Elaboración y Aplicación del

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE

GROHMANN
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

CURSO:

Microbiología Ambiental

DOCENTE:

Dr. César Julio Cáceda Quiroz

ESTUDIANTE:

Walter Tapia Flores

CÓDIGO:

2016 - 178046

Human Enterovirus, Poliovirus, TEM

Fuente: ScienceSourceImages

Trabajo opcional

Detección de virus entéricos en el agua

TACNA - PERÚ 2018
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

Detección de virus entéricos en el agua

Experimento 20

20.1. RESUMEN
Objetivo: demostrar cómo se concentran los virus entéricos y son detectados en el agua.
 Demostración de equipos utilizados para concentrar virus en el agua.
 Observación de cultivos celulares para efectos citopatógenos virales (CPE).

20.2. TEORÍA Y SIGNIFICADO

Ocurrencia
Los virus excretados con heces de cualquier especie de animal pueden contaminar el agua.
Especialmente numerosos, y de particular importancia para la salud, son los virus que
infectan el tracto gastrointestinal de los humanos y se excretan con las heces de individuos
infectados. Estos virus se transmiten con frecuencia desde persona a persona por la ruta fecal-
oral. Sin embargo, también están presentes en aguas residuales domésticas que, después de
varios grados de tratamiento, se descargan a ya sea las aguas superficiales o la tierra. Virus
entéricos que se sabe que se excretan en cantidades relativamente grandes con heces incluyen
poliovirus, coxsackievirus, echovirus, y otros enterovirus, adenovirus, reovirus, rotavirus, el
virus de la hepatitis A (hepatitis infecciosa) y los norovirus. Son responsables de una amplia
gama de enfermedades que incluyen gastroenteritis, erupción cutánea, meningitis,
miocarditis, infecciones oculares, parálisis, fiebre, etc. con la posible excepción de la
hepatitis A, cada grupo o subgrupo consiste en una serie de diferentes tipos serológicos; por
lo tanto, más de 100 virus entéricos humanos diferentes son reconocidos.

Los virus no son flora normal en el tracto intestinal; solo son excretados por personas
infectadas, en su mayoría bebés y niños pequeños. Las tasas de infección varían
considerablemente de una zona a otra, dependiendo de los aspectos sanitarios y condiciones
socioeconómicas. Debido a que los virus entéricos se multiplican solo dentro de los seres
vivos, susceptibles de células, sus números no pueden aumentar en las aguas residuales. El
tratamiento de aguas residuales, dilución, la inactivación natural y el tratamiento del agua
reducen aún más el número de virus. Grandes brotes de enfermedades virales transmitidas por
el agua pueden ocurrir cuando la contaminación de las aguas residuales de un suministro de
agua ocurre. Ha sido demostrado que la infección puede ser producida experimentalmente
por la ingestión de solo unas pocas unidades de virus. El análisis de riesgo ha sugerido un
riesgo significativo de infección que podría resultar de números bajos (un virus en 100 litros)
de virus entéricos presentes en el suministro de agua potable.

Pruebas para detectar virus

La detección de virus en el agua a través de la recuperación del virus infeccioso, requiere de
tres pasos generales: (a) recopilar una muestra representativa; (b) concentrar el virus en la
Página 2 | 8
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

muestra; y (c) identificar y estimar cantidades del virus concentrado. Problemas particulares
asociados con la detección de virus de interés para la salud pública en el ambiente acuático
son: (a) el pequeño tamaño de partículas de virus (aproximadamente 20-100 nm de diámetro);
(b) las bajas concentraciones de virus en el agua y la variabilidad en las cantidades y tipos
que pueden estar presente; (c) la inestabilidad inherente de los virus como entidades
biológicas; (d) varios materiales disueltos y suspendidos en el agua y aguas residuales que
interfirieren con los procedimientos de detección de virus; y (e) las limitaciones actuales de
métodos de estimación e identificación de virus.

Selección del método de concentración

Las densidades de los virus entéricos en el agua y las aguas residuales suelen ser muy bajas
que la concentración de virus necesaria, excepto posiblemente para las aguas residuales sin
tratar en ciertas áreas o estaciones. Numerosos métodos para concentrar en el agua virus
entéricos se han propuesto, probando en condiciones de laboratorio con muestras
experimentales contaminadas y, en algunos casos, utilizadas para detectar virus bajo
condiciones de campo.
Los métodos de concentración de virus a menudo son capaces de procesar solo limitados
volúmenes de agua de una calidad dada. Al seleccionar un método de concentración de virus
se debe considerar la densidad probable del virus, las limitaciones de volumen de la
concentración según el método para el tipo de agua y la presencia de constituyentes
interferentes. Un volumen de muestra de menos de un litro y posiblemente tan pequeño como
unos pocos mililitros, pueden ser suficientes para la recuperación de virus de tratamiento
primario o sin procesar de aguas residuales. Para el agua potable y otras aguas relativamente
no contaminadas, es probable que los niveles del virus sean tan bajos que cientos o quizás
miles de litros deban ser muestreados para aumentar la probabilidad de detección de virus.
Actualmente, el método de elección para concentrar los virus a partir del agua es la técnica de
adsorción/elución (APHA, 1998). Esto implica el paso de agua a través de un filtro al que se
adsorben los virus y, posteriormente, se eluyen (desabsorben) los virus fuera del filtro
utilizando una suspensión de uno o dos litros del 1,5%. extracto de carne de res.
Se usan dos tipos de sistemas de filtrado y ambos tienen ventajas y desventajas.
Se ha demostrado que los filtros electronegativos tienen una mayor capacidad para adsorción
de virus en aguas con alta turbiedad y materia orgánica, pero requieren la adición de AlCl 3 y
la acidificación del agua a pH 3.5 para obtener la adsorción máxima de los virus al filtro. Esto
puede ser engorroso ya que requiere modificar la muestra de agua antes de filtrar (adición de
AlCl3) y materiales y equipos adicionales (medidores de pH). También requiere un amplio
entrenamiento y experiencia para el uso apropiado.
Los filtros electropositivos no requieren ningún preacondicionamiento de agua, pero pueden
obstruirse más fácilmente, y pueden no ser tan eficientes para aguas residuales crudas y otras
aguas con alto contenido de materia orgánica. No pueden utilizarse con aguas con un pH
superior a 8,5-9,0. También puede utilizarse un prefiltro para aumentar la capacidad de los
filtros de virus, pero debe eluirse y procesarse de la misma manera que los filtros de
adsorción de virus.
Página 3 | 8
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

El filtro electronegativo más utilizado es el Filterite®. Generalmente se usa como un cartucho

plisado de 10 pulgadas (25,4 cm) en una clasificación de poro de 0,22 mm o 0,45 mm (Gerba
et al., 1978). El VDS 1 MDS electropositivo está especialmente fabricado para la adsorción
de virus del agua.
Una vez que los virus se eluyen de los filtros, se concentran (reconcentrados) a un volumen
más pequeño (generalmente 20-30 ml) antes del ensayo en cultivo de células animales. El
procedimiento completo para concentrar virus del agua se muestra en la Figura 20-1.

Página 4 | 8
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

FIGURA 20-1 Procedimiento para la concentración y detección de virus en el agua.

Los virus entéricos humanos se detectan y cuantifican por sus efectos en las monocapas de
células derivadas de tejidos humanos o animales. Los enterovirus, reovirus y adenovirus
destruyen las células y muestran un efecto citopatógeno (CPE). Otros virus pueden crecer en
las células, pero no causan CPE. Otros virus, como Norwalk, todavía no se pueden cultivar en
cultivos celulares.

20.3. PROCEDIMIENTO
Materiales
Equipo de concentración de virus como se muestra en la figura 20-1 (a efectos de
demostración).
Cultivos celulares infectados con el virus de la polio tipo 1 (cepa de la vacuna LSc) en un
matraz de cultivo.
Microscopio de luz invertida.
El equipo y los procedimientos para la concentración de virus entéricos del agua serán
demostrados por el instructor:

Procedimientos de recolección y filtrado

1. Conecte el alojamiento del filtro directamente a un grifo o bomba directamente desde
la instalación de retención de agua (pasos 1A y 1B).

2. Si es necesario declorar, agregue tiosulfato sódico en línea (0.4 ml gal -1 (0.1 ml L-1) de
una solución al 10%) con la ayuda de un inyector en línea o una bomba dosificadora
(paso 1B). la muestra también se puede recoger en recipientes de plástico grandes y
declorar como se describe para los filtros electronegativos.

3. Coloque el filtro de cartucho 1 MDS en la carcasa, asegure y conecte todos los tubos.
El medidor de flujo debe colocarse después del filtro. Se puede usar un filtro previo
Filterite® si es necesario (tamaño de poro de 3 mm), conectado antes del filtro de
adsorción de virus.

4. Comience a bombear un caudal entre 5-10 gal min-1 (19-38 L min-1).

5. Después de filtrar el volumen deseado, coloque inmediatamente el filtro a 4 °C o en

hielo y envíe al laboratorio para su procesamiento o eluya el filtro en el campo. A
diferencia de los filtros electronegativos, que deben enviarse congelados, los filtros
electropositivos pueden mantenerse a 4 °C durante hasta 3 días antes de la elución de
los virus adsorbidos (Sobsey y Glass, 1980).

Página 5 | 8
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

Manejo y Desinfección de Equipos

6. Antes de su uso o envío, las botellas de recolección y/u otras piezas de plástico deben
esterilizarse en autoclave.

7. Los materiales que no se pueden esterilizar en autoclave, como las mangueras, la

carcasa del filtro, los contadores de agua y las bombas, deben estar expuestos a 10 mg
L-1 de cloro libre durante 30 minutos. Las sondas de pH se desinfectan colocando en
HCl 1 M durante 10 minutos.

8. Después del muestreo, todo el equipo debe desinfectarse mediante la exposición a 10-
15 mg L-1 de cloro (en forma de NaOCl) durante 30 minutos y luego declorarse
mediante la adición de tiosulfato de sodio suficiente para neutralizar el cloro libre
restante.

9. Los caudalímetros deben colocarse aguas abajo de los alojamientos del filtro (pasos
1A y 1B).

Transporte de Filtros y Efluentes

10. Los filtros pueden dejarse en el portafiltros o pueden colocarse en una bolsa de
plástico con cierre para enviar. Los filtros electrofisiológicos (1 MDS Virozorb®) se
deben enviar a 4 °C para evitar la muerte significativa de los virus. Los filtros
electropositivos deben eluirse dentro de las 48-72 h posteriores a la recolección
(Sobsey y Glass, 1980).

11. Los eluidos del filtro pueden enviarse o almacenarse en hielo a 4 °C hasta que el
laboratorio los reciba. Deben mantenerse por más de 72 horas a esta temperatura antes
de congelarlos y almacenarlos a -1 °C o menos. Las muestras pueden congelarse y
enviarse en hielo seco. Las muestras congeladas pueden conservarse indefinidamente.

Procedimientos de laboratorio para el aislamiento del virus

Cuando se lleva una muestra de agua al laboratorio, el procesamiento adicional de la muestra
del virus se logra a través de la elución, reconcentración, clarificación y análisis del cultivo
celular. A veces, el paso de elución debe llevarse a cabo en el campo. El análisis de
laboratorio puede tardar de dos a cuatro semanas en completarse. A continuación, se incluye
una breve descripción de cada paso.

Filtro de elución
12. El agua residual se elimina del filtro mientras está en el soporte.

Página 6 | 8
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

13. Un litro de extracto de carne al 1,5%, con glicina 0,05 M a un pH de 9.5, se agrega al
portafiltro y pasa a través del filtro aplicando presión de aire. Esto eluye el virus del
filtro (paso 2, Figura 20-1).

14. El eluido se ajusta inmediatamente a un pH neutro con 1M HCl. El pH del eluido

debe ajustarse inmediatamente después de la elución para evitar la inactivación del
virus debido al alto pH del eluyente.

Filtro efluente reconcentración y aclaración

15. El eluido de un litro se reconcentra mediante la precipitación de las proteínas y el
virus con ácido, seguido de la centrifugación (paso 3, Figura 20-1).

16. El precipitado de la centrifugación se vuelve a suspender en 20-30 ml de tampón a un

pH de 8-10.

17. Las bacterias se eliminan mediante centrifugación a baja velocidad y tratamiento con
antibióticos, si es necesario.

18. La muestra final se lleva a un pH neutro.

Análisis de efluente en cultivo celular

19. La línea celular estándar utilizada para analizar muestras ambientales de enterovirus
es la línea celular del riñón del mono verde de Búfalo (BGM). Las células se
convierten en monocapas confluentes en frascos de plástico (paso 4, Figura 20-1).

20. Las células se examinan durante 14 días para detectar la destrucción celular (ECP,
efecto citopatógeno) causada por el virus. Cualquier frasco positivo se confirma
mediante pasajes a las células frescas y el subsiguiente ECP. Deberá analizarse al
menos la mitad de la muestra reconcentrada.

21. Los enterovirus suelen cuantificarse por el método del número más probable (NMP),
similar a las bacterias coliformes, o por el método de la unidad formadora de placa
(PFU). En el método PFU, la monocapa celular se cubre con agar y se expone a un
colorante que sólo tiñe las células vivas. Las células muertas por virus producen zonas
claras o placas en la monocapa.

Examen de cultivo celular

Su asignación
22. Cada estudiante examinará cultivos celulares que han sido infectados con el
poliovirus tipo 1 LSc (la cepa de la vacuna) bajo un microscopio de luz invertida.
Compare la monocapa de células infectadas con una monocapa de células no
infectadas. Registre sus observaciones.
Página 7 | 8
 Detección de virus entéricos en el agua | Walter Tapia Flores

20.4. PREGUNTAS Y PROBLEMAS

1. ¿Qué tipo de enfermedades son causadas por virus entéricos?

2. ¿Por qué es importante detectar pequeños números de virus entéricos en grandes

volúmenes de agua?

3. ¿Por qué los virus se adsorben a los filtros electropositivos?

4. ¿Qué es CPE?

5. ¿Qué es un virus entérico?

6. ¿Por qué se utiliza el extracto de carne de res para concentrar los virus del agua?

20.5. REFERENCIAS
APHA (1998) Métodos estándar para el examen de agua y aguas residuales. 20ª edición.
Asociación Americana de Salud Pública. Washington DC.
Dahling, D.R., y Wright, B.A. (1984). Procesamiento y transporte de muestras de virus
ambientales. Microbiología Aplicada y Ambiental 47, 1272-1276.
Gerba, C.P., Farrah, S.R., Goyal, S.M., Wallis, C. y Melnick, J.L. (1978) Concentración de
enterovirus a partir de grandes volúmenes de agua del grifo, aguas residuales tratadas y agua
de mar. Microbiología Aplicada y Ambiental 35, 540-548.
Katznelson, E., Fattal, B., y Hostovesky, T. (1976) Floculación orgánica: y método eficiente
de concentración en el segundo paso para la detección de virus en el agua del grifo.
Microbiología Aplicada y Ambiental 32, 638-639.
Payment, P. y Trudel, M. (1981) Método mejorado para el uso de inyectores proporcionales
para acondicionar grandes volúmenes de agua para el análisis virológico. Canadian Journal of
Microbiology 27, 455-457.
Sobsey, M.D., y Glass, J.S. (1980) Concentración de poliovirus a partir de agua del grifo con
filtros adsorbentes electropositivos. Microbiología Aplicada y Ambiental 40, 201-210.

Página 8 | 8