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2008
i
Articulo 23 de la R resolución No 13 de Julio de 1946
¨ La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo vela por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y por que las tesis no contengan ataques contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia ¨.
ii
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para adoptar al titulo de
Microbióloga Industrial
DIRECTORA
VIVIANA PEÑA PÁEZ
Microbióloga Industrial
CO-DIRECTORA
JANETH ARIAS PALACIOS
Bacterióloga M.Sc- M.Ed
iii
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE
AUTOR
JOHANNA CAROLINA VELANDIA CASTELLANOS
APROBADO
iv
VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE
AUTOR
JOHANNA CAROLINA VELANDIA CASTELLANOS
APROBADO
v
AGRADECIMIENTOS
A la Microbiologa Industrial Viviana Peña Páez, por ser una gran directora de tesis.
No me habría sido posible llevar a cabo esta investigación sin su ayuda, sus
conocimientos, su orientación, guía, perspicacia, su apoyo, dedicación y por su gran
amistad.
vi
TABLA DE CONTENIDO
Pagina
1. RESUMEN 1
ABSTRACT 2
2. INTRODUCCIÓN 3
3. REVISIÓN DE LITERATURA 6
3.1 ANTIBIÓTICOS 6
3.1.1 Definición 6
3.1.2.3.1 Aminoglucosidos 10
3.1.2.3.2 Anfenicoles 10
3.1.2.3.3 Antimicobacterianos 10
3.1.2.3.5 Glucopeptidos 11
3.1.2.3.6 Lincosaminas 11
3.1.2.3.7 Macrólidos 11
3.1.2.3.8 Penicilinas 11
3.1.2.3.9 Quinolonas 12
3.1.2.3.11 Tetraciclinas 12
vii
3.1.2.3.12 Polipeptidicos 13
3.2 BACITRACINA 13
3.2.1 Descubrimiento 13
3.2.2 Sinónimos 13
3.2.9 Farmacocinética 16
3.2.11 Interacciones 17
3.3.2 Estabilidad 18
3.3.3 Incompatibilidades 18
3.5.2 Características 20
viii
3.5.3 Bioquímica 21
3.5.4 Patogénesis 21
3.6.1 Definición 22
3.6.3.2 Farmacopeas 23
3.7.1 SELECTIVIDAD 27
3.7.1.1 Definición 27
3.7.2 LINEALIDAD 29
3.7.2.1 Definición 29
3.7.3 PRECISION 30
3.7.3.1 Definiciones 30
ix
3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisión 31
3.7.3.2.1 Repètibilidad 31
3.7.3.2.3 Reproducibilidad 32
3.7.4 EXACTIDUD 33
3.7.4.1 Definición 33
3.7.4.4 Determinación 34
3.7.5.1 Definición 35
3.7.6 ROBUSTEZ 36
3.7.6.1 Definición 36
3.7.7 ESPECIFICIDAD 38
3.7.7.1 Definición 38
3.7.7.2 Determinación 38
3.8.1 Generalidades 39
3.8.2 Definiciones 39
x
3.8.2.4 Potencia estimada 40
3.8.3 METODO 40
3.8.4 Validación 41
3.8.4.1 Linealidad 41
3.8.4.3 Exactitud 42
3.8.4.4 Selectividad 42
5. JUSTIFICACION 45
6. OBJETIVOS 47
7. MATERIALES Y METODOS 48
7.8 Validación del método de cuantificación del principio activo (USP, 30) 52
7.8.1 Especificidad 52
xi
7.8.2 Selectividad 53
7.8.6 Exactitud 55
8. RESULTADOS Y DISCUCION 57
9. CONCLUIONES 67
10. RECOMENDACIONES 69
11. REFERENCIAS 70
12. ANEXOS 74
xii
LISTA DE FIGURAS
Pagina
xiii
LISTA DE TABLAS
Pagina
xiv
LISTA DE ANEXOS
Pagina
xv
1. RESUMEN
Se realizo la validación del método analítico para la cuantificación de Bacitracina, para ser
utilizado en el control de calidad de materias primas y en los productos farmacéuticos con
este principio activo. En el presente trabajo se describió y desarrollo el proceso de
validación de la valoración microbiológica de antibióticos en cilindro-placa (difusión en
agar), para la determinación cuantitativa de Bacitracina Zinc al 15% y Bacitracina Metilen
Disalicilato al 11%, que incluye los requisitos exigidos en la determinación de parámetros
analíticos de linealidad del sistema, linealidad del método, especificidad, exactitud,
selectividad, limite de detección, limite de cuantificación y la precisión expresada en sus dos
formas: repetibilidad y reproducibilidad.
De esta forma mediante los estudios realizados se establece que las características de
desempeño analítico cumplen con los requisitos para la aplicación analítica propuesta
siendo confiable para ser utilizado en la comprobación de las especificaciones de calidad.
1
ABSTRACT
The validation of the analytical methods method for the quantitative of Bacitracin was carried
out to be used in the quality control in a raw material and the pharmaceutical products
finished with this active principle. In this work was described and developed the validation
process of microbiological cylinder-plate determination method for antibiotics (diffusion in
agar) for the quantitative determination of Bacitracin Zinc 15% and Bacitracin Methylene
Disalicylate 11%, it includes the necessary requirements in the determination of the analytic
parameters: method linearity, system linearity, specificity, exactness, selectiveness,
detection limit, quantification limit and accuracy, which was expressed in its 2 forms:
repeatability and reproducibility.
It was demonstrated by through experimental design, with the statistical evaluation of the
experimental data and having like base the allowed approaches of acceptance that the
analytic method is specific, selective, lineal (r2 0. 993 system linearity, r2 0.995 method
linearity of Bacitracin Zinc y r2 0.99 method linearity Bacitracin Methylene Disalicylate),
precise (CV< 5%), exact (Sesgo < 3% y texp.< ttab.) in the interval of studied concentrations.
The quantification limit and detection limit was 0.02 UI/ml and 0.005 UI/ml respectively. For
that reasons, states that the characteristics of analytic acting fulfill the requirements for the
application analytic proposal, therefore, they are reliable and may be used in the checking of
the quality specifications of the raw material and the pharmaceutical products finished with
this active principle.
2
2. INTRODUCCIÓN
3
y clostridio. Es también activa frente a Actnomyces, Treponema pallidum y algunas
especies Gram negativas, como Neisseria y Haemophilus influenzae; sin embargo, la
mayoría de los microorganismos Gram. Negativos son resistentes. (Sweetman, C.
2003). Su espectro de acción abarca también, algunos corinebacterias, espiroquetas,
Nocardidia, Entamoeba histolytica. (Trolldenier, 1985). Las salmonellas, E.coli, Proteus,
los hongos y los virus son resistentes. Los gérmenes sensibles son inhibidos por una
concentración comprendida entre 0,005 y 2,0 UI/mg. Los que necesitan 50 UI/mg o mas
se consideran resistentes. (Trolldenier, 1900). La acción de la bacitracina es
bacteriostática y bactericida. La dosis requerida para que sea bactericida es 5 – 10
veces mayor. La bacitracina influye sobre importantes sistemas enzimáticos. Impide la
construcción de la pared celular bloqueando la desfosforilizacion (Parthier, 1969). La
Bacitracina interfiere en la síntesis de la pared celular bacteriana al bloquear las
funciones de las moléculas transportadoras de lípidos que transfieren las subunidades
de la pared celular a través de la membrana. La Bacitracina se une al undecaprenol-
pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e impidiendo por lo tanto, la regeneración
del transportador de membrana.. (Sweetman, C. 2003). En los estafilococos inhibe la
incorporación del acido glutámico durante la fase de proliferación. (Trolldenier, 1984)
La Bacitracina y la Bacitracina zinc se aplican por vía tópica, a menudo junto con otros
antimicrobianos como la Neomicina o Polimixina B, y algunas veces con
corticosteroides, en el tratamiento de las infecciones locales. La bacitracina se emplea
en infecciones de piel (piodermitis, heridas infectadas, Impetigo contagioso, foliculitis,
furunculosis, ulcera decubitus, dermatitis infecciosa eczematoid, escabiosis, y
dermatofitosis), conjuntivas (causadas por S. aureus, S. pyogenes, entre otros),
sinusitis, faringitis, traqueobronquitis, infecciones mandibulares (actinomicosis),
oculares, entre otros. La bacitracina ha sido efectivamente usada oralmente para el
manejo de amebiasis intestinal, pero se encuentran disponibles otros amebicidas más
potentes. (Remington´s. 1980)
El presente trabajo tiene como objetivo describir el proceso de validación del método
analítico para la cuantificación de Bacitracina efectuado en el laboratorio de VICAR
FARMACEUTICA S.A. mediante estudios de laboratorio que permitan la determinación
y el estudio de las característica de desempeño analítico para la validación del método.
5
3. REVISION DE LITERATURA
3.1. ANTIBIÓTICOS
3.1.1 Definición
El primero que expresó el concepto de antibiótico fue Waksman (1942): los antibióticos
son sustancias de acción antimicrobiana producidas por microorganismos o plantas
superiores en el curso de su metabolismo normal, sustancias que inhiben el crecimiento
de otros microorganismos en concentraciones mínimas. Esta definición ha sido
ampliada posteriormente en virtud de los conocimientos adquiridos sobre su obtención,
y con objeto de deslindar otros productos metabólicos: un antibiótico es una sustancia
químicamente definida, producida en el metabolismo de células vivas y aislada de ellas
por primera vez, o uno de sus derivados producidos por métodos sintéticos o
biosintéticos, el cual ejerce su acción bacteriostática o bactericida en pequeña
concentración contra microorganismos vegetales y animales.( Brunner y Machek,
1962).
6
2. fase de muerte: inhibición del crecimiento o muerte de los gérmenes. El número de
bacterias que sobreviven disminuye espontáneamente mientras dura la acción letal si la
concentración es constante.
3. fase tardida: la reducción de gérmenes disminuye, pero sin que cesé por completo.
Esta fase también se puede llamar persistencia. (Thrum y Bocker, 1971)
Todos los antibióticos poseen un espectro de actividad conocido sobre los gérmenes
patógenos en virtud a su mecanismo de acción específica. Por los microorganismos o
agentes afectados, dividimos los antibióticos en bacteriostáticos, bactericidas,
fungistáticos, virostáticos, rickettsiostáticos y citostáticos. En cuanto al número de
especies o familias sensibles el espectro de los antibióticos puede ser reducido, medio o
amplio. El espectro es muy variable siendo la mayoría de tipo amplio el mayor en
cefalosporinas de 4ª generación, carbapenemas y piperacilina-tazobactam, seguido de
cefalosporinas de 3ª generación incluyendo Gram Negativos, Gram Positivos y
espiroquetas. De espectro más reducido destacan la bencilpenicilina y
fenoximetilpenicilina (estreptococos y Neisseria), cloxacilina (antiestafilococo) y
aztreonam (sólo Gram negativos) y los de espectro medio suelen ser activos frente a
gérmenes Gram Positivos y Gram negativos y a ellos pertenecen las penicilinas, los
antibióticos macrólidos, algunos polipeptídicos y los aminoglucosídicos, la amoxicilina-
clavulánico y cefalosporinas de 1ª y 2ª generación.(Trolldenier, 1900)
Otra forma de agrupar los antibióticos es en función de las "dianas" sobre las que
actúan y con las que interfieren:
7
antibióticos no lesionan las células humanas ya que éstas no poseen pared celular.
(Pareja Iañez, 1998)
A diferencia de los antibióticos que actúan a nivel de pared, los que interfieren con la
membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo
8
esté o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de
procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan más o menos tóxicos para
los mamíferos y, en general, han encontrado escasa aplicación clínica. Algunos de los
antibióticos que pertenecen a este grupo son: Polienos, Polimixinas, Imidazoles, entre
otros. (Pareja Iañez, 1998). La Estreptomicina, la Polimixina B y la Colistina, perturban
las funciones de la membrana citoplasmática que regula las condiciones de
permeabilidad, de tal modo que puede producirse la muerte de la célula por
desregulaciones osmóticas. Esta acción no exige división celular y es posible también
en la fase de reposo. (Trolldenier, 1984)
Esta acción inhibidora del metabolismo no depende tampoco de la división celular, pero
se desarrolla con mayor rapidez y seguridad durante la fase de proliferación.
(Trolldenier, 1900). Algunos de los antibióticos que pertenecen a este grupo son:
Tetraciclinas, Aminoglucósidos, Anfenicoles, Lincosamidas, Macrólidos, entre otros.
(Pareja Iañez, 1998)
9
Sus mecanismos de acción son: a). Por bloqueo de la trascripción:- Impide que actué la
ARN polimerasa bacteriana que es la que sintetiza el ARN. - Rifampicina. b). Por
bloqueo de la duplicación del ADN:- Actúan inhibiendo la acción de las enzimas que
enrollan y desenrollan la cadena de ADN, estos antibióticos impiden que la cadena se
desenrolle. - Quinolonas: Oflozacino, cinoxacino, norfloxacino. - Novobiocina:
Benzamida. c) Por interferencia en la síntesis de bases nitrogendas:- Impiden la síntesis
de bases nitrogenadas, Adenina, timina, etc. (método exclusivo de las bacterias). -
Sulfamidas - Diaminopirimidinas. Algunos de los antibióticos que pertenecen a este
grupo son: Quinolonas, Ansamicinas, Sulfonamidas, entre otros. (Pareja Iañez, 1998)
3.1.2.3Estructura química
3.1.2.3.1 Aminoglucosidos
3.1.2.3.2 Anfenicoles
3.1.2.3.3 Antimicobacterianos
10
utilizan para el tratamiento de tuberculosis, la lepra y otras infecciones micobacterianas.
(Sweetman, 2003).
3.1.2.3.5 Glucopeptidos
3.1.2.3.6 Lincosaminas
3.1.2.3.7 Macrólidos
3.1.2.3.8 Penicilinas
11
principio como una mezcla de penicilinas conocidas como F, G, X y K, a partir del moho
Penicillium notatum. Se obtuvieron mejores rendimientos utilizando P. chrysogenum.
Son bactericidas por medio de su acción inhibitoria sobre la síntesis de la pared
bacteriana. La bencilpenicilina puede considerarse el compuesto original de las
penicilinas y es activa principalmente frente a bacterias grampositivas y Neisseria spp.
Algunas penicilinas son activas frente algunos microorganismos gramnegativos (ejemplo
ampicilina, mecilinam, temocilina, entre otros). (Sweetman, 2003).
3.1.2.3.9 Quinolonas
3.1.2.3.11 Tetraciclinas
12
colera, acne), espiroquetas, algunas micobacterias y algunos protozoos. (Sweetman,
2003)
3.1.2.3.12 Polipeptidicos
3.2 BACITRACINA
3.2.1 Descubrimiento
En Junio de 1943, Una niña de 7 años llamada Margaret Tracy, ingreso a la sala de
urgencias del Hospital Presbiteriano de Columbia de la ciudad de Nueva York, pues la
había atropellado un coche, ocasionándole una fractura abierta en la tibia. De esta
herida se tomo una muestra y en el análisis microbiológico inicial se determino la
presencia de Staphylococus aureus. Sin embargo, a su vez otras muestras fueron
enviadas al laboratorio de bacteriología, donde su directora, Balbina Jonson, describió
que el Staphylococus aureus visto en el examen inicial microscópico había
desaparecido de la noche a la mañana. Con la ayuda de Fran L. Meleney y H. Anker,
consiguieron aislar a partir de la muestra de la herida una cepa de un bacilo muy activo
frente S. Aureus, al que dominaron ¨Tracy I¨. Tras filtrar el caldo de cultivo se detecto la
presencia de un potente antibiótico a este antibiótico le dieron el nombre de Bacitracina,
de la combinación del termino ¨bacilo¨ y ¨tracy¨, apellido de esta niña. (Martín, 2005)
3.2.2 Sinónimos
Bacitracina A: C66H103N17O16S
Bacitracina F: C66H97N15O17S
(Trolldenier, 1900)
(Trolldenier, 1900)
Es un polvo higroscópico de color blanco a amarrillo pálido, inodoro o con ligero olor.
Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol, acido acético glacial y metanol; la
solución en disolventes orgánicos a menudo presenta un residuo insoluble; insoluble en
acetona cloroformo y éter. Estas soluciones se deterioran fácilmente a temperatura
ambiente. Precipita en estas soluciones y se inactiva por sales de algunos metales
14
pesados. (USP 30). Forma sales estables con el cinc y el manganeso, las cuales son
relativamente insolubles (0,23 – 0,45 % a 25oC). (Trolldenier, 1984)
De la mezcla se han aislado diversas (5 – 10) bacitracinas: A, A´, B, C, D, E, F1, F2, F3,
G. La conservación requiere ausencia de aire y oscuridad. La sustancia seca se
conserva durante 1,5 y 2 años a baja temperatura. (Patsch, 1975). En solución acuosa
al 1% presenta un pH entre 6 y 7. Conservar a temperatura entre 8 y 15 oC en envases
herméticos. (F. EUR). El pH en una solución acuosa que contiene 10.000UI/ml oscila
entre 5,5 y 7,5. (USP 30).
15
Tabla 1. Espectro de acción de la Bacitracina (Según Wege, 1969)
3.2.9 Farmacocinética
16
3.2.10 Indicaciones y administración
3.2.11 Interacciones
17
3.3 BACITRACINA ZINC
3.3.2 Estabilidad
3.3.3 Incompatibilidades
Antibiótico polipeptídico. Inhibe la síntesis del mucopéptido que forma la pared celular.
De esta manera, impide la formación de la pared celular y hace a la bacteria
osmóticamente sensible, llevándola a la lisis.
18
3.3.5 Indicaciones de uso, dosis recomendadas, vías de aplicación.
Especies a las que se destina (Pollos, pavos, cerdos, conejos, entre otros) se emplea
como promotor de crecimiento y terapéutico para infecciones entéricas y superficiales.
Para mejorar la producción de huevo, la eficiencia alimenticia en la gallina y el peso de
la carcasa o canal. (Abecia et al. 2004), (King et al.1980).
Es un polvo granular de color amarrillo a café, olor tenue, de sabor amargo, es insoluble
en agua y soluble en alcohol y metanol. (Tianjin XinXing, 2007). Debe almacenarse en
un lugar frío y seco protegido de la luz solar directa y la humedad. (Alpharma Inc. 2007).
19
contagiosa (cresta azul, fiebre del lodo) en pavos, complicada por organismos
susceptibles a la Bacitracina. En cerdos se administra para el tratamiento de la
disentería porcina asociada a Treponema hyodysenteriae. También se está indicado su
uso como mejorador del desempeño y para prevenir o controlar la enteritis necrótica en
pollo de engorde, gallinas de postura y reproductoras, aves de reemplazo y pavos. Es
eficaz en el control de bacterias Gram Positivas y altamente efectivo contra Clostridium
perfringens, causante de enteritis necrótica. (Alpharma Inc. 2007).
Dominio: Bacteria
Phylum Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Familia: Micrococcaceae
Genero: Micrococcus
Especie: M. luteus
3.5.2 Características
3.5.3 Bioquímica
M.luteus produce pigmentos insolubles en agua de amarrillo crema. Puede crecer sobre
agar de nitrógeno inorgánico y pocos pueden reducir nitrato. Son oxidasa positiva.
M.luteus no produce ácido a partir de glucosa o glicerina bajo condiciones aeróbicas y
no produce arginina hidrolasa o galactosidasa. Los carbohidratos son oxidados a CO2 y
a agua. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).
3.5.4 Patogénesis
Mientras algunas especies son utilizadas para el mejoramiento del sabor y olor de
productos carnicol fermentados M.luteus han sido usado en la producción económica de
hidrocarburos alifáticos de cadenas largas (C21 - C34). Éstos podrían ser útiles como
aceites de lubricación y poder ser sustitutos de productos del petróleo. (Sciencenet
Multimedia Publishing, 2003)
21
3.6 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS
3.6.1 Definición
Definición General
Definición Analítica
Son validables los métodos analíticos clasificados en la siguiente forma (AEFI, 2001):
Ensayos de identificación
Ensayos para la identificación del analito de interés de una materia prima o de una
especificidad farmacéutica.
Ensayos microbiológicos.
22
3.6.3 Entorno Legal
3.6.3.2 Farmacopeas
No existe una guía oficial que indique la optima secuencia de experimentos analíticos
necesarios para el desarrollo de un método, ya que esto depende del método en si
mismo. No obstante, el desarrollo lógico de un método analítico transcurre en diferentes
fases.
23
calificación del personal, tipo de equipo e instrumentación, condiciones de seguridad,
entre otras. (AEFI, 2001)
La puesta a punto del método analítico, incluye desde los primeros estudios de tanteo
con patrones, hasta la utilización del método en muestras reales que garanticen el buen
funcionamiento del sistema en el momento de análisis. (AEFI, 2001)
El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del valor de los
parámetros del método antes de validar. A partir de este estudio se definirán las
características de idoneidad o conjunto de parámetros que garantizan que el sistema
responde, en el momento del análisis, a los requisitos fijados. Dichas características se
reúnen en un ensayo conocidas como ensayo de idoneidad. (System Suitability Test).
(AEFI, 2001)
24
3.6.4.4 Características de fiabilidad
Esta última permitirá conocer las características de fiabilidad del método para su
aplicación rutinaria. Dichas características son las que demuestran la capacidad de un
método analítico para mantener a lo largo del tiempo ¨ los criterios fundamentales de
validación¨. Las características de fiabilidad comprenden los cinco criterios
fundamentales de validación. (No necesariamente aplicados a todos los casos) y de los
que derivan en la práctica todos los parámetros de validación (AEFI, 2001):
Selectividad
Linealidad
Rango
Precisión
Exactitud
Limite de Cuantificación
Limite de Detección
Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde valoraciones analíticas muy
rigurosas hasta evaluaciones de tributos subjetivos. Considerando esta amplia variedad,
es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de
validación. A continuación se indican las categorías de pruebas más habituales para
las que se exigen datos de validación según la USP 30:
25
Para cada categoría se requieren diferente información analítica. En la Tabla 2 se
indican los elementos de datos que normalmente se requieren para cada una de estas
categorías.
Categoría II
Características de
Desempeño
Categoría Categoría Categoría
Pruebas Pruebas de
Analítico
I III IV
de Limite Limite
Cuantitati Cualitativas
vas y Limite
Exactitud Si Si * * No
Precisión Si Si No Si Si
Repetibilidad Si No Si No
Precisión Si No Si No
Inmediata
Especificidad Si Si Si * Si
Limite de No No Si * No
Detección
Limite de No Si No * No
Cuantificación
Linealidad Ni Si No * No
Intervalo Si Si * * No
26
3.7 CARACTERÍSTICAS DEL DESEMPEÑO ANALÍTICO
3.7.1 SELECTIVIDAD
3.7.1.1 Definición
27
3.7.1.2 Ámbito de aplicación
Los criterios de selectividad que debe satisfacer un método puede diferir dependiendo
de la finalidad con la que se aplique. El grado de selectividad asociado a un método
adquiere mayor relevancia según su finalidad. En un método de control de calidad de
rutina la exigencia de alguna interferencia se podría aceptar si esta es conocida y de
magnitud aceptable. En estos casos la selectividad puede entrar en conflicto con el
coste y el tiempo necesario para la determinación del analito. (AEFI, 2001)
28
3.7.2 LINEALIDAD
3.7.2.1 Definición
Aunque el proceso lógico consistiría en evaluar cuales son los limites de concentración
en los que el método analítico pierde su linealidad, normalmente se toma como punto de
partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el
conocimiento analítico de la técnica empleada y principalmente en función de las
especificaciones. (AEFI, 2001)
29
Valoración de un fármaco o de un producto terminado: de 80% a 120% de la
concentración de la prueba.
Según la guía ICH Q2A se estudia la linealidad en todos los métodos de tipos
cuantitativo:
3.7.3 PRECISION
3.7.3.1 Definiciones
30
3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisión
P R E C IS IO N
R epetibilidad R epetibilidad
Instru mental D el M éto do
En la tabla (Huber, 1999) se resumen los factores que pueden o no variar en el estudio
de repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.
Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma
muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos
aparatos y reactivos, entre otros), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo
corto. (AEFI, 2001)
Uno de los factores que pueden influir en la repetibilidad del método de análisis es la
concentración del analito, ya que la desviación estándar de las respuestas obtenidas
aumenta al disminuir la concentración del analito. Por otro lado el valor aceptado del
coeficiente de variación depende del intervalo de aceptación especificado en el método
de análisis. El numero de replicas se deduce a partir del coeficiente de variación de
repetibilidad del método. (AEFI, 2001)
31
3.7.3.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental
El ensayo de repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alícuotas de una
muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación
de la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y mismo
analista. Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: un mínimo de 6
muestras a la concentración nominal. (AEFI, 2001)
Estudia la variabilidad del método efectuado una serie de análisis sobre la misma
muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días,
entre otros) y en un mismo laboratorio. El objeto del estudio de precisión inmediata es
determinar la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma
muestra, en un mismo laboratorio pero en condiciones operativas diferentes. (AEFI,
2001)
3.7.3.2.3 Reproducibilidad
32
tanto la evaluación de la precisión no es necesaria ni en el ensayo de identificación ni
en el test limite de impurezas. (AEFI, 2001)
3.7.4 EXACTITUD
3.7.4.1 Definición
Según la guía (ICH, Q2A) debe ensayarse la exactitud en métodos de análisis para la
valoración en materia prima y en producto terminado y en métodos de análisis de
cuantificación de impurezas, según la USP 30 también debe evaluarse en métodos de
análisis de estudios de la velocidad de disolución.
33
Impurezas: desde el 50% del nivel de especificación hasta el 120% de dicho nivel.
3.7.4.4 Determinación
del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza conocida (por ejemplo
un estándar de referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de
un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o
definido. En la valoración de un fármaco en un producto formulado, la exactitud puede
determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico a mezclas sintéticas de
los componentes del producto farmacéutico al que se hayan añadido cantidades
conocidas de analito dentro del intervalo de procedimiento. Si no resulta posible obtener
muestras de todos los componentes del producto farmacéutico, se puede aceptar tanto
el agregado de cantidades conocidas del analito al producto farmacéutico (¨Spike¨)
como la comparación de los resultados con los de un segundo procedimiento bien
caracterizado, cuya exactitud haya sido comprobada o definida. (USP 30)
3.7.5.1 Definición
35
3.7.5.2 Ámbito de aplicación
Según ICH Q2B, tanto el LD como el LQ podrían determinarse a partir del análisis de
muestras con concentraciones conocidas y decrecientes del analito, estableciéndose
visualmente la mínima concentración detectable como aquella concentración limite que
permite cuantificar con razonable precisión y exactitud la señal obtenida. (AEFI, 2001)
3.7.6 ROBUSTEZ
3.7.6.1 Definición
36
empleo. Es por lo tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para
proporcionar resultados validos en presencia en presencia de pequeños cambios
respecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante
su utilización. (AEFI, 2001)
Aunque la USP define la robustez junto con los parámetros de validación de un método
analítico, no es considerado, todavía, un requisito necesario para registro de
especialidades, sino que se trata de un estudio que sugirió con el fin de resolver los
problemas que se planteaban en la transferencia de métodos analíticos entre
laboratorios. Las guías ICH recomienda incluir la robustez en una fase apropiada del
desarrollo del método y no en la validación propiamente dicha , dado que si la robustez
del método no se comprueba con anterioridad a iniciar la validación, puede suceder que
se intente validar un método poco robusto, con lo consiguientes malos resultados y
perdida de tiempo y dinero. Incluso después de realizar el estudio de robustez podría
concluirse que se debe modificar algún parámetro del método, obligando a la
consiguiente revalidación de los puntos necesarios. De hecho la consecuencia directa
de los resultados del estudio de robustez ha de ser la definición razonada del test de
idoneidad del método, que en muchas ocasiones es fijado de una forma arbitraria y sin
saber la ciencia cierta si los requisitos que impone son realmente necesarios o limitan la
realización del método a unas condiciones escasamente reproducibles.(USP, 30)
Todos los métodos, sea cual sea la técnica empleada, son susceptibles a ser sometidos
a un estudio de robustez. Algunos pueden tener muchos parámetros sobre los que
37
actuar y otros menos. Además estos no tienen por que ser solo factores relacionados
con la medida final, sino que pueden ser de cualquier etapa del procedimiento analítico,
Por esto la primera etapa del estudio es precisamente analizar todo el método y definir
que factores son los que se espera que influyan mas en el resultado final. (AEFI, 2001)
3.7.7 ESPECIFICIDAD
3.7.7.1 Definición
3.7.7.2 Determinación
38
impurezas en concentraciones adecuadas y la demostración de que esas impurezas se
determinan con exactitud y precisión adecuadas. (USP 30)
3.8.1 Generalidades
3.8.2 Definiciones
39
Básicamente la valoración de antibióticos por difusión en agar se fundamenta en la
difusión del antibiótico desde un cilindro vertical (o desde una perforación circular en el
agar) a través de una capa de agar solidificada en una placa de petri hasta inhibir
totalmente el crecimiento del microorganismo añadido, en un área circular o zona de
inhibición entorno al cilindro que contiene una solución antibiótico. El método
turbidimetrico se basa en la inhibición del crecimiento de un cultivo microbiano en una
solución uniforme del antibiótico en un medio líquido que promueva su rápido
crecimiento en ausencia del antibiótico. (USP 30)
3.8.3 METODO
El diseño mas simple para esta prueba es un ensayo con una curva estándar. Para ello
se prepara el patrón a 5 concentraciones o dosis (A, B, C, D, E) que mantengan entre si
una relación logarítmica, y una solución de la preparación a ensayar a una
concentración teórica equivalente a la intermedia del patrón (C). Se considera el ensayo
como preliminar si la potencia de la muestra una vez interpolada en la curva construida
con las respuestas del patrón es inferior al 80% o superior al 120%. En tal caso se
debe preparar la muestra a una concentración teórica mas centrada a la del patrón y
repetir el ensayo. Otro diseño seria del cuadrado latino, en el que la potencia del
problema se determina por comparación entre una recta constituida por el patrón y otra
constituida por el problema. (AEFI, 2001)
40
Los sistemas biológicos presentan una variabilidad que obliga a tener diferentes criterios
para verificar y realizar ensayos. Realmente la verdadera potencia se puede encontrar
dentro de un rango de valores que vendrá definido por los límites de confianza de error
calculados para el ensayo, que nos dará los valores de los extremos con una
probabilidad de un 95%.( AEFI, 2001)
3.8.4 Validación
El ensayo debe diseñarse de tal forma que permita examinar la validez del método
matemático en el que se basa la ecuación de la potencia. Si se escoge el modelo de
líneas paralelas, las dos líneas de logaritmos de dosis-respuesta deben ser paralelas, y
lineales en el rango de dosis usadas en el cálculo. Estas condiciones deben verificarse
por ensayos de validación con una probabilidad P= 0.05. Pueden usarse otros modelos
matemáticos si se demuestra su validez. (AEFI, 2001)
Los pasos a seguir para la validación de una valoración de antibióticos son según la
USP 30
3.8.4.1 Linealidad
Demostrar que la recta de regresión construida con la muestra de producto acabado que
contiene el antibiótico a las mismas dosis que la recta patrón, presenta una relación Log.
Dosis-respuesta que cumple con los parámetros de regresión lineal y análisis de
varianza.
41
media, coeficiente de variación, limites de confianza de la media y la tolerancia, que
expresa la variabilidad del método respecto al intervalo entre las especificaciones
superior e inferior.
3.8.4.3 Exactitud
Para determinar la exactitud se preparan tres alícuotas de un blanco con los excipientes,
se añaden a una de ellas la cantidad de antibiótico correspondiente al limite inferior de
aceptación, en la otra alícuota se añade la cantidad correspondiente al 100% y en la
tercera la cantidad correspondiente al limite superior de aceptación. Se efectúan las
valoraciones de cada una de las alícuotas y con los resultados obtenidos se comprueba
que se cumplan los parámetros estadísticos que definen la exactitud:
3.8.4.4 Selectividad
42
4. FORMULACION DEL PROBLEMA
44
5. JUSTIFICACION
45
consistentes, que se llevan a cabo por medio de técnicas y métodos exactos,
reproducibles y sólidos. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
Por otra parte se encuentran las normas ISO 9000 presentes en un manual de calidad
conciso que establece políticas básicas fundamentadas en la descripción de
procedimientos de procesos que reflejen en pocas palabras lo que se hace en la
industria. La norma ISO 9000 busca mejorar y certificar las industrias de manufactura en
el ámbito nacional e internacional mediante la estandarización de cada uno de los
procesos de producción (Teormina, 1997). Al ir realizando la validación de cada uno de
los métodos analíticos que se desarrollan en esta industria farmacéutica se estan
alcanzando las pautas para la certificación de la empresa, alcanzando un alto nivel de
calidad que tiene como resultado el desarrollo, crecimiento y alto grado de
competitividad en la industria farmacéutica a nivel nacional e internacional, ser líder en
prestación de servicios de análisis de laboratorio, tener reconocimiento del alto nivel de
calidad de los productos que ofrece al consumidor, logrando su misión y visión.
46
6. OBJETIVOS
6.2.3 Evaluar cada una de las características de desempeño analítico para la validación
del método.
47
7. MATERIALES Y METODOS
La primera muestra que se utilizo en el análisis fue Bacitracina Zinc al 15% como
principio activo, de Lote 20071102-6 y potencia asignada 6006 U/g en base seca
(indicada en el certificado de Análisis por el fabricante).
Los análisis estadísticos para la Validación del Método Analítico se realizaron utilizando
Statgraphics Plus for Windows 2.0 (1996). Statistical Graphics Corp. Serial Number:
3862216 para la linealidad del sistema y las linealidades del método y se utilizo
Microsoft Office Exel 2007 para el análisis de datos de la precisión, exactitud,
selectividad, especificidad, limite de cuantificación, limite de detección, linealidad del
sistema y linealidad del método.
48
7.3 Preparación y estandarización de la suspensión del microorganismo de
ensayo
49
sugerido (0.3ml / 100ml medio) para inoculo por la USP 30. Los volúmenes de prueba
que se utilizaron de suspensión madre fueron: 0.3, 0.5, 1.0 y 2.0 ml por cada 100 ml de
medio antibiótico No 1 (Anexo 1). Cada volumen de prueba se hizo por triplicado. Se
agrego 6ml de inoculo sobre cada una de las cajas petri con capa de agar base. Se
dejaron las cajas 45 minutos sobre una superficie plana hasta que el inoculo se
solidificara para perforarlas con el sacabocados de 6 perforaciones y se retiro el residuo
de agar de cada uno de los pozos, en cada pozo se sembró 100 microlitros del la
dilución media del estándar de referencia en una concentración de 1.0 UI/ml. Se
incubaron las placas de 32 a 35 oC durante 18 horas. Después del periodo de
incubación se determino la cantidad de suspensión madre para el inoculo que mostró
una demarcación satisfactoria de las zonas de inhibición obtenida por la relación dosis-
respuesta optima a partir de la cantidad de cultivo del microorganismo en las placas.
(USP, 30)
7.4.2 Diluciones finales del patrón: la valoración se realizo con 10 niveles (desde A
hasta J) del Estándar. Se preparo a partir de la solución madre 10 diluciones en
concentraciones de: 0.05 UI/ml , 0.1 UI/ml , 0.15 UI /ml , 0.20 UI/ml , 0.25 UI/ml , 0.50
UI/ml , 1.0 UI/ml, 1.5 UI/ml, 2.0 UI/ml y 2.5 UI/ml utilizando solución amortiguadora No 1,
1%, pH 6 (Anexo 1) como diluyente ( tabla.4 y 5). La dilución media utilizada fue de 1.0
UI por ml según lo especificado en la USP 30.
Volumen de 0.5 UI/ml (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)
2 8 0.1
3 7 0.15
4 6 0.2
5 5 0.25
50
Tabla 5. Diluciones de la curva patrón (intervalo de concentraciones 0.5 a 2.5
UI/ml)
Volumen de Solucion Madre (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)
1 99 0.5
1 49 1.0
3 97 1.5
2 48 2.0
2.5 47.5 2.5
Para el estudio no fue posible obtener el placebo de cada uno de los productos a
analizar de esta forma se realizo la inactivación del principio activo para poder analizar
los excipientes presentes en la muestra. Para la desactivar el principio activo se
51
realizaron diluciones madres de cada una de las muestras y se les adiciono 5ml de HCl
1N posteriormente se sometieron 60 minutos a 90 0C en baño de termostatado. Pasado
el periodo de tiempo se adiciono 5 ml de NaOH 1N con el fin de neutralizar la muestra.
Finalmente se afora el balon de 50ml con Buffer 1 al 1% pH6. Se realizaron estudios
para la confirmación de que no existiera actividad ni presencia de la molécula del
principio activo.
7.8 Validación del método de cuantificación del principio activo (USP, 30)
52
se realizo con 3 replicas para cada uno. Se observo si existió o no la formación de halo
de inhibición.
Para observar la degradación por acción de la luz las muestras se colocaron bajo luz
UV por un tiempo de 8 días a luz solar, transcurrido el periodo de tiempo se realizaron
diluciones para obtener una concentración de 1.0 UI/ml. Una vez que se obtuvieron los
datos de la valoración de cada una de las condiciones a las que se sometieron las
muestras, se realizo una segunda prueba en la que se llevó acabo los mismos
procedimientos solo que el periodo de exposición a la temperatura cambio siendo de 30
minutos a 90 oC, en las condiciones acidas y básicas únicamente. Se realizo esta
segunda prueba ya que los resultados que se obtuvieron mostraron una degradación
53
total de la molécula del principio activo al ser sometidas a 90oC en baño de maría
durante 1 hora en las diferentes condiciones, por esta razón se analizo en un periodo de
tiempo mas corto para determinar si la respuesta de la molécula era la misma en un
periodo de tiempo mas corto en las mismas condiciones de prueba.
7.8.3 Linealidad del sistema: Para el estudio de la linealidad del sistema se preparó
una curva de calibración en un intervalo de concentración desde 0.05 hasta 2.5 UI/ml,
que incluyó 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.5,
1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estándar de Referencia USP Bacitracina (Ver Tabla. 6). El
análisis se realizó por triplicado en cada concentración. Los niveles de concentración se
encuentran dentro de los intervalos establecidos para el tipo de análisis (80% 100%
120% 140%).
7.8.4 Linealidad del método: para esta determinación se analizo el método preparando
10 muestras de diferentes niveles de concentración de analito de muestra. Las
concentraciones verificadas previamente, son las mismas que se utilizaron en la
linealidad del sistema. El intervalo de concentraciones se utilizo desde 0.05 hasta 2.5
UI/ml que incluyó 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25,
0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estándar de Bacitracina mas placebo. De cada una de
las concentraciones se realizaron 3 replicas. A cada una de las diluciones se le adiciono
1ml de placebo antes de aforar los balones con Buffer 1 al 1% pH6. El placebo se
obtuvo sometiendo una solución madre de muestra a una hidrólisis acida con 5ml de
HCl 1N posteriormente se sometió a 60 minutos a una temperatura de 90 oC en baño
termostatado transcurrido el tiempo se neutralizo con 5ml de NaOH 1.0N. De esta
forma se inactivo el principio activo y la muestra represento el placebo.
54
7.8.5 Precisión del método: a una muestra de concentración única que representó el
100,0% de la cantidad teórica declarada se le realizo dilución hasta obtener una
concentración de 1.0 UI/ml; se efectuaron las valoraciones por 2 analistas en 2 días
diferentes en la que cada analista realizo diluciones para obtener muestras de
concentración de 1.0UI/ml del estándar y las muestras para ser analizadas. Para su
evaluación se realizó un análisis de varianza. De la muestra se realizaron 3 replicas por
analista y para cada día de análisis.
55
Tabla. 7 Diluciones del las muestras para determinar el limite de detección
Una vez finalizado el análisis se genero informe de validación y de acuerdo con los
resultados obtenidos se concluyo y se demostró estadísticamente que el método es
adecuado para el propósito determinado, es decir que posee un alto grado de
confiabilidad que puede ser aplicado a un amplio numero de muestras y matrices que
es practico con respecto al costo y el tiempo requerido en el análisis.
56
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 ESPECIFICIDAD
El método tiene la capacidad de diferenciar precisa y específicamente el principio activo
de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato, en presencia de los demás
componentes como lo son el diluyente utilizado y el placebo, que se espera estén
presentes en la matriz de la muestra. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
A partir de los resultados obtenidos de la especificidad presentados en el Anexo 5 y 6
se muestra evidencia de que el procedimiento no resulta afectado por la presencia del
diluyente o excipientes, ya que al sembrar el placebo y el diluyente en las placas de
valoración no se observo formación de halo lo que demuestra que estos no intervienen
en la formación de halo al cuantificar el principio activo. Al sembrar la concentración
central del principio activo en las placas de valoración se observo la formación de halos
de inhibición en de Bacitracina Zinc y en Bacitracina Metilen Disalicilato.
8.2 SELECTIVIDAD
En el Anexo 8 y 7 se presentan los porcentajes de degradación de cada una de las
muestras (M1 estándar, M2 muestra y M3 placebo) en los tratamientos con Bacitracina
Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato sometidas a condiciones externas de temperatura,
radiación UV, condiciones acidas y condiciones alcalinas. .
57
A partir de los porcentajes de degradación se observa como la molécula al ser expuesta
a condiciones acidas y básicas presenta degradación coincidiendo con la información
obtenida en cuanto a la estabilidad de la Bacitracina, determinando que esta es
rápidamente inactivada en soluciones que tienen un pH mayor a 9 y menores de 4.
(McEvoy, G.K., 1993)
Se observo una degradación apreciable al someter las muestras durante ocho días a
radicación solar directa, el Estándar Bacitracina (M1) presento un porcentaje de
degradación de 18.4%, a partir de este se determina que el principio activo es afectado
por la radiación UV. La muestra Bacitracina Zinc (M2) y muestra Bacitracina Metilen
Disalicilato (M2) mostraron una degradación mucho mas acentuada presentando un
82.6% y 76.6% de degradación correspondientemente siendo mas sensibles a la
exposición de luz solar durante un periodo mayor o igual a 8 días. Al someter las
muestras a una temperatura de 90oC durante un periodo de una hora se obtuvo un
porcentaje de recuperación de: 22.1% en el Estándar Bacitracina (M1), 75.5% en
Bacitracina Zinc (M2) y 73.0% en Bacitracina Metilen Disalicilato (M2). Se determino
que los principios activos son susceptibles o pierden su estabilidad al someterlos a altas
temperaturas, aunque el Estándar de Bacitracina presento un porcentaje de
degradación mas bajo es afectada igualmente. Los dos tipos de Bacitracina tuvieron un
porcentaje de degradación muy cercano lo cual nos muestra que las dos se ven aun
mas afectadas al someterlas a altas temperaturas y que las dos responden de igual
manera al someterlas a 90oC por una hora.
58
esto puede deberse a la presencia de una sustancia de degradación en los excipientes
del producto farmacéutico, que hace que la muestra genere un mayor halo de inhibición
y por lo tanto un porcentaje mayor de degradación.
59
La curva de calibración realizada entre el logaritmo de la concentración en la variable
dependiente (Y) y el diámetro del halo (mm) en la variable independiente (X) resultó ser
lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/mL. Al
aplicar la regresión lineal a los datos se obtuvo la ecuación de la recta que se expresó
según y = 0.168504x – 4.19447 (LogConc= -4.19447 + 0.168504*Diámetro). El
coeficiente de correlación fue de 0,997576. (R-squared = 99.5158 percent). (Anexo 3)
La regresión lineal obtenida es el diseño del modelo matemático, representado como
una ecuación, que permite establecer o simular el comportamiento de la variable
dependiente con respecto a la variable independiente. En el Anexo 3. se muestra la
curva de calibración para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresión lineal y un
coeficiente de correlación de 0.997576 hasta una concentración de 2.55 UI/ml arriba de
esta concentración el sistema puede perder su respuesta lineal (Reyes Aguero C.,
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una
curva de calibración lineal en el rango lineal.
El coeficiente de correlación obtenido es nuestro índice estadístico que mide la relación
lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentración y diámetro). Este mide
la correlación entre la variable dependiente xi (Diámetro halo) y una variable
independiente yi (Log de concentración), El coeficiente de correlación obtenido es muy
cercano a 1 existiendo una correlación positiva casi perfecta. El índice indica que existe
una dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando el
halo tiene un mayor diámetro (mm) la concentración (UI/ml) del principio activo es
mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra también lo hace en
idéntica proporción. (Reyes Aguero C., 2007).
60
dependiente con respecto a la variable independiente. En el Anexo 4. se muestra la
curva de calibración para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresión lineal y un
coeficiente de correlación de 0.980127 hasta una concentración de 2.55 UI/ml arriba de
esta concentración el sistema puede perder su respuesta lineal (Reyes Aguero C.,
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una
curva de calibración lineal en el rango lineal.
El coeficiente de correlación obtenido es nuestro índice estadístico que mide la relación
lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentración y diámetro). Este mide
la correlación entre la variable dependiente xi (Diámetro halo) y una variable
independiente yi (Log de concentración), El coeficiente de correlación obtenido es
cercano a 1 existiendo una correlación positiva. El índice indica que existe una
dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando el halo
tiene un mayor diámetro (mm) la concentración (UI/ml) del principio activo es mayor, es
decir cuando una de las variables aumenta, la otra también lo hace en idéntica
proporción. (Reyes Aguero C., 2007).
Se observo como la recta de la regresión constituida con el diámetro del halo y su
respuesta en la concentración cumple con los parámetros establecidos del coeficiente
de correlación. En los resultados obtenidos (Anexo 2, 3 y 4) del coeficiente de
correlación ninguno fue menor o igual a 0.95, de esta forma se encuentra en los criterios
de aceptación.
Los valores obtenidos en el P-value en los análisis de varianza (ANOVA) (Anexo 2, 3 y
4) realizados a cada una de las Bacitracinas es menor a 0.01, lo que muestra evidencia
estadísticamente significativa de la relación entre el logaritmo de la concentración y el
diámetro del halo con un nivel de confianza del 99%. De esta forma cumple con los
criterios de aceptación.
En el Anexo 2, 3 y 4 se muestra el análisis de la varianza de cada una de las
Bacitracinas, a partir de estos resultados se puedo concluir que existen diferencias
significativas entre las concentraciones establecidas dentro de un intervalo de 0.05
hasta 2.55. Es decir que las concentraciones que se trabajaron presentaron diferencia
en sus halos y de esta forma se puede establecer diferencia entre las concentraciones
para así poder realizar una cuantificación del principio activo.
8.6 PRECISIÓN
La desviación estándar obtenida en cada uno de los Grupos nos muestra la medida del
grado de dispersión de los datos del valor promedio o media. Valores grandes de la
desviación estándar indican que los datos (puntos) están lejos de la media y valores de
la desviación estándar pequeños indica que los datos están agrupados cerca de la
media. (AEFI, 2001) En todos los grupos la desviación estándar obtenida es
relativamente pequeña indicando que existe una agrupación de datos muy cercanos
alrededor de la media. La desviación estándar de cada uno de los grupos de medidas
nos indican la precisión de estas, ya que se muestra que tan lejos están estas del valor
real o media al ser realizado en diferentes condiciones (día, analista, equipó) pero con
una misma muestra. Las desviaciones estándar que se obtuvieron fueron de valores
pequeños lo que indico que no se observo una diferencia significativa entre los datos de
los grupos siendo un método preciso.
El coeficiente de variación (CV) en cada una de los grupos de datos para la repetibilidad
y para la reproducibilidad no fue mayor al 5% mostrando que el método cumple con los
parámetros establecidos, siendo el ensayó repetitivo.
Las medias de cada uno de los analistas en dos días, de cada uno del analista en un
mismo día, los dos analistas en un mismo día, o presentaron diferencias significativas lo
cual muestra la buena repetitibilidad del método y reproducibilidad. No se observaron
diferencias significativas entre las medias de ambos analistas, por tanto el método
analítico fue reproducible por ambos analistas, de igual forma no se detectaron
diferencias significativas entre las medias de ambos días siendo el método analítico
reproducible en diferentes días. De esta forma el método analítico posee repetibilidad
en diferentes días y por diferentes analistas, al igual que diferentes días por el mismo
analista.
Con un nivel de confianza de 95% que se corresponde con valores α de 0.05 informa
con un 95% de seguridad que nuestro valor estimado se encuentra en un intervalo de
confianza. Los valores obtenidos de los intervalos de confianza (Anexo 9 y 10),
muestran los valores que componen el intervalo dentro de la cual se considera que se
encuentra el verdadero valor de aquella característica que se esta estimando, el
diámetro del halo en mililitros con respecto a la concentración del principio activo.(AEFI,
2001)
El coeficiente de variación obtenido en la precisión del sistema fue menor al 5%, de esta
forma se encuentra dentro del criterio de aceptación establecido. La desviación estándar
obtenida muestra la dispersión de los 10 datos obtenidos con respecto a su media.
(Anexo 11).
63
8.7 EXACTITUD
Como forma de medir la dispersión de los datos hemos determinado la homogeneidad
de variancias. La varianza es una medida de dispersión que nos permite conocer que
tanto se dispersan los datos alrededor de su promedio o media. Los valores obtenidos
de la variancia de cada uno de los tratamientos con Bacitracina se muestran en los
Anexos 12 y 13, estos valores nos permiten identificar la diferencia promedio que hay
entre cada uno de los valores respecto a su punto central (la media). En el tratamiento
con Bacitracina Zinc los datos que presentaron la menor dispersión alrededor de su
media fue la concentración 120% con una variancia de 0.311 y en el tratamiento con
Bacitracina Metilen Disalicilato los datos que presentaron la menor dispersión alrededor
de su media fue la concentración 120% con una variancia de 0.062.
A partir del estudio de la homogeneidad de variancias por medio del test de Cochran, se
obtuvo el Valor Gexp=0.682 en Bacitracina Zinc y Gexp=0.790 en Bacitracina Metilen
Disalicilato que son inferiores al G3-.2-.0.05 (0.8709) (Anexos 12 y 13). Se acepta la
hipótesis de homogeneidad (igualdad) de variancias de las 3 poblaciones de origen, ya
que Gexp=0.682 en Bacitracina Zinc y Gexp=0.790 en Bacitracina Metilen Disalicilato es
inferior a G3-.2-.0.05 ( 0.8709).es decir que las variancias son homogéneas. La hipótesis de
igualdad de variancias no se rechaza por que el valor G obtenido no es superior al
correspondiente valor G (K,v,α) dado por la tabla e la prueba de COCHRAN. Los valores
optenidos de Gexp son mayores a 0.05 lo que indica que no hay diferencias significativas
en las variancias por lo que hay homogeneidad de variancias.
Los valores obtenidos del sesgo (e%) en cada uno de los tratamientos con Bacitracina
se muestran en los Anexos 12 y 13. Los valores obtenidos del sesgo es el error
sistemático, que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de
la magnitud. Este puede estar originado en un defecto del instrumento, en una
particularidad del operador o del proceso de medición, entre otros. (Vaqué. J, 2007).
Ninguno de los valores que se obtuvieron del e% fue mayor al 3% lo que nos indico que
se encuentran dentro de los criterios de aceptación. El tratamiento que presento menor
error sistemático fue el tratamiento de Bacitracina Zinc con un e%=1.24, el tratamiento
con Bacitracina Metilen Disalicilato presento un e%= 2.2 también entra en los criterios
de aceptación pero con un mayor error sistemático que el tratamiento con Bacitracina
Zinc.
De acuerdo con la prueba t de Student se obtuvo un Valor texp 1.208 para Bacitracina
Metielen Disalicilato y un Valor texp 0.39 para Bacitracina Zinc valores son menores a lo
que indica para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa
64
entre la recuperación de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es
conforme.
Los resultados obtenidos del análisis estadístico se muestran con más detalles en el
Anexo 15.
65
una muestra que puede cuantificarse en las condiciones experimentales indicadas. De
esta forma; se determina que el método es capaz de cuantificar en forma confiable
cantidades mínimas de Bacitracina en una muestra, siempre que tengan una
concentración igual o mayor a 0.02 UI/ml .
Los resultados obtenidos del análisis estadístico se muestran con más detalles en el
Anexo 14.
66
9. CONCLUSIONES
9.4 Las moléculas del principio activo disminuyen su actividad al someterlas a una
temperatura de 90oC por periodos mayores o iguales a una hora y al someterlas a
radicación solar UV durante un periodo de ocho días, por esta razón se debe mantener
el principio activo a temperatura ambiente y protegido de la luz solar.
9.5 La exactitud del método analítico cumple con los parámetros y/o criterios de
aceptación, concluyendo que los resultados de la prueba obtenidos mediante el
procedimiento establecido bajo condiciones descritas posee una proximidad al valor
verdadero.
9.7 Los resultados en la precisión mostraron que los coeficientes de variación son
aprobados, si el valor aceptable debe ser menor o igual que 5%, los coeficientes de
variación resultaron ser menores que 5%, lo cual demuestra la buena repetibilidad del
método de cuantificación..
67
9.9 A partir del análisis cuantitativo se determino el limite de cuantificación en la
concentración de 0.02 UI/ml de Bacitracina, esta concentración corresponde a la mas
baja cantidad de Bacitracina que puede determinarse cuantitativamente con precisión y
exactitud aceptables observando claramente la formación de halo.
9.10 Los resultados permiten concluir que el método analítico para la cuantificación de
Bacitracina presenta resultados de linealidad, especificidad, precisión y exactitud
satisfactorios que permiten obtener resultados seguros y confiables en la detección y
cuantificación de Bacitracina en las muestras al 15% y 11%.
68
10. RECOMENDACIONES
Para la correcta cuantificación del analito de interés se requiere que la señal producida se
deba inequívocamente a su presencia y que no existan interferencias de sustancias y/o
compuestos de degradación ácidos o básicos que puedan estar presentes en la muestra, su
preparación, condiciones instrumentales y/o material de trabajo. Es importante verificar que
estas sustancias interferentes y compuestos de degradación estén ausentes para no generar
interferencia significativa en el resultado.
El estudio de muestras de principio activo a condiciones de estrés, tales como exposición a
altas temperaturas y radiación UV, permitió identificar la presencia de compuestos de
degradación potencialmente interferentes, razón por la cual es importante que durante los
procesos de fabricación, empaque, almacenamiento y en los análisis de control de calidad
no se exponga el producto a ambientes con temperaturas superiores a 90ºC y a radiaciones
UV.
Si se desarrolla el método analítico dentro del rango de concentraciones 0.05 UI/ml hasta
2.55UI/ml se obtendrá una respuesta de tipo lineal, obteniendo resultados que son
directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de la muestra.
Por medio de este método analítico bajo las condiciones experimentarles descritas, la
mínima cantidad de analito presente en una muestra que se puede cuantificar con razonable
certeza, precisión y exactitud es de 0.02 UI/ml. Y la mínima cantidad de analito en una
muestra que se puede detectar pero no cuantificar es de 0.005 UI/ml, razón por la cual se
sugiere realizar la cuantificación del analito en muestras que contienen concentraciones
iguales o mayores a 0.02 UI/ml evitando así falsos positivos.
69
11. REFERENCIAS
http://www.farquimica.com/catalogo/espanol/catalog/default.php?cPath=139&PHPSESSI
D=30b5e6992df73dfe99ef90f595cc5169. Consulta: 10 Marzo 2008
<http://www.uch.ceu.es/principal/eponimos_cientificos/inicio.asp?menusuperior=>.
Consulta: 10 Octubre 2007.
Bacitracin Methylene Disalicylate (BMD) 10% 11%, Powder Granular, Premix. Tianjin
XinXing, 2007). Tianjin XinXing Veterinary Pharmaceutical Factory, The South of
Huozhuang Bridge, Beichen District Tianjin Tianjin 300402 China.
http://buy.ecplaza.net/search/1s1nf20sell/bacitracin_methylene_disalicylate.html.
Consulta: 10 Marzo 2008
70
40 Hastings Road, Hawthorn East, 3123, Victoria, Australia.
/www.microbionet.com.au/mluteus.htm. Consulta: 10 Marzo 2008
BRUNNER, R., UND MACHEK, G...1962: Die antibioka, Band I, 1. Teil. Verlag Hans
Carl, Nurnberg.
ICH- Techical Coordination- R. Bass, (1998); ICH Topic Q1A Stabilitu testing Guidelines:
Stabilitesting of new drug substances and product.
Errores y Sesgos. (Vaqué Josep, 2007). Hospital Universitari Vall d´Hebron. Facultad
de Medicina – UAB. Consulta: 10 Mayo 2008
www.vhebron.net/preventiva/docencia/mastphoenix/t12_validez_sesgos_diapos_fx.pdf -
MCEVOY, G.K. ed. 1993.. American Hospital Formulary Service - Drug Information 93.
Bethesda, MD: American Society of Hospital Pharmacists, Inc., 1993 (Plus Supplements,
1993)., p. 325
71
NEGWER, M. 1971. Organisch-chemische Arzneimittel und ihre Synonyma. Akademie-
Verlag, Berlin.
http://www.uacj.mx/transparencia/Acervo/Documentos/Ensayos%20en%20el%20laborat
orio%20ambiental%20-IIT/PR-IIT-143.pdf. Consulta: 1 Mayo 2008
Statgraphics Plus for Windows 2.0 (1996). Statistical Graphics Corp. Serial Number:
3862216
72
THRUM, H., UND BOCKER, H.1971.:Antibioka – Woher, wofur?, Urania-Verlag, Leipzig-
Jena-Berlín
73
11. ANEXOS
Peptona de caseína
Cloruro sódio
Agar-agar
Dextrosa1.0 g/L
Ajustar pH com acido fosfórico 18N o hidróxido de potasio 10N a 6.0 +/-0.05
74
ANEXO 2. LINEALIDAD DEL SISTEMA
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
75
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
The StatAdvisor
---------------
fitted model is
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
76
-----------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
0,09
0,06
Log concentración
0,03
-0,03
-0,06
-0,09
0 2 4 6 8 10
Diámetro
-----------------------------------------------------------------------------
F table 113.49
77
BACTRAN
LINEALIDAD DEL SISTEMA BACITRACINA
78
• Análisis de la Varianza de la Linealidad del Sistema
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p>0.05 acepto la Ho
------------------------------------------------------------------------------------------
data: resultado$residuals
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------
80
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
The StatAdvisor
---------------
fitted model is
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
81
---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
0,11
0,08
Log concentración
0,05
0,02
-0,01
-0,04
-0,07
0 2 4 6 8 10
Diámetro (mm)
-----------------------------------------------------------------------------
F table 1644.21
Confidence level 95
82
BACTRAN 15%
LINEALIDAD METODO BACITRACINA
Curva Estándar
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio Promedio corr.
S 7-G 24,86 24,61 24,39 24,12 24,74 24,81 24,22 25,07 24,47 221,29 24,59
S 1-A 16,01 16,49 16,48 15,70 17,41 º6.38 16,77 17,02 16,90 132,78 16,60 16,91
S 7-G 24,80 24,91 24,85 24,56 25,30 24,16 14,72 25,06 24,75 213,11 23,68
S 2-B 19,10 18,94 18,59 17,81 17,06 18,22 18,29 16,83 18,04 162,88 18,10 19,32
S 7-G 24,53 24,63 24,77 24,74 24,41 24,34 24,65 24,33 24,69 221,09 24,57
S 3-C 19,98 19,28 20,27 18,45 18,61 19,37 19,70 20,40 19,79 175,85 19,54 19,87
S 7-G 24,89 24,85 24,89 25,65 25,81 24,98 25,00 25,10 24,90 226,07 25,12
S 4-D 21,26 21,47 20,27 20,59 21,28 20,66 21,39 20,78 20,49 188,19 20,91 20,69
S 7-G 24,77 24,95 24,92 25,30 24,63 25,05 25,02 24,81 24,49 223,94 24,88
S 5-E 21,50 21,35 21,01 21,03 21,66 21,15 21,69 21,42 21,73 192,54 21,39 21,41
S 7-G 24,70 25,19 25,23 24,49 24,31 24,27 24,59 25,02 25,30 223,10 24,79
S 6-F 24,69 24,16 24,18 23,10 22,49 22,29 22,84 22,94 23,78 210,47 23,39 23,50
S 7-G 25,19 24,72 24,78 24,97 24,87 24,46 24,42 24,36 24,98 222,75 24,75
S 8-H 25,60 25,89 25,54 26,30 26,55 26,33 26,24 26,45 25,86 234,76 26,08 26,23
S 7-G 25,08 24,49 24,83 24,80 24,88 24,75 24,83 25,20 24,59 223,45 24,83
S 9-I 26,52 26,33 26,19 26,54 25,72 26,95 26,63 26,52 26,62 238,02 26,45 26,52
S 7-G 25,00 25,20 25,04 24,20 24,66 24,40 25,26 24,32 24,88 222,96 24,77
S 10-J 28,41 27,57 27,60 26,90 26,79 26,43 26,50 27,24 26,30 243,74 27,08 27,21
24.9024.9
CURVA ESTANDAR DATOS ESTANDAR 24
Puntos Diámetro Concentración Log (Conc.) Peso (mg) 17,0
(mm) (mg/ml) Potencia (P) UI/mg 75,1
S1 16,91 0,05 -1,3010 Fecha de Vencim iento N.A
S2 19,32 0,10 -1,0000 Lote N1E200
S3 19,87 0,15 -0,8239 DATOS
S4 20,69 0,20 -0,6990 Pendiente 0,1278
S5 21,41 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322
S6 23,50 0,51 -0,2924 Factor de Dilucion (D) 1250
S7 24,66 1,02 0,0086 Promedio General
S8 26,23 1,53 0,1847 Concentracion Central 24,90
S9 26,52 2,04 0,3096
S10 27,21 2,55 0,4065 Pr T (X S 3 )es mayor que Pr R= Suma
Pr T (X S 3 )es menor que Pr R= Resta
83
• Análisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Zinc
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p>0.05 acepto la Ho
--------------------------------------------------------------------------------------------
data: resultado$residuals
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con zinc (Kruskal-Wallis p< 0.05)
84
ANEXO 4. LINEALIDAD DEL MÉTODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
85
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
The StatAdvisor
---------------
fitted model is
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
86
0,6
Log concentración
0,2
-0,2
-0,6
-1,4
18 20 22 24 26 28
Diámetro (mm)
---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
0,15
0,1
Log concentración
0,05
-0,05
-0,1
-0,15
0 2 4 6 8 10
Diámetro
-----------------------------------------------------------------------------
F table 195.30
Confidence level 95
87
BACT R AN 11%
LINEA LID AD M ETOD O B A CITR A CINA
Curva Estándar
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Prom edio Prom edio corr
S 7-G 23,58 23,66 23,76 22,98 23,80 23,66 24,18 23,50 23,57 212,69 23,63
S 1-A 17,09 17,91 17,37 17,70 16,91 17,40 17,14 17,80 17,09 156,41 17,38 18,65
S 7-G 22,80 23,54 23,23 24,03 24,33 24,29 23,63 24,50 23,80 214,15 23,79
S 2-B 16,99 17,30 17,37 18,42 18,10 18,66 16,61 17,68 16,52 141,04 17,63 18,74
S 7-G 24,04 23,41 23,35 23,19 23,70 23,58 23,60 23,12 23,22 211,21 23,47
S 3-C 16,98 18,20 18,42 17,50 17,06 17,94 17,87 18,23 17,58 159,78 17,75 19,19
S 7-G 23,02 23,51 22,82 23,99 23,64 23,46 23,57 22,66 22,40 209,07 23,23
S 4-D 18,36 18,82 18,22 19,38 18,37 18,26 17,16 17,90 18,81 165,28 18,36 20,03
S 7-G 23,10 23,18 24,15 23,41 23,82 24,02 23,44 23,20 23,67 211,99 23,55
S 5-E 18,73 18,87 19,14 18,77 19,41 19,42 18,73 19,70 19,63 172,40 19,16 20,50
S 7-G 23,20 20,09 23,01 23,77 23,25 24,43 23,26 23,18 23,33 207,52 23,06
S 6-F 20,84 20,54 21,90 20,11 20,86 21,04 20,54 20,45 21,07 187,35 20,82 22,66
S 7-G 23,90 23,32 23,68 22,94 23,24 23,20 23,92 23,75 23,54 211,49 23,50
S 8-H 24,57 23,53 23,03 23,93 23,95 23,58 23,17 23,72 23,72 213,20 23,69 25,09
S 7-G 24,80 23,62 23,38 23,31 23,60 23,22 23,58 23,06 23,22 211,79 23,53
S 9-I 24,13 25,01 25,60 24,21 24,18 24,19 24,68 25,50 24,93 222,43 24,71 26,08
S 7-G 23,29 23,03 22,86 23,21 23,03 23,05 23,13 23,00 22,60 207,20 23,02
S 10-J 24,79 25,22 24,80 24,60 25,11 24,04 24,90 24,83 24,52 222,81 24,76 26,63
S 7-G 23,42 24.9024.9
CUR VA ES TAN D AR DAT O S EST AND AR 24
Puntos Diám etro Concentración Log (Conc.) P eso (m g) 17,0
(m m ) (m g/m l) Potencia (P) U I/m g 75,1
S1 18,65 0,05 -1,3010 F echa de V encim iento
S2 18,74 0,10 -1,0000 Lote N 1E 200
S3 19,19 0,15 -0,8239 DAT O S
S4 20,03 0,20 -0,6990 P endiente 0,1278 Pr T (X S 3 )es m ayor que Pr R= Sum a
S5 20,50 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322 Pr T (X S 3 )es m enor que Pr R= Resta
S6 22,66 0,51 -0,2924 F actor de Dilucion (D ) 1250
S7 23,42 1,02 0,0086 P rom edio G eneral
S8 25,09 1,53 0,1847 C oncentracion Central 24,90
S9 26,08 2,04 0,3096
S10 26,63 2,55 0,4065
88
• Análisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Metilen Disalicilato
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p>0.05 acepto la Ho
data: resultado$residuals
ANOVA
Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 1 observation deleted due to missingness
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con metilen (ANOVA de una via p<
0.05)
89
ANEXO 5 ESPECIFICIDAD BACITRACINA ZINC
EST ANDAR 1250 25 HC l 0,01N 1.0 U I / mL M UEST R A 217.2 mg 25 HC l 0,01N 1.0 U I/mL
1 50 BPH 6 1 50 BPH 6
M U ES TR A S DATO S ESTANDAR
M UESTR A P LAC EB O D ILUENTE Peso (m g) 17,0
Diám etro 25,08 0,00 0,00 Potencia (P) UI/m g 75,1
Concentración (U I/m l) 1,183 Fecha de vencim iento N.A.
Log (Concentración) 0,073 Lote N1E200
Cantidad Muestra (m g) 217,1 217,1 DATO S
g Bacitracina /100 g 6,8 --- --- Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
Factor de Dilución (D) 1250
Prom edio General Concentracion Central 24,90
RESULTADO
M1 M UEST R A 6,8 g / 100g
M2 PLAC EBO N O PRO DU C E H ALO
M3 DILUEN T E NO PR O D UC E H ALO Pr T (X S 3 )es m ayor que Pr R= Sum a
Pr T (X S 3 )es m enor que Pr R= Resta
90
ANEXO 6 ESPECIFICIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO
EST ANDAR 1250 25 H C l 0,01N 1.0 U I / m L M UEST R A 292 mg 25 H C l 0,01N 1.0 U I/mL
1 50 BPH 6 1 50 BPH 6
RESULTADO
M1 MU EST R A 5,0 g / 100g
M2 PLAC EBO N O PR O D U C E H ALO
M3 D ILU EN T E N O PR O D U C E H ALO Pr T (X S 3 )es m ayor que Pr R= Sum a
Pr T (X S 3 )es m enor que Pr R= Resta
91
ANEXO 7. SELECTIVIDAD BACITRACINA ZINC
BACTRAN 15%
SELECTIVID A D COND ICION ACID A
M uestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
92
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION BASICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
M UESTRA DEGRADACION
M1 ESTÁNDAR 99,9 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma
M2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S3)es menor que Pr R= Resta
M3 PLACEBO ----
93
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62
ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73
94
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66
ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97
95
ANEXO 8. SELECTIVIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO
EST ANDAR 1250 25 HC l 0,01N 1.0 U I / mL M UEST RA 292 mg 25 HC l 0,01N 1.0 U I/mL
1 50 BPH 6 1 50 BPH 6
M uestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Prom edio Prom edio corr
S3 22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
96
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION BASICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTÁNDAR 99,9 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma
M2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S3)es menor que Pr R= Resta
M3 PLACEBO ----
97
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62
ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73
98
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
M uestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66
ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97
99
ANEXO 9. PRECISIÓN DEL METODO BACITRACINA ZINC
IC = 24.886±4.303* 0.032/√3
Números de datos 3
100
DATOS DEL GRUPO 2 - PRECISION DIA 1 ANALISTA 2
%
Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm) Recuperación
1 1,0 24,82 105.12
IC = 24.887±4.303* 0.060/√3
Números de datos 3
101
DATOS DEL GRUPO 3 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 1
% Recuperación
Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm)
101.79
1 1,0 24.71
2 1,0 24.65 99.84
(0.243%) (1.767%)
IC = 24.711±4.303* 0.06/√3
IC = 101.6±4.303 *1.797/√3
Números de datos 3
102
DATOS DEL GRUPO 4 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
IC = 24.925±4.303* 1.410/√3
Números de datos 3
103
DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS
% Recuperación
Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm)
1 1,0 24.90 107.64
2 1,0 24.85 106.00
3 1,0 24.91 107.73
4 1,0 24,82 105.12
5 1,0 24.94 108.83
6 1,0 24.90 107.18
7 1,0 24.71 101.79
8 1,0 24.65 99.84
9 1,0 24.77 103.43
10 1,0 24.96 103.32
11 1,0 24.91 106.56
12 1,0 24.91 107.44
IC = 24.85±2.201* 0.097/√12
104
Números de datos 12
X= X ± t S/√n X= X ± t S/√n
Grados de libertad 11
105
BACTRAN 15%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 1
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,81 22,49 22,82 22,29 23,21 23,05 23,11 23,09 23,06 23,02
M1 23,05 23,36 22,89 22,86 23,10 23,21 22,98 23,01 23,09 23,02 24,90
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,03 24,01 23,27 23,49 23,31 24,76 23,19 23,59 23,83 23,61
M1 23,26 23,20 23,09 23,52 23,80 24,45 23,87 23,08 23,52 23,53 24,82
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 25,34 23,98 24,57 25,58 24,65 25,20 24,95 25,30 25,41 24,93
M1 24,65 23,83 24,51 24,86 23,63 24,13 25,68 25,24 25,00 24,74 24,71
108
BACTRAN 15%
PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 25,43 24,54 24,54 25,57 25,38 24,89 24,80 25,62 24,89 25,07
M1 25,18 24,20 25,42 25,73 25,11 25,63 25,01 25,58 24,35 25,13 24,96
109
ANEXO 10. PRECISIÓN DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
IC = 24.86±4.303* 0.024/√3
Números de datos 3
110
DATOS DEL GRUPO 2 - PRECISION DIA 1 ANALISTA 2
% Recuperación
Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm)
1 1,0 24,91 106.90
IC = 24.96±4.303* 0.049/√3
IC = 108.75 ± 4.303*1.638/√3
Números de datos 3
111
DATOS DEL GRUPO 3 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 1
% Recuperación
Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm)
107.64
1 1,0 24.92
2 1,0 24.93 108.0
IC = 24.935±4.303* 0.014/√3
Números de datos 3
112
DATOS DEL GRUPO 4 - PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
IC = 24.78±4.303* 0.115/√3
IC = 103.51 ± 4.303*3.542/√3
Números de datos 3
113
DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS
IC = 24.88±2.201* 0.089/√12
IC= 106.48±2.201*2.728/√12
Números de datos 12
114
%
# Diámetro Recuperación Sesgo (b)
1 24,86 105,704 5,704
2 24,96 108,775 8,775
3 24,94 107,947 7,947
4 24,786 103,512 3,512
Varianza 0,006 5,610
Media 24,886 Ř 106,485 6,485
Desviación estándar 0,078 2,369 2,369
Coeficiente de variación 0,003 0,022 0,365
% Coeficiente de
variación 0,315 2,224 36,526
t de Student
X= X ± t S/√n X= X ± t S/√n
Grados de libertad 11
115
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 1
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 24,13 24,99 24,78 24,63 24,69 25,09 25,20 24,53 24,59 24,81
M1 24,66 24,80 24,84 25,50 24,92 24,52 25,62 24,37 24,74 24,79 24,88
116
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 2
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 25,72 25,75 25,33 25,19 25,03 25,11 25,10 25,51 25,51 25,36
M1 25,82 25,60 25,27 25,04 25,46 24,54 25,41 25,69 25,49 25,37 24,91
117
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 2 ANALISTA 1
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,14 21,99 21,76 23,05 22,09 22,41 21,54 22,49 23,05 22,28
M1 22,67 22,17 21,84 21,93 22,07 23,20 22,76 22,20 21,89 22,30 24,92
118
BACTRAN 11%
PRECISION DIA 2 ANALISTA 2
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 21,25 23,45 23,20 23,51 23,70 23,30 23,21 23,60 22,48 23,08
M1 21,85 22,70 22,17 23,76 23,12 22,20 23,83 23,03 23,52 22,91 24,73
119
ANEXO11. PRECISION DEL SISTEMA
%
Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm) Recuperación
1 1.0 24.84 107.79
2 1.0 24.89 109.58
3 1.0 24.76 105.50
4 1.0 24.82 107.44
5 1.0 24.66 102.30
6 1.0 24.77 105.80
7 1.0 24.81 107.10
8 1.0 24.77 105.85
9 1.0 24.83 107.46
10 1.0 24.83 107.55
Media 24.798 106.641 Tendencia central
(0.251%) (1.817%)
IC = 24.798±2.262* 0.062/√10
Números de datos 10
120
ANEXO 12. EXACTITUD METODO BACITRACINA ZINC
2 2 2 2
Gexp = S max / S li +S t +S is
%
# recuperacion Sesgo (b)
1 100,230 -0,230
2 103,710 -3,710
3 85,690 14,310
4 111,790 -11,790
5 111,660 -11,660
6 100,450 -0,450
7 92,410 7,590
8 91,430 8,570
9 91,460 8,540
Promedio Ř 98,759 Б 1,241
Desvest 9,246
Media 98,759
CV 0,094
CV% 9,362
Variancia 85.485
e% 1,24
Valor de referencia 100,00
121
t de Student
# halos
1 23,766
2 23,878
3 23,231
4 24,893
5 24,888
6 24,530
7 24,862
8 24,830
9 24,830
Varianza 0,390
Media 24,412
IC 0,408
Desvest 0,625
n 9
CV 0,026
CV% 2,559
122
Area
Variance 0.390
Mean 24.41
Recovery
Variance 85.485
Degrees of freedom 8
123
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 80%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 173.8 mg 25 HCl 0,01N 0,8 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,36 24,41 23,29 23,34 23,03 23,23 23,30 23,10 23,24 23,37
M1 22,64 23,01 22,53 22,17 22,01 22,26 21,68 21,75 22,04 22,23 23,77
124
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 100%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.27 mg 25 HCl 0,01N 1,0 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,51 22,20 23,73 23,83 23,73 23,37 23,87 23,27 23,34 23,43
M1 22,12 23,36 24,10 23,56 23,82 23,34 23,76 23,45 23,28 23,42 24,89
125
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 120%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 260.73 mg 25 HCl 0,01N 1,2 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,44 23,60 23,67 23,46 23,53 23,01 23,96 23,88 23,95 23,61
M1 23,57 23,63 23,52 23,20 23,23 23,95 23,78 23,67 23,61 23,57 24,86
126
ANEXO 13. EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
127
t de Student
# halos
1 23,540
2 23,430
3 23,488
4 24,526
5 24,526
6 24,369
7 25,011
8 25,024
9 25,024
Variancia 0,456
Media 24,327
Desvest 0,675
n 9,000
CV 0,028
CV% 2,776
128
Area
Variance 0.479
Mean 24.32
Recovery
Variance 11.49
Degrees of freedom 8
129
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 80%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 222.7 mg 25 HCl 0,01N 0,8 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,91 23,21 23,62 22,90 23,47 23,11 23,09 23,63 22,80 23,09
M1 21,04 22,17 20,92 21,86 21,56 20,29 21,98 21,76 20,63 21,73 23,54
130
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 100%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 278.3 mg 25 HCl 0,01N 1,0 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 22,62 22,84 23,30 22,84 23,04 23,00 23,75 23,30 23,99 23,40
M1 23,06 23,10 23,42 23,19 23,11 22,90 23,39 22,80 23,00 23,02 24,53
131
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 120%
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 334.07 mg 25 HCl 0,01N 1,2 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,63 24,53 23,51 22,65 23,53 23,63 24,04 24,64 24,04 23,80
M1 24,05 24,55 23,75 23,88 23,87 24,56 23,62 23,19 23,73 23,91 25,01
132
ANEXO 14. LIMITE DE CUANTIFICACION
Concentración % recuperación
# (UI/ml) Diámetro (mm)
1 0,02 17,82 669.00
2 0,02 17,55 616.90
3 0,02 17,57 620.60
4 0,02 17,55 617.30
5 0,02 17,15 548.20
6 0,02 17,40 591.30
Varianza 0.050 1572.275
Expresa la
variabilidad del
Desviación Estándar 0.223 39.65 método
Expresa la
variabilidad del
Desviación estándar de la media 0.100 ---------- método
Números de datos 6
Grados de libertad 5
133
BACITRACINA
LIMITE DE CUANTIFICACION
LOTE N1E200
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL
1 50 BPH6 1 100 BPH6
2 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,27 23,15 24,00 23,41 23,52 23,24 23,42 23,38 24,07 23,50
M1 16,63 17,67 16,61 16,34 16,66 16,31 15,66 16,60 15,30 16,42 17,82
134
BACITRACINA
LIMITE DE CUANTIFICACION
LOTE N1E200
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL
1 50 BPH6 1 100 BPH6
2 50 BPH6
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,36 22,69 23,36 24,12 23,73 23,77 23,60 23,27 23,52 23,49
M1 16,33 15,74 15,80 15,65 15,90 16,00 16,16 16,89 16,81 16,14 17,55
135
ANEXO 15. LIMITE DE DETECCIÓN
ACTIVO Bacitracina Zinc BACITRACINA
Lote M1E200
50 50 50 50 BPH6
0,005 0,01 0,015 0,025 UI/ml
Muestras
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S3 23,65 24,46 23,70 24,16 23,59 25,17 24,43 23,94 23,30 24,04
0,005 UI/ml --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
136