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4867-Article Text-17784-1-10-20130429 PDF
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UNIVERSITAS 2007
SCIENTIARUM
Revista de la Facultad de Ciencias
Vol. 12 N° 2, 69-81
Resumen
Con el fin de estandarizar metodologías que permitan determinar la concentración de bacterias nitrifican-
tes y denitrificantes en compost, se propuso evaluar el crecimiento de estas bacterias en dos concentracio-
nes diferentes del sustrato nitrogenado ((NH4)2SO4 y KNO3), en presencia y ausencia de CaCO3. Se utilizó
la técnica de número más probable (NMP), revelando los tubos con reactivo de Griess (nitrito), reactivo
de Nessler (amonio), y el polvo de zinc (nitrato). Se aplicaron 4 tratamientos para bacterias nitrificantes
y denitrificantes respectivamente, trabajando a concentraciones de 0.5 o 0.33 g de (NH 4)2SO4 y 0.5 o 2 g
de KNO 3, evaluados con respecto al mayor crecimiento de biomasa. No se encontraron diferencias
significativas en la biomasa de los días 14, 15 y 16 para las bacterias nitrificantes, pero el día con mayor
reporte fue el 15 con 115.88 NMP/g de compost, asimismo no se presentaron diferencias significativas
que para las bacterias denitrificantes el día 15 y 16 arrojaron el mismo resultado con 31.42 NMP/g de
compost. El tratamiento 1 hasta el día 15 (0.5 g de (NH4)2SO4 con 1 g de CaCO3 en nitrificantes y 0.5 g de
KNO 3 con 5 g de CaCO 3 en denitrificantes) presentó mayor recuperación con recuentos de bacterias
nitrificantes y denitrificantes con 112.67 NMP/g de compost y 27.53 NMP/g de compost respectivamen-
te, al día 15. Se demostró que el sustrato nitrogenado, y la adición del carbonato de calcio son importantes
para mantener del pH en el medio, promoviendo las reacciones enzimáticas asociadas.
Palabras clave: compost, desnitrificación, nitrificación, número más probable.
Abstract
In order to standardize methodologies that allow to determine the concentration of nitrifying and denitrifying
bacteria in compost, bacteria growth was evaluated at two different concentrations of nitrogen substrate
(NH 4)2 SO4 and KNO3), with and without calcium carbonate. Technique used was the most probable
number (MPN), revealing the tubes by means Griess reagent (nitrite), Nessler reagent (ammonium), and
the zinc powder (nitrate). Four treatments for nitrifying and denitrifying bacteria were applied respectively,
with concentrations of 0,5 or 0,33 g of (NH4) 2SO4 and 0,5 or 2g of KNO3. Biomass production was
evaluated. No significant differences were evidenced in biomass of days14 th,15th and 16th for nitrifying
bacteria; however, 15 th day 115.88 MPN/g of compost was obtained for nitrifying bacteria, and 31.42
MPN/g for denitrifying bacteria. Treatment 1 (0.5g of (NH4)2SO4 with 1g of CaCO3) in nitrifying and 0.5g
of KNO3 with 5g of CaCO3 in denitrifying group represent the best biomass condition: 112.67 MPN/g and
27.53 MPN/g of compost. 15 days were necessary for incubation because it is the time needed to activate
enzymes regulating pH with addition of the CaCO3.
Keywords: compost, denitrification, nitrification, most probable number (MPN).
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NMP a partir de la determinación del nú- 2000), por medio del software estadístico
mero de tubos positivos, en cada dilución Statistix 8.1.
para bacterias oxidantes de amonio y
reductoras de nitrato, respectivamente. Se Resultados y discusión
adicionaron 2 gotas del reactivo Griess
(Valerie y Bardin, 1995) con el fin de reali- Las muestras de compost de flores recolec-
zar la detección de nitritos. Los datos fue- tadas en Cultivos del Norte, para la prueba
ron anotados según el número de tubos de estandarización del tiempo de incuba-
positivos y negativos por dilución. A los ción del NMP de bacterias nitrificantes y
tubos negativos se les adicionó polvo de denitrificantes presentaron un promedio de
zinc (Girard y Rougieux, 1964) para detec- temperatura de 21ºC con un rango mínimo
tar la presencia de nitrato en el medio, los de 19ºC y máximo de 24ºC y pH entre 7.89
que no cambiaron fueron considerados y 8.54.
como tubos negativos a los cuales se les
adicionó reactivo de Nessler (Mariorri et La importancia que tiene el período de
al., 1982), y así se confirmó la presencia de incubación de muestras (Belser, 1977) en
amonio y nitrato indicativo de que no ocu- general para todos los procesos y en este
rrió proceso de nitrificación y desnitrifica- caso para los relacionados con el nitróge-
ción respectivamente. Luego se realizó el no, fue la razón por la cual se tomaron 11
recuento por medio de las tablas de Cochran muestras para la estandarización del tiem-
(1950), con el ajuste respectivo de las di- po y cinco para la estandarización de las
luciones tomadas para leer (Schmidt y sales, ya que con el seguimiento realizado
Belser 1982; Verhagen y Laandbroek 1991; durante siete días fue posible reconocer la
Deni y Penninckx 1999). fluctuación de los valores de NMP/g.
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Con el fin de establecer el mejor día para Verhagen y Laanbroek 1991, indican que
hacer la lectura después de la incubación, 15 días es el tiempo suficiente para que las
obteniendo mayor biomasa en caldo bacterias amonio-oxidadoras pasen el
amonio, se calcularon las medias para cada amonio a nitrito, en condiciones óptimas,
una de las muestras registrando el mayor lo que sugiere que se gastaría un mes para
crecimiento el día 15 (figura 1). Dichos evidenciar la presencia de bacterias nitrito
datos no se distribuyeron normalmente se- oxidadoras, ya que en los últimos 15 días
gún la prueba de Shapiro Wilk, por tanto se de incubación ocurriría el paso de nitrito a
aplicó la prueba de Kruskal-Wallis con un nitrato, si se parte de caldo amonio como
a=0,05, obteniendo un p á0,00001, con lo sustrato. Según Yuan et al., 2005 y
que se demostró nuevamente que el mayor Degrange y Bardin, 1995, el color de los
índice de crecimiento fue del día 15. tubos persiste luego de un mes de incuba-
ción a 28ºC. Con este fenómeno se sugiere
Aunque no se presentaron diferencias sig- que el NO2 puede coexistir con el NO3 en el
nificativas entre la concentración de bac- medio amonio del NMP y los reactivos no
terias de los días 14, 15 y 16, la concentra- diferencian entre NO 3 y NO 2 . Belser y
FIGURA 1. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes con
desviación estándar
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FIGURA 2. Registro de las medias del NMP/g de bacterias nitrificantes el día 15 de las
muestras recolectadas para la estandarización del tiempo de incubación
Schmidt, 1978, afirman que el NMP es un bacterias denitrificantes en caldo nitrato del
acercamiento tradicional a estudiar la di- NMP, se calcularon las medias para cada
námica de población de nitrificantes en una de las muestras registrando el mayor
suelo, y por tanto esta técnica debe leerse crecimiento los días 15 y 16 (figura 3). Di-
cuando se observe la mayor cantidad de chos datos no se distribuyeron normalmente
tubos positivos, ya que por razones fisico- según la prueba de Shapiro Wilk por tanto
químicas, las poblaciones desaparecen a se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis con
menudo con la incubación. un a=0.05, obteniendo un p á0.00001, con
lo que se demostró nuevamente que el ma-
Por tanto cabe la posibilidad de que pasa- yor índice de crecimiento se evidenció los
dos 15 días de incubación con nitrito o ni- días 15 y 16. Con la lectura del NMP para
trato formado puede suceder desnitrifica- bacterias denitrificantes se obtuvo una con-
ción incompleta que podría formar oxido centración máxima de 39 NMP/g de
nitroso que se va a perder, por la cual los compost, a partir de la muestra 4, mientras
resultados de biomasa del día 16 en ade- que la mínima fue 23.3 NMP/g de compost
lante resultaron menores, al reaccionar di- obtenido de la muestra 3 (figura 4).
chos compuestos con el reactivo de Griess
(Valerie y Bardin, 1995) o el polvo de zinc. Aunque Belser 1977, indica que los expe-
También puede que se haya dado el ciclo rimentos con bacterias denitrificantes re-
completo del nitrógeno en algunos micro- quieren tres semanas como tiempo de
sitios por presencia de bacterias capaces de incubación, en el presente estudio se evi-
reducir en bajas condiciones de oxigeno, denció que luego del aumento inicial de
llevando NO 3 a N 2 (Cadrin, 1997), o por biomasa seguido de una estabilización el
último realice una reducción desasimilato- número de individuos disminuye en fun-
ria que lleve el nitrito o nitrato formado a ción del tiempo.
amonio nuevamente, razón por la cual los
tubos dieron resultados negativos a la re- En cuanto a la utilización del nitrato como
acción con el reactivo de Nessler. fuente de nitrógeno Samuelsson y
Gustafsson 1988, describen mayor la acu-
Con el fin de establecer el día de incuba- mulación de oxido nitroso en la siembra
ción en que se obtuvo mayor biomasa de con caldo nitrito comparada con la produc-
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FIGURA 3. Registro diario de las medias del NMP/g de bacterias de denitrificantes con
desviación estándar
ción en medio con nitrato, posiblemente falsos negativos; este factor fue controlado
por la reducción del nitrito, en respuesta a con la observación diaria de la capacidad
la toxicidad del mismo (Kaspar, 1982). de reducir nitrato a nitrito (Valerie y Bardin,
1995).
Adicionalmente Samuelsson 1985, encon-
tró que la desnitrificación puede llevarse a Letey et al., 1980, indicaron que la enzima
cabo en caldo con medio nutritivo a las 12 nitrato reductasa desasimilatoria tiene la
horas de incubación, de modo que la reac- capacidad de desarrollarse rápidamente,
ción con el polvo de zinc pudo haberse mientras que la enzima óxido nitroso
inactivado después del un período de al- reductasa desasimilatoria se desarrolla len-
macenamiento; por tanto, algunos de los tamente luego del inicio de las condicio-
tubos pudieron haber arrojado resultados nes anóxicas.
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FIGURA 5. Registro de las medias por tratamiento del NMP/g de bacterias nitrifican-
tes con desviación estánda
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hidroxilamina, por tanto el nitrógeno se sentó en el medio. Según Smith et al., 1982,
estaría perdiendo sin comenzar un proceso esta acumulación de nitrito puede tener
de nitrificación, y en el caso del T3 sería efectos tóxicos representados en la inhibi-
más rápida la pérdida al tener menor canti- ción en el sistema de reducción enzimático.
dad de amonio en el medio. No obstante algunas especies como Pseu-
domonas aeruginosa son capaces de redu-
En la estandarización de dos concentracio- cir nitrato con acumulación de nitrito en el
nes de KNO3 y la adición de CaCO3 sobre la medio (Samuelsson, 1985). Es de aclarar
recuperación de biomasa, actividad y con- que los niveles de nitrito acumulado de-
tribución del mayor recuento de bacterias penden de la concentración inicial de ni-
denitrificantes por la técnica del NMP fue- trato en el medio, ya que Blaszczyk et al.,
ron calculadas las medias para cada una de 1985, afirma que en altas concentraciones
las muestras. T1 presentó mayor recuento de NO3 la cantidad de nitrito acumulado
con 27,5 NMP/g de compost con diferen- podría llegar a ser casi 1 g de N por litro de
cias significativas frente a los demás trata- medio y que definitivamente la acumula-
mientos (figura 6). ción de nitrito durante la reducción de ni-
trato depende del equilibrio apropiado y
Smith et al., 1982, demostraron que con la no apropiado de las fuentes de carbono y
baja concentración de glucosa y nitrato el nitrógeno.
producto predominante es nitrito eviden-
ciándose amonio. Igualmente Samuelsson Por otra parte, es posible que con la adi-
1985, plantea que cuando Pseudomonas ción de CaCO3 haya sido posible la regula-
putrefaciens fue cultivado anaeróbicamen- ción del pH del medio nitrato de modo que
te con glucosa como fuente de carbono y se facilitó la recuperación de bacterias
nitrato como aceptor de electrones, el con- denitrificantes. McKeeney, 1985, encontró
sumo de nitrato y la producción de nitrito que en suelo que las condiciones suave-
presentan el mismo patrón reportado para mente ácidas pueden llegar a inducir
Citrobacter sp. reduciendo el nitrito a autodescomposición de ácido nitroso, cons-
amonio tan pronto como el nitrato se pre- tituyendo uno de los principales mecanis-
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mos de pérdida de nitrito (Van Cleemput et duce en ciertas etapas. También se eviden-
al., 1976). Del mismo modo la descompo- ció la gran cantidad de bacterias nitrifican-
sición de HNO2 es dependiente de pH y es tes presentes, lo que es muy bueno para los
más significativa con un pH menor a 5 procesos agrícolas, al ser usado el compost
(Smith y Chalk 1980). como un insumo asegura de cierto modo el
ciclaje de nitrógeno en el suelo.
Asimismo, la adición de cobre en la solu-
ción de oligoelementos presente en el cal- LITERATURA CITADA
do nitrato, pudo haber estimulado la enzi-
ma oxido nitroso reductasa compensando ANDERSON, I. y LEVINE, J., Relative rates
así, la sensibilidad del dicha enzima por el of nitric oxide and nitrous oxide pro-
oxigeno. Es importante destacar que es duction by nitrifiers, denitrifiers, and
posible que numerosas especies bacterianas nitrate respirers. Applied and Environ-
puedan llevar a cabo procesos de denitrifi- mental Microbiology, 1986, (51), 938-
cación en medios de cultivo pero este he- 45.
cho no asegura que el organismo sea capaz
BEIJERINCK, M. y MINKMAN, D., 1909.
de hacer lo mismo en suelo u otro sustrato
Bildung und Verbrauch von Stickstof-
(Nash y Bollag, 1974). Beijerinck et al.
foxydul durch Bakterien. Zentralbl.
1970, encontraron que algunos organismos
Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr,
denitrificantes en el suelo, como Bacillus
Hyg: Abt., 1909, 2 (25), 30-63.
sp. al ser incubado con nitrato no favorecía
el proceso de desnitrificación. BELL, L. y FERGUSON, S., Nitric and ni-
trous oxide reductases are active un-
CONCLUSIONES der aerobic conditions in cells of
Thiosphaera pantotropha. Biochemi-
La técnica del número más probable para cal Journal, 1991, (273), 423-7.
bacterias nitrificantes y denitrificantes en
compost, se estandarizó con una concen- BELSER, L., Nitrate reduction to nitrite, a
tración de sustrato nitrogenado de 0.5 g de possible source of nitrite for growth of
(NH4)2SO4 con 1 g de CaCO3 en nitrifican- nitrite-oxidizing bacteria. Applied and
tes y 0.5 g de KNO3 con 5 g de CaCO3 en Environmental Microbiology, 1977,
denitrificantes presentando mayor recupe- (34), 403-10.
ración con recuentos de bacterias nitrifi-
cantes y denitrificantes con 112.67 NMP/g BELSER, L. y SCHMIDT, E. Diversity in
de compost y 27.53 NMP/g de compost res- the Ammonia-Oxidizing Nitrifier
pectivamente, al día 15. Population of a Soil. Applied and En-
vironmental Microbiology, 1978, (36),
Se demostró la importancia del CaCO 3 en 584-8.
el medio, como buffer para mantener el pH
BETLACH, M. y TIEDJE, J., Kinetic expla-
debido a que la carencia de este puede dis-
nation for accumulation of nitrite, ni-
minuir las reacciones enzimáticas y por
tric oxide, and nitrous oxide during
ende la biomasa producida.
bacterial denitrification. Applied and
Environmental Microbiology, 1981,
Se pudo evidenciar la presencia de bacte- (42), 1074-84.
rias denitrificantes en un proceso de
compost aeróbico, lo cual demuestra la BLASZCZYK, M., GALKA, E., SAKOWICZ,
microaerofilia o anaerobiosis que se pro- E. y MYCIELSKI, R. Denitrification
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