INSTITUTO TECNOLOGICO

SUPERIOR DE MARTINEZ
DE LA TORRE.

Asignatura: Bioquímica de
alimentos.
“Evaluacion del uso de la fitasa
como ingrediente funcional en
alimentos de consumo humano”

Docente: Elena Cruz Preza.

Alumno: Luis Javier Martínez Hernández.
Francisco Pasión Vázquez.
Rivera Preza Jesús.
Reyes Martínez Larissa.

Fecha de entrega: 08-May-2019.

1
Lugar: Martínez de la Torre, Ver.

Contenido
Introducción............................................................................................................................3
Figura 1: Productos generados a partir de la hidrolisis de ácido fitico...........................4
Objetivo general......................................................................................................................4
Objetivos específicos...............................................................................................................4
Planteamineto del problema..................................................................................................5
Antecedentes..........................................................................................................................5
Justificacion.............................................................................................................................8
Marco teorico..........................................................................................................................9
Generalidades sobre el ácido fítico.....................................................................................9
Propiedades químicas del fitato.......................................................................................11
Figura 1 A, B. Efecto de pH y metales en la fisiología natural del fitato. A..................12
Generalidades sobre las fitasas........................................................................................13
Aplicación Biotecnológica de las Fitasas...........................................................................15
Aplicación en nutrición humana.......................................................................................16
Hipótesis................................................................................................................................17
Metodología..........................................................................................................................17
Método de Haug y Lantzsch..............................................................................................17
Método de Frühbeck.........................................................................................................18
Referencias............................................................................................................................19

2
Introducción.
Los granos de cereales y las semillas de leguminosas contienen cantidades considerables
de ácido fítico (1%-2%), cuya principal función es almacenar fósforo como fuente de
energía para la planta (Raboy,2003). El ácido fítico (myo-inositol hexafosfato) posee la
capacidad de establecer fuertes uniones iónicas con minerales esenciales en la nutrición
formando quelatos insolubles que no pueden ser absorbidos por el organismo (Hurrell,
1992). Está demostrado que el ser humano presenta una limitada capacidad de hidrolizar
el ácido fítico, produciéndose como consecuencia una importante disminución en la
absorción de los minerales implicados (Erdman, 1979). Para producir la hidrólisis del ácido
fítico de una manera eficaz, se hace necesaria la presencia de unas enzimas con actividad
fosfohidrolasa llamadas fitasas. Estas enzimas hidrolizan el ácido fítico a derivados de
inositol fosfato con un menor número de fosfatos (Figura 1) e incluso a inositol libre y que
presentan una menor capacidad de unirse a minerales. Las fitasas se encuentran de forma
común en la naturaleza, pudiendo ser de origen microbiano, vegetal o animal (Konietzny,
2004). Varias de estas fitasas han sido clonadas y caracterizadas genéticamente (Tijskens,
2001). Las fitasas (myo-inositol hexafosfatohidrolasas), son enzimas con actividad
fosfomonoesterasa capaces de hidrolizar ácido fítico (myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6
hexakisfosfato) para producir ortofosfato inorgánico y una serie de ésteres fosfóricos
menores (desde inositol penta- a monofosfato como productos intermediarios) liberando
finalmente el myo-inositol. Dos fitasas están reconocidas por la IUPAC-IUB (International
Union of Pure and Applied Chemistry-International Union of Biochemistry) (1976): 3- fitasa
(EC 3.1.3.8) y 6-fitasa (EC 3.1.3.26), estas enzimas comienzan la defosforilación del myo-
inositol en las posiciones 3 y 6 respectivamente. La 3-fitasa se encuentra en animales y
microorganismos mientras la 6-fitasa está presente en vegetales. Existen evidencias de
que las fitasas pueden incrementar significativamente, la utilización de fósforo fítico,
hecho que ha sido descrito como de un gran interés en nutrición humana y animal, así
como para el medio ambiente ya que supone una reducción en la excreción de fósforo
(Bohn, 2008). La ingesta de ácido fítico parece sin embargo no tener sólo implicaciones
negativas como antinutriente en la salud del ser humano. Numerosos estudios han

3
demostrado sus propiedades antiinflamatoria y antitumoral debido a su capacidad para
inhibir la proliferación celular y la angiogénesis, inducir la apoptosis o muerte celular
programada, así como de regular la expresión de determinados oncogenes (Bohn, 2008.,
Cholewa, 2008). El ácido fítico ha sido también reconocido por su capacidad para
estimular el sistema inmune, prevenir la formación de cálculos renales y reducir el riesgo
de aparición de enfermedades cardiovasculares (Vucenik, 2006). El propósito del presente
artículo es realizar una revisión de los trabajos publicados en los últimos años que
estudian las implicaciones del ácido fítico en la salud humana, así como la posibilidad del
empleo de determinadas fitasas en nutrición humana.

Figura 1: Productos generados a partir de la hidrolisis de ácido fitico.

Objetivo general.
Evaluar la actividad de hidrolisis del fitato utilizando la fitasa como ingrediente funcional
en alimentos para consumo humano.

Objetivos específicos.
Identificar los alimentos con mayor presencia de ácido fitico.

Elaborar un producto alimenticio con el contenido de la fitasa.

Determinar el contenido de minerales de dichos alimentos.

Determinar la cantidad de ácido fitico hidrolizado.

4
Planteamineto del problema.
Como bien ya se sabe el ácido fítico o fitato son considerados antinutrientes ya que son
asimilables y reduce la digestibilidad de numerosos nutrientes clave. Los fitatos tienen la
capacidad de unirse mediante un proceso conocido como quelación, esto quiere decir que
hace que disminuya la absorción de algunos minerales como el zinc, el calcio, el hierro o el
magnesio dando como resultado la formación de complejos insolubles de baja
biodisponibilidad. Nuestro organismo no puede separarlos porque no tenemos la enzima
necesaria para hacerlo.

Los cereales como el maíz (que es uno de los más consumidos en el estado de México)
contienen niveles elevados de fitato, esto puede llegar a ser un problema para la
población ya que los fitatos forman complejos fitato-minerales-proteínas, el resultado de
esto es una reducción importante en la digestibilidad del fósforo, principalmente, seguida
de los demás minerales y proteínas.

Antecedentes.
(Sotelo, A. et al 2002) Debido a que existen diferencias en los resultados de la mediación
del ácido fítico en alimentos entre distintos métodos analíticos, realizaron un estudio
comparativo de 2 métodos colorimétricos uno de ellos que es muy utilizado y otro, en el
que efectuaron una purificación previa. Realizaron la validación de este último método y
demostraron que es lineal, reproducible y exacto en las concentraciones evaluadas (5 a 50
μg de ácido fítico / mL).

(Neira, 2013) Realizaron una investigación de la producción a gran escala de fitasas las
cuales prometieron ser factibles y económicamente aceptables, ya que los usos de estas
enzimas en el sector agropecuario impulsarán el desarrollo y promoverá su crecimiento,
todo lo anterior originado por los beneficios nutricionales aportados a los animales no
rumiantes. El uso de estas enzimas permitirá no solo incrementar la biodisponibilidad de
nutrientes, sino que disminuirá el daño ambiental ocasionado por las grandes
concentraciones de fosforo en las heces.

5
(Gracia, 2017) Recabaron información acerca de los inicios de los cultivos microbianos y
concluyeron que las enzimas más utilizadas habitualmente en panificación son: xilanasa,
glucosa oxidasa, glucoamilasa, proteasa, etc; sin embargo existen más como lo son la
peroxidasa, pululanasa, fitasa, entre otras. Además de sus distintas aplicaciones en la
industria.

(Buades 2017) Investigaron el fitato o myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihidrogenofosfato

(InsP6) y estudiaron a pacientes que padecen enfermedad renal crónica (ERC) los cuales
experimentan una mortalidad por enfermedad cardiovascular de hasta 30 veces mayor
que la población en general. En su investigación obtuvieron datos recientes que indican
que la restricción impuesta de alimentos que contienen fosfatos vegetales puede
comprometer el aporte adecuado de nutrientes que tienen un efecto beneficioso en la
prevención de episodios cardiovasculares.

(Gambarota, 2005) realizo una tesina donde reprodujo a escala piloto el proceso de
obtención de harinas para determinar la importancia relativa de algunos parámetros que
pudieran servir como indicadores de la calidad de las harinas obtenidas. Recabo
información acerca de la fitasa que contenían los cereales y su transformación y beneficios
para el cuerpo humano.

(Villalva, 2005) realizo una tesis doctoral donde describe que realizo un procesos
enzimático, adicionando a la harina de guisante enzima fitasa en condiciones óptimas de
actuación tratando de disminuir la cantidad de factores no nutritivos, en especial de
inositoles fosfato, y aumentar la biodisponibilidad de los minerales sin detrimento de la
calidad del resto de los nutrientes.

(Dyner, 2009). Evidenciaron en su país (Argentina) un resurgimiento de alimentos

autóctonos, aportadores de vitaminas, minerales y proteínas de alta calidad, entre ellos el
amaranto. Sin embargo, por su contenido de fitatos, el aporte mineral se ve disminuido.
Evaluaron el contenido de inositos fosfato (IP) en panes elaborados con un 20% de
reemplazo de harina de trigo (HT) por harina integral de amaranto (HIA) y el efecto que
produce la adición de 100 ppm de fitasa en la formulación.

6
(Gerez, 2007) participaron en una investigación acerca del pan tradicional e innovador en
el Centro de Referencia para Lactobacilos con la finalidad de dar a conocer todo lo
relacionado con el pan, el proceso de panificación, las tendencias globales de la industria
panadera, etc; asi como las estrategias que incrementarían el valor nutricional del pan
(fitasa).

La Estación Experimental de Santa Catalina, (2008), evaluaron le contenido de ácido fítico

y su relación con la biodisponibilidad de minerales, proteína y lisina, en líneas avanzadas
y/o variedades de cebada procesada y no procesada. Además, determinaron la
biodisponibilidad de minerales en líneas avanzadas y/o variedades de cebada no
procesada y tratadas con un proceso efectivo para reducir el contenido de ácido fítico.

(López, 2008) Revisaron información relacionada con el uso, disponibilidad y respuesta de

los cerdos, en sus diferentes etapas, a la adición de fitasa como fuente de fosforo,
además, justificaron su trabajo haciendo mención de que al realizarse, más personas
obtendrían información clara y concisa acerca de las ventajas que aporta esta fuente de
fosforo para los productores que manejan a este tipo de ganado bovino, así como para la
reducción de la contaminación del suelo y subsuelo, al reducirse la excreción de fosforo.

(Sanz, 2012) Elaboraron un pan integral incluyendo masa madre inoculada con
bifidobacterias productoras de fitasa, mostrando en sus resultados una elevada
aceptabilidad del producto y presentando características de calidad similares al control en
cuanto a los parámetros tecnológicos, con excepción del volumen específico de la pieza
panadera y la relación de aspecto de la rebanada central. Mencionan también que la
mayor hidrolisis de fitatos que obtuvieron se debió principalmente a la actividad de fitasa
endógena del cereal por disminución del pH de la masa.

(Sancho, 2017) determinaron las características tecnológicas y nutricionales del pan

elaborado por sustitución de 25 y 50% de la harina de trigo convencional por harina
integral de arroz (Oryza sativa), quínoa (Chenopodium quinoa) o centeno (Secale cereale,
L.) Al finalizar su investigación observaron que el pan que elaboraron con un 25% de
harina de arroz aumento significativamente los niveles de trifosfato de mio-inositol,

7
sugiriendo una mayor hidrolisis de fitatos. Del mismo modo consideraron que la
biodisponibilidad de minerales en los productos integrales está relacionada con los
procesos de elaboración del pan, y principalmente por la presencia de fitatos.

(Frontela, 2008), con la finalidad de mejorar la hidrolisis del ácido fítico, comprobaron
mediante investigación y procedimentacion que la adición de fitasas exógenas (myo-
inositol hexafosfato fosfohidrolasas) procedentes de diferentes orígenes pueden tener
una importante eficacia en alimentación animal. Tambien aclararon que diversos estudios
sobre el empleo de fitasas exógenas en alimentación humana han demostrado un gran
potencial para su empleo en mejora de la disponibilidad mineral.

(Carreon, 2008), realizo una tesis de fin de Master donde describe la caracterización
bioquímica de la fitasa C de Bacillus subtilis y sus formas recombinantes. Menciona las
propiedades bioquímicas de la fitasa así como también su tipo de clasificación y su
mecanismo de hidrolisis del fitato. El objetivo general con el que trabajo fue el de
caracterizar bioquímicamente 3 fitasas del genero Bacillus para su valoración en el
potencial de aplicación en la nutrición del camarón Blanco del Pacifico (Litopenaeus
vannamie).

Justificacion.
Un alimento funcional es aquel que ha demostrado de manera satisfactoria que posee un
efecto beneficioso sobre una o varias funciones específicas en el organismo, más allá de
los efectos nutricionales habituales, siendo este hecho relevante para la mejoría de la
salud y el bienestar y/o la reducción del riesgo de enfermedad. La importancia de este
análisis radica en aprovechar el ácido fitico que se encuentra presente en alimentos a base
de plantas como cereal, trigo, y varios granos. El ácido fitico es una forma de fosforo
indigestible que solo puede ser obtenido a través del proceso de hidrolisis acción que es
llevada a cabo por la fitasa la cual, es una enzima fosfatasa que cataliza, o inicia, la
hidrólisis del ácido fítico, también conocido como fitato de esta forma puede ser
aprovechado por el organismo.

8
Minerales como calcio, magnesio, hierro, y zinc son frecuencia unido (quelado) en la
molécula de ácido fítico. Fitasa escinde y liberan los fosfatos unidos de la molecula de
acido fitico. Este proceso provee fósforo esencial necesario para una nutrición saludable.
Durante la reacción química, fotasa también libera calcio, zinc, hierro, magnesio, y
manganeso, lo cual hace que estos minerales sean hábiles para el uso en el cuerpo.

El ser humano presenta una limitada capacidad de hidrolizar el ácido fítico, produciéndose
como consecuencia una importante disminución en la absorción de los minerales
implicados. Para producir la hidrólisis del ácido fítico de una manera eficaz, se hace
necesaria la presencia de unas enzimas con actividad fosfohidrolasa llamadas fitasas. 

Numerosos estudios han demostrado sus propiedades antiinflamatoria y antitumoral

debido a su capacidad para inhibir la proliferación celular y la angiogénesis, inducir la
apoptosis o muerte celular programada, así como de regular la expresión de determinados
oncogenes. El ácido fítico ha sido también reconocido por su capacidad para estimular el
sistema inmune, prevenir la formación de cálculos renales y reducir el riesgo de aparición
de enfermedades cardiovasculares.

Marco teorico.
Las fitasas disponibles actualmente en el mercado son por lo general de origen fúngico,
del género Aspergillus, y éstas han sido optimizadas principalmente para su empleo en la
producción de cerdos y aves. La optimización de la eficacia de las fitasas se han enfocado
principalmente en el desarrollo de fitasas con alta actividad catalítica a valores de pH
ácidos de 2 a 5 y a las temperaturas del tracto gastrointestinal de las especies animales
monogástricos terrestres, estabilidad a altas temperaturas y resistencia a las enzimas
proteolíticas digestivas.

Generalidades sobre el ácido fítico

El ácido fítico (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexafosfato, IP6) es un compuesto formado por
inositol esterificado con seis grupos fosfatos, las sales de éste son conocidas con el

9
término de fitato. El fitato es la principal forma de almacenamiento de inositol y fosfato
en las semillas de plantas y en granos (Pointillart, 1994). El fitato es formado durante la
maduración de las plantas y en la germinación de las semillas representa del 60-90% del
fosfato total (Loewus, 2002). Por tal razón, el fitato es un componente común en los
alimentos derivados de plantas.

Debido a los 6 grupos fosfatos, el fitato se encuentra cargado negativamente en un amplio

rango de pH, interaccionando fuertemente con componentes de los alimentos que se
encuentren cargados positivamente, tales como minerales, elementos traza y proteínas
(Konietzny & Greiner, 2003; Cheryan, 1980). Esta interacción afecta la calidad nutricional,
además del rendimiento y la calidad de los alimento (Caransa, 1988)

Los 6 grupos fosfato del ácido fítico muestran una fuerte capacidad para quelar cationes
de minerales como zinc, hierro, magnesio, manganeso y cobre (Konietzny & Greiner, 2003;
López et al., 2002). La formación de complejos de fitato-mineral a valores de pH fisiológico
conduce a una pobre biodisponibilidad de estos minerales, ya que estos complejos no son
absorbidos en el tracto gastrointestinal de humanos y animales monogástricos (Greiner &
Konietzny, 2006). La solubilidad y la estabilidad de los complejos fitato-mineral decrecen a
medida que los residuos de fosfato son removidos del fitato, por lo cual la remoción de
fosfatos del fitato mejora la absorción de los minerales que interaccionan con éste (Han et
al., 1994)

Debido a su unión a proteínas mediante interacciones electrostáticas, el ácido fítico puede

también interferir en la digestión de las proteínas al afectar la solubilidad de éstas,
(Cheryan, 1980). A pH ácido, el ácido fítico posee una fuerte carga negativa para
interaccionar con proteínas con carga positiva. A pH neutro y alcalino, tanto el ácido 6

fítico como las proteínas poseen carga negativa, por lo que se cree que son necesarios
cationes multivalentes, como el calcio para, formar el complejo fitato-proteína (Rham &
Jost, 1979; Cheryan, 1980). La interacción del fitato con las proteínas puede afectar en su
estructura y como consecuencia en la actividad enzimática, solubilidad y digestibilidad

10
proteolítica, aunque en este último caso aún existe controversia al respecto (Greiner &
Konietzny, 2006).

La interacción del ácido fítico no se limita solamente a las proteínas ingeridas con el
alimento, sino que también se ha reportado la inhibición de enzimas digestivas
endógenas, tales como la β-amilasa (Brenes, 2002, Knuckles & Betschart, 1987;
Desphande & Cheryan, 1984), lipasas (Knucckles, 1988) y proteasas (Singh & Krikorian,
1982; Inagawa et al., 1987) tales como tripsina, pepsina y quimotripsina. Esta inhibición,
puede ser debido a la interacción del fitato con las proteínas, o debido a la acción
quelante del fitato sobre el ion calcio, el cual es esencial para la actividad de la tripsina y la
β -amilasa.

Así, el fitato es considerado como un factor antinutricional debido a su acción quelante

sobre cationes divalentes, como Ca 2+, Zn2+ y Fe2+, y la interacción con proteínas
importantes nutricionalmente disminuyendo la biodisponibilidad de ambos nutrientes
(Urbano et al., 2000).

Por otro lado, los animales monogástricos son incapaces de utilizar el fitato, ya que éstos
carecen o presentan una baja actividad de fitasa en su tracto digestivo (Schroder et al.,
1996). Por consiguiente el fosfato inorgánico es agregado frecuentemente en sus
alimentos, para facilitar el crecimiento óptimo de estos animales. Esta práctica conduce a
un alto contenido de fitato y fosfato inorgánico en la excreción de los animales, lo cual
puede estimular el crecimiento de algas y causar eutroficación en la superficie del agua.

Propiedades químicas del fitato

El fitato puede existir en forma libre o como complejo de fitato-metal dependiendo del pH
y la concentración de cationes en la solución (Fig. 1A). A pH ácido, la protonación de los
grupos fosfatos del fitato genera una forma libre sin interacciones con metales. En
contraste, a pH neutro la desprotonacion de los grupos fosfatos cargados 7

negativamente interactúan con metales catiónicos divalentes, principalmente Mg 2+ y Ca2+,

formando el complejo fitato-metal (Cheryan, 1980; Maenz et al., 1999).

11
Figura 1 A, B. Efecto de pH y metales en la fisiología natural del fitato. A. El
fitato existe en forma libre y como complejo fitato-metal, dependiendo del pH, de los
metales catiónicos divalentes, la magnitud del enlace depende del pH y la relación del
metal-fitato. A valores de pH alcalino y alta concentración del catión se forma el complejo
fitato-metal debido a la interacción electrostática directa. B. Los metales con cationes
divalentes enlazan los grupos fosfatos del fitato dependiendo del radio iónico de los
cationes. La formación del complejo fitato-metal bidentato es favorecido por la
interacción con cationes con un radio iónico grande.

En el complejo fitato-metal, los metales catiónicos divalentes con un radio iónico grande,
tal como el Ca2+ (0.99Å) y el Sr2+ (1.12Å) enlazan dos oxianiones de dos grupos fosfatos
en forma de bidentato (Martin & Evans, 1986). Sin embargo, los metales catiónicos
divalentes con un radio iónico pequeño, tales como Mg2+ (0.65Å), Fe2+ (0.74Å) y Zn2+
(0.71Å) enlazan dos átomos de oxígeno de un grupo fosfato (Fig. 1B). Por tal razón, la
formación de la forma bidentato del complejo fitato-metal prefiere los metales divalentes
con radios de iónicos grandes (Jonson & Tate, 1969; Cheryan, 1980).

12
Generalidades sobre las fitasas
Las fitasas son una clase especial de fosfatasas que catalizan la hidrólisis secuencial del
fitato a derivados de myo-inositol menos fosforilados y fosfato inorgánico (Wyss et al.,
1999a). Recientemente, Oh y colaboradores (Oh et al., 2004) han clasificado las fitasas en
dos clases principales basados tanto en las secuencias de aminoácidos y su análisis
filogenético, como por las propiedades bioquímicas de éstas: las fosfatasas ácidas de
histidina (HAP) y las fitasas alcalinas, las cuales correlacionan bien con las propiedades
bioquímicas y las propiedades catalíticas de cada clase.

La mayoría de las fitasas bacterianas, fúngicas y de plantas pertenecen a las fosfatasas

ácidas de histidina. Todos lo miembros de esta familia comparten una sitio activo
conservado con la secuencia RHGXRXP, la cual está presente solo en esta clase de enzimas
(Van Etten et al., 1991).

Las fitasas alcalinas son ampliamente distribuidas en la naturaleza (Liu et al., 1998). Sin
embargo, la caracterización enzimática de las fitasas ha sido principalmente enfocada en
las HAPs, ya que la técnica más ampliamente usada para realizar el screening de fitasas se
basa en medir la cantidad de fosfato inorgánico liberado del fitato libre no unido a metal
(fitato de sodio) y usado como sustrato (Englen et al., 1994). Por tal razón, el screening de
microorganismos o plantas productores de fitasas y la clonación de genes que codifican
para éstas, conduce a seleccionar principalmente HAPs que actúan sobre fitato libre a pH
ácido.

La Unión Internacional de Química aplicada y la Unión Internacional de Bioquímica

(IUPAC-IUB 1975) clasificaron las enzimas de HAPs en dos grupos: las 3-fitasa (hexafosfato
de inositol 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y 6 fitasa (hexafosfato de inositol 6-fosfohidrolasa,
EC 3.1.3.26), basados en la posición específica de la hidrólisis inicial del fitato. La 3-fitasa
hidroliza primero el grupo fosfato de la posición 3, mientras 9

que la 6-fitasa hidroliza primero el de la posición 6, dando lugar al 1, 2, 4, 5, 6-

pentafosfato de inositol y el 1, 2, 3, 4, 5-pentafosfato de inositol, respectivamente.

13
Las fitasas son usadas como aditivos en alimentos para animales mejorando la
biodisponibilidad de fosfato y reduciendo la pérdida de fosfatos y cationes divalentes del
fitato.

Las fitasas existen ampliamente en una variedad de microorganismos, plantas y en

algunos tejidos de animales (Liu et al., 1998).

Las primeras fitasas fueron descritas en cereal de arroz en 1907 y posteriormente las
fitasas de especies de Aspergillus en 1911 (Dox & Goleen, 1911). También han sido
encontradas en el cereal de trigo, semillas de plantas, en el tracto gastrointestinal de
cerdos (Pointillart, 1994b; Yi & Kornegay, 1996), aves (Davies & Motzok, 1972) y en otras
especies monogástricas se han encontrado fitasas, (Pointillart, 1994a) aunque su actividad
fítica es muy escasa.

La actividad de fitasa a sido encontrada mas frecuentemente en hongos, tales como

Aspergillus terreus (Yamada et al., 1968), Aspergillus ficuum, Aspergillus niger (Shieh &
Ware, 1968). Las fitasas también son producidas en bacterias gram-positivas tales como
Bacillus y bacterias gram-negativas tales como Aerobacter aerogenes (Greaves et al.,
1967), Pseudomonas sp. (Cosgrove, 1970), Escherichia coli (Greiner et al., 1993) y
Klebsiella (Shah & Parekh, 1990). Generalmente las fitasas de bacterias gram-negativas
son proteínas intracelulares, mientras que las fitasas de bacterias gram-positivas y de
hongos son enzimas extracelulares.

En plantas, la actividad de fitasa se encuentra en muchas de las semillas de éstas, sin

embargo solamente las fitasas de trigo, fríjol verde y soja han sido purificadas y
caracterizadas (Mandal et al., 1972).

En la tabla I se presentan un listado de fitasas documentadas en la literatura y y

hospederos empleados para la producción de las formas recombinantes.

14
Aplicación Biotecnológica de las Fitasas
Las fitasas son de gran interés para la aplicación biotecnológica, particularmente para la
reducción del contenido de fitato en alimentos para animales y consumo humano (Lei &
Stahl, 2001; Vohra & Satyanarayana, 2003).

Dependiendo de la aplicación, una fitasa de interés comercial debe de cumplir con una
serie de criterios de calidad. Éstas deben de ser efectivas en la liberación del fósforo fítico
en el tracto digestivo, también deben de ser estables y resistentes a las altas temperaturas
empleadas durante el procesado del alimento y durante el almacenamiento, además que
su producción sea de bajo costo.

La termoestabilidad es una característica importante ya que el proceso de peletizado es

comúnmente realizado a temperaturas entre 65-95 ºC. Existe la posibilidad de aplicar la
fitasa después del peletizado ya sea por aspersión o recubrimiento químico y con esto
superar la desnaturalización por las altas temperaturas, aún así la termoestabilidad sigue
siendo una característica deseable para estas enzimas. Son muy pocas las fitasas de origen
natural que poseen el nivel requerido de termoestabilidad para la aplicación como aditivo
para alimentos para animales (Lei & Stahl, 2001). Por lo cual esta propiedad es hasta hoy
motivo de búsqueda de nuevos aislamientos y caracterización y del diseño de nuevas
fitasas termoestables (Kim et al., 1998b; Lehmann et al., 2000; Pasamontes et al., 1997b).
De la misma manera sigue siendo de gran valor las enzimas estables a un largo tiempo de
almacenamiento y transporte a temperatura ambiente.

La habilidad de las fitasas para hidrolizar el fitato en el tracto digestivo es determinada por
sus propiedades enzimáticas. Ya que es el estomago el principal sitio dónde se requiere la
actividad de una fitasa, ésta debe de poseer una buena actividad a pH ácidos y deben de
ser resistentes a la pepsina. El valor de pH en el tracto digestivo de la especie animal
dónde se requiera aplicar una fitasa, determinará el tipo de fitasa a emplease dependiente
de el intervalo de pH en el cual la fitasa tiene actividad. 32

La estabilidad a las enzimas proteolíticas del tracto digestivo de cada especie es también
un factor determinante en el tipo de fitasa emplearse. Se ha demostrado que las fitasas de

15
Escherichia coli y Citrobacter brakki son mas resistentes a la pepsina y pancreatina que las
fitasas comerciales disponibles de Aspergillus niger (Kerovuo et al., 2000b; Rodríguez et
al., 1999), además la fitasa de Citrobacter braakii es resistente a tripsina (Rodríguez et al.,
1999).

Otra característica que determina la eficiencia o limitaciones en la suplementación de las

fitasas es la dependiente de la especificidad del sustrato. Experimentos in vitro sugieren que
las fitasas que presentan un especificidad amplia por diversos sustratos son más apropiadas
para su aplicación en la nutrición animal (Wyss et al., 1999a) que las fitasas con una estrecha
especificidad. Desafortunadamente una amplia especificidad por el sustrato esta relacionada
con una baja actividad especifica. Finalmente, las fitasa son competitivas si se pueden
producir con un rendimiento alto y purificar con estrategias relativamente baratas, por lo cual
actualmente existe una gran competitividad en la sobre-expresión y secreción de fitasas por
microorganismos recombinantes (Mayer et al., 1999; Miksch et al., 2002; Yang & Shamsuddin,
1995).

La reducción de los niveles de fitato y el incremento de la actividad de fitasa en las semillas de

plantas se ha planteado como otra alternativa estratégica. El incremento de la actividad de
fitasa en las semillas de las plantas se ha buscado a través de la expresión de genes
heterólogos de fitasas fúngicas (Brinch-Pedersen et al., 2000; Li et al., 1997; Pen et al., 1993;
Ullah et al., 1999).

Aplicación en nutrición humana

El procesado y la manufactura de alimento para el consumo humano es también un campo de
aplicación posible para las fitasas. Hasta el momento no hay en el mercado una fitasa aplicada
en la alimentación humana. Las investigaciones se han enfocado para mejorar la absorción de
minerales y el mejoramiento técnico del procesado de alimentos.

Algunos estudios han mostrados que las formas superiores de inositol trifosfato (IP3) afectan
la adsorción de hierro presente en cereales y leguminosas (Sandberg et al., 1999) y ésta se
puede mejora al incluir fitasa en el preparado alimenticio.

16
Métodos empleados en el procesado de alimentos como lo son: cocinado, germinación,
fermentación, tratamiento hidrotérmico y remojo muestran una reducción considerable de la
cantidad de fitato de las leguminosas (Rehms & Barz, 1995; Nout & Rambouts, 1990). Así se ha
reportado que fitasas endógenas degradan totalmente el ácido fitico durante la manufactura
de los alimentos basados en harinas de arroz trigo, maíz, avena, sorgo y una harina la cual es
una mezcla de soja y trigo (Hurrell et al., 2003) y la degradación del fitato se ha correlacionado
con una mejora en absorción de hierro. Haros y colaboradores en el 2001 (Haros et al., 2001)
a investigaron el posible uso de fitasas durante el procesado del pan, demostrando que el
empleo de fitasa mejorar el procesado del pan.

Hipótesis.
El uso de la enzima Fitasa en alimentos de consumo humano es realmente efectivo al
hidrolizar el contenido de acido fitico dejando asi que el alimento contenga una mayor
cantidad de minerales.

Metodología.
Debido a que no existe la suficiente información para conocer con el método más factible
para elaboración del contenido de ácido fítico se retoma la metodología propuesta por
Sotelo, A. et al (2002), con la finalidad de incurrir en errores que pudiesen llegar a
ocasionarnos problemas a lo largo de la experimentación. Para la realización se pretende
utilizar un análisis proximal ya que este permite conocer la composición de cada muestra y
sobre todo, el contenido de grasa el cual es importante para evitar interferencias en la
medición. La determinación de humedad, grasa, cenizas y fibra se tiene contemplado
realizarla de acuerdo a la metodología descrita por la AOC. Para la valoración del
contenido de ácido fítico se tiene planeado utilizar el método de Haug y Lantzsch; y el
método de Frühbeck. La valoración se hará con un método colorimétrico.

Método de Haug y Lantzsch

De acuerdo a lo que menciona Sotelo, A. et al (2002), y siguiendo si misma metodología
nos menciona que: “La valoración del ácido fítico se realizara pesando la muestra (0.040-
0.120g) y se extraer con 20 mL de HCl 0.2N y con agitación mecánica a temperatura

17
ambiente durante 20 minutos. Luego se centrifugara el extracto a 12000 r.p.m. durante 15
min. Posteriormente se tomara una alícuota de 0.5 mL a la que se le agregara 1 mL de la
solución férrica: 0.2 g de sulfato férrico de amonio. 12 H 2 O disueltos en 100 mL de HCL
0.2 N y se aforara con agua a 1000 mL. El tubo se tapara con una canica, se colocara en
baño de agua a ebullición por 30 minutos. Posteriormente, se agregaran 2 mL de solución
de 2,2-bipiridina, 1g más 1 mL de ácido tioglicólico y aforando con agua a 100 mL. Se
mezclara el contenido y la absorbancia la cual se leerá a 519 nm 30 segundos después de
haberse agregado el último reactivo”.

Método de Frühbeck
Se pesara el alimento “X” (que debe contener menos de 5 % de grasa), se agregaran 20 mL
de HCl (0.65 N) para llevar a cabo la extracción. El pH de la mezcla deberá estar entre 0 y
1. Esta mezcla se someterá a agitación vigorosa durante dos horas a temperatura
ambiente. El extracto que se obtenga se transferirá cuantitativamente a unos tubos para
ser centrifugados a 17300 G. Una vez transcurridos 30 min se colectara el sobrenadante, y
se tomara una alícuota la cual se diluirá con agua desionizada.

Nota: Se recomienda la dilución 1:25 para alimentos que contengan 1 % o más de ácido
fítico y la dilución 5:25 para contenidos menores.

El pH se ajustara a un valor de 6.0 con solución de NaOH 1N y luego se tomara 10 mL de la

alícuota diluida que se transferirán cuantitativamente a la columna de resina de 8 mm ×
65 mm (AG1-X8, 200-400 mesh, 0.5 g, Bio Rad No. 140- 1451). El lavado de la columna se
hará con 15 mL de NaCl 0.1 N. El fitato se eluira con 15 mL de NaCl 0.7 N y se recolectara
el extracto purificado. Se tomaran 3 mL de agua desionizada (usada como blanco), o bien,
3 mL de los estándares (soluciones de fitato de sodio cuyo contenido es de 5 a 50 µg / mL
en agua desionizada) o bien, los extractos purificados a través de la columna a los que
previamente se les ajustara el pH a 3 y se les adicionara 1 mL de reactivo de Wade: 0.03 %
de FC l 3∗6 H 2 O más 0.3 % de ácido sulfosalicílico disueltos en agua desionizada. Después
de la agitación en un vórtex durante 5 s se leerá la absorbancia a 500 nm.

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