto que no se logró extraer
DNA o bien que la cantidad obtenida fue muy baja y por ende no se evidenció producto en el gel
debido a que posiblemente no se logro romper la pared de las esporas y por ende no se liberaron
los contenidos celulares y su DNA.

Debido a lo anterior, se tomó la decisión de trabajar los protocolos de extracción de DNA

directamente de las raíces micorrizadas, para lo cuál se colectaron muestras de raíces de Manihot
esculenta bajo la cobertura de chagra en el Sur del trapecio Amazónico y de Manihot esculenta
de arreglos agroforestales de an José del Guaviare.

Se logró extraer DNA a partir de raíces colonizadas empleando los procedimientos descritos por
Redecker, 2000 y el kit “Ultraclean DNA soil” de MO BIO Laboratorios”. Empleando el protocolo de
Redecker se obtuvo muy poco DNA y de baja calidad, observándose degradación en muy corto
tiempo (2 días), mientras que con el kit, aunque se obtuvo poca cantidad (entre 3-20 ng/µl) y el
DNA fue de mejor calidad.

Amplificación.

En la amplificación general utilizando los primers ITS4 y NS5 (Redecker et al., 1997) no se
obtuvieron bandas visibles, razón por la cual se realizó una dilución 1/100 del producto de PCR,
de acuerdo con lo sugerido poren Redeker (2000). Esdilución fue utilizada) para realzar las PCR
anidadas con los primers específicos.

En la primera amplificación anidada con el primer GLOM5.8R, se evidencióoque de las 6 muestras

del sur del trapecio amazóonco, solamente en 2 que corresponden a chagra terraza, replica 1 y 3
se obtuvo el fragmento amplificado del tamaño esperado (200 pb), los cumuestras que
amplificaron fueron las que correspo

De las 6 muestras de San José del Guaviare 4 amplificaron con el primer GLOM5.8R,
evidenciándose el fragmento esperado, una banda de aproximadamente 200 pb. Las muestras
positivas correspondieron a los arreglos agroforestales 2, 4, 7 y10. (Figura 21 carriles 2,3,, 6 y 7).
Es necesario aclarar que se realizaron diluciones (1/100) del producto de PCR general con tres
muestras (CHTR1, CHTR3 y A.AF 7) y se amplificó nuevamente con el primer específico para
Glomus (GLOM 5.8R), observándose la banda esperada (~ 200 pb) pero con mayor intensidad,
por tal razón se decidió de ahí en adelante amplificar con la dilución 1/100 (Figura 21 Carriles 11,
12 y 13).

En la segunda amplificación anidada con el primer específico GIGA 5.8 R, se encontró que de las
12 muestras evaluadas solamente en 2, presentaron el fragmento esperado (300 pb). Las
muestras positivas correspondieron a los arreglos agroforestales 7 y 10 de San Josée del
Guaviare (Figura 2119 (B) carrils 1 y 3)

Específicos para Acaulospora sensu-stricto

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CN MP 1 2 3 4 MP

B B
A

Figura 21.PCR anidada con los primers genero-específicos (A) ITS1F-GLOM 5.8 R (B) ITS1F-GIGA 5.8R
en las muestras colectadas en el Sur del trapecio amazónico y San José del Guaviare.

En la PCR anidada lason los primers ACAU 1660 (específo para Acaulospora sensu stricto),
ARCH1311 (específico para A. gerdemannii, A. trappei, G. occultum y G. brasilianum) y LECT
1670 (específico para Glomus etunicatum y Glomus claroideum), no se evidencióo amplificación
indicando siendo est un indicativo de que podos por Redecker (2000) positivasreportadas en
Redecker, (20muestras.
Clonación

Con los productos de amplificación obtenidos en la PCR anidada con los primers genero-
específicos GLOM 5.8R y GIGA 5.8R se realizaron los ensayos de clonación usando el vector
topo PCR 2.1 y transformando el producto de la ligación en células de E. coli DH5 -α
químicamente competentes.

Se evaluaron las dos muestras de chagra (CHTR1 y CHTR3) en las cuales se había reportado el
fragmento esperado de 200 pb con el primer GLOM 5.8R; igualmente las muestras (2, 7, 10 y 13)
que corresponden a los arreglos agroforestales colectados en San José del Guaviare que también
reportaron el fragmento esperado con el primer anteriormente mencionado (Tabla 9).
Para el caso de las muestras que dieron el fragmento esperado con el primer GIGA 5.8R
(Muestras 7 y 10) que corresponden a los arreglos agroforestales colectados en San José del
Guaviare, se realizó la clonación siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado (Tabla 9).

Tabla 9. Datos clonación

Lugar de Muestra Clones positivos Clones positivos
muestreo con el primer con el primer
GLOM 5.8R Giga 5.8R
Sur del trapecio CHTR1 6 0
amazónico CHTR3 4 0
San José del A A.F 2 9 0
A. AF 7 17 12
Guaviare
A. AF 10 10 4
A. AF 13 16 0

Como se observa en la tabla 9, en general la muestra en la que se obtuvo mayor número de

clones positivos fue el arreglo agroforestal 7, con 17 clones. La muestra que menor cantidad de
clones positivos presentóo fue la CHTR3, con 4 clones.

En la muestra de CHTR1 se obtuvo 6 clones positivos (con el fragmento de interés) (Figura 22

(A)), y en la muestra CHTR3 4 clones positivos (Figura 22 (B)), los que se evidenciaron en gel de
agarosa al 23% dspués de realizar una PCR con los primers universales (M13 F, M3R). En el gel
se observave clamente la presencia nte qudos al inserto evidenciándose un fragme un tam
amentede el inserto + 200 pb del vector).
 1 2 3 4 5 6 MP 1 2 3 4 MP

400
400pbpb 400
400
pbpb

B
A

Figura 22. Clones positivos muestras Sur del Trapecio Amazónico (A). CHTR1, (B) CHTR3.

En las muestras positivas para GLOM5.8R de San José del Guaviare se obtuvo un total de 52
clones positivos; 9 para el arreglo agroforestal 2 (Figura 23 (A)), 17 para el arreglo agroforestal 7
(Figura 231(B)), 10 para el arreglo agroforestal 10 (Figura 231 C)) y 16 para el arreglo agroforestal
13 (Figura 231 D)).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 MP

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
MP MP

C D

Figura 23. Clones positivos de los arreglos agroforestales 2, 7,10 y 13 del muestreo de San José del
Guaviare.

En los clones positivos para el primer GIGA5.8R de las 2 muestras correspondientes a los
arreglos agroforestales 7 y 10 del muestreo de San José del Guaviare, se obtuvo n total de 16
clones positivos de los cuales 12 corresponden al arreglo agroforestal 7 (Figura 242 (A)) y 4
rreglo agroforestal 10 (Figura 242 (B)).
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 MP
1 2 3 4 MP
500 pb

500 pb

A B

Figura 24. Clones positivos para GIGA 5.8 R (A) Arreglo agroforestal 7 y (B) Arreglo agroforestal 10.

Análisis de patrones ARDRA

Inicialmente el amplificado de 400 y 500 pb fue digerido con 2 enzimas (Hinf I y Taq I) generando
diferentes patrones de restricción.

En los productos de amplificación del inserto de interés con los primers M13F/M13R a partir de los
clones de la muestra CHTR1 se evidenció que las 2 enzimas presentaron sitio de reconocimiento
(Figura 253A Y (B),generando en total 9 sitios de restricción. A partir de estos patrones se
construyó una matriz de presencia-ausencia considerando simultáneamente los resultados de las
2 enzimas y agrupando los clones positivos para GLOM5.8R según su semejanza genética. Se
generóo n dendograma a partir de los patrones de ARDRA con los datos de las 2 enzimas,
usando el coeficiente de Dice y el méetodode agrupamiento de UPGMA (Figura 253 C). Co este
agrupamiento se encontróevidencia 6 clone positivos para está muestra se agruparon en 4
grupos. Se observóo de manera genera que el coeficiente de similitud para los clones 2, 3, 4, 5 y
6 fue de aproximadamente 0.70, siendo el clon 1 el mas el más disím un porcentaje de 0.51.

1 2 3 4 5 6 1
MP 1 2 3 4 4 5 6 MP
2

5
A B 0.51 0.63 0.76 0.88 1.00
Coefficient

Figura 25. Análisis ARDRA CHTR1. (A)Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C) Dendograma construido
con base en el agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

En los productos PCR a partir de los clones positivos de la muestra CHTR3 se evidenció que para
las 2 enzimas existióhuitio de reconocimiento (Figura 264 (A) y B)), generando 4 sitios de
restriccióon. De auerdo aa lo antrior, los 4 clones se agruparon en 3 grupos. Se observaveue 3 de
los 4 clones (1,2 y 4) presentantuvi coficiente de similitud alto, aproximadamente 0.80 y el clon 3
se ubica en un grupo diferente,fue erente teniendo con un cotud con respecto a los demas de
0.49, siendo por lo símil (Figura 264 (C)).

1 2 3 4 1
MP 1 2 3 4 MP
2

0.49 0.62 0.74 0.87 1.00

B C
Coefficient

A
C
Figura 26. Análisis ARDRA CHTR3. (A) Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C) Dendograma
agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

En las digestiones de los productos PCR de los clones positivos del arreglo agroforestal 2, las dos
enzimas tuvieron sitios de reconocimiento generando 5 patrones de restricción (Figura 275A y B).
En el agrupamiento de los 9 clones se obtuvierono4 grupos de los cuales 3 presentaron un
coeficiente de similitud de 0.56 y el clon 9 fue el más diferente con un coeficiente de 0.41 (Figura
275 ).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 MP
1
2
6
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 MP
A 7
8
9

0.41 0.56 0.71 0.85 1.00

Coefficient

B C

Figura 27. Análisis ARDRA arreglo agroforestal 2. (A) Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C)
Dendograma agrupamiento UPGMA índice de Dice.

En la digestión de los productos de PCR de los clones del arreglo agroforestal 7, solamente se
encontró sitio de restricción con la enzima Hinf I (Figura 28 A Y B), generándose 8 grupos
diferentes. Se observóo ue el grupo 1, conformado por el clon 1, fue el más disímil de todos, con
un porcentaje de similaridad de 0.0 (Figura 286 C)
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 MP 1
2
9
10
17
14
13
5
6
A 8
3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 141516 17 MP 4
15
7
11
16
12
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
B Coefficient

C
Figura 28. Análisis ARDRA arreglo agroforestal 7. (A) Digestión con Hinf I, (B) Digestión con Taq I y (C)
Dendograma agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

En la digestión de los productos de PCR de los clones del arreglo agroforestal 10 se evidenció
que la solamente la enzima Hinf I tuvo sitio de reconocimiento (Figura 29 A Y B), generando en
total de 4 patrones de restricción los que al agruparse generaron 3 grupos totalmente diferentes,
eon un coeficiente de similaridad en 0.00 (Figura 29 7 C).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MP
1
2
3
4
8

A 5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MP 7
10
6
9

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

Coefficient

B
C

Figura 29. Análisis ARDRA arreglo agroforestal 10. (A) Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C)
Dendograma agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

En la digestión de los productos de PCR de los clones del arreglo agroforestal 13 se evidenció que
para las 2 enzimas existió sitio de reconocimiento (Figura 3028Ay B), generando 4 fragmentos de
restricción. De acuerdo a esto los 16 clones se agruparon en 3 grupos. Se observó que 2 de los 3
grupos se correlacionaron en un porcentaje de similaridad de aproximadamente 0.70 %, mientras
que el 3 grupo se unió a un coeficiente de similaridad de 0.41%, siendo el más disímil (Figura
3028 C)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 MP
 1
2
3
4
5
6
7
A 8
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 11
13
MP 15
9
14
12
16
0.41 0.56 0.71 0.85 1.00
Coefficient

B C

Figura 30. Análisis ARDRA arreglo agroforestal 13 (A) Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C)
Dendograma agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

Respecto a los clones positivos amplificados con el primer GIGA 5.8R se puede anotar lo
siguiente:a En la digestión de los productos de PCR de los clones del arreglo agroforestal 7 se
observóoque tanto la enzima Hinf I como Taq I tuvieron sitio de reconocimiento (Figura 3129 y B),
generando 10 patrones de restricción. De acuerdo a estos sitios los 12 clones se agruparon en 6
grupos, correlacionándose entre sí a un coeficiente de similaridad de 0.57% (Figura 3129 C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 MP

1
2
3
8
9
A 4
6
7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 MP 11
12
5
10
0.57 0.68 0.78 0.89 1.00
Coefficient

B
C

Figura 31. Análisis ARDRA Arreglo agroforestal 7. (A) Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C)
Dendograma agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

En la digestión de los productos de PCR de los clones del arreglo agroforestal 10 solamente se
observó sitio de reconocimiento con la enzima Hinf I (Figura 32 A y B). Se encontraronn3 sitios de
restricción, los clones los sruparon en 2 grupos con un coeficiente de similitud alto 0.80 (Figura
320 C).
 Figura 32.

1 2 3 MP 1 2 3 MP 1

0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

Coefficient

A B C

Análisis ARDRA Arreglo agroforestal 10. (A) Digestión Hinf I, (B) Digestión Taq I y (C) Dendograma
agrupamiento UPGMA e índice de Dice.

Secuenciación

De los 15 clones que se seleccionaron entre las muestras del sur del Trapecio Amazónico y San
José del Guaviare, solamente en 2 se obtuvo una secuencia valida. En los demás se perdieron
muchos pares de bases siendo secuencias no validas y no compatibles con ninguna secuencia
reportada en el Genebank.

De los clones enviados a secuenciar de las muestras del sur del Trapecio Amazónico no se
obtuvo ninguna secuencia válida. Las 2 secuencias con las que se obtuvo un alineamiento
significativo corresponden al muestreo de San José del Guaviare, a los arreglos agroforestales 13
clon 12 positivo para GLOM5.8R, y 10 clon 6 positivo para GIGA5.8 R.

En la secuencia del clon 12 del arreglo agroforestal 13 se evidenció que en una regióo hubo
problemas con la secuencia, ya que 42 pb de nucleótidos no pudieron ser identificados siendo
reemplazados por N (Figura 331)

En la secuencia del arreglo agroforestal 13, clon 12 positivo para GLOM5.8R se encontró un
alineamiento significativo con un 92% de homologíia en 37 pares de bases y 2% de Gaps con el
clon Glomus Pa106 18S rRNA aislado de raíices colnizadas de HMA de Prunus africana
reportada por Wubet, et al., 2004.

GCCCATCTCATGAGATTATTTTTATTATAAGAGTGGGGTTTTAAATACAGTTTTCACGAGACCGTGACCAAAAGGCCAGGCTCGCCA
AAATCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCAAGAAGGGCGAATTC
CAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGANNNNNNN
NNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNCNNNNNNCCNCACANANCAACCCACCCCACCCAACCAAANCATCCCCCAACAAA
ACCACACCCCCCCCAACAACCAACACCAAACACCCCCCCCCAACAACCCCCACAACCAACACCCCAATAAAACTACATAACACCAC
CTACAATACTTTCTACATATTACCCACACTATAACATCATTCATTCTCCTATCCCTTAACTCTCCAACTCCTCTTTCATAATCTCATAAT
CTACATTAATTTTCATATTAAATATTTAAATCTTACTCCTTCTATATTCCCCCACTTTATATCCATCAACACCTTCTTAACTATACCCCTT
TTTTCCTTATATATTCCCTTATTCATCTCTCCTCTACCTTTTCCTTAACCCTCACTTTTTCTCTAATCTCTTATTTCTTTTCATTAACACT
CTTCTTCAACAATCCTACCTATACTCAACCCCTATACCATCCTTCCTTATTTACTAC

Figura 33. Secuencia obtenida del clon 12 del Arreglo agroforestal 13

En la secuencia del clon 6 del arreglo agroforestal 10 (Figura 34), se encontró un alineamiento sig-
nificativo con un porcentaje de homología de 94% en 254 pares de bases y 2% de gap con la se-
cuencia del clon Giga3538.1 18S rRNA, aislado de raíces colonizadas de Inga parteno por HMA,
reportada por Carpenter et al., (2007, en prensa).

AACTGACGAAGTGATTTGCGTTCAAAATTTGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCATATTACCTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCAT
CGATGCGAGAGCCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTTTTTTTTTAATAAAATTTATATTTAAAAAAGAGTAAGGTTTTAAATACAAGAGG
TATAAATACCTCAAATTTTTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCAAGA
AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC
CTGAAAACACAATCATATACCCTTCTCCTCTAACAATACTTAACCCACACATCCACACAACACTACCTGACGACAACCTCGACAACAC
CTCCCCATCACTCTCTTGCCCACAAAACCACTTTTCCACCCCTATCCACTCCACTTCTTACCTCAGAAACCATCTTCCCTTTTCATCA
AATCGATCCACCACGCTCCACCTACTCATACAGAATTCTAAACAATCCCAATCATTTTACACCCTATCACCCCACCCCCCCATAGAAC
AATACTTCACTCTCCATACCGCAACAACATCTCAATCTCAAACCCACCTCCTACCAAACACATAACACATATACGCTCCAAACTACCA
ACCTACACCATACTAATATCGACCCCCTACTCATCACCACCTAAACCTCACCATCCTTCTCTTGAAGCCCACATTCT

Figura 34. Secuencia del clon 6 del arreglo agroforestal 10.

 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Porcentaje de colonización de HMA y su relación con recuentos de esporas y el contenido

de fósforo (ppm) en el suelo.

En cuanto al porcentaje de colonización de HMA en las muestras evaluadas, se evidenció que fue
mayor la colonización por HMA en los arreglos agroforestales de San José del Guaviare (77,5%).
El porcentaje más alto, lo reportó el arreglo agroforestal 10, con un valor de 88% (tabla 4). La
discusión se realizó teniendo en cuenta el porcentaje de colonización micorrítica por hifas del
hongo, debido a que ésta es la estructura adicional de absorción que capacita a la planta para
obtener nutrientes que de otra forma no le serían accesibles. Además, son las hifas las que
forman las unidades de colonización y las que por medio de divisiones celulares específicas
generan arbusculos y vesículas (Sánchez de P, 1999 citado por Cardona, 2000).

En todas las raíces evaluadas, el porcentaje más alto de colonización fue el reportado por
arbusculos (78%) (Tabla 4). Se ha mostrado que durante la colonización intraradical del hongo MA
las hifas internas forman una zona de interfase con la célula vegetal para realizar la transferencia
inicial de nutrientes mientras se establecen los arbusculos (Sanders y Sheik, 1983). Esto puede
indicar que en el momento del muestreo posiblemente está interfase ya se había presentado y se
establecieron los arbusculos, hecho que evidencia una alta colonización por este tipo de
estructuras. Es muy importante resaltar que la vida media de estás estructuras es muy corta (4-15
días), por lo que es poco común obtener resultados como estos, puesto que se degradan en corto
tiempo. La presencia de arbusculos es un buen indicativo de actividad metabólica asociada al
transporte de sustancias a través de membranas (Guerrero, 1996). De acuerdo a esto se puede
inferir que en el momento del muestreo la planta tenia mayor dependencia de la simbiosis, ya que
se estaba presentando el transporte de sustancias metabólicas.

aunque se observó un mayor porcentaje de colonización por estructuras de hongos MA en los

arreglos agroforestales de San José de Guaviare, las muestras colectadas bajo chagras en el Sur
del Trapecio Amazónico presentaron porcentajes de colonización con valores que van desde el
rango de medios a altos (Tabla 4).

Es sabido, por resultados obtenidos en la Amazonía Colombiana (Arcos y Benavides, 1999) que
una alta presencia de micorrizas en sistemas intervenidos puede deberse a las prácticas
agronómicas realizadas por los indígenas. Una de estás prácticas es la rotación de cultivos con
especies de alta dependencia micorrítica como Manihot esculenta, maíz, piña y plátano,
considerados como hospederos importantes que favorecen la colonización del hongo bajo las
condiciones evaluadas.
En cuanto a la relación del número de esporas y el porcentaje de colonización se observó que los
recuentos de esporas más altos se obtuvieron en el muestreo de San José del Guaviare (Tabla 5).
Sin embargo, no en todas las muestras en las que se presentó una mayor colonización hubo
mayor número de esporas (Tabla 4). Los recuentos más bajos se obtuvieron en las muestras del
Sur del Trapecio Amazónico. Estos dos factores no siempre están relacionados, ya que la
producción de propágulos en posiciones ecológicas está limitada, depende de los parámetros
fisiológicos y puede no estar correlacionada con colonización en raíz (Merryweather y Fitter,
1998). De acuerdo con esto, no necesariamente tiene que existir una relación directa entre
colonización y esporulación. Recientes reportes encontraron que la falta de esporulación no
necesariamente significa ausencia de la micorriza en ese lugar. Por ejemplo, el micelio de algunos
HMA fue detectado en raíces de plantas, pero las esporas no fueron encontradas en ninguna de
las muestras de suelo.

No obstante, hay que considerar que aunque en las muestras de San José del Guaviare se
presentó mayor colonización por MA, esto no necesariamente indica que la simbiosis sea efectiva,
es decir, no se puede afirmar que la mayor ocurrencia del microsimbionte significa mayor beneficio
para la planta. Azcon (1980) reporta que, en general, los endófitos más infectivos no tienen que
ser los más efectivos, puesto que el grado de infección que va a alcanzar una planta va a estar
determinado por sus propias características fisiológicas y genéticas.

Otro aspecto importante a tener en cuenta es que la germinación de las esporas y el crecimiento
del tubo de germinación en el suelo no están influidos por la colonización de la raíz, sino que
están determinadas por factores físicos y químicos del suelo. La formación de esporas comienza
entre la 3º y 4º semana después de la colonización de la raíz, con algunas especies de hongos,
mientras que otras requieren hasta de 6 meses para su formación. Por lo tanto, la planta
hospedero, el suelo y las condiciones medioambientales pueden afectar el tiempo y la extensión
de esporulación (Sieverding, 1991).

Los niveles de fósforo en el suelo tienen una relación directa con el porcentaje de colonización y el
número de esporas, ya que cuando este elemento es limitante favorece el establecimiento de la
simbiosis (Arcos y Benavides, 1996).

Se observó que los niveles más bajos de fósforo se encontraron en todas las muestras que
corresponden a los arreglos agroforestales de San José del Guaviare (Tabla 6). Estos valores
oscilaron entre 0.61 y 5.51ppm. Los valores menores a 15 ppm fueron reportados como bajos
según las consideraciones generales para interpretar análisis de suelos (IGAC, 2007). La baja
presencia de fósforo puede contribuir a una alta presencia de la simbiosis, pues en ambientes
donde hay contenidos bajos de este elemento se ha reportado una alta micorrización. Las plantas
cultivadas en condiciones de baja disponibilidad de nutrientes tienden a ser micotróficas
obligadas, debido a su necesidad de mejorar la toma de nutrientes. Por lo tanto, se estimula el
establecimiento del hongo y se permite un mayor drenaje de fotosintatos. En el caso de la Manihot
esculenta (yuca) se sabe que tiene altos porcentajes de asimilación y pueden presentar
considerables metabolitos sintéticos para el establecimiento de las MA (Sieverding, 1991). Esto se
evidenció claramente, ya que tanto el porcentaje de colonización como el número de propágulos
infectivos tuvieron una relación inversamente proporcional a los niveles de fósforo y fue mayor el
número de propágulos y el porcentaje de colonización en niveles bajos de fósforo (Figura 18).

En cuanto a las muestras del sur del Trapecio Amazónico en Chagra-Llanura aluvial se
encontraron valores medios y bajos de fósforo (Tabla 6). Esto evidencia claramente que la
muestra CHVR1, que tuvo el nivel de fósforo más bajo (3ppm) de las 3 muestras, mostró con
respecto a las otras 2 muestras un mayor número de propágulos infectivos (213 esporas/100 g de
suelo) y a su vez un mayor porcentaje de colonización (60%). La diferencia en porcentaje de
colonización y recuentos de esporas se pudo deber a los contenidos de fósforo, ya que el
establecimiento de estás poblaciones se presenta mucho mejor en suelos con carencias de este
elemento.

Recuento de esporas de HMA

Existen varios factores que pueden afectar la estimación de la abundancia y riqueza de hongos
formadores de micorriza arbuscular (HMA) a partir del aislamiento de sus esporas. Entre ellos está
la capacidad natural de cada especie para producir esporas, la época y las condiciones del
muestreo (Cardona, 2000).

Se sabe que no todas las especies de hongos formadores de micorriza arbuscular tienen la misma
capacidad de formar esporas. Muchos de los HMA no esporulan (Sanders et al., 1996) o la
producción de esporas está condicionada a los cambios edáficos del suelo, por lo que estudiar las
esporas de HMA puede no ser un reflejo fiel de la comunidad de estos hongos.

El número de esporas presentes en una muestra de suelo varía de acuerdo con el tipo de
cobertura muestreada. Si comparamos coberturas diferentes como bosque (bosque maduro poco
intervenido), potrero (zonas cubiertas por gramíneas naturales o introducidas producto de una tala
completa del bosque primario), rastrojo (zonas de recuperación natural luego de una tala completa
del bosque primario) y diferentes formas de cultivo presentes en la región amazónica colombiana
(cultivo referido al monocultivo, agroforestal referente al policultivo multiestrata y chagra referente
al policultivo obtenido por prácticas de manejo tradicional indígena), encontramos que el promedio
de esporas recuperadas de potreros, bosques o rastrojos es de aproximadamente 2000
esporas/100g suelo, mientras que los cultivos tienden a presentar en promedio recuentos
menores, oscilando alrededor de 1000 esporas/100g suelo (Peña et al., 2006). Los recuentos de
esporas encontrados en las muestras del sur del trapecio Amazónico, colectadas en chagras bajo
el paisaje de terraza y llanura aluvial, estuvieron por debajo del promedio reportado por Peña et
al., (2006) (Tabla 5). En el recuento de esporas de las muestras del sur del trapecio amazónico el
menor valor fue 78 esporas/100g de suelo correspondiente a la muestra CHVR3 y el mayor 320
esporas/100g de suelo correspondiente a la muestra CHTR1. A diferencia de lo encontrado en los
arreglos agroforestales de San José del Guaviare en donde se obtuvo recuentos mayores que los
del sur del Trapecio Amazónico (Figura 16). No obstante, estos valores se encuentran por debajo
del promedio (Peña et al, 2006). La muestra con mayor número de esporas fue 871 esporas/100g
correspondiente al arreglo agroforestal 8 y la que menor recuento fue 218 esporas/100g de suelo
correspondiente al arreglo agroforestal 4 (Tabla 5).

La discrepancia en la abundancia de esporas en las diferentes coberturas podría estar

relacionada con la permanencia de plantas hospederas en el lugar y al establecimiento de HMA
en el suelo. Una de las estrategias más exitosas de los HMA para colonizar nuevos hospederos
consiste en desarrollar una red de micelio extraradical compleja que comunica las diferentes
plantas del ecosistema. La colonización de un nuevo hospedero tiende a realizarse en primer
lugar por la red de micelio ya establecida, y en segundo lugar por la germinación de esporas. La
ventaja de establecer la red es que ésta les permite permanecer unidos a más de un hospedero
aumentando su oportunidad de supervivencia. Si el hongo opta por producir inicialmente esporas,
cada propágulo tendrá una oportunidad de encontrar un hospedero (Cardona, 2000).

Las muestras de San José del Guaviare fueron las que reportaron mayor número de propàgulos
infectivos, esto se pudo deber al tipo de cobertura presente, ya que en los arreglos agroforestales
se encuentran diferentes especies asociadas en vecindad a Manihot esculenta (Tabla 1) y esto
mejora las condiciones del suelo y su cobertura proporcionando mejores condiciones para el
establecimiento de la simbiosis. Según Sieverding, 1984 existen factores cuyas interrelaciones
afectan la presencia y la actividad de los HMA y son tipo de cobertura vegetal, fertilidad y
temperatura. Según Peña et al, 2006 en los Análisis de cobertura realizados en la amazonía
colombiana se encontró que los sistemas agroforestales, seguidos por los rastrojos y el bosque
nativo presentan los mayores promedios de colonización radicular, estando por encima del 30%.
Por el contrario, las coberturas de chagra, monocultivo y potrero presentaron los valores de
porcentaje de colonización más bajos respectivamente. Los resultados estarían indicando que la
simbiosis micorriza arbuscular es más efectiva en ecosistemas con coberturas altamente diversas.
De allí la importancia que tiene promover sistemas de producción agrícola agrodiversos para la
región amazónica colombiana. Lo anterior corrobora los datos obtenidos en las muestras de
chagras del sur del trapecio amazónico en y los arreglos agroforestales en San José del Guaviare.

Es muy importante tener en cuenta que el tiempo de establecimiento de Manihot esculenta en los
arreglos agroforestales fue mayor encontrándose entre 2 y 7 años, mientras que la edad
correspondiente a las muestras del sur del trapecio amazónico varia entre 10 meses y 7 años
(Tabla 1). Es importante tener en cuenta la edad del cultivo, ya que de acuerdo a esto se puede o
no encontrar establecido el HMA, ya que requieren de un tiempo determinado que varia de
acuerdo a la especie y unas condiciones para que se realice el establecimiento y se presente la
colonización.

Por todo lo anterior, a partir de un recuento de esporas no se puede hacer inferencia acerca de
abundancia y riqueza de HMA, ya que la presencia de propágulos infectivos depende de muchos
factores. Con estos datos se pueden realizar valiosas aproximaciones acerca de la diversidad de
HMA presentes en suelos rizosféricos de plantas colonizadas por HMA. Aunque el recuento de
esporas da una estimación del potencial de infectividad del suelo, en este caso, es posible que
algunas de las cepas de HMA nativas de este lugar no produzcan esporas, pues no todos los
hongos endomicorricicos esporulan (Gerderman y Trappe, 1974; citado en Arcos, 1996)

Porcentaje de colonización de HMA y su relación con los valores del pH, el contenido de
materia orgánica, acidez intercambiable y % de saturación de Aluminio.

El pH de los suelos tanto del Sur del Trapecio Amazónico como de San José del Guaviare fue
extremadamente ácido (se encontró en el rango 3,64 y 5.0) (Tabla 6). El pH más bajo
correspondió al arreglo agroforestal 10, que tuvo el mayor porcentaje de colonización (88%),
hecho que evidencia que la acidez no afectó la colonización. Barea y Jeffries (1995) argumentan
que las MA tienen amplia adaptación a condiciones de pH (éstas se han encontrado en suelos con
pH desde 2,7-9,2). Se han encontrado diferentes especies y ecotipos en cuanto a su capacidad
para colonizar un hospedero en función del pH (Peña et al., 2006).

Todos los HMA son dependientes del pH. Está dependencia no es exclusiva de este grupo de
organismos. En general toda la microflora edáfica está fuertemente relacionada con el pH. De
hecho se encuentra que el valor límite para la vida en el suelo está alrededor de 3.0. La mayoría
de los géneros se aislaron en un rango de pH entre 3,64 y 5,0, pH natural para desarrollar la
simbiosis, establecerse en el suelo y esporular.

En cuanto a la relación de la colonización con la materia orgánica, es sabido que la aplicación de

materia orgánica se constituye como una práctica agrícola que ha mostrado efectos positivos
sobre la diversidad y dinámica de las poblaciones de hongos micorrizógenos y sobre la efectividad
de la simbiosis (Arcos y Benavides, 1996). El resultado de está práctica es la estimulación de la
microflora rizosférica y con ella la de los hongos micorrizógenos, de tal forma que se dinamiza la
movilización de nutrientes mediada por microorganismos.

En las muestras del sur de Trapecio Amazónico de chagra-llanura aluvial se obtuvieron valores de
carbono orgánico medios y altos, mientras que los valores obtenidos en los arreglos
agroforestales de San José del Guaviare estuvieron entre bajo y medio hecho que evidencia
claramente que éstas presentaron valores mucho más bajos. Las plantas estresadas por
nutrientes liberan más carbohidratos solubles en los exudados de las raíces, lo que les permite ser
mejores hospedero es para las micorrizas que las plantas fertilizadas (Collins, 1993), hecho que
podría explicar los mayores porcentajes de colonización en las muestras de San José de Guaviare
y su relación con contendidos bajos y medios de carbono orgánico.

En las muestras del Sur del Trapecio Amazónico y en las de San José del Guaviare se evidenció
claramente que los valores de acidez intercambiable y el porcentaje de saturación de Aluminio se
encontraron en el nivel de toxicidad para la mayoría de los cultivos (Figura 19). Se evidenció que
estos valores no afectaron el porcentaje de colonización. Debido a que los HMA tienen una alta
capacidad para tolerar la toxicidad producida por elevadas concentraciones de elementos tales
como el aluminio, una de las grandes funciones de los HMA es que colaboran en la recuperación
de suelos degradados (Daft, 1974 citado en Arcos, 1993).

Algunos estudios han concluido que las MA favorecen los mecanismos de exclusión de aluminio
de la raíz, modificando el patrón de exudación de ácidos orgánicos quelantes del aluminio
alterando la capacidad de intercambio catiónico de la pared celular y disminuyendo en
consecuencia la acumulación de este elemento y su movilización hacia la parte aérea (Sánchez,
1999 citado en Cardona, 2000).

Los porcentajes de saturación por aluminio reportados, son considerados como tóxicos para la
mayoría de cultivos (IGAC, 2007), cuya toxicidad se ve reflejada en la inhibición del crecimiento
radial de la planta, pues el Al se acumula en la raíz limitando el poder de absorción de nutrientes y
por lo tanto su crecimiento (Galeano, 1991 citado en Cardona, 2000). Sin embargo es importante
tener en cuenta que los niveles de toxicidad se deben manejar para los diferentes suelos y
especies vegetales, pues algunas presentan tolerancia natural a estás condiciones.

Evaluación Morfológica de Esporas

La evaluación taxonómica se determinó de acuerdo con las características morfológicas a partir de

las esporas de HMA de las muestras del sur del Trapecio Amazónico y de San José del Guaviare.
Está evaluación se vio afectada por el estado de las esporas. En algunas muestras,
especialmente en las provenientes de ecosistemas recientemente perturbados como las chagras,
un buen número de esporas no eran viables. Muchas aparecían mordidas o hiperparasitadas
comparativamente con la cantidad de aquellas que parecían haber sido rotas mecánicamente.

Es poco lo que se ha estudiado sobre los agentes que deterioran las esporas de HMA (Powell &
Bagyaraj, 1984), pero se ha especulado que las esporas de HMA podrían ser muy susceptibles al
ataque de otros organismos dada su composición rica en lípidos. Las esporas oscuras, muy
melanizadas, parecen ser menos susceptibles al ataque de otros organismos (Daniels & Menge,
1980). En las muestras de chagras se observa que las paredes externas de esporas oscuras
tienden a permanecer en el suelo, sin evidenciarse otras paredes no melanizadas o hifas o células
suspensorias.

Igualmente, se observó con alguna frecuencia que las esporas presumiblemente no viables, pero
aparentemente en buen estado, albergan esporas de otros HMA. Koske (1984) reportó este hecho
como una tendencia de algunas especies para su germinación. En el presente trabajo se observó
que muestras que no son lo suficientemente secas y se refrigeran tienden a producir con mayor
frecuencia esporas dentro de esporas de HMA. Éste es el caso de las esporas encontradas en las
muestras del Sur del Trapecio Amazónico.

Dentro de los caracteres importantes para la determinación taxonómica de especies de HMA

están la conexión hifal y tipo de agrupación para Glomus; las paredes y ornamentaciones para
Acaulospora; la presencia de las dos cicatrices para Entrophospora; la presencia de escudo
germinal y una pared compleja para Scutellospora y la composición simple de pared para
Gigaspora( Peña et al., 2006). En este estudio se observó predominancia de las especies del
género Glomus y Acaulospora, siendo mayor la incidencia de especies pertenecientes al género
Glomus.

En el aislamiento de morfotipos correspondientes al muestreo del Sur del Trapecio Amazónico se

evidenció la predominancia de especies del género Glomus. Éste es el más abundante y el que
presenta mayores interrogantes en su filogenia y taxonomía, lo cual indica el enorme campo de
investigación que aún existe alrededor de éste género. Se encontraron 4 morfotipos
correspondientes a este género. También se encontró el género Acaulospora, posiblemente la
especie foveata, que fue reportada por Peña et al., (2006) (Tabla 7). Ésta ha sido reportada en
suelos húmedos tropicales en México, Costa Rica y Panamá (Janos & Trappe, 1982), asociada a
cultivos de cacao, banano y caña de azúcar. Tiene una amplia distribución en la región amazónica
colombiana. Se ha reportado asociado a ají en los departamentos de Guaviare, Putumayo, Baúles
y Vichada. En el departamento del Guaviare, municipio de San José del Guaviare, Agua Bonita, se
ha encontrado asociado a pastos en potrero; en el departamento de Caquetá, municipios de
Florencia y Morelia, asociado a Caucho en cultivo; y en el departamento de Guaina, Puerto
Inhirida, asociado a agroforestales. En el departamento de Amazonas, en los municipios de Leticia
y Puerto Nariño se ha encontrado en bosque maduro, pastos y rastrojos, y asociado a abarco,
caña de azúcar y leguminosas (Peña et al., 2006).

En las muestras de San José del Guaviare se encontraron 4 morfotipos correspondientes a el

género Glomus y 1 morfotipo correspondiente al género Acaulospora problablemente
Acaulospora foveata, se encontró un morfotipo que no logró ser evidenciado, ya que la espora
estaba hiperparasitada y no se lograron evidenciar las estructuras para su clasificación. Las
muestras que presentaron mayor número de morfotipos fueron las de San José del Guaviare
encontrándose entre 3-6 morfotipos por muestra (Tabla 8).

Uno de los morfotipos encontrados correspondió a Glomus intraradices (Figura 20 (B)). Ésta es
una de las especies de Glomus más común de Florida, USA. Se ha reportado asociada a papaya,
tomate, apio, algunos cítricos, maní, maíz, fríjol, fresa, zanahoria, papa, avena y trigo. En la región
amazónica colombiana, Glomus intraradices sólo ha sido encontrada en suelos rizosféricos
provenientes del departamento del Amazonas asociada a potreros en la comunidad de Ventura y
en el municipio de Leticia, en las comunidades de San Juan de los Parentes, Mocagua, Zaragoza
y San Martín de Amacayacu asociada a pastos y en el presente estudió se encontró asociado a
Manihot esculenta en arreglos agroforestales de San José de Guaviare.

Los morfotipos no lograron ser identificados hasta especie, ya que las condiciones de las esporas
no eran las mejores y no se logró observar características importantes en la clasificación
taxonómica como son conexión hifal, presencia de cicatriz, presencia de escudos etc.

Extracción de DNA

De los protocolos seleccionados para la extracción de DNA a partir de esporas de HMA ninguno
fue eficiente, ya que en ningún caso se logró extraer DNA. Esto se pudo deber a la edad de la
espora, ya que, según De Souza (comunicación personal), para trabajar con esporas de hongos
de micorriza arbuscular se deben emplear esporas jóvenes viables. En la madurez y senescencia
las esporas crean capas de pared adicionales que tienen grandes contenidos de polisacáridos que
hacen impermeable la espora y por ende se dificulta su rompimiento (Guerrero, 1996). Por lo
anterior se tomo la decisión de realizar un muestreo de raíces y suelo rizosférico asociado a
Manihot esculenta en dos regiones de la amazonía colombiana, con el fin de extraer el DNA de
raíz, ya que el inóculo de esporas disponible estaba viejo y no existía la disponibilidad de tiempo
para realizar una nueva multiplicación.

Con la estandarización de los métodos de extracción de DNA de raíz también se presentaron

inconvenientes, ya que por ser extraído de raíz era un DNA de baja calidad y muy sucio. Parte de
la dificultad pudo deberse a la recuperación de DNA fungal de la raíz de la planta en suelo.
Polisacáridos, compuestos polifenólicos y sustancias húmicas, todas deben ser removidas de
forma eficiente para obtener DNA de alta calidad (Namanusart, 2003). También se pueden
presentar problemas con los tejidos de la raíz, dado que el tejido de los hongos está embebido
profundamente dentro de las raíces en los HMA y por eso la extracción de DNA puede causar más
problemas. Por lo anterior se observó que de los 4 protocolos que se probaron solamente con 2
se logro extraer DNA, pero el que mejor resultados presentó fue la extracción del ADN de la raíz
con el kit ultraclean DNA soil, ya que este tiene varios pasos de purificación y limpieza utilizando
columnas, elimina de manera más eficiente los polisacáridos, los compuestos fenólicos y las
sustancias húmicas Esto es muy importante, ya que estos compuestos son inhibidores de PCR.

Según Redecker, 2000 la mayoría de DNA extraído de raíces colonizadas es de origen vegetal y
por eso se deben emplear primers para PCR específicos para géneros para obtener fragmentos
de DNA fungal, ya que al utilizar primers que sean funcionales con casi todos los eucariotas no es
una aproximación útil para el estudio molecular de los HMA.

Redecker (2000), diseñó un grupo de primers para 5 subgrupos mayores de los Glomales
analizando secuencias de DNA bajo la consideración de la filogenia de los caldos de HMA. Se
mostró que los primers excluyen el DNA de plantas y la mayoría de otros hongos. Éstos
permitieron la amplificación de rDNA de HMA a partir de raíces colonizadas.

Amplificaciones con primers generales y género- específicos, clonación y secuenciación

El DNA extraído de fragmentos de raíces minorízales fue utilizada como templado para las
reacciones de PCR. El resultado del primer juego de primers (ITS4-NS5), que es el primer
exterior, no mostró ninguna banda. Después, el producto de PCR de un primer específico fue
generado en un tamaño de 200-pb y 300-pb por GLOM5.8R-ITS1F y GIGA5.8R-ITS1F,
respectivamente.

Sólo con estos primers pudo ser amplificado el producto de PCR, mientras que la amplificación
con los otros primers no evidenció producto positivo, indicando con esto que los géneros
reportados por Redecker (2000) no se encuentran en las muestras evaluadas colonizando la raíz
o que no fueron detectados por los primers usados. Para establecer cual de las dos causas
ocurre, sería necesario el uso de un mayor número de primers que cubran la mayoría de géneros
de MA y que incluya especies de suelos tropicales. Como se había mencionado anteriormente no
siempre los hongos MA encontrados en la rizósfera son los mismos que colonizan la raíz, por tal
razón la presencia de MA en interior de la raíz, evidenciado por técnicas moleculares es una
aproximación más exacta para corroborar cuales efectivamente se encuentran como simbiontes
en una planta determinada, ya que es posible encontrar esporas en el suelo de algunas especies
que no necesariamente estén colonizando la planta hospedera más cercana.

El grupo diana de los primers GIGA5.8R es la familia Gigasporaceae y con GLOM5.8R son
Glomus mosseae y el grupo de Glomus intraradices, (Redecker, 2000)). Los primers GIGA5.8R y
GLOM5.8R fueron probados y arrojaron buenos resultados con raíces de A. mangium colonizadas
por Gigaspora y Glomus (Namasuart, 2003). En los resultados de PCR obtenidos con raíces no-
colonizadas, no se observó este producto, ni siquiera después de una segunda amplificación, lo
que indica que solamente amplifican para los géneros de Glomus y Gigaspora.

En este estudio se evidenció la presencia de especies del genero Glomus por técnicas
moleculares en las muestras CHTR1 y CHTR3 del Sur del Trapecio Amazónico y en los arreglos
agroforestales 2, 7, 10 y 13. Mientras que especies del género Gigaspora se encontraron
únicamente en los arreglos agroforestales 7 y 10 de San José del Guaviare. A partir del producto
de PCR de estás muestras se realizó la clonación en TOPO, obteniendo entre 3 y 17 clones
positivos (Tabla 9).

En los amplificados de los clones con el inserto de interés obtenido en las muestras del sur del
Trapecio Amazónico, con el primer específico GLOM5.8R para el género Glomus, se obtuvo en
total 10 clones positivos, mientras que en las muestras de San José del Guaviare se obtuvieron 68
clones, tanto con el primer específico para Glomus como para Gigaspora (primers GLOM 5.8R y
GIGA 5.8R, respectivamente) (Tabla 9). Esto indica que las muestras de San José del Guaviare
tuvieron mayor incidencia de los HMA.

Estos datos pueden tener relación con las diferencias en la textura de suelo: los suelos con
mayores partículas de arena, permiten un mejor flujo de oxígeno y agua a profundidades mayores
por poseer poros más grandes. Por el contrario, suelos con un mayor número de partículas
arcillosas, tienden a tener poros pequeños y ser fácilmente compactable, por lo que el oxígeno se
limita a las zonas más superficiales del suelo. Los hongos MA son aeróbicos. Las esporas de
géneros con propágulos de gran tamaño como los miembros de la familia Gigasporineae tienen
una mayor superficie de intercambio y requieren de una mejor aireación que géneros con esporas
de menor tamaño, lo que explicaría la alta frecuencia de aislamiento de esporas de Glomus sp.
(Peña-Venegas et al., 2006).

Los análisis de ARDRA con los productos de amplificación de cada uno de los clones positivos
con los primers (GLOM 5.8 R y Giga 5.8R), evidenciaron que en las muestras colectadas en el
sur del trapecio amazónico se encontró en general una alta similaridad entre los clones evaluados,
a diferencia de lo encontrado en las muestras colectadas en San José del Guaviare, donde se
obtuvieron mayor número de grupos y en algunas arreglos agroforestales (A.AF 7 y A.AF 10) se
encontró que la correlación de los grupos fue a un porcentaje de similaridad de 0,00 (Figuras 28 y
29), con lo que se puede inferir una mayor diversidad de HMA este sitio de muestreo.
extracción de DNA

, a partir del aislamiento de sus esporas. Entre ellas está la capacidad natural de cada
especie para producir esporas, la época y las condiciones del muestreo.

Muchos de los HMA no esporulan (Sanders et al., 1996) o la producción de esporas está
condicionada a los cambios edáficos de
En los últimos años se vienen desarrollando métodos diferentes al aislamiento y
cuantificación de esporas para el estudio de las micorrizas arbusculares. Dentro de los
métodos se encuentra la comparación de secuencias de nucleótidos, especialmente el de
los genes rRNA que han revolucionado la taxonomía y la filogenética de este grupo de
hongos (Redecker & Thierfelder ,1997; Tuinen & Jacquot ,1998; Simon et al., 1992;
Redecker et al., 1997; Redecker, 2000) y ofrece ventajas tan importantes como la
posibilidad de caracterizar individuos aislados directamente de su hábitat, o de la planta
huésped sin tener que cultivarlos previamente en plantas trampa. A pesar de ello, el costo
para implementar estas técnicas imposibilita a muchos investigadores usarlas en forma
rutinaria o de diagnóstico en pequeños proyectos. Es así como la cuantificación de
esporas de HMA sigue siendo la forma mas sencilla de evaluar las poblaciones de
micorrizas en el suelo (Cuenca et al., 1998).
 Figura 1. No. morfotipos por muestra de suelo

150

100

50

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
No. morfotipos presentes/10g suelo

Es interesante anotar que a pesar que para los hongos del suborden Gigasporineae las
esporas son el propágulo principal, en ninguna de las muestras de suelo colectada en la
Amazonia colombiana, este grupo mostró ser el mas representativo en términos de la
cantidad de esporas por volumen de suelo, siendo su representatividad entre el 2 al 34%
para

Gigaspora y Scutellospora. Los géneros que con mayor frecuencia invaden otras esporas
son GlomusAcArchaeospora y Acaulospora de menor tamaño y superficie lisa si. Es
posible que las esporas con capas mucilnosos en el exGlomus, las paredes y
ornamentaciones para Acaulospora, la presencia de las dos cicatrices para
Entrophospora, la presencia del escudo germinal y una pared compleja para
Scutellospora, y la composición simple de pared para Gigaspora.

2003, sometido). La mayoría de los géneros se aislaron en un rango de pH entre 4.0 y

5.0, siendo este su pH natural.
et al., 1994). De allí que los hongos prefieran usar la red de micelio extraradical para
colonizar nuevos huéspedes en suelos pobres en este elemento, que consumir una buena
cantidad de ATP en la producción de propágulos.
± 27.8% independientemente de la cobertura. Por otra parte, la presencia de arbúsculos
en muestras provenientes de la Amazonia colombiana es poco común, los mayores
valores aparecen en muestras provenientes de sistemas antrópicos como los
agroforestales y no en condiciones naturales. Se encontró igualmente una correlación
directa entre el porcentaje de colonización radical y el porcentaje de arbúsculos (p=0.30),
en donde los valores promedio de colonización radicular (37.6%) están en el límite inferior
en que se observa la presencia de arbúsculos.

Si realizamos el análisis por cobertura, encontramos que los sistemas agroforestales,

seguidos por los rastrojos y el bosque nativo presentan los mayores promedios de coo
Distribución de géneros de hongos micorriza arbuscular en la región amazónica
colombiana

Glomus manihotis, Glomus sp8 y Acaulospora mellea solo fueron aislados de suelos
francos y no de suelos arcillosos. Para el género Entrophospora se encontraron dos
grupos de la misma especie claramente separables: aquellos biotipos que prefieren los
suelos arenosos y aquellos aislados de suelos franco a arcillosos, los dos biotipos
estarían relacionados con su lugar de origen.

La mayor sensibilidad a los suelos arcillosos estaría dada por la poca disponibilidad de
oxígeno y bajo drenaje de estos suelos, la formación deictats acos en taría la viabilida

Paul & Clark, 1996). La acidez igualmente esta directamente relacionada con tercambio
cationic generos se aislaron en un rango de pH entre 4.0 y 5.0, siendo este su pH natural
para desarrollar la simbiosis, establecerse en el suelo y esporular.

foro. ción de esporas se encuentran los niveles de fósforo en el suelo (p= 0.55). Este
hecho puede estao la imporas en lipidos, proteinas y glucogeno ( que consumir una buena
cantidad de ATP en la producción de prop
Concentraciones bajas de este elemento tienden a generar simbiosis mas efectivas
(Douds & Schenck, 1990; Jonson, 1993, Arcos, 2003). El coeficiente de correlacion de
pearson tambien mostro una correlacion inversamente proporcional entre las
concentraciones de fosforo y la colonización radicular (p=0.10) y la presencia de
arbúsculos (p=0.72).
Los niveles de fosforo en solucion en los suelos amazonicos tienden a ser muy bajos. El
proEsta relacion podria estar igualmente relacionada con la disponibilidad de fosforo,
encontrando concentraciones mas bajas en las zonas no inundables.
vesículas y las concentraciones de fosoforo (p=0.01). Las vesículas souras de amn.
Aparentemente su formación estaria dada por la naturaleza misma de la especie de HMA
que no por efecto de f
fosfatados,pueden ser contraproducentes para el desarrollo de la simbiosis MA en los
suelos de la region. Se deben asegurar niveles bajos de fosforo que p
en la distribución de generos de HMA en el suelo, posiblemente por la disponibilidad de
oxigeno y l
 CONCLUSIONES

La simbiosis se encuentra establecida en las 2 regiones estudiadas de la Amazonía puesto que se

encontraron propágulos infectivos y colonización, lo cuál se corroboró por las dos aproximaciones
metodológicas (técnicas taxonómicas y caracterización molecular); sin embargo la riqueza de
morfotipos fue baja ya que solamente se encontraron los géneros Glomus, Gigaspora y
Acaulospora, siendo el género Glomus el más predominante.

La relación entre porcentaje de colonización radicular y número de esporas no fue directamente

proporcional, ya que no siempre en las muestras que hubo mayor colonización hubo mayor
número de esporas; la colonización estuvo directamente relacionado con algunas características
fisicoquímicas del suelo como textura, pH, materia orgánica, saturación por aluminio y
concentración de fósforo; al igual que con la riqueza de especies vegetales presentes en las
coberturas muestreadas.

El protocolo de extracción de DNA con mejores resultados fue el del Kit “Ultraclean DNA Soil”,
permitiendo la amplificación de los géneros Glomus (6 muestras) y Gigaspora (2 muestras) de 12
evaluadas; sin embargo no hubo una relación directa entre la presencia de Acaulospora en suelo
rizosférico y su ausencia dentro de la raíz, al igual que sobre la presencia de Gigaspora dentro de
la raíz, pero no en el suelo rizosférico; hecho evidenciado por técnicas moleculares.

Las muestras correspondientes a San José del Guaviare fueron las más abundantes y diversas en
cuanto al número de clones específicos y grupos generados por los análisis de patrones de
restricción. El alineamiento de las 2 secuencias obtenidas con las bases de datos del Genebank
mostró que estás presentaron una homología del 94% y 92%, respectivamente, con los clones
Giga 3538.1 y Glomus Pa106.

Las aproximaciones moleculares permiten estimar la presencia de varios géneros de HMA en una
sola pieza de raíz micorrizada, sin embargo su uso en conjunto con las técnicas de identificación
taxonómica clásicas permiten el estudio ecológico de está simbiosis en un ambiente determinado.
 RECOMENDACIONES

Para la caracterización molecular de HMA a partir de esporas, es necesario extraer el ADN a partir
de esporas jóvenes y en el mismo estadio de maduración.

Para disminuir la alteración extrínseca de los rasgos morfológicos de las esporas, los cuales son
indispensables para su identificación taxonómica, es indispensable dejar secar el suelo después
del muestreo para evitar que se altere su morfología por procesos de humedad.

Con el fin de obtener un fragmento de PCR de mayor tamaño (~1000 pb), es necesario evaluar la
combinación de primers generales como ITS4i con primers genero-específicos GLOM1310,
ARCH1311, ACAU1661, LETC1671, según lo recomendado por Redecker et al (2003) y de está
manera obtener datos de secuencia más completos que permitan aclarar la filogenia de está
comunidad de HMA.

El Análisis ARDRA es útil para seleccionar los clones a ser secuenciados, pero se debe utilizar
como técnica complementaria a otros procedimientos moleculares que confirmen la presencia de
HMA ya que al utilizarla de manera única puede generar problemas, ya que se pueden detectar
posibles amplicones no glomeromycotanos.
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180.http://invam.caf.wvu.edu/index.html
181.
182.http://www.turipana.org.co/micorrizas.htm
183.
184.
 11. ANEXOS

Anexo 1
Protocolos de extracción de DNA a partir de esporas de HMA

1. Sanders & Kathleen, 1995

Extraer las esporas de los potes por las técnicas de centrifugación en sucrosa y flotación y
verificar el contenido de cada espora (viabilidad). Sonificar las esporas por 15 min para
remover artefactos de la superficie y organismos potencialmente contaminantes. Extraer el
DNA macerando una sola espora o esporocarpo con unas pinzas pequeñas estériles en tubos
(Eppendorf) con 20 µl de TrisCl a pH 8.0, mantener las muestras en hielo y agregar 20 µl de la
resina Chelex 100. Centrifugar las muestras por 5 min a 14000 rpm y colectar el sobrenadante.

2. Redecker & Thierfelder, 1997.

Las esporas se extrajeron del suelo por tamizado en húmedo y decantación. Bajo microscopio
de disección se separaron con una micropipeta y se transfirieron a una caja de petri con agua
estéril. Posteriormente se colocaron en un tubo Eppendorf con una mínima cantidad de agua.
El DNA se extrajo, macerando las esporas con la punta de una pipeta en: 2 µl de NaOH 0.25M
y se incubaron en un baño de agua hirviendo por 1 minuto. Luego se adiciono 1 µl de Tris HCl
0.5M (pH 8.0) y 2 µl de HCl 0.25M y se pusieron a hervir de nuevo por 2 minutos. Centrifugar
por 5 minutos a 14000 rpm y colectar el sobrenadante.

3. Manian et al, 2001

Las muestras fueron congeladas en nitrógeno liquido en tubos de 0.5 ml y maceradas con la
punta de una micropipeta. A cada muestra se añadió 100µl de buffer de lisis (200 mM tris-HCl
pH 7.5, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA y 1% SDS, w/v) y fueron mezclados. Las muestras fueron
sujetas a 3 ciclos alternados de congelamiento en nitrógeno líquido e incubación a 100°C por 1
minuto, seguidos por congelamiento y una incubación final a 100°C por 10 minutos. Los
contenidos de cada tubo fueron centrifugados a 11000 g por 3 minutos y el sobrenadante fue
colectado cuidadosamente. Los sobrenadantes fueron pasados a través de columnas de
purificación de DNA (QIAquick, Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
DNA purificado fue suspendido en 50µl 1mM tris-HCl pH 8.5 precalentado a 55°C.

NOTA: Este protocolo se probó a partir de 10, 20, 50, 60, 100 y 120 esporas y se monto 5
veces. Esto se debe a que en la primera extracción se observo una pequeña banda dudosa de
DNA. En la macerada de las esporas se utilizo perlas de circonio y vidrio molido para facilitar
el rompimiento de las esporas, pero sin ningun resultado positivo. El paso de purificación en
columnas no se realizo debido a que no teníamos columnas.

4. Dibonito et al, 1995

Macerar las muestras de raíces o propágulos con un micropestle en tubos eppendorf . Se

adiciono 800 µl de buffer de extracción (1 mM Tris HCl pH 8,5 y resina Chelex al 5%), los
contenidos de cada tubo fueron hervidos por 15 minutos. La resina fue removida por
centrifugación a 12000 g/20 segundos. El sobrenadante se colecta para usarlo posteriormente
para PCR.

NOTA: Este protocolo se realizo a partir de muestras de esporas extraidas de suelo

rizosferico.

5. Tuinen & Jacquot, 1998

Las esporas fueron colectadas en tubos eppendorf y lavadas con agua destilada esteril.
Macerar las esporas con 40 µl de buffer TE (TrisHCl 10 mM y EDTA 1 mM). Calentar a 95ºC
por 10 minutos en presencia de 10 µl de chelex 100. La suspensión cruda se separo por
centrifugación a 12000 g/ 5 minutos. Se colecta el sobrenadante.

6. Gadkar & Rillig, 2005

Las esporas individuales de las especies de Glomus y Gigaspora fueron escogidas bajo un
estereoscopio y dispensadas cuidadosamente en tubos de 0.5 ml que contenían 2.5 µl de
KOH (0.25 N). Cada espora individual fue macerada un micropestle estéril bajo el
estereoscopio. Los contenidos fueron mezclados en un vortex brevemente. Posteriormente
fueron hervidos a 90ºC/ 10 minutos. A esta solución se le adiciono 2.5 µl de solución
neutralizante (0.5 M de TrisHCl pH 8.0 y 0.25 N de HCl) fueron hervidos nuevamente a
90ºC/10 minutos. El DNA extraído fue usado inmediatamente.

NOTA: Este protocolo se empleo a partir de esporas de las especies de Glomus, Acaulospora
y Scutellospora.

7. Dodd et al, 1996

Las esporas fueron colectadas en Cajas de petri en papel filtro y posteriormente transferidas a
tubos eppendorf que contenían STEB (20 mM trisma base, 10 mM de NaHCO3, 10mM de
MgCl2 x 6 H20, 0.1 mM Na2 EDTA x 2H20, 10mM de mercaptoetanol, 2% de triton X-100).
Las esporas colectadas en los tubos fueron maceradas sobre hielo durante 2 minutos
utilizando un pestle de vidrio. Centrifugar a 20000 g/20 minutos a 4ºC. El sobrenadante se
transfieren a otro tubo estéril y se almacena a -80ºC hasta su utilización en PCR.

8. Kowalchuk, De Souza & Van Veen, 2002

Las esporas fueron sonicadas 4 veces por 15 segundos y lavadas 6 veces con agua destilada
estéril entre los pasos de sonicacion. Las esporas fueron seleccionadas nuevamente bajo el
estereoscopio y transferidas individualmente a tubos de microcentrifuga, el exceso de agua fue
removido. Las esporas fueron maceradas con un micropestle. Se adiciono 40 µl de TE (10 mM
Tris HCl pH 8.0 y 1 mM de EDTA) y 10 µl de resina chelex 100, fueron macerados
nuevamente. Las muestras se someten a 4 ciclos de congelamiento y ebullición por 1 min,
seguido por una incubación final a 95ºC por 5 minutos. Finalmente las muestras se centrifugan
a 10000 g/5 minutos y se colecta el sobrenadante en un tubo estéril.

9. Öpik, 2004

Las muestras fueron sembradas en 750 µl de buffer CTAB (2% de CTAB, 20 mM EDTA, 100
mM TrisHCl, 1.4M NaCl), con la ayuda de un micropestle y arena fina de cuarzo se maceraron,
y posteriormente se incubaron a 65ºC/1 hora. Las muestras se centrifugan a 14000 g/5
minutos. El sobrenadante fue colectado y precipitado con 750µl de isopropanol a -20ºC por al
menos 1 hora y centrifugadas a 14000 g/30 minutos. El pellet fue lavado con 200µl de etanol al
70% a -20ºC, centrifugadas a 7000 g/5 minutos. Secado y resuspendido en 25 µl de agua
estéril o buffer TE.

10. Antoniolli, 1999

Grupos de esporas fueron sonicados por 20 segundos durante varias veces, seguido por un
enjuague con agua estéril desionizada. El agua fue removida transfiriendo la suspensión de
esporas a un papel filtro, las esporas fueron transferidas a tubos de microcentrifuga de 1.5 ml.
Las muestras se maceran con un micropestle sobre hielo en 50µl de buffer de extracción que
contenía (100 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 2mM de MgCl2 y 2% de triton pH 8.0). Las
muestras fueron mantenidas en hielo 2-3 minutos y centrifugadas a 6000 rpm/2 minutos. El
sobrenadante que contiene el DNA fue transferido a un tubo nuevo y guardado a -20ºC.
11. Kit ultraclean DNA soil

En el tubo con la solución bead (2 ml) adicionar la muestra de esporas, mezclar suavemente.
Adicionar 60 µl de solución S1, mezclar suavemente en un vortex, se adiciono 200 µl de
solución IRS, mezclar entre 3-4 segundos en un vortex suavemente, incubar a 70ºC durante 5
minutos, mezclar nuevamente en el vortex, incubar nuevamente por otros 5 minutos, mezclar
nuevamente. Centrifugar a 10000 g/30 segundos, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo
de microcentrifuga estéril, adicionar 200 µl de solución S2, mezclar suavemente en un vortex,
centrifugar por 1 minuto a 10000 g, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrifuga
nuevo. Adicionar 1.3 ml de solución S3 al sobrenadante, mezclar con vortex nuevamente,
pasar a través de las columnas aproximadamente 700 µl, centrifugar, descartar lo que se
colecta en el tubo. Adicionar 300 µl de solución S4, centrifugar 30 segundos a 10000g,
descartar lo colectado en el tubo, centrifugar nuevamente 1 minuto, cambiar el tubo por un
tubo nuevo estéril, adicionar 50 µl de solución S5 en el centro de la membrana, centrifugar 30
segundos, descartar el filtro, almacenar lo recolectado en el tubo a -20ºC.

12. Procedimiento utilizado por Francisco A De Souza (Brasil) para 1 espora

Macerar la espora en tubos de microcentrifuga de 1.5 ml usando un micropestle,

inmediatamente adicionar 40 µl de buffer TE pH 8.0, mezclar nuevamente usando el
micropestle, adicionar 10 µl de chelex 100 (20%), mezclar una vezmásusando el micropestle.
Incubar en un baño de agua a 95ºC durante 10 minutos, congelar en hielo, centrifugar a
10000g por 1 minuto, transferir el sobrenadante a un tubo esteril nuevo, almacenar a -20ºC
después de usar, usar de 1-5 µl por reacción de PCR.

13. Procedimiento utilizado por Francisco A De Souza (Brasil) 10-60 esporas

Macerar la espora en tubos de microcentrifuga de 1.5 ml usando un micropestle,

inmediatamente adicionar 800 µl de buffer TE pH 8.0, mezclar nuevamente usando el
micropestle, adicionar 40 µl de chelex 100 (20%), mezclar una vezmásusando el micropestle.
Incubar en un baño de agua a 95ºC durante 10 minutos, congelar en hielo, centrifugar a
10000g por 1 minuto, colectar el sobrenadante en un tubo nuevo estéril, adicionar 5 µl de
RNAasa , incubar a 37ºC por 10 minutos, diluir la preparación de DNA hasta 1/500, la tasa de
dilución depende de la naturaleza de la especie analizada.
almacenar a -20ºC después de usar, usar de 1-5 µl por reacción de PCR de 25µl.

14. Método de extracción CTAB

Colectar entre 10-50 mg de esporas o micelio, transferir la muestra a tubos eppendorf,

macerar las muestras congeladas con un micropestle plástico, adicionar inmediatamente entre
300-500 µl de buffer CTAB con 0.1mg de proteinasa K. Mezclar suavemente con un vortex,
incubar por 1 hora a 65 ºC, centrifugar de 5-10 minutos a 13000 g, colectar el sobrenadante en
tubos nuevos estériles , adicionar 500 µl de cloroformo: isoamil alcohol (24:1), centrifugar
nuevamente, colectar el sobrenadante. Adicionar 1 ml de isopropanol, mezclar, incubar a
-70ºC por 1 hora, centrifugar a 13000 g por 30 minutos, eliminar el sobrenadante , retener el
pellet y secar a temperatura ambiente, finalmente resuspender el pellet en 30-50 µl de agua
ultrapura o buffer TE proceder inmediatamente con la PCR.

A partir de la solución de DNA obtenida en cada uno de estos protocolos se monto una
electroforesis en un gel de agarosa de 0.8% a partir de 10 µl de la muestra con 1 µl de blue
juice como buffer de carga. En ningún caso se obtuvo banda lo que nos indica que no se logro
extraer DNA o que la cantidad obtenida fue muy baja y por ende no se evidencio señal en el
gel. Debido a esto se monto una PCR directamente de la solución obtenida en cada uno de los
protocolos utilizando como iniciadores el par ITS1/ITS4, ya que estos han sido reportados para
la identificación de la mayoría de las especies de hongos de micorriza arbuscular,
obteniéndose excelentes resultados.

El método de amplificación por PCR que se utilizo fue el reportado por Sanders &
Kathleen, 1995.

La mezcla PCR contiene: Una concentración final de 200 µM de cada dNTP, 50 mM de KCl,
10 mM de TrisHCl (pH 8.3), 1.5 mM de MgCl2 y 1 µM de cada primer (ITS1 e ITS4) y 5µl de
DNA. Las reacciones fueron llevadas a cabo en un termociclador programable (PTC-100). El
paso de denaturacion inicial fue 95ºC por 9 minutos, seguido por 40 ciclos de denaturacion,
anillaje y extensión las temperaturas y tiempos para estos pasos son: 95ºC por 30 segundos,
55ºC por 45 segundos y 72ºC por un minito. La extensión final fue a 72ºC por 10 minutos.