1) Que es inmunoensayo

Es el control de calidad de productos bio-farmacéuticos que se obtienen por medio de la

vía del ADN, recombinante para la cuantificación e identificación de proteínas, en
muestras de ingredientes farmacéuticos activos y productos terminados son ensayos de alta
sensibilidad y tienen como ventaja respecto a métodos físico-químico su alta especificidad
y que se basa en enlaces antígeno-cuerpo en la naturaleza. Un ensayo Inmuno-enzimático
es el diagnóstico que permite detectar los causante de una enfermedad en el caso de un
organismo que ha estado en contacto con él, ampliamente empleado en el área médica
para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios
en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos
o fases activas de enfermedades autoinmunes y/o los anticuerpos generados por el
organismo.

2) ¿Qué es el ELISA, cuál es su mayor utilidad y fundamente porque fue el

inmunoensayo empleado en esta validación?

La técnica ELISA es un ensayo inmuno-enzimático ampliamente empleado en el área

médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan
cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o
parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes, ELISA también es muy usada en
los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las
moléculas de interés en cada caso, Elisa determina anticuerpos mediante un antígeno
Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran los métodos
directo e indirecto. El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo
específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el
antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es
entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de
anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado
enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar
diferentes antígenos. El inmunoensayo fue empleado fundamentalmente para la
cuantificación del Interferón alfa 2b humano recombinante y definiéndose en criterios de
validez del ensayo y basado en la buenas prácticas de laboratorio
3) ¿Qué es el Interferón alfa 2b cuál es su utilidad terapéutica y cuantos
productos existen en el mercado colombiano con este principio activo?
(consulte el INVIMA).

Acción terapéutica: Antineoplásico, modulador de la respuesta biológica

(inmunomodulador) Acción farmacológica el interferón alfa 2b es una proteína
altamente purificada, formada por 165 aminoácidos, con un grupo arginina en la
posición 23, Se obtiene por técnicas de ADN recombinante, a partir de una cepa de
Escherichia coli, a la que se le introdujo el gen del interferón alfa 2b humano por
técnicas de ingeniería genética. El interferón alfa 2b es un modificador de la respuesta
biológica que posee propiedades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras.
Las acciones antivirales y antiproliferativas se supone que están relacionadas con
efectos sobre la síntesis de ADN, ARN y proteínas celulares. Oprime la proliferación
celular y como inmunomodulador estimula la actividad fagocítica de los macrófagos y
aumenta la citotoxicidad específica de los linfocitos hacia células blanco.
Farmacocinética: luego de la aplicación intralesión, se alcanzan concentraciones
plasmáticas por debajo de los niveles detectables; sin embargo, se han reportado
efectos sistémicos, indicando algún grado de absorción. La absorción, luego de la
administración subcutánea o intramuscular, es mayor del 80%. La bio-transformación
del interferón alfa 2b es renal. Los interferones alfa se filtran totalmente por glomérulo
y sufren una rápida degradación proteolítica durante la reabsorción tubular. La vida
media plasmática del interferón alfa 2b, luego de la administración intramuscular o
subcutánea, es de 2 a 3 horas. La máxima concentración plasmática se alcanza entre las
3 y 12 horas.

INTERFERÓN ALFA 2B

PEG INTRON 80 MCG

PEG INTRON PEN 150 MCG

INTRON A SOLUCIÓN INYECTABLE

TECNOFERON ALFA HUMANO

VIRAFERON INYECTABLE 3 MILLONES DE UI

INTRON A SOLUCIÓN INYECTABLE

 VIRAFERON 10 MILLONES DE UI

Interferón alfa 2b Humano Recombinante

HEBERON ALFA R SOLUCIÓN SIN ALBUMINA

SISTEMA DE TRAMITES EN LÍNEA

HEBERON ALFA R. INTERFERON ALFA 2B HUMANO RECOMBINANTE

5.000.000 UI.

HEBERON ALFA R 10M

HEBERON ALFA R SOLUCION SIN ALBUMINA 5M

HEBERON ALFA R SOLUCION SIN ALBUMINA 10 M

LEMERON 18 MUI

LEMERON 10 MUI - LIOFILIZADO PARA RECONSTITUIR A SOLUCION

INYECTABLE

Interferón alfa 2b Pegilado

PEG - INTRON INYECTABLE 50 MCG.

PEG - INTRON INYECTABLE 120 MCG.

EG-INTRON ® PEN 120 MCG.

PEG - INTRON INYECTABLE 100 MCG.

4) Explique el método de producción de ADN recombinante (para producir

Interferón alfa 2b y que posible control de calidad tiene ese método).

La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la expresión

génica, en la regulación de la producción comercial de síntesis de proteínas como la
Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de organismos transgénicos y en la
amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen
determinado. En este último caso, existe una técnica mejor, denominada con las
siglas PCR.

La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a su

vez, dentro de una célula, denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria
celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína codificada en el gen. Además, al
dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también sintetizan
esa proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto.

Las etapas en la producción de ADN recombinante son las siguientes:

1. Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

2. Preparación de un vector de clonación

3. Formación del ADN recombinante

4. Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona

5. Propagación del cultivo

6. Detección y selección de clones recombinantes

1. Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.

 Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).

 Las proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse

del ADN.

 El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de

restricción.

 Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida
o por centrifugación.

 Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores de la

expresión génica.

2. Preparación de un vector de clonación

El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe
presentar las siguientes características:

 Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.

 Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos.

 Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.

 Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.

 Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células
clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico.

Las etapas del proceso consisten en:

Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron para
cortar el ADN que se quiere insertar.

Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o
pegajosos, o escalonados.

Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o
simplemente, inserto.

Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus como el fago l,
cromosomas creados de forma artificial y quimeras.

3. Formación del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unión covalente del vector y el ADN inserto mediante una
ligasa. Así se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.

4. Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona

Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular.

Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.

Los tipos de células anfitrionas son:

  Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de
replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente
manipulables.

 Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de

mantener se usan levaduras y células tumorales:

o Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la

expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.

o Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la

velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin
producirse cambios, pues son muy estables.

Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes
fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la
penetración de grandes moléculas.

5. Propagación del cultivo

Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de

ADN recombinante y, por ello, la clonación. Primero se efectúa una siembra en placas
Petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas será
seleccionada y transferida a distintos medios líquidos, donde seguirá aumentando el
número de individuos de la colonia.

6. Detección y selección de los clones recombinantes

En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células. Al final del proceso se
hace necesario separar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo
contienen.

La detección y la selección de colonias se realizan en los medios de cultivo. En los

procesos de clonación se obtienen células anfitrionas que no han incluido el vector, células
recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar, y células
anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto.

Los métodos para detectar y seleccionar son:

  Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN
recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de él.

 Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el ADN recombinante

mediante anticuerpos específicos.

 Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser:

o Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de la célula

anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce
enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN
bacteriano en ese gen.

o Vector con genes de resistencia a un antibiótico: en el medio se agrega el

antibiótico y sólo crecerá aquella colonia que sea resistente a él, por tanto,
que porte el ADN.

o Colonias con defectos nutricionales: se utilizan células anfitrionas mutantes

que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminoácido. Para que la colonia
sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio de cultivo. Empleando
un vector que lleve el gen correcto para la síntesis de dicho aminoácido,
haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes de él sólo
crecerán las bacterias que lleven el ADN inserto

CONTROL DE CALIDAD

 Control de materia de inicio,

 Control del proceso de producción.

 Control del producto final.

Caracterización de las proteínas:

 Electroforesis SDS-PAGE.

 Inmuno-química (ELISA, Western blot).

 Mapeo peptídico.
  Dicroísmo circular.

 Cristalografía.

 Electroforesis capilar.

 Cromatografía líquida.

 Espectrometría de masa.

5) Explique que es un anticuerpo monoclonal y cuál fue su utilización en la

validación.

Anticuerpo monoclonal

Es un anticuerpo homogéneo producido por una célula híbrida producto de la fusión de

un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula
plasmática tumoral.

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos idénticos porque son producidos por un
solo tipo de célula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una sola
célula madre. Es posible producir anticuerpos monoclonales que se unan específicamente
con cualquier molécula con carácter antigénico. Este fenómeno es de gran utilidad
en bioquímica, biología molecular y medicina.

UTILIDAD

Una vez que se han producido anticuerpos monoclonales que se unen a determinadas
sustancias, estos pueden ser usados para detectar la presencia y cantidad de esta sustancia,
gracias a la prueba de Western blot, que detecta una sustancia en una solución o con una
prueba de inmunofluorescencia, que detecta una sustancia en una célula entera. Los
anticuerpos monoclonales también son usados para purificar una sustancia con técnicas
llamadas inmunoprecipitación y cromatografía.

Los anticuerpos monoclonales muestran una serie de ventajas sobre los anticuerpos
policlonales como:

1. Mayor homogeneidad.

2. Reproductibilidad de sus efectos, como consecuencia de su homogeneidad.

 3. Mayor capacidad potencial de seleccionar los mejores anticuerpos en afinidad, tipo
de reconocimiento.

Los anticuerpos monoclonales se utilizan en muchos campos como:

 La investigación biomédica, como la identificación y clonación de genes, la

identificación y aislamiento de proteínas, la activación de enzimas, conocimiento
de la estructura molecular y morfogénesis.

 Diagnóstico: En medicina, gracias a la gran especificidad y capacidad

prácticamente ilimitada de los anticuerpos monoclonales para reconocer cualquier
estructura química, permite la detección de hormonas, vitaminas, citocinas; la
monitorización de drogas, detección de enfermedades infecciosas en microbiología;
la detección de alérgenos en alergia, hematología, marcadores tumorales e infartos
de miocardio, aplicaciones forenses, inmunoescintografía. En las técnicas
diagnósticas se emplean diversas herramientas de biología molecular como ELISA,
EIA, citometría, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia. Los anticuerpos
monoclonales son unas de las sustancias más utilizadas en los laboratorios de
diagnóstico.

 Catálisis: Los anticuerpos monoclonales se han utilizado como catalizadores de

múltiples reacciones químicas.

 Biosensores: Los anticuerpos monoclonales acoplados a transductores electrónicos

pueden detectar tanto moléculas orgánicas como inorgánicas como
la contaminación de metales pesados en alimentos y agua, detección de gases
tóxicos, etc. Un biosensor es un instrumento analítico formado por un material
biológico inmovilizado como una enzima, anticuerpo, célula entera, orgánulo o
combinaciones de los mismos, en íntimo contacto con un sistema transductor
adecuado que convierta la señal bioquímica en una señal eléctrica cuantificable.

 Tratamiento: Las aplicaciones terapéuticas constituyen el campo más importante

de los anticuerpos monoclonales, ya que son capaces de destruir células, incluidas
las tumorales, mediante distintos mecanismos. Se emplean en el tratamiento de
diversas enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, el cáncer o para
 evitar el rechazo tras un trasplante. Existen varios anticuerpos monoclonales
aprobados para su uso en determinadas enfermedades.

USO EN LA VALIDACIÒN

Los Anticuerpos Monoclonales (AcM) CB - IFN 2.3 y CB – IFN 2.4 .PRP contra el IFN
alfa 2b hu-rec, empleados como recubrimiento de las placas de ELISA y como conjugado
respectivamente, fueron suministrados por el CIGB de Sancti Spíritus y se titularon según
el Procedimiento Patrón de Operación 4.09.036.91 (3). ELISA tipo Sandwich que utiliza
dos anticuerpos monoclonales, cada uno de los cuales reconoce a la molécula por sitios
diferentes.

6) ¿Qué son las ICH Q2 (R1) y porque se utilizaron en la validación?

Conferencia internacional tripartita sobre armonización.

Utilizada para validar un método analítico siguiendo las normas y parámetros, dentro de
estas encontramos: exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de
cuantificación, linealidad, intervalo. Esto se evalúa dentro de las siguientes categorías:
Categoría I (Principio(s) activo(s)); Categoría II (Prueba límite cuantitativa, prueba límite
cualitativa); Categoría III (Desempeño físico-químico); Categoría IV (Identificación).

La validación del ELISA se realizó siguiendo lo planteado en la Regulación No. 41-2007

del CECMED (4), y la ICH Q2 (R1) (5), definiéndose los parámetros a estudiar de acuerdo
con la clasificación a que pertenece el método: .Métodos de contenido o potencia

7) Qué significa “la .t de Student. de muestras pareadas” (p < 0,05)” y cuál su

aplicación en el artículo

Es una prueba paramétrica de comparación de dos muestras relacionadas, debe cumplir las
siguientes características:
• Asignación aleatoria de los grupos
• Homocedasticidad (homogeneidad de las varianzas de la variable dependiente de los
grupos)
• Distribución normal de la variable dependiente en los dos grupos
• Nivel intervalar o de razón de la variable dependiente
Su función es comparar dos mediciones de puntuaciones (medias aritméticas) y determinar
que la diferencia no se deba al azar (que la diferencia sea estadísticamente significativa).
Durante el artículo se utilizó la t student para determinar la especificidad estudió
evaluando si este era capaz de discriminar la presencia del IFN alfa 2b hu-rec en una
matriz resultante del mismo proceso de producción pero sin la presencia de dicha proteína,
al comparar con el punto de la curva de calibración del ensayo correspondiente a la menor
concentración de IFN alfa 2b hu-rec. Se aplicó una prueba t de Student de muestras
pareadas (p < 0,05). En el estudio de la exactitud se empleó el método de recuperación,
mediante la adición de concentraciones conocidas (0,5; 3 y 10 ng/mL) de IFN alfa 2b hu-
rec, al tampón del ensayo, así como al tampón empleado durante el proceso de purificación
del IFA (KH2 PO4 0,168 mM; Na2 HPO4 8,45 mM; KCl 2,61 mM y NaCl 0,137 mM,
pH 7.2). Se evaluó el porcentaje de recuperación para cada concentración, el cual debe
encontrarse entre 80 y 120%.
Para establecer el rango, se estudiaron los resultados obtenidos de las dos concentraciones
extremas de la curva de calibración (0,5 y 10 ng/mL) en 10 ensayos. Se determinó el
intervalo de confianza para los porcentajes de recuperación obtenidos para la
concentración esperada y observada, para comprobar que el 100% de recuperación
estuviese incluido dentro del intervalo de confianza calculado.

8) Cuál es la diferencia entre precisión, precisión intermedia y reproducibilidad

y cuales se utilizaron el artículo. En caso de utilizar precisión intermedia
especifique que parámetros se evaluaron.

PRECISIÓN: Es el grado de concordancia entre los resultados independientes de una

medición, obtenidos en condiciones estipuladas, ya sea de repetibilidad o de
reproducibilidad y depende de la distribución de los resultados sin estar relacionada
con el valor verdadero.

PRECISIÓN INTERMEDIA: Medida de la precisión de los resultados de un método

en condiciones diferentes de analista, día, equipo y lote de reactivos, dentro del mismo
laboratorio. No es necesario determinar precisión intermedia, cuando se ha
determinado reproducibilidad.

REPRODUCIBILIDAD: Coincidencia entre los resultados de mediciones realizadas

en diferentes condiciones de medición en un mismo laboratorio o entre 2 laboratorios.

Durante el estudio se utilizo para medir la precisión; la repetibilidad y la precisión

intermedia, tanto para la curva patrón de IFN alfa 2b hu-rec como para diferentes
 muestras de IFA de IFN alfa 2b hu-rec, empleadas como control positivo del ensayo.
La repetibilidad para la curva patrón se estudió con 5 curvas patrones de forma
independiente en un mismo ensayo, tomándose los datos experimentales del estudio de
linealidad, y la precisan intermedia se estudió en 3 ensayos evaluándose el
comportamiento de las absorbancias para cada concentración.

La repetibilidad para las muestras se estudió mediante la medición de los valores de 15

réplicas de una muestra control en una misma placa por un mismo analista, a las
diluciones habituales de trabajo. La precisión intermedia para las muestras
(variabilidad interensayo) se estudió con dos muestras evaluadas a diferentes
diluciones, con uno y dos analistas en días diferentes.

9) Cuál es la diferencia entre la desviación estándar (DE) y el coeficiente de

variación (CV) y para que se utilizaron en el artículo

Desviación Estándar: Es la medida de cómo se dispersan los valores alrededor de la

media en la distribución de valores. Al rededor de la media en la distribución de valores.
Se calcula con la fórmula:

DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA (RSD) DESVIACIÓN ESTÁNDAR

RELATIVA (RSD): Es la comparación de la desviación estándar con respecto a la media,
generalmente se expresa en % y se denomina como Coeficiente de Variación Se calcula
con la siguiente fórmula:
Durante el ensayo en todos los casos se determinó la media, la desviación estándar (DE) y
el coeficiente de variación (CV), y se consideró que el CV fuese inferior al 10% para el
caso de la repetibilidad e inferior al 20% para la precisión intermedia.

Para establecer el rango, se estudiaron los resultados obtenidos de las dos concentraciones
extremas de la curva de calibración (0,5 y 10 ng/mL) en 10 ensayos. Se determinó el
intervalo de confianza para los porcentajes de recuperación obtenidos para la
concentración esperada y observada, para comprobar que el 100% de recuperación
estuviese incluido dentro del intervalo de confianza calculado. Se determinó el CV entre
los diferentes porcentajes de recuperación obtenidos, considerándose adecuados CV
inferiores al 20%.

10) Explique cómo se evaluó la robustez del ensayo en el artículo.

El parámetro de robustez se estudió evaluando el efecto borde en las placas de ELISA y la
estabilidad de las soluciones empleadas. Se evaluó una muestra control positivo colocada
en diferentes posiciones de la placa de ELISA y se determinó si el valor de las densidades
Ópticas de la muestra colocada en la posición de los bordes estuviese dentro del intervalo
de la ± 2 DE, calculado para la muestra ubicada en la posición central de la placa.
El estudio de la estabilidad de las soluciones y su influencia en la robustez del ensayo se
realizó mediante los resultados de la precisión intermedia, donde dos analistas utilizaron
diferentes lotes de soluciones recién preparadas, con días de preparadas y cercanas a su
fecha de vencimiento (6).

BIBLIOGRAFÍA
 LIBAU-medmol.tecnicas-perspectiva molecular
 Privademecum-Inteferon alfa 2b-2013

INTERGRAFÍA
 “(Normatividad/medicamentos, normatividad /dispositivos médicos)”.
Recuperado de: http//:www.invima.gov.co
 “Producción de ADN recombinante.” Recuperado de:
http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos3.htm
 “Interferón alfa ADN recombinante”. Recuperado de:
http://www.ema.europa.eu/docs/es_ES/document_library/EPAR__Product_Inform
ation/human/000281/WC500034679.pdf

 “Anticuerpo monoclonal”. Recuperado de:

http://www.ciencias.unal.edu.co/unciencias/datafile/cimun/encuentro_farmacovig/v
ie_12/interferones_otras_proteinas.pdf