UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 

FACULTAD DE QUÍMICA 

MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

GRUPO 11

EQUIPO 7

TRABAJO FINAL

"CASO CLÍNICO"

 
INTEGRANTES:
Nequis González Jesús Alberto
Velázquez Gutiérrez Cynthia Sarahi

Caso
“Una paciente con diabetes refiere problemas a la micción caracterizados por
ardor al orinar, prurito vulvar y la presencia de eritema y edema, se solicita una
muestra de orina para urocultivo y se encuentran abundantes levaduras, indique
los pasos para identificar la levadura causante del problema, así como medios,
pruebas, resultados de estas y métodos de control para este problema.”

 POSIBLES AGENTES ETIOLÓGICOS

En una infección urinaria, la levadura más común es Candida. El crecimiento de

este tipo de levaduras se ve favorecido en la presencia de glucosa, es por ello
que la candidiasis es más frecuente en pacientes con diabetes. De igual manera,
las mujeres son más susceptibles a desarrollar una infección urinaria por hongos.
Existen diversas especies de Candida, pero la más frecuente y conocida es C.
albicans y Candida  glabrata

1. Candida albicans: Como es sabido es

la levadura que , más frecuentemente
produce patología en la cavidad oral, en
el tracto gastrointestinal y en la vagina
causando muy variadas manifestaciones
clínicas. Forma parte de la flora
comensal del tracto gastrointestinal,
vagina y mucosa bucal. Es el primer
causante de infección micótica
“oportunista” El espectro de las
manifestaciones clínicas causadas por esta especie incluye: Vaginitis,
infecciones cutáneas, cistitis y septicemia entre algunas otras
manifestaciones .

2. Candida  glabrata: Se aísla tanto en infecciones

intrahospitalarias como en infecciones superficiales,
fundamentalmente en candidiasis vulvovaginal. En
general, dentro del hospital, afecta a pacientes
inmunocomprometidos o debilitados. Esta especie se
aísla cada vez con mayor frecuencia en casos de
candiduria, especialmente en los pacientes
diabéticos, en quienes reciben tratamiento antibiótico
múltiple o son portadores de una sonda urinaria.
 MEDIOS DE PRIMO AISLAMIENTO

El medio de primo aislamiento e identificación de levaduras es ASD con antibiótico

(Agar Sabouraud Dextrosa con cloranfenicol y gentamicina). Las colonias de
levaduras son ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o
rugosa, con olor agradable, tornándose pastosas a medida que envejecen. El
género Candida se caracteriza por presentar colonias cremosas de color blanco
amarillento, lustrosas, poco elevadas y de bordes bien definidos.

 RECUENTO

Para el recuento de levaduras, el agar más común es el agar sangre y no necesita

ningún factor de dilución por el cual deba multiplicarse, el conteo es directo.

En una infección urinaria, el valor del recuento de colonias no está bien

establecido.

En general, se acepta que un parámetro de >10 000 UFC/mL indique infección

urinaria o candidiasis diseminada, sin embargo, es necesario contemplar varios
parámetros, como la edad, el género, el procedimiento de toma de muestra y si el
paciente sufre alguna enfermedad como diabetes. 

Para pacientes diabéticos un recuento bajo puede ser de valor, sin embargo, se
debe  considerar una nueva muestra.
 TINCIONES

La tinción simple nos ayuda a diferenciar, de una manera

rápida, entre bacterias y levaduras, ya que puede
observarse su morfología al microscopio ( 100x).

Las levaduras forman células redondas u ovaladas de

tres a siete micras de diámetro, que se reproducen por
blastoconidias y forman pseudomicelio en la mayoría de
las especies.

Las levaduras no presentan característica de Gram, por lo

que no es necesario realizar dicha tinción.

Existe otra prueba rápida

mediante la cual puede
diferenciarse una C. albicans
de cualquier otra  Candida, ya
que es la única capaz de
formar verdaderos tubos
germinales. Ésta prueba
involucra una tinción en
fresco.
 
Tubo germinativo: En 0.5mL de suero del paciente diabético (con glucosa arriba
de 150 mg) se suspende una pequeña muestra del cultivo con 24 horas de
desarrollo. Se incuba en una estufa bacteriológica por 3 horas y se observa al
microscopio (40x). La prueba es positiva al visualizar una estructura elongada que
se origina a partir de la levadura.

 MEDIOS SELECTIVOS O DIFERENCIALES

Placas de CHROMagar Candida, e incubadas

durante 48 horas a 30 ºC. Éste medio de cultivo es
el más eficiente y didáctico para la identificación y
diferenciación de las diferentes especies de
Candida. 

Los medios de cultivo CHROMagar Candida de

Becton-Dickinson (CHROM-O, CHROM-R) y
CHROMagar Candida de MAIM (CHROM-M) están
diseñados para el aislamiento y diferenciación de
varias especies de Candida de interés clínico. La
composición del medio CHROM-M por litro es la
siguiente: peptona (10,2 g), mezcla cromogénica (22 g), cloranfenicol (0,5 g) y
agar (15 g), tamponado a pH 6,1.
 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN 

Con placas de CHROMagar Candida

Pruebas bioquímicas 
Una de las pruebas bioquímicas más útiles para la identificación de cepas es la
asimilación de carbohidratos, ya que cada especie tiene un metabolismo único.

Los patrones de asimilación de azúcares (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa,

galactosa y rafinosa) permiten identificar las diferentes especies de Candida.

Una prueba positiva se caracteriza por el viraje del color del medio, de morado a
amarillo.

Una prueba negativa es aquella donde no ocurre viraje del color y el medio
permanece morado.

  

La
formación de clamidosporas, blastoconidias y
artrosporas es de gran importancia para identificar y diferenciar algunas especies
de Candida. 

En este caso, se hace una diferenciación de C. albicans y C. glabrata, gracias a

que la primera levadura forma estas estructuras mientras que la segunda no lo
hace, respectivamente. 

Se siembra la colonia a estudiar (con estría en paralelo) en agar Harina de maíz.

Se coloca un cubreobjetos sobre el estriado y se incuba a temperatura ambiente
por 3-5 días. Pasado el tiempo, se observa al microscopio (a 10x y 40x). Se
observan dichas estructuras se trata de una C. albicans.

Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para identificar

Candida albicans.

La identificación de los aislados de levaduras, aislados desde CHROMAgar

Candida, se realiza mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con partidores específicos para detección de especies de Candida.

Debido a que Candida albicans y Candida dubliniensis comparten características

morfológicas, fisiológicas y presentan patrones bioquímicos similares, no es
posible diferenciarlos mediante el uso de CHROMAgar Candida (ambas son
verdes en este medio de cultivo).

Para poder identificar aislados de estas especies se utiliza partidores específicos

de pared celular para amplificar por PCR el gen HWP-1 que codifica para la
proteína 1 de pared de la hifa.

Esta técnica produce amplificación de

un fragmento de ADN que es de
distinto tamaño dependiendo de la
especie.

La amplificación por PCR se lleva a cabo en tubos Eppendorf, los productos

amplificados se separan por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1,5%
utilizando marcadores de tamaño molecular de 50 y/o 100pb de la marca Bioline.
El gel es tratado con bromuro de etidio y los productos se visualizan mediante el
uso de un transiluminador UV y son registrados fotográficamente. Se utilizan como
control las cepas C. albicans A.

En esta imagen, los dos primeros

carriles corresponden a las cepas de
control, la primera corresponde a C.
albicans ATCC 90029, con 1180 pb y
la segunda a C. dubliniensis CD36
con 930 pb. Los carriles 3 y 4 corresponden a aislados clínicos, correspondiendo 3
a C. albicans y 4 a C. dubliniensis.

Técnica de Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos de Restricción

(RFLP) para identificar Candida albicans y Candida dubliniensis

A modo de control se realiza un corte de los fragmentos con la enzima de

restricción Baní que permite diferenciar a ambas especies en un ensayo de
verificación. Se agregan el amplicón obtenido por PCR a un tubo con enzima
BamHI, Buffer K y agua.

Para la mezcla de los controles se reemplaza la enzima MspI por agua. Se

mantiene a 37 ºC durante 3 horas y se agrega Colorante 10x para luego realizar la
electroforesis en gel de agarosa. El ADN de C. albicans cortado con BamHI
produce fragmentos de 793 y 387 pb., en cambio el ADN de C. dubliniensis no es
cortado por esta enzima.

Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para identificar

especies de Candida no Candida albicans

Para distinguir las especies C. albicans de C. glabrata se utiliza la técnica de

polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) acoplada a PCR
(PCR-RFLP) con los partidores ITS1
e ITS4. Las especies son
identificadas por el distinto tamaño de
los amplicones. Se utiliza como
control las cepas C. albicans ATCC
90029, C. dubliniensis CD36, C.
glabrata ATCC 2001 y C. tropicalis
ATCC 750.

En la siguiente figura, corresponde al control de C. tropicalis y cg al control de C.

glabrata. Los aislados  90 y 92 fueron identificados como C. glabrata. 
Técnica de Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos de Restricción
(RFLP) para identificar especies de Candida no Candida albicans

Como control se realiza digestión con la enzima MspI, se agrega amplicón

obtenido por PCR a un tubo con la enzima MspI,  Buffer Tango y agua. Para la
mezcla de los controles se reemplaza la enzima MspI por agua.

Se mantiene a 37ºC durante 3 horas y se agrega Colorante 10x para luego realizar
la electroforesis en gel de agarosa. Este RFLP da fragmentos de 297pb y 238pb
para C. albicans; de 557pb y 314pb para C. glabrata; de 340pb y 184pb. 

 POSIBLE TRATAMIENTO

Para tratar la candidiasis vaginal debe recetarse un antimicótico, en cualquiera de

sus formas farmacéuticas.

Se recomienda que sea Miconazol, Clotrimazol, Tioconazol y Butoconazol.

Candida glabrata tiene resistencia al tratamiento con fluconazol

La dosis está sujeta a valoración del médico y especificaciones del fabricante.

Al tratarse de una mujer diabética, también se recomienda el control de la glucosa,

ya que ésta es un medio para el crecimiento de las levaduras. También se
recomienda una sana alimentación, así como realizar ejercicio

 CONCLUSIONES
C. albicans y C. glabrata son las principales especies causantes de una infección
urinaria, sin embargo C. albicans es la más aislada de pacientes con diabetes, por
tanto, es probable que sea la cepa causante de la candidiasis en la paciente.

Ambas especies se asocian a la utilización de glucosa como factor de crecimiento,

por lo que la diabetes de la paciente es un factor de suma importancia en la
infección.

A pesar de que ambas especies son comunes en las infecciones del tracto urinario
existen diversos factores que las diferencian y que gracias a ellos pueden
realizarse pruebas de identificación desde las más básicas hasta las más
específicas.

Así mismo, tienen un metabolismo distinto, el cual da paso a la eficiencia en las

pruebas bioquímicas como métodos de identificación.
 
A pesar de que no existe un parámetro exacto para el conteo de levaduras a partir
del cual pueda diagnosticarse una candidiasis, por los síntomas y características
que presenta la paciente, una candidiasis es el diagnóstico más acertado
BIBLIOGRAFÍA

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