Journal of Information Processing and Management Word Template

Elsevier

Radarweg 29, Amsterdam

Elsevier Inca,b, Global Customer Serviceb,*
a
1600 John F Kennedy Boulevard, Philadelphia
b
360 Park Avenue South, New York

Formulación de un perfume con esencias obtenidas a partir de

procesos biotecnológicos y tradicionales
Gómez Leonardoa, Jiménez Dafnea, Farinango Romia, Orozco Margaritab, Rodarte Pamelac,
a
Departamento de Bioingenierías, Tecnológico de Monterrey, Estado de México, México
b
Departamento de Bioingenierías, Tecnológico de Monterrey, Querétaro, México
c
Departamento de Bioingenierías, Tecnológico de Monterrey, Ciudad de México, México

ABSTRACT
Los perfumes han ocupado un lugar importante entre los artículos de belleza de hombres y mujeres a lo
largo de la historia. Por años, las plantas han sido utilizadas como materia prima en la obtención de esencias
para la producción de perfumes. Hace años se observó que es más económico sustituir las sustancias naturales
por sintéticas. Recientemente se descubrió la capacidad de microorganismos, como levaduras y bacterias, de
producir metabolitos secundarios de olor agradable e incluso se han creado bacterias recombinantes que
produzcan compuestos aromáticos encontrados en plantas o que anteriormente eran sintetizados
químicamente. Esto ha disminuido los costos, así como el tiempo necesario para la de producción de perfumes,
debido a que los microorganismos tienen un tiempo de reproducción corto, la materia prima necesaria es
económica y los compuestos de interés pueden ser separados fácil y eficientemente. A lo largo de este estudio
se explicarán distintos métodos para la extracción de compuestos aromáticos que tienen potencial para su uso
en la perfumería.
Keywords: perfumes, microorganismos recombinantes, compuestos aromáticos, materia prima

campos, no sólo en el sector cosmético, sino también

1. Objetivo general
Obtener y comprender conocimientos en el área
biotecnológica y química para ser capaz de formular
un perfume con esencias obtenidas a partir de
procesos biotecnológicos y tradicionales.
2. Introducción
Los perfumes han ocupado un lugar importante
entre los artículos de belleza de hombres y mujeres a
lo largo de la historia. En la actualidad los perfumes
destacan en el mercado cosmético, llegando a ser
productos de alto valor agregado y de una demanda
significativa en muchos países. Sin embargo, las
fragancias tienen diversas aplicaciones en diversos
en detergentes, suavizantes, y otros productos de
casa donde la fragancia puede ser usada para
enmascarar olores desagradables de materias primas
(Dixon, 2011).
En la actualidad hay más de 7.000 materias
primas entre las que escoger para desarrollar un
perfume. Todas ellas están reguladas principalmente
por dos organizaciones: la IFRA (International
Fragance Association) y el RIFM (Research Institute
for Fragance Materials). En estas instituciones se
investigan y elaboran protocolos y recomendaciones
para que la utilización de sustancias sea segura,
aprobando o no su uso para la industria perfumista
(García, 2014).
 Por años, las plantas han sido utilizadas como
materia prima en la obtención de esencias para la
producción de perfumes. Hace años se observó que
es más económico sustituir las sustancias naturales
por sintéticas, lo cual deja mayor margen de
beneficios económicos al producir grandes
volúmenes (Dixon, 2011).
Recientemente se descubrió la capacidad de
microorganismos, como levaduras y bacterias, de
producir metabolitos secundarios de olor agradable e
incluso se han creado bacterias recombinantes que
produzcan compuestos aromáticos encontrados en
plantas o que anteriormente eran sintetizados
químicamente.
Concretamente, estos microorganismos
producen compuestos ampliamente usados para
colonias y aromatizantes, así como también en
procesos químicos para elaborar pinturas,
combustibles y otros productos. Introduciendo el
cambio genético adecuado al microorganismo, se
cambia el tipo de compuesto que este produce. La
materia prima empleada por los microorganismos
está basada en azúcares, los cuales se pueden obtener
de la biomasa renovable, así como de inductores que
hacen posibles las reacciones de transformación
(Schwartz, 2017).
Esto ha disminuido los costos, así como el
tiempo necesario para la de producción de perfumes,
debido a que los microorganismos tienen un tiempo
de reproducción corto, la materia prima necesaria es
económica y los compuestos de interés pueden ser
separados fácil y eficientemente.
3. Justificación
Los sabores y fragancias representan más de una
cuarta parte del mercado mundial y la mayoría de los
aromatizantes y compuestos de perfume se producen
mediante síntesis química o por extracción de
materiales naturales como plantas y animales. Las
plantas son una fuente importante de fragancias, pero
estos compuestos bioactivos están presentes en
pequeñas cantidades, lo que hace que su aislamiento
y formulación sean muy caros. La otra ruta biológica
para la síntesis de fragancias se basa en procesos
microbianos de novo (fermentación) o en
bioconversiones de precursores naturales utilizando
células microbianas o enzimas (biocatálisis).
Esta investigación se basa en el potencial de los
microorganismos para ser utilizados como pequeñas
biofábricas para la producción de sabores biológicos
y fragancias. Las bacterias son microorganismos con
una capacidad extraordinaria de adaptación a
diferentes condiciones ambientales, el conocimiento
del funcionamiento genético de las bacterias, sumado
al hecho de que son de fácil manejo en el laboratorio
y que tienen crecimiento rápido, han permitido
usarlas para realizar de manera acelerada la
producción de esencias para la elaboración de
productos como son los perfumes, fragancias,
colonias, ambientales, entre otras.
Estos metabolitos pueden ser sintetizados de
manera natural por el organismo en cuestión. Para la
Yarrowia lipolyitica, una especie de hongo
levaduriforme, la síntesis de una molécula que
produce olor a durazno ocurre como parte del
metabolismo basal del microorganismo. Al agregar
ácido ricinoleico, proveniente del aceite de ricino, al
medio de crecimiento, se lleva a cabo una reacción
de esterificación sobre la molécula mencionada,
dando como producto la 𝛾-decalactona, que produce
el olor de durazno
Sin embargo, es posible realizar modificaciones
genéticas que garanticen la síntesis de enzimas
específicas necesarias para la producción de
sustancias de interés como parte del metabolismo
primario o secundario. Una de las cepas más
utilizadas en experimentos de microbiología es
Escherichia coli. La cepa modificada Escherichia
coli DH5α, a la cual se le agrega el plásmido J23100-
ATF1, encontrado en la Saccharomyces cerevisiae,
el cual permite la síntesis de la enzima AFTI, enzima
transferasa que transforma el alcohol isoamílico
agregado al medio de cultivo; en acetato de isoamilo;
lo que produce el olor característico de plátano.
4. Experimentos
4.1 Materiales
El inóculo de E. coli DH5α transformada con
plásmido J23100-THF1 y de Yarrowia lypolítica
fueron proporcionados por la PhD. Ana Laura Huerta
Torres, Tecnológico de Monterrey, Estado de
México, México. Las flores de manzanillas fueron
obtenidas del mercado, Estado de México, México.
El hexano (99.9%) fue comprado en Fermont,
México. Caldo LB, dietiléter, acetato de etilo usados
fueron de Sigma-Aldrich, México. Toda el agua
utilizada para los procedimientos y formulaciones
fue destilada.
La muestra seca y las flores de manzanilla fueron
pesadas y se prosiguió con una extracción por
método soxhlet usando hexano (99.9%) como
solvente. Después de la extracción, se destiló con
rotavapor para separar la esencia del solvente.

4.1.2 Equipos 4.6 Formulación de fragancias

Centrífuga AllegraTM X-22R Beckman Coulter Se siguió el protocolo obtenido de García (2014).
Incubadora VWRTM Se agregó lentamente a un matraz, alcohol (96%, 640
Parrilla de calentamiento CIMAREC® mL/L) y los aceites esenciales (150 mL/L). El frasco
Equipo soxhlet se agitó suavemente hasta que los reactivos se
Rotavapor mezclaron. En otro matraz, se mezcló agua destilada
(150 mL/L) con el fijador universal (10 mL/L) y
4.2 Cultivo de Escherichia coli glicerina líquida (5mL/L). Esta mezcla se agitó y
después fue agregada lentamente a al matraz con
El inóculo de E. coli DH5α transformada con alcohol y aceites. Las fragancias obtenidas se
plásmido J23100-THF1, siguiendo el protocolo de guardaron en frascos.
Dixon (2011), se cultivó en medio LB con ampicilina
como marcador selectivo (100 µg/mL concentración
final) por 16 horas. Después se le agregó alcohol 5. Resultados y discusión
isoamílico (93.4 µL/mL concentración final) como
5.1 Cultivo de Escherichia coli
iniciador. Se dejó cultivar por 20 horas más. Las
condiciones de cultivo fueron a 37°C y con agitación Las densidades ópticas obtenidas a lo largo
a 130 rpm. del proceso de crecimiento de E. coli son mostradas
en la tabla 1. Como se puede observar en la gráfica
4.3 Extracción de acetato de etilo 1 la fase lag de crecimiento se observa entre las 12-
18 horas y el inicio de la fase estacionaria entre las
El cultivo de E. coli DH5α se centrifugó (4000 18-36 horas.
rpm, 10°C) en tubos de 15 mL y el sobrenadante fue
recuperado. Se realizó una mezcla de acetato de etilo Tiempo OD600 Bacterias/mL
y sobrenadante (1.5:1) que fue agitada en un embudo (horas)
de decantación. Después de la separación, la fase 0 0.014 ≈ 1.4 ∗ 107
orgánica fue recuperada y destilada con aparato 12 0.448 ≈ 4.48 ∗ 108
soxhlet. El compuesto se dejó en campana de 18 0.981 ≈ 9.81 ∗ 108
extracción por 24 horas para la evaporación de 36 1.158 ≈ 1.158 ∗ 109
residuos del solvente. Tabla 1. Crecimiento bacteriano a través del tiempo

4.4 Extracción de γ-decalactona Crecimiento bacteriano

1.4
El cultivo de Yarrowia lypolítica fue
1.2
centrifugado en tubos de 50 mL (4000 rpm, 10°C). 1
El sobrenadante recuperado se mezcló con dietiléter
OD600

0.8
(1:5) y fue agitado. La fase orgánica fue recuperada 0.6
y destilada con aparato Soxhlet. El compuesto se dejó 0.4
en campana de extracción por 24 horas para la 0.2
evaporación de residuos del solvente. 0
0 10 20 30 40

4.5 Extracción de esencia de manzanilla Horas

Gráfica 1. Absorbancia vs tiempo

5.2 Extracción de acetato de etilo en etanol (96%) para ser usados posteriormente en la
formulación de las fragancias. La extracción tuvo
El cultivo obtenido presentó el olor deseado una eficiencia de 1.86%, dada la cantidad de
a plátano. En la extracción líquido-líquido se utilizó manzanilla natural utilizada en un inicio, con la
acetato de etilo debido a que el acetato de isoamilo cantidad obtenida posterior a la destilación,
es miscible en este compuesto, lo que ayudó a que el siguiendo la ecuación 2.
compuesto de interés (acetato de isoamilo) se
𝑚𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
quedara en la fase orgánica. La destilación fue %= 𝑥100 (ec. 2)
𝑚𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
posible debido a la alta diferencia entre puntos de
ebullición. Para el acetato de etilo 77.1°C y para el 5.5 Formulación de fragancias
acetato de isoamilo 142°C (NCBI, 2019). Después de
las extracción y destilación, se obtuvieron 1.5 mL de
acetato de etilo que fueron utilizados posteriormente Extracto Olor Volumen [mL]
para la formulación del perfume.

5.3 Extracción de γ-decalactona Acetato de etilo Plátano 1.5

La extracción de la γ-decalactona fue exitosa,

sin embargo, esta no presentó el olor deseado γ-decalactona Sin olor 2
después de la primera extracción y destilación. De
acuerdo con lo reportado, el cultivo de
Saccharomyces cerevisiae debe incubarse de 4 a 7 Esencia de
días para percibir más fácilmente el olor a durazno Manzanilla 2
manzanilla
del compuesto; sin embargo, puesto que el tiempo del
proyecto no permitía comprehender estos intervalos,
no se obtuvo la calidad del olor esperado. Tabla 2. Resultados de esencias obtenidas
En la extracción líquido-líquido se utilizó
A partir de la cantidad de aceites esenciales
dietiléter debido a que la γ-decalactona es miscible
obtenidos en cada proceso (ver tabla 2.), se
en este compuesto, lo que ayudó a que el compuesto
prepararon 5 fragancias distintas. En la Tabla 3 se
de interés (γ-decalactona) se quedara en la fase
presentan las esencias con las cuales se formaron y
orgánica. La destilación fue posible debido a la alta
qué tipo de fragancia son.
diferencia entre puntos de ebullición. Para el
dietiléter 34.6°C y para la γ-decalactona 281°C
Número Contenido Tipo de
(NCBI, 2019). fragancia
Al comparar el rendimiento teórico del
cultivo en la producción de γ-decalactona, con el 1 ● Manzanilla Perfume
obtenido a partir de la extracción y destilación, se ● Bergamota
obtuvo un rendimiento porcentual del 57%, usando
la ecuación 1. 2 ● Manzanilla Agua de
● Ylang perfume
|𝛿𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 −𝛿𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 |
𝛿% = 𝛿𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜
∙ 100 (ec. 1)
3 ● Manzanilla Perfume
● Fresa
5.4 Extracción de esencia de manzanilla ● Vainilla

La extracción de manzanilla presentó una 4 ● E. coli Perfume

coloración amarillenta y un olor penetrante. Después (plátano)
de la evaporación quedaron sedimentos en el vaso de ● Chocolate
precipitado, dichos sedimentos fueron resuspendidos
 5 ● E. coli Agua de
(plátano) perfume
● Chocolate
Tabla 3. Formulación de perfumes
6. Propuesta del uso de Yarrowia lipolytica para
la producción de geosmina
El petricor o comúnmente conocido como
“aroma de lluvia” es producido por diferentes
compuestos que se hacen presentes cuando llueve
como aromas volátiles de plantas, concentraciones
de ozono y la geosmina, que es una molécula volátil
producida por actinomicetos (Gupta, Gupta. Garg y
Prakash, 2015).
La geosmina (figura 1) es una molécula que
es fácilmente percibida por humanos y animales, la
nariz humana puede percibir una concentración muy
baja de este compuesto de hasta 5 partes por trillón
(Hernandes, 2018). Debido a esto, se ha teorizado
que el alto nivel de percepción que tenemos para la
geosmina es una mejora evolutiva animal usada para
la identificación de lluvia cuando no se tenían
cuerpos de agua cercanos. Por la alta sensibilidad de
nuestra nariz a este compuesto la industria de los
perfumes ha comenzado a usarlo para mejorar sus
formulaciones, sin embargo; varios de los
microorganismos que forman parte de la división de
los actinomicetos y que producen geosmina son
patógenos por lo que su uso en productos de consumo
humano no es seguro.
Figura 1. Estructura 2D de la geosmina (PubChem, s.f.).
Yarrowia lipolytica es considerada como un
microorganismo “GRAS” por la Food and Drug
Administration de Estados Unidos, este término se
usa para denotar aquellos aditivos o Schwartz, Frogue, Misa y Wheeldon (2017), ya que
microorganismos que, de acuerdo a los expertos, son
seguros para su consumo (Food and Drug
Administration, 2018). Es por esto que su uso en la
producción de metabolitos de interés para el
consumo humano ha sido relevante en diferentes
industrias. Con base en esto se propone su uso para
la producción de geosmina para la industria de la
perfumería.
Debido a que la geosmina es un metabolito
secundario de naturaleza no proteica (Li, Imai, Ukita,
Sekine y Higuchi, 2004) es necesario contar con la
maquinaria necesaria para su síntesis en el sistema de
expresión seleccionado, es por esto que mediante
técnicas de ingeniería genética se propone la
transformación de Yarrowia lipolytica con el gen
SCO6073 (726 aminoácidos) de Streptomyces
coelicolor que contiene la información genética para
la síntesis de la germacradienol/geosmina sintasa
(EC:4.2.3.22 EC:4.2.3.75 EC:4.1.99.16), sin
embargo; Jiang, He y Cane (2006) demuestran en su
trabajo que basta con la expresión del dominio N-
terminal (366 aminoácidos) (Figura 2) para obtener
resultados catalíticos similares a los resultados
obtenidos con toda la enzima. Esta enzima es capaz
de realizar la biotransformación de pirofosfato de
farnesilo, intermediario de la ruta metabólica del
mevalonato, a germacradenienol y posteriormente a
geosmina.
Figura 2 . Estructura 3D del dominio N-terminal de la
germacradienol/geosmina sintasa (UniProt, 2019).
Se propone el uso de ingeniería genética para
la creación de un YAC (Yeast Artificial
Chromosome) de alta expresión que contenga el gen
SCO6073 y que permita altos rendimientos de
geosmina en en Y. lipolytica. Así mismo se propone
aumentar la expresión de la ruta metabólica del
mevalonato en la cepa PO1f conforme al trabajo de
de esta manera se aumentaría la concentración de
precursor para la geosmina. Finalmente se aconseja
evitar cualquier interacción de la geosmina con
ácidos ya que estos, al reaccionar con la geosmina,
producen argosmina, un compuesto similar en
propiedades a la geosmina pero sin su aroma
característico, lo cual vuelve inservible este
compuesto para su uso como aromatizante.
7. Conclusiones
La obtención de aceite esencial mediante el
proceso químico tradicional muestra un rendimiento
menor al de las esencias obtenidas a partir de
procesos biotecnológicos; ya que requiere del uso de
mayor materia prima y solventes. Lo que a su vez trae
consigo un mayor costo económico y ambiental.
Sin embargo, estos procesos aún presentan
áreas de oportunidad para realizar mejoras e
innovaciones, tales como la síntesis de compuestos
aromáticos, la extracción mediante el uso de mejores
solventes y la separación de sustancias que no son de
interés.
Agradecimientos
El presente trabajo de investigación fue
realizado bajo la supervisión de la Dra. Ana Laura
Huertas Torres y del M. En C. Jesús Calzada Frías
quienes nos gustaría expresar nuestro más profundo
agradecimiento, por hacer posible la realización de
este estudio. Además, de agradecer su paciencia,
tiempo y dedicación que tuvieron para que esto
saliera de manera exitosa. Gracias por su apoyo, por
ser parte de la columna vertebral de este artículo.
A los profesores del Departamento de
Ingeniería Química y Biotecnológica del campus
Estado de México por compartir sus conocimientos
con nosotros, por su tiempo, dedicación y por su
pasión por la actividad docente.
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