Ensayo justificatorio 2

Una de mis razones principales por la cual quiero estudiar la maestría en química en su
universidad, es mi curiosidad por aprender nuevas técnicas químicas que tal vez no haya
abarcado en mi pregrado, además aprender con más certeza temas todavía inmaduros para mí, y
de tener la posibilidad de tener contacto con nuevas instalaciones y equipo que aún no domino o
que desconozco.

Otras de las razones por la cual me motivo a estudiar su maestría en química, es mi deseo de
continuar con la línea de estudio en la que realice mi trabajo de grado para el pregrado, en el cual
se trataban temas de medioambiente, química analítica y algo de biotecnología.

No obstante, unas de mis principales razones es el conocer una cultura e idioma completamente
diferente, ya que eso implica un reto y por supuesto eso me incentiva más a conocer sus zonas
campesinas y aplicar lo aprendido en muestreo y análisis de suelos con los diferentes
contaminantes, y por qué no, con diferentes técnicas que puedo aprender y las aprendidas.

DESCRIPCCION DEL PROYECTO

Mi idea de investigación para optar a este posgrado es cuantificación de contaminantes y

Biorremediación bacteriana en suelos contaminados con compuestos orgánicos altamente tóxicos
(OF’S, OC’S Y HAP’S) Con esta propuesta de investigación se busca resaltar la alta problemática
que vive hoy día la agricultura en américa latina, producto de la tala, la desforestación, el arado y
riego de pesticidas en suelos potencialmente cultivables, sumado al lamentable hecho de la poca
tecnificación para la producción en masa de los alimentos de origen natural.

RESUMÉN DEL PROYECTO.

RESUMÉN
Con esta propuesta de investigación se busca resaltar la alta problemática que vive hoy día la
agricultura en sur america, producto de la tala, la desforestación, el arado y riego de pesticidas en
suelos potencialmente cultivables, sumado al lamentable hecho de la poca tecnificación para la
producción en masa de los alimentos de origen natural.Este proyecto de investigación consistirá
en la cuantificación de contaminantes (OF’s, OC’s y HAP’s ) y una vez identificado los niveles
de cuantificación, la biorremediacion de suelos destinados a la agricultura que a su vez han
pasado también por un proceso de arado o quema de la tierra para la iniciación de un cultivo, a
partir de la biodegradación realizada por las bacterias nativas presentes en las zonas de muestreos
realizados en la región caribe a partir de técnicas bioquímicas, Microbiológicas y de biología
molecular Empleando una metodología de aislamiento e identificación de cepas bacterianas en
las muestras de suelos contaminados, para posteriormente realizar ensayos de crecimiento y
degradación con bioestimulacion, aplicando concentraciones conocidas un selecto grupo de
estándares de OF’s, OC’s y HAP’s.

BREVE INTRODUCCIÓN JUSTIFICATORIA.

Como su nombre lo menciona, biorremediación significa "dar remedio" a cualquier individuo o

ecosistema mediante técnicas biológicas y microbiológicas, por lo que una definición acertada de
biorremediación sería: el conjunto de técnicas que permiten resolver problemas de contaminación
mediante el uso de microorganismos (bacterias, algas unicelulares, etc. (Garbisu C; et al., 2002),
hongos, plantas o enzimas derivadas de ellos (Maroto M; et al., 2000). Basándonos en este
proyecto de investigación la biorremediación se aplica a suelos u otros sistemas contaminados
con compuestos orgánicos altamente tóxicos, para este caso, hablamos de los plaguicidas de
característica organoclorado y organofosforado y de los llamados hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP o PAH siglas en inglés, polyciclic aromatic hydrocarbons) (Jonsen; et al.,
2006), por un lado, los plaguicidas organofosforados constituyen un grupo heterogéneo con
estructuras químicas derivadas del ácido fosfórico, específicamente son ésteres de este ácido,
dentro de sus principales propiedades fisicoquímicas encontramos que son mayormente
liposolubles y medianamente volátiles (Henao ; et al.;2014 ), lo que le permite a este grupo de
plaguicidas presentar altos niveles de toxicidad y bioacumulación en las cadenas tróficas. Por
otro lado tenemos a los plaguicidas organoclorados, los cuales se caracterizan principalmente por
ser compuestos químicos de bajo peso molecular que tienen en su estructura átomos de cloro
(Wilkinson; 1976, et al., Harris; 2003), y que debido a sus propiedades y características
fisicoquímicas (Liposolubles, bioacomulables, de amplio espectro y buen exterminante de plagas)
(Harner &Wideman; 1999) están escalonados como los plaguicidas más tóxicos para el
tratamiento de cultivos. Estos plaguicidas (OC’s y OF’s) han sido estudiados a nivel mundial y
por ello se ha tratado de profundizar acerca propiedades toxicas y capacidad de afección en los
seres vivos y animales, tales como el ganado, para el control de plagas y de forma indirecta para
el hombre por medio del consumo de alimentos que han sido tratados por estos compuestos
(Eddleton et al., 2012, Menezez et al., 2010, Cycon et al., 2013).

Por otro lado tenemos los HAP’s, son compuestos que se generan por la combustión incompleta
de combustibles fósiles, por causas naturales y en mayor medida, antrópicas. Si tenemos en
cuenta que el sustento del sistema energético mundial son los combustibles fósiles, podemos
hacernos una idea de la relevancia y elevada presencia de estos compuestos en la vida cotidiana.
Considerando sus complejas propiedades y su carácter perjudicial para el ser humano y los
ecosistemas (Internacional Agency for Research on Cancer, 1972-1990), los HAP’s suscitaron
una creciente preocupación a partir del pasado siglo, siendo los primeros carcinógenos
ambientales reconocidos (Haritash & Kaushik, 2009). Ésto, dio lugar a numerosos estudios
científicos con el objetivo de determinar sus efectos en el medio y el ser humano, así como a la
búsqueda de soluciones para su eliminación.Con base a toda la problemática creciente, cuyo
impacto a perturbado las zonas agropecuarias, se hace necesario buscar técnicas que no alteren la
biota y la micro biota involucrada en la agricultura, por lo que se recurre a la degradación
bacteriana frente a muchas otras técnicas de eliminación de contaminantes (técnicas físicas y/o
químicas).Por tal razón se buscan técnicas analíticas que permitan la eficaz cuantificación de
estos contaminantes y a su vez dar reporte del nivel de contaminación presente en la zona.

La biorremediación presenta una característica clave que la hace destacar sobre las otras técnicas
y es que se basa en procesos que respetan el medio perturbado y permiten, en la medida de lo
posible, su recuperación.(Gonzalez N; et al., 2011)

OBJETIVOS

 Cuantificar en los suelos muestreados los niveles contaminantes de OC’s, OF’s y HAP’s.
 Aislar e identificar por medio de técnicas asociadas a la biología molecular, las cepas
bacterianas provenientes de los suelos muestreados en la zona agropecuaria colombiana
más resaltante.
 Bioestimular químicamente la cepas procedentes de los suelos y comparar su capacidad
degradadora, frente a cepas certificadas inoculadas con distintos grados de
contaminación (OC’s, OF’s y HAP’s) y con diversas técnicas de biorremediacion
(bioaumento y atenuación natural).
  Evaluar la eficacia de las cepas bacterianas tanto en la eliminación del contaminante y la
toxicidad, como en su capacidad para recuperar algo de su ecosistema implicado.

MARCO TEORICO: Los pesticidas son definidos como cualquier sustancia o mezcla de sustancias
destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga incluyendo los vectores de enfermedades
humanas o de enfermedades animales (FAO 1990 & FAO 2015), estos a su vez poseen la capacidad de
matar repeler, atraer o interrumpir el crecimiento de seres vivos o microorganismos considerados
perjudiciales tanto para la elaboración como para la producción alimenticia (Baird; 2001). El término
plaguicida incluye además, todas las sustancias destinadas a ser utilizadas como reguladoras del
crecimiento de las plantas, exfoliantes (Provocan la caída de las hojas o follaje de las plantas,
generalmente para facilitar la cosecha), desecantes (promueven la deshidratación de tejidos vivos, como
insectos o partes específicas de una planta .), agentes para reducir la densidad de fruta, o evitar su caída
prematura, y todas las sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger al
producto contra su deterioro durante su crecimiento. (CICOPLAFEST, 2008).
La propiedades químicas de los plaguicidas difieren de un grupo a otro, sin embargo sus
características generales poseen grandes similitudes entre sí, como la liposolubilidad, la
capacidad para bioacomularse etc. (Tian Y, et al., 2008). La liposolubilidad de estos compuestos
facilita su absorción porque atraviesan las barreras biológicas (piel, mucosas), también penetran
el sistema nervioso central y algunos pueden almacenarse en los tejidos provocando toxicidad
retardada debido a la liberación tardía, su mediana presión de vapor permite que sean
semivolatiles y que puedan ser absorbidos por vías respiratorias, sufren hidrolisis alcalina en la
tierra y en líquidos biológicos, no siendo persistentes en el ambiente (Carmona & Carmona
2005).
Por otra parte los HAP’s se pueden clasificar en función del número de anillos bencénicos: en
HAP’s de bajo peso molecular (menos de tres anillos donde solo entran HAP´s como el
naftaleno, fenantreno y antraceno) (Cerniglia, 1984, 1992) y de alto peso molecular y por tanto,
su destino en el medioambiente, depende del número de anillos aromáticos que lo componen y de
su tipología molecular (Kanaly & Harayama, 2000). En general, a medida que aumenta su
tamaño, peso molecular y angularidad, aumenta su hidrofobicidad y estabilidad electroquímica
(Zender,1983). Los PAH’s suelen estár presentes como constituyentes naturales de los
combustibles fósiles y se forman durante la combustión incompleta de la materia orgánica. Las
fuentes naturales de producción de HAP’s son los incendios forestales y de pastizales,
yacimientos de petróleo o erupciones volcánicas (Haritash & Kaushik, 2009). Sin embargo, las
fuentes antrópicas son las que más contribuyen a su formación mediante la quema de
combustibles fósiles con fines energéticos, en el tratamiento de la madera con creosota, mediante
el uso de lubricantes y en el refino del petróleo y actividades de transporte (Lee et al., 1981).
Los HAP’s ’s debido a su naturaleza lipofílica tienen un elevado potencial de bioacumulación en
la cadena trófica, fenómeno conocido como biomagnificación (Clements et al., 1994). Se sabe
que los HAP ejercen un acusado efecto tóxico y poseen propiedades mutagénicas, teratogénicas y
en algunos casos, carcinogénicas (Internacional Agency for Research on Cancer, 1972-1990).
Así mismo los plaguicidas también poseen alta toxicidad como los de característica
organoclorada, donde la acción tóxica principal tiene lugar sobre el sistema nervioso, tanto
central como periférico, dando lugar a una estimulación del mismo, por mecanismos no del todo
conocidos, aunque parece jugar un papel importante la inhibición de la Ca,Mg-ATPasa y un
bloqueo (antagonismo) del receptor del GABA, neurotransmisor inhibidor.

Asi mismo, los de característica organofosforada reaccionan con la zona esterasica de la enzima
(esterasas, transferasas, ubicadas principalmente en el higado.) formando una unión estable que si
no se rompe mediante tratamiento, se hace irreversible, quedando la enzima inhabilitada para
ejercer su función normal. La pérdida de dicha función permite la acumulación de la Acetilcolina
(ACh) en las uniones colinérgicas neuroefectoras (efectos muscarinicos), en las uniones
mioneurales del esqueleto y los ganglios autónomos (efectos nicotínicos) y en el sistema nervioso
central (SNC) (Carmona & Carmona, 2005; Carson & Harris, 2008, Fernández et al. 2010)

También, Es de suma importancia decir que entre las diversas técnicas de separación de mezclas,
la más utilizada por su capacidad para separar mezclas complejas de una manera eficaz es la
cromatografía. Este proceso consiste en una muestra que se desplaza a través de una fase móvil
(por ejemplo un gas) la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria, esta última fijada en
una columna o superficie. Para la escogencia de estas fases hay que tener en cuenta que no sean
miscibles y que los componentes de la muestra se distribuyan de forma distinta entre estas dos.
Las interacciones de los compuestos con la fase estacionaria es un factor decisivo para la
separación, es decir, aquellos que sean más a fin con la fase estacionaria van a ser más retenidos
y por ende tardan más tiempo en ser detectados (denominado tiempo de retención), mientras que
los de poca atracción por esta fase muestran preferencia por la móvil produciéndose así la elución
deseada (Skoog, 2011).Tras haber pasado por la columna cromatografía los compuestos según el
tiempo de interacción, van llegando al detector (alta sensibilidad) el cual responde a la
concentración del soluto y registra su señal en función del tiempo, formando una especie de
grafico llamado cromatograma, este último permite hacer análisis cualitativos y cuantitativos
sobre los analitos (Skoog, 2011).

BIORREMEDIACION :Es una rama de la biotecnología que busca resolver los problemas de
contaminación mediante el uso de microorganismos capaces de degradar compuestos que
provocan desequilibrios en el medio ambiente tales como: Hidrocarburos, PCB’s, Metales
pesados, pesticidas, entre otros (Tirado & Vasquez 2005). Usualmente, se asocia la
contaminación con un proceso negativo para los organismos, sin embargo, desde el punto de vista
bacteriológico, ésta promueve el crecimiento de agentes microbiológicos que emplean los
compuestos químicos para la nutrición y crecimiento de las colonias (Cosimi, et al., 2009). Este
aprovechamiento de los recursos es posible gracias al empleo de enzimas específicas
involucradas en el metabolismo aerobio o anaerobio de las bacterias generando tasas de reacción
más rápidas y mejorando los procesos de degradación de los agentes contaminantes (Rona &
Rosenmerg, 2002; Ezezika & Singer, 2010; Ezezika & Singer, 2010).
El proceso de degradación se lleva a cabo mediante el aprovechamiento de las características de
los microorganismos a utilizar: (Tamaño, distribución, versatilidad enzimática, especificidad, tasa
de crecimiento). la biorremediación bacteriana ha sido estudiada desde hace más de tres décadas,
obteniendo una buena acogida puesto que fue verificada la eficiencia de los microorganismos
para depurar diversas matrices contaminadas por diferentes sustancias dentro de las cuales se
encuentran los Plaguicidas (Oshiro, et al., 1996; Weber, 1994). Muchos han sido los estudios
relacionados con estos compuestos y muchos han sido los resultados favorables.

Hoy en día existe la necesidad de indagar en la búsqueda de procesos que aceleren la degradación
de los contaminantes presentes en el ambiente. Así, se reducirían de forma progresiva los efectos
perniciosos que producen sobre los ecosistemas y la salud humana. En este contexto, la
biorremediación, el cual es un proceso que utiliza las habilidades catalíticas de los organismos
vivos para degradar y transformar contaminantes tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos,
presenta un enorme potencial en la mitigación de la contaminación ambiental.
PROCESOS METODOLÓGICOS. Muestreo para la cuantificación: La toma de muestra
será realizada de acuerdo a lo descrito por Brady y Weil, 1999; y Blanco, 2003: tomar 3
muestras M1, M2 y M3, cada una de 13 submuestras .Las submuestras serán recogidas en zigzag,
a una profundidad de 0-20cm. Una vez tomadas serán mezcladas, almacenadas en cartuchos de
aluminio e introducidas en un congelador.

Aislamiento de cepas bacterianas nativas de suelos de cultivo: Se diluirá 10 g de suelo

homogenizado en 100 mL de medio mínimo esterilizado (MSM) que contiene en gL-1 (Na2HPO4,
5.8; KH2PO4, 3.0; NaCl, 0.5; NH4Cl, 1; MgSO4, 0.25 y pH 6.8–7.0), posteriormente una alícuota
de 1 mL es transferido a un Erlenmeyer de 50 mL que contiene 10 mL de medio mínimo y 50
mg/L del compuesto OC’s de mayor presencia en los suelos de cultivo, cada tratamiento se le
harán cinco diluciones de (1:10; v/v), se incubarán por cinco días a 30 °C y agitación de 160 rpm,
después cada dilución será transferida a MSM en agar con 50 mg/L de OC’s e incubada por 5 – 7
dias a 30 °C, cada aislamiento será purificada en agar Luria Bertani (LB).

Identificación bioquímica y biomolecular de cepas aisladas: Se tomarán colonias

representativas y se les realizarán pruebas bioquímicas convencionales (Tincion de Gram,
Oxidasa, Catalasa, Movilidad, etc) para su identificación, a su vez se le realizarán identificación
por medio pruebas bioquímicas y biomoleculares especializadas, por medios de equipo como
PCR, para así poder obtener el árbol filogenético.

Sometimiento de bacterias aisladas para verificar su capacidad degradadora de

contaminantes en medio líquido: En un recipiente que contiene 10 mL de MSM y 50 mg/L de
OC’s , OF’s Y HAP’s de mayor presencia en suelos de cultivo será inoculado 100 μL de una
suspensión de células previamente preparada, se incubarán a 30 °C con agitación de 160 rpm y
cada 24 horas serán sometidas a cromatografía de gases (GC/ECD) para cuantificar los
compuestos contaminantes a lo largo del tiempo; además el crecimiento bacteriano será medido
y la degradación será monitoreada mediante UV-VIS a 600nm y 278 nm respectivamente.

También es vital recalcar que lo anteriormente descrito será realizado con blancos y testigos para
garantizar la confiabilidad de los resultados y los ensayos serán efectuados por triplicado como
medida de control y para obtener datos estadísticamente significativos, además de que se
realizaran otros tipos de estudios tentativos (pruebas fisicoquímicas del suelo) para poder
optimizar el trabajo su mayor rendimiento.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.

Periodo de tiempo (Meses)

6 8 9 10 1 12 1 1
Actividades 2 4
1
13 14
5
16 17 18
9
20 22 24

Revisión bibliográfica.

Recolección de muestras de suelos de

cultivo.

Estandarización del método quechers ( por

la método mas actual)

Preparación de las muestras y extracción de

los contaminantes OC’s, OF’s y HAP’s.

Cuantificación de los contaminantes

presentes en suelos de cultivo agrícola.

Aislamiento de cepas nativas con capacidad

degradadora de contaminantes

Verificación de la capacidad degradadora de

las cepas en medio líquido y en suelos (ex
situ)

Análisis de resultados.

Preparación de la publicación.

Entrega de informe final.

REFERENCIAS BIBILOGRAFICAS

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