Estudio sobre la bioadsorción y biodegradación de hidrocarburos

de petróleo por un consorcio microbiano.

RESUMEN

Un consorcio microbiano aislado del lodo contaminado de los campos petroleros de

Shengli fue capaz de degradar la naftaleno (NAP), fenantreno (PHE), pireno (PYR) y
petróleo crudo. Realizó una alta actividad de biodegradación emulsificabilidad para
hidrocarburos de petróleo, y fue tolerante a 6.2 mM Cu 2+ , 2.7 mM Zn 2+ y9.5 mM Pb
2+ . Las tasas de biodegradación de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo fueron del 53%,
21%, 32% y 44% en presencia de metales pesados (Cu 2+ , 1.7 mM y Zn 2+ , 2 mM),
respectivamente. Exploración de la absorción y la absorción de hidrocarburos de petróleo
por microbios sugirió la estabilidad de la absorción de la superficie y la célula. La
absorción por el consorcio microbiano vivo siguió un orden decreciente de NAP> PHE%
PYR> petróleo crudo. la absorción por el consorcio microbiano matado por calor fue
constante para los HAP, mientras que disminuyó para el petróleo crudo.

Los experimentos sobre la degradación de las enzimas indicaron que la eficiencia

metabólica del micro citoplasma periplásico y las enzimas extracelulares secretadas por
los consorcios microbianos para diversos sustratos fueron diferentes.

MARCO TEÓRICO

Consorcio Microbiano: Un Consorcio Microbiano es una asociación natural de dos o

más poblaciones microbianas, de diferentes especies, que actúan conjuntamente como
una comunidad en un sistema complejo, donde todos se benefician de las actividades de
los demás. La asociación refleja estilos de vida sinérgicos o sintróficos (que significa
“comiendo juntos”) en el que el crecimiento y el flujo cíclico de nutrientes se conduce más
efectiva y eficientemente que en poblaciones individuales (López, Domínguez & García,
2007).
Biodegradación: Es la capacidad de un material de ser biodegradado, es un proceso
natural en el que un material por acción biológica, cambia y en general pierde sus
propiedades originales y a nivel químico las moléculas que lo conforma se convierten en
formas mas simples y estables, pudiendo ser la forma más oxidada de la molécula original
(para materiales de carbón la forma más oxidada es el dióxido de carbono CO2), la forma
más reducida (para el carbono es el metano CH4) o una mezcla de ambas.
Bioadsorción: La adsorción es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas de
gases, líquidos o sólidos disueltos son retenidos en una superficie, en contraposición a la
absorción, que es un fenómeno de volumen.
Petroleo: Sustancia compuesta por una mezcla de hidrocarburos, de color oscuro y olor
fuerte, de color negro y más ligera que el agua, que se encuentra en estado natural en
yacimientos subterráneos de los estratos superiores de la corteza terrestre; su destilación
fraccionada da productos de gran importancia industrial como la gasolina, el queroseno, el
alquitrán, los disolventes, etc.
Naftaleno (NAP): Es una de las sustancias que se obtienen del alquitrán de hulla ,en
mayor cantidad. Se encuentra también en pequeñas cantidades en el petróleo de diversas
procedencias.
Fenantreno (PHE): Es un hidrocarburo policíclico aromático compuesto de tres anillos
fusionados bencenos, como lo muestra la fórmula del costado.
Pireno (PYR): El benzopireno es un hidrocarburo policíclico aromático potencialmente
carcinógeno y que contienen algunos alimentos, como las carnes y el pescado.
Metales Pesados:
Los metales pesados son componentes naturales de la corteza de tierra. No pueden ser
degradados o ser destruidos. En un grado pequeño se incorporan a nuestros cuerpos vía
el alimento, el agua potable y el aire. Como elementos de rastro, algunos metales
pesados (ergio, cobre, selenio, cinc) son esenciales mantener el metabolismo del cuerpo
humano.
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP): Los HAP se encuentran en el
petróleo, el carbón y en depósitos de alquitrán y también como productos de la utilización
de combustibles (ya sean fósiles o biomasa). Como contaminantes han despertado
preocupación debido a que algunos compuestos han sido identificados como
carcinógenos, mutágenos y teratógenos.
Oleoducto: Se denomina oleoducto a la tubería e instalaciones conexas utilizadas para el
transporte de petróleo, sus derivados y biobutanol, a grandes distancias.

Fotolisis: La fotólisis es la ruptura de enlaces químicos por causa de energía radiante. Se

llama fotólisis o fotolisis, fotodisociación, o fotodescomposición a la disociación de
moléculas por efecto de la luz, y se define como la interacción de uno o más fotones con
una molécula objetivo.
Volatilización: La sublimación o volatilización es el proceso que consiste en el cambio de
estado de sólido al estado gaseoso sin pasar por el estado líquido.
 1. INTRODUCCIÓN
El petróleo es uno de los recursos energéticos más importantes y
materias primas de la industria química. Con el crecimiento de la demanda
para la energía, un gran número de hidrocarburos de petróleo entran en nuestra
medio ambiente en el proceso de explotación, transporte y
refinamiento, especialmente los derrames accidentales. Entre los compuestos complejos
de hidrocarburos de petróleo, los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) exhiben
características cancerígenas, teratogénicas, mutagénicas y otras
propiedades tóxicas como la bioacumulación, la biomagnificación y
toxicidad persistente (Balachandran et al., 2012). La USEPA ha enumerado
16 HAP como contaminantes prioritarios.
Los contaminantes del petróleo, especialmente los HAP, contaminan nuestras aguas
subterráneas, la atmósfera, el suelo terrestre, el mar, el agua y los sedimentos causando
extensos problemas ambientales; que plantea una grave amenaza para la vida marina, la
salud humana, el medio marino, los recursos y sistemas ecológicos; y la destrucción de
los equilibrio que puede tardar años o incluso décadas en recuperarse (Park y Park,
2011; Cohen, 2013).

Los ejemplos más recientes de los derrames a gran escala son la explosión de Deepwater
Horizon en el Golfo de México en abril de 2010 y la explosión del oleoducto en Dalian,
China, en julio de 2010, que causó daños masivos en el océano y costa. En
consecuencia, las contaminaciones de hidrocarburos de petróleo han suscitado una gran
preocupación medioambiental en todo el mundo.

Aunque los hidrocarburos de petróleo liberados en el medio ambiente pueden sufrir

oxidación química, fotolisis, volatilización y la absorción en el sedimento y las partículas
del suelo, la principal vía para su eliminación es probablemente a través de la
transformación microbiana y la degradación. Comparado con los métodos físicos y
químicos como la combustión, la fotolisis y la adición de dispersantes, se espera que la
biodegradación sea un proceso eficiente, económico y ecológico. alternativa amistosa
para la eliminación de la contaminación por petróleo de y reducir los daños causados por
los derrames de petróleo (Zhang et al., 2011). Por lo tanto, cada vez más intereses de
investigación están cambiando a la biodegradación del petróleo crudo y los (HAP) (Zhang
et al., 2011; Jin
y otros, 2012; Moscoso y otros, 2012).

En la actualidad, muchos estudios han

se centró en el potencial de biorremedación de los microbios preadaptados
y la mejora de la eficiencia de la biodegradación mediante el bioaumento y la
bioestimulación. Hay contaminaciones de diversas fuentes en el medio ambiente. Los
metales pesados son comunes
constituyentes del petróleo crudo y sus derivados, como el pb2+-
gasolina con plomo, aceites y grasas lubricantes; compuestos de Zn2+, Cd2+.
aceite de motor modificado, etc. (Máthé y otros, 2012). Además, los pesados
la contaminación por metales, especialmente Cu2+, Zn2+ y Pb2+, ocurría con frecuencia
en muchos ríos, mares o lagos, etc. (Meybeck et al., 2007; Kwon et al..,
2010).
Enfrentando múltiples contaminaciones en el medio ambiente, algunos de
los investigadores sólo se centraron en la biodegradación del petróleo crudo y los HAP,
mientras que ignorando las otras condiciones desventajosas que existían, tales como
como la presencia de metal pesado. Así que los efectos de los metales pesados en
la biodegradación de los hidrocarburos del petróleo, incluida la resistencia
de microorganismos a metales pesados son esenciales para ser tomados en
cuenta.
Además, los microorganismos desempeñan un papel importante en el destino de
contaminaciones en el medio ambiente, incluyendo la bioadsorción y
biodegradación (Stringfellow y Alvarez-Cohen, 1999). En el proceso de biorremedación,
los microorganismos se pueden considerar tanto como un biosorbente que acomoda los
contaminantes orgánicos como un biorreactor
que degrada los contaminantes (Chen et al., 2010).
Hasta ahora, la bioadsorción de metales pesados, tintes y pesticidas por materiales
biológicos como las bacterias, los hongos y las algas fueron extensamente reportados
(Sharma y otros, 2011; Khosravihaftkhany y otros, 2013; Maciel y otros..,
2013). Recientemente, las influencias de la bioadsorción y la biodegradación
sobre el transporte, el destino y la lucha contra la contaminación de los contaminantes
orgánicos persistentes en el medio ambiente han recibido cada vez más atención.
La mayoría de las investigaciones se han centrado principalmente en los factores que
afectan la absorción de una sola de las bacterias, hongos o algas; la relevancia
de la absorción, la polaridad celular o el coeficiente de partición; las contribuciones de la
bioadsorción y la biodegradación a la biodisipación de las contaminaciones disueltas y
adsorbidas; y la influencia de la continua
cultura sobre la absorción (Chen et al., 2010; Ke et al., 2010; Chen y
Ding, 2012; Ding et al., 2013).

Pocos investigadores se centraron en la absorción en la superficie y en la absorción por

las células de diferentes contaminantes orgánicos por
microorganismo. Por lo tanto, es muy significativo e interesante explorar
el destino de las contaminaciones en la célula y la superficie de los microorganismos para
Comprensión del mecanismo y el transporte de la degradación
contaminaciones.
El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la biodegradación, la bioadsorción y la
absorción de los hidrocarburos del petróleo
(petróleo crudo y HAP) por un consorcio microbiano. Podría proporcionar una
apoyo teórico para la biorremedación de las contaminaciones de hidrocarburos de
petróleo. La investigación se centró principalmente en
el transporte de la bioadsorción de la superficie y la absorción de las células por los seres
vivos consorcio de microbios muertos por calor. Mientras tanto, el estudio de la resistencia
de los metales pesados, la actividad de biodegradación y la emulsión de
el consorcio microbiano, así como la eficiencia metabólica de
enzimas periplásmicas, citoplasmáticas y extracelulares secretadas por
también se exploró el consorcio microbiano.

2. MÉTODOS
2.1. MATERIALES

2.1.1. Químicos

✔ El Fenantreno (PHE, pureza P97%) y el pireno (PYR, pureza P97%) se obtuvieron

de Aladdin Chemistry Co. Ltd.

✔ La Naftalina (NAP) fue comprada a Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.

Otros reactivos eran de grado analítico y se compraron de varias fuentes

comerciales. El petróleo crudo se obtuvo del yacimiento de Shengli, que se
deshidrató y eliminó el precipitado no disuelto.

2.1.2. Soluciones y medios.

Las soluciones de sustrato único se prepararon con antelación, respectivamente. La

concentración de cada HAP (NAP, PHE y PYR) era 2 g L1 en ciclohexano. La
concentración de petróleo crudo fue de 10 g de L1 en éter de petróleo. La concentración
de cada metal pesado (CuSO4, ZnSO4 y Pb(NO3)2) era de 100 g L1 en destilado agua.

El medio de sales minerales (MSM) estaba compuesto por (g L1 de agua destilada) NaCl
0,5, (NH4)2SO4 0,1, MgSO47H2O 0,025, NaNO3 0,2, KH2PO4 0,4, K2HPO43H2O 1,0. El
medio de degradación fue compuesto de MSM y un solo sustrato (petróleo crudo, NAP,
PHE y PYR).

El medio de peptona del extracto de carne de vacuno estaba compuesto por (g L1 de

agua destilada) extracto de carne de vacuno 0,5, peptona 1,0, NaCl 0,5, agar 15-25
(sólido).

Todos los medios se ajustaron a un pH de 7,2-7,4 con HCl o Soluciones de NaOH y

esterilizadas en un autoclave a 121 C para 20 minutos antes de ser usado.

2.1.3. Microorganismo y condición de cultivo

Un consorcio microbiano aislado del yacimiento petrolífero de Shengli contaminó el lodo
era capaz de degradar el petróleo crudo y los HAP, incluyendo NAP, PHE y PYR, y los
usaba como la única fuente de carbono.
Las condiciones óptimas de crecimiento del consorcio microbiano son la temperatura de
30 C, pH 7-8, concentración de NaCl 5-10 g L1, NAP 800 mg L1, PHE 40 mg L1, PYR 40
mg L1 y concentración de petróleo crudo 3 g L1. La eficiencia de degradación de NAP,
PHE, PYR y el petróleo alcanzó hasta el 80%, 30%, 56% y 48%, respectivamente.
Estos resultados se obtuvieron de los primeros experimentos de exploración en nuestro
laboratorio.
El consorcio microbiano fue cultivado en medio de peptona de extracto de carne de
vacuno a 30 C con agitación a 120 rpm. Los gránulos de células fueron cosechado por
centrifugación (6000 rpm durante 5 minutos a 4 C) y se lavó 3 veces con MSM para
eliminar las impurezas. Luego las paletas fueron re-suspendidos en MSM. Después de
estos procedimientos, los perdigones podría ser usado.
2.2. Identificación de los aislamientos de bacterias
2.2.1 Caracterización bioquímica
Para identificar y caracterizar las bacterias aisladas, la bioquímica, pruebas como la
tinción de Gram, la tinción de esporas y las pruebas de oxidación/fermentación, M.R, V-P,
indol y la hidrólisis de la celulosa se realizaron de acuerdo con el manual de identificación
de bacterias comunes (Dong y Cai, 2001)

2.2.2. Identificación molecular

Se realizó un análisis del gen 16S rDNA para el sistema taxonómico caracterización de las
bacterias aisladas. Se extrajo el ADN total de las cepas bacterianas usando el kit de
extracción de ADN de bacterias TIANamp (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, China).
La bacteria 16S los del ADNr fueron amplificados usando el dominio universal específico
de el cebador delantero 27F (50-AGAGTTGATCCTGCTCAG-30) y el cebador inverso
universal 1492R (50-AAGGTGATCCAGCCGCA-30).

La reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 30 lL que contienen 17,8 lL

de H2O, 3 lL de tampón de reacción, 3 lL de cada cebador de avance y retroceso, 2 lL de
dNTPs, 0,2 lL de Taq polimerasa y 1 lL de plantilla de ADN.

El programa de amplificación se realizó con un paso de desnaturalización inicial a 95 C

durante 5 min; seguido de 30 ciclos de 30s de paso de desnaturalización a 95 C, 30 s de
paso de recocido a 53 C y una etapa de extensión de 1 minuto a 72 C; y una etapa de
extensión final a 72 C durante 10 min.

Después de la detección de electroforesis los resultados de la PCR, el producto de la

PCR obtenido fue secuenciado por el BGI (Beijing Genomics Technology Co., Ltd.)
usando 3730 secuenciadores de ADN (ABI, EE.UU.).

El se utilizó el rango de similitud de la base de datos de nucleótidos para para estimar el

grado de similitud con otras secuencias de genes de ADNr 16S por el sitio web del NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y estructuran los árboles filogenéticos. La alineación de la
secuencia fue llevada a cabo arboles filogenéticos y análisis de las secuencias fueron
construidas usando el vecindario de unión (NJ) y realizado por el software MEGA (versión
4.0). La escala La barra indica el número medio de sustituciones de aminoácidos por sitio.

2.3 Análisis de hidrocarburos de petróleo

El total de hidrocarburos de petróleo en MSM fue extraído usando el método de extracción

líquido-líquido por medio de extractantes (el petróleo crudo utilizado éter de petróleo y los
HAP utilizaron ciclohexano) durante tres veces. Un completo se había hecho una
exploración de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo para obtener las longitudes de onda
apropiadas. Las concentraciones de NAP, PHE, PYR y el petróleo crudo fueron medidos
por el espectrofotómetro ultravioleta Alpha-1860 (Shanghai lab-spectrum instruments
Co. Ltd., China) a la longitud de onda máxima de 221,5, 252, 241,5 y 225 nm,
respectivamente (Zhao y otros, 2006). El correspondiente extracto como el control fue
medido al mismo tiempo.

Rd = (Po-P1)/Po x 100%

Donde:

● Rd- la tasa de eliminación de hidrocarburos de petróleo después de td, %;

● P(0)- la concentración inicial de hidrocarburos de petróleo, g L1 omg L1;

● P(1)- la concentración residual de hidrocarburos de petróleo después de ser

biodegradado t d, g L1 o mg L1.

2.4 La absorción en la superficie de los hidrocarburos de petróleo por un microbio

vivo consorcio.

El consorcio microbiano fue cosechado después de un cultivo de enriquecimiento para 3

d. Una serie de cada sustrato (NAP, PHE, PYR y crudo de aceite) se inoculó un 20% de
medio de degradación microbiana células del consorcio, respectivamente. Las
concentraciones individuales de NAP, PHE, PYR y el petróleo crudo fueron 20, 20, 20 y
100 mg L1. Para probar la superficie de adsorción, los paletas de células se recogieron
por centrifugación (6000 rpm durante 5 min a 4ºC) y se lavó una vez con agua estéril
MSM, dos veces con el respectivo extracto y las dos últimas veces con MSM estéril. Que
los cinco combinados eran la solución lavada.

Las concentraciones de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo en los lavados individuales
solución por este proceso de extracción se consideraron como la superficie contenidos de
adsorción por un consorcio microbiano (Chen y Wang, 2011). Después de que la fase
superior en la solución lavada se separara cuidadosamente por medio de un pipeteador,
se midió la concentración de sustrato (NAP, PHE, PYR y petróleo crudo) en 1, 2, 5, 10, 15,
20, 30, 60, 300, 600 y 1440 minutos, respectivamente. Todas las pruebas se hicieron en
duplicados.

2.5. La absorción celular de los hidrocarburos del petróleo por un microbio vivo
consorcio

La preparación experimental sobre el consorcio microbiano, el medio de degradación y el

proceso de lavado de la superficie de adsorción por de los microbios eran tan iguales.
Luego se suspendió la eliminación de células bacterianas de la superficie de adsorción, se
suspendió en 10 mL Tris-HCl (pH = 7.4, 10 mmol L -1) y se rompió ultrasónicamente en un
baño de hielo con 10 s de pulso y 10 s de pausa durante un período total de 3 minutos.

Después de la centrifugación (7000 rpm durante 10 min a 4 C), el las concentraciones de

NAP, PHE, PYR y petróleo crudo en cada uno de los sobrenadante se consideraban como
el contenido de la captación celular de
hidrocarburos del petróleo por el consorcio microbiano (Chen y Wang, 2011).
Se midió la concentración de sustrato (NAP, PHE, PYR y petróleo crudo) en 1, 4, 5, 8, 10,
12, 15, 16, 20, 24, 28 y 30 minutos, respectivamente. Todas las pruebas se hicieron en
duplicado.

2.6. Adsorción de hidrocarburos de petróleo por un consorcio de microbios

muertos por calor

La preparación experimental sobre el consorcio microbiano y medio de degradación eran

tan iguales como la Sección 2.4. El las células bacterianas matadas por calor fueron
obtenidas por autoclave en 121 C durante 20 min. Después de incubar durante 10, 20, 30,
40, 50 y 60 minutos, el medio de cultivo fue centrifugado (6000 rpm para 5 min a 4 C). La
concentración de NAP, PHE, PYR y crudo se determinó el aceite en el sobrenadante
individual. El peso seco de células bacterianas matadas por el calor fue medido por el
secado en el horno a 60 C hasta que alcanzó una constante. Todas las pruebas se
hicieron en duplicados.

2.7. Efecto del metal pesado en un consorcio microbiano

Se probó la resistencia a metales pesados, del consorcio microbiano en medio de peptona

de extracto de carne que contiene diferentes concentraciones (100, 50, 25, 12.5, 6.25,
3.125, 1.56, 0.78 g L À1) de cada metal pesado (CuSO4 Á5H2O, ZnSO4 Á7H2O y Pb
(NO3)2) en una serie de tubos, respectivamente.

Los tubos se inocularon con suspensiones de células microbianas (2ml) y luego se

incubaron a 35 ° C durante 3 días.
Los resultados fueron evaluado visualmente para el crecimiento en comparación con el
libre de metales pesados controlar la cultura.

La sensibilidad del consorcio microbiano contra metales pesados, fue ensayado en placas
de agar de peptona con extracto de carne de res que contienen filtros contaminados
papeles con diferentes concentraciones (2, 5, 10, 15, 20 g LÀ1) de cada metal pesado
(CuSO4 Á5H2O, ZnSO4 Á7H2O o Pb (NO3)2) por método modificado de difusión de
disco de Kirby Bauer (Bauer et al., 1996;
Máthé et al 2012).

Antes de la prueba, se inocularon placas con 100μL del consorcio microbiano y luego se
incubaron a 30 ° C por 2 d; papel de filtro (diámetro, 0,9 cm) esterilizado se empapó en
solución individual de metales pesados, y secada en la naturaleza.

Después de esto, las placas se volvieron a incubar a 30°C durante 24 h. Todas las
pruebas se realizaron en duplicados. En cuanto a la resistencia de metales pesados, el
crecimiento de el consorcio microbiano se evaluó de acuerdo con el diámetro de La zona
de inhibición.
El efecto del metal pesado en el consorcio microbiano que biodegradaba los
hidrocarburos del petróleo se ensayó en diferentes medios de degradación de
hidrocarburos (NAP 800 mg L1, PHE 40 mg L1, PYR 40 mg L1 y concentración de
petróleo crudo 3 g L1) en presencia de 0,5 g de L1 CuSO45H2O y 0,5 g de L1
ZnSO47H2O.

Estos medios de degradación fueron incubados con un 5% de microbios consorcio a 25 C

durante 7 d con agitación a 120 rpm, respectivamente, las concentraciones de NAP, PHE,
PYR y petróleo crudo fueron medidos por el método ultravioleta, respectivamente.

Todas las pruebas fueron hecho en duplicados.

2.8. Medición de la hidrofobia de un consorcio microbiano

y la tensión de la superficie del líquido:

El consorcio microbiano utilizado para el experimento de hidrofobia se cosechó después

de un cultivo de enriquecimiento para 1 d. El tubo que contenía 20 mg L1 cada medio de
degradación de sustratos (NAP, PHE, PYR y petróleo crudo) se pinchó con 5 mL de la
suspensión de células bacterianas, que se sellaron y cultivaron a 30 C durante 24, 36 y 48
h, respectivamente.

Después de girar durante 2 minutos, el medio se re cultivó a 30 C durante 1 h para

estratificar completamente la fase orgánica y la fase acuosa. La absorbencia inicial y final
A (menos de 1) de la suspensión microbiana en fase acuosa se midieron con el
espectrofotómetro ultravioleta Alpha - 1860 (Shanghai lab-spectrum instruments Co.
Ltd., China) a la longitud de onda de 600 nm (Chen y Wang, 2011).
Formula:
BATH =100% [1- (A1/Ao)]
donde;
• BATH (Adhesión bacteriana al hidrocarburo)
• Hidrofobia: porcentaje de un consorcio microbiano %.
• A1: la absorbencia final.
• A0: la absorbencia inicial.
El alcance del porcentaje de BATH estaba en 0-100%.
La hidrofobicidad de los microorganismos mejoró a medida que aumentó el valor
del BATH (Al-Tahhan et al., 2000).

La tensión superficial se probó en el proceso de biodegradación mediante el tensiómetro

digital BZY-2 (Shanghai Hengping Instrument, China).

El experimento de biodegradación se llevó a cabo en un medio de degradación de 20 mg

L1 de petróleo crudo y HAP mezclados (la concentración individual de NAP, PHE, PYR y
era de 20 mg L1) inoculados con un 10% de consorcio microbiano, respectivamente.

Se midió la tensión superficial de las muestras a 2, 5, 8, 9 y 10 d. Todos los ensayos se

hicieron por duplicado.

2.9. Biodegradabilidad de las enzimas periplasmáticas, citoplasmáticas y

extracelulares

Basado en el trabajo previo que había verificado que el consorcio microbiano podía
metabolizar efectivamente los hidrocarburos de petróleo, la degradación enzimática fue
explorada más a fondo para probar La distribución de la producción enzimática por el
consorcio microbiano, así como su función de degradación para diferentes sustratos. Se
empleó el método de choque osmótico para recolectar las enzimas en diferentes partes
de la célula (Chen et al., 2004; Chen y Wang, 2011; Yoo et al., 2012).

El medio de degradación que contiene sustratos mixtos (la concentración individual de

NAP, PHE, PYR y petróleo crudo fue 20 mg/L, respectivamente) fue inoculado con un
10% de microbios e incubado a 30 ° C con agitación a 120 rpm para 3 d. El sedimento
celular P1 se cosechó por centrifugación (6000 rpm durante 10 min a 4 C).

El sobrenadante se filtró (0,45 lm) para su eliminación de microorganismos fue S1. Luego
el sedimento P1 se lavó 2 veces con el agua destilada triple fría se resuspendió en 10 ml
de Tris-HCl (pH = 8, 10 mmol/L), centrifugado (6000 rpm durante 10 min a 4 ° C) y se filtró
(0,45 lm, S2).
El sedimento P2 se resuspendió en 10 ml de solución de sacarosa (25%), se agitó a 30°
C, 120 rpm durante 10 minutos, centrifugado (10.000 rpm durante 10 min a 4 ° C) y
filtrado (0,45 lm, S3). El sedimento P3 se lavó 2 veces con agua fría destilada triplemente
se resuspendió en 10 ml de agua fría destilada triple, se agitó un baño de hielo durante 10
min, centrifugado (13,000 rpm durante 10 min a 4 C) y filtrado (0,45 lm, S4).

Después de que el sedimento P4 se resuspendió en 10 ml de Tris – HCl (pH = 7.4, 10

mmol/L), la disrupción celular fue llevado a cabo en baño de hielo usando un procesador
ultrasónico durante 3 minutos, seguido de centrifugación (15,000 rpm durante 20 minutos
a 4 ° C) y filtración (0,45 lm, S5).

El filtrado S1, S2, S3, S4 y S5 se recogieron y guardado a 4 C, respectivamente las

enzimas periplasmáticas (S4), citoplasmáticas (S5) y extracelulares (S1, S2 y S3
mezclados) (10%, v / v) se inoculó en 20 mg/L de cada sustrato (NAP, PHE, PYR y
petróleo crudo) medios de degradación y cultivado a 30 ° C con agitación a 120 rpm
durante 1, 2, 5, 12 y 18 d, respectivamente.

Todas las pruebas se realizaron por duplicado. El control se realizó en las mismas
condiciones.

3. Resultados y discusión

3.1. La caracterización e identificación de bacterias.

Las Cuatro cepas bacterianas que componen el consorcio microbiano utilizado se

denominaron PH-1, PH-2, PH-3 y PH-4. Los resultados de sus pruebas fisiológicas y
clásicas bioquímicas se mostraron en la Tabla 1.

✔ Tenían diferentes colores de colonias y formas celulares.

✔ Todas las bacterias eran grampositivas y tenían otras características bioquímicas
individuales.
✔ La identificación molecular de las bacterias se realizó amplificando y secuenciando
el gen 16S rDNA y comparando las secuencias con la base de datos de secuencias
conocidas de 16S rDNA.
✔ Los árboles filogenéticos de las cuatro cepas se mostraron respectivamente en
Figura 1 (a – c). Las cepas seleccionadas para estructurar los árboles filogenéticos
tubo más del 99% de similitud en la secuencia de nucleótidos. El análisis de
secuencia del gen 16S rDNA.

la comparación de secuencia BLAST y el análisis filogenético confirmó que las bacterias

PH-1, PH-2, PH-3 y PH-4 estaban afiliados a Pseudomonas sp., Bacillus sp.,
Ochrobactrum sp. y Pseudomonas sp., respectivamente. El GenBank ID de ellos son
KF113575 (PH-1), KF113576 (PH-2), KF421109 (PH-3) y KF113577 (PH-4).

3.2. Adsorción superficial de hidrocarburos de petróleo por un consorcio

microbiano vivo
Para investigar la regla de transporte de la adsorción superficial de NAP, PHE, PYR y
petróleo crudo por un consorcio microbiano vivo de 1 a 1440 min, los resultados se
mostraron en la Fig. 2. Dentro del tiempo experimental, la tendencia de adsorción de la
superficie del petróleo crudo aumentó gradualmente en su conjunto, mientras que la de
NAP, PHE y PYR fue básicamente estable. La estabilidad de la adsorción superficial de
NAP, PHE, PYR y petróleo crudo por el consorcio microbiano siguieron un orden
decreciente de NAP> PHE PYR > petróleo crudo.

NAP, PHE y PYR fueron más fácil de absorber por el consorcio microbiano que el petróleo
crudo antes de 1 min y se infirió que el proceso de adsorción de superficie por un
consorcio microbiano fue un proceso rápido. En la misma concentración, el contenido de
adsorción de superficie de PHE fue mayor que el de PYR, mientras que PYR fue mayor
que NAP, lo que probablemente fue relevante con absorción selectiva de células.
Curiosamente, el contenido de adsorción superficial de PHE, PYR y petróleo crudo
disminuyó aproximadamente hasta el punto más bajo a los 20 min.

Todos estos fenómenos fueron resultado del comportamiento de bioadsorción de células

microbianas para HAP y alcanos, que fue controlado por los efectos distributivos con el
proceso de sorción-desorción siendo reversible (Chen et al., 2010; Ding et al., 2010).

Probablemente las concentraciones iniciales de los sustratos eran tan altos que los
sustratos fueron transferidos de La alta concentración a la baja concentración de la
superficie celular este proceso puede no estar asociado con la biodegradación a corto
tiempo. Sin embargo, en mucho tiempo la biodegradación podría estar presente y la
cantidad de microbios estaba aumentando.

3.3. Captación celular de hidrocarburos de petróleo por un consorcio microbiano

vivo

La Fig. 3 exhibió la absorción celular de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo por un
consorcio microbiano vivo a lo largo del tiempo para explorar la regla de transporte de
captación celular de diferentes sustratos. El consorcio microbiano tenía cierta capacidad
de transportar y enriquecer NAP, PHE, PYR y petróleo crudo, y este proceso puede estar
asociado con la biodegradación. el mayor contenido de absorción de NAP, PHE, PYR y
petróleo crudo por el consorcio microbiano fue de 0.04 mg/L a los 28 min, 0.19 mg/L en 30
min, 0.08 mg/L a los 20 min y 7.2 mg/L a los 16 min, respectivamente, que fueron
inferiores a su contenido de absorción superficial.

(Figura 2). La estabilidad de la absorción celular de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo
siguió el orden de NAP> PHE=PYR > petróleo crudo. A la misma concentración, el
contenido de absorción celular de NAP fue menor que el de PHE y PYR, mientras que el
contenido de absorción de PHE fue un poco más alto que el de PYR. Estos fueron los
mismos que los resultados de la Sección 3.2 (en la Fig. 2).
Se han propuesto tres posibles mecanismos de absorción de hidrocarburos (Beal y Betts,
2000).

• En el primer mecanismo, el microbio absorbe directamente el hidrocarburo disuelto

en la fase acuosa.

• En el segundo, la célula microbiana absorbe la partícula de hidrocarburo que está

disuelto o semidisuelto y mucho más pequeño que la célula.

• En el tercero, la célula microbiana contacta directamente con el hidrocarburo, que

es más grande que la célula, y luego absorbe el hidrocarburo debido a que los
hidrocarburos de petróleo tienen una fuerte hidrofobicidad, especialmente HAP, el
consorcio microbiano puede absorber el petróleo hidrocarburos por el segundo o el
tercer modelo.

*Aquí va la tabla*

Ha sido mostrado que algunos hongos absorben y almacenan HAP en vesículas lipídicas,
y el grado de absorción y mecanismos por los cuales los HAP atraviesan las paredes de
la célula , aún se desconocen (Thion et al., 2012).

Al estudiar el transporte de HAP por el aislamiento ambiental P. fluorescens cLP6a,

Bugget al. (2000) observaron un mecanismo de flujo de salida activo para PHE, antraceno
y fluoranteno, pero no para NAP o tolueno. Mediante explorar la adsorción superficial y la
captación celular de hidrocarburos del petróleo, la tendencia del transporte y la absorción
de sustratos por microbio sugirió que las vías de transporte de HAP (NAP, PHE y PYR) y
el petróleo crudo por consorcio microbiano era probablemente diferente.

Entonces, esta hipótesis fue propuesta. Comparación de HAP y petróleo crudo, la

adsorción superficial y el contenido de absorción celular del petróleo crudo por este
microbio aumentó ligeramente, mientras que el de los HAP fue básicamente estable.

Todo lo que probablemente fue el resultado de los componentes del sustrato y la

absorción selectiva de la célula.

tabla 1
90/5000
Fig. 1. Árboles filogenéticos de las cuatro bacterias: (a) PH-1 y PH-4, (b) PH-2 y (c) PH-3.
84/5000.

Fig. 2. Adsorción superficial de hidrocarburos de petróleo por un consorcio microbiano

vivo.

Fig. 3. Captación celular de hidrocarburos de petróleo por un consorcio microbiano vivo.

Fig. 4. Adsorción de hidrocarburos de petróleo por un consorcio microbiano matado por
calor.

Tabla 2. Susceptibilidad del consorcio microbiano contra metales pesados evaluado con
disco ensayo de difusión

Propiedades morfológicas, fisiológicas y bioquímicas de las bacterias del lodo

contaminado con aceite.

3.4. Adsorción de hidrocarburos de petróleo por un consorcio microbiano matado

por calor

Para explorar la adsorción de diferentes sustratos por un microbio matado por calor, la
regla de adsorción de hidrocarburos de petróleo se describió un consorcio microbiano
matado por calor a lo largo del tiempo en la Fig. 4. Los contenidos de adsorción de NAP,
PHE y PYR por el consorcio microbiano matado por calor fue constante, 2.1, 1.9 y 3.8
mg/g respectivamente, y siguió un orden de PYR> NAP> PHE.

Debido a la mayor hidrofobicidad de PYR, la eficiencia de adsorción de PYR fue mayor

que la de PHE y NAP, que fue consistente con los resultados de Ding et al. (2013) sin
embargo, el contenido de adsorción de NAP por consorcio microbiano matado por calor
fue superior a PHE, que fue diferente de los resultados de la Sección 3.2 y 3.3. La
absorción selectiva de la célula no se realizó en este proceso, que probablemente fue
relacionado con los componentes de la célula y las sustancias.

El contenido de petróleo crudo adsorbido en el consorcio microbiano matado por calor

disminuyó gradualmente, que fueron probablemente porque el petróleo crudo es una
mezcla compleja que contiene n-alcanos, aromáticos, resinas y asfaltenos, algunos de los
cuales fueron adsorbidos en las células muertas rápidamente. Sin embargo, debido a
muchos contaminantes polares ,orgánicos incluidos y la reversibilidad de la adsorción
realizada en el proceso, el petróleo crudo adsorbido fue liberado de las células muertas.

Chen y col. (2010) informaron que la bioadsorción de cuerpos muertos por calor estaba
relacionado con el coeficientes de partición de carbono normalizado.

Ding y col. (2013) pensó que la eliminación de HAP por cadáveres de Phanerochaete
chrysosporium fue solo atribuido a bioadsorción y exploró los respectivos coeficientes de
partición de PHE y PYR estos resultados se infirieron que la adsorción de hidrocarburos
de petróleo por consorcio microbianos matados por calor fue un proceso rápido; el
contenido de adsorción fue constante para la señal HAP, mientras que variable para el
petróleo crudo y re-demostró que el mecanismo de bioadsorción de los contaminantes
orgánicos no polares por biomasa muerta es partición (Chen et al., 2010; Ding et al.,
2010, 2013).

Yuan y col. (2010) había estudiado la adsorción de HAP del agua utilizando carbono
poroso derivado del coque de petróleo y descubrió que el porcentaje de adsorción de
NAP, PHE y PYR en los primeros 30 minutos fueron 99.1%, 95.2% y 93.4%,el cual fue
mayor que el contenido máximo de bioadsorción de superficie y célular por
microorganismo vivo y muerto (NAP, 31.3%; PHE, 20.6%; PYR, 14.6%) en tiempo
experimental (en comparación con las Figs. 2-4).

Así se puede ver ese contenido de adsorción física fue mucho más que la bioadsorción.
Sin embargo, su mecanismo, importancia y costos económicos eran completamente
diferentes, Además, siempre se espera que la biodegradación sea una alternativa
eficiente, económica y ecológica para la eliminación de contaminaciones (Zhang et al.,
2011).
3.5 Resistencia de un consorcio microbiano a metales pesados.

Los metales pesados son componentes comunes del petróleo crudo y derivados del
petróleo (Máthé et al., 2012).

Durante un aumento, largo contaminación a largo plazo con hidrocarburos de petróleo e

industrial contaminación, contaminaciones de metales pesados habían ocurrido con
frecuencia.

La susceptibilidad a metales pesados (tabla2) y resistencia de la se investigó el consorcio

microbiano. La concentración de CuSO4, 5H2O, ZnSO4, 7H2O y Pb(NO3)2 que fueron
más altos que 5gL 1 (Cu2+, 20 mM), 5 g L 1 (Zn2+, 17.4 mM) and 10 g L 1 (Pb2+, 30.2
mM) inhibieron el crecimiento del consorcio microbiano (tabla 2) respectivamente.
Diferentes concentraciones de metales pesados tuvieron varios efectos negativos sobre la
proliferación del consorcio microbiano.

El MTC (concentración máxima tolerada) del consorcio microbiano a metales pesados

CuSO45H2O, ZnSO47H2O and Pb(NO3)2, fueron 1.56 g L−1 (Cu2+, 6.2 mM), 0.78 g g L−1
(Zn2+, 2.7 mM) y 3.13 g g L−1 (Pb2+, 9.5 mM), respectivamente, que eran más altas que
las de f Cu2 +¿¿(3 mM) y Pb 2+¿¿ (3.5 mM), y poco más bajo que el de Z n2 +¿¿ (4 mM)
reportado por Máthé et al. (2012). Las MTC de metales pesados fueron mucho más altas
que las concentraciones de Pb (0.01–0.3 mg L−1), Zn (about 5 mg L−1) y Cu (1–10 mg L−1)
en agua de mar normal r (Zhang, 2004).

Estos resultados infirieron que el consorcio microbiano toleraba C u2 +¿¿ , Zn2 +¿¿ y Pb 2+¿¿ en
una mayor concentración. Para explorar el efecto del metal pesado sobre la
biodegradación de los hidrocarburos de petróleo por el consorcio microbiano, las tasas de
biodegradación de los hidrocarburos de petróleo en presencia de metales pesados (C u2 +¿¿
+, 1.7 mM y Zn2 +¿¿+2 mM) y se midió el control. Las tasas de biodegradación de NAP,
PHE, PYR y petróleo crudo fueron 53%, 21%, 32% y 44%, respectivamente. En
comparación con la condición óptima (Sección 2.1.3), disminuyeron lentamente (NAP,
80%; PHE, 30%; PYR, 56% y petróleo crudo, 48%). Pero también realizaron una
eficiencia de biodegradación mucho mayor.

Por lo tanto, el consorcio microbiano se desempeñó bien en la biorremediación de

hidrocarburos de petróleo en presencia de metales pesados, relativamente.

3.6 Emulsificabilidad de un consorcio microbiano y tensión superficial en medio de

degradación.

Para probar la actividad de biodegradación y la emulsificación del biosurfactante

secretado por el microbio, la tensión superficial y la hidrofobicidad del consorcio
microbiano se mostraron en la figura 5.

La hidrofobicidad del consorcio microbiano (Fig. 5a) cultivado en NAP, PHE, PYR y medio
de degradación de petróleo crudo fue superior al 55% a las 24 hy al 35% a las 72 h, lo
que indicó que el consorcio microbiano tenía una gran capacidad emulsionante y una alta
degradación actividad (Hassanshahian et al., 2012).

La hidrofobicidad del consorcio microbiano en cuatro muestras cambió ligeramente. Sin

embargo, la hidrofobicidad del consorcio microbiano se redujo gradualmente a lo largo del
tiempo. Estos resultados probablemente se debieron a que el consorcio microbiano que
degrada el sustrato condujo a la falta de fuente de carbono, por lo que la cantidad de
microbios disminuyó y la capacidad de emulsificación del consorcio microbiano para los
hidrocarburos de petróleo se debilitó.

Zhang et al. (2010) pensó la hidrofobicidad de Serratia spp. JC1 y JCN13 pueden estar
asociados con la concentración y la toxicidad del sustrato.

La tensión superficial (Fig. 5b) en el medio de degradación del petróleo crudo disminuyó
mucho más rápido que la de los HAP antes de los 5 días. Se infirió que los
biosurfactantes producidos por el consorcio microbiano eran más significativos para
reducir la tensión superficial del sobrenadante en el medio de petróleo crudo que la del
medio de HAP.

Los resultados también demostraron que el consorcio microbiano tenía una alta hidrofobicidad. Sin
embargo, la tensión superficial en el medio de degradación del petróleo crudo aumentó después de 8
días, que probablemente fue el resultado de los metabolitos de microorganismos y los productos de
degradación del petróleo crudo.

3.7. Papel de las enzimas periplásmicas, citoplasmáticas y extracelulares en la

biodegradación de hidrocarburos de petróleo.

El experimento se realizó de acuerdo con la Sección 2.9. Las curvas de degradación de

NAP, PHE, PYR y petróleo crudo por enzimas periplásmicas, citoplasmáticas y
extracelulares del consorcio microbiano en diferentes momentos se presentaron en la
figura 6a-d.

De 1 a 18 días, las tasas de degradación de NAP por las tres enzimas fueron
básicamente las mismas (Fig. 6a); el de PHE y PYR siguió un orden de enzima
periplásmica citoplasmática extracelular (Fig. 6b yc); el del petróleo crudo siguió un orden
de enzima citoplasmática> extracelular> periplásmica (Fig. 6d).

Todos exhibieron que las diversas partes de la enzima se desempeñaron de manera

diferente para varios sustratos. Para el petróleo crudo, la actividad enzimática intracelular
fue mayor que la extracelular. Sin embargo, tenían un comportamiento opuesto en
comparación con los HAP. Yousefl Kebria y col. (2009) pensaron que el éxito de la
biorremediación dependía de la biodegradabilidad inherente del contaminante, la
accesibilidad del contaminante degradado por microorganismos y de la optimización de la
actividad biológica.

Deive et al. (2009) detectó que la actividad lipolítica extracelular era menor que la
actividad enzimática intracelular. En nuestro experimento, el extracelular secretado por
este consorcio microbiano fue mucho más fácil de degradar los HAP que el petróleo
crudo. Las tasas de degradación de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo por tres enzimas
aumentaron a lo largo del tiempo en diferentes grados.
Por ejemplo, la degradación por enzimas extracelulares (Fig. 6d) fue menor de 1 a 12
días, mientras que fue más rápida que las otras dos muestras entre 12 y 18 días, lo que
puede atribuirse a la actividad enzimática y a la diferente estructura del sustrato.

Ye y col. (2011) se centró en la tasa de degradación de las enzimas extracelulares y las

células de Aspergillus fumigatus, y pensó que las tasas de degradación final por células o
enzimas no exhibían diferencias significativas y las enzimas extracelulares podían
metabolizar el antraceno de manera efectiva.

Este trabajo demostró que todas las enzimas contribuyeron a la eficiencia de

biodegradación de los sustratos y que la actividad enzimática fue diferente para varios
sustratos.

4. Conclusión
Un consorcio microbiano fue tolerante a 6.2 mM C u2 +¿¿ +, 2.7 mM Zn2 +¿¿ + y 9.5 mM P
b 2+¿¿, y realizó una alta actividad de degradación y emulsionabilidad para hidrocarburos de
petróleo. Las tasas de biodegradación de NAP, PHE, PYR y petróleo crudo fueron 53%,
21%, 32% y 44% en presencia de metales pesados. La estabilidad de la adsorción de
superficie y la absorción celular de sustratos por ella siguió un orden de NAP> PHE PYR>
petróleo crudo. El contenido de adsorción por el consorcio microbiano matado por calor
fue constante para los HAP, disminuyó para el petróleo crudo. La eficiencia metabólica de
las enzimas periplásmicas, citoplasmáticas y extracelulares secretadas por ella para
diversos sustratos fue diferente.