Fitoquímica Lizeth Malaver Sánchez

BIOENSAYOS FITOQUÍMICOS DE LA FLORA MEDICINAL

Lizeth Malaver Sánchez1

Abril de 2020

RESUMEN

La bioautografía es una técnica sencilla y rápida que combina las ventajas de la cromatografía en
capa fina y la detección de actividad antimicrobiana, logrando visualizar directamente la(s)
fracción(es) con actividad antimicrobiana. Los productos naturales son de gran importancia
brindando la base para los nuevos fármacos. En este bioensayo se presentan algunas
metodologías utilizadas para la evolución de la estructura-actividad de los hallazgos.

Palabras Clave: HPLC, TLC, LPLC.

ABSTRACT

Natural products are of great importance providing the basis for new drugs. In this bioassay, some
methodologies used for the evolution of the structure-activity of the findings are presented.

Key Words: HPLC, TLC, LPLC.

1. INTRODUCCIÓN

Desde tiempos prehistóricos el hombre ha utilizado plantas con fines medicinales (curativos y preventivos),
alimenticios y cosméticos. Actualmente, especies de plantas promisorias de uso etnofarmacológico son
fuentes de información para el descubrimiento de posibles sustancias con importante actividad biológica. Las
sustancias derivadas de las plantas han alcanzado una gran proyección, propio de sus aplicaciones versátiles.
La emergencia de la resistencia bacteriana ha generado nuevos intereses en la búsqueda de medicamentos
con poder antibacteriano, prueba de ello es el aumento en los últimos años del número de publicaciones,
relacionando productos naturales y actividad antimicrobiana, centrándose las investigaciones en los productos
naturales como fuentes de moléculas bioactivas. El desarrollo de la farmacéutica inicia con la identificación de
principios activos, los análisis biológicos, la formulación de la dosis, seguida por estudios clínicos para
establecer la seguridad, eficacia y perfil farmacológico de las nuevas drogas. [ CITATION Ram09 \l 3082 ]

Este método es una variante del de difusión en agar, con la premisa de que el extracto crudo al que se le
evaluarán las propiedades antimicrobianas, es colocado sobre una placa de cromatografía en capa fina
(CCF), posteriormente es eluído con una mezcla apropiada de solventes, permitiendo la separación de los
diferentes componentes del extracto. La CCF es un método ideal para la separación de compuestos naturales
debido a que después de eluir la cromatografía se evapora el solvente, evitando así la posible actividad de el
mismo. [ CITATION Sán16 \l 3082 ]

Los métodos bioautográficos son divididos principalmente en tres categorías:

a)  Bioautografía por contacto.

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b)  Bioautografía directa.

c)  Bioautografía por inmersión o por superposición de agar. Hay que considerar que antes, se debe
seleccionar la fase móvil que proporcione mayor separación de los componentes del extracto con el fin de
poder realizar la identificación del compuesto responsable con mayor facilidad

2. SECCIÓN EXPERIMENTAL

BIOAUTOGRAFÍA

Este ensayo puede representar una herramienta útil para la purificación de sustancias antibacterianas, o como
una técnica de tamizaje fitoquímico preliminar, o un fraccionamiento, realizando el ensayo a través de
cromatogramas, que permitan la localización de los compuestos activos, incluso en matrices complejas como
los derivados de productos naturales. Se puede definir como una variación de los métodos de difusión en
agar, donde el analito es absorbido dentro de una placa de cromatografía delgada TLC. El método consiste en
colocar las muestras a evaluar en placas de TLC, seleccionar la fase móvil que de mejor separación,
posteriormente esta placa es llevada y colocada en forma invertida sobre una caja de petri previamente
inoculada con el microorganismo a evaluar , se deja de 8 a 12 horas en la nevera para facilitar la difusión de
los extractos en el medio, luego se retira la placa y se lleva la caja a incubación según los requerimientos del
microorganismo; luego se observa el halo de inhibición donde está el compuesto activo. Para visualizar mejor
los resultados se puede utilizar alguna sal de tetrazolium. Es importante tener en cuenta que solventes ácidos
o demasiado alcalinos pueden permanecer en las placas de TLC, después del secado, inhibiendo el
crecimiento bacteriano. [ CITATION Ram09 \l 3082 ]

Bioautografía por contacto

En este método se deben preparar placas Petri con agar Mueller Hinton (MH), posteriormente, la placa
cromatográfica previamente y sin restos de solventes, se coloca «cara abajo» sobre el agar inoculado con la
cepa de interés, una vez colocada se debe permitir que los compuestos separados difundan hacia el agar, por
lo que es recomendable mantener la CCF sobre el agar por 2 h. Después de esto, el cromatograma es
retirado y la placa Petri será incubada considerando las condiciones óptimas de crecimiento del
microorganismo. Transcurrido el tiempo de incubación, la actividad antimicrobiana se evidencia mediante la
aparición una zona de inhibición del crecimiento sobre la superficie del agar en el lugar donde el o los
compuestos antimicrobianos estuvieron en contacto con la capa de agar. [ CITATION Sán16 \l 3082 ]

Bioautografía directa

En este método, la cromatografía en capa delgada previamente y sin restos de solventes, es sumergida en
una suspensión del microorganismo de interés, el cual se encuentra en crecimiento activo y en un caldo de
cultivo, posteriormente la bioautografía se incuba en una cámara húmeda y bajo las condiciones apropiadas
para el desarrollo del microorganismo utilizado, esto permitirá que la sílica cubierta con el caldo de cultivo
sirva de soporte y permita el crecimiento del microorganismo directamente sobre la CCF. Después del tiempo
de incubación se observan las zonas donde no hay crecimiento, las cuales corresponden a los compuestos
antimicrobianos buscados. [ CITATION Sán16 \l 3082 ]

Bioautografía por inmersión o por superposición de agar

Esta técnica es una combinación de la bioautografía por contacto y la bioautografía directa. En esta el
cromatograma es cubierto con una capa de agar MH previamente inoculado, hay que considerar que el agar

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debe estar aproximadamente a 45 °C al momento de inocularlo para evitar inactivar al microorganismo en
cuestión. Posteriormente, la placa cubierta con agar es incubada en cámara húmeda durante el tiempo y la
temperatura apropiada, después de esto, zonas claras sobre la placa de CCF indican la actividad
antimicrobiana de los componentes (Figura 2). [ CITATION Sán16 \l 3082 ]

Estandarización de las técnicas.

Estas técnicas, aunque fáciles de realizar, presentan algunos inconvenientes, sobre todo en la
estandarización de las mismas, varios factores importantes deben ser considerados: la fase móvil apropiada
para conseguir la mejor separación de los componentes del extracto, la cual debe ser establecida con
anterioridad; el tiempo de contacto de la cromatoplaca y el agar inoculado, ya que suele ser muy variable con
los diferentes extractos, por lo que hay que realizar una serie de ensayos para minimizar este problema.
También es importante considerar que en algunas ocasiones el contacto de la placa cromatográfica con el
agar. [ CITATION Sán16 \l 3082 ]

Figura 2. Zona de inhibición producida por un componente antimicrobiano en una bioautografía

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En estas técnicas influyen diversos factores como la composición del medio de cultivo, el pH y la solubilidad
del extracto en el medio de cultivo utilizado en la bioautografía, por lo que puede resultar difícil la
estandarización de estos métodos debido a la diferencia existente entre los diversos extractos de plantas
(Figura 3). Basándonos en lo anterior se destaca la importancia de estandarizar las técnicas bioautográficas,
ya que mucha de la literatura menciona que, aunque presentan inconvenientes, son técnicas especialmente
diseñadas para la detección selectiva de compuestos con actividad antimicrobiana. Como parte de la
estandarización de las técnicas bioautográficas, es de suma importancia considerar el inóculo del
microorganismo de interés, y para esto la literatura señala que lo más recomendable es trabajar con 1X106
UFC/mL en el caso de bacterias y para el caso de hongos filamentosos 1X106 conidias/Ml. [ CITATION Sán16
\l 3082 ]

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Figura 3. CCF de diferentes extractos de plantas observados con luz UV

4. CONCLUSIONES
Se deben tener consideraciones generales para los estudios de la actividad antimicrobiana en extractos de
plantas y compuestos aislados a partir de ellos. El enfoque etnofarmacológico en la investigación moderna de
moléculas bioactivas en planas es de grandes importancias con respecto a sus avances y los bioensayos que
se realizaran para la facilidad de ensayos.

5. BIBLIOGRAFÍA

1. Fuentes R., C., Angulo H., P., & Hernández de Jesus, L. (2001). La etnofarmacología y los bioensayos
como nuevas estrategias en la investigación fitoquímica de la flora medicinal. México: Ciencia e
investigación Vol (2).

2. Ramirez., L., & Castaño. , D. (2009). METODOLOGIAS PARA EVALUAR IN VITRO LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA DE. Pereira.

3. Sánchez-García, E. C.-H.-P. (2016). ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA. Barcelona, España: Rivas-Morales,

C., Oranday-Cardenas, M.A.,.

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