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PROYECTO DE NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

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MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y
DILUCIONES DECIMALES PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.

PARTE 3

REGLAS ESPECÍFICAS PARA LA PREPARACIÓN DE PESCADO Y PRODUCTOS


DE LA PESCA

CONTENIDO

Introducción
1 Objeto y campo de aplicación
2 Referencias normativas
3 Definiciones
4 Principio
5 Diluyentes
6 Aparatos
7 Preparación de muestras
8 Procedimientos generales
9 Procedimientos específicos
10 Diluciones decimales adicionales

INTRODUCCIÓN

La norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la preparación de la suspensión
inicial y de las diluciones decimales para el análisis microbiológico.

Debido a la diversidad de los productos alimenticios para los cuales aplica esta norma,
ISO/TC 34/SC 9 ha decidido dividirla en cuatro partes. La tercera parte comprende la
preparación específica de muestras de pescado y productos de la pesca y sus
suspensiones para el análisis microbiológico, cuando requieren una preparación
diferente al método descrito en la primera parte.

La parte actual de la norma ISO 6887 proporciona directrices para hacer diluciones.
Especifica las precauciones útiles con relación al medio de cultivo en varios casos
particulares.

IMPORTANTE: La leche y los productos lácteos se tratan en la norma ISO 8261,


elaborada por ISO/TC 34 SC5.

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma sólo describe métodos de preparación que son aplicables a varios
microorganismos simultáneamente. Excluye las preparaciones que sólo aplican a la
detección y /o enumeración de un solo microorganismo cuando los métodos de
preparación están descrito en la norma respectiva para ese microorganismo, por
ejemplo, para el Vibrio parahaemolyticus.

Aplica a pescado y mariscos crudos, procesados, cocidos o congelados y sus


productos.

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- Pescado y mariscos crudos, incluyendo:

Pescado, completo o en filetes, con o sin piel y cabeza y eviscerados.

Pescado salado, ahumado seco o encurtido.

Cefalópodos completos o en tajadas.

Mariscos, completos, incluyendo camarones, langostinos, langostas, cangrejos,


langosta de Noruega.

Gastrópodos, bivalvos, equinodermos y tunicados vivos.

- Pescado y mariscos procesados incluyendo:

Pescado seco, ahumado, marinado, salado, encurtido y apanado.

Pescado, completo o filetes preparados, con o sin piel.

Surimi y productos delicatessen de pescado.

Mariscos completos o desconchados y su carne.

Platos cocidos basados en camarones, langostinos, langosta, gastrópodos,


bivalvos, holotúridos, tunicados, pescado, mariscos y caracoles.

- Pescado y mariscos congelados, en bloques o en otra forma, incluyendo:

Pescado, filetes y trozos de pescado, camarones completos y desconchados,


cangrejo en trocitos, cefalópodos, mariscos cocidos desconchados y
caracoles desconchados.

2 REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos contienen disposiciones que, en virtud de su


referencia aquí, constituyen disposiciones aplicables a esta parte de la norma ISO
6887. Para referencias actualizadas, no aplican enmiendas o revisiones futuras de
cualquiera de estas publicaciones. Sin embargo, se exhorta a las partes con acuerdos
basados en esta parte de la norma ISO 6887 a investigar la posibilidad de aplicar las
ediciones más recientes de los documentos normativos que se indican a continuación.
Para referencias no actualizadas, aplica la edición más reciente del documento
normativo de referencia. Los miembros de la ISO y la IEC conservan registros de
normas internacionales válidas actualmente.

EN ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test
samples, initial suspension and decimal dilution for microbiological examination - Part
1: General rules for the preparation of initial suspension and decimal dilutions.

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for
microbiological examinations.

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3 DEFINICIONES

Para propósitos de esta parte de la norma ISO 6887, aplican los siguientes términos y
definiciones:

3.1 Muestra de laboratorio

Alícuota representativa de material alimenticio requerido para el análisis


microbiológico.

3.2 Muestra de ensayo

Muestra representativa medida (volumen o peso) tomada de la muestra de laboratorio


para usarla en la preparación de la suspensión inicial.

3.3 Suspensión inicial (dilución primaria)

Suspensión, solución o emulsión obtenida después de que una cantidad pesada o


medida del producto sujeto a análisis (o una muestra de ensayo preparada a partir del
producto) se ha mezclado con lo que normalmente debe ser nueve veces la cantidad
de diluyente, que permite que las partículas grandes, si están presentes, se
sedimenten.

3.4 Diluciones decimales adicionales

Suspensiones o soluciones obtenidas mezclando un volumen medido de la suspensión


inicial (3.3) con un volumen de nueve veces de diluyente y repitiendo esta operación
con diluciones adicionales, hasta obtener una serie de diluciones decimales,
adecuadas para la inoculación en el medio de cultivo.

4 PRINCIPIO

Preparación de la suspensión inicial (3.3) para obtener una dispersión lo más uniforme
posible de los microorganismos contenidos en la muestra de ensayo.

Preparación de una suspensión de pre enriquecimiento o de enriquecimiento en la


misma manera, usando el medio recomendado por el método de análisis involucrado,
excepto en los casos especiales mencionados en el capítulo de esta norma
correspondiente a cada producto.

Preparación, si es necesario, de diluciones decimales (3.4) para reducir la cantidad de


microorganismos por unidad de volumen para permitir, después de la incubación, la
observación de cualquier crecimiento (en el caso de medios líquidos) o colonias (en el
caso de placas de agar), como se establece en cada norma específica.

Para restringir, si se requiere, el rango de enumeración a un intervalo determinado, o


si se prevén grandes cantidades de microorganismos, es posible inocular solamente
las diluciones decimales necesarias (al menos dos diluciones sucesivas) que se
necesitan para lograr la enumeración de acuerdo con el cálculo descrito en la norma
ISO 7218.

5 DILUYENTES

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5.1 MATERIALES BÁSICOS

Ver la norma ISO 6887-1

5.2 DILUYENTES PARA USO GENERAL

Nota. Cuando se analiza pescado de mar, no procesado, crudo con relación a su flora
microbiana marina natural (halofílica), se recomienda el uso de, por ejemplo, 4% de NaCl (es
decir, isotónico para el agua marina).

5.2.1 Solución salina de peptona

Ver norma ISO 6887-1

5.2.2 Agua con peptona neutralizada

Ver norma ISO 6887-1, 5.2.2

5.3 DILUYENTES PARA PROPÓSITOS ESPECIALES

5.3.1 Solución salina de peptona con púrpura de bromocresol

5.3.1.1 Composición

Solución salina de peptona (ver 5.2.1) 1.000 ml

Púrpura de bromocresol (solución de alcohol al 0,04%) 0,1 ml

5.3.1.2 Preparación

Diluir 0,1 ml de púrpura de bromocresol en 1.000 ml de solución salina de peptona


(5.2.1).

5.3.1.3 Aplicación

Esta solución se puede usar en ciertos productos ácidos de manera que el ajuste del
pH se puede hacer sin el uso de pruebas de pH estériles.

El púrpura de bromocresol es amarillo en pH ácido y se torna púrpura con pH superior


a 6,8.

5.4 DISTRIBUCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL DILUYENTE

Ver norma ISO 6887-1

6 APARATO

Equipo de laboratorio microbiológico común, para uso general (ver normas ISO 7218
e ISO 6887-1)

6.1 Homogenizador

6.1.1 Homogenizador giratorio

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Ver norma ISO 7218. Si se usa una muestra de ensayo grande, el equipo debería
incluir un recipiente con capacidad de 1 litro.

6.1.2 Homogenizador peristáltico

Ver norma ISO 7218.

6.2 Tijeras, cuchillos, mondador para mariscos, escalpelos y cuchillo grande estériles.

6.3 Tenazas (grande y pequeña), espátulas, cucharas, etcétera, estériles.

6.4 Instrumentos estériles para abrir cochas (cuchillos especiales, martillo, tenacillas,
prensa ajustable, etcétera).

6.5 Cepillo rígido pequeño para limpiar las conchas.

6.6 Taladro eléctrico equipado con una broca estéril para madera (14 mm o 16 mm de
diámetro).

7. PREPARACIÓN DE MUESTRAS

7.1 MUESTRAS

Las muestras almacenadas congeladas se deben llevar hasta una consistencia que
permita el muestreo a temperatura ambiente (18° C a 25° C durante un máximo de 3
h), o 2° C ± 2° C durante un máximo de 24 h. Las muestras se deberían ensayar lo
más rápido que sea posible. Ver norma ISO 687-1.

Si el producto aún está congelado cuando se toman las porciones, la temperatura del
diluyente puede estar a temperatura ambiente.

7.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE LABORATORIO

Para productos secos y duros o heterogéneos, puede ser necesario picar o triturar la
muestra de laboratorio. En este caso, para evitar el aumento excesivo de la
temperatura, no pique ni triture por más de 1 minuto.

7.3 HOMOGENIZACIÓN DE PRODUCTOS SECOS Y DUROS

Para productos secos o duros, no homogenice en un homogenizador giratorio por más


de 2,5 minutos consecutivos.

7.4 MEZCLA DE MUESTRAS LÍQUIDAS NO VISCOSAS

La muestra de ensayo se debería tomar después de haber agitado la muestra de


laboratorio, mecánica o manualmente, para asegurar que los microorganismos se
distribuyen uniformemente.

7.5 PRODUCTOS HETEROGÉNEOS

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El muestreo de productos que contienen diferentes fragmentos de alimentos se
debería hacer tomando alícuotas de cada componente con relación a sus proporciones
en el producto inicial o después de homogenizar la muestra de laboratorio en su
totalidad.

8. PROCEDIMIENTOS GENERALES

8.1 GENERALIDADES

Todas las preparaciones y manipulaciones se deberían realizar usando buenas


técnicas asépticas y con equipo estéril para evitar la contaminación microbiana externa
de las muestras. Ver Norma ISO 7218.

Indique en el informe cualquier procedimiento utilizado para el análisis cuando es


diferente al de esta norma.

8.2 CASO GENERAL PARA LOS PRODUCTOS ÁCIDOS

Es importante cuando se usa una solución de suspensión de productos ácidos


asegurar que el pH se devuelva a la neutralidad. El uso de diluyente con adición de un
indicador de pH (5.3.3) puede evitar el uso y esterilización de pruebas de pH: adicione
NaOH para devolver la coloración de la suspensión cuando el indicador está
cambiando.

Para el uso con diluyentes neutralizados, con frecuencia es necesaria la adición de


hidróxido de sodio (NaOH) para reforzar la reserva alcalina.

8.3 ALIMENTOS CON ALTO CONTENIDO DE GRASA (por ejemplo cuando más
de 20% de su masa total es grasa)

El uso de un diluyente con la adición aproximada de 1 g/l a 10 g/l de mono oleato de


sorbitan (Tween 80), de acuerdo con los contenidos de grasa, puede mejorar el
proceso de emulsión durante la suspensión.

9. PROCEDIMIENTOS ESPECÍFICOS

9.1 PESCADO Y MARISCOS CRUDOS

9.1.1 Pescado fresco completo

Del músculo dorsal, tome una muestra en forma de cubo, corte en dados y triture en el
diluyente (5.2).

9.1.2 Pescado tajado, filetes, lonjas

Trate la muestra de acuerdo con la norma ISO 6887-1.

9.1.3 Cefalópodos completos y tajados

Retire la piel y la ventosa con las tenazas (6.3) y el escalpelo (6.2). Tome muestras en
forma de cubo de los músculos dorsales y trozos de los tentáculos.

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Adicione diluyente (5.2) para hacer una dilución de 1 en 10. Puesto que la carne de los
cefalópodos es relativamente firme, triture la muestra en diluyente usando un
homogenizador giratorio (6.1) o córtela en trozos finos.

9.1.4 Mariscos completos como el cangrejo

Use un martillo, tenacillas (6.4) o tenazas (6.3) para romper la concha y las pinzas con
el propósito de extraer la máxima cantidad de carne para el análisis.

Adicione diluyente (5.2) y, preferiblemente, triture en un homogenizador giratorio


(6.1.1), de lo contrario, corte en trozos finos y coloque en una bolsa doble para
stomacher para evitar la filtración cuando se macere en un homogenizador peristáltico
(6.1.2).

9.1.5 Carne de cangrejo desconchado y mariscos

Tome la cantidad requerida de carne, prepare la suspensión inicial 1 en 10 en


diluyente (5.2) y macere como el numeral 9.1.4.

9.1.6 Mariscos como camarón, langostino, langosta o langosta de Noruega


(completa o las colas)

Antes del análisis de la carne del cuerpo se retiran la cabeza y la aleta caudal.

Retire el caparazón del crustáceo y corte la carne en trozos, luego adicione trozos del
caparazón. Triture en un homogenizador giratorio (6.1.1).

Si esto no es posible, pese la carne y los trozos de caparazón en una bolsa para
stomacher retirando, con tenazas (6.3), cualquier trozo de caparazón que pueda
perforar la bolsa y llevándolo a un recipiente estéril.

Adicione la cantidad de diluyente (5.2) para obtener una dilución de 1 en 10. Los
trozos de caparazón se adicionan nuevamente después de la homogenización. En
seguida, mezcle a mano para separar los microorganismos del caparazón.

9.1.7 Mariscos vivos

Inmediatamente después de llegar al laboratorio, almacene las muestras a una


temperatura de 6° C ± 2° C. Los mariscos deberían estar vivos.

Una muestra de ensayo representativa debe contener mínimo cinco individuos y debe
pesar entre 75 g y 100 g (25 g para animales pequeños). En el análisis de bivalvos se
tiene en cuenta tanto la carne como el agua intervalvular.

9.1.7.1 Bivalvos

Lave y cepille (6.5) cada concha bajo el agua potable del grifo, especialmente
alrededor de la charnela o abertura.

Drene la abertura y flamee rápidamente para descontaminarla.

Si está el músculo biso, córtelo con las tijeras (6.2) antes de abrir completamente.

ADVERTENCIA: No lo desgarre.

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Cuando cada concha esté abierta, recoja la carne y el agua intervalvular en un
recipiente estéril adecuado para la trituración. Los bivalvos que han perdido su agua
intervalvular se pueden usar si aún están vivos cuando se abre la concha.

Adicione 1 parte de carne y agua intervalvular a 2 partes de diluyente (5.2). Triture con
un homogenizador giratorio (6.1.1) durante aproximadamente 30 segundos a 2
minutos dependiendo del homogenizador utilizado (ver norma ISO 7218).

De esta manera, se obtiene una suspensión de 1 en 3 a la cual se puede adicionar


diluyente (5.2) para obtener una dilución de 1 en 10.

Si no hay astillas de la concha, se puede usar un stomacher.

9.1.7.2 Gastrópodos ( por ejemplo, caracoles buccinos)

Cepille (6.5) y lave la concha, límpiela con 70% de alcohol y colóquela en una bandeja
estéril (si es necesario, entre dos capas de gasa estéril) y con un martillo (6.4) rompa
la concha para poder extraer el cuerpo del animal.

Las conchas también se pueden triturar con una prensa para abrirlas (6.4).

Corte la carne en dados y retire los restos de concha con las tenazas (6.3).

Prepare una suspensión inicial (3.3) de 1 en 3 en diluyente (5.2), luego diluya a 1 en


10 usando el mismo diluyente.

Nota. El análisis de buccinos es muy difícil puesto que es imposible sacar la carne del animal, a
través de la concha, sin contaminarla.

9.1.8 Erizo de mar

Lave mínimo cinco individuos bajo el agua potable del grifo y colóquelos en una
bandeja estéril.

Sostenga al erizo con las tenazas o con un guante apropiado y corte un trozo de la
parte ventral con tijeras afiladas y con una espátula recoja toda la carne y el agua en
un recipiente estéril adecuado para la trituración.

Prepare una suspensión inicial (3.3) de 1 en 3 en diluyente (5.2), luego diluye a 1 en


10 usando el mismo diluyente.

9.1.9 Halotúridos y tunicados

Corte con tijeras (6.2) en trozos finos y triture en un homogenizador giratorio (6.1.1).

Prepare una suspensión inicial (3.3) de 1 en 3 en diluyente (5.2), luego diluye a 1 en


10 usando el mismo diluyente.

9.2 PESCADO Y PRODUCTOS DE MARISCO PROCESADOS

9.2.1 Alimentos marinos salados o encurtidos

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Tome tiras del músculo de las muestras de ensayo para obtener una preparación
homogenizada. En el caso de productos muy salados, puede ser necesario diluir en
más de 1/10.

9.2.2 Pescado seco

Con las tijeras (6.2.1), corte trozos del cuerpo del pescado, incluyendo la piel.

Adicione diluyente (5.3.1) y triture en un homogenizador giratorio (6.1.1).

9.2.3 Pescado seco salado

Tome muestras en la misma manera que para el pescado seco (9.2.2) para los
productos salados (9.2.1) cuando haga la suspensión.

Rehidrate la muestra mediante inmersión, si es necesario, durante 60 minutos a la


temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C.

9.2.4 Pescado ahumado completo

Si se consume el pescado completo, entonces la piel se incluye en la muestra. Si la


piel no se consume, entonces ésta se excluye.

La muestra se toma del área dorsal y la carne se corta en dados y se homogeniza en


diluyente (5.2).

9.2.5 Tajadas y filetes de pescado ahumado, con o sin piel

Tome trozos de los filetes y córtelos en dados, bajo condiciones estériles, sin retirar la
piel.

9.2.6 Productos marinados

Trate la muestra igual que para los productos ácidos con pH bajo (8.2)

9.2.7 Pescado apanado, surimi y delicatessen de pescado y mariscos

Ver norma ISO 6887-1.

9.2.8 Platos cocidos con base en pescado y mariscos

Tome alícuotas de cada componente, teniendo en cuenta sus proporciones.

Se puede homogenizar toda la muestra de ensayo para uso en el laboratorio, de


manera que se pueda obtener una muestra homogénea para el ensayo.

9.2.9 Mariscos cocidos completos o desconchados, carne de mariscos

Ver numerales 9.1.5, 9.1.6 y 9.1.7

9.2.10 Gastrópodos cocidos

Retire el opérculo con un escalpelo (6.2), luego , extraiga el cuerpo del animal usando
las tenazas (6.3) o con un mondador de caracoles, o en su lugar, una vara metálica
fina con forma de gancho en el extremo.

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9.2.11 Bivalvos desconchados cocidos o precocidos

Ver norma ISO 6887-1

9.3 Pescado y productos de marisco congelados

9.3.1 Camarones desconchados congelados en bloque

Descongele levemente para poder partir el bloque, luego separe los camarones y tome
trozos de carne con las tenazas (6.3).

9.3.2 Camarones completos congelados en bloque

Deje descongelar durante 1 hora a la temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C de


modo que se pueda partir el bloque.

Extraiga los camarones con las tenazas estériles (6.3) y descónchelos con las tenazas
en una bandeja estéril.

Triture trozos en un homogenizador giratorio (6.1.1).

9.3.3 Carne de cangrejo en trocitos congelada en bloque

Tome una muestra del bloque congelado usando un taladro (6.6) o deje descongelar a
la temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C y retire porciones grandes con las
tenacillas (6.4) o las tenazas (6.3).

9.3.4 Cefalópodos completos congelados en bloque

Descongele levemente (1 hora para bloques grandes) a la temperatura del laboratorio


18° C a 25° C. Corte trozos con las tijeras o un cuchillo grande bien afilado (6.2).

9.3.5 Caracoles desconchados precocidos, mariscos congelados en bloque

Ver el numeral relacionado con carne de cangrejo (9.1.6)

9.3.6 Filetes de pescado congelados en bloque

Deje descongelar hasta que esté lo suficientemente blando para poder cortar, durante
1 hora y no más de 3 horas, a la temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C y retire
trozos del bloque con un cuchillo grande y las tenazas (6.3).

9.3.7 Trozos de pescados grandes (por ejemplo, filete de atún) congelados en


bloque

Deje descongelar hasta que esté lo suficientemente blando para poder cortar, durante
1 hora y no más de 3 horas, a la temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C. Corte
una tajada de la parte media del bloque con un cuchillo grande bien afilado (6.2)

9.3.8 Partes pequeñas y porciones individuales congeladas

Deje descongelar hasta que esté lo suficientemente blando para poder cortar, durante
1 hora y no más de 3 horas, a la temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C.

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La muestra se debería tratar como los productos frescos.

9.3.9 Porciones completas y grandes de pescado congelado (salmón, atún,


etcétera)

9.3.9.1 Atún completo congelado (normalmente las muestras se toman en


establecimientos comerciales)

Si el atún está descongelado, con un cuchillo tome un trozo del músculo por debajo de
la piel. Si el atún no está descongelado, utilice un taladro (6.6).

9.3.9.2 Pescado congelado y trozos de pescado congelados

Si la masa del producto indica que la descongelación tardará más de 3 horas a la


temperatura del laboratorio de 18° C a 25° C, descongele en un refrigerador a una
temperatura de 0° C a 2° C, durante un máximo de 48 horas, o tome muestras usando
el taladro (6.6), en lo posible, evitando los huesos.

10. DILUCIONES DECIMALES ADICIONALES

Ver norma ISO 6887-1

DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of food


and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal
dilutions for microbiological examination - Part 3: Specific rules for the preparation of
fish and fishery products. ISO/DIS 6887-3, 2001, 10 p (ISO/DIS 6887-3).

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