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3 y 4. Técnicas para El Aislamiento de Microorganismos y OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE BACTERIAS Autoguardado
3 y 4. Técnicas para El Aislamiento de Microorganismos y OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE BACTERIAS Autoguardado
RESUMEN
En la práctica se transfirió una muestra microbiológica conocida a un medio de cultivo, lo que permitió
obtener colonias aisladas. La aplicación de diversos procedimientos al realizar la practica determinan la
efectividad a la hora del conteo bacteriano y así mismo obtener cultivos puros (los cultivos puros existen
de manera artificial y se obtienen en el laboratorio, son aquellos donde solo hay una clase de
microorganismo presente) facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de
estos. Para la apreciación de algunas características físicas y morfológicas de las bacterias que se cultivaron
en la práctica se hizo una tinción de Gram y movimiento bacteriano para los Bacillus sp con contraste
cromático de las endosporas para los Bacillus sp; se dedujo de la observación de tinción de Gram que los
bacilos presentan coloración de Gram.
Palabras clave: aislamiento microbiano, cultivos puros, tinción.
ABSTRACT
In the practice transfire a microbiological sample known to a way of culture, which was allowed to obtain
isolated colonies. The application of diverse procedures on having realized the practice they determine the
efficiency at the moment of the bacterial count and likewise to obtain pure cultures (the pure cultures exist
in an artificial way and are obtained in the laboratory, are those alone where there is a class of present
microorganism) facilitating thus, the study, characterization, application and control of these. For the
appraisal of some physical and morphologic characteristics of the bacteria that were cultivated in the
practice Gram's tint and bacterial movement was done for the Bacillus sp by chromatic contrast of the
endosporas for the Bacillus sp; dedujo of the observation of Gram's tint that the bacilli present Gram's
coloration
Key words: Microbial isolation, pure cultures, tint.
2.2.OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE
BACTERIAS
MATERIALES.
Cajas usadas: Caja de Petri con cultivos puro de
Bacillus sp, con E.coli, Klebsiella sp,
Staphylococcus sp.
Cubeta para coloración de Gram: Usada para las
tinciones y evitar manchar los mesones
Papel absorbente: Se usó papel absorbente Scott para
la limpieza de los mesones con alcohol 70% y para Figura No. 1. Resultado de la siembra en superficie
soporte de los materiales esterilizados evitando el de la dilución 10-4 en PDA
contacto directo con el mesón.
Asas redondas: Se usó un asa redonda para tomar
muestras de los microorganismos ya sembrados,
esterilizándola al someter al fuego.
Mecheros: Se usó para esterilizar el asa antes de
poner cada muestra en su respectivo portaobjeto.
Laminas porta objetos: Se usaron laminas
portaobjetos en los cuales se puso una gota de agua
con una muestra de los resultados de la incubación
de los microrganismos del suelo y hongos y
bacterias. Para las tinciones: Colorantes de Gram,
verde malaquita, tinta china, tubos con agua estéril.
METODOS
Montaje en fresco. Observación de movilidad.
Sobre un portaobjetos limpio se agregó una gota de
Figura No.2. resultado de la siembra en superficie,
agua destilada estéril con una porción del
dilución 10-5 en AN
microorganismo presente en la caja de Petri con un
asa flameada previamente. Luego se hizo su
observación en el microscopio a 100X
Tinción de endosporas.
Se realizó el frotis del microorganismo Bacillus sp
en un portaobjetos, fijándolo con calor, adicionando
posteriormente verde de malaquita, luego se secó a
la llama del mechero, luego se lavó con agua y luego
se observó al microscopio con el objetivo 100X
Tinción negativa o Tinta china para capsula.
provocan vibraciones sin desplazamiento; en este
caso la preparación a fresco constituye el método
más simple y rápido de determinar movilidad de
microorganismos (Pedro García Martos, 1994).
El movimiento usual debido a la presencia de En la dilución 10-5, se pudo identificar más de 5x105
flagelos se puede determinar al microscopio con una UFC/g y aproximadamente 3S, indicando de igual
preparación en fresco como se hizo en esta caso, es manera la eficiencia que tiene la dilución ya que las
importante diferenciar el movimiento traslatorio de unidades formadoras de colonias se redujeron en una
las bacterias del movimiento browniano que es el proporción de aproximadamente de 2x10 5,
movimiento vibratorio, originado por choque de las demostrando una reducción de estas unidades, esto
moléculas del líquido contra las bacterias, que
se puede observar Figura No.2. resultado de la se mencionó anteriormente aplicar calor al medio
siembra en superficie, dilución 10-5 en AN. (Pedro García Martos, 1994).
En este caso se utilizó verde malaquita como
Tinción Gram positivas y negativas colorante primario el cual es eliminado del resto de
Seguidamente, se realizó la extracción de las la célula por medio de un enjuague, pero no de la
muestras para cada una de las observaciones espora.
realizadas en la práctica, las de GRAM (positivas y Existen otros métodos de tinción de endosporas, uno
negativas) y las de endosporas. En la tinción GRAM, de los más conocidos es el método de schaeffer y
es una tinción de las más utilizadas en los fulton, en el que el proceso se realiza de la misma
laboratorios de bacteriología, y permite de acuerdo forma, pero el finalizar la coloración verde
con la estructura y grosor de la pared bacteriana malaquita se emplea safranina para teñir el resto de
agrupar las bacterias en Gram positivas y Gram la célula (Alarcón, 2001).
negativas (Pírez M., 2008), por lo tanto en estas dos Es evidenciable que en la Figura No 3. Resultados
practicas se realizó la siembra en superficie de una de la observación de la tinción de endosporas, no
muestra de tierra (10.678 g) disuelta en agua proporciona una vista clara de las características de
peptona, y se llevó un procedimiento de dilución de las bacterias, sin embargo, al ser vistas
la muestra. Se realizó dos siembras por cada una de experimentalmente se concluyó le presencia de
las diluciones presentes (10-3, 10-4 y 10-5), intentando bacilos en forma empalizada inmóviles con
con esto realizar un aislamiento con una proporción extremos redondos y angulares en diferentes casos,
mayor y finalmente un conteo de las colonias se presentan en poca cantidad estreptobacilos con la
presentes en cada una de las siembras, donde se pudo mismas características y gran cantidad de esporas en
determinar una gran cantidad de predominación de forma fusiliforme y oblonga.
GRAM positivas y en una pequeña proporción
GRAM negativas, estos resultados pudieron ser
alterados por el mal procedimiento en la tinción o 5. CONCLUSIONES
por un error humano. Esto se puede observar en la Se puede concluir que la preparación en fresco no
Figura No. 6. Resultados de la observación de permite aumentar el contraste de la preparación
bacilos por medio de la tinción Gram. sin embargo la ventaja que tiene es que también
Además de una excesiva decoloración la edad del es útil para observar la movilidad de las bacterias.
cultivo influye en que las bacterias GRAM positivas La preparación en fresco nos ayudó a observar la
se observen total o parcialmente rosadas, debe morfología de las bacterias, aunque con un poco
prestarse atención también a los lavados que se más de trabajo y sin una clara distinción de la
realizan puesto que si se dejan excesos de agua se forma que se apreciaba.
puede presentar una dilución de los colorantes o La gruesa pared celular de las bacterias Gram
diferentes reactivos en este caso el yoduro. positivas está constituida principalmente por
peptidoglicano. Se cree que ésta gruesa capa de
Tinción de Endosporas peptidoglicano es la determinante de que estas
Las endosporas son formas de resistencia altamente
bacterias retengan el cristal violeta de la
deshidratadas y con una serie de cubiertas muy poco coloración de Gram.
permeables, esto hace que sean difíciles de teñir,
Los conocimientos adquiridos en esta práctica son
excepto si se calienta la preparación para
de gran importancia ya que da conocimiento de la
permeabilizarlas (Pírez M., 2008), es por eso que se
conformación y estructura de las bacterias, se
flamea la muestra después de ser aplicado el
logró el objetivo el cual era identificar a las
colorante.
bacterias que se tenían tanto Gram positivas como
Las endosporas bacterianas son muy resistentes a
negativas. Con la gran ayuda de nuestro instructor
procedimientos tinto riales usuales, la aplicación de
se pudo reforzar el aprendizaje que esta práctica
un solo colorante a una célula bacteriana que
nos aportaba.
contiene una endosporas, solo tiñe la célula, pero la
Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio
espora se mantiene incolora, para lograr aplicar
de Microbiología se requiere disponer de una serie
colorante dentro de la endosporas es necesario como
de medios de cultivo estériles. Para esto, resulta
necesario conocer los métodos de preparación y
esterilización utilizados habitualmente en el Flagelar: Presentes en la mayoría de bacterias,
laboratorio. generalmente son rígidos, implantados en la
En la práctica se emplearon medios de cultivo membrana celular mediante un corpúsculo basal.
sólidos (agar nutritivo, King B y PDA), cabe Permiten a la mayoría de bacterias la movilidad
resaltar que, para hacer siembras en el laboratorio, en medios líquidos, una excepción son las
es necesario que los cultivos sean ricos en bacterias deslizantes que se mueven por flexión
nutrientes o que al menos satisfagan los de la pared celular.
requerimientos básicos necesarios por el
microorganismo que se va a sembrar. Desliz: Fallo involuntario, especialmente con
Para la siembra del cultivo de hongos se empleó respecto a la relación sexual.
agar PDA, el cual se caracteriza porque permite el
crecimiento de hongos y esporas debido a que ¿Que son las Archaeas?
poseen cloranfenicol, un pH neutro y altas Las Archaea, arqueas o arqueobacterias, son un
concentraciones de glucosa. grupo de microorganismos unicelulares de
Se comprobó la presencia de microorganismos en morfología procariota (sin núcleo ni, en general,
las diferentes muestras, ya que se encontraron organelos membranosos internos), que forman
unidades formadoras de colonias. De lo anterior, uno de los tres grandes dominios de los seres
se pudo afirmar que en todo lo que nos rodea vivos, y que son diferentes de las bacterias.
podemos encontrar microorganismos, estos
pueden ser tan pequeños que simplemente no son Las arqueas y bacterias son bastante similares en
visibles al ojo humano, hay que resaltar que éstos tamaño y forma, aunque algunas arqueas tienen
hacen posible que se cumplen diversas funciones formas muy inusuales, como las células planas y
esenciales permitiendo que se desarrolle la vida en cuadradas de Haloquadra walsbyi. A pesar de
el planeta. esta semejanza visual con las bacterias, las
arqueobacterias poseen genes y varias rutas
5. BIBLIOGRAFIA metabólicas que son más cercanas a las de los
Alarcon, L,R(2001). Manual de practicas de eucariotas, en especial en las enzimas implicadas
microbiología básica y microbióloga de en la transcripción y la traducción.
alimentos, programa de nutrición UACJ
Lichtman, J. J. y Conchillo, A. 2005. ¿Porque las endosporas bacterianas
Fluorescence microscopy. Nature Methods resisten temperatura?
Pedro García Martos, F. P. (1994). Las endosporas son formas de resistencia que
Microbiología clínica práctica. Servicio desarrollan ciertos bacilos y cocos Gram
Publicaciones UCA. positivos, ante los estímulos adversos del
Pírez M., M. M. (2008). Morfología y ambiente.
estructura bacteriana. Bogota: Editorial Las endosporas están destinadas a proteger el
Universidad nacional de colombia. ADN y el resto del contenido citoplasmático,
cuya actividad metabólica se reduce al estado de
6. ANEXOS vida latente, pudiendo resistir temperaturas de
hasta 80 ºC y soportar la acción de diversos
6.1.CUESTIONARIO
agentes físicos y químicos.
Identifique los tipos de movilidad de las
bacterias.
¿Porque las endosporas pueden ser
Browniano: Movimiento aleatorio derivado del
teñidas con verde malaquita?
empuje de moléculas de agua alrededor de la
La verde malaquita es un colorante débilmente
bacteria. Es la constante vibración de las
básico y, por tanto, se une débilmente a la célula
bacterias en un punto fijo comportamiento que se
bacteriana, penetra las células vegetativas,
presenta por estar suspendidas en medio líquido
cuando se penetra en la preparación también
y por su pequeño tamaño.
penetra las esporas.