5.2.2. Análisis microbiológico de agua para consumo humano.

Las técnicas empleadas son las siguientes:

Recuento de bacterias heterótrofas en placa (RHP) y el método de los tubos

múltiples de fermentación.

5.2.2.1 Recuento de bacterias heterótrofas en placa (RHP)

EL RHP se puede usar para indicar la composición bacteriana

general del agua de la fuente y la eficacia y eficiencia de los
procesos de tratamiento del agua, como la sedimentación,
coagulación, filtración y cloración. El monitoreo del RHP en el agua
distribuida puede proporcionar información sobre la limpieza del
sistema de distribución, desarrollo de bacterias después del
tratamiento, efectos de los cambios de temperatura en el agua y del
cloro residual en la población bacteriana

Procedimiento
Consiste en agregar un mililitro de la muestra y de la dilución 10-1
a una placa estéril, por duplicado, y verter 15 mL del medio (agar
plate count), el cual debe estar a una temperatura de 45° a 46° C,
luego se realiza la homogenización, se deja solidificar e incubar a
35+/- 0,5 °C por 48 horas. El conteo de las colonias se expresa
como UFC/mL. (Fluj. 01)

5.2.2.2 Determinación de coliformes totales/fecales por el método de

los tubos múltiples de fermentación para agua de consumo
humano.

Una de las pruebas estándar para el grupo de los coliformes puede

realizarse mediante la Técnica de Fermentación en Tubos
Múltiples en la cual los resultados del estudio de los tubos y
diluciones replicados se comunican en términos de Número Más
Probable (NMP) de microorganismos existentes. La densidad
bacteriana puede calcularse mediante una fórmula o por medio de
la tabla que utiliza el número de tubos positivos en las diluciones
múltiples. La prueba estándar para detectar bacterias coliformes
consta básicamente de dos fases: la prueba presuntiva y la prueba
confirmatoria.

 Prueba presuntiva:
Durante esta pruebas el medio de cultivo que se utiliza es el
caldo lauril sulfato de sodio.

Procedimiento

 Agitar y transferir de 10ml de la muestra hacia el primer frasco

correspondiente a dilución 10-1. Homogenizar. Luego con una
pipeta agregar 1ml del frasco a los cinco primeros tubos.
 Después del frasco de dilución 10-1 agregar 10ml al frasco de
dilución 10-2. Agitar. Luego con una pipeta agregar 1ml del
frasco a otros cinco tubos correspondientes a la segunda serie.
 Posteriormente, del frasco de dilución 10-2 agregar 10ml al
frasco de dilución 10-3. Homogenizar. Posteriormente con una
pipeta agregar 1ml del frasco a los últimos cinco tubos.
 Finalmente incubar los tubos a una temperatura de 37°C por
48 horas.
Nota: Al cabo de las 24 horas de incubación los tubos deben
ser examinados, si no se ha producido gas se vuelve a
examinar a las 24 horas. La presencia de turbidez,
efervescencia y gas en el caldo lauril sulfato indica una prueba
positiva.

 Prueba confirmativa para coliformes totales:

Para esta prueba se utilizan tubos de fermentación que
contienen el caldo lactosado bilis verde brillante. (Fluj. 02)

Procedimiento
Para la transferencia se debe utilizar un asa de siembra con
alambre de nicron cromo o platino iridio Nº 22 ò 24 en forma de
asa o anillo con 4 mm de diámetro.
  Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido
durante la prueba presuntiva, a tubos que contiene caldo (brila),
con campana de Durham.
 Luego agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
 Después incubar a 35°C durante 24 a 48 h.
 Finalmente registrar como positivos aquellos tubos en donde se
observen turbidez (crecimiento), efervescencia y producción de
gas en la campana, y consultar la tabla de NMP para conocer
el número más probable de organismos coliformes totales/100
mL.
Se aplica también a aguas de balnearios, efluentes clorados de
las plantas de depuración de aguas negras y en general a
cualquier muestra de agua.

 Prueba confirmativa para coliformes fecales:

Para esta prueba se utilizan tubos de fermentación que

contienen el caldo E.C usado para la determinación de
microorganismos coliformes fecales. (Fluj. 03)

Procedimiento
 Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido
durante la prueba presuntiva a tubos con caldo EC.
 Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
 Incubar a 44.5 +/-0.1°C en incubadora o un baño de agua con
circulación durante 24 a 48 h.
 Finalmente luego del periodo de inoculación, los tubos son
retirados del baño de agua, se agita suavemente y se observa
la producción de gas.
Se calcula el número más probable (NMP), basándose en las
combinaciones de tubos positivos y negativos, reportando los
resultados como coliformes fecales por 100ml.

5.2.3. Análisis microbiológico de agua de mar.

La técnica empleada se basa en el método de los tubos múltiples de
fermentación.

5.2.3.1 Determinación de coliformes totales/fecales por el método de

los tubos múltiples de fermentación para agua de mar.

La prueba estándar para detectar bacterias coliformes consta

básicamente de dos fases: la prueba presuntiva y la prueba
confirmatoria.

 Prueba Presuntiva
Para la prueba presuntiva se utiliza el medio de cultivo A1. (Fluj.
04)

Procedimiento
 Preparar unas 3 series de 5 tubos con medio A1 y ponerlos en
gradillas.
 Rotular los frascos de agua de dilución y los tubos dependiendo
del código asignado a la muestra.
 Homogenizar la muestra.
 Luego con una pipeta estéril inocular con 10 mL de muestra a
los 5 primeros tubos de caldo A-1
 Después inocular con 1 mL de muestra a los 5 tubos de caldo
A-1 correspondientes a la segunda serie.
 Finalmente transferir un 1 mL de la dilución 10-1 a 5 tubos de
caldo A-1, lo cual sería la tercera dilución.
 Incubar los tubos en baño maría a 44.5°C durante 24 horas.
Serán positivos aquellos que presente producción de gas,
turbidez y efervescencia para luego pasar a la prueba
confirmativa.

 Prueba confirmativa para coliformes totales:

Para esta prueba se utilizan tubos de fermentación que
contienen el caldo lactosado bilis verde brillante*.

 Prueba confirmativa para coliformes fecales:

 Para la prueba confirmativa se utilizan tubos de fermentación
que contienen el caldo E.C*
NOTA: Tanto para la determinación de coliformes
totales/fecales se utiliza el mismo procedimiento empleado en
la muestra de agua para consumo.

5.2.4. Análisis microbiológico de agua residual.

La técnica empleada se basa en el método de los tubos múltiples de

fermentación.

5.2.4.1 Determinación de coliformes totales/fecales por el método de

los tubos múltiples de fermentación para agua residual.

La prueba estándar para detectar bacterias coliformes consta

básicamente de dos fases: la prueba presuntiva y la prueba
confirmatoria.

 Prueba Presuntiva

Para esta prueba se emplea el caldo lauril sulfato de sodio.

(Fluj. 05)

Procedimiento
 Preparar 8 series de 5 tubos con medio Lauril Sulfato y
colocarlos en gradillas.
 Rotular los tubos dependiendo del código asignado a la
muestra.
 Homogenizar la muestra.
 Con una pipeta estéril, inocular 10 mL de la muestra a los 5
primeros tubos de Lauril Sulfato
 Luego inocular con 10 mL de muestra al frasco que
corresponde a la dilución 10-1. Homogenizar.
 Del frasco de la dilución anterior, transferir 1ml hacia los 5
tubos.
  Luego del frasco de 10-1 inocular con 10 mL hacia el frasco de
dilución 10-2. Homogenizar.
 Después transferir 1ml del frasco hacia los otros 5 tubos.
Repetir el procedimiento hasta la dilución 10-7
 Incubar los tubos a una temperatura de 37°C por 48 horas.

 Prueba confirmativa para coliformes totales:

Para esta prueba se utilizan tubos de fermentación que
contienen el caldo lactosado bilis verde brillante.

 Prueba confirmativa para coliformes fecales:

Para la prueba confirmativa se utiliza el medio E.C usado para
la determinación de coliformes fecales.

 Prueba confirmativa para identificar la presencia/ausencia

de Escherichia coli

Se emplea el caldo E.C con MUG

NOTA*: el procedimiento es el mismo que se realizó en el análisis del agua para

consumo humano.

XI. BIBLIOGRAFIA

RECUENTRO DE BACTERIA HETERÓTROFA. Métodos normalizados para el Análisis

de Agua potable y residuales APHA, AWW , WEF, 2th ed, 1998. Para Agua potable.
NUMERACIÓN DE COLIF. TOTALES. Método Estandarizado con tubos múltiples
APHA, AWN, WEF, 2th ed,2005. Aguas en general.
NUMERO DE COLIF. FECALES. Método Estandarizado de fermentad de tubos
múltiples APHA, AWW, WEF Part Z1 9221 Y 9221 E- 2, 2005. Aguas en general.
DIRECCIÓN GENERAL DE SALUD AMBIENTAL, 2010. Reglamento de la Calidad
de Agua para Consumo Humano, Lima- Perú.
Anexo 07: Preparación y distribución de medios de cultivo para el
análisis Microbiológico Descripción de medio de cultivo empleado para
el Recuento de bacterias heterótrofas en placa (RHP)

Agar Plate Count

Composición

Triptona.………………………………….… 20.0 g/litro

Dextrosa………………………………………5.0 g/litro
Extracto de levadura .………………………5.0 g/litro
Agar…………………………………………. 4.0 g/litro
pH final: 7.0 +/- 0.2

Preparación
Pesar 22.5 gramos por cada litro de agua destilada. Homogenizar. Luego
es llevado a ebullición y después es esterilizado en autoclave (utilizar
envuelto en papel de aluminio) a 121°C durante 15 minutos. Finalmente
se mantiene refrigerado en a conservadora.

Anexo 08: Descripción de medios de cultivo, para la determinación de

Coliformes totales/fecales por el método de los tubos Múltiples de
fermentación para el agua de consumo humano.

Existen 3 medios de cultivo para la prueba presuntiva (caldo lactosado,

caldo lauril triptosa y caldo lauril sulfato), se puede usar cualquiera de ellos
pero con preferencia se emplea el caldo lauril sulfato.

o Caldo lauril sulfato simple

Fundamento:
 Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los
microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores
lentos.

La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos,

la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato
proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico. Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el
desarrollo de la flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa, se
produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las campanas
Durham.

Formula (por litro):

Triptosa…………………………………………………..20g

Fosfato hidrogeno dipotasico……………………….2.75g

Fosfato dihidrogeno de potasio…………………….2.75g

Cloruro de sodio………………………………………5.0g

Lactosa…………………………………………………5.0g

Lauril sulfato de sodio………………………………..0.1g

Preparación:

Disolver 35.6 gramos en 1000ml de agua destilada distribuir la cantidad

de 10ml en los tubos de ensayo de 120 x 16mm provistos de las campanas
durham invertidos.

Esterilizar a la autoclave por 15 minutos y a 15 libras de presión y a 121oC.

o Caldo lauril triptosa

Fundamento:

Por la presencia de sodio lauril sulfato queda inhibida la totalidad de la

flora secundaria. El resto de los componentes constituyen los soportes
nutritivo, energético, salino y regulador del pH necesario para el buen
desarrollo de los coliformes. La detección de gas se hace con campanas
de durham. El medio no lleva ningún indicador de producción de ácido,
pero puede incorporarse. Un buen indicador de pH puede ser el purpura
de Bromocresol a una concentración de 0.02g/l. Este caldo es idóneo para
ser suplementado con MUG a razón de 50mg por litro de medio; MUG es
un fluorocromo que permite la detección de E. coli. Ademas se puede
detectar la producción de indol, añadiendo al cultivo el reactivo de
KOVACS o con las tiras reactivas del indol. Esta determinación permitirá
la confirmación de E. coli.

Formula (por litro):

Sodio Laurilsulfato…………………………………………...0.10g

Triptosa………………………………………………………20.0g

Lactosa………………………………………………………..5.0g

Potasio di-hidrogeno Fosfato……………………………..2.75g

di-Potasio Hidrogeno Fosfato…………………………….2.75g

Sodio Cloruro………………………………………………5.0g

pH final: 6.8+/-0.2

Preparación:

Disolver 35.6 gramos en 1000ml de agua destilada distribuir la cantidad

de 10ml en los tubos de ensayo de 120 x 16mm provistos de las campanas
durham invertidos.

Esterilizar al autoclave por 15 minutos y a 15 libras de presión y a 121oC.

o Caldo lactosado:

Fundamento:

Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores de crecimiento

bacteriano. Permite recuperar células injuriadas, diluye sustancias toxicas
o inhibitorias y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras
 bacterias. El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y
nitrógeno, mientras que la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.
Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas.

Formula (por litro):

Lactosa…………………………………………..5.0g

Extracto de carne………………………………3.0g

Peptona de gelatina…………………………..5.0g

pH final: 6.9+/-0.2

Preparación:

Disolver 13 gramos en 1000ml de agua destilada distribuir la cantidad de

10ml en los tubos de ensayo de 120 x 16mm provistos de las campanas
durham invertidos.

Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión a 121oC.

Enfriar lo más rápido posible.

Anexo 09: Descripción de medios de cultivo, para la determinación de

Coliformes totales/fecales por el método de los tubos Múltiples de
fermentación para agua de mar.

o Caldo A1

Fundamento:
Usado para la determinación presuntiva de coliformes.

Formula (por litro):

Triptona.………………………………….20 gr
Lactosa……………………………………..5 gr
Cloruro de Sodio.…………………………5 gr
Salicina……………………………………0.5 gr
 Triton.………………………………………1ml

Preparación:
Suspender 31,5 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar
bien y se disuelve calentando con agitación frecuente. Hervir durante un
minuto hasta la disolución esté completa. Dispense en tubos con
campanas Durham para la detección de gas. Esterilizar en autoclave a
121 ° C durante 15 minutos.

Anexo 10: Descripción de los medios de cultivo para pruebas

confirmativas

Existen 2 medios de cultivo para la prueba confirmativa (caldo lactosado

Verde Brillante Bilis 2%-Caldo Brilla y Caldo EC para las muestras de
agua de consumo, agua de mar, lagunas yaguas residuales.

o Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2%-Caldo Brilla

Fundamento:

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el

adecuado desarrollo bacteriano, con la presencia de la bilis de buey y del
verde brillante se consigue la inhibición de casi toda la totalidad de los
microorganismos Gram-positivos y de los Gram- negativos distintos de los
grupos de los coliformes. Se ha de señalar que la concentración de verde
brillante es crítica para impedir el crecimiento de gérmenes anaerobios
capaces de fermentar la lactosa a 44oC, lo cual si se produjera, podría
falsear los resultados.

Formula (por litro):

Bilis de buey deshidratada…………………….20.0g

Verde brillante…………………………………13.3mg
 Lactosa…………………………………………..10.0g

Peptona de gelatina……………………………10.0g

Preparación:

Disolver 40g en 1000ml de agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo

con campana Durham en porciones de 10ml cuando la muestra sea de
1ml o menos. Si la muestra a analizar es mayor, se puede preparar un
caldo más concentrado (doble o triple concentrado) y restablecer la
concentración al añadir la muestra. En cualquier caso esterilizar a 121oC
durante 15 minutos.

o Caldo E.C

Fundamento:

En el medio de cultivo la tripteína es la fuente de péptidos, aminoácidos y

nitrógeno. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece el
desarrollo de bacterias coliformes, las sales biliares inhiben el crecimiento
de la flora acompañante Gram positiva, las sales fosfato constituyen un
sistema buffer que impide que los productos ácidos originados por la
fermentación de lactosa afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico.

Formula (por litro):

Peptona de caseína…………………………………………..20.0g
Lactosa…………………………………………………………5.0g
Mezcla de sales Biliares……………………………………...1.5g
Cloruro de Sodio……………………………………………..…5.0g
Di- Potasio hidrogeno fosfato…………………………….……4.0g
Potasio dihidrogeno fosfato……………………………….…..1.5g

Preparación:

Disolver 37 gramos de este medio en 1000ml de agua destilada.

Distribuir la cantidad de 10ml en los tubos de ensayo de 150 x 16mm

provistos de los tubos durham invertido.
 Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión y
121oC. El pH del medio después de la esterilización es de 6.9 +/- 0.1

o Caldo E.C con MUG

Fundamento:
Usado para la determinación confirmativa de coliformes fecales para
aguas residuales y de laguna.
Esta prueba se basa en la presencia de enzima ß-glucoronidasa (GUD)
en E.coli, que desdobla el sustrato MUG (4-methyl-umbelliferyl beta D-
glucoronido), y lo transforma en MU (4-methylumbelliferone).
Aproximadamente el 94 % de E. coli,incluyendo algunas cepas
aerogénicas producen la enzima GUD.Aunque Shigella (44 %) y
Salmonella (29 %) también producen GUD, su producción por otras
Enterobacterias es infrecuente.
Las cepas de E. coli enterohemorrágico no producen GUD. La falta de la
actividad de esta enzima en E.C.E.H, se ha usado como un criterio de
selección para su patogenicidad. Cerca del 34 % de los aislamientos de
E. coli en heces humanas son informados como GUD negativos.
Hay evidencia sin embargo que la actividad de la enzima GUD puede
estar controlada por represión catabólica y que la secuencia genética para
la producción de la enzima está presente en la mayoría de los E. coli GUD
negativos aislados. Incorporando MUG en el medio EC e incubarlos a 44,5
°C y examinando los tubos a la luz U.V. (365 nm), se presenta una
fluorescencia que es fácilmente observada

Formula (por litro):

Enzima caseína.………………………………….20.0 g/litro
Lactosa…………………………………….….…..5.0 g/litro
Cloruro de Sodio.…………………………….…. 5.0 g/litro
Dipotasio hidrógeno fosfato…………………….4.0 g/litro
Sales biliares….….….….……………………… 1.5 g/litro
Potasio di-hidrógeno fosfato……………………5.0 g/litro
4-Metilumbeliferil-β-D-glucorónido (MUG). 0.05 g/litro
pH final: 6.9 +/- 0.2
 Preparación:
Rehidratar 37 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15
minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición
durante 1 minuto para disolverlo por completo. Distribuir en tubos de
ensayo o frascos con campana de Durham.

Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos.

Conservar en refrigeración de 2º a 8ºC. Antes de utilizar el medio verificar
que en la campana no existan burbujas de aire.

Anexo 11: Preparación y distribución de agua de dilución amortiguadora

Se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los

microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se
cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH
favorables para iniciar la recuperación y actividad de las células
microbianas presentes, así como para favorecer aquellas que se buscan
entre una población mixta.
El agua de dilución se prepara con las siguientes soluciones:

Solución A:

Fosfato monopotasico (KH2PO4 )…………………………34.0 g

Agua destilada ………………………………………………1000 ml

Preparación:

Disolver el Fosfato monopotasico con 500ml de agua destilada. Luego

ajustar el pH hasta 7.2 con NaOH 1N y completar el volumen a 1000 ml.
Finalmente esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de
presión (121°C)

Solución stock B

Sulfato de magnesio (MgSO4)7H2O……………………….50.0G

Preparación:
Disolver el sulfato de magnesio en 1000 mililitros de agua destilada.
Después esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión
(121°C)

Preparación del agua de dilución

Formula:

Solucion A……………………………………………………1,25 ml

Solucion B……………………………………………………5,00 ml

Agua destilada ………………………………………………1000 ml

pH después de la esterilización 7,2 +/- 0.1

Adicionar 1,25ml de la solución A y 5,00 ml de la solución B a 1000 ml de

agua destilada. Mezclar bien. Distribuir en frascos de dilución la
cantidades de 90 +/- 2ml para diluir 20 ml de muestra. Finalmente
autoclavar a 121°C durante 15 minutos.
 Flujograma N°01: determinación de bacterias heterótrofas.

Flujograma N°02: determinación de coliformes totales por la técnica de los tubos múltiples
de fermentación.
Flujograma N°03: determinación de coliformes fecales por la técnica de los tubos múltiples
de fermentación.
Flujograma N°04: determinación de coliformes fecales por NMP para aguar de mar.
Flujograma N°05: diluciones usadas en la determinación de coliformes totales para análisis
de aguas residuales.