DISCUSIÓN DE RESULTADOS

“EXTRACCIÓN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTEÍNAS EN MACHA”

Durante la práctica se realizaron dos extracciones proteicas: el extracto salino y

el extracto acuoso para analizar cualitativamente la presencia de algún tipo de
proteína en Macha. Para este fin, se llevaron a cabo como soluciones patrón
que sirvieron para comparar los resultados de los extractos en Macha y
dictaminar si había o no proteínas contenidas en ésta. Además se realizó
también la prueba de Biuret para tener un patrón más específico de los
resultados que se esperaban obtener.
La Macha da principalmente fuentes de proteínas (20 al 40%) de bajo costo en
la dieta del hombre. Tal como lo cita el párrafo anterior, se comprobó que en
efecto la Macha contiene un buen porcentaje de proteínas puesto que al
realizar la prueba de Precipitación con Metales pesados así como la prueba de
Biuret, tanto para el extracto salino como para el extracto acuoso las pruebas
fueron positivas, evidenciadas en los diferentes precipitados y coloración de las
muestras al agregarles los reactivos; tal como se muestra en los anexos, así
como también se especifican en la tabla de los resultados.
Es sabido que ciertos factores como el tamaño de partícula de la macha, la
fuerza de agitación, la relación harina-disolvente, el número de extracciones
por etapa, así como el estado fisiológico de la semilla, influyen en la proporción
de las diferentes fracciones proteicas. Esos factores, influyeron en la
recuperación total de la proteína pues en el caso de la prueba de Biuret el color
de las soluciones no fue tan marcado como en las soluciones patrón con las
que se comparó.
Sin embargo, de manera general podemos afirmar que el proceso cumplió con
lo que se quería, desnaturalizar las proteínas para su posterior cualificación. Y
es que es por la desnaturalización de las proteínas que se logra apreciar, por
ejemplo, los precipitados con los metales o la formación de los complejos y
coloides ya que, cuando se desnaturaliza la proteína el disolvente disminuyen
su estabilidad en disolución provocando la precipitación. Así, la desaparición
total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas
o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitan la agregación intermolecular y
terminan precipitándola.
La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína; como lo son,
Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la
viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión. También una drástica
disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior
aparecen en la superficie. Y por último la pérdida de las propiedades
biológicas.
“ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS EN MACHA”

Para poder realizar la identificación de aminoácidos en las soluciones de

extracto de proteínas primero se realizó la hidrólisis salina y acuosa, en medios
ácido y básico. Esto con el fin de que por medio de la presión y alta
temperatura se lograra la ruptura de los enlaces peptídico existente entre los
aminoácidos de las proteínas. Ya que con ese propósito se realiza el proceso
de hidrólisis, puesto que es un proceso de rompimiento del enlace peptídico
con lo que se producen aminoácidos libres.
Al realizar las diferentes pruebas con los reactivos indicados, se obtuvieron
soluciones patrones positivas, como era de esperarse. Así como se observa en
la tabla No.1; la Ninhidrina al reaccionar con lisina, triptófano, tirosina, leucina,
histidina y cisteína todas presentaron una coloración amarillenta.
No todas las proteínas reaccionaron con igual intensidad, seguramente la
diferencia de concentración colorimétrica ha debido ser por la cantidad de
aminoácidos presente en cada muestra analizada, es de esperar que no todas
las proteínas contengan el mismo porcentaje de enlaces peptídico en su
estructura, y por ende, la cantidad que reacciona es menor lo cual se refleja de
forma cualitativa en la reacción llevada cabo.
Con la prueba Xantoproteica tanto el triptófano como la tirosina dieron el color
naranja-amarillo esperado y dado que la tonalidad de los colores era bastante
intensa podemos decir que en solución había una gran cantidad de
aminoácidos disueltos y por ende, cabría decir que estos aminoácidos
contienen grupos nitro aromático. El color amarillo-naranja que se apreció
confirma que en esa muestra hay aminoácidos que contienen anillos en su
estructura y que al reaccionar formaron algún compuesto nitrado dada la
influencia de reactividad del ácido nítrico que se utilizó. De hecho, de los veinte
aminoácidos esenciales únicamente la Fenilalamina, el triptófano y la tirosina
contiene anillos bencénicos en su estructura por lo que es permitido decir que
en esas muestras había tales aminoácidos presentes. “Esta prueba sirve para
caracterizar aminoácidos bencénicos. En esta prueba se produce la nitración
del anillo bencénico presente en los aminoácidos de tirosina y triptófano,
obteniéndose nitro compuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjados
en medio fuertemente alcalino.
Con el reactivo millón la tirosina dio resultado positivo, comprobado en el
compuesto rojizo que se formó luego de la reacción; además de ello, la prueba
de millón también se hizo con la histidina la cual resultó ser negativa, como era
de esperarse ya que esta proteína no contiene radicales hidroxibenceno en su
estructura molecular. Al calentar la solución se obtuvo un cambio en la
coloración rojo ladrillo ya que las sustancias se disolvieron dejando como
resultado prueba positiva para reacción de aminoácidos.
La prueba de bromo, que se realizó con la histidina y cisteína, no formó el
producto azul-violeta que se esperaba; sin embargo, no se descarta el
contenido de aminoácidos que posiblemente la pureza de los reactivos haya
afectado el proceso y por lo mismo no se logró la ruptura de los grupos
imidazol que se supone contiene la histidina; tampoco se descarta la presencia
de otros aminoácidos pues de la reacción del reactivo de millón con la histidina
se obtuvo un producto color naranjizo Para completar el análisis de las pruebas
patrón, se hizo la prueba de sulfuro con el triptófano, cuya formación grisácea
de su producto indica un resultado positivo.
Ahora bien respecto a las pruebas realizadas a los hidrolizados acuosos y
salinos, los resultados obtenidos que indican en la tabla. En donde se observa
que todas las muestras de los hidrolizados contenían cierto porcentaje de
aminoácidos, aunque muy bajo. La diferencia de la coloración en comparación
con los patrones seguramente radica en la cantidad de aminoácidos que
contiene cada muestra pues como se dijo en la discusión anterior, a mayor
contenido proteico, mayor es la cantidad de aminoácidos y por ende mayor
concentración productos.
Al realizar la prueba con Ninhidrina a los hidrolizados ácidos y básicos los
resultados sugerían prueba positiva pues las soluciones se tornaron de color
amarillo y rosa un poco pálidos en realidad, quizá por falta de energía térmica
la reacción no se efectuó a cabalidad o puede ser también que esta reacción
sea lenta y haya necesitado más tiempo para que se dé una reacción con
mayor porcentaje de rendimiento. El que se haya presentado un cambio en el
color nos da la pauta a pensar que en el hidrolizado había seguramente
presencia de α-aminoácidos y con pH bajos. De hecho, todas las proteínas
tienen por lo menos un α-aminoácido en su estructura.
Segun Wharton (1978): “La Ninhidrina es un poderoso agente reactivo común
para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o
electroforesis. Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra
entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Esta
reacción sirve para detectar aminoácidos en varios sustratos. Tiene como
objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los
aminoácidos, en general reaccionan con la Ninhidrina cuando son calentados
con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo
amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído
que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original.
“ESTUDIO DE AMINOÁCIDOS, CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS Y
ESPECTOFOTOMETRIA ”
Con los datos obtenidos se puede decir que los aminoácidos que reaccionaron
con la ninhidrina fueron la glicina y la prolina.
Tras colocar la placa de sílica gel en la fase móvil y dejarse en reposo por
varias minutos, observamos que la fase móvil se desplazó verticalmente a
través de la placa de sílica gel (debido al proceso de capilaridad, el mismo que
usan las plantas para transportar agua). Después de haberse secado el eluente
de la placa, se roció con ninhidrina y se calentó, al hacer esto se formaron
manchas de colores en la placa correspondientes a los diferentes aminoácidos
que fueron arrastrados por el eluente, esta adquisición de color se explica
mediante la siguiente reacción química.
Como se observa en los resultados, los aminoácidos aparecen como manchas
púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que
no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de
color amarillo obscuro.
En la solución se encuentran cuatro diferentes aminoácidos correspondientes a
la prolina, la metionina y la fenilalanina; esto lo pudimos comprobar
comparando los cuatro diferentes recorridos con los demás aminoácidos y
observando que realizaban recorridos de longitudes similares a los de otros
aminoácidos, así es como constatamos que el “aminoácido 1” se desplazaba
igual distancia que la prolina, lo que significaba que las dos eran las mismas
sustancias, lo mismo pasó con el “aminoácido 2” que se desplazaba igual
distancia que la metionina y el “aminoácido 3” se desplazaba la misma
distancia que la fenilalanina.
En lo que respecta a los aminoácidos puros, su comportamiento lo podemos
explicar a partir de las características de su radical, pues como vemos en la
tabla de resultados, los aminoácidos con radicales sin cargas se movieron más
a través de la placa de sílica gel, esto es debido a que la fase móvil era de
carácter apolar, por lo que estos aminoácidos eran arrastrados por esta en su
paso a través de la placa; por otro lado, los aminoácidos que menor
desplazamiento mostraron eran predominantemente polares, por lo que no
eran fácilmente disueltos por la fase móvil y como consecuencia de ello su
desplazamiento fue menor.