Una de mis razones principales por la cual quiero estudiar la maestría en química en su

universidad, es mi curiosidad por aprender nuevas técnicas químicas que tal vez no haya
abarcado en mi pregrado, además aprender con más certeza temas todavía inmaduros para mí, y
de tener la posibilidad de tener contacto con nuevas instalaciones y equipo que aún no domino o
que desconozco.

Otras de las razones por la cual me motivo a estudiar su maestría en química, es mi deseo de
continuar con la línea de estudio en la que realice mi trabajo de grado para el pregrado, en el cual
se trataban temas de medioambiente, química analítica y algo de biotecnología.

No obstante, unas de mis principales razones es el conocer una cultura e idioma completamente
diferente, ya que eso implica un reto y por supuesto eso me incentiva más a conocer sus zonas
campesinas y aplicar lo aprendido en muestreo y análisis de suelos con los diferentes
contaminantes, y por qué no, con diferentes técnicas que puedo aprender y las aprendidas.

Siempre me ha causado gran interés la rama medioambiental, es por eso que mi temática central
podría estar relacionado estrechamente con el medio ambiente o la biotecnología, ya que quiero
realizar estudios de suelos, para la cuantificación de pesticidas y Pha’s presentes, y la
degradación de estos contaminantes con las bacterias nativas del suelo o muestra estudiada.

DESCRIPCCION DEL PROYECTO

Mi idea de investigación para optar a este posgrado es Biorremediación bacteriana en suelos

contaminados con compuestos orgánicos altamente tóxicos (OF’S, OC’S Y HAP’S) Con esta propuesta
de investigación se busca resaltar la alta problemática que vive hoy día la agricultura en américa
latina, producto de la tala, la desforestación, el arado y riego de pesticidas en suelos
potencialmente cultivables, sumado al lamentable hecho de la poca tecnificación para la
producción en masa de los alimentos de origen natural .

Este proyecto de investigación consistirá en la biorremediacion de suelos destinados a la

agricultura que a su vez han pasado también por un proceso de arado o quema de la tierra para la
iniciación de un cultivo, a partir de la biodegradación realizada por las bacterias nativas presentes
en las zonas de muestreos realizados en la región rural que se emplee por medio de técnicas
bioquímicas, Microbiológicas y de biología molecular Empleando una metodología de
aislamiento e identificación de cepas bacterianas en las muestras de suelos contaminados, para
posteriormente realizar ensayos de crecimiento y degradación con bioestimulacion, aplicando
concentraciones conocidas un selecto grupo de estándares de OF’s, OC’s y HAP’s.

Por su ubicación geográfica, el país brasileño tiene una enorme diversidad climática y por tanto,
tiene selvas, llanuras, desiertos, alta montaña, paramos, altiplanicie entre otros. Gracias a esto es
rico en recursos naturales y tiene una gran diversidad de productos agropecuarios.

La región amazónica de Brasil es conocida por ser altamente rica en flora y fauna así como de la
múltiple diversidad de su agricultura y ganadería, por lo cual esto hace de esta región un lugar
idóneo para las practicas agropecuarias y por tanto se intensifica la hipótesis de que sus suelos de
cultivo estén potencialmente contaminados con estos compuestos orgánicos persistentes o
tóxicos.

OBJETIVOS

 Aislar e identificar por medio de técnicas asociadas a la biología molecular, las cepas
bacterianas provenientes de los suelos muestreados en las zonas agropecuarias que estén
presentes en las regiones aledañas.
 Bioestimular químicamente la cepas procedentes de los suelos y comparar su capacidad
degradadora, frente a cepas certificadas inoculadas con distintos grados de
contaminación (OC’s, OF’s y HAP’s) y con diversas técnicas de biorremediacion
(bioaumento y atenuación natural).
 Evaluar la eficacia de las cepas bacterianas tanto en la eliminación del contaminante y la
toxicidad, como en su capacidad para recuperar algo de su ecosistema implicado.

MARCO TEORICO

Los pesticidas son definidos como cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a
prevenir, destruir o controlar cualquier plaga incluyendo los vectores de enfermedades humanas o
de enfermedades animales (FAO 1990 & FAO 2015), estos a su vez poseen la capacidad de matar
repeler, atraer o interrumpir el crecimiento de seres vivos o microorganismos considerados
perjudiciales tanto para la elaboración como para la producción alimenticia (Baird; 2001). El
término plaguicida incluye además, todas las sustancias destinadas a ser utilizadas como
reguladoras del crecimiento de las plantas, exfoliantes (Provocan la caída de las hojas o follaje
de las plantas, generalmente para facilitar la cosecha), desecantes (promueven la deshidratación
de tejidos vivos, como insectos o partes específicas de una planta .), agentes para reducir la
densidad de fruta, o evitar su caída prematura, y todas las sustancias aplicadas a los cultivos antes
o después de la cosecha para proteger al producto contra su deterioro durante su crecimiento.
(CICOPLAFEST, 2008).
La propiedades químicas de los plaguicidas difieren de un grupo a otro, sin embargo sus
características generales poseen grandes similitudes entre sí, como la liposolubilidad, la
capacidad para bioacomularse etc. (Tian Y, et al., 2008). La liposolubilidad de estos compuestos
facilita su absorción porque atraviesan las barreras biológicas (piel, mucosas), también penetran
el sistema nervioso central y algunos pueden almacenarse en los tejidos provocando toxicidad
retardada debido a la liberación tardía, su mediana presión de vapor permite que sean
semivolatiles y que puedan ser absorbidos por vías respiratorias, sufren hidrolisis alcalina en la
tierra y en líquidos biológicos, no siendo persistentes en el ambiente (Carmona & Carmona
2005).
Por otra parte los HAP’s se pueden clasificar en función del número de anillos bencénicos: en
HAP’s de bajo peso molecular (menos de tres anillos donde solo entran HAP´s como el
naftaleno, fenantreno y antraceno) (Cerniglia, 1984, 1992) y de alto peso molecular y por tanto,
su destino en el medioambiente, depende del número de anillos aromáticos que lo componen y de
su tipología molecular (Kanaly & Harayama, 2000). En general, a medida que aumenta su
tamaño, peso molecular y angularidad, aumenta su hidrofobicidad y estabilidad electroquímica
(Zender,1983). Los PAH’s suelen estár presentes como constituyentes naturales de los
combustibles fósiles y se forman durante la combustión incompleta de la materia orgánica. Las
fuentes naturales de producción de HAP’s son los incendios forestales y de pastizales,
yacimientos de petróleo o erupciones volcánicas (Haritash & Kaushik, 2009). Sin embargo, las
fuentes antrópicas son las que más contribuyen a su formación mediante la quema de
combustibles fósiles con fines energéticos, en el tratamiento de la madera con creosota, mediante
el uso de lubricantes y en el refino del petróleo y actividades de transporte (Lee et al., 1981).
Los HAP’s ’s debido a su naturaleza lipofílica tienen un elevado potencial de bioacumulación en
la cadena trófica, fenómeno conocido como biomagnificación (Clements et al., 1994). Se sabe
que los HAP ejercen un acusado efecto tóxico y poseen propiedades mutagénicas, teratogénicas y
en algunos casos, carcinogénicas (Internacional Agency for Research on Cancer, 1972-1990).
Así mismo los plaguicidas también poseen alta toxicidad como los de característica
organoclorada, donde la acción tóxica principal tiene lugar sobre el sistema nervioso, tanto
central como periférico, dando lugar a una estimulación del mismo, por mecanismos no del todo
conocidos, aunque parece jugar un papel importante la inhibición de la Ca,Mg-ATPasa y un
bloqueo (antagonismo) del receptor del GABA, neurotransmisor inhibidor.

Asi mismo, los de característica organofosforada reaccionan con la zona esterasica de la enzima
(esterasas, transferasas, ubicadas principalmente en el higado.) formando una unión estable que si
no se rompe mediante tratamiento, se hace irreversible, quedando la enzima inhabilitada para
ejercer su función normal. La pérdida de dicha función permite la acumulación de la Acetilcolina
(ACh) en las uniones colinérgicas neuroefectoras (efectos muscarinicos), en las uniones
mioneurales del esqueleto y los ganglios autónomos (efectos nicotínicos) y en el sistema nervioso
central (SNC) (Carmona & Carmona, 2005; Carson & Harris, 2008, Fernández et al. 2010)

También, Es de suma importancia decir que entre las diversas técnicas de separación de mezclas,
la más utilizada por su capacidad para separar mezclas complejas de una manera eficaz es la
cromatografía. Este proceso consiste en una muestra que se desplaza a través de una fase móvil
(por ejemplo un gas) la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria, esta última fijada en
una columna o superficie. Para la escogencia de estas fases hay que tener en cuenta que no sean
miscibles y que los componentes de la muestra se distribuyan de forma distinta entre estas dos.
Las interacciones de los compuestos con la fase estacionaria es un factor decisivo para la
separación, es decir, aquellos que sean más a fin con la fase estacionaria van a ser más retenidos
y por ende tardan más tiempo en ser detectados (denominado tiempo de retención), mientras que
los de poca atracción por esta fase muestran preferencia por la móvil produciéndose así la elución
deseada (Skoog, 2011).

Tras haber pasado por la columna cromatografía los compuestos según el tiempo de interacción,
van llegando al detector (alta sensibilidad) el cual responde a la concentración del soluto y
registra su señal en función del tiempo, formando una especie de grafico llamado cromatograma,
este último permite hacer análisis cualitativos y cuantitativos sobre los analitos (Skoog, 2011).

BIORREMEDIACION
Es una rama de la biotecnología que busca resolver los problemas de contaminación mediante el
uso de microorganismos capaces de degradar compuestos que provocan desequilibrios en el
medio ambiente tales como: Hidrocarburos, PCB’s, Metales pesados, pesticidas, entre otros
(Tirado & Vasquez 2005).

Usualmente, se asocia la contaminación con un proceso negativo para los organismos, sin
embargo, desde el punto de vista bacteriológico, ésta promueve el crecimiento de agentes
microbiológicos que emplean los compuestos químicos para la nutrición y crecimiento de las
colonias (Cosimi, et al., 2009). Este aprovechamiento de los recursos es posible gracias al empleo
de enzimas específicas involucradas en el metabolismo aerobio o anaerobio de las bacterias
generando tasas de reacción más rápidas y mejorando los procesos de degradación de los agentes
contaminantes (Rona & Rosenmerg, 2002; Ezezika & Singer, 2010; Ezezika & Singer, 2010).

El proceso de degradación se lleva a cabo mediante el aprovechamiento de las características de

los microorganismos a utilizar: (Tamaño, distribución, versatilidad enzimática, especificidad, tasa
de crecimiento). la biorremediación bacteriana ha sido estudiada desde hace más de tres décadas,
obteniendo una buena acogida puesto que fue verificada la eficiencia de los microorganismos
para depurar diversas matrices contaminadas por diferentes sustancias dentro de las cuales se
encuentran los Plaguicidas (Oshiro, et al., 1996; Weber, 1994). Muchos han sido los estudios
relacionados con estos compuestos y muchos han sido los resultados favorables.

Hoy en día existe la necesidad de indagar en la búsqueda de procesos que aceleren la degradación
de los contaminantes presentes en el ambiente. Así, se reducirían de forma progresiva los efectos
perniciosos que producen sobre los ecosistemas y la salud humana. En este contexto, la
biorremediación, el cual es un proceso que utiliza las habilidades catalíticas de los organismos
vivos para degradar y transformar contaminantes tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos,
presenta un enorme potencial en la mitigación de la contaminación ambiental.

La biorremediación se ha centrado en la explotación de la diversidad genética y versatilidad

metabólica que caracteriza a las bacterias para transformar contaminantes en productos inocuos o,
en su defecto, menos tóxicos, que pueden entonces integrarse en los ciclos biogeoquímicos
naturales (Maroto M; et al., 2000).

PROCESOS METODOLÓGICOS.

Muestreo: La toma de muestra será realizada de acuerdo a lo descrito por Brady y Weil, 1999; y
Blanco, 2003: tomar 3 muestras M1, M2 y M3, cada una de 13 submuestras .Las submuestras
serán recogidas en zigzag, a una profundidad de 0-20cm. Una vez tomadas serán mezcladas,
almacenadas en cartuchos de aluminio e introducidas en un congelador.

Aislamiento de cepas bacterianas nativas de suelos de cultivo: Se diluirá 10 g de suelo

homogenizado en 100 mL de medio mínimo esterilizado (MSM) que contiene en gL-1 (Na2HPO4,
5.8; KH2PO4, 3.0; NaCl, 0.5; NH4Cl, 1; MgSO4, 0.25 y pH 6.8–7.0), posteriormente una alícuota
de 1 mL es transferido a un Erlenmeyer de 50 mL que contiene 10 mL de medio mínimo y 50
mg/L del compuesto OC’s de mayor presencia en los suelos de cultivo, cada tratamiento se le
harán cinco diluciones de (1:10; v/v), se incubarán por cinco días a 30 °C y agitación de 160 rpm,
después cada dilución será transferida a MSM en agar con 50 mg/L de OC’s e incubada por 5 – 7
dias a 30 °C, cada aislamiento será purificada en agar Luria Bertani (LB).

Identificación bioquímica y biomolecular de cepas aisladas: Se tomarán colonias

representativas y se les realizarán pruebas bioquímicas convencionales (Tincion de Gram,
Oxidasa, Catalasa, Movilidad, etc) para su identificación, a su vez se le realizarán identificación
por medio pruebas bioquímicas y biomoleculares especializadas, por medios de equipo como
PCR, para así poder obtener el árbol filogenético.

Sometimiento de bacterias aisladas para verificar su capacidad degradadora de

contaminantes en medio líquido: En un recipiente que contiene 10 mL de MSM y 50 mg/L de
OC’s , OF’s Y HAP’s de mayor presencia en suelos de cultivo será inoculado 100 μL de una
suspensión de células previamente preparada, se incubarán a 30 °C con agitación de 160 rpm y
cada 24 horas serán sometidas a cromatografía de gases (GC/ECD) para cuantificar los
compuestos contaminantes a lo largo del tiempo; además el crecimiento bacteriano será medido
y la degradación será monitoreada mediante UV-VIS a 600nm y 278 nm respectivamente.

También es vital recalcar que lo anteriormente descrito será realizado con blancos y testigos para
garantizar la confiabilidad de los resultados y los ensayos serán efectuados por triplicado como
medida de control y para obtener datos estadísticamente significativos, además de que se
realizaran otros tipos de estudios tentativos (pruebas fisicoquímicas del suelo) para poder
optimizar el trabajo su mayor rendimiento.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.
 Periodo de tiempo (Meses)

6 8 9 10 1 12 1 1
Actividades 2 4
1
13 14
5
16 17 18
9
20 22 24

Revisión bibliográfica.

Recolección de muestras de suelos de

cultivo.

Estandarización del método quechers ( por

la método mas actual)

Preparación de las muestras y extracción de

los contaminantes OC’s, OF’s y HAP’s.

Cuantificación de los contaminantes

presentes en suelos de cultivo agrícola.

Aislamiento de cepas nativas con capacidad

degradadora de contaminantes

Verificación de la capacidad degradadora de

las cepas en medio líquido y en suelos (ex
situ)

Análisis de resultados.

Preparación de la publicación.

Entrega de informe final.

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