MINISTERIO DE EDUCACION NACIONAL

UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA
Nit. 891.190.346-1

GUIA PRÁCTICA N.

“xxx”

NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES Y

FECALES
PRUEBA PRESUNTIVA Y CONFIRMATIVA

OBJETIVO

Objetivos específicos

La obtención de microorganimso coliformes totales se fundamenta en

la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con
producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C +/- 1°C durante 48
horas, usando un medio que contenga sales biliares.

Fase Presuntiva. El medio de cultivo que se utiliza en algunas

ocasiones el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la
recuperación de microorganismo que sean capaces de utilizar la
lactosa como fuente de carbono.

Fase Confirmatoria. Se emplea como medio de cultivo el caldo

lactosado bilis verde brillante, selectivo y solo permite el desarrollo de
aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares
como el verde brillante.
MUESTRA: Aguas residuales o un alimento sin cocción de venta
callejera. Buscar una tabla para Número más probable

Está conformado por cuatro géneros principales: Enterobacter,

Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

PROCEDMIENTO PRUEBA PRESUNTIVA

PREPARAR EL ÁREA DE TRABAJO

1. Preparación del medio de cultivo

Tome un frasco de caldo Brilla o caldo lactosado bilis verde brillante;
lea las instrucciones de preparación y calcule la cantidad en gramos
necesaria para preparar 90 ml de caldo.
Pese la cantidad de reactivo necesaria y dilúyalo con agua destilada.
Pipetee 10 ml de caldo en tubo tapa rosca con campana de Durham.
Coloque los tubos en una gradilla y esterilize en autoclave por 15
minutos.
Laboratorio de Biotecnología y control de calidad microbiológico
Email: gbiotecnologiaccm@gmail.com Tel: 3002821190
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Deje enfriar y verifique que no haya burbujas de gas en las

campanas.

2. Preparación de la muestra

Prepare la dilución 10-1:

Muestra sólida: Tome 10g de la muestra y macere hasta que sea

posible diluir, Agregue la muestra macerada en 90ml de agua
peptonada al 0,1%. Homogenice

Muestra líquida: Destape cuidadosamente el empaque del alimento,

Con la ayuda de una pipeta estéril y un pipeteador, tome 10ml de la
muestra. Agregue la muestra a 90ml de agua peptonada al 0,1%.
Homogenice

Prepare la dilución 10-2. Use una pipeta estéril de 1ml y tome 1 ml de

la dilución 10-1 y agréguelo a un tubo con 9ml de agua peptona al
0,1%. Homogenice

3. Siembra

Pipetee 1ml de cada una de las diluciones en tres tubos con 10 ml

de caldo Brilla marcado con el número de la dilución

9 tubos en total, 3 de cada dilución

4. Incubación

Incubar a 35°C +/- 2 por 24-48 horas

Revisar los tubos a las 24 horas, si hay formación de gas. Realizar

prueba confirmativa, si no hay formación de gas, continuar la
incubación hasta las 48 horas.

Realizar prueba confirmativa a los tubos que presenten turbidez y/o

formación de gas
Realizar informe de acuerdo a la tabla de NMP

PROCEDIMIENTO PRUEBA CONFIRMATIVA

Con un asa redonda, tomar una asada de los tubos positivos y

sembrar por aislamiento en una caja de Petri con Agar EMB (Eosina
Metil Blue ) o VRB ( Rojo Neutro, Bilis, Agar).
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Incubar las cajas invertidas a 35°C +/- 2°C por 24 horas

Leer las colonias compatibles con coliformes (Revisar bibliografía)

Anotar el número de tubos confirmado como positivo

Para calcular el NMP de organismos coliformes por gramo o mililitro

utilizar la tabla

COLIFORMES FECALES

A partir de los tubos positivos realice la prueba de Mac – kenzie, siga

este procedimiento.

Siembre una asada en un tubo con caldo Brilla y campana de Durham

y en un tubo con caldo triptófano.

Incubar por 48 horas.

Lectura e interpretación de resultados. Evalúe la producción de

gas en la campana de Durham y en el caldo triptófano, agregue unas
gotas de reactivo de Kovacs para evaluar la producción de indol. Se
consideran coliformes fecales si hay producción de gas e indol.
Calcule el NMP de acuerdo a la tabla

PREGUNTAS
1. ¿Cuál es el fundamento bioquímico de la prueba de triptófano?
2. ¿Cuáles son los componentes de los medios EMB y VRB y cuál
es la función de cada uno de ellos?
3. Cuál es la diferencia entre coliformes totales y fecales?
ANEXAR LA TABLA DE MC CRADY
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Castillo Jorge – Aspectos estadísticos del análisis microbiológico
www.u-cursos.cl/ingenieria/2004/2

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