ANTEPROYECTO DE

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC DE 081/03 (DE 677/02)

Grupo de trabajo del 22 abril

Revisón 6 de mayo -

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y ALIMENTO PARA ANIMALES

METODO HORIZONTAL DE TÈCNICAS DE MUESTREO DE SUPERFICIES
USANDO CAJAS DE CONTACTO Y METODO DE ESCOBILLÒN

0. INTRODUCCIÒN

Esta norma especifica un método horizontal para la determinación del número de

microorganismos viables en las superficies de utensilios, superficies de trabajo y otros equipos
en contacto con alimentos para conocer el nivel de contaminación durante la producción o la
efectividad de los protocolos efectivos de limpieza y desinfección.

Este método horizontal describe ambos, el método de contacto de superficies usando contacto
con caja o el método de láminas de inmersión o de escobillón o enjuague. El método de
contacto de cajas es solo aplicable a superficies planas, mientras que el método de escobillón
(humedo y seco) puede ser usado para cualquier tipo de superficies. Para una muestra de
superficies extensas largas (> 100 cm2) paños o esponjas ) pueden ser utilizadas paños o
esponjas. Los métodos alternativos prescritos en este estándar son métodos útiles para la
estimación de la carga microbiana de las superficies.

Los resultados son muchas veces presentados como puntajes de calificación de higiene,
basados en el número de UFC ( Unidad Formadora de Colonias) x cm2 presentado en un test
de superficies.

1. OBJETO

Esta norma específica un método horizontal para la enumeración de microorganismos viables

en superficies con contacto de placas, láminas de inmersión y escobillones (trapo o esponja).

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de esta norma.
Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no
fechadas, se aplica l última edición del documento referenciado (incluida cualquier corrección) .

NTC 4092: (ISO 7218:1996), Microbiología de Alimentos y de Alimentos para Animales.

Reglas Generales para el Análisis Microbiológico.

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ISO 4832:1991, Microbiology -- General guidance for the enumeration of coliforms - Colony
count technique

ISO 4833 : 1991, Microbiology -- General guidance for the enumeration of micro-organisms --
Colony count technique at 30 °C

ISO 6887-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs- Preparation of test samples,
initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination.

ISO 6888-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) --
Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium

ISO 6888-2: 1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) --
Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium

ISO 7402 Microbiology -- General guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae without
resuscitation -- MPN technique and colony-count technique

ISO 7218: 1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- General rules for
microbiological examinations

ISO 7954:1987, Microbiology -- General guidance for enumeration of yeasts and moulds --
Colony count technique at 25 °C

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES

3.1
cajas de contacto
cajas plásticas servidas con un volumen de agar controlado especialmente elaborados para
muestras de superficies, las cajas varían en diámetro acorde al producto.

3.2
láminas de inmersión
láminas sintéticas, uno o ambos lados (7 cm2 x 10 cm2 ) cubiertas con una capa de un medio de
crecimiento sólido. Varios medios de crecimiento están disponibles acorde al microorganismo
buscado.

3.3
escobillón
barra delgada (estéril) con algodón o material sintético (alginato), escobillón contenido en un
tubo o envuelto.

3.4
tela o paño
húmedo, es de material estéril entretejido, libre se sustancias antimicrobianas, empacado
individualmente en bolsas plásticas estériles, usado para toma de muestras de superficies
largas (> 100 cm2).

3.5
esponja

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húmeda, cuadro estéril de esponja plana, libre de sustancias antimicrobianas, también

empacado individualmente en bolsa plástica estéril, usado para toma de muestras de
superficies largas (> 100 cm2).

4. PRINCIPIO

4.1 Para obtener un estimativo de contaminación microbiana de una superficie usando

cajas de contacto o método de escobillón se requiere seguir los siguientes pasos:

4.2 Una caja de contacto (o lámina de inmersión) con el medio agar apropiado, es
presionado contra la superficie a analizar. Después de la incubación una estimación de
contaminación de la superficie puede ser obtenida por el conteo del número de colonias
desarrolladas. Debido a que estos métodos no son cuantitativamente dignos de confianza o de
resultados reproducibles, podrían solo ser usados en un análisis de tendencia.

4.3 Usando el método del escobillón para examinar un área específica marcada de
superficie (por ejemplo usando una plantilla) y después de frotar para tomar la muestra. Las
barras de los escobillones se rompen dentro de un tubo o botella que contiene un fluido en
dilución estéril o líquido neutralizante y luego se mezcla manualmente.

Si la superficie es enjuagada con un paño o esponja estéril, el dispositivo de muestreo es

almacenado en un líquido de volumen de dilución conocida, (100 ml x 100 cm2).

En el laboratorio, se utiliza la suspensión inicial y si es necesario, diluciones decimales (1ml,

5ml y 10 ml de diluyente), para determinar el número de microorganismos, usando los
procedimientos descritos en los métodos para la enumeración de (grupos) microorganismos a
ser investigados.

4.4 El tiempo y temperatura de incubación depende del tipo de microorganismo a ser

detectado.

4.5 Para medios selectivos, se pueden realizar las pruebas de confirmación apropiadas. El
número de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) de un microorganismo específico por cm 2 o
por objeto, es calculado del número de colonias (confirmadas).

Nota : Estos métodos no son cuantitativamente confiables o reproducibles y sus resultados solo pueden ser usados
en n análisis de tendencias

4.6 Luego de tomar la muestra de la superficie, puede hacerse la limpieza y desinfección

para prevenir el aumento de la contaminación cómo resultado del procedimiento de muestreo.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y LIQUIDOS DE DILUCIÓN

5.1 Agar Plate Count, ISO 4833 y si es requerido.

5.2 Agar Rojo Violeta Bilis Dextrosa, ISO 7402 y si es requerido.

5.3 Agar Rojo Bilis Violeta, ISO 4832 y si es requerido.

5.4 Agar Oxitetraciclina Huevo Glucosa (OGY), ISO 7954 y si es requerido.

5.5 Agar Baird Parker, ISO 6888-1 y 6888-2.

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O cualquier otro medio de cultivo conocido para enumeración o enriquecimiento de (grupos) microorganismos.

5.6 Líquidos de dilución, ISO 6887-1

5.7 Líquidos neutralizantes, véase punto 7.

6. APARATOS Y CRISTALERIA

6.1 Para los requerimientos generales. Véase ISO 7218

Aparatos disponibles son una alternativa aceptable a cristalería reutilizable si este tiene
especificaciones similares. Los aparatos usuales del laboratorio de microbiología y, en
particular, los siguientes:

6.2 Aparatos para esterilización en seco (horno) o esterilización húmeda (autoclave)

Véase ISO 7218.

6.3 Incubadoras, capaces de operar en la temperatura de incubación para los (grupos de)
microorganismos a ser investigados (25 ° C ± 1 ° C, 30 ° C ± 1 ° C, 37 ° C ± 1° C).

6.4 Baños de agua, o aparatos similares, una capacidad de operar entre 44 ° C a 47 ° C y

otro capaz de hervir agua.

6.5 Ph -metro, capaz de ser leído a la unidad cerca de 0,01 pH a 25 ° C ± 1 ° C,

posibilitando la medición a ser hecha, la cual es precisa a ± 0,1 unidad pH.

6.6 Stomacher o Pulsifier, usando bolsas plásticas estériles para preparar las
suspensiones iniciales por movimiento peristáltico ( Stomacher) o vibración (Pulsifier).

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6.7 Mezclador vortex, para mezclar líquidos en tubos de cultivo.

6.8 Pipetas graduadas, con amplia capacidad de abertura y una capacidad nominal de 1 ml,
graduadas en divisiones de 0,1 ml, o pipetas automáticas de 100 µl o 1 000 µl.

6.9 Contenedores, como botellas, tubos, frascos, disponible para esterilización y

almacenamiento de medios de cultivo.

6.10 Cajas de petri, elaboradas en plástico de 90 mm a 100 mm.

6.11 Láminas de inmersión, cubiertas con medio ya descrito (numerales 5.1 a 5.5).

6.12 Cajas de contacto, de plástico y con medio ya descrito (numerales 5.1 a 5.5).

6.13 Escobillones, paños o esponjas, individualmente envueltas y estériles.

6.14 Plantilla, con material resistente a corrosión (por ejemplo un marco en acero
inoxidable de 20 cm 2 a 100 cm2), las cuales son fáciles de limpiar y pueden esterilizarse.

6.15 Nevera o caja con aislamiento, capaz de mantener las muestras entre 1 ° C y 4 ° C
durante el transporte al laboratorio.

7. MUESTREO

7.1 GENERAL

Es importante que le laboratorio reciba una muestra representativa de la superficie a analizar y

que esta muestra no haya sido cambiada por residuos de desinfectantes o durante el
transporte o almacenamiento.

Los desinfectantes son generalmente formulados para una desinfección en un tiempo de

contacto de 5 min a 15 min, esperar 15 min antes de investigar la superficie con escobillón o
cajas de contacto, para avaluar el desempeño del programa de limpieza y desinfección (o de
otro modo, acorde a las especificaciones del desinfectante).

En todos los casos donde se esperan residuos de desinfectantes, pueden añadirse

neutralizantes apropiados al líquido de dilución y al medio usado en las cajas de contacto, para
prevenir cualquier efecto inhibitorio del desinfectante en el crecimiento del microorganismo.

Un neutralizante apropiado para toda situación puede no ser descrito. Generalmente, el Tween 80
(30 g/l) y la Lecitina (3g/l) son usados para neutralizar residuos de desinfectantes absorbidos
(componentes de amonio cuaternario, anfotericidas).

El tiosulfato de sodio (5 g/l) es un buen neutralizante de productos con base halógena. En el

caso del peróxido usado en desinfectantes, la catalasa o peroxidasa pueden ser usados como
neutralizantes. Una unidad de estas enzimas cataliza la descomposición de 1 µmol de peróxido
de hidrogeno por un minuto a 25 ° C y a un pH de 7.

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La fórmula para neutralizantes universal es:

Tween 80 (Polisorbato 80) 30 g/l

Lecitina 3 g/l
Tiosulfato de sodio 5 g/l
L-histidina 1 g/l
Saponina 30 g/l

Preparar en líquido de dilución ( peptona 1g/l, NaCl 8,5 g/l), distribuir en tubos o botellas y
esterilizar 15 minutos a 121 ° C.

7.2 MÉTODO DE CAJA DE CONTACTO

Después de remover de los contenedores de transporte, presionar la superficie del agar de la

caja de contacto o de la lámina firmemente y sin cualquier movimiento lateral contra la
superficie analizada. La literatura dice que resultados óptimos de las cajas de contacto son
obtenidos con un tiempo de contacto de 10 s y una presión de 500 g. (para cajas RODAC de
un diámetro de 55 mm tienen un aplicador comercialmente disponible). Cerrar la caja de
contacto o láminas inmediatamente después de la inoculación y poner en el contenedor de
transporte.

7.3 MÉTODO DE ESCOBILLÓN

Remover un escobillón de la envoltura y humedecer la punta por inmersión en el tubo que

contiene el líquido de dilución. Presionar la punta del escobillón contra la pared del tubo para
remover el exceso de agua. Ubicar la punta del escobillón en la superficie para ser investigada
y una línea del área estimada de 20 cm 2 a 100 cm2, mientras que se rota el escobillón entre el
pulgar y el dedo índice en dos direcciones en sentido derecho uno al otro.

Poner el escobillón en el tubo con el líquido de dilución y romper o cortar el límite indicado del
palo de madera asépticamente. En caso de paños o esponjas, abrir el paquete plástico que
contiene la esponja o paño.

Remover el paño o esponja con pinzas estériles o guantes estériles y enjuagar como se
describió antes. Devolver al paquete plástico y cerrar de manera que quede sin agujeros.

Otra alternativa es abrir el paquete que contiene la esponja o paño; apretar la esponja o paño a
través de la bolsa sobre la mano. Use la esponja para recoger la muestra y transferir al paño o
esponja en una bolsa plástica estéril, cerrar la bolsa de manera que no queden agujeros.

Frotis con siembra directa

Utilizar aplicadores o hisopos de algodón estériles para realizar el frotis o toma de muestra en
la superficie. [2]

Una vez tomada la muestra, sembrar con el hisopo o aplicador en la superficie del agar, según
el tipo de microorganismo o analito objetivo de la búsqueda.

Para el transporte de los aplicadores es importante tener en cuenta el numeral 8.

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8. TRANSPORTE

La siembra El transporte de las muestras obtenidas por el método de escobillón debe realizarse
preferiblemente dentro de las con 4 h siguientes a la toma de muestra.

Se debe igualmente transportar en una caja o nevera de icopor a una temperatura entre de 1 °
C a 4 ° C. Examinar en el laboratorio tan pronto como sea posible y no después de 24 h.

El transporte de cajas de contacto y/o láminas preferiblemente con 4 h en una vía donde no
ocurra contaminación.

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9. PROCEDIMIENTO

9.1 MÉTODO DE CAJA DE CONTACTO

Incubar las placas o láminas de acuerdo al tipo de microorganismo a ser detectado.

9.2 MÉTODO DE ESCOBILLÓN (INCLUYENDO ESPONJA O PAÑO)

Mezclar el contenido del tubo que tiene los escobillones en el mezclador vortex por 30 s,
ajustando la velocidad para que la pared del tubo quede humedecida arriba a una altura de 2
cm a 3 cm debajo de la tapa.

Esto representa la suspensión inicial.

Añadir a la bolsa plástica que contienen los paños o esponjas, una cantidad de líquido de
dilución o líquido neutralizante, dependiendo del tamaño del área a investigar (100 ml x 100 cm2).
Después de esto, tratar al contenido de la bolsa en un stomacher por 1 min o pulsifier por 30 s,
esto representa la suspensión inicial.

Si se presume de números altos elevados de microorganismos son esperados, ppreparar otras

diluciones decimales en diluyente agua peptonada para obtener un número de colonias
contables.

De acuerdo a la enumeración de métodos utilizados (ver normas ISO apropiadas), inocular por
duplicado en las cajas con medio la dilución inicial, usando un 1 ml de inoculo para servir las
cajas y 0,1 ml de inoculo para técnicas de difusión. Tratar cualquiera de las otras diluciones de
la misma manera; Invertir las cajas e incubarlas a una temperatura y tiempo adecuado para
cada medio.

Otro método utilizado puede ser el método de Goteo (DIN 10113-2). Comenzando con la
dilución más alta, usar pipetas estériles para transferir alicuotas de 0,05 ml de la suspensión
inicial (escobillones, esponjas o paños) y de las otras diluciones a sectores apropiados del
medio de cultivo marcado en el centro de la placa de agar ( por duplicado, usando las mismas
diluciones pero en diferente placa de agar) cada pre-secado de la placa de agar puede ser
usado por goteo de no más de 6 diluciones diferentes. Cuando el goteo es aplicado, es
conveniente tocar la punta de la pipeta en la superficie del agar en orden de transferencia de
una cantidad completa de la dilución al medio de cultivo. Guardar las placas de agar
horizontalmente (tapa arriba) bajo una superficie húmeda.

Si el método de escobillón es usado para demostrar la presencia de microorganismos

específicos (Lysteria monocytogenes o Salmonella spp), el área investigada podría ser
preferiblemente de no menos de 1 000 cm2. Transferir el escobillón, paño o esponja a un medio
de enriquecimiento y mezclar bien.

9.3 SELECCIÓN Y CONTEO DE COLONIAS

9.3.1 Método de placa de contacto

Contar el número de (específico) colonias en las placas de contacto o láminas directamente

después del periodo de incubación especificado y confirmar este, si es necesario, acorde a el
microorganismo(s).

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9.3.2 Método de escobillón (esponja o paño)

Contar las colonias de cada caja y confirmar si es necesario, acorde al microorganismo(s).

9.3.3 Método de goteo en placa

Contar el número de colonias (blanco) a las diluciones producidas de 5 colonias a 50 colonias.

9.3.4 En el caso de procedimientos de enriquecimiento, seguir las instrucciones después de

pre- enriquecimiento acorde al microorganismo(s).

10. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

10.1 MÉTODO DE CAJA DE CONTACTO

Dividir el número de (blanco) colonias por el área de la superficie de la placa, Reportar el

recuento como UFC x cm2 de superficie.

10.2 MÉTODO DE ESCOBILLÓN (ESPONJA O PAÑO)

10.2.1 Calcular el número de UFC x ml de suspensión inicial, como se describe en ISO

estándar. (Véase punto 5).

10.2.2 Calcular el número de UFC por cm2 de superficie investigada con la fórmula:

N x F
x D
A

en donde

N es el número de UFC en 1 ml de líquido de dilución (líquido de inactivación)

F es la suma (ml) de líquido de dilución (liquido de inactivación) en el tubo o bolsa.

A es la superficie investigada (cm2)

D es el reciproco de la dilución usada.

10.2.3 Para el método de goteo, calcular el número de N de UFC/ml del líquido de suspensión
usando la fórmula.

N 
C
V  n1  0,1 x n2  d

en donde

C es la suma de colonias contadas en todas las gotas retenidas de dos diluciones

sucesivas de 1 de la menor que contenga cinco colonias.

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V volumen de inoculo aplicado en cada gota ( en este caso 50 µl).

n1 número de gotas retenidas en la primera dilución.

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n2 número de gotas retenidas en la segunda dilución.

d factor de dilución correspondiente a la primera dilución.

Para obtener el conteo/cm2 de superficie, usar la fórmula:

N x F
A

en donde

F es el volumen del líquido de dilución ( o líquido neutralizante) en el tubo o bolsa.

A es el área de muestreo / cm2

10.2.4 Si el área analizada no es definida, usar la fórmula N x F x D para calcular el número de

UFC / escobillón.

Cuando los métodos semicuantitativos son usados, el resultado obtenido en UFC/cm 2 de

superficie puede ser llamado también número higiénico. Estos pueden variar dependiendo de
las superficies examinadas es recomendable que estos sean designados y agregados entre las
partes interesadas.

10.2.5 En el caso de procedimientos de enriquecimiento, reportar el organismo blanco tanto

detectado como no detectado en el área muestreada.

Expresión de resultados para el método de Frotis con siembra directa

Se reporta como ausencia / presencia del microorganismo patógeno objeto de la búsqueda por
elemento evaluado (ejemplo cuchara, cuchillo, etc) o área de la superficie evaluada.

Cuando se presume de recuentos inferiores a 10 UFC para los casos de aislamiento de

microorganismos mesófilos ,coliformes totales , mohos y levaduras, se debe reportar las
unidades encontradas por elemento o área de la superficie evaluada.

Si el objeto de la búsqueda lo requiere posteriormente realizar la identificación correspondiente.

BIBLIOGRAFÍA

[1] EN 1276, Chemical desinfectans and antiseptics- Quantitatice suspensión tests for rhe
evaluation of bactericidal activity of chemical desinfectants and antiseptics used in the food,
industrial, domestic and institutional areas- test methods and requirements phase 2, step 1.

[2] Manual operativo de análisis microbiológicos para limentos , Cortes Luna Gilma Janeth
M.Sc. Laboratorio de Control de Calidad de Alimentos, edición 91 pag 124 y 125.

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DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONA ORGANIZATION FOR STANDARIZATION. Microbiology of food and Animal

feeding stuffs- horizontal method for sampling techniques from surfaces using contact plates
and swab methods. Geneve: ISO, 2002 8 p, (ISO/DIS 18593).

Preparado por:________________________________
GLORIA ISABEL OSPINA C.

Revisado por: _________________________________

grr.

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