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INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
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2000; Hoodbhoy y cols. 2005). El espermatozoide se une a esta formidable
barrera y sufre la RA para atravesarla (Yanagimachi, 1994). Numerosos estudios
evidencian que la unión del espermatozoide a la ZP es un proceso mediado por
carbohidratos (Nixon et al., 2001; Wassarman y Litscher, 2001; Wassarman et al.,
2001), pero los oligosacáridos precisos a los que se une el espermatozoide
permanecen bajo debate y pueden variar según la especie.
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actuaran eficazmente. Se ha demostrado que en los ovocitos fecundados in vitro
no se produce el endurecimiento de la ZP tras la fecundación, cuando los ovocitos
porcinos y bovinos han sido madurados in vitro (Coy et al., 2002; 2005a). Sin
embargo, in vivo Wang et al., (1998) demostraron que la ZP de los ovocitos
ovulados recogidos de oviducto presenta una mayor resistencia a la digestión con
pronasa (permaneciendo inalterable tras 2 horas en la solución de pronasa),
mientras que en los madurados in vitro la ZP era digerida en 2 minutos
aproximadamente.
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casos de interacción heteróloga espermatozoide-ZP desencadenan la inducción
de la RA, demostrando que no se trataba de una simple interacción mecánica.
Atendiendo a la ZP, Zhu y Naz (1999) demostraron que existe un alto grado
de homología entre especies para la secuencia de aminoácidos de la ZP3. Esta
proteína se considera responsable de la unión del espermatozoide en diferentes
especies, entre ellas el ratón (Wassarman y cols ., 2004 ). En el caso del cerdo y
el hombre la homología a nivel de ZP3 se cifra en el 78,9 % (Zhu y Naz, 1999).
Teniendo en cuenta esto se plantea como una opción interesante estudiar si es
posible la unión del espermatozoide humano a la ZP porcina, lo cual sería de
utilidad para el estudio de la funcionalidad espermática humana. El estudio de la
interacción espermatoide-ZP entre gametos humanos, presenta limitaciones
debido a la dificultad para obtener ZP humana. Por esta razón numerosos grupos
de investigación han intentado obtener ZP humana recombinante utilizando
células CHO (cells hamster ovary), habiéndose demostrado en algunos casos que
la proteína recombinante obtenida es funcional (Brewis y cols. 1996; Bray y cols,
2002; Chakravarty y cols. 2005), mientras que en otros la proteína no posee la
actividad biológica esperada (Rankin y cols., 1998; Martic y cols., 2004).
Recientemente Ni y cols. (2006) han publicado los resultados obtenidos utilizando
péptidos de ZP humana recombinante que inducen la RA. De cualquier modo su
uso no se ha extendido a nivel clínico, por lo que sigue siendo de interés buscar
nuevas alternativas al uso de la ZP humana.
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hembras de hámster a las que hay que inducir la ovulación y sacrificar para
obtener ovocitos.
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0.1 OBJETIVOS
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1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1.1. Preliminares
1.1.1.1. Capacitación e hiperactivación
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La capacitación es un proceso reversible, que comienza con la eliminación
de factores unidos al espermatozoide procedentes del plasma seminal y se
considera que acaba cuando el espermatozoide es capaz de responder al
estímulo provocado por los ligandos de la ZP, desencadenando la RA.
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Durante la capacitación, uno de los procesos bioquímicos que se produce
es la desestabilización de la membrana plasmática, lo que provoca un aumento
de la fluidez de la misma. El colesterol de la membrana de los espermatozoides
es el responsable de la estabilidad de la membrana, permitiendo una
permeabilidad iónica de la misma e inserción y motilidad limitada de las proteínas.
In vitro, la incubación de los espermatozoides en medios que contienen albúmina,
que actúa como adsorbente de colesterol (Cross, 1998), o con fluido folicular u
oviductal, favorece la pérdida de colesterol y la consiguiente capacitación (de
Lamirande y cols., 1997). Algunos autores proponen que esta pérdida de
colesterol es necesaria para la exposición de determinados antígenos o ligandos,
que interactúan con moléculas de reconocimiento presentes en la ZP (Benoff y
cols., 1993). Visconti y Kopf, (1998) señalan que la pérdida de colesterol está
relacionada con las señales que resultan de la fosforilación de proteínas en
residuos tirosina.
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produce en el oviducto en un momento exacto, pero todavía no ha sido
identificada. Sin embargo sí se sabe que el resultado final de esta señal consiste
en la interacción de los iones Ca2+ con el axonema del flagelo, lo que provoca la
hiperactivación (Cook y cols., 1994). A este nivel actúan las “CatSper1” que
funcionan como canales de Ca2+ dependientes de voltaje, y controlan la entrada
de este ión a nivel del flagelo (Carlson y cols. 2003). Aunque la hiperactivación
ocurre normalmente in vitro a la vez que el proceso de capacitación, determinados
autores consideran que los mecanismos implicados no coinciden exactamente.
De hecho, en ratón y hámster la hiperactivación puede ocurrir en ocasiones
independientemente de la capacitación (DeMott y cols., 1995; Olds-Clarke, 1989).
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El papel que juega en la fecundación la progesterona sintetizada por estas
células ha sido debatido, ya que si uno de los requisitos para que los
espermatozoides mantengan su capacidad fecundante es que su acrosoma esté
intacto, la inducción de la RA por la progesterona no favorecería el éxito de la
fecundación. Sin embargo, se ha demostrado en diferentes especies (humana,
Morales y cols., 1988; hámster, Myles y cols., 1987) la capacidad que tienen de
unirse a la ZP espermatozoides con el acrosoma reaccionado.
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1.1.2. Interacción con la ZP
En otros vertebrados como los peces, anfibios y reptiles, las capas que
rodean al ovocito son denominadas corion, membrana vitelina o membrana
perivitelina, respectivamente. Estas estructuras son similares en grosor y función
a las de los mamíferos, por lo que pueden ser referidas colectivamente como ZP
(Spargo y Hope, 2003).
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Cummulus ZP
oophorus
Ovocito Oolema
Oolema
A B C
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fusión de varias capas de la red de la ZP (Sinowatz y cols., 2001; Funahashi y
cols., 2000). En la especie porcina, Rath y cols., (2005) observaron que los
ovocitos madurados in vitro durante 48 horas presentaban una estructura similar
a los ovocitos inmaduros, con gran número de poros quizás debido a que la
retracción de los microfilamentos estaba retrasada o era incompleta, mientras que
los ovocitos madurados sólo durante 24 horas presentaban un aspecto más
parecido a los madurados in vivo. Sin embargo, a pesar de los resultados
mencionados, Familiari y cols., (2006), apuntan que estos deben ser interpretados
con precaución, debido a que el procesado de las muestras para microscopía
electrónica provoca artefactos en las mismas.
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Como ya hemos mencionado, en la mayoría de especies son tres las
glicoproteínas que conforman la ZP, aunque recientemente se ha descrito la
presencia de una cuarta proteína en la ZP humana (Lefievre y cols., 2004), en la
ZP de rata (Hoodbhoy y cols., 2005) y en la ZP de hámster (Jiménez-Movilla,
2005; “Genbank” bankit821091, DQ838550).
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de unión a lectinas en diferentes especies demuestran una alta especificidad
(Sinowatz y cols., 2001a; Avilés y cols. 1994, 2000).
1.1.2.2. Funciones de la ZP
Entre las funciones más importantes que esta estructura desempeña hasta
el momento de la fecundación destacan las siguientes: protección del ovocito,
regulación de la interacción espermatozoide-ovocito estableciendo cierta
especificidad de especie, inducción de la RA y prevención de la polispermia.
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cierta elasticidad (Green, 1987). Además cuando los ovocitos con la ZP intacta
son sometidos a un vigoroso pipeteo, la ZP se puede romper y fragmentarse sin
pérdida de la estructura esférica de los fragmentos (Green, 1997).
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forma competitiva la unión de los espermatozoides a la ZP, mientras que ZP1 y
ZP2 no provocan este bloqueo. Esto sugiere que la ZP3 es la proteína de la ZP
donde se une el espermatozoide (Bleil y Wassarman, 1986; Mortillo y
Wassarman, 1991; Shur y cols. 2006).
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del tipo O-unidos de la ZP3 y que estos son eliminados después de la
fecundación (Florman y Wassarman, 1985; Miller y cols., 1992; 1993). Sin
embargo otros estudios evidencian el papel de las cadenas de oligosacárido N-
unidas en la unión del espermatozoide en bovino y porcino (Amari y cols., 2001;
Nakano y Yonezawa, 2001; Yonezawa y cols., 2001).
El modelo supramolecular descrito por el grupo del Dr. Dean propone que
es la estructura supramolecular de las proteínas la que determina la unión del
espermatozoide a la ZP, la cual es modificada por una proteasa liberada desde
los gránulos corticales. El mencionado modelo se propone a raíz de los resultados
obtenidos por Rankin y cols. (1998; 2003) utilizando animales transgénicos, en los
que se han introducido los genes de ZP2 y ZP3 humana. Los resultados
demuestran que aunque se expresa ZP2 y ZP3 humana en los ovocitos de ratón
no hay unión de espermatozoides humanos, mientras que los espermatozoides
de ratón se unen, incluso después de haberse producido la reacción cortical.
Según este modelo, la ZP formada por ZP2 y ZP3 con una disposición
tridimensional específica, sería responsable de la capacidad de unión del
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espermatozoide, de modo que según han descrito diferentes autores (Barros y
Yanagimachi, 1972; Wolf y Hamada, 1977), tras la unión de un espermatozoide y
extrusión de los gránulos corticales, se produciría una modificación o “cleavage”
de la ZP2 que provocaría una modificación de la estructura supramolecular, un
cambio en la conformación espacial que impediría que se puedan unir más
espermatozoides. En este modelo, aunque no se descarta la participación de los
carbohidratos, no sería necesaria su modificación tras la fecundación. Este
modelo supramolecular explicaría los resultados obtenidos con ratones en los
que no hay ZP1 y que forman una ZP compuesta de ZP2 y ZP3 la cual, aunque
estructuralmente es defectuosa, continúa teniendo la capacidad de unir
espermatozoides, siendo los ratones “knockout” de ZP1 fértiles (Rankin y cols.,
1999).
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espermatozoides de diferentes especies en ovocitos sin ZP de especies
heterólogas (Yanagimachi y cols., 1976; Gardon y cols., 2001; Zhao y cols.,
2002).
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1.1.2.5. Receptores del espermatozoide y la ZP
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La importancia biológica de la GalT-I y la adhesión a la ZP3 se ha
comprobado en varios ensayos in vitro. En experimentos usando la ZP intacta, el
bloqueo o eliminación de los residuos N-acetilglucosamina reduce la unión de
espermatozoides (Lopez y cols., 1985). Cuando dichos residuos
N-acetilglucosamina son bloqueados o eliminados de la ZP3 solubilizada, ésta
pierde su capacidad para unir espermatozoides (Miller y cols., 1992). Estos
resultados sugieren que la interacción entre GalT-I y ZP3 es necesaria para la
unión entre gametos. Sin embargo, parece no ser totalmente imprescindible, ya
que Rodeheffer y Sur (2004) demostraron la unión de espermatozoides a la ZP
utilizando ratones transgénicos sin Gal T-I, aunque el número de espermatozoides
unidos fue menor, por lo que se sugiere que en ovocitos ovulados existe otro
ligando independiente de ZP3, además de Gal T-I, que permite la unión del
espermatozoide a la ZP pero que no participa en la exocitosis del acrosoma.
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La RA está mediada por una compleja interacción de señales celulares, las
cuales incluyen activación de proteínas quinasas y su consecuente fosforilación,
activación de canales iónicos y otros procesos aún por definir (Aitken, 1997;
Breitbart, 1997; 2002; Visconti y cols., 1999; Herrick y cols., 2005), aunque
algunos de estos se describen como característicos del proceso de capacitación.
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Aunque existen evidencias de que los espermatozoides movilizan Ca2+
tanto del medio extracelular como de los depósitos intracelulares, no se conocen
los mecanismos precisos. Existen indicios de que el acrosoma pudiera actuar
como depósito intracelular de calcio, lo cual ha sido demostrado en ratón (Herrick
y cols., 2005).
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OVOCITO
Me mbrana
plas má tica
Me mbrana
acros o mal ex te rna
ACROSOMA
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La activación de las fosfolipasas PLC β 1 (mediante la proteína G acoplada
al receptor R) y la PLCγ (mediante el ligero aumento de calcio por movilización
desde el acrosoma), generaría la hidrólisis del fosfatidil inositol bifosfato (PIP 2)
para formar inositol trifosfato (IP 3) y diacilglicerol (DAG).
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la fosfolipasa D (PLD). Esta estructura a modo de “andamiaje” mantiene
separadas ambas membranas, evitando que se fusionen y se libere el contenido
del acrosoma (Breitbart y cols., 2005).
Los altos niveles de Ca2+ intracelular (sobre 500nM) que se producen como
consecuencia de la inducción de la RA, según el modelo antes descrito, provocan
la activación de proteínas “cortadoras” de actina, que inducen la ruptura de los
filamentos de actina y el desmantelamiento de la estructura de sostén entre
ambas membranas que las mantenía separadas (Breitbart y cols. 2005). Spungin
y cols., en 1995 observaron que la inhibición de la despolimerización de la actina,
mediante el uso de faloidina provoca la inhición de la RA.
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Una compleja serie de interacciones moleculares acontecen durante la
interacción de las membranas de los gametos, que se inicia con una primera
unión o “attachment”. Posteriormente tiene lugar la adhesión celular propiamente
dicha entre los dos gametos, para culminar con la fusión de las dos membranas,
que tiene como resultado la formación de una célula fruto de la unión de otras dos
(Evans, 2002).
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Respecto al ovocito, las proteínas que se consideran implicadas en esta
interacción son denominadas integrinas (α 6β 1 y otras) y tetraspaninas (CD9)
(Evans, 2002; Kaji y Kudo, 2004). Sin embargo, He y colaboradores (2003) de
acuerdo a los resultados que obtuvieron afirman que ninguna de las proteínas
ADAM o integrinas presentes en ratón es imprescindible para la unión y fusión
entre gametos.
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La fusión queda restringida a una región específica de cada gameto, la cual
puede reflejar una composición proteica, organización de lípidos o morfología de
membrana determinada para esa región. La porción de la membrana plasmática
del espermatozoide que cubre parte del acrosoma y que no se fusiona durante la
RA se denomina región ecuatorial y es la zona donde se inicia el proceso de
fusión en el espermatozoide (Yanagimachi, 1988; Figura 3). Aunque la fusión del
espermatozoide al oolema puede producirse en posición perpendicular o paralela,
generalmente siempre se produce mediante la región central de la membrana
plasmática, en la proximidad o a nivel de la región ecuatorial (Gaddum-Rosse,
1985). A nivel del oolema, se observa la presencia de microvellosidades en la
mayoría de la superficie; en roedores, la zona que recubre la placa metafásica no
presenta microvellosidades y la fusión raramente ocurre a este nivel, no
apareciendo a este nivel moléculas de CD9, ni integrinas.
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Me mbr an a acros o mal inter na
Cumulus
o o p ho rus S eg ment o ecu at orial
Acros o ma
Micr o vellos i da des
ZP
Es pacio peri vi telino
Placa me t afá s ica
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Además en el conjunto de espermatozoides unidos se incluyen varias
poblaciones, y algunos de ellos se unen mediante interacciones que no les
permitirán posteriormente fusionarse. Por ejemplo, espermatozoides de roedores
con acrosoma intacto pueden unirse a ovocitos libres de ZP pero no pueden
fusionarse (Yanagimachi, 1994). En la mayoría de ensayos se utilizan largos
periodos de tiempo de coincubación (20-24 horas), lo cual no permite diferenciar
entre los espermatozoides que se unen rápidamente (antes de que exista fusión
de algún espermatozoide al ovocito) y los que se unen de forma tardía (cuando ya
se ha unido algún espermatozoide al ovocito), teniendo en cuenta que la fusión de
un espermatozoide podría cambiar la habilidad del ovocito para que se unan
espermatozoides adicionales.
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especies de mamíferos testadas (Yanagimachi, 1988). Sin embargo existen
referencias en las que se demuestra que los espermatozoides humanos no son
capaces de fusionarse y penetrar ovocitos de ratón y rata, especies
filogenéticamente cercanas al hámster (Quinn, 1979; Pavlok, 1980).
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Mediante ensayos en los que se utilizaron secuencias de péptidos de la
fertilina β de hámster (en concreto del dominio desintegrina), obtenidos mediante
síntesis, se observó una importante reducción de la fusión entre espermatozoides
y ovocitos (Myles y cols. 1994), por lo que se le ha atribuido una función en el
mecanismo de fusión. Para profundizar en el estudio del mecanismo de unión y
fusión de gametos se han obtenido ratones “knock-out” con ausencia de fertilina
β, ADAM 3 o ambas. Los espermatozoides de cada una de las líneas de ratones
mostraron una dramática reducción en la unión a ovocitos sin ZP, en torno al 90%
(Cho y cols., 1998; Nishimura y cols., 2001). Sin embargo, se observó además
que los ratones “knock-out” para fertilina β o ADAM 3, presentaban reducción en
la expresión de otras desintegrinas y podría afectar a otras proteínas no
identificadas y responsables de la unión del espermatozoide.
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La primera referencia que indica la implicación del CD9 en el proceso de
fecundación fue obtenida de experimentos en los que usaban anticuerpos contra
CD9 (Chen y cols., 1999), y como resultado se inhibía in vitro la unión y fusión del
espermatozoide al ovocito de forma dosis dependiente. CD9 se encuentra
distribuido por toda la superficie del ovocito, con la excepción de la región que
cubre la placa metafásica en el caso de roedores y donde raramente se produce
la fecundación (Kaji y cols., 2000). Kaji y cols., (2000), Le Naour y cols. (2000) y
Miyado y cols. (2000) demostraron que los espermatozoides eran capaces de
unirse a ovocitos de ratón deficientes en CD9 de modo similar al tipo salvaje, pero
que sin embargo raramente se producía la fusión entre los gametos in vivo o in
vitro. Además cuando se microinyectaron espermatozoides en los ovocitos
deficientes en CD9 se consiguió desarrollo a término, demostrando que la
deficiencia en CD9 no impedía el desarrollo normal de los cigotos (Miyado y cols.
2000).
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ESPERMATOZOIDE
ADAM´S
Fertilina β
Fertilina α Cirystetina
DE
PROTEINA-GPI
INTEGRINAS
OVOCITO CD 9
UNIÓN
FUSIÓN
?
Figura 4. Representación de las moléculas implicadas en el proceso de unión y fusión
espermatozoide-ovocito (Modificado de Kaji y Kudo, 2004).
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1.1.5. Interacción con el citoplasma
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1997), hámster (Yanagida y cols., 1991) y cerdo (Kim y cols., 1999) después de la
microinyección de espermatozoides de especies heterólogas. Sin embargo, en el
caso de espermatozoides de rata se ha observado que no son capaces de formar
pronúcleos masculinos en ovocitos libres de ZP de cerdo (Zhao y cols. 2002),
hámster o conejo (Hanada y Chang, 1976). Una posible explicación a estos
resultados sería que los espermatozoides de rata tengan una cantidad insuficiente
de factor activador o una baja capacidad activadora. Además, Okitsu y cols.
(2001) tras la microinyección de espermatozoides de toro y hombre en ovocitos
bovinos maduros observaron que los humanos producían unos porcentajes de
activación significativamente menores (75.9 % vs. 14.8%). Estos resultados
sugieren que existe diferente capacidad del espermatozoide según la especie
para provocar la activación del ovocito.
Naish y cols. (1987) demostraron que los mecanismos empleados por los
ovocitos de hámster para transformar el núcleo del espermatozoide en pronúcleo
y la síntesis de ADN en el núcleo no son exclusivos para espermatozoides de
hámster. No obstante, los mecanismos mencionados funcionan, aparentemente,
de forma más efectiva cuando está presente un núcleo espermático de hámster
que con núcleos espermáticos heterólogos.
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parece que existen algunas limitaciones en cuanto a las especies más adecuadas
de ovocitos a utilizar en función de la procedencia de los espermatozoides.
1.2.1. Polispermia
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fecundación in vitro, como son el uso de ovocitos obtenidos por maduración in
vitro, el uso de un alto número de espermatozoides capacitados por ovocito,
anormalidades a nivel de la ZP, inadecuada composición de los medios de FIV, o
condiciones subóptimas de pH o temperatura durante la fecundación.
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residuos de ácido siálico de las cadenas de la ZP bovina están implicados en la
unión de espermatozoides y que la presencia de un inhibidor de sialidasa en el
medio de FIV incrementa la polispermia, sugiriendo la participación de la sialidasa
en la especie bovina (Velasquez y cols., 2006); sin embargo, en la especie
porcina no se ha detectado por el momento ningún enzima de los gránulos
corticales que participe con seguridad en el bloqueo de la polispermia.
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Aunque no se conoce demasiado sobre las moléculas y mecanismos
básicos del bloqueo del oolema en mamíferos, hay evidencias de su existencia a
partir de varios resultados obtenidos desde hace décadas. Por ejemplo, la
presencia de espermatozoides en el espacio perivitelino (EPV, entre la ZP y la
membrana plasmática) que son incapaces de fecundar el ovocito, descrita por
Lewis y Wright (1935) y por Austin (1961).
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publicados demuestran que también se produce polispermia, en porcentajes entre
el 10 y el 25 % (Wang y cols., 1997; Coy y cols., 2005). Por ello es de gran interés
profundizar en el conocimiento de los mecanismos implicados en el mecanismo
de bloqueo de la polispermia en estas especies, con el fin de disminuirla y que
ello repercuta en un mayor rendimiento de la producción de embriones in vitro.
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Otro de los mecanismos propuestos que participa en el bloqueo efectivo
de la polispermia en condiciones fisiológicas es la deglicosilación enzimática, es
decir la eliminación de terminales glicosídicos de la ZP que podrían intervenir
como receptores para la unión del espermatozoide.
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demostrada la existencia de glicosidasas (Miller y cols. 1993; Carrasco y cols.,
2007; Romar y cols. 2007).
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En relación a la formación de puentes disulfuro se ha observado que en la
ZP, después de la fecundación o la activación in vitro, se produce un cambio en la
sensibilidad frente a diferentes agentes como enzimas proteolíticos, calor, ácidos
y agentes reductores (Dunbar y Wolgemuth, 1984). Estas modificaciones, a
menudo denominadas endurecimiento (“hardening”), que normalmente implican
un mayor tiempo necesario para la solubilización de la ZP, estarían relacionadas
con el bloqueo de la polispermia y/o con la protección del embrión durante su
paso por el oviducto (Hoodbhoy y Talbot, 1994).
Diferentes autores han propuesto que las células oviductales y células del
cumulus oophorus ejercen efectos sobre la ZP. Broermann y cols. (1989)
observaron que los ovocitos que habían estado en contacto con las secreciones
oviductales necesitaban largos periodos de tiempo, más de 24 horas, para la
disolución de la ZP. Además la preincubación de ovocitos con glicoproteínas
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purificadas de oviducto (Kouba y cols., 2000) y con células oviductales (Romar y
cols., 2001) aumenta la monospermia tras la fecundación.
Bajo condiciones in vitro, en las que los ovocitos no han estado en contacto
con las secreciones oviductales, la reacción cortical de ovocitos porcinos
madurados y fecundados in vitro aparece de forma tardía en el tiempo (Wang y
cols. 1997). Coy y cols. (2002) sugieren que tras la fecundación in vitro podría no
producirse el endurecimiento de la ZP y Romar y cols. (2005) proponen que la
falta de endurecimiento de la ZP después de la FIV podría ser una de las
explicaciones a los altos porcentajes de polispermia observados en los sistemas
in vitro.
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los resultados son claros, no hay ninguna demostración del mecanismo de acción
implicado en la reducción de la polispermia observada, siendo tan sólo hipótesis o
sugerencias de los autores para explicar dichos resultados.
En la especie porcina, desde 1985 cuando Cheng publicó por primera vez
la obtención de lechones mediante fecundación in vitro y tras el primer nacimiento
de lechones utilizando ovocitos madurados y fecundados in vitro en el año 1993
(Yoshida y cols.), numerosos grupos de investigación han centrado su trabajo en
el estudio de la producción in vitro de embriones en esta especie, intentado
buscar soluciones a los problemas planteados (limitado desarrollo de los
embriones para alcanzar el estadio de blastocisto y menor calidad en
comparación con los embriones obtenidos in vivo) (Hunter, 1990; Wang y cols.,
1998 ; Prather y Day, 1998; Abeydeera, 2002; Coy y Romar, 2002; Niemann y
cols., 2003; Funahashi, 2003; Nagai y cols., 2006).
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pueden superar el 50 % (Funahashi y Romar, 2004). En bovino, aunque es menos
frecuente, nuestras observaciones en laboratorio y algunos trabajos publicados
demuestran que también se produce polispermia, en porcentajes entre el 10 y el
25 % (Wang y cols., 1997; Coy y cols., 2005a).
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utilizando ovocitos madurados in vivo, que se sitúan alrededor del 28% (Wang y
cols., 1998).
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entonces diferentes investigadores han intentado desarrollar métodos que
identifiquen alteraciones en la funcionalidad espermática. Sin embargo,
desafortunadamente hoy día no existe una prueba fiable al 100% que permita
identificar cualquier tipo de alteración en la función del espermatozoide y predecir
con exactitud los resultados de fecundación in vivo y/o in vitro.
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Existen distintos tipos de estudios que tienen como objetivo predecir la
fertilidad masculina, los cuales se pueden dividir en grandes grupos, siguiendo
diferentes criterios. Por ejemplo según sean análisis básicos u opcionales, según
evalúen características físicas y bioquímicas del semen o características
funcionales.
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A nivel bioquímico, la evaluación del semen se refleja en el estudio de los
productos de secreción de las glándulas accesorias. Entre los parámetros que se
cuantifican destaca la medición de la fructosa, como indicador de la función de las
vesículas seminales. También se ha demostrado que los niveles de L-carnitina y
zinc son significativamente menores en plasma seminal de varones infértiles que
en el de varones fértiles (WHO, 1999). Otros ensayos de interés son los que
determinan la acrosina o el contenido de ATP.
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como fármacos, elevada temperatura testicular, contaminación atmosférica, edad
avanzada, tabaquismo, y diversas enfermedades (reviado por Agarwal y
Allamaneni, 2005). Esto ha generado el desarrollo de distintas técnicas que
permiten detectar la presencia de lesiones en el ADN de los espermatozoides.
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quimioluminiscencia y de citometría de flujo. Aunque comúnmente se han utilizado
los ensayos de quimioluminiscencia (Sikka, 2004), debido a los altos costos que
requieren las técnicas de resonancia magnética de electrones, actualmente las
técnicas de citometría de flujo ofrecen una alternativa que permite obtener
resultados satisfactorios (Gadea y cols., 2005) a un menor coste, haciendo más
accesible su uso.
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ha unido está desnaturalizado y se trata de una cadena simple). Para medir las
emisiones generadas con diferente color se utiliza la citometría de flujo.
Actualmente el estudio de la estructura de la cromatina del espermatozoide,
conocido como SCSA es frecuentemente usado en clínicas de infertilidad humana
(Bungum y cols., 2004) y también se ha demostrado su utilidad en el análisis
seminal de especies domésticas como el cerdo (Evenson y cols., 1994) y el toro
(Ballachey y cols., 1988). En la especie humana, estudios realizados demostraron
que índices de fragmentación del ADN superiores al 27 % (Larson y cols., 2000) o
al 30% (Evenson y cols., 1999) estaban relacionados con infertilidad o
subinfertilidad. Gandini y cols., (2004) proponen que el estudio de la integridad de
ADN puede tener mayor relevancia cuando se trata de correlación con resultados
de fecundación natural o FIV convencional, mientras que no existen evidencias
tan claras en cuanto a las correlaciones con los resultados de ICSI.
Otro ensayo que permite detectar anomalías del ADN es el ensayo TUNEL
(“Terminal deoxinucleotidyl transferase-meditated deoxyUridine triphosphate-Nich
End Labeling”). Este ensayo se base en el principio de que la desoxinucleotidil
transferasa terminal (TdT) incorpora dUTP en roturas de cadenas dobles o
simples del ADN, utilizando en el ensayo desoxiuridina biotinilada, actuando como
señal la biotina, la cual se puede detectar, por ejemplo, a través de técnicas de
fluorescencia o quimioluminiscencia. Cuanto mayor número de roturas presente el
ADN mayor será la señal resultante debido a un mayor número de moléculas
incorporadas. Se ha demostrado una correlación inversa entre el porcentaje de
espermatozoides con ADN fragmentado y la motilidad, concentración y
morfología, habiéndose utilizado como predictor del éxito en técnicas de
reproducción asistida (Sun y cols., 1997).
59
imagen generada por el ADN del espermatozoide tras descondensarse en un gel
y someterse a la acción de un campo eléctrico.
60
observaron correlación entre la penetración del moco cervical (humano y bovino)
y los resultados de gestación.
Sin embargo debido a los problemas asociados con el MCH como son la
disponibilidad de cantidades muy limitadas y las dificultades en la recogida junto
con su inestabilidad en el almacenamiento, su uso ha sido muy limitado y algunos
medios alternativos como la metilcelulosa están siendo empleados como
alternativa (Ivic y cols., 2002).
61
y personal muy entrenado, por lo cual no puede ser utilizado de forma rutinaria.
Otra técnica empleada es la microscopía de campo claro, desarrollada por Talbot
y Chacon (1981), que continúa en uso por su simplicidad y bajo coste, a pesar de
que la identificación exacta de los espermatozoides con acrosoma reaccionado es
muchas veces difícil con este método.
62
que los ensayos de RA son útiles bajo determinadas condiciones y que deben ser
diseñados para distinguir entre RA espontánea e inducida. El descubrimiento de
que la RA debe comprobarse a lo largo del tiempo, originó el desarrollo de nuevos
ensayos que proporcionan una visión más real del comportamiento fisiológico del
espermatozoide.
Otros inductores de la RA que se han utilizado son las células del cumulus
oophorus (Tesarik, 1985), por la capacidad de sintetizar progesterona que
poseen, aunque esto no ha sido confirmado por algunos autores (Hoshi y cols.,
1993), el moco cervical (Perry y cols., 1996) o el fluido folicular (Liu y Baker,
1994).
63
Franken, 2007). Sin embargo se ha demostrado que la cantidad de ZP intacta
necesaria para inducir la RA es menor que la cantidad de ZP solubilizada (Liu y
Baker, 1996b), por lo tanto se considera importante la estructura tridimensional de
ésta.
64
disminuido por los defectos de la estructura o la función del acrosoma (Schill,
1991).
65
cual es el valor que proporciona el mejor significado biológico. Calvo y cols.,
(1989) encontraron que este parámetro estaba reducido en casos de infertilidad
de origen desconocido aunque la actividad acrosina podía también estar reducida
(Koukoulis y cols., 1989). Fénichel y cols., (1991) encontraron una baja respuesta
al estímulo del ionóforo de calcio en casos repetidos de fallos de fecundación in
vitro de etiología desconocida cuando usaron como valor de corte de la inducción
de la RA el 20%. Parinaud y cols. (1995) obtuvieron una predicción del 83% de los
resultados de FIV por combinación de los parámetros de motilidad y morfología
con RA espontánea y RA inducida.
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Los problemas que son causados por un defecto de la RA pueden ser debidos
a una insuficiente RA en cuyo caso el uso de un medio y un estímulo adecuado
como la pentoxifilina (PF) que puede ser beneficioso, o deberse a una RA
prematura anormalmente alta, para lo cual el tratamiento con yema de huevo ha
demostrado disminuir la ratio de reacción espontánea, e incrementar el número de
espermatozoides unidos a la ZP (Tesarik y Mendoza, 1995).
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a la ZP intacta; una será utilizada por el control y otra por la muestra problema, de
modo que el resultado se obtiene como una ratio entre ambos (HZI, “hemizona
index”). Ambos estudios, aunque presentan diferencias en la metodología
utilizada, evalúan la capacidad de los espermatozoides de unirse firmemente a la
ZP. Dichos estudios presentan alto valor de predicción positivo y negativo,
además de un bajo porcentaje de falsos negativos (Oehninger y cols., 2000).
Otro tipo de ensayos son aquellos que estudian las interacciones del
espermatozoide con la ZP, no sólo su capacidad de unión. Para ello se determina
la capacidad de sufrir la RA de los espermatozoides que se han unido de forma
activa a la ZP y como consecuencia de ello se ha producido la inducción de la RA.
Liu y Baker desarrollaron en 1996 un ensayo para estudiar la RA de los
espermatozoides unidos a la ZP en la especie humana, cuya representación
esquemática se refleja en la figura 8.
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pacientes con un valor de ZPIAR 16% presentaban una media de fecundación
del 23%, mientras que con ZPIAR >16% tuvieron una media de la ratio de
fecundación del 61 %. Estos datos están en concordancia con los resultados
obtenidos por Franken y cols., (2000) y Bastiaan y cols., (2003) en los que
utilizaron la ZP humana solubilizada como inductor de la RA.
69
Numerosos trabajos han estudiado la relación entre los resultados del
ensayo de penetración espermática y el rendimiento de la FIV. Para ello se han
establecido valores de corte según el número de ovocitos sin ZP penetrados, que
permitían la clasificación de las muestras en dos categorías: muestras de alta o
de baja fertilidad. Los porcentajes de penetración establecidos como valor de
corte, entre las dos categorías varían según los estudios y oscilan entre el 10 % y
el 20 % de ovocitos heterólogos penetrados (Oehninger y cols., 2000),
permitiendo obtener predicciones cuya correlación con los resultados de FIV se
aproximan al 80 % en algunos estudios (Freeman y cols., 2001).
Desde el punto de vista clínico, esta prueba ha sido correlacionada tanto con el
rendimiento de la FIV humana (Aitken y cols., 1987) como con la tasa de
gestación en estudios prospectivos con pacientes que mostraban infertilidad
idiopática (Aitken y cols., 1991).
70
humano no puede formar los microtúbulos en estos ovocitos cuando es
microinyectado (Hewitson y cols., 1997). Además se añaden otros inconvenientes
para el uso de ovocitos de roedores como son la necesidad de criar los animales
en instalaciones específicas para este fin y el control preciso del ciclo estral de las
hembras para su sacrificio y recogida de los ovocitos.
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La ICSI permite, entre otros usos, evaluar los eventos que se producen
después de la introducción del espermatozoide en el ovocito, incluso utilizando
ovocitos heterólogos, lo cual es de gran interés para los estudios de infertilidad
humana. Dichos eventos post-ICSI corresponden a la desintegración del
acrosoma, descondensación del núcleo, organización del centrosoma, formación
de microtúbulos, activación del ovocito y migración del pronúcleo entre otros.
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propusieron su aplicación para evaluar la funcionalidad espermática, estudiando
parámetros como la capacidad de activación del ovocito, descondensación del
núcleo o la formación de pronúcleos.
Según First y Parrish (1987), la FIV homóloga con ovocitos que mantinen la
zona intacta permite obtener una mejor predicción de la fertilidad que los análisis
rutinarios de evaluación del semen. Sin embargo este ensayo, tiene evidentes
limitaciones éticas para su uso en la especie humana, aunque su desarrollo sí es
posible en especies animales. Por ejemplo, en cerdo ha sido muy utilizado y se ha
demostrado que es posible el uso tanto de ovocitos maduros in vitro (Xu y cols.,
1995), como ovocitos inmaduros (Martínez y cols., 1993; Matás y cols., 1996).
Además, los resultados demuestran que en la especie porcina existe una buena
correlación entre los resultados de fecundación in vitro y el resto de parámetros
convencionales, a excepción de la concentración espermática y la tinción vital con
eosina-nigrosina (Gadea y Matás, 2000).
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selección de las muestras más idóneas a utilizar en los programas de
recuperación de estas especies (Roth y cols., 1999). En bóvidos es a menudo
utilizada por lo que se ha sugerido que existe una escasa especificidad de
especie (Hugh y Rutledge, 1998).
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