Estructura de la población, perfil de resistencia a fungicidas múltiples 1 y frecuencia de

mutación sdhB de Botrytis cinerea de fresas y tomates cultivados en invernadero en Grecia.

Resumen
Botrytis cinerea es un patógeno con alta variabilidad genética que también ha mostrado un alto
riesgo de desarrollar resistencia a los fungicidas. En total, 1.169 aislamientos obtenidos de fresas (n
= 297) y tomates (n = 872) en cinco regiones geográficas de Grecia se analizaron para determinar su
sensibilidad a varios botricidas. Se encontró una alta frecuencia de aislamientos con resistencia
múltiple a carbendazim, ciprodinil, piraclostrobina y boscalid en aislamientos de fresa. En los
aislamientos de tomate, el fenotipo predominante fue el de resistencia dual a carbendazim y
ciprodinil en la isla de Creta, resistencia única a carbendazim en la región de Preveza y aislamientos
sensibles en la región de Kyparissia. Ninguno de los aislamientos probados fue resistente al
fludioxonil. Se observaron altas frecuencias de fenotipos resistentes a los boscálidos en los aislados
de fresa, mientras que la frecuencia de resistencia a los boscálidos en los aislados de tomate fue
menor. H272R fue la mutación sdhB predominante, asociada con la resistencia al boscalid, en todos
los aislamientos muestreados, mientras que otras mutaciones sdhB se encontraron a bajas
frecuencias. B. cinerea Grupo S, identificado por la presencia de una inserción de 21 pb en el gen
del factor de transcripción mrr1, predominaba dentro de los aislados de tomate obtenidos de las tres
regiones muestreadas con frecuencias que van del 62 al 75% de los aislados, mientras que dentro de
aislados de fresa, B. cinerea fue predominante con frecuencias de 75 a 95%. Las correlaciones del
genotipo de los aislamientos y el perfil de resistencia a los fungicidas mostraron que los
aislamientos de B. cinerea sensu stricto eran más propensos al desarrollo de resistencia al boscalid
en comparación con los aislamientos del grupo Botrytis S, lo que puede explicar el predominio
observado de B. cinerea sensu stricto en los campos de fresas.
Introducción
Botrytis cinerea Pers: el p. Es un hongo ubicuo que ataca a más de 200 especies de plantas en las
regiones templadas de todo el mundo. Es un patógeno vegetal necrotrófico y causa una enfermedad
conocida como moho gris. Todos los órganos de plantas sobre el suelo, incluidas las flores, hojas,
brotes y frutos, son susceptibles a B. cinerea (7).
B. cinerea es una especie de hongo heterogénea. Las principales fuentes de su variabilidad genética
incluyen: i) heterocariosis y el ciclo parasexual, ii) reproducción sexual y iii) elementos móviles
transponibles (5). Hasta finales de la década de 1990, B. cinerea se consideraba una sola especie
generalista. Sin embargo, la identificación de dos elementos transponibles, Boty y Flipper, dentro
del genoma fúngico condujo a una agrupación basada en la presencia o ausencia de estos elementos
transponibles (14). Más tarde, el hongo se agrupó en dos grupos diferentes, Grupo I y Grupo II,
según los polimorfismos de ADN revelados por los marcadores de microsatélites y el nivel de
sensibilidad al fungicida fenhexamida hidroxianilida (11,12). Recientemente, Botrytis Group I se
estableció como una nueva especie de hongo llamada B. pseudocinerea basada en estudios de
genealogía genética y compatibilidad sexual (39). Incluso más recientemente, Leroch et al. (23)
proporcionaron evidencia de la existencia de una subpoblación de B. cinerea principal, llamada
provisionalmente B. grupo de cinerea S. La diferenciación de B. cinerea sensu stricto y el grupo S
se basó en diferencias de patrones IGS-RFLP, diversidad de secuencias en varios genes. y
preferencias del anfitrión (23).
El control del moho gris se basa principalmente en el uso de fungicidas con un modo de acción
específico del sitio que pertenece a varias clases químicas como bencimidazoles (MBC),
dicarboximidas (DIC), hidroxianilidas (Hyds), anilinopirimidinas (AP), fenilpirrol (PP) ) e
inhibidores de la succinato deshidrogenasa (SDHI) que representan la última incorporación al grupo
de los botrticidas. Además de ellos, los inhibidores externos de quinona (QoI) muestran una acción
supresora contra el moho gris y la piractrostrobina se usa contra la enfermedad como socio del
boscalid SDHI en una mezcla preenvasada. Los inhibidores multisitio tales como clorotalonil,
diclorofluanida, iminactodina y captan se usan solo en mezclas de tanque 67 o en rotación con
inhibidores específicos del sitio ya que su eficacia en aplicaciones individuales es relativamente
baja. Sin embargo, B. cinerea es un patógeno clásico de "alto riesgo" y se ha informado sobre el
desarrollo de resistencia a la mayoría de las clases de fungicidas en todo el mundo (24). La
resistencia de B. cinerea a los fungicidas se asocia comúnmente con modificaciones en el sitio
objetivo que confieren niveles moderados o altos de resistencia. Una mutación G143A en el gen del
citocromo b se asocia con resistencia a QoIs (25,33), varias mutaciones en la histidina quinasa
osmosensible (Bcbos1) se asocian con resistencia a DIC (17,27), mutaciones en el gen 3-ceto
reductasa erg27 se asocia con resistencia a Hyds (10,16), y varias mutaciones en el gen de la
subunidad de la succinato deshidrogenasa B (sdhB) se asocian con resistencia a SDHI (25,36).
Además, se ha informado de niveles de resistencia bajos a moderados a varios grupos de botricidas
en aislamientos de viñedos de Alemania y Francia y campos de fresas en Alemania y EE. UU. Que
se asocian con la sobreexpresión de transportadores de eflujo (20,26,30). Los primeros estudios de
resistencia de B. cinerea informaron casos de desarrollo de resistencia a una sola clase química. Sin
embargo, en el pasado reciente, el número de informes de resistencia múltiple a diferentes clases
químicas asociadas con la acumulación de diferentes mutaciones en el sitio objetivo en las mismas
cepas, ha aumentado dramáticamente en todo el mundo, lo que representa una amenaza importante
para el control exitoso de la enfermedad (1, 4,6,23,41).
Los tomates y las fresas cultivados en invernadero que se cultivan en el campo bajo túneles de
plástico de gran altura representan dos cultivos de alto valor en Grecia que están fuertemente
tratados con botricidas. Hasta ahora, se sabe poco sobre la estructura genética de las poblaciones de
hongos de estos huéspedes en Grecia, mientras que la información sobre el perfil de resistencia a los
fungicidas se limita solo a la resistencia a SDHI / QoI en las poblaciones de fresa (33,36). Por lo
tanto, se inició un estudio para: a) investigar el perfil de resistencia a fungicidas de Botrytis spp.
poblaciones de fresas y tomates cultivados en invernadero en Grecia, b) determinan la frecuencia de
mutaciones sdhB asociadas con la resistencia al boscalid SDHI en las poblaciones de hongos, yc)
investigan la composición de la población de moho gris en términos de B. cinerea sensu stricto y B .
frecuencia del grupo S de cinerea dentro de las poblaciones recolectadas.
Materiales y métodos
Aislamiento de patógenos y antecedentes de aplicación de fungicidas en los sitios muestreados.
B. cinerea se aisló a partir de frutos de tomate enfermos cultivados en invernaderos y frutos de fresa
cultivados en túneles plásticos de plástico de gran altura. El muestreo para aislamientos de tomate
se realizó en tres regiones geográficamente distintas de Grecia (Preveza, Kyparissia e isla de Creta),
mientras que el muestreo para aislamientos de fresa se realizó en campos de fresas ubicados en 2
regiones del país (regiones de Manolada y Pieria), (Fig. 1 ) Los detalles relacionados con el número
de invernaderos o campos muestreados y el número total de aislamientos obtenidos se dan en la
Tabla 1.
El muestreo de los aislamientos de ambos huéspedes se realizó después del final del período de
pulverización durante la primavera de 2012. En las cinco regiones muestreadas, los fungicidas
pertenecientes a las clases de QoI, SDHI, AP, PP y DIC se utilizaron en esquemas de alternancia.
(Tabla 1). La hid fenhexamida y el metil tiofanato de metilbromuro se habían usado muy raramente
en algunos campos de la región de Pieria y / o Preveza. Los campos de fresas en la región de
Manolada fueron los más tratados con la mezcla preempaquetada de boscalid (SDHI) y
piractrostrobina (QoI) (Signum, BASF Hellas, Atenas, Grecia), mientras que la mezcla de ciprodinil
(AP) y fludioxonil (PP), (Switch, Syngenta Hellas, Atenas, Grecia) fue el fungicida más utilizado en
invernaderos de tomate en las regiones de Creta y Preveza (Tabla 1).
Todos los aislamientos fueron recolectados de fruta infectada mostrando abundante esporulación en
la superficie de la fruta podrida. Se obtuvieron esporas fúngicas de las lesiones de esporulación
utilizando hisopos de algodón estériles y luego se transfirieron a medio de agar dextrosa de papa
acidificado (APDA) (0,5 ml / litro de ácido láctico v / v) para suprimir las bacterias. Los fragmentos
individuales de micelio en crecimiento activo, observados bajo el microscopio, se transfirieron de
placas APDA a placas PDA nuevas y se incubaron a 20 ° C, en la oscuridad durante 1 semana. Los
cultivos se mantuvieron a 4 ° C hasta su uso.
Aislamiento de ADN e identificación de especies / grupos.
Para extraer el ADN, los aislamientos se cultivaron en caldo de dextrosa de papa (Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO) durante 3 días a 22o C. El micelio se cosechó por filtración, se secó, se liofilizó, se
trituró hasta un polvo fino usando micropestles (Eppendorf International, Wesseling, Alemania) y
almacenado a -20o C hasta su uso. El ADN se extrajo utilizando el kit QIA Puregene Core A
(QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración
de ADN extraído se midió usando un nanofotómetro P330 (Implen GmbH, Munich, Alemania).
La diferenciación de los aislamientos de moho gris en B. cinerea sensu stricto y B. cinérea group S
se basó en un ensayo de PCR desarrollado por Leroch et al. (23) El par de cebadores mrr1_spez_F
(TATCGGTCTTGCAGTCCGC) y mrr1_spez_R (TTCCGTACCCCGATCTTCGGAA) se utilizó
para detectar una inserción de 21 pb en el gen mrr1 que caracteriza a los aislamientos de B. cinerea
group S pero no a B. cinerea sensu stricto. Los reactivos de reacción de PCR y el protocolo de
amplificación fueron descritos por Leroch et al. (23). Las mezclas de reacción de PCR se incubaron
en un termociclador PTC 200 (MJ Research, Waltham, MA) y se verificó el tamaño de los
productos de PCR en geles de agarosa al 1,5% en tampón TBE, suplementado con bromuro de
etidio (0,1 μg / ml), por electroforesis y se observó bajo luz ultravioleta.
Determinación del perfil de resistencia a fungicidas.
El fenotipo de resistencia a fungicidas de los aislamientos recolectados se determinó utilizando
concentraciones discriminatorias de MBC carbendazim (Pacarzim 50WP, Papaoikonomou
Agrochemicals SA), AP cyprodinil (Chorus 50WG, Syngenta Hellas), PP fludioxonil (Geoxe
50WG, Syngenta Hellas), Hyd fenhexamida (Teldor 50 WG, Bayer Hellas), QoI pyraclostrobin 144
(BAS 500 06F 20EC, BASF Hellas) y el boscalid SDHI (Cantus 50WG, BASF Hellas). Se
prepararon suspensiones conidiales para cada aislado en agua estéril (2 x 105 conidios por ml).
Para determinar la sensibilidad de los aislados a carbendazim, fludioxonil, ciprodinil y
fenhexamida, se utilizó un protocolo previamente desarrollado (22,23). Se transfirieron veinte
microlitros de la suspensión conidial a medio HA (4 g de extracto de levadura, 4 g de glucosa, 10 g
de extracto de malta y 15 g de agar por litro de medio), (23), enmendado con 5, 0.8 y 3 μg / ml de
carbendazim, fludioxonil y fenhexamid, respectivamente o en medio Gamborg B5 (3 g Gamborg,
1.36 g KH2PO4, 9.9 g glucosa y 15 g agar por litro de medio, pH 5.5) (20), enmendado con 8 μg /
ml de ciprodinil. Después de 72 h de incubación a 20 ° C, en la oscuridad, los cultivos se
verificaron visualmente para detectar la presencia o ausencia de crecimiento micelial. Los
aislamientos que muestran un crecimiento visible de colonias miceliales donde se aplicó la
suspensión conidial se consideraron resistentes a los fungicidas.
Para determinar la sensibilidad a la piractrostrobina y al boscalid, se extendieron 40 μl de las
suspensiones conidiales en medio de agar con agua al 2% (+ 100 μg / ml de ácido
salicilhidroxámico) o medio de agar YBA (10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona Bacto, 20
g de sodio acetato y 15 g de agar por litro de medio), enmendado con 5 μg / ml de piraclostrobina o
2 μg / ml de boscalid, respectivamente. A estas concentraciones, la germinación conidial de
piractrostrobina o aislamientos sensibles a boscalidos se inhibe por completo como se muestra en
estudios previos de nuestro grupo (33,37). Después de 20 h de incubación a 20 ° C en la oscuridad,
los conidios se examinaron microscópicamente para determinar la germinación. Los aislamientos se
clasificaron como sensibles o resistentes en función de la presencia o ausencia de germinación
conidial. Un conidio se consideró germinado si el tubo germinal tenía al menos el doble de la
longitud del conidio.
Identificación de mutaciones sdhB.
La identificación de mutaciones sdhB se realizó en aislamientos que se encontró que eran
resistentes al boscalid, utilizando una técnica PIRA-PCR desarrollada previamente (36). La técnica
fue capaz de identificar 5 mutaciones diferentes de sdhB (H272L / R / Y, P225F y N230I) asociadas
con la resistencia al boscalid. Para este propósito, se usaron pares de cebadores no coincidentes
específicos para cada mutación (36). Se seleccionaron los desajustes para crear artificialmente sitios
de restricción HindIII, BamHI, BglII, HhaI y EcoRV durante la PCR para detectar mutaciones
P225F, N230I, H272L, H272R y H272Y, respectivamente.
Análisis de los datos.
Los datos se registraron como frecuencias (%) de aislamientos resistentes. La prueba de Chi
cuadrado se utilizó para comparar distribuciones de frecuencia entre grupos de datos. Las
proporciones se compararon con la prueba z. En todos los procedimientos de prueba de hipótesis, el
nivel de significancia observado (valor α) se calculó con el método de simulación Monte-Carlo
(29), utilizando 10.000 ciclos de muestreo. Este método lleva a conclusiones inferenciales válidas
incluso en los casos en que no se cumplen las presuposiciones metodológicas de las pruebas
estadísticas correspondientes. El nivel de significancia de todos los procedimientos de prueba de
hipótesis estaba predeterminado en α = 0.05. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el
software SPSS v.20.0 (Armonk, NY, EE. UU.) Mejorado con el módulo Exact Tests (para la
implementación de Monte-Carlo).
Resultados
Frecuencias de resistencia a fungicidas.
Entre los aislamientos de ambos cultivos, la resistencia a carbendazim (MBC) fue la resistencia más
común con frecuencias que oscilaron entre 78.6 a 86.2% y 37.5 a 68.9% en las poblaciones de fresa
y tomate, respectivamente (Fig. 2). De manera similar, se observaron altas frecuencias de
resistencia a la piolostrobina QoI (67.2 a 86.2%) y al boscalid SDHI (54.9 a 77.1%) en poblaciones
de fresas. En contraste, en las poblaciones de tomate, las frecuencias de resistencia a la
piractrostrobina y al boscalid fueron más bajas (P <0.05) en comparación con las poblaciones de
fresa. Curiosamente, en la isla de Creta, solo 4 aislamientos (0,8%) fueron resistentes al boscalido
(Fig. 2). En las dos regiones restantes de las cuales se tomaron muestras de poblaciones de tomate,
Kyparissia y Preveza, las frecuencias de resistencia a ambos fungicidas oscilaron alrededor del
10%. También se encontraron altas frecuencias de resistencia al ciprodinil (AP) en ambos cultivos,
que van desde 54.9 a 69.1% y 7.8 a 62.6% en las poblaciones de fresa y tomate, respectivamente
(Fig. 2). Se encontró que la resistencia al fungicida hid fenhexamida ocurre solo en la población de
hongos obtenida de los campos de fresas en la región de Pieria a una frecuencia del 13.1%, mientras
que la resistencia al fungicida PP fludioxonil no se observó en ninguna de las poblaciones
analizadas (Fig. 2)
En ambos hospedadores, se encontró que las frecuencias de resistencia al boscalid estaban
correlacionadas con el número total de tratamientos con boscalid aplicados antes del muestreo de
los aislamientos. Por ejemplo, en los campos de fresas ubicados en Manolada, se encontró que la
frecuencia de resistencia del boscalid era de solo 15.3% en un campo tratado dos veces con
boscalid, mientras que se observaron frecuencias más altas (P <0.05) de 85.6, 93.5 o 95,6% en los
campos tratados con boscalid en 3, 4 o 5 aplicaciones de pulverización, respectivamente (Tabla 2).
El mismo patrón también se observó en los invernaderos de tomate ubicados en las regiones de
Kyparissia y Preveza, en los que se observó un aumento gradual de la frecuencia de resistencia a los
boscálidos en los invernaderos que recibieron un gran número de aplicaciones de aspersión de
boscálidos (Tabla 2). Por el contrario, las frecuencias de resistencia al ciprodinilo o carbendazim no
se correlacionaron con el número de tratamientos AP o MBC aplicados antes del muestreo de los
aislados (datos no mostrados).
Fenotipos de resistencia a fungicidas múltiples.
Se observaron diferencias marcadas entre las poblaciones de los dos hospedadores muestreados con
respecto a la acumulación de resistencias específicas en el mismo aislado (resistencia a fungicidas
múltiples). En los aislamientos obtenidos de las fresas, la resistencia simultánea a 4 clases químicas
diferentes (R4) fue el fenotipo más común (57.2 y 35,2%), en las regiones de Manolada y Pieria,
respectivamente (Tabla 3). También se observaron altas frecuencias de resistencia triple (R3: 22.4 y
24.6%) en las regiones de Manolada y Pieria, respectivamente. En contraste, en los aislamientos
obtenidos de tomates, los fenotipos R3 y R4 se observaron en frecuencias relativamente bajas. En
Creta, la resistencia a 2 clases químicas diferentes fue el fenotipo más común (R2) observado en
una frecuencia del 49,6%, mientras que en las dos regiones restantes en las que se tomaron muestras
de invernaderos de tomate, Kyparissia y Preveza, el fenotipo de resistencia más común fue el de
resistencia a una sola clase química (R1: 28.6 y 59.9%, respectivamente), (Tabla 3).
En total se observaron 17 fenotipos de resistencia distintos, 15 de ellos en aislamientos de fresa y 12
en aislamientos de tomate (Tabla 4). En ambas poblaciones de fresas, el fenotipo más común fue el
de resistencia cuádruple al boscalid, piractrostrobina, carbendazim y ciprodinil (57.2 y 30.3%) en
Manolada y Pieria, respectivamente (Tabla 4). Además, en la región de Pieria, una pequeña fracción
de la población mostró resistencia simultánea a cinco fungicidas diferentes (boscalid,
pyraclostrobin, carbendazim, cyprodinil y fenhexamid) con una frecuencia de 4.9% (Tabla 4). En la
población obtenida de invernaderos de tomate en la región de Creta, el fenotipo más común fue el
de resistencia dual a carbendazim y ciprodinil (48.8%), mientras que la resistencia única a
carbendazim fue el fenotipo de resistencia más común en las poblaciones obtenidas de las regiones
de Kyparissia y Preveza (21.8 y 57.4%, respectivamente, Tabla 4).
Frecuencia de mutaciones sdhB.
Todos los aislamientos resistentes a los boscálidos se seleccionaron utilizando la técnica PIRA-PCR
para identificar las mutaciones asociadas con la resistencia a los SDHI. En total, se identificaron
cinco mutaciones diferentes de sdhB (P225F, N230I y H272R / Y / L). H272R fue, con mucho, la
mutación predominante asociada con la resistencia al boscalid, en todas las poblaciones
muestreadas, con frecuencias de 93.5, 68.4, 100, 94.1 y 83.3% en los aislamientos de Manolada,
Pieria, Crete, Kyparissia y Preveza, respectivamente (Tabla 5) . La mutación H272Y se encontró a
frecuencias de 5.1 y 15.2% en las dos poblaciones de fresa muestreadas y con una frecuencia de
16.7% en la población de tomate obtenida de la región de Preveza. La mutación N230I se detectó en
las dos poblaciones de fresa muestreadas (0.7 y 8.4% en las regiones de Manolada y Pieria,
respectivamente), y en la población de tomate obtenida de la región de Kyparissia (Tabla 5). Las
mutaciones H272L y P225F rara vez se encontraron y se observaron solo en aislamientos obtenidos
de campos de fresas (Tabla 5).
Estructura poblacional.
La identificación basada en PCR de B. cinerea sensu stricto y B. cinérea group S reveló la presencia
generalizada de ambos grupos. En ambas poblaciones obtenidas de fresa, B. cinerea sensu stricto
fue el genotipo más prevalente con frecuencias que oscilaron entre 78.9 y 94.1% (Fig. 3). Por el
contrario, en las tres poblaciones del grupo de tomates, se encontró que el genotipo predominante
era S con frecuencias de 74.5, 71.0 y 58.9% en las regiones de Creta, Preveza y Kyparissia,
respectivamente (Fig. 3).
En las poblaciones obtenidas de tomate, la frecuencia de resistencia al ciprodinil y carbendazim fue
mayor (P <0.05) dentro del grupo de aislamientos de B. cinerea grupo S. Por ejemplo, el 71.5% y el
53.6% de los aislamientos del grupo S fueron resistentes a carbendazim y ciprodinil, mientras que
solo el 38.2 y el 25% de los aislamientos de B. cinerea sensu stricto fueron resistentes a
carbendazim y ciprodinil, respectivamente (Fig.4A). Por el contrario, solo el 4.8% de los
aislamientos de B. cinerea grupo S obtenidos de tomate fueron resistentes a la piractrostrobina o al
boscalid, mientras que el 29.4 y el 25% de los aislamientos de B. cinerea sensu stricto fueron
resistentes a estos fungicidas, respectivamente (Fig. 4A) . Del mismo modo, en las poblaciones
obtenidas de los campos de fresas, solo el 8,6 y el 4,3% de los aislamientos del grupo S eran
resistentes a la piractrostrobina o al boscalid, respectivamente. Sin embargo, se observaron
frecuencias de resistencia más altas (P <0.05) dentro de la subpoblación de B. cinerea sensu stricto
con valores de 88.2 y 81.6%, respectivamente (Fig. 4B). Dentro de las subpoblaciones de B. cinerea
sensu stricto de fresa también se observaron frecuencias más altas de resistencia a carbendazim y
ciprodinilo en comparación con la observada dentro de la subpoblación de B. cinerea grupo S,
mientras que se encontró resistencia a fenhexamida en frecuencias iguales (Fig. 4B).
Discusión
En el estudio actual, se investigó el perfil de resistencia a los fungicidas y la estructura de las
poblaciones del patógeno del moho gris de la fresa y los tomates cultivados en invernadero en
Grecia. Las mediciones de frecuencias de resistencia a los fungicidas más importantes y
comúnmente utilizados mostraron que múltiples resistencias han evolucionado. Se descubrió que la
resistencia a los MBC es el fenotipo más común en los aislados de hongos obtenidos de ambos
cultivos, a pesar del hecho de que los MBC ya no se usan comúnmente contra el moho gris u otras
enfermedades foliares. Esta larga persistencia de alta frecuencia de resistencia a bencimidazol,
incluso en ausencia de presión de selección, se ha observado en otros estudios y probablemente esté
relacionada con la alta aptitud de las cepas resistentes a bencimidazol (23,32,43).
Boscalid fue el primer miembro del grupo SDHI, introducido contra el moho gris en 2007. Sin
embargo, pronto se notificaron casos de desarrollo de resistencia a este compuesto en varios países,
incluida Grecia (4,8,19,22,25,36). En el estudio actual, también se encontró resistencia al boscalid a
altas frecuencias en las dos poblaciones de fresa analizadas, mientras que en las poblaciones de
tomate la resistencia al boscalid y QoI estuvo casi ausente o en frecuencias bajas a moderadas. Sin
embargo, en ambos cultivos las frecuencias observadas se correlacionaron con el número total de
tratamientos SDHI aplicados antes del muestreo. Esto está de acuerdo con los hallazgos anteriores
que sugieren que las limitaciones en el número de tratamientos SDHI fueron efectivas en el manejo
de la resistencia de B. cinerea a SDHI en viñedos franceses (40). En base a estos hallazgos, las
recomendaciones de FRAC sugieren un número limitado de tratamientos SDHI en cultivos de
vegetales y bayas pequeñas (13).
La resistencia a los SDHI se ha asociado con varias mutaciones ubicadas en las subunidades sdhB,
sdhC y sdhD (25,35,36,42). A pesar del hecho de que ya hay varios informes sobre la frecuencia de
mutaciones SDH en poblaciones de hongos resistentes a los bóscáridos de fresa u uvas, actualmente
no hay informes similares para las poblaciones de B. cinerea de tomate. El conocimiento preciso de
la frecuencia de mutaciones específicas asociadas con la resistencia a SDHI dentro de las
poblaciones de hongos es de gran importancia para el control exitoso de la enfermedad o la
implementación de estrategias apropiadas de resistencia. Esto se debe a que está bien establecido
que las mutaciones SDH afectan de manera diferencial la sensibilidad de las cepas de B. cinerea
mutadas a diferentes moléculas que pertenecen a SDHI (2,21,34,37). Las moléculas SDHI más
nuevas, como el fluopiram, el fluxapiroxad o el pentiopirato, se han introducido recientemente o se
introducirán en un futuro próximo, y se integrarán en los programas de pulverización aplicados
contra el patógeno. En el caso de mutantes sdh previamente seleccionados, la eficacia de estos
nuevos productos puede verse muy afectada por el tipo de mutaciones sdh y su frecuencia
respectiva dentro de las poblaciones de hongos. Además, las aplicaciones de estas nuevas moléculas
SDHI pueden contribuir a la eliminación de mutaciones previamente seleccionadas o pueden
favorecer la selección de mutaciones novedosas o contribuir al aumento de la frecuencia de
mutaciones que ya se han seleccionado pero que ocurren a bajas frecuencias. En el presente informe
proporcionamos evidencia sobre la prevalencia de mutantes H272R dentro de la fracción resistente
a los boscálidos de las poblaciones de hongos obtenidas de la fresa y los tomates. Se ha demostrado
previamente que esta mutación es predominante en poblaciones de hongos de fresa y manzana en
los EE. UU. (2,8,42). Curiosamente, mutaciones como la P225F o la H272L asociadas con niveles
más altos de resistencia al boscalid en comparación con las conferidas por las mutaciones H272R se
han encontrado en frecuencias muy bajas. La frecuencia más baja de estos mutantes probablemente
se correlaciona con un costo de aptitud que se ha confirmado recientemente tanto para cepas
isogénicas como de campo del patógeno (21,38).
Se encontró que la resistencia al boscalid estaba, en la mayoría de los casos, asociada con la
resistencia a la piractrostrobina. Este hallazgo no es inesperado ya que hasta hace poco el único
producto que contenía SDHI disponible registrado contra el moho gris, era una mezcla
preempaquetada de boscalid con el fungicida QoI pyraclostrobin. Obviamente, el uso exclusivo de
esta mezcla preempaquetada co-seleccionada para resistencia a ambas clases de fungicidas. La
frecuencia ligeramente más alta de resistencia a las QoI en comparación con la del boscalid sugiere
que la resistencia a las QoI se desarrolló antes, ya que otras QoI como la azoxistrobina se aplicaron
en los campos de fresas o invernaderos de tomate contra otras enfermedades como el mildiu o la
antracnosis en las fresas y el mildiu polvoriento o tardío. tizón en tomates. También se ha observado
una ocurrencia similar de cepas de B. cinerea con resistencia simultánea a ambas clases de
inhibidores de la respiración en poblaciones de hongos de fresa o manzana en los EE. UU. (8,19) y
de uvas en Alemania y Francia (23,25,41) .
Se encontró que la resistencia al ciprodinilo es muy común en los aislados de fresa y en los aislados
obtenidos de tomates cultivados en Creta. Los AP se registraron en Grecia como botrticidas en 1998
y se han utilizado ampliamente desde entonces. Se usan dos moléculas en el país; pirimetanil
aplicado como producto individual y cyprodinil aplicado en mezcla preenvasada con el fludioxonil
PP. La resistencia a los AP se detectó en Grecia por primera vez en 2005, con una frecuencia del
49%, durante un monitoreo realizado en cultivos de hortalizas de la isla de Creta (31). Por lo tanto,
el estudio actual confirma un aumento adicional de la frecuencia de resistencia en 62.6%. Las altas
frecuencias observadas de resistencia a AP están asociadas con una mayor presión de selección y la
alta aptitud de las cepas resistentes a AP (3).
A pesar de la presencia generalizada de resistencia al ciprodinil en ambos hospedadores y en todas
las regiones muestreadas, no se observó resistencia para su compañero de fenilpirrol, fludioxonil.
Hasta ahora, los casos de resistencia al fludioxonil en B. cinerea estaban restringidos en campos de
fresas en Alemania y EE. UU. Y en viñedos en Alemania, principalmente asociados con la
sobreexpresión de transportadores de eflujo que confieren niveles bajos o moderados de resistencia
no específica a la mayoría de los grupos de botritis. 9,20,26,30). En contraste con la ausencia de
resistencia al fludioxonil, la presencia de cepas de B. cinerea con resistencia a la hidroxianilida
fenhexamida se confirma por primera vez en los campos de fresas en Grecia. La resistencia a la
fenhexamida en las cepas de patógenos en Grecia se había informado previamente solo en campos
de lechuga (6). Sin embargo, la resistencia a la fenhexamida es un rasgo común en las poblaciones
de hongos en Alemania (41) y los Estados Unidos (16). La ausencia de resistencia a la fenhexamida
en las poblaciones de hongos de los tomates o la muy baja frecuencia de resistencia observada en
los aislados de fresa de la región de Pieria probablemente se asocia con el número relativamente
bajo de aplicaciones de fenhexamida. Los productores en Grecia no confían en las aplicaciones de
fenhexamida ya que tiene un espectro de actividad restringido y prefieren aplicar otros compuestos
con un espectro de actividad más amplio, como SDHI, QoI y AP.
La investigación de la estructura de la población de patógenos del moho gris en términos de B.
cinerea sensu stricto y B. cinerea grupo S reveló la presencia del grupo S tanto en campos de fresa
como en invernaderos de tomate, aunque con diferentes frecuencias. Los aislamientos de B. cinerea
grupo S se identificaron por primera vez en campos de fresas de Alemania, en frecuencias que van
del 35 al 100% de los aislamientos muestreados (23). A pesar de su predominio en los campos de
fresas alemanes, rara vez se encuentran en las poblaciones de viñedos (23). La presencia de
aislamientos del grupo S también se confirmó en poblaciones de hongos de viñedos en Nueva
Zelanda (18) y moras en los Estados Unidos (26). En contraste con las frecuencias observadas en
los campos de fresas alemanes, en el estudio actual encontramos que los aislamientos de B. cinerea
grupo S estaban presentes solo a bajas frecuencias en los campos de fresas. La presencia de este
nuevo grupo de B. cinerea también se confirmó en los aislamientos obtenidos de tomates cultivados
en invernadero. Curiosamente, los aislamientos de B. cinerea grupo S fueron predominantes en las
tres regiones muestreadas, aunque con frecuencias variables.
Varios factores pueden contribuir a la estructura de las poblaciones de B.cinerea, como la
preferencia del huésped u órgano, la sucesión temporal y la sensibilidad a los fungicidas (15,28). El
predominio observado del grupo S de B. cinerea en las tres regiones de las que se tomaron muestras
de los invernaderos de tomate puede sugerir que este clado novedoso se adapta mejor en este
huésped en comparación con B. cinerea sensu stricto. Sin embargo, se requiere más investigación
para confirmar esta hipótesis. El estudio actual proporciona evidencia de los efectos de la
resistencia a los fungicidas en la configuración de la estructura de las poblaciones de B. cinerea.
Descubrimos que los aislamientos de B. cinerea sensu stricto eran más propensos a desarrollar
resistencia a los inhibidores de la respiración (boscalid y piractrostrobina) en comparación con los
aislamientos del grupo S que rara vez eran resistentes a estos dos fungicidas. Por el contrario, para
los fungicidas restantes probados, se demostró que la capacidad de los aislamientos de B. cinerea
sensu stricto y B. cinerea group S para desarrollar resistencia era variable. Por lo tanto, el
predominio observado de B. cinerea sensu stricto en las poblaciones de fresa probablemente esté
relacionado con la alta frecuencia de resistencia a boscalid / piractrostrobina. Leroch et al. (23)
también observaron diferencias en el perfil de resistencia a los fungicidas entre los dos grupos de
Botrytis (23), quienes informaron que los aislamientos del grupo S eran más propensos a la
acumulación de diferentes resistencias específicas si portaban una deleción específica de 3 pb en el
mrr1 gen asociado con el fenotipo de resistencia a múltiples fármacos MDR1h. La presencia
generalizada de este fenotipo dentro de los campos de fresas alemanes y su completa ausencia en
los campos de fresas griegos puede explicar las diferencias en las frecuencias del grupo S de
Botrytis entre los campos de fresas griegos y alemanes. Sin embargo, a pesar de la capacidad del
grupo S de B. cinerea para acumular mutaciones de resistencia a fungicidas, también se observó que
dentro de este grupo, la resistencia al boscalid era rara (23). Pero no se excluye que una mayor
presión de selección por exposición a SDHI / QoI conduciría a un aumento de B. cinerea grupo S
con resistencia a SDHI.
La prevalencia observada de múltiples resistencias a los fungicidas dentro de las poblaciones de
hongos analizadas representa una amenaza importante para el control exitoso del moho gris. La
disponibilidad restringida de nuevas moléculas con diferentes modos de acción requiere la
implementación de estrategias antirresistencia dirigidas a retrasar el aumento de la resistencia a los
fungicidas y mantener la eficacia de los compuestos disponibles.