Efectos de las proteínas de soja e

hidrolizados en las propiedades de fusión y

fusión de glóbulos de grasa del helado
Los enlaces del autor abren el panel de
superposiciónWenpu Chen abGuijiang Liang abXiang LicZhiyong He abMaomao Zeng abDaming G
ao abFang Qin abH. Douglas GoffdJie Chen ab
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https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2019.02.045Obtenga derechos y contenido

Reflejos
•
La hidrólisis selectiva condujo a hidrolizados con diferentes perfiles de
polipéptidos.
•
La interacción entre las subunidades SPI y los monoglicéridos decidió las
propiedades de fusión.
•
El helado SPHPe muestra insuficiente coalescencia parcial de grasa y
velocidad de fusión rápida.
•
El helado con SPHPa exhibió propiedades de fusión similares a las de la
proteína de la leche.

Resumen
Se investigó el efecto del aislado de proteína de soja y sus hidrolizados sobre la
estabilidad de la mezcla de helado y las propiedades de fusión del helado. Los
helados se hicieron con 10% de grasa de leche, 3.5% de proteína y 34.3% de
sólidos totales, y todos contenían 0.15% de monoglicéridos agregados. Las
proteínas utilizadas fueron el aislado de proteína de soja nativa (NSPI), el aislado
de proteína de soya comercial (CSPI), la proteína de soja hidrolizada por pepsina
(SPHPe), la proteína de soja hidrolizada por papaína (SPHPa) y la leche
 descremada en polvo.(SMP) El helado con SPHPe que contiene la composición
relativa más alta de la subunidad β mostró una buena estabilidad de la emulsión
de la mezcla y una velocidad de fusión rápida porque la subunidad β no puede ser
desplazada por los monoglicéridos, lo que conduce a la falta de coalescencia
parcial de grasa en el helado. El helado SPHPa exhibió una funcionalidad
comparable a SMP en propiedades reológicas y de fusión. Los resultados de
SDS-PAGE indicaron que la subunidad α, la subunidad α ', la subunidad ácida, la
subunidad básica y el polipéptido de molécula pequeña fueron desplazados por
los monoglicéridos durante el envejecimiento del helado. La hidrólisis selectiva
de la proteína de soja se puede usar para helado con suficiente coalescencia
parcial de grasa y buenas tasas de fusión.

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Palabras clave
Aislado de proteína de soja
Hidrolizados
Helado

1 . Introducción
El helado es un complejo sistema de emulsión alimentaria con cristales de hielo,
glóbulos de grasa dispersos y células de aire, estructuras de proteínas
hidrocoloides y una fase acuosa continua no congelada. Un mayor grado de
desestabilización de la grasa (un alto nivel de grupos de glóbulos de grasa
parcialmente unidos) estabiliza la fase de aire y contribuye a los atributos físicos
del helado, como la textura y las propiedades de fusión ( Goff y Hartel,
2013 ). Tradicionalmente, la proteína de la leche.es una fuente importante en la
fabricación de helados debido a sus múltiples funcionalidades deseables, que
incluyen la estabilización de las gotas de grasa mediante repulsión estérica, la
interacción con emulsionantes en la interfaz, la estabilización de las burbujas de
aire y la mejora de la viscosidad de la fase no congelada para evitar el
crecimiento de cristales de hielo más grandes además de su función nutricional
( Dickinson, 2003 ; Goff y Hartel, 2013 ). El papel de la proteína de la leche en el
helado se ha explorado por completo en la retención de la forma, la
desestabilización de los glóbulos grasos y las propiedades de fusión ( Alvarez,
Wolters, Vodovotz y Ji, 2005 ; Daw y Hartel, 2015 ; Patel, Baer y Acharya,
2006 ).
La proteína de soja se considera una alternativa o extensión de la proteína de la
leche en los sistemas alimentarios debido a su disponibilidad, propiedades
emulsionantes, fuente derivada de plantas y beneficios para la salud ( Abdullah et
al., 2003 ; Anderson, Smith y Washnock, 1999 ; Biswas, Chakraborty y
Choudhuri, 2002 ). Como un emulsionante macromolecular con naturaleza
anfifílica, el aislado de proteína de soja estabiliza las interfaces aceite-agua
formando una película viscoelástica en la interfaz aceite / agua ( Palazolo,
Mitidieri y Wagner, 2003 ; Puppo et al., 2008 ). Las características del aislado de
proteína de soja, como la solubilidad y la emulsificación, permiten su uso en
helados (Dervisoglu, Yazici y Aydemir, 2005 ; Friedeck, Aragul-Yuceer y Drake,
2003 ). La adición de aislado de proteína de soja en el helado reduce el efecto del
choque térmico sobre la recristalización del hielo y la velocidad de fusión
( Pereira, Resende, Abreu, Giarola y Perrone, 2011 ). Al reemplazar la leche
descremada parcial en polvo con extracto de soja en helado, se lograron cristales
de hielo más pequeños y se minimizó la recristalización del hielo bajo
fluctuaciones de temperatura ( Pereira et al., 2011 ). Sin embargo, el aislado de
proteína de soja 100% como fuente de proteína en la fórmula condujo a una
mezcla altamente viscosa y a un helado resistente a la fusión ( Akesowan,
2009 ; Dervisoglu et al., 2005) Ha habido algunas investigaciones publicadas
sobre la funcionalidad de la proteína de soja en la formación de la estructura del
helado. La proteína de soja con mayor peso molecular y estructura compacta
tenía una actividad superficial limitada en la interfaz aceite / agua debido a la
lenta velocidad de difusión y adsorción ( Santiago et al., 2008 ), lo que puede
afectar la formación de coalescencia parcial de grasa durante la congelación de
helados. Por lo tanto, la producción de helado de alta calidad con proteína de soja
requeriría una viscosidad de mezcla de helado comparable a la de la proteína de
la leche y la formación de coalescencia de grasa parcial, que son necesarias para
una estructura de espuma estable en el helado, la sequedad de retención de la
forma y la lentitud de la fusión ( Goff, 1997) La optimización de las
funcionalidades de la estructura de la proteína de soja es de interés para lograr un
alto grado de coalescencia parcial de glóbulos de grasa en la fabricación de
helados.
Se ha utilizado una hidrólisis enzimática limitada de proteínas para exponer
grupos hidrofóbicos ocultos y aumentar la flexibilidad molecular, lo que indica
una buena afinidad en la interfaz aceite / agua ( Conde y Patino, 2007 ; Panyam y
Kilara, 1996 ). Cui, Zhao, Yuan, Zhang y Ren (2013)informó que la hidrólisis
enzimática limitada con pepsina aumentó la actividad emulsionante y logró
glóbulos de grasa más pequeños en comparación con la proteína de soja
intacta. El objetivo de este estudio fue aplicar pepsina y papaína para modificar la
proteína de soja para hidrolizados con diferentes propiedades viscoelásticas e
interfaciales e identificar la composición principal de proteína de soja que puede
afectar las propiedades de microestructura y fusión del helado. Para este
propósito, el helado y sus mezclas formuladas con diferentes hidrolizados de
proteína de soya se caracterizaron por reología , distribución de tamaño de
partículas, cantidad y perfil de péptido de la proteína adsorbida en la interfaz
aceite / agua, velocidad de fusión y estructura por microscopía confocal.

2 . materiales y métodos
2.1 . Materiales

La soja se obtuvo del mercado local (Wuxi, China). El aislado de proteína de

soja (SPI) se preparó de acuerdo con el procedimiento proporcionado por Diftis y
Kiosseoglou (2006) . Se usó el método de Kjeldahl (N x 6.25) para determinar el
contenido de proteína de las muestras ( Ryan et al., 2008 ). El aislado de proteína
de soja comercial (CSPI) se obtuvo de Solae, EE. UU. La leche descremada en
polvo (SMP), la mantequilla sin sal (Anchor) y la lactosa se obtuvieron de
Fonterra, Nueva Zelanda. La composición principal de SMP incluye 35%
de proteína de leche , minerales, lactosa y menos del 1% de contenido de
grasa. Jarabe de maízlos sólidos (36DE) se obtuvieron de Cargill, China. Se
obtuvieron goma de guar, guar de haz de langosta y monoglicéridos de Danisco,
China. La pepsina (3000 U / mg) se adquirió en Sangon Biotech, Shanghai,
China y la papaína (2000 U / mg) se adquirió en Regal, Shanghai, China. Se
usó agua desionizada como ingrediente agua y todos los demás productos
químicos utilizados fueron de grado analítico a menos que se especifique lo
contrario.

2.2 . Preparación y caracterización del aislado de proteína de soja y sus

hidrolizados.

El aislado de proteína de soja comercial (CSPI) se reconstituyó y centrifugó para

eliminar la porción insoluble (320 x g , 5 min, 25 ° C). El sobrenadante se
liofilizó para obtener polvo. Para el aislado de proteína de soja nativa y sus
hidrolizados, las escamas de proteína de soja desgrasadas se dispersaron en un
peso de agua destilada de 9 veces a 25 ° C, y el valor del pH de la suspensión se
ajustó a 8,0 con NaOH 2M. La suspensión se agitó durante 120 min y se
centrifugó (10000 x g , 20 min, 25 ° C) para eliminar la porción insoluble. El
sobrenadante se ajustó a pH 4,5 con HCl 2 M y la cuajada de proteína de soja
precipitada con ácido se recogió por centrifugación (3300 x g, 10 min, 25 °
C). Se prepararon tres porciones de cuajada de proteína de soja precipitada con
ácido. La primera porción se hizo como aislado de proteína de soja nativa
(NSPI). El precipitado se dispersó en un peso 4 veces mayor de agua y se
neutralizó a pH 7,0 con NaOH 2 M antes de liofilizar.
La segunda porción de cuajada se dispersó en agua hasta la concentración final al
5% (p / v) a 40 ° C y el pH se ajustó a 2,0 con HCl 2M. Se añadió pepsina a la
dispersión de SPI con una relación de enzima a SPI de 0,3% en peso con
agitación. La suspensión se incubó a 40 ° C durante 2 h y se terminó por
tratamiento térmico (120 ° C, 15 s). El precipitado recogido se dispersó en un
peso 4 veces mayor de agua destilada y se neutralizó a pH 7,0 con NaOH 2 M
antes de liofilizar. En lo sucesivo se denominará proteínas de soja hidrolizadas
por pepsina (SPHPe). La tercera porción de cuajada se dispersó en agua a una
concentración del 5% (p / v) y se ajustó a pH 7,0 con NaOH. Se añadió 0,5% en
peso de papaína y se incubó durante 30 minutos a 50 ° C. La reacción se terminó
por tratamiento térmico (120 ° C, 15 s). La solución se liofilizó para obtener
proteínas de soja hidrolizadas por papaína (SPHPa). El contenido de proteína en
NSPI, CSPI, SPHPe y SPHPa es 79.5%, 81.4%, 68.0% y 77.8%. El resto de la
composición principal en NSPI, CSPI, SPHPe y SPHPa son carbohidratos
solubles, minerales y una cantidad muy pequeña deresiduo de aceite de soja .
El grado de hidrólisis (DH) se determinó mediante el método TNBS descrito
por Adler-Nissen (1979) . El índice de actividad emulsionante (EAI) y el índice
de estabilidad de la emulsión (ESI) de las muestras se determinaron mediante el
método descrito por Guo et al. (2015) .
Los perfiles de polipéptidos del aislado de proteína de soja y sus hidrolizados se
determinaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio y
poliarilamida (SDS-PAGE) de acuerdo con el procedimiento proporcionado
por Li et al. (2016) y Keerati-u-rai y Corredig (2009) , con ligeras
modificaciones. Para el análisis se utilizó un sistema de electroforesis de mini
proteínas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Para los ingredientes
crudos, el aislado de proteína de soja y sus hidrolizados se disolvieron en el
tampón (0,0625 M de Tris-HCl, 10% de glicerina , 2% de SDS y 0,0025% de
azul de bromofenol) a una solución de proteína de 1 mg / ml. Después de calentar
durante 3 minutos en agua hirviendo y centrifugar a 5000 x gdurante 10 minutos
a temperatura ambiente con una centrífuga TGL-16G 144 (Anting Scientific
Instrument Co. Ltd., Shanghai, China), se cargaron alícuotas (20 μL) de las
muestras preparadas en los geles. Para la proteína adsorbida en los glóbulos de
grasa en los helados descongelados, las mezclas se centrifugaron a 10000 xg
durante 45 minutos a 25 ° C en una centrífuga con temperatura controlada
(SIGMA 3K15, SIXMA, Alemania). Se recogió la crema y se secó sobre el papel
de filtro. La crema recolectada se volvió a suspender con agua ultrapura hasta el
volumen inicial y luego se mezcló con la misma cantidad de tampón para la
determinación de la composición usando electroforesis. Se usó azul brillante de
Coomassie (G-250) para teñir el gel. Todos los geles se escanearon mediante un
densitómetro informático (Molecular Imager ChemiDocXRS +, Bio-Rad, EE.
UU.) Se utilizó el software Image Lab (Bio-Rad, EE. UU.) Para integrar las
intensidades de las bandas.

2.3 . Formulación de helados y procesamiento.

Se prepararon mezclas de helado con la formulación en la Tabla 1 con el mismo

contenido de proteína (3,5% p / p). Cada mezcla de helado se pasteurizó a 85 ° C
durante 1 min. Posteriormente, la mezcla pasó por un homogeneizador de 2
etapas (17.2 / 3.4 MPa) (NANO Homogenize Machine, Modelo AH-Basic, ATS
Engineering Inc, China). La mezcla se enfrió inmediatamente a 4 ° C y se
envejeció durante 24 ha 4 ° C. El helado se produjo en un congelador discontinuo
(Modelo 104, Taylor Freezers, Rockton, IL, EE. UU.) Con una temperatura de
salida entre -5 y -6 ° C. El exceso de helado estaba en el rango de 40-50%. Los
helados se recogieron en recipientes de papel con un peso de alrededor de 90 a
100 gy se endurecieron por debajo de -30 ° C en el congelador durante al menos
72 h antes de realizar más pruebas.
Tabla 1 . Formulaciones de mezclas de helados que contienen diferentes proteínas.

Ingredientes SMP (%) NSPI (%) CSPI (%) SPHPe (%) SPHPa (%)
Azúcar 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
gordo 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
CSS 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
SMP 10.00 00 00 00 00
NSPI 00 4.40 00 00 00
CSPI 00 00 4.30 00 00
SPHPe 00 00 00 5.15 00
SPHPa 00 00 00 00 4.50
 Ingredientes SMP (%) NSPI (%) CSPI (%) SPHPe (%) SPHPa (%)
Lactosa 00 5,60 5.70 4.85 5,50
Estabilizadores 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15
Monoglicéridos 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15
IW 65,70 65,70 65,70 65,70 65,70
Total 100 100 100 100 100
*
Abreviaturas: NSPI, aislado de proteína de soja nativa ; CSPI, aislado de proteína de soja
comercial; SPHPe, aislado de proteínas de soja hidrolizado por pepsina; SPHPa: aislado de proteína de
soja hidrolizado por papaína; CSS, jarabe de maíz sólido; IW: Ingrediente Agua.

2.4 . Propiedades reológicas

El perfil reológico de todas las mezclas de helados se midió en un reómetro

HAAKE MARS (Thermo Scientific, Alemania) equipado con cono y placa (40
mm, 2 °). El tamaño de la muestra fue de 2 ml. Las muestras se cortaron
previamente a 20 s −1 durante 30 s y el esfuerzo cortante se registró a una
velocidad de corte de 0s −1 a 300s −1 durante 420 s, luego una velocidad de corte
decreciente a 0 s −1 durante 420 s Los datos reológicos se modelaron según el
modelo de Herschel-Bulkley.τ=τ0+Kγndonde τ es el esfuerzo cortante, K es el
coeficiente de consistencia, γ es la velocidad de corte, n es el índice de
comportamiento del flujo y τ 0 es el esfuerzo de fluencia.

2.5 . Distribución de tamaño de partícula

La distribución del tamaño de partícula de las mezclas de helado fresco y

derretido se determinó mediante el analizador de tamaño de partícula por láser de
difracción láser Microtrac BlueWave S3500 (Microtrac Inc. Montgomeryville,
PA, EE. UU.). Las muestras se diluyeron directamente (1: 1000) en la cámara de
muestra con agua MiliQ a 16-18 ° C. El índice de refracción de la emulsión se
tomó como 1,33. Las mediciones se realizaron a temperatura ambiente y se
repitieron por triplicado. Se registró la media ponderada por volumen (d 4 , 3 ).

2.6 . Determinación de fracción de proteína adsorbida

La fracción de proteína adsorbida (AP%) de muestras frescas y descongeladas se
determinó utilizando el método descrito por Ye (2008) y Chen et al. (2019)Con
ligera modificación. Cada muestra (4 ml) se centrifugó a 10000 xg durante 45
minutos a 25 ° C en una centrífuga con temperatura controlada (SIGMA 3K15,
SIXMA, Alemania). Después de la centrifugación, la capa acuosa se eliminó
cuidadosamente usando una jeringa. La capa de crema se volvió a dispersar en
agua desionizada y se centrifugó a 10000 xg durante 45 minutos a 25 ° C. Los
subnatantes se filtraron a través de filtros de 0,22 μm (Milipore Corp.). Se usó el
método Kjeldahl (N x 6.25) (KDN-103F, Determinador automático de nitrógeno,
Qianjian, Shanghai, China) para determinar los filtrados y la proteína total en la
mezcla. La fracción de proteína adsorbida (%) se calculó mediante la siguiente
fórmula:Fracción de proteína adsorbida (%) = (C 0 - C i ) / C 0 x 100%donde C 0es
la concentración de proteína inicial de la emulsión y C i es la concentración de
proteína no adsorbida de la emulsión.

2.7 . Propiedades derretidas del helado

La tasa de derretimiento de los helados se determinó mediante la prueba

de filtración por pantalla ( Goff y Hartel, 2013 ). Se midió el peso inicial de las
muestras (a -20 ° C), se colocó en una rejilla de malla (2.5 * 2.5m) y se dejó
reposar a temperatura ambiente (25 ° C). Se recogió el suero que pasaba a través
de la rejilla y se registró el peso cada 10 min durante 90 min. La prueba de tasas
de fusión se realizó por triplicado.

2.8 . Microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

Se utilizó microscopía de escaneo láser confocal (Leica Microsystem,

Mannheim, Alemania) con una lente objetivo de 20x para observar la
microestructura de la emulsión de helado descongelado. La fase grasa se coloreó
con rojo Nilo (NR) según el método de Lent, Vanlerberghe, Oostveldt, Thas y
Meeren (2008) . Se añadieron 0,5 ml de NR al 1% en dimetilsulfóxido y 0,5 ml
de FITC al 0,1% en agua a 500 g de mezcla de helado. La muestra teñida se
colocó en un portaobjetos de microscopio y se cubrió con un cubreobjetos
recubierto con glicerol. Las muestras se excitaron con una línea de láser de argón
de 488 nm y una línea de láser de helio / neón de 633 nm, y se detectaron a 503–
588 nm y 648–733 nm, respectivamente.

2.9 . análisis estadístico

Todos los experimentos y medidas asociadas se realizaron al menos por

triplicado. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA de dos vías (α
<0.05) por Statistix 9.0 (Statistix, Tallahassee, FL, EE. UU.).

3 . Resultados y discusión
3.1 . Composición y propiedades del aislado de proteína de soja y su
hidrolizado.

El grado de hidrólisis del aislado de proteína de soja y las propiedades

emulsionantes (EAI y ESI) de todas las muestras se muestran en la Tabla 2 . El
EAI se incrementó por hidrólisis, principalmente en el DH más bajo (2.4%) para
CSPI. El aumento de la flexibilidad molecular y los sitios hidrofóbicos más
expuestos causados por la hidrólisis condujeron a mejores características de
superficie y propiedades funcionales. La emulsión SPHPe tenía el índice de
estabilidad más alto y SPHPa tenía el índice de estabilidad más bajo de todas las
muestras ( Tabla 2 ). La figura 1a muestra los patrones SDS-PAGE de SPI con
diferentes grados de hidrólisis como ingredientes crudos. El perfil proteico de
NSPI mostró subunidades intactas de β-conglicinina (α, α 'y β) y glicinina
(subunidad ácida y básica) en el análisis electroforético (Fig. 1 a), que fue
consistente con el hallazgo de investigaciones anteriores ( Nishinari, Fang, Guo y
Phillips, 2014 ). En comparación con NSPI, CSPI mostró bandas
correspondientes de desvanecimiento para la subunidad β y subunidad básica y
ninguna banda correspondiente a la subunidad AB en SDS-PAGE ( Fig. 1 a), que
se debió a la pérdida durante el tratamiento térmico en la producción. Las
subunidades principales en SPHPe fueron la subunidad α', la subunidad α, la
subunidad β y la subunidad básica. El perfil de SPHPa indicó que todas las
subunidades de glicinina y β-conglicinina se habían hidrolizado y solo los
péptidos con un peso molecular inferior a 20 kDa identificado ( Fig. 1 a).
 Tabla 2 . Propiedades del aislado de proteína de soja y sus hidrolizados.

Ingredientes DH EAI (m 2 / g) ESI (min)

SMP - 33,96 ± 0,32 c 85.06 ± 0.51b
NSPI 0.0% ± 0.1a 36,69 ± 1,04b 89.63 ± 1.20ab
CSPI 2.4% ± 0.2b 32,65 ± 0,16c 86.68 ± 4.65b
SPHPe 3.6% ± 0.4c 42,21 ± 0,99a 94.72 ± 0.88a
SPHPa 15.6% ± 0.7d 40.43 ± 0.72a 63.20 ± 0.81c

* DH: grado de hidrólisis; EAI: índice de actividad emulsionante; ESI: índice de estabilidad de la
emulsión. Los valores con las mismas letras de superíndice dentro de cada columna no son
significativamente diferentes (P> 0.05). DH no se prueba para SMP. Abreviaturas: SMP, leche
descremada en polvo ; NSPI, aislado de proteína de soja nativa; CSPI, aislado de proteína de soja
comercial; SPHPe, aislado de proteínas de soja hidrolizado por pepsina; SPHPa, aislado de proteína de
soja hidrolizado por papaína.

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Fig. 1 . Patrones SDS-PAGE de la proteína de soja y sus hidrolizados ( proteína a-
ingrediente, absorción b en la superficie de los glóbulos de grasa). BS: subunidades
básicas; AS: subunidades ácidas; AB: sus agregados. α, α 'y β son subunidades de β-
conglicinina.
Los perfiles de proteína adsorbida en los glóbulos de grasa en el helado
descongelado también se analizaron mediante SDS-PAGE ( Fig. 1 b). Todas las
subunidades principales de β-conglicinina (α, α 'y β) y glicinina (subunidad ácida
y básica) se identificaron en muestras NSPI y CSPI, excepto que las muestras
CSPI no tenían subunidad AB y subunidad básica. La β-conglicinina (α, α 'y β)
estaba presente en la superficie de los glóbulos de grasa de helado SPHPe y la
composición relativa de la subunidad β fue la más alta de todas las
muestras. SPHPa solo tenía los péptidos con bajo peso molecular de menos de 20
kDa. El análisis densitométrico de las principales bandas de proteínas en SDS-
PAGE se muestra en la Tabla 3. Para las muestras de mezcla de helado NSPI,
CSPI y SPHPe, la composición relativa de la subunidad α, α ', ácida y básica en
la superficie de los glóbulos grasos fue menor que esas subunidades en los
ingredientes. Las subunidades ácida, α y α 'con un mayor contenido de
aminoácidos hidrofílicos no mostraron una fuerte tendencia a ser absorbidas en la
superficie grasa y pueden ser desplazadas por los monoglicéridos de la interfaz
aceite / agua durante el envejecimiento ( Chen, Liang, Li y Chen, 2018 ; Thanh y
Shibasaki, 1977 ). La composición relativa de la subunidad β no indicó
diferencias en todas las muestras de helado entre los ingredientes y la proteína
adsorbida en la interfaz agua / aceite. Keerati-u-rai y Corredig (2009)Las
subunidades β indicadas tenían una adsorción preferencial a la superficie de los
glóbulos grasos. La subunidad β no puede ser desplazada por los monoglicéridos
de la interfaz aceite / agua durante el envejecimiento ( Chen et al., 2018 ).
Tabla 3 . El análisis densitométrico: composiciones relativas (%) de proteínas e
hidrolizados de soja tanto en los ingredientes de partida como adsorbidos en los
glóbulos de grasa aislados del helado derretido.
Subunidad α' α β AB COMO BS
NSPI
Ingrediente 5.5 6.3 11,2 24,9 11,5 6.1
Proteína adsorbida 4.5 4.5 5.4 10,8 27,0 7.8 5.3
CSPI
Ingrediente 9.5 13,1 4.1 0.0 21,5 0.0
Proteína Adsorbida 6.5 6.6 3.9 0.0 5.8 0.0
SPHPe
Ingrediente 25,4 8.7 14,3 0.0 4.1 17,9
Proteína Adsorbida 10,1 7.0 13,9 0.0 0.0 4.2 4.2
SPHPa
 Subunidad α' α β AB COMO BS
Ingrediente 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Proteína adsorbida 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

* Abreviaturas: NSPI, aislado de proteína de soja nativa; CSPI, aislado de proteína de soja
comercial; SPHPe, aislado de proteína de soja hidrolizado por pepsina; SPHPa, aislado de proteína de
soja hidrolizado por papaína. BS: subunidades básicas; AS: subunidades ácidas; AB: sus agregados. α, α
'y β son subunidades de β-conglicinina.

3.2 . Propiedades reológicas de las mezclas de helados.

El coeficiente de consistencia (K) y el índice de comportamiento de flujo (n) de

las mezclas de helado hechas con SPI y su hidrolizado se muestran en la Tabla
4 . El índice de comportamiento de flujo (n) de todas las muestras fue inferior a
1, que oscila entre 0,46 y 0,58. Todas las mezclas de helados exhibieron un
comportamiento no newtoniano, mostrando que la viscosidad aparente disminuye
al aumentar la velocidad de corte. Las mezclas de helado SPHPa tenían el valor
más bajo en el índice de comportamiento de flujo (n), por lo tanto, las
propiedades pseudoplásticas más altas. Todas las moléculas de polímero,
incluidas las proteínas en todas las mezclas de helados, tienden a desenredarse
bajo el cizallamiento y se alinean en el campo de flujo, dando menos resistencia
al flujo ( Innocente, Comparin y Corradini, 2002) Las propiedades de flujo de las
mezclas de helado se indicaron mediante el coeficiente de consistencia (K), que
se atribuyó a las partículas coloidales en la mezcla de helado ( Damodaran,
1997 ). En este estudio, las diferentes fuentes de proteínas afectaron el
coeficiente de consistencia debido a su tamaño de molécula, estructura,
composición e interacción con otras moléculas de proteína. La mezcla hecha con
NSPI exhibió K alta y viscosidad aparente debido a su estructura
molecular compacta, que requieren más esfuerzo de corte para lograr la misma
velocidad de corte. Curiosamente, la mezcla hecha con SPHPe tuvo el coeficiente
de consistencia más alto en todas las muestras. Esto se atribuyó a la modificación
de SPI por la pepsina, lo que aumentó la interacción entre las moléculas vecinas
debido a los sitios hidrófobos e hidrófilos más expuestos, lo que confiere una
mayor resistencia al flujo. El coeficiente de consistencia de la mezcla CSPI no
fue significativamente diferente de SMP y SPHPa (p> 0.05), lo que significa que
tenía una viscosidad aparente similar a la misma velocidad de corte. La razón
puede deberse a la eliminación de la porción insoluble de SPI y la pérdida de
subunidades como se discutió anteriormente. El peso molecular en SPHPa fue
inferior a 20 kDa, lo que condujo a una menor polimerización de proteínas y
bajos coeficientes de consistencia (K).
Tabla 4 . Propiedades reológicas de las mezclas de helados.

Parámetro Herschel-Bulkley Viscosidad aparente (Pa s)

K norte τ0 10 s −1 100 s −1
SMP 0.64 ± 0.24 b 0.58 ± 0.03 ab 0.19 ± 0.05 a 0,26 0,09
NSPI 1.23 ± 0.43 b 0.55 ± 0.03 a 0.35 ± 0.09 a 0,47 0,16
CSPI 0.74 ± 0.22 b 0.49 ± 0.06 a. C. 0.15 ± 0.09 a 0.25 0,07
SPHPe 2.12 ± 0.96 a 0.55 ± 0.05 ab 0.72 ± 0.39 a 0,83 0.28
SPHPa 0.86 ± 0.03 b 0.46 ± 0.03 c 0.32 ± 0.01 a 0.28 0,07

* K = coeficiente de consistencia; n = índice de comportamiento del flujo; τ 0  = estrés de

rendimiento. Los valores con las mismas letras de superíndice dentro de cada columna no son
significativamente diferentes (P> 0.05). Abreviaturas: SMP, leche descremada en polvo ; NSPI, aislado
de proteína de soja nativa ; CSPI, aislado de proteína de soja comercial; SPHPe, aislado de proteínas de
soja hidrolizado por pepsina; SPHPa, aislado de proteína de soja hidrolizado por papaína.

3.3 . Tasa de fusión

Como indicador del desarrollo de la estructura y la resistencia al colapso ( Goff y

Hartel, 2013 ), las tasas de fusión del helado con proteína de soja y sus
hidrolizados se muestran en la Fig.2 . Todas las muestras de helado en este
estudio se derritieron en 90 minutos. El helado hecho con SPHPe tuvo la tasa de
fusión más alta en todas las muestras, que varió de 1.23% min -1 a 2.05% min -
1
. El helado hecho con CSPI, SMP y SPHPa tenía la tasa de fusión más baja, que
no era significativamente diferente entre sí. Investigaciones anteriores indican
que la viscosidad de la mezcla de helado, el exceso y el tamaño de los cristales de
hielo influyeron en la tasa de fusión ( Muse y Hartel, 2004 ; Sofjan y Hartel,
2004) En este estudio, la concentración de proteínas, el exceso y la condición de
congelación se estandarizaron al mismo nivel en todos los tratamientos. La fuente
 de proteína fue más dominante al afectar la tasa de fusión. Para las viscosidades
de la mezcla, la mezcla SPHPe tuvo la viscosidad más alta ( Tabla 4 ) pero
exhibió la velocidad de fusión más alta, lo que indica que las propiedades
reológicas de la mezcla no tenían una relación con la velocidad de fusión. La
coalescencia parcial de grasa y la formación de grupos de glóbulos de grasa
causados por la desestabilización se relacionó principalmente con la velocidad de
fusión del helado mediante la formación de una red tridimensional de glóbulos de
grasa, que se unieron y se estabilizaron en la superficie de las burbujas de aire del
helado ( Cruz, Antunes, Sousa, Faria y Saad, 2009 ; Marshall, Goff y Hartel,
2003 ;Muse y Hartel, 2004 ). La desestabilización insuficiente de los glóbulos de
grasa en el helado resultó en una tasa de fusión rápida ( Goff y Hartel, 2013 ). La
relación entre la velocidad de fusión del helado y la coalescencia parcial de grasa
se analiza más adelante en la sección a continuación.

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Fig.2 . Índice de deshielo del helado. Los valores son medias ± desviación estándar
(el error entre múltiples mediciones); los valores con la misma letra de superíndice
no son significativamente diferentes (p> 0.05).

3.4 . Distribución de tamaño de partícula

Los medios ponderados por volumen (d 4,3 ) y la distribución del tamaño de

partícula de los glóbulos de grasa son buenos indicadores del desarrollo de la
coalescencia de la grasa ( Méndez-Velasco y Goff, 2012 ). Se utilizaron para
ilustrar cómo el diferente grado de hidrólisis del aislado de proteína de soja
impactó en la estabilización de las emulsiones y la fusión de glóbulos de grasa
después de congelar mezclas de helado ( Fig. 3 ). Las mezclas frescas de CSPI,
SMP y SPHPa exhibieron distribución bimodal de partículas con el primer pico
en el rango de 0.1-10 μm y el segundo pico 10-100 μm. La distribución principal
del tamaño de partícula de las mezclas frescas NSPI y SPHPe estaba en el rango
de 0.1-10 μm con una cola larga en el rango de 10-100 μm. La distribución de
partículas de las mezclas SMP y CSPI estuvo en el rango de 0.1–100 μm con
curvas similares (Fig. 4 A). Esto indicó que SMP y CSPI tenían propiedades
emulsionantes similares en la estabilización de la mezcla de helado fresco, lo que
coincidía con los resultados de EAI y ESI ( Tabla 2 ). La proteína de la
leche formó una película en la superficie de los glóbulos de grasa para evitar el
contacto cercano a través de fuerzas de repulsión estéricas y electrostáticas
durante la homogeneización ( Méndez-Velasco y Goff, 2012 ). SPI y sus
hidrolizados ayudaron a la formación de una emulsión estable mediante la
formación de una barrera física en la interfaz aceite / agua, lo que evitó
la floculación y la fusión de las gotas de grasa ( Li et al., 2016) Después de la
congelación, la desestabilización de la grasa condujo a un aumento en el volumen
de partículas de mayor tamaño con un aumento del segundo pico en el rango de
10–100 μm, lo que representa una fusión parcial de las gotas de emulsión en
comparación con la emulsión fresca para todas las muestras ( Fig. 4 B) ( Boode Y
Walstra, 1993 ). La muestra descongelada SPHPa mostró el volumen más alto en
el segundo pico, seguido de las muestras descongeladas SMP y CSPI. Las
partículas más grandes en la muestra descongelada de SPHPe fueron las más
bajas entre todas las muestras, lo que indica menos coalescencia de glóbulos
grasos ( Fig. 4 B). d 4,3 de SPHPa y SMP no mostraron diferencias significativas
en la mezcla fresca y la mezcla de helado descongelado ( Fig. 3 ). El tamaño de
partícula (d 4,3) de glóbulos de grasa en el helado SMP en este estudio estuvo de
acuerdo con el hallazgo de ( Méndez-Velasco & Goff, 2012 ). Todas las muestras
descongeladas tuvieron un aumento significativo de d 4,3 en comparación con las
muestras frescas con excepción de SPHPe ( Fig. 3 ). La muestra SPHPe tuvo el
aumento más pequeño en d 4,3 entre todas las muestras, de 2.95 μm a 4.69 μm. La
mayor agregación de glóbulos grasos se produjo en muestras hechas con SPHPa,
donde d 4,3 aumentó de 1.99 μm a 9.45 μm. d 4,3de helado descongelado hecho con
CSPI y NSPI no fueron significativamente diferentes de SMP, lo que indica que
se formaron coalescencias parciales de glóbulos grasos similares durante la
congelación en comparación con SMP. El grado de desestabilización de la grasa
fue controlado por las propiedades del cristal de grasa y la proteína adsorbida en
la interfaz aceite-agua ( Segall y Goff, 2002 ; Vanapalli, Palanuwech y Coupland,
2002 ). La mantequilla sin sal utilizada como fuente de grasa consistía en
triacilglicerol graso de alto y bajo punto de fusión, que existía como una mezcla
de 2/3 cristalino y 1/3 líquido a 4 ° C ( Adleman y Hartel, 2001 ), lo que aseguró
la aparición de coalescencia parcial con la estructura agregada de grasa deseada
( Sung y Goff, 2010 ). Las propiedades mecánicas de adsorbidoLa película de
proteína en la interfaz aceite / agua y la repulsión estérica entre las moléculas de
proteína impidieron que los glóbulos de grasa se unieran en la fase acuosa ( Bos
& Van, 2001 ). La mayoría de las proteínas utilizadas como tensioactivo en las
interfaces aceite / agua disminuyen la tensión superficial entre 15 y 20 mNm -
1,
pero los tensioactivos pequeños pueden disminuir entre 30 y 40 mNm -
1
( Damodaran, 2005 ). El desplazamiento de la proteína adsorbida por el
emulsionante ocurre porque el emulsionante tiene una tensión interfacial más
baja en la interfaz agua / aceite. Como resultado, la capa debilitada proporciona
la condición para la desestabilización de los glóbulos de grasa en la congelación
dinámica ( Boode y Walstra, 1993 ; Gelin, Poyen, Courthaudon, Le, y; Lorient,
1994 ;Pelan, Watts, Campbell y Lips, 1997 ). En este estudio, el 0.1% de los
monoglicéridos desplazaron la proteína de soya y sus hidrolizados de la
superficie de los glóbulos de grasa durante el envejecimiento de la mezcla,
excepto SPHPe. El alto porcentaje de subunidad β en SPHPe mantuvo la
emulsión de helado estable y no puede ser desplazada por los
monoglicéridos. Las cantidades de proteína desplazada y el cambio de perfil de
proteína en la interfaz aceite / agua para todas las muestras se han discutido en la
Sección 3.1 y más adelante en 3.5.
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Fig.3 . El volumen medio ponderado del diámetro de partícula (d 4,3 ) de helado con
diferentes aislados de proteína de soja . Los valores son medias ± desviación
estándar (el error entre múltiples mediciones); los valores con la misma letra de
superíndice no son significativamente diferentes P> 0.05.

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Fig.4 . Distribución del tamaño de gota de (A) mezcla de helado fresco y (B) helado
descongelado.

3.5 . Fracción de proteína adsorbida y composición

El grado de coalescencia parcial de glóbulos grasos en la mezcla de helado tiene
una relación directa con la capa de proteína adsorbida en la interfaz aceite / agua
( Bolliger, Kornbrust, Goff, Tharp y Windhab, 2000 ). La medición del cambio
en la cantidad de proteína de leche adsorbida en la superficie del aceite / agua en
la mezcla de helado fresco y el helado descongelado se usó para predecir la
aparición de coalescencia parcial durante la congelación ( Barfod, Krog, Larsen y
Buchheim, 1991 ; Gelin, Poyen, Courthaudon, Le Meste y Lorient, 1994 ; Lai,
O'Connor y Eyres, 2006 ; Pelan et al., 1997 ). Fig. 5muestra la fracción de
proteína adsorbida de SMP, NSPI, CSPI, SPHPe y SPHPa en aceite / agua en las
mezclas de helado fresco y las mezclas de helado descongelado. La proteína de
soja intacta, como NSPI y CSPI, exhibió una menor cantidad adsorbida en la
interfaz en comparación con SPHPe y SPHPa, que se atribuyeron al gran tamaño
de la molécula y a la menor flexibilidad de la estructura de la molécula. La
hidrólisis enzimática limitada mejoró la flexibilidad molecular de la proteína de
soja y logró mejores propiedades emulsionantes ( Li et al., 2016) Durante el
envejecimiento del helado, una mayor desorción de proteínas por los
monoglicéridos puede disminuir la estabilización estérica de los glóbulos de
grasa para crear una película más delgada, lo que lo hace propenso a la fusión
parcial durante la congelación del helado. Después del envejecimiento, la
fracción de proteína absorbida en los glóbulos de grasa disminuyó en toda la
mezcla de helado. Las fracciones desplazadas de proteína en las mezclas de
helados en este estudio estuvieron en el rango de 8.0% a 22.6%. La mayor
fracción de proteína en los glóbulos de grasa desplazados durante el
envejecimiento y la congelación fue la mezcla de SPHPa (22,6%), que fue
comparable a la de SMP (21,8%). La menor fracción de desplazamiento fue la
mezcla SPHPe (8.0%). Gelin y col. (1994)La proteína láctea indicada puede ser
desplazada por los monoglicéridos de la interfaz aceite / agua durante el
envejecimiento de la mezcla de helado debido a la formación de una interfaz
favorable. Para la proteína de soja, todas las subunidades y péptidos pueden ser
desplazados por monoglicéridos, excepto la subunidad β, debido a su fuerte
capacidad de adsorción en la interfaz aceite / agua ( Fig. 1 b). Por lo tanto, la
composición proteica absorbida en los glóbulos de grasa indicó la funcionalidad
del emulsionante en la interfaz aceite-agua y el grado de estabilización estérica
de los glóbulos de grasa. Pelan y col. (1997) encontraron que la emulsión
estabilizada por las proteínas de suero exhibía una mayor coalescencia parcial en
comparación con la leche descremada en polvo porque la capa adsorbida formada
por las moléculas de proteína de suero no era tan espesa como
la caseínamicelas Para las mezclas NSPI, CSPI, SPHPa y SMP, una gran
cantidad de proteína fue desplazada por los monoglicéridos, lo que condujo a una
menor estabilización estérica de la gota y la hizo más propensa a la coalescencia
parcial ( Fig. 3 ). SPHPa mostró una carga de proteína adsorbida intermedia
( Fig. 5 ), un gran tamaño de partícula de grasa después de congelar
y descongelar ( Fig. 3 ) y, en consecuencia, una baja tasa de fusión ( Fig. 2 ), todo
similar a SMP ( Fig. 2 ). SPHPe con un alto porcentaje de subunidad β mantuvo
la emulsión estable y solo una pequeña porción de proteína fue desplazada por
los monoglicéridos ( Fig. 5 ), lo que resultó en una coalescencia menos
parcial. ( Fig. 3) y alta tasa de fusión ( Fig. 2 ). En este caso, dado que no había
suficiente coalescencia parcial de glóbulos de grasa para estabilizar la lámina
acuosa entre las células de aire y evitar el drenaje, el suero dentro de la estructura
del helado se escurrió a una velocidad más rápida. Se dieron dos mecanismos
para describir el mecanismo del desplazamiento. Hoffmann y Reger
(2014) informaron que los tensioactivos interactuaban con las moléculas de
proteína en la interfaz aceite / agua, lo que resulta en un aumento de las
propiedades hidrofílicas de la proteína y la desorción de la interfaz. Otro
mecanismo fue que los emulsionantes se adsorbieron en defectos localizados de
la película proteica, acumulando y desarrollando un dominio, que forzó a las
proteínas superficiales adsorbidas débiles hacia la fase acuosa ( Mackie et al.,
2003) Sin embargo, es aconsejable seguir estudiando el mecanismo de
desplazamiento de las moléculas de proteína de soja y los monoglicéridos en la
interfaz aceite / agua.
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Fig.5 . Fracción proteica absorbida en la superficie de los glóbulos grasos. Los
valores son medias ± desviación estándar (el error entre múltiples mediciones).

3.6 . Microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

Se usó microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) para examinar

visualmente la estructura de los glóbulos de grasa en las mezclas de helado
derretido. Los glóbulos grasos de las mezclas de helado descongelado hechas con
SMP, NSPI, CSPI y SPHPa interactúan entre sí para formar partículas más
grandes en diferentes grados, lo que indica una fusión parcial de los glóbulos de
grasa de leche en comparación con las muestras frescas ( Fig. 6 ). Grupos de
glóbulos de grasa estaban presentes en la fase sérica, indicada por las regiones
rojas intensas en las micrografías. Los glóbulos de grasa parcialmente fusionados
cubrieron la interfaz de aire de forma incompleta y estabilizaron la burbuja de
aire en la estructura del helado debido a su hidrofobicidad ( Koxholt, Eisenmann
y Hinrichs, 2001 ). Fig. 6demuestra que había mucha aglomeración de grasa en la
micrografía de helado con SPHPa, similar a la que se muestra al dispersar la
luz en la Fig. 3 , lo que sugiere una posible fuente de proteína alternativa para
hacer helado. Hay pocos agregados de glóbulos grasos formados en helados
hechos con SPHPe debido a su emulsión estable.
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Fig.6 . Microestructura de (a) mezcla de helado fresco y (b) helado descongelado
con SMP, NSPI, CSPI, SPHPe y SPHPa. Barra r = 25 μm.

4 . Conclusión
Este estudio presenta nueva información sobre el papel de
la proteína de soja.aislar y sus hidrolizados en la formación de la estructura del
helado, incluido el perfil de composición de proteína de soja en la interfaz de la
grasa y las propiedades fisicoquímicas del helado. La composición del aislado de
proteína de soja tuvo un impacto significativo en el grado de desestabilización de
la grasa y la velocidad de fusión del helado. La proporción relativamente alta de
la subunidad β en SPHPe evitó la aparición de suficientes coalescencia parcial de
glóbulos de grasa y tuvo la tasa de fusión más alta en todas las muestras. El
desplazamiento de la subunidad ad ', α, ácida y básica adsorbida en CSPI, NSPI y
SPHPa en los glóbulos de grasa por monoglicéridos promovió la formación de
coalescencia parcial de grasa y contribuyó a la microestructura del helado con
propiedades de fusión deseables. La fusión y las propiedades reológicas del
helado hecho con SPHPa fueron comparables a SMP,