Patricia Alvarenga

METODOS DE ANALISIS PARA LA DETERMINACION DE NITROGENO Y

CONSTITUYENTES NITROGENADOS EN ALIMENTOS

1. MÉTODO DE KJELDAHL
• REALIZA UN ESQUEMA DETALLADO DEL PROCESO.

Se pesa aproximadamente 10 gramos de Sulfato de Potasio

se adiciona 1 ml de disolucion de Sulfato de Cobre al 5%

Se homogeiniza la muestra, se mide aproximadamente 5 ml (si es liquido) y se pesa

En un Tubo de Digestion se añade la muestra con el sulfato de Potacio y el Sulfato de cobre junto con 20 ml de Ac.Sulfurico
Concentrado agitando para disolver todo

Se deposita el tubo en el Digestor de Kjeldahl y se procede a calentar, aumentando la temperatura lentamente durante 4
horas hasta que la muestra presente un color transparente con un ligero color celeste

Se deja enfriar el tubo a temperatura ambiente

Se agrega 100 ml de agua destilada, poco a poco, haciendo que esta resvale por las paredes del tubo

Se Procede a la destilacion, vertiendo NaOH al 50% a la muestra

En un Erlenmeyer se agregra 50 ml de Ac. Borico al 4%, con un exceso para mejor reaccion y unas gotyas del indicador Shiro
- Tashiro para recoger el destilado

Se destila la puestra hasta obtener aproximadamente 100 a 150 ml de destilado

Se Procede a la valoracion del liquido obtenido con Ac. Clorhidrico 0.250 molar hasta que la coloracion cambie de verde
esmeralda a debilmente violaceo

Con los datos obtenidos en la valoracion se procede al calculo del porcentaje de proteinas

• ¿QUE DIFERENCIAS EXISTES ENTRE AMBOS PROCESOS?

▪ Los procesos se diferencian en la utilización de equipos (automatizados y
manuales), tipo de muestra (sólida y liquida) y en la utilización de algunos reactivos
y las cantidades debido a que uno realiza el método Micro Kjeldahl
Patricia Alvarenga

2. MÉTODO DE DUMAS y MÉTODOS RADIOQUÍMICOS

• ¿Entre el método de Dumas y los métodos radioquímicos, cual presenta mayor ventaja
y por qué?
▪ Presentan mayor ventaja los métodos radioquímicos por su rapidez, simpleza, la
falta de problemas de contaminación y la correlación de los resultados con el
método de Kjeldahl

METODOS DE DETERMINACION DE PROTEINAS

1. UTILIZACIÓN DEL FACTOR DE CONVERSIÓN
• ¿Es conveniente utilizar el método del factor de conversión para determinar
proteínas? Justifica
▪
No es conveniente la utilización de factores de conversión, debido a que no
suelen ser exactos y pueden dar resultados no representativos.
2. MÉTODOS QUÍMICOS
• MÉTODO DE BIURET
o Reactivos
▪ Extracto proteico
▪ NaCl 1% (P/V)
▪ Reactivo de Biuret
▪ Patrón de albumina o caseína 5mg/ml

Para la preparacion de los patrones

se etiquetan los tubos: 1 blanco, 5
patrones y 2 muestras
se procede a la elaboracion del
blanco, mesclando en el tubo el
reactivo de Biuret y el NaCl al 1%
hasta completar 5 ml
se mezclan diferentes cantidades
del patron, el reactivo de Biuret
(siempre la misma cantidad),
completandose con NaCl al 1%
hasta completar 5 ml

Una vez hecha la curva de

Agitar la solucion e incubar Se cuantifican los tubos en un
calibracion se procede a la
durante 10 minutos a 37°C espectrofotometro a 540 nm
preparacion de la muestra

En los tubos restantes se agrega

0.5 y 1 ml de la muestra, la
cantidad de reactivo de Biuret
utilizada anteriormente y se
completa con NaCl al 1 % hasta
llegar a 5 ml
Se interpola la coloracion dentro
Agitar la solucion e incubar de la curva de calibracion para
durante 10 minutos a 37°C estimar la concentracion a
proteina en la muestra
Patricia Alvarenga

MÉTODO DE TITULACIÓN CON FORMOL

• REALIZAR UN RESUMEN DE LA PRACTICA

o Materiales:
▪ Pipeta
▪ Erlenmeyer
▪ Bureta
o Reactivos
▪ Fenolftaleína 0.5%
▪ Oxalato de Potasio saturado
▪ Formaldehido 37%
▪ Hidróxido de Sodio 0.1N
o Procedimiento
▪ Colocar en un Erlenmeyer 10 ml de leche, adicionar 0.5ml de
fenolftaleína al 0.5%, el cual es un indicador de pH, 0.4 ml de
Oxalato de Potasio saturado, que neutraliza la muestra y bloque
los iones de calcio, se deja reposar unos minutos y se procede a
la titulación con NaOH 0.1N hasta que cambie a una coloración
rosa.
▪ Una vez neutralizada la muestra agregar 2 ml formaldehido al
37%, titular con NaOH 0.1N hasta que cambien a una coloración
rosa y anotar el volumen gastado.
▪ Prepara un blanco con 10 ml de agua destilada, 2 ml de
Formaldehido 37% y 0.5 ml de Fenolftaleína 0.5%, mesclar y
dejar reposar por unos minutos
▪ Titular con NaOH 0.1N y anotar el volumen gastado para el
cálculo final
▪ Para obtener los gramos de proteína se aplica la siguiente
formula: 1,7 ∗ (𝑎 − 𝑏) = 𝑔 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠(%) donde 𝑎 =Gasto
de NaOH 0.1N en las muestras y 𝑏 =Gasto de NaOH 0.1N en el
blanco
Patricia Alvarenga

METODO BRADFORD

• REALIZA EN ESQUEMA DE OBTENCIÓN TENIENDO EN CUENTA LOS REACTIVOS,

TEMPERATURAS, ELEMENTOS, EQUIPOS, ETC

Se preparan estandares, que ayudaran a la construccion de una curva de estandares, de diferentes concentraciones de una
proteina que ya es conocida, en este caso Albumina de suero bovino (BCA)

Se preparan 6 estandares con la proteina (BCA) y agua destilada en las siguientes concentraciones, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 µgr/µl

Una vez preparados los estandares se mezclan con el Vortex y se procede a la preparacion de las muestras

Las muestras refrigeradas previamente homogeneizadas con un bufer tris ac. clorhidrico, se diluyen dependiendo del tipo de
muestra

Con tres muestras distintas, Higado sano, Higado Obeso e Higado con Diabetes, las concentraciones fueron las siguientes: para el Higado Sano 1µl del higado en 599µl de
agua destilada, para el Higado Obeso, 1 µl del higado en 299 µl de agua destilada y para el Higado con diabetes, 1 µl de higado en 499µl de agua destilada

Se mezclan las muestras con el Vortex

Se adicionan 10 µl de estandares y muestras por pozo en una placa

Analizando siempre por duplicado o triplicado

Se añade 200µl de Reactivo Bradford

Vertiendo el reactivo siempre en medio de la placa, evitando que se pegue a las paredes

Se cuantifican los datos en un espectrofotometro a 595 nm, dejando reposar por 5 minutos, para incubar la muestra.

Se obtiene una regrecion lineal simple de los estandares las lecturas de absorvancia, concentraciones de estandares y
concentraciones de proteinas en la solucion problema
Patricia Alvarenga

MÉTODOS FÍSICOS
MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

OBSEVAR EL ENLACE Y REALIZAR UN RESUMEN DEL MISMO.

Hay dos métodos para medir la turbidez de una muestra la turbidimetría y la nefelometría, que
son técnicas complementarias que se utilizan para el análisis cuantitativo de disoluciones
coloidales, emulsiones, humos o niebla; están basadas en la dispersión de partículas
suspendidas en líquidos.

Inicialmente comenzó a utilizarse para proporcionar una evaluación básica de la calidad del
agua, desde la década del 60 hasta mediados de la década del 80, la tecnología óptica se
mantuvo sin cambios, desde ese entonces el desarrollo tecnológico de estos equipos ha
avanzado de manera agigantada.

La turbidimetría, mide la disminución de la luz transmitida a través de la suspensión de

partículas, utilizando para ello un espectrofotómetro, se suele utilizar para soluciones
concentradas para que haya una buena disminución de luz transmitida

Fundamento: puede realizarse en espectrofotómetros de visible o violeta, cuando la

concentración de partículas en suspensión se mide por turbidimetría, la suspensión se coloca
en una cubeta similar a un tubo de ensayo que permite realizar las medidas de energía
incidentes y transmitidas. Si tenemos en la cubeta una suspensión coloreada se debe usar un
filtro para evitar que la lampara influya sobre los resultados.

Los turbidímetros, pueden incorporar cualquier detector que sea sensible a la longitud de onda
transmitida.

Aplicaciones

La turbidimetría permite trabajar con muestras gaseosas, liquidas e incluso con solidos
trasparentes.

Es frecuentemente utilizada en laboratorios analíticos, laboratorios clínicos y en plantas de

procesos. Las medidas de dispersión de la luz se utilizan también para determinar análisis
cuantitativos de disoluciones coloidales y emulsiones, estos métodos pueden ser apropiados
también para ensayos cuantitativos que usan complejos antígenos o para medir la cantidad de
proteínas en fluidos, como la inmunoglobulina, entre otras proteínas de gran importancia.

El turbidímetro se calibra con un material conocido comúnmente como el polvo de la calle de

Arizona, posteriormente se utilizan factores ambientales, los factores k, para compensar el
polvo más claro o más oscuro. Los factores k son determinados por el usuario.

La unidad nefelométrica de turbidez es la UNT, se utiliza para medir la turbidez de un fluido.

Esquema general para la medición de la turbidez:

Generalmente consta de:

▪ Una fuente de luz

▪ Muestra de análisis
▪ Fotodetector
▪ Procesador digital
Patricia Alvarenga

Nefelometría, se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada

hacia un detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso.
En los últimos 15 años el laboratorio clínico ha reemplazado el método de
inmunodifusión radial por los métodos nefelométricos.
Un sistema nefelométrico ideal es el que produce un campo totalmente oscuro en el
detector, cuando no existen partículas difusoras. El nefelómetro cuantifica la
intensidad de la luz dispersada por la muestra bajo análisis.
Aplicaciones
Tiene aplicación para la determinación del complemento, inmunoglobulina,
transferrina, cadenas kappa, landa, albumina entre otras.
Se usa ampliamente en instrumentos automatizados que miden la sensibilidad de los
antibióticos, determinación de ribonucleasa, sulfatos en orina. También tiene
aplicaciones principalmente para contar células sanguíneas, medir complejos
antígenos y anticuerpos, determinar algunos fármacos, efectuar análisis de enzimas
que actúan sobre distintos sustratos.
Funcionamiento
El nefelómetro, muestra un dispositivo de iluminación y un dispositivo de detección,
entre ambas se encuentra un elemento de ensombrecimiento central.
ELECTROFORESIS
• REALIZA UN ESQUEMA DETALLADO
Se agita la mezcla para una
completa homogeneizacion
En primer lugar se situa el
y luego se añade en el
cristal superior sobre el
Se prepara el gel separador espacio de separacion de
separador y ambos se fijan
los cristales, ocupando una
con el sorporte
tercera parte del volumen
total
Se añade agua destilada, el tampón del gel separador pH 8.8, la mezcla Acrilamida/Bis-
Acrilamida al 30% y SDS al 10%, Persulfato de amonio, para la polimerización del gel y el
Reactivo de TEMED que completa la polimerización.
Se prepara el gel
Se añade el gel Se añade una fina capa de
concentrador, de la misma
concentrador en la parte agua en la parte superior
manera que el gel
superior y se coloca el luego, una vez polimerizado
separador, modificando las
peine, para crear los pozos el gel se retira dicha capa de
proporciones de los
donde se colocara la agua con un papel
componentes y se reduce el
muestra absorvente
pH a 6.8

Se retira el peine y se
Se traslada el gel a otro
Una vez dentro de la cubeta cargan las muestras con
soporte que permite la
se añade el tampon de ayuda de una guia
colocacion del mismo
electroforesis de manera a • las muestras se preparan en
dentro de la cubeta de
que cubra todo el gel precencia del tampon de carga
electroforesis.

Se retira la guia, una vez

Se selecciona el voltaje y se cargadas las muestras y se
inicia la electroforesis conectan los electrodos a
una fuente electrica
 Patricia Alvarenga
Una vez terminada la
electroforesis, se retira
tampon de electroforesis que
cubre el gel en la cubeta
se añade el gel a un recipiente
con una solucion de tincion,
suficiente para cubrirlo en su Se procede a retirar
totralidad cuidadosamente el gel del
cristal
• La solucion contiene Azul de
Coomassie
Se retira la solucion colorante
Se incuba el gel en la tincion,
y se lava el gel, de manera a
bajo agitacion durante algunas
retirar la solucion de tincion
horas
no fijada
METODOS DE DETERMINACION DE AMINOACIDOS
• OBSERVA EL SIGUIENTE ENLACE Y REALIZA UN ESQUEMA DEL ANALISIS
se lava el gel con abundante
Se retira el gel de los soportes agua, para retirar los restos
del tampon
Se separan los cristales para
Se lava con agua para retirar
acceder al gel situado en su
restos del tampon
interior
Se incuba el gel en una
disolucion decolorante, en un
Se identifican las proteinas
agitador hasta distinguir las
presentes en las muestras por
bandas correspoindientes a
medio de su peso molecular
las proteinas separadas en la
electroforesis
Patricia Alvarenga

Tomar la muestra(1ml Agregar 6 gotas de

Agregar 1 ml de NaOH
de albumina) Acetato de Plomo

Observar el cambio de
color a cafe oscuro el
Llevar a Baño Maria
cual da la prueba
durante 2 min
positiva a aminoacidos
azufrados