Espectroscopías UV-Visible e Infrarroja de moléculas poliatómicas.

1. Introducción.

En espectroscopia se estudian las interacciones de la radiación electromagnética (luz)

con la materia. Entre los fenómenos que producen estas interacciones están la
absorción, emisión y dispersión de luz por la materia.

La mayoría de nuestra información experimental sobre los niveles de energía de los

átomos y moléculas proviene de la espectroscopia. A nivel molecular, las diferentes
técnicas espectroscópicas también nos permiten conocer las estructuras moleculares
(conformaciones, longitudes y ángulos de enlace), las frecuencias moleculares de
vibración, descubrir la composición de una muestra, seguir la concentración de especies
reactivas en función del tiempo en una reacción química, determinar intermedios de
reacción y un largo etc.

En este bloque utilizaremos tres técnicas diferentes: absorción ultravioleta-visible (UV-

visible), emisión de fluorescencia y absorción infrarroja (IR) para caracterizar la
fotofisicoquímica de un alcaloide denominado norharmano de gran interés
farmacológico cuya presencia se ha detectado en diferentes tipos de plantas e incluso en
el cuerpo humano. La estructura de este compuesto se muestra en la figura 1. Está
compuesta de un anillo piridínico deficiente en electrones π unido a otro anillo indólico
con exceso de electrones π. Las interesantes propiedades fotofísica que este derivado
presenta son debidas a cambios fotoinducidos en la distribución electrónica que
originan un fuerte incremento en la basicidad del núcleo piridínico en el primer estado
electrónico excitado y que, consecuentemente, modifican la reactividad de esta
molécula.

Fig. 1.- Estructura del Norharmano

La técnicas de absorción y emisión de luz en la región UV-visible se encuadran dentro

de la espectroscopia electrónica y la técnica de absorción IR se encuadra dentro de la
espectroscopía de vibración.
Mediante la absorción y la emisión de radiación en la región UV-visible
caracterizaremos los espectros de absorción y fluorescencia de las dos formas que
pueden existir (neutra y catiónica) en disolución acuosa en el intervalo de pH entre 1 y
10. Obtendremos el rendimiento cuántico de fluorescencia de la forma catiónica y la
constante de acidez de este alcaloide una vez protonado, tanto en el estado fundamental
como en el primer estado excitado. Utilizando la espectroscopia de absorción infrarroja
obtendremos la constante de formación de un complejo de tipo NH-π entre este
alcaloide y el derivado fenantreno.

1
Este bloque se realizará en tres sesiones y consta de un fundamento teórico y de una
metodología experimental para cada una de las técnicas utilizadas, así como, de tres
prácticas

2 Fundamento Teórico

2.1 Espectroscopía Electrónica.

El estudio de los espectros electrónicos, además de permitir explicar los colores de las
sustancias, también proporciona importante información sobre los estados excitados de
las moléculas. La distribución electrónica de una molécula determina las propiedades
físicas y químicas de ésta, de esta manera, puede ocurrir que reacciones que se
producen fotoquímicamente (estado excitado), no lo hagan térmicamente (estado
fundamental), ya que son el resultado de una distribución electrónica diferente en la
molécula producto de la excitación.

2.1.1 Espectros de absorción UV-visible.

La energía total de una molécula es el resultado de las interacciones atractivas entre el

núcleo y los electrones, repulsivas electrón-electrón y núcleo-núcleo, vibraciones de los
núcleos, rotación nuclear e interacciones magnéticas resultantes de los spines de los
electrones y núcleos. Resolviendo la ecuación de ondas podríamos conocer el valor de
esta energía, sin embargo, en la práctica, esto es imposible y es necesario recurrir a
aproximaciones. Si suponemos que los núcleos y electrones son masas puntuales y
despreciamos las interacciones spin-órbita y otras interacciones relativistas, mediante la
aproximación de Born-Oppenheimer podemos separar la función de onda molecular
como un producto de funciones de onda electrónica y nuclear. Esta aproximación se
basa en que los electrones se mueven mucho más rápidamente que los núcleos y es una
buena aproximación, considerar a los núcleos fijos mientras los electrones realizan sus
movimientos. De esta manera, podemos separar la función de onda molecular en un
producto de funciones de onda electrónica y nuclear. Por otro lado, un tratamiento
similar para la función de onda del movimiento nuclear demuestra que ésta puede
separarse en funciones de onda rotacional, vibracional. Esta separación se basa en que la
vibración molecular es mucho más rápida que la rotación molecular, por lo que
podemos usar una separación internuclear media para calcular el momento rotacional de
inercia. Por tanto, aunque la siguiente ecuación no es exacta ya que conlleva las
aproximaciones anteriormente descritas, podemos considerar la energía total de una
molécula como la suma de las energías electrónicas, vibracional, rotacional y
traslacional. Etotal = Eelect + Evibr + Erot + Etrasl
Los valores relativos de estas energías son importantes. Las energías implicadas en los
cambios de las distribuciones electrónicas de las moléculas son del orden de varios
electrón-voltios (1eV equivale a unos 8000 cm-1) por tanto los espectros electrónicos
aparecen en las regiones del visible y ultravioleta del espectro electromagnético que se
extienden desde unos 14000 cm-1 para la luz roja hasta 21000 cm-1 para la luz azul y
unos 50000 cm-1 para la ultravioleta. Las transiciones vibracionales corresponden a
absorciones en la región del infrarrojo (sobre 100 cm-1 a 1000 cm-1). Las transiciones
rotacionales corresponden a la absorción en la región de microondas (sobre 0.03 cm-1 a
10 cm-1). Así, la separación entre los niveles de energía electrónicos es mucho mayor

2
que la separación entre niveles vibracionales, y ésta, a su vez es mucho mayor que la
separación entre niveles rotacionales (figura 2). De esta manera, a nivel molecular, una
transición electrónica siempre irá acompañada de transiciones vibracionales que a su
vez van acompañadas de rotacionales. Como la energía traslacional no hace mas que
sumar una cantidad constante a la energía total, las frecuencias de una transición vienen
dadas por hν = (E´elec- E´´elec) +(E´vib- E´´vib)+ (E´rot- E´´rot) donde cada término entre
paréntesis es sustancialmente menor que el término precedente.

Fig.2.- Esquema energético de separación de niveles.

Tipos de transiciones electrónicas en moléculas poliatómicas. La solución de la parte

electrónica de la ecuación de ondas da los niveles de energía (orbitales) y las
distribuciones electrónicas aproximadas para unas determinadas coordenadas nucleares.
Es costumbre, aunque no es rigurosamente cierto, situar los electrones en orbitales
moleculares y considerar la absorción de luz como una transición uni-electrónica entre
orbitales. Podemos hacer una clasificación de las transiciones electrónicas en términos
de orbitales σ (enlazante), σ*(antienlazante), π (enlazante), π*(antienlazante) y par
solitario (no enlazante, designado por n). En la figura 3, mostramos los niveles de
energia de los orbitales moleculares del formaldehído/y algunas posibles transiciones
electrónicas que pueden ocurrir entre estos orbitales, tales como σ→ σ*, n →σ*,
π→π*, n →π*. Las energías de estas transiciones electrónicas sigue, generalmente, el
siguiente orden:
n → π *< π→π*< n →σ*< σ →π*< σ→ σ*

Otros dos importantes tipos de orbitales que se consideran en estas transiciones son el
orbital molecular ocupado de mayor energía denominado HOMO ( Highest Occupied
Molecular Orbital) y el orbital molecular desocupado de menor energía denominado
LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital). Ambos orbitales se refieren al estado
fundamental de la molécula.

3
 Fig.3.- Diagrama de energía de los orbitales moleculares de l
Formaldehído y posibles transiciones electrónicas.

En las cuatro transiciones que se muestran en la figura 3, el electrón que promociona no

varia su spin y por tanto el número cuántico de spin total permanece igual a cero (S=Σsi,
con si= +1/2 ó -1/2 ). La multiplicidad de spin (M=2S+1) en ambos estados, tanto
fundamental como excitado, es igual a 1, por tanto todos estos estado son estados
singlete ( usualmente se denota como S0 el estado fundamental y S1, S2, S3,… para los
siguiente estados excitados). Todas las transiciones mostradas en la figura 3 son , por
tanto, transiciones singlete-singlete. Si por lo contrario, el electrón promocionado
cambia su spin, el momento angular total de spin es 1 y su multiplicidad 3. El estado
excitado que produce la transición es un estado triplete. De acuerdo con la regla de
Hund, para una misma configuración electrónica, el estado triplete tiene menor energía
que el correspondiente singlete (figura 4).

4
 Fig.4.- Distinción entre estados singletes y tripletes.
Ejemplo del formaldehído.

Probabilidad de las transiciones. Ley de Lambert-Beer y Fuerza de Oscilador.

Experimentalmente, la eficiencia de absorción de luz a una determinada longitud de
onda, λ, por un medio absorbente se caracteriza por la absorbancia a esta λ, A(λ), o la
transmitancia T(λ) que se definen como

A(λ)= log (Iλ0/Iλ) = -log T(λ)

siendo T(λ) = Iλ/Iλ0, donde Iλ0 y Iλ son las intensidadesde la luz que entra y sale del
medio absorbente, respectivamente.
En muchos casos, la absorbancia de una muestra sigue la ley de Lambert-Beer
A(λ)= log (Iλ0/Iλ)= ε(λ) l c , donde ε(λ) es el coeficiente de absorción molar
(comúnmente expresado en L mol-1 cm-1), l es la longitud de paso de luz y c es la
concentración ( mol L-1). El coeficiente de absorción molar expresa la habilidad de una
molécula para absorber la luz a una λ y un determinado disolvente. Según la teoría
clásica, la absorción molecular de luz puede ser descrita si consideramos a la molécula
como un dipolo oscilando, lo cual nos permite introducir la llamada fuerza de oscilador,
la cual está directamente relacionada con la integral de la banda de absorción mediante
la siguiente ecuación:

f = 2.303 mc02/ Naπ e2n ∫ ε(υ) d υ

donde m y e son la masa y carga del electrón, respectivamente y c0 es la velocidad de la

luz, n es el índice de refracción. f es una cantidad adimensional y sus valores están

5
normalizados, de tal manera que las transiciones más eficaces o probables tienen f ≈
1 que se corresponde con unos valores de ε 104-105 M-1 cm-1 .
La ventaja de introducir la fuerza de oscilador estriba en que tiene una conexión directa
con las funciones de onda de los estados excitados inicial (Ψi) y final (Ψf) implicados en
la transición. El tratamiento mecano-cuántico de la interacción entre la radiación y la
materia demuestra que la probabilidad de absorción o emisión entre dos estados
estacionarios es proporcional al cuadrado de la magnitud de la integral llamada
momento de transición. Esta integral se define mediante la siguiente expresión

µfi = ∫Ψf* µ Ψi dζ, µ = -er

que es una medida del momento dipolar asociado con el desplazamiento de carga que se
produce cuando tiene lugar la redistribución electrónica. La fuerza de oscilador se
relaciona con este momento por

f = (8π2/3) (mν/h e2) │µfi│2

Así pues, se puede estimar lo probable que es una transición si se conocen las funciones
de onda, lo que es una relación importante entre la teoría y la experimentación.
En las parejas de estados para los cuales esta integral es cero se dice que es una
transición prohibida. Cuando el valor de esta integral es distinto de cero se dice que la
transición entre estos estados está permitida.

2.1.2 Espectros de emisión

En la figura 5 se muestran todos los procesos que pueden ocurrir a una vez la molécula
interacciona con un fotón de una determinada longitud de onda en la región UV-visible
y lo absorbe. A estos procesos se denominan como fotofísicos y pueden ser definidos
como transiciones que convierten un estado excitado en otro estado excitado o en el
fundamental.

Vamos a
empezar

Fig.5.- Posibles vías de desexcitación de una molecula excitada.

Empezaremos describiendo los procesos fotofísicos que son unimoleculares. Estos
procesos se clasifican en radiativos y no-radiativos, y para ilustrarlos, nada mejor que
utilizar el diagrama de Perrin-Jablonski de la figura 6. En esta representación la
dirección vertical corresponde a un incremento de energía y la dirección horizontal no

6
tiene ningún significado físico. Los estados electrónicos son representados por los
símbolos S0, S1, S2 y corresponden a los estados singlete fundamental, primero y
segundo excitado, respectivamente. T1 y T2 representan los correspondientes estados
tripletes de S1 y S2, respectivamente. Los procesos radiativos están dibujados con líneas
rectas y los no-radiativos con línea ondulada.
Vamos a describir brevemente estos procesos:

Transiciones radiativas

Absorción S-S (S0 + hν → S1), caracterizada experimentalmente por el coeficiente de

absorción molar ε. Este proceso transcurre en un tiempo de aproximadamente 10-15s.

Absorción S-T (S0 + hν → T1), transición prohibida ya que son estados de diferente
multiplicidad de spin y por tanto la integral momento de transición se anula. Esta
transición está caracterizada experimentalmente por el coeficiente de absorción molar
ε(S-T).

Emisión de fluorescencia (S1 → S0 + hν ), transición permitida y caracterizada por una

constante de velocidad k f con valores entre 1010-107 s-1.

Emisión de fosforescencia (T1 → S0 + hν ) transición prohibida y caracterizada por una

constante de velocidad kp con valores entre 106 – 1 s-1.

Transiciones no-radiativas

Conversión interna (CI). Transiciones entre estados excitados de la misma multiplicidad

de spin (ej. S1 → S0 + Q) caracterizadas por una constante kic con valores entre 1011-109
s-1. Cuanto menor sea la diferencia entre los estados excitados, mayor es la eficiencia de
CI.

Cruce entre sistemas (CIS). Transiciones prohibidas entre dos niveles vibracionales
isoenergéticos de estados electrónicos excitados de diferente multiplicidad de spin (ej.
S1 → T1 + Q o bien T1 → S0 + Q) caracterizadas por una constante kcis con valores
comprendidos entre 1010-108 s-1. La presencia de átomos pesados incrementa el
acoplamiento spin-órbita y por tanto favorece que se produzca con más probabilidad
este tipo de transición.

Existe un tipo de transición no-radiativa que ocurre entre estados vibracionales de un

mismo estado electrónico. Este proceso se denomina relajación vibracional y a
temperatura ambiente, esta disipación de energía, se produce en un tiempo de alrededor
10-12s. Este proceso es lento con respecto a la absorción, sin embargo es muy rápido con
respecto a la fluorescencia, CI y CIS. Esto explica que las propiedades fluorescentes de
una molécula sean independientes del estado vibrónico, dentro de la banda de
absorción
S0 → S1, al que la molécula es excitada.

7
 Fig.6.- Diagrama de Perrin-Jablonski. Posición relativa de las bandas de
absorción, fluorescencia y fosforescencia.

Estos procesos no-radiativos son los responsables de que no fluorezcan el 100% de las
moléculas excitadas, que la fluorescencia se origine siempre desde el estado S1, que su
perfil no varíe con la longitud de onda de excitación y que el máximo de emisión
siempre se sitúe a mayores longitudes de onda (menor energía) que el máximo de
absorción. Este gap entre el máximo de la primera banda de absorción y el máximo de
fluorescencia se denomina desplazamiento de Stokes. En general, las diferencias entre
los niveles vibracionales son similares en el primer estado excitado y en el fundamental
de aquí que los perfiles de la primera banda de absorción y la fluorescencia sean
imágenes especulares (figura 7). La transición 0-0 es usualmente la misma en absorción
y fluorescencia, por tanto podemos obtener la longitud de onda de esta transición del
punto de corte de ambos perfiles. Aunque no entraremos en más detalles,
mencionaremos que todos los procesos anteriormente descritos son espontáneos.

8
 Fig.7.-
Bandas vibracionales en el espectro de absorción y fluorescencia
de un hidrocarburo aromático.

Además de kf, hay otros parámetros que caracterizan la emisión fluorescente, uno de
éstos es el rendimiento cuántico de fluorescencia (Фf)que se define como el cociente
entre el número de fotones emitidos y el número de moléculas excitadas. Si no
existieran canales de desactivación, el rendimiento cuántico de la molécula sería igual a
uno. Si sólo consideramos procesos de desactivación unimoleculares, Фf vendrá dado
por :
Φf = kf/ (kf + ∑ ki)

Siendo ki la constante de desactivación de cada uno de los procesos no-radiativos

unimoleculares.
Efecto de los procesos fotoinducidos intermoleculares sobre la emisión fluorescente.
Transferencia protónica fotoinducida.
Las propiedades ácidas y básicas de una molécula pueden diferir significativamente del
estado fundamental al excitado. Una de las causas posibles de esta observación es la
diferencia en la densidad de distribución electrónica entre ambos estado y la ocurrencia
de la transferencia protónica durante el tiempo de vida del estado excitado dependerá de
las velocidades relativas entre los procesos de desexcitación unimoleculares y el
proceso de transferencia protónica.

Determinación del pKa en el estado excitado mediante el ciclo de Föster.

El pKa de un ácido débil puede determinarse teóricamente utilizando el ciclo de Foster
junto con medidas espectroscópicas.

De acuerdo con este ciclo que mostramos en la figura 8

Na hνAH + ΔH0* = Na hνA- + ΔH0

donde ΔH0 y ΔH0* son las entalpias molar de ionización estándar, hνAH y hνA- son las
diferencias de energía( correspondiente a la transición 0-0) entre el estado excitado y

9
fundamental de AH y A-, respectivamente y Na es el número de Avogrado. Esta
ecuación puede ser escrita como

Na (hνA- - hνAH) = ΔH0* - ΔH0

Fig.8.- Ciclo de Foster para la determinación del pK del estado excitado.

Asumiendo que las entropías de ionización ΔS0 y ΔS0* son iguales, las diferencias de
entalpía puede ser reemplazada por la diferencia de energías libres ΔG0*- ΔG0.
ΔG0 está relacionada con la constante de equilibrio mediante

ΔG0 = - RT ln K = 2.3 RT pK

de la misma forma, ΔG0* = - RT ln K* = 2.3 RT pK*

donde R es la constante de los gases y T la temperatura absoluta. Usando estas
ecuaciones y convirtiendo las frecuencias a números de onda, la ecuación puede
expresarse como

pK*-pK = 2.1 10-3 (υA- - υAH)

Esta ecuación muestra que si la banda de emisión de la forma básica está localizada a
mayor longitud de onda que la forma ácida, pK* es menor que el pK del fundamental.
Por el contrario, si la emisión de la forma básica está desplazada hacia el azul (menor
landa) con respecto a la banda de emisión de la ácida, el ácido en el estado excitado es
más débil que en el fundamental.
En la práctica, la diferencia entre υA- y υAH corresponde con la diferencia entre las
transiciones 0-0 de A- y AH , las cuales no son fáciles de determinar . Normalmente se
estiman promediando los números de onda de los máximos de absorción y fluorescencia

υ00 = ( υabsmax+ υem max )/2

Sin embargo la mejor aproximación se encuentra utilizando el punto de intersección de

los espectros normalizados de absorción y fluorescencia. En el caso que el
desplazamiento de Stokes sea muy grande, será difícil encontrar este punto de
intersección y será preferible tomar υabsmax como el promedio de los números de onda
de la mitad superior de la banda de absorción (S0→S1) y realizar la misma operación
para obtener υemmax pero, en este caso, con la banda de emisión fluorescente.

1
0
La determinación de la energía de esta transición 0-0 es el mayor factor de error en la
estimación del pK*. La ventaja de este método es su sencillez y que puede usarse
incluso cuando no se establece el equilibrio en el tiempo de vida del estado excitado.

1
1
2. Espectroscopia de Vibración. Espectros de absorción IR.

La espectroscopía de absorción infrarroja (IR) es una técnica analítica de gran

importancia para los químicos. Está basada en las vibraciones de los átomos de las
moléculas. Un espectro de infrarrojo consiste en un espectro de absorción que implica
transiciones entre niveles vibracionales diferentes dentro del mismo estado electrónico.
Dado que una molécula poliatómica tiene 3N-6 ( 3N-5 si es lineal) grados de libertad
vibracionales, su espectro de infrarrojo puede presentar dicho número de bandas de
absorción, cuyas energías corresponderán a la frecuencia de cada modo vibracional.
Para que una vibración dé lugar a una absorción de infrarrojo, debe causar un cambio en
el momento dipolar de la molécula. Así, la intensidad de una banda de infrarrojo será
mayor cuanto mayor sea el cambio en el momento dipolar con la vibración.
La principal utilidad de la espectroscopía de infrarrojo deriva del hecho de que los
grupos funcionales mantienen cierta individualidad dentro de las moléculas, afectando
sus vibraciones fundamentalmente al enlace considerado. Según el modelo clásico del
oscilador armónico, la frecuencia vibracional de dos átomos unidos por un enlace viene
dada por la expresión
  =  1 k
ν
2π c  μ

donde K es la constante de fuerza del enlace y μ la masa reducida del sistema.

Como resultado, se encuentra que los diferentes grupos funcionales se caracterizan por
diferentes frecuencias vibracionales, que naturalmente van asociadas a bandas distintas
en el espectro de infrarrojo.
Siempre que obtengamos un espectro IR, en condiciones que no sean de vacío, la
radiación infrarroja va atravesar el aire y será inevitable que parte de esta radiación sea
absorbida por algunas de las moléculas que lo componen. Esta absorción, junto con la
correspondiente a las ventanas que utilicemos como soporte, constituirá el fondo del
espectro. Analizaremos brevemente la absorción por parte del aire.
Interpretación del espectro de infrarrojo del aire: entre los componentes mayoritarios
de la atmósfera terrestre, los gases de N2 y O2 no producen absorción de radiación
infrarroja, ya que son moléculas diatómicas apolares. En cambio, el vapor de agua y el
dióxido de carbono absorben radiación infrarroja y por tanto serán observados siempre
que se realicen medidas de absorción de infrarrojo en presencia de aire, y deben
corregirse (espectro de referencia) a la hora de estudiar una muestra problema.

O O O
H H H H H H
ν1 ν2 ν3
|| (dos ramas) || (dos ramas) (tres ramas)

O C O O C O O C O

ν1 ν2 ν3 , ν4
No activa IR || (dos ramas) Degeneradas
(tres ramas)

1
2
 La molécula de agua tiene una estructura no lineal y por tanto presenta tres
modos vibracionales: una tensión simétrica (v1), una flexión simétrica (v2) y una tensión
asimétrica (v3). Generalmente se requiere menos energía para deformar un ángulo entre
tres átomos que para estirar un enlace, por lo que la banda v2 debe aparecer a menores
frecuencias que v1 y v3. Las vibraciones v1 y v3 cambian el módulo del momento dipolar
(vibraciones paralelas) mientras que la vibración v2 cambia la orientación de dicho
momento (vibración perpendicular). Como consecuencia, estas tres vibraciones deben
dar lugar a bandas vibracionales activas en infrarrojo. La molécula de CO2 presenta una
estructura lineal y por tanto sus grados de libertad vibracionales son cuatro. Dado que el
momento dipolar permanente de la molécula es nulo, la vibración de tensión simétrica
no será activa en el espectro de infrarrojo. En cambio la vibración de tensión asimétrica
(vibración paralela) producirá una banda de absorción, así como las dos vibraciones de
flexión (vibraciones perpendiculares), que son degeneradas en energía y por tanto
aparecen como una sola señal en el espectro. Por otra parte, como las moléculas de H 2O
y CO2 pueden girar libremente en su estado gaseoso, sus absorciones de infrarrojo
implican transiciones entre los distintos niveles rotacionales de los estados vibracionales
implicados. De ahí que las bandas de infrarrojo de estos compuestos sean bandas de
vibración-rotación, es decir, que sus bandas de vibración presentan estructura fina de
rotación. Así una molécula poliatómica como H2O o CO2 presenta bandas paralelas con
un contorno PR, mientras que sus bandas perpendiculares tienen contornos PQR.

Los espectros de infrarrojo se pueden utilizar para identificar componentes de muestras

comparándolos con una colección de espectros de sustancias conocidas. Además de la
identificación y comparación de componentes se puede obtener información estructural.
Los grupos funcionales se pueden identificar debido a que sus bandas de absorción se
encuentran en zonas relativamente estrechas. Los espectros de infrarrojo de los
compuestos orgánicos se pueden dividir en las siguientes regiones generales:
La región de los grupos funcionales: 4000-1300 cm-1
La región de la huella dactilar: 1300-910 cm-1
La región de los aromáticos: 910-650 cm-1.
Las bandas en la región de los grupos funcionales indican la presencia de grupos
orgánicos funcionales específicos. Existen tablas donde se indican en qué intervalo
absorben los diferentes grupos. Entre lo grupos funcionales fácilmente identificables se
encuentran el grupo carbonilo, C=O, y el grupo hidroxilo, -OH.
La región de la huella dactilar contiene picos que aparecen por modos normales
complicados que conllevan movimientos de flexión y no son fácilmente asignables. Sin
embargo, es la región más sensible a la diferencia de estructura de los compuestos, es
decir, representa la huella dactilar para un compuesto específico.
Los picos en la región de los aromáticos no indican automáticamente la presencia de
anillos aromáticos, debido a que aparecen también en esta región las bandas
correspondientes a enlaces carbono-halógeno. Las bandas se originan por los
movimientos de flexión de los enlaces C-H fuera del plano del anillo aromático.
En la realidad, se requiere mucha práctica para interpretar los espectros IR ya que
aparecen numerosas desviaciones a la apariencia esperada. En la actualidad los
instrumentos con transformadas de Fourier pueden obtener espectros en varios
segundos, para que, posteriormente, utilizando el software que desarrolle la
comparación entre picos, se pueda identificar cada componente.

1
3
3. Medidas experimentales de absorción, emisión y excitación de fluorescencia.

3.1 Espectros de absorción

Las técnicas experimentales para espectroscopia de absorción en las regiones, UV,

visible e IR son similares. En ellas se pasa un haz de luz, conteniendo un intervalo
continuo de frecuencias, a través de la muestra, la luz que sale de ésta (luz transmitida)
se dispersa usando un prisma de difracción reticulado y, en cada frecuencia, se compara
la intensidad de luz transmitida (It) con la intensidad del haz de referencia que no ha
pasado a través de la muestra (I0) .
La medida de un espectro de absorción se basa en dos principios importantes: ley de
Lambert y la ley de Beer . La ley de Lambert establece que la proporción de luz absorb
ida por un medio es independiente de la intensidad de luz incidente, Ι 0 . La ley de Beer
establece que la cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración de
cromóforo en la muestra. De la combinación de estas dos leyes podemos expresar:

A=εbc

donde A se define como absorbancia y viene dado por A = log (I0/It ), ε es el coeficiente de
molar que es una constante de la molécula y que depende de la longitud de onda de la luz
incidente. c es la concentración molar y b la longitud de paso de luz (anchura de la cubeta).
La intensidad de la luz absorbida Ia viene dado por:

Ia=I0 - It

y a partir de la le ley de Lambert-Beer

Ia = I0(1-e-2.3εbc)

Cuando A>2, Ia = I0 es decir toda la luz incidente es absorbida.

Un espectro de absorción viene descrito por una gráfica donde se representa la intensidad de
absorbancia en la ordenada y la longitud de onda de la luz absorbida en la abcisa. Sin
embargo, en espectroscopia IR es más habitual presentar los espectros como un gráfico
%Transmitancia frente al número de onda (cm-1)

3.2 Espectros de fluorescencia

La ley de Lambert-Beer también puede ser expresada como.

It = I0 10 -εbc
(1)

Si asumimos que la intensidad de la luz absorbida viene dada por I0 - It, tenemos:

Ia = I0 (1-10-εbc)

La intensidad de la fluorescencia If viene dada por Iaϕf

1
4
 If = I0ϕf (1-10 )
-ϵbc

Haciendo un desarrollo en serie 10 -ϵbc

If = I0ϕf{1-[1-2.303ϵbc+(2.303ϵbc)2/2!+.....]}

Si bc < 0.05 todos los términos del desarrollo después de -2.303ϵbc

pueden ignorarse, de manera que If puede expresarse como:

If = 2.303 I0ϕfϵbc (2)

Se ha determinado que para una absorbancia de 0.01 se producirá un error del 1% en la

intensidad de fluorescencia. Sin embargo, no solamente existen errores en la If debido a la
rotura de la aproximación matemática, sino que estos errores también se debe al efecto de
filtro inerte de la disolución. Bowen y Wokes establecieron que para obtener una respuesta
lineal, la disolución debe absorber menos que el 5% de la luz de la fuente.
El verdadero espectro de fluorescencia es una representación de la intensidad de
fluorescencia (a una intensidad y longitud de onda de absorción fija) como una función de las
frecuencias o longitudes de onda de emisión.
Los espectros obtenidos en el fluorímetro no son, generalmente, los verdaderos
espectros debido a la dependencia de la respuesta del sistema instrumental con la longitud de
onda.
Los parámetros que caracterizan la emisión de fluorescencia son: Perfil ( If frente a
λ), rendimiento cuántico (If relativa a Ia ) y tiempo de vida ( decaimiento de If con el
tiempo) de fluorescencia.

3.2.1 Espectro de excitación

A la representación de la intensidad de emisión (a una longitud de onda de emisión

fija) en función de la longitud de onda de excitación ( I0 constante) se le llama espectro de
excitación.
Si la molécula cumple la regla de Kasha y Vavilov, ϕf es independiente de la λ de
excitación.
Así, si fijamos la concentración de la especie que emite (fluoróforo), II0 y b; If α ε.
En otras palabras, el espectro de excitación observado variará con ε. En estos casos, el
espectro de excitación tendrá el mismo perfil que el espectro de absorción. Una ventaja de la
espectroscopia de excitación sobre la absorción es la mayor sensibilidad de la técnica de
fluorescencia que permite observar el espectro de excitación a concentraciones más bajas que
en absorción y sobre todo, la gran utilidad de un espectro de excitación está en que nos
informa de cual es la especie que está produciendo esa emisión.

3.2.2 Determinación del rendimiento cuántico

1
5
Factores que afectan al rendimiento cuántico. La medida del rendimiento cuántico de
fluorescencia de un compuesto en disolución está afectada por una serie de factores que hay
que tener en cuenta a la hora de obtener buenos valores de este parámetro.

• Efectos de autoabsorción y filtro inerte La relación lineal entre concentración y

fluorescencia sólo puede aplicarse a absorciones muy bajas. A altas absorciones
los factores de corrección dependen de la geometría del instrumento. Por otro
lado, si hay un fuerte solapamiento entre absorción y fluorescencia la
autoabsorción es importante y aumenta con la concentración. De aquí, que los
valores de ϕf se obtengan de disoluciones muy diluidas.
• Efecto de la longitud de onda de excitación Es muy común asumir que el ϕf es
independiente de la λ de excitación. Sin embargo, se han observado excepciones
a esta regla, de aquí que sea necesario verificar el cumplimiento de la ley de
Vavilov en el derivado cuyo ϕf queremos medir.
• Una corrección del índice de refracción entre un estándar y la muestra se
requiere de manera que se compensen las diferencias de la geometría óptica entre
la disolución y el estándar.
• Efectos de la temperatura. La fluorescencia es un parámetro que puede depender
fuertemente de la temperatura por lo que la medida del ϕf hay que realizarlo a una
temperatura determinada y si se realizan varias medidas hay que tener la
precaución de mantener constante la temperatura.
• Efectos de las impurezas. Para evitar la presencia de posibles desactivadores de la
fluorescencia, es necesario utilizar disolventes grado uvasol
• .Dispersión de la luz. Toda la luz incidente no es absorbida o trasmitida por la
muestra, sino que es también dispersada. Esta dispersión se origina por las
mismas moléculas (dispersión Rayleigh) o por partículas en suspensión coloidal
(dispersión Tyndall). Ambos tipos de luz dispersa son recogidas junto con la
fluorescencia y hay que tomar las debidas precauciones para separarlas.
Otro tipo de dispersión es la llamada dispersión Raman. Las bandas Raman
aparecen separadas de la radiación incidente por la misma diferencia de
frecuencias que la λ de excitación. De esta manera, si la fluorescencia coincide
con la banda del disolvente, la separación puede efectuarse cambiando la λ de
excitación a valor más bajo. La dispersión Raman es solamente importante si
recogemos la fluorescencia con alta sensibilidad, ya que este fenómeno es débil,
no obstante hay que tenerla siempre en cuenta. Por consiguiente, antes de medir la
fluorescencia, hay que realizar un ensayo en blanco. Todos los disolventes
conteniendo átomos de hidrógeno ligados a carbono u oxígeno, muestran un
Raman desplazado 3000 cm-1 de la radiación incidente.

Métodos utilizados para determinar el rendimiento cuántico de fluorescencia. Si

analizamos la historia de las determinaciones de los rendimientos cuánticos, observamos que
la mayor parte de los autores sobreestiman su método y que es muy difícil determinar el
ϕf )con un error menor del 5%. El método que utilizaremos en esta práctica consistirá en
comparar la integral de fluorescencia de nuestro sistema con la integral de un patrón cuyo
valor de ϕf ya es conocido (estándar de fluorescencia). La expresión del rendimiento
cuántico de la muestra vendrá dada por:

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 Α r  λ  Ι r  λ  D s n 2s
 fs= fr
Α s  λ  Ι s  λ  D r n 2r

Donde los subíndices s y r se refieren a la sustancia problema y de referencia

respectivamente, ϕf es el rendimiento cuántico; A(λ) es la absorción de la disolución a la
longitud de onda de excitación; n, el índice de refracción; I(λ) es la intensidad de la lámpara
a la longitud de onda de excitación y D la integral de fluorescencia.
De la expresión anterior vemos que el rendimiento cuántico relativo puede ser determinado
midiendo el área de la banda de fluorescencia de la muestra y del estándar. También
comentar que para minimizar los errores en la obtención del rendimiento cuántico, es
conveniente excitar la muestra y el patrón de fluorescencia a la misma longitud de onda y así
evitaremos los errores de corrección del perfil de la lámpara.
El principal error de este método está en la corrección de los espectros de fluorescencia. Este
error será tanto más pequeño cuanto más solapen los perfiles de fluorescencia de la muestra y
del estándar.

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