Dpto.

de Bacteriología y Virología
Curso Bases Científicas de la Patología 2020
Pruebas bioquímicas

Pruebas bioquímicas útiles para la identificación de cocos Gram positivos

Catalasa
Permite detectar la presencia de la enzima catalasa, que produce
H2O y O2 a partir de H2O2.
Procedimiento: suspensión de colonias sobre una gota de peróxido
de hidrógeno (H2O2) al 3%
▪ Resultado positivo: Aparición instantánea de burbujas
▪ Resultado negativo: No se observan burbujas

Coagulasa
Permite detectar la presencia de coagulasas, enzimas presentes en Staphylococcus aureus, las cuales
convierten fibrinógeno a fibrina que luego recubre al microorganismo.
Existen dos tipos de pruebas de coagulasa:

Coagulasa en lámina: Permite detectar la coagulasa ligada o clumping factor, que se encuentra
presente en la pared bacteriana, uniéndose directamente al fibrinógeno provocando la formación
de coágulos.
Procedimiento: En una lámina de vidrio se colocan una gota de
suero fisiológico y allí se emulsiona una colonia del microorganismo
a estudiar hasta lograr una suspensión lechosa. Al lado se agrega una
gota de plasma citratado de conejo y se mezcla luego con la
suspensión bacteriana.
▪ Resultado positivo: formación de grumos.
▪ Resultado negativo: no se forman grumos. Este resultado se
debe confirmar con prueba en tubo.

Coagulasa en tubo: Permite detectar la coagulasa libre que actúa mediante la formación de un
complejo con un factor sérico activado (CRF) el cual reacciona con el fibrinógeno formando el
coágulo de fibrina.
Procedimiento: Se emulsiona una colonia del microorganismo a estudiar en 0,5 ml de suero
citratado de conejo. Se incuba 4 h a 35 ºC y si es negativo, se sigue incubando y se lee a las 18 h.
▪ Resultado positivo: Formación de un coágulo.
▪ Resultado negativo: No se forma un coágulo luego de 18 h de incubación.

Aglutinación para búsqueda de proteína A

Se trata de kits comerciales que permiten detectar la presencia de proteína A junto con el clumping
factor en Staphylococcus aureus. La proteína A es un componente de superficie de S. aureus que se
une a la porción Fc de las inmunoglobulinas.
Los test de a aglutinación comerciales utilizan partículas de látex cubiertas con plasma.
Procedimiento: Las especificaciones dependen de cada kit,
pero consiste en emulsionar una o varias colonias del
aislamiento con el reactivo conteniendo plasma unido a las
partículas de látex.
▪ Resultado positivo: Formación de grumos en pocos
segundos.

DNAsa
Permite detectar la presencia de enzimas capaces de clivar los enlaces fosfodiéster de la cadena de
ADN, llamadas desoxirribonucleasas o DNAsas.
Procedimiento: Se utiliza un medio sólido que presenta ADN altamente polimerizado combinado
con verde de metilo, dando una coloración verde al medio. Se siembra con asa una estría o una
moneda y se incuba 18-24 h a 35-37 ºC.
▪ Resultado positivo: Halo transparente alrededor de la siembra. La
acción de la DNAsa destruye el complejo ADN-verde de metilo, lo
que provoca la decoloración del medio.
▪ Resultado negativo: No se observa un halo transparente, el medio
permanece verde.

Nucleasa termoestable
Permite detectar DNAsas y RNAsas resistentes al calor, las cuales se encuentran presentes en
Staphylococcus aureus, pero no en otras especies de Staphylococcus.
Procedimiento: Se parte de un cultivo del aislamiento en medio líquido, el cual se calienta 15
minutos a 100 ºC y se deja enfriar a temperatura ambiente. El medio empleado es agar azul de
toluidina, el cual forma complejos con el ADN. En este medio, se realiza un pocillo de pocos
milímetros donde se inocula el caldo previamente calentado. Se incuba 3 h a 35-37 ºC, si no se
observan cambios puede leerse a las 18 h. También se puede hacer en placa con verde de metilo.
▪ Resultado positivo: Observación de un halo rosado
a rojo alrededor del pocillo inoculado.
▪ Resultado negativo: No se observan cambios de
color, el medio permanece azul.

Susceptibilidad a la optoquina
Permite diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otros Streptococcus α- hemolíticos
(resistentes).
Procedimiento: En una placa de agar sangre se realiza una siembra confluente con asa o a partir
de una suspensión 0,5 McFarland del aislamiento a estudiar. Luego se coloca un disco de
optoquina sobre el área sembrada y se incuba 18-24 h a 35-37 ºC en atmósfera con CO2.
Interpretación:
▪ Sensible: Presencia de un halo de inhibición ≥14 mm alrededor del
disco de optoquina
▪ Resistente: Presencia de un halo de inhibición <14 mm alrededor del
disco de optoquina.

Solubilidad en bilis
Permite diferenciar Streptococcus pneumoniae de otros Streptococcus α- hemolíticos.
Streptococcus pneumoniae presenta autolisinas, que provocan la lisis del
microorganismo en el medio conteniendo sales biliares.
Procedimiento: Se realiza una suspensión en un tubo del microorganismo en suero
fisiológico al cual se le agrega una solución de sales biliares. Se incuba 3 h a 35-37
ºC examinándose cada hora.
▪ Resultado positivo: La observación de clarificación o pérdida de turbidez
indica la lisis bacteriana.
▪ Resultado negativo: El contenido del tubo permanece turbio.
 Hidrólisis de PYR
Permite detectar la presencia de la enzima pirridonil aminopeptidasa. Es útil para la identificación
de Streptococcus β-hemolíticos y para diferenciar Enterococcus de Streptococcus α- y γ-hemolíticos.
Procedimiento: Sobre un disco embebido de L-pirridonil-β-naftilamida (PYR) se colocan varias
colonias tomadas con un asa o punta. Se observa la reacción luego de 1 a 2 minutos.
▪ Resultado positivo: La hidrólisis de PYR por la enzima pirridonil
aminopeptidasa se observa con la aparición de un color rosado
sobre el disco.
▪ Resultado negativo: No se observa un cambio de color del disco.

CAMP
Permite detectar la presencia del factor CAMP, una proteína que actúa sinérgicamente con la β-
hemolisina de S. aureus, aumentando la hemólisis producida por esta. Es de utilidad para la
identificación de Streptococcus agalactiae y algunos bacilos Gram positivos como Listeria
minocytogenes.
Procedimiento: En una placa de agar sangre se realiza una estría lineal
con un asa cargada de un aislamiento de S. aureus productor de β-lisina.
En forma perpendicular, se realiza una estría del aislamiento a estudiar,
distanciada 2 a 3 mm de la estría de S. aureus. Se incuba 18-24 h a 35-37
ºC.
▪ Resultado positivo: Formación de una zona de hemólisis en forma de
flecha en la intersección de las dos estrías.

Pruebas bioquímicas útiles para la identificación de bacilos Gram negativos

Oxidasa
Pone en evidencia la presencia de la enzima citocromo oxidasa, que forma parte de la cadena de
transporte de electrones en bacterias aerobias, donde cataliza la oxidación de citocromo C
mientras reduce O2.
Procedimiento: Se utilizan discos o tiras embebidos de diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina
o tetraclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina, sobre los cuales se extienden varias colonias
del aislamiento a estudiar.
▪ Resultado positivo: Observación de un color
rosado o violeta.
 OF glucosa (prueba de óxido-fermentación)
Permite evaluar la capacidad de un aislamiento de oxidar (proceso aeróbico) y/o fermentar
(proceso anaeróbico) glucosa.
Procedimiento: El medio utilizado es Hugh Liefson suplementado con glucosa como fuente de
energía, baja cantidad de peptonas y azul de bromotimol, contiene un indicador de pH que es azul
de bromotimol (verde), el cual se torna amarillo a pH ácido. Puede realizarse en medio líquido o
semisólido agregando 0,7% de agar. Se utilizan dos tubos por cepa, los cuales se inoculan con
punta bacteriológica cargada con una colonia. A uno de los tubos se le agregan gotas de un aceite
mineral para formar un tapón que genere un ambiente de anaerobiosis. Se incuba 18-24 h a 35-
37 ºC.
Interpretación:
▪ Metabolismo fermentador: Ambos tubos de color amarillo
▪ Metabolismo oxidativo: Tubo aerobio amarillo (por lo general en la superficie) mientras que
el tubo anaerobio (con tapón de acente mineral) permanece verde.
▪ No oxida ni fermenta: Ambos tubos verdes.

Metabolismo Metabolismo No oxida ni

fermentador oxidativo fermenta

Agar TSI (triple azúcar hierro)

Permite estudiar la capacidad de un microorganismo de utilizar glucosa, sacarosa y/o lactosa, y
de producir gas en el metabolismo de la glucosa y H2S.
Medio: El medio TSI contiene glucosa 10 veces menos concentrada que sacarosa y lactosa (0.1%
vs 1%), peptonas, tiosulfato de sodio y rojo fenol como indicador de pH. Es sólido y se dispensa
en tubos con fondo y superficie. El rojo fenol vira al amarillo a pH ácido y rojo a pH alcalino.
Procedimiento: se siembra con una punta por picadura en el fondo y estría en la superficie. Se
incuba 18-24 h a 35-37 ºC.
Interpretación (Pico/fondo/gas/H2S):
▪ Alcalino/ácido: La bacteria fermentó la glucosa formando productos ácidos (fondo amarillo),
y no fue capaz de utilizar ni lactosa ni sacarosa, por lo que realizó degradación aerobia de las
peptonas del medio, un proceso aerobio que ocurre en la superficie del tubo (pico rojo).
▪ Ácido/ácido: Luego de fermentar la glucosa, la bacteria fue capaz de metabolizar sacarosa y/o
lactosa, formando productos ácidos que se observan en todo el tubo.
▪ Alcalino/alcalino: La bacteria no fue capaz de utilizar ningún carbohidrato.
▪ Presencia de gas: Se observa como burbujas o rupturas en el agar.
▪ Presencia de H2S: Se observa como un precipitado negro en el fondo del tubo.

Sin sembrar Alcalino/Ácido/ Ácido/Ácido/ Ácido/Ácido/ Alcalino/Ácido/

Gas-/H2S- Gas+/H2S- Gas-/H2S+ Gas-/H2S+

LIA (lisina hierro agar)

Permite estudiar si un microorganismo presenta las enzimas lisina descarboxilasa o lisina
desaminasa, las cuales descarboxilan o desaminan la lisina respectivamente. También estudia la
capacidad de producir H2S.
Medio: El agar LIA contiene lisina, glucosa en baja proporción, tiosulfato de sodio, sal de hierro.
Su indicador de pH es el púrpura de bromocresol (de color lila) que vira al amarillo a pH ácido y
al violeta a pH alcalino. Es sólido y se dispensa en tubos con fondo y superficie.
Procedimiento: se siembra con una punta por picadura en el fondo y estría en la superficie. Se
incuba 18-24 h a 35-37 ºC.
Interpretación (pico/fondo/H2S):
▪ Alcalino/alcalino: Se produce la descarboxilación de la lisina, cuyo producto alcaliniza el
fondo del tubo observándose un color violeta.
▪ Alcalino/ácido: La bacteria en incapaz de descarboxilar la lisina. Se produjo fermentación de
la glucosa por lo cual se acidificó el fondo del tubo (fondo amarillo).
▪ Pico rojo: La observación
de un pico de color rojo
indica la presencia de
lisina desaminasa que
forma ácido alfa-ceto-
carbónico el cual
reacciona con la sal de
hierro dando un color
rojo.
▪ Presencia de H2S: Se
observa como un
precipitado negro en el
fondo del tubo.
 MIO (Movilidad indol ornitina)
Permite determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos, si presenta la
enzima triptofanasa que hidroliza triptófano en indol entre otros productos y la presencia de
ornitina descarboxilasa.
Medio: El medio MIO es semisólido, contiene glucosa, triptófano y ornitina. El indicador de pH
es púrpura de bromocresol, que a pH alcalino es violeta y a pH ácido es amarillo.
Procedimiento: Se siembra por picadura, con una estría única y recta hasta 1cm antes del final del
tubo. Se incuba a 35-37º por 18-24 h.
Interpretación:
▪ Ornitina descarboxilasa positivo: Tubo de color violeta por la presencia de productos alcalinos
de la descarboxilación de ornitina
▪ Ornitina descarboxilasa negativo: Tubo color amarillo por los productos ácidos de la
fermentación de glucosa.
▪ Microorganismo móvil: Se observa turbidez
en el tubo.
▪ Microorganismo inmóvil: El crecimiento del
microorganismo se observa únicamente en la
estría, mientras que el resto del medio se ve
translúcido.
▪ Indol positivo: Tras el agregado de 2 o 3 gotas
de reactivo de Kovacs, se observa un anillo
rojo en la superficie del tubo, debido a la
reacción con el indol formado por la enzima
triptofanasa.
▪ Indol negativo: Tras el agregado de 2 o 3
gotas de reactivo de Kovacs, se observa un
anillo amarillo en la superficie del tubo.

Citrato de Simmons
Permite estudiar la capacidad de un aislamiento de utilizar citrato fuente de carbono.
Medio: El medio citrato de Simmons es sólido y se dispensa en tubos inclinados sin fondo.
Contiene únicamente citrato como fuente de carbono y el indicador de pH es azul de bromotimol
(verde) que a pH alcalino vira al azul.
Procedimiento: Se estría la superficie del medio con una punta bacteriológica. Se incuba 18-24 h
a 35-37ºC, pero en algunos casos puede ser necesaria su lectura a las 48 h.
 Interpretación:
▪ Resultado positivo: Tras el metabolismo del citrato, las sales de amonio
producen amoníaco, que alcaliniza el medio virando el indicador al color
azul.
▪ Resultado negativo: El tubo permanece de color verde.

Fenilalanina desaminasa
Permite determinar la presencia de fenilalanina desaminasa, enzima que produce ácido
fenilpirúvico por desaminación oxidativa.
Procedimiento: Se utiliza un medio sólido rico en fenilalanina, que se dispensa en tubos de agar
inclinado sin fondo. Se estría la superficie con una punta bacteriológica y se incuba 18-24 h a 35-
37 ºC. Para revelar el resultado es necesario agregar 3 a 5 gotas de cloruro férrico sobre la estría
luego de la incubación.
Interpretación:
▪ Resultado positivo: Se observa un color verde tras la adición de cloruro
férrico sobre la estría, revelando la presencia de ácido fenilpirúvico.
▪ Resultado negativo: No se observa el color verde luego de agregar
cloruro férrico.

Uso de carbohidratos
La capacidad de fermentar diferentes carbohidratos es de gran utilidad en la identificación de
enterobacterias, por lo cual existen estrategias que permiten evaluar cada azúcar en forma
individual.
Medio: Hugh Liefson suplementado con 1% del carbohidrato a estudiar. Se puede utilizar como
medio líquido o como semisólido agregando 0,7% de agarosa. Como indicador de pH usualmente
se emplea rojo fenol, que vira al amarillo a pH ácido y al color rojo a pH alcalino.
Procedimiento: Se inocula con punta bacteriológica. Para generar un ambiente anaerobio que
permita la fermentación, se agregan gotas de un aceite mineral para formar un tapón en la
superficie del tubo.
Interpretación:
▪ Resultado positivo: Tubo de color amarillo debido a la presencia
de productos ácidos de fermentación del azúcar testeado.
▪ Resultado negativo: Tubo de color rojo.