Instituto Tecnológico De Tijuana

Investigación 3.3 Enzimas. Cinética de las

reacciones Enzimáticas; efectos del pH, de temperatura y
efecto de otros agentes. Uso de las enzimas como índice
de calidad. Reactivación de enzimas.

Alumno:

García Rodríguez Karen Aylín

17210505

Fecha de entrega

19 de mayo de 2020

Índice
1
2 Marco teórico..............................................................................................................................4
2.1 Enzimas:...............................................................................................................................4
2.2 Cinética de las reacciones de las enzimas...................................................................4
2.3 Efectos del pH, de temperatura y efecto de otros agentes......................................7
a) Efecto del pH......................................................................................................................7
b) Efectos en la temperatura..............................................................................................8
c) En presencia de otros factores.....................................................................................8
2.4 Uso de las enzimas como índice de calidad................................................................9
Los alimentos, las células y las enzimas........................................................................9
2.5 Reactivación de enzimas................................................................................................18
Bibliografía....................................................................................................................................20

Índice de imágenes:

2
Figura 2. 1 Se muestra la representación de una enzima...................................4
Figura 2. 2 Fijación enzimática...............................................................................5
Figura 2. 3 Diagrama de energía de fijación enzimática......................................6
Figura 2. 4 Efectos enzimático en el pH................................................................7
Figura 2. 5 Efecto enzimático en temperatura......................................................8
Figura 2. 6 Eduard Buchner....................................................................................9
Figura 2. 7 Enzima.................................................................................................10
Figura 2. 8 Ruta metabólica de producción de etanol.......................................14
Figura 2. 9 Queso camembert..............................................................................15
Figura 2. 10 Queso roquefort...............................................................................16
Figura 2. 11 Enzimas de productos lácteos........................................................17
Figura 2. 12 Salmonella.........................................................................................18
Figura 2. 13 SDS-PAGE al 12 %, de las fracciones proteicas de la CEH.........19

3
 Objetivo
Conocer más sobre: Enzimas. Cinética de las reacciones Enzimáticas;
efectos del pH, de temperatura y efecto de otros agentes. Uso de las enzimas
como índice de calidad. Reactivación de enzimas.

2 Marco teórico
2.1 Enzimas:
Las enzimas son proteínas (RNA) que catalizan reacciones químicas en las
células. Cada enzima es altaente específica para la reacción que cataliza. Esta
especificidad está determinada por el centro activo de la enzima (en donde se
hallan los grupos químicos responsables de la catálisis). (Ren et al., 2008; Hsu,
2010).

Son Proteínas de alto peso molecular (macromoléculas, 104 a 106 g/mol,

102 a 104 aminoácidos) Su actividad depende de la integridad de su conformación
proteica. Metales pueden formar parte de su centro activo, o de otra parte de la
enzima (co-factor). Los reactivos de las reacciones catalizadas por enzimas se
denominan sustratos (Ren et al., 2008; Hsu, 2010)

Figura 2. 1 Se muestra la representación de una enzima

2.2 Cinética de las reacciones de las enzimas

La unión entre un enzima y su sustrato para formar el complejo enzima-
sustrato se ve favorecida por la formación de una serie de interacciones débiles
(puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, etc) entre grupos funcionales
complementarios de ambas moléculas (Ghaly et al., 2013; Silva et al., 2014).

La formación de cada una de estas interacciones débiles va acompañada

por la liberación de una pequeña cantidad de energía libre que contribuye a
estabilizar el complejo. La suma de todas estas pequeñas cantidades de energía

4
liberadas por a totalidad de las interacciones débiles formadas representa la
energía de fijación (Ghaly et al., 2013; Silva et al., 2014)

El papel que juega esta energía en la catálisis enzimática es de una

importancia extraordinaria: la energía de fijación no se limita a producir una
estabilización del complejo enzima-sustrato, sino que constituye la principal fuente
de energía libre que los enzimas utilizan para rebajar la barrera de energía de
activación y con ello aumentar la velocidad de la reacción catalizada (Ghaly et al.,
2013; Silva et al., 2014)

En primer lugar, el enzima puede fijar a las moléculas reaccionantes

(sustratos) de manera que queden muy próximas entre sí sobre el centro activo y
a su vez próximos a eventuales grupos catalíticos del propio enzima (Ghaly et al.,
2013; Silva et al., 2014)

En segundo lugar, el enzima fija a las moléculas reaccionantes de manera

que quedan no sólo próximas entre sí, sino orientadas en la relación geométrica
más favorable para que la reacción tenga lugar, es decir, con sus grupos
funcionales reaccionantes enfrentados. Las colisiones al azar de moléculas
reaccionantes en el medio de reacción son extremadamente improbables, y aún
en el caso de producirse, la orientación de los grupos funcionales reaccionantes
no será la más favorable en la mayor parte de los casos (Ghaly et al., 2013; Silva
et al., 2014)

Figura 2. 2 Fijación enzimática

El centro activo del enzima, al fijar a los sustratos de manera

energéticamente favorable mediante interacciones débiles, y al hacerlo con una
orientación precisa, proporciona a éstos un "lugar de encuentro" idóneo para que
se lleve a cabo la reacción. La combinación de los factores de proximidad y
orientación favorable de los sustratos sobre el centro activo explica por sí misma

5
los incrementos de velocidad observados en algunas reacciones catalizadas
enzimáticamente (Ghaly et al., 2013; Silva et al., 2014).

Sin embargo, los enzimas todavía pueden utilizar la energía de fijación de

un modo adicional para producir catálisis, a saber, provocando en las moléculas
de sustrato una distorsión favorable para que se alcance con prontitud el estado
de transición (Gómez et al., 2013).

Figura 2. 3 Diagrama de energía de fijación enzimática

Cuando el sustrato penetra en el centro activo del enzima se forman

algunas interacciones débiles entre ambos; a partir de este momento, cualquier
distorsión del sustrato tendente a alcanzar el estado de transición se verá
acompañada por el establecimiento de interacciones débiles adicionales
energéticamente favorables. Así, el coste energético que supone llevar al sustrato
al estado de transición es "pagado" gracias al descenso de energía libre asociado
con el establecimiento de dichas interacciones débiles (Gómez et al., 2013)

La energía de fijación del sustrato al centro activo todavía puede suponer

una fuente adicional de poder catalítico. La optimización de las interacciones
débiles entre el sustrato y el enzima puede conducir no sólo a una distorsión
estructural y electrónica del sustrato, sino también a una alteración en la
conformación de la proteína enzimática (Gómez et al., 2013)

La alteración conformacional, conocida como encaje inducido, puede

conllevar una aproximación de grupos catalíticos esenciales del enzima a los
grupos funcionales del sustrato susceptibles de reaccionar, con lo que las
propiedades catalíticas del enzima se habrán visto incrementadas (Gómez et al.,
2013)

6
 La vieja y en exceso rígida imagen de la "llave y la cerradura" para describir
la interacción específica entre el sustrato y el centro activo del enzima, ha sido
sustituida por una más flexible en la que dicha interacción se contempla más bien
como la que tiene lugar entre "una mano y un guante", reflejando así el ajuste
mutuo que tiene lugar entre ambos objetos (Gómez et al., 2013).

El importante papel que juega la energía de fijación en la catálisis

enzimática da respuesta, por añadidura. En efecto: si la energía de fijación es la
principal fuente de poder catalítico, el enzima debe ofrecer el mayor número
posible de grupos funcionales capaces de establecer interacciones débiles con el
sustrato, con el consiguiente aumento en el tamaño de la proteína enzimática
(Gómez et al., 2013).

2.3 Efectos del pH, de temperatura y efecto de otros agentes.

a) Efecto del pH
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino
-NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según
el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o
neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas
eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la
actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo (Belén Camacho et al., 2007).

Figura 2. 4 Efectos enzimático en el pH

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.

Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden
afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de
2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios
del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han

7
desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH
intracelular: Los amortiguadores fisiológicos (Belén Camacho et al., 2007)

b) Efectos en la temperatura
En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas:
por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La
temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura
óptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento de
velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida
de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad
enzimática decrece rápidamente hasta anularse (Belén Camacho et al., 2007).

Figura 2. 5 Efecto enzimático en temperatura

c) En presencia de otros factores

A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no
proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser
iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas
conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se
llama coenzima. Muchos de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas
(Belén Camacho et al., 2007)

Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos

covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente
activa del enzima, es decir, el enzima unido a su grupo prostético, se llama
holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima
(Belén Camacho et al., 2007).

8
2.4 Uso de las enzimas como índice de calidad.
Los alimentos, las células y las enzimas
Antes de que el gran científico alemán Eduard Buchner se ofreciera como
voluntario para el servicio militar durante la Primera Guerra Mundial y muriera finalmente
ametrallado a los 57 años, justo 10 años después de ser galardonado con el premio
Nobel, este gran químico desarrolló trabajos en la Universidad de Tübingen en los que
demostró que el proceso de fermentación, descubierto por Pasteur, se podía llevar a cabo
en la ausencia de células. Por estas observaciones Buchner recibió el premio Nobel de
Química en 1907,1 después de publicar el trabajo titulado Fermentación alcohólica sin
células de levadura (Alkoholische Gährung ohne Hefezellen) (BUCHNER, 1897).

El químico supuso que la fermentación era resultado de la actividad de un

complejo enzimático, que él llamó zimasa. Su texto inicia: " Hasta ahora se había
conseguido separar la acción fermentativa de las células de levadura, a
continuación, se describe a un procedimiento que resuelve el
problema…"(BUCHNER, 1897).

Figura 2. 6 Eduard Buchner.

Actualmente se sabe que la primera etapa de la fermentación alcohólica se

lleva a cabo por 10 enzimas y se llama glucólisis, del griego glycos (azúcar)
y lysis (ruptura). Como producto del glucólisis se obtiene piruvato, el que
transforma en etanol debido a la acción de dos enzimas más. Buchner nunca
imaginó la importancia que las enzimas tendrían décadas después de sus
descubrimientos, ya que en la actualidad muchos de los procesos industriales se
llevan a cabo en presencia de estas proteínas catalizadoras (aceleradoras) de
reacciones químicas (BUCHNER, 1897).

9
 Adicionalmente, ahora sabemos que virtualmente todas las reacciones en
los seres vivos son catalizadas por enzimas. Las enzimas son proteínas que
forman parte de las células de todos los seres vivos. Debido a que son capaces de
acelerar la velocidad de reacciones químicas es que se les considera
catalizadores biológicos y son esenciales para que la célula esté metabólicamente
activa (BUCHNER, 1897).

Figura 2. 7 Enzima

Sin ellas, muchas de las reacciones químicas dentro de la célula serían muy
lentas, tanto, que no serían compatibles con la vida. En el área de alimentos, las
enzimas juegan un papel destacado, dado que muchas reacciones catalizadas por
éstas se llevan a cabo en los alimentos o en procesos alimentarios, tanto que el
30% de las enzimas que se producen industrialmente se utilizan en el área de
alimentos y bebidas (VOET et al., 2013).

Estas proteínas se clasifican de acuerdo con las reacciones que catalizan

en: oxidoreductasas (aceleran reacciones de óxido-reducción), transferasas
(transfieren grupos químicos entre moléculas), hidrolasas (rompen o sintetizan
enlaces covalentes de las moléculas), liasas (rompen enlaces formando a su vez
dobles ligaduras), isomerasas (catalizan un rearreglo espacial de grupos químicos
en la molécula sin modificar su composición química) y ligasas (promueven unión
covalente de dos moléculas acopladas con la ruptura de un enlace pirofosfato
como fuente de energía (VOET et al., 2013).

10
11
12
13
 Tabla 1. Ejemplos de enzimas usadas en alimentos y su fuente de obtención.

Las enzimas pueden estar relacionadas directamente con las

reacciones metabólicas de las células que constituyen un alimento. Por ejemplo, el
que un fruto madure depende directamente de un grupo de enzimas que se
expresan diferencialmente de acuerdo con la etapa de maduración. Este es el
caso de las pectinasas del jitomate, manzanas y peras, entre otras, que son
responsables del ablandamiento que sufren los frutos al madurar (Quirasco &
López-Munguía, 2013).

De igual forma, el proceso de germinación de una semilla depende de que

ésta se hidrate y de que enzimas hidrolicen (degraden) el almidón –polisacárido de
reserva–, haciendo disponible la glucosa que el embrión requiere para
desarrollarse. En dicho proceso se basa la producción de malta dentro de la
semilla de cebada (por acción concertada de las enzimas α y β-amilasas), que
posteriormente se utilizará para la producción de cerveza (Mathewson, 1998).

Los ejemplos anteriores muestran actividades propias del metabolismo de

las plantas que dan como resultado un alimento listo para consumir o un sustrato o
materia prima (la malta) apropiado para ser transformado. Particularmente, en el
caso de la cerveza y otras bebidas alcohólicas obtenidas a partir de un proceso
fermentativo, existe además el efecto de la actividad metabólica de las levaduras –
del género Saccharomyces– para la producción de etanol a partir de los azúcares
del mosto (VOET, 2013).

Figura 2. 8 Ruta metabólica de producción de etanol.

14
 Las enzimas también son utilizadas en la preparación de alimentos.
¿Cuántos de nosotros empleamos ablandadores de carne como práctica en la
cocina? El ingrediente activo de esa preparación culinaria son enzimas
proteolíticas o proteasas, las cuales son de origen vegetal y se llaman papaína y
bromelina (Tabla 1). Las proteasas hidrolizan proteínas, como las que forman
parte de los filamentos musculares y el colágeno de la carne, con la subsecuente
modificación de la textura del tejido muscular, haciéndolo más blando
(GUERRERO, 1999).

Ya que tocamos el tema de las proteasas, éstas son muy utilizadas en la

industria de alimentos en procesos tales como la elaboración de cerveza y en la
producción de salsa de soya. En el primer caso, en la producción de cerveza hay
una etapa en la que ésta se enfría pudiéndose formar cierta turbidez indeseable
en el producto. La papaína se utiliza para hidrolizar proteínas residuales de la
malta responsables del enturbiamiento (GUERRERO, 1999).

El caso de la producción de la salsa de soya es muy interesante, pues

involucra un proceso fermentativo de un hidrolizado de proteínas de soya y trigo.
Dicho hidrolizado se obtiene por la acción de proteasas extracelulares de dos
hongos microscópicos que participan en el proceso (Aspergillus
oryzae y Aspergillus sojae), aunque se pueden agregar proteasas puras para
acelerar la hidrólisis de las proteínas de soya y trigo (GUERRERO, 1999).

Figura 2. 9 Queso camembert.

15
 Las enzimas proteolíticas han sido utilizadas por el hombre desde tiempos
antiguos. Una de las aplicaciones que datan de las épocas más remotas de la
civilización humana es la utilización de enzimas para la producción de queso. La
renina o quimosina es una proteasa que se obtiene del cuarto estómago de
rumiantes aún no destetados, es una enzima cuya actividad es muy específica ya
que hidroliza un solo enlace de la proteína más abundante en la leche, llamada k-
caseína. Al romper este enlace, se forma un coágulo que conocemos como
cuajada (QUIRASCO & LÓPEZ-MUNGUÍA, 2013).

Ésta se separa del suero, se sala y se prensa, con lo que se obtiene el

queso fresco que es altamente consumido en nuestro país. Ahora que, si
hablamos de quesos madurados, para su elaboración intervienen lipasas y
proteasas extracelulares que producen, por ejemplo, hongos como Penicillium
camemberti o Penicillium roqueforti, con lo que se obtienen los quesos camembert
y roquefort, respectivamente. Las lipasas hidrolizan la grasa contenida en la leche
de manera gradual, con la generación de compuestos de aroma y sabor como el
ácido butírico, los cuales, a su vez, pueden ser transformados químicamente a
otras moléculas llamadas aldehídos y cetonas que también aportan aromas
característicos de los quesos (QUIRASCO & LÓPEZ-MUNGUÍA, 2013)

Figura 2. 10 Queso roquefort.

Por su parte, las proteasas hidrolizan parcialmente a las proteínas de la

leche, con lo que se produce un cambio de textura en el producto, haciéndolo más
suave. En algunos quesos fuertes, como el roquefort, es posible percibir un aroma

16
a amoniaco, el que se produce por una posterior descomposición de los
aminoácidos que se obtuvieron por la hidrólisis de las proteínas (MARILLEY &
CASEY, 2004).

Las enzimas también tienen un papel importante en la conservación de las

características químicas y sensoriales del alimento durante su proceso y
almacenamiento. A nivel industrial es una práctica común manejar el huevo en
polvo, con el fin de tener un producto más estable y más fácil de manejar. Para
este fin, el huevo se debe secar después de haberle eliminado la glucosa
(presente en la yema, principalmente), utilizando una enzima llamada glucosa
oxidasa. De no hacerlo, durante el secado se llevaría a cabo una reacción entre la
glucosa y las proteínas del huevo, dando como resultado un polvo de color oscuro
(BANKAR et al., 2009).

La glucosa oxidasa también consume oxígeno, por lo que se utiliza para

evitar que productos con alto contenido de grasas se oxiden. Se han desarrollado
empaques para alimentos donde la enzima se encuentra "atrapada" en el material
de empaque de tal forma que consume el oxígeno, evitando así que el producto se
enrancie. Este tipo de empaques se ha utilizado para mantener las propiedades
sensoriales de quesos y mayonesa durante su almacenamiento (BANKAR et al.,
2009).

Figura 2. 11 Enzimas de productos lácteos

Durante siglos se han utilizado bacterias ácido lácticas para la conservación

de alimentos. Por mucho tiempo se consideró que el ácido láctico producido por
estos microorganismos era el único responsable de evitar que otras bacterias se
desarrollaran en el alimento. Recientemente, se ha encontrado que algunas
bacterias lácticas como Pediococcus y Enterococcus, aisladas de productos

17
cárnicos y quesos, que además producen enzimas que tienen un efecto inhibitorio
contra bacterias patógenas como Salmonella entérica, Staphylococcus
aureus y Listeria monocytogenes. Dichas enzimas se llaman peptidoglucán
hidrolasas y se encargan de eliminar a los patógenos, debido a la ruptura de su
envoltura celular, con lo que la utilización de estas enzimas en alimentos podría
tener un efecto de bioconservación (GARCÍA-CANO et al., 2014).

Figura 2. 12 Salmonella

2.5 Reactivación de enzimas

Debido a que la producción de enzimas de estos organismos es muy baja,
se recurre al uso de la tecnología del ADN recombinante. Un problema muy
frecuente en la expresión de proteínas recombinantes de halófilos, es la formación
de cuerpos de inclusión (IB’s), debido a que las proteínas no se pliegan
correctamente en el citoplasma (carente de sal) de E. coli, produciendo
aglomerados proteicos (Figueroa et al., 2016).

En nuestro laboratorio, se logró la expresión de la carboxilesterasa (CEH)

putativa de Halobacterium sp. NRC1 en E. coli; sin embargo, esta enzima fue
obtenida como IB’s, que aunque se facilita su purificación, carece de actividad
enzimática. El objetivo del presente trabajo fue reactivar y caracterizar
parcialmente la CEH putativa de Halobacterium sp (Figueroa et al., 2016).

Se usó la cepa E. coli BL21 (D3E) Star para clonar y expresar el gene
VNG1474G que codifica a una carboxilesterasa putativa (CEH) del arquea
halofílica Halobacterium sp.3 NRC1, misma que se presentó como IB’s. Estos
fueron purificados en un sólo paso, usando cromatografía de afinidad a níquel.
Fueron realizados estudios de fluorescencia intrínseca para determinar la
concentración de aditivos que reactivaran a la enzima, por el método de diálisis y
dilución, usando buffers con diferentes concentraciones de urea, KCl y L-arginina.

18
Para determinar la identidad de la CEH obtenida, los cuerpos de inclusión se
identificaron mediante LC-MS (Figueroa et al., 2016).

Se determinó la actividad específica de los IB’s reactivados, usando ésteres

de p-nitrofenilo (acetato, propionato, butirato, valerato, caprilato, laurato, miristato
y palmitato), así como termoestabilidad. Resultados. Los IB’s de la CEH fueron
recuperados empleando un tampón conteniendo urea 3 M, KCl 2 M e imidazol 150
mM.

El análisis por SDS-PAGE reveló la presencia de una sola banda de

proteína (Fig. 1), con un peso molecular de 38 kDa, cuya identidad fue
posteriormente confirmada por espectrometría de masas, coincidiendo con la
secuencia predicha mediante el análisis bioinformático. Para disgregar los IB’s y
reactivar la enzima, se emplearon diferentes concentraciones de L-arginina, urea y
KCl, por el método de diálisis (Figueroa et al., 2016).

Figura 2. 13 SDS-PAGE al 12 %, de las fracciones proteicas de la CEH

Encontrado que la mejor recuperación de la actividad enzimática se logró

con 0.3, 3, y 2 M, respectivamente. Durante la reactivación, se mostró que la
actividad catalítica de la CEH fue dependiente de la concentración de KCl, pues la
actividad disminuyó hasta un 50% cuando no fue adicionado, revelando su
carácter halofílico. Esto sugirió que la sal, junto con la arginina y la urea, poseen
un efecto cooperativo de renaturalización de la proteína (Figueroa et al., 2016).

Sin embargo, la recuperación de la actividad enzimática de la CEH a partir

de los IB’s fue baja (40%). La CEH reactivada mostró preferencia para hidrolizar
ésteres de p-nitrofenilo de cadena corta, observando una especificidad hacia p-
nitrofenil-butirato (0.581 U/mg), confirmando que se trata de una esterasa. La

19
enzima mostró una actividad óptima a la temperatura y el pH de 60ºC y 7.5 y un pI
de 4.84 (Figueroa et al., 2016).

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