Sitio de muestreo y colección.

Las 72 muestras de la fase disuelta de las aguas superficiales fueron recolectadas de

20 sitios diferentes, en todo el territorio continental de Portugal, por las autoridades

nacionales, para garantizar los procedimientos de muestreo correctos (Fig. 1). Tomar

muestras (1,5 L) se obtuvieron a 1 m de profundidad, 500 m aguas arriba y aguas

abajo las descargas de efluentes de las EDAR seleccionadas, durante dos períodos de

muestreo: entre el 9 de septiembre y el 11 de noviembre de 2014 - verano / otoño

(verano) y 19 de febrero / 15 de marzo de 2015 - invierno. Muestreo en

Se realizaron los ríos Mondego (Figueira da Foz), Tajo y Guadiana.

en las zonas estuarinas, en el último cuarto de la marea baja para prevenir anormales

efectos de dilución, altas tasas de salinidad y para asegurar que el flujo natural,

hacia la desembocadura del río, se observó.

Dos muestras, obtenidas en días consecutivos, fueron tomadas aguas arriba

y aguas abajo de cada PTAR, para cada temporada de muestreo, con el

excepción de los ríos Tajo y Trancão debido a problemas de recolección de muestras

(Tabla S2, Información de apoyo). En el río Tajo, solo se utilizaron tres ubicaciones de

muestreo y Expo sirvió tanto como muestra aguas abajo

para una EDAR y como muestra ascendente para la otra EDAR (Fig. 1).

Otra excepción fue la ubicación de muestreo de Formoselha, aguas abajo

muestra para la PTAR de Coimbra. Esta ubicación se incluyó debido a la

presencia de varias PTAR pequeñas en esta región y desde entonces ha sido

previamente identificado tiene un punto de contaminación de productos

farmacéuticos

(Figura 1).
Después de la recolección en recipientes de polietileno de alta densidad, previamente

enjuagados con agua bidestilada, las muestras se acidificaron a pH 3 con

ácido fórmico y refrigerado durante el transporte; a su llegada a la

laboratorio se almacenaron a -20 ° C hasta el análisis.

2.2. Normas y productos químicos

Todos los estándares farmacéuticos, con un grado de pureza ≥98% o certificado

material de referencia, se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

ESTADOS UNIDOS). Las soluciones madre e intermedias se prepararon en acetonitrilo.

a 500 μg mL − 1 y 100 μg mL – 1, respectivamente, y almacenados a −20 ° C

por un máximo de 6 meses. Soluciones de trabajo estándar mixtas,

renovado antes de cada ejecución analítica, y preparado en concentraciones

que oscilan entre 25 y 250 ng mL − 1, en una mezcla de agua metanol (90:10 v / v), se

utilizaron para ensayos de linealidad, precisión y repetibilidad. Para los sustitutos

etiquetados, una concentración de 250 ng mL − 1, también en agua-metanol (90:10 v /

v), se utilizó.

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) Suministró metanol y acetonitrilo y se obtuvo

agua de HPLC de un sistema Millipore Milli Q (Bedford, MA, EE. UU.). Para mi

2.3. Procedimiento experimental

Análisis de productos farmacéuticos, metabolitos y una transformación.

el producto se llevó a cabo utilizando 500 ml de agua superficial, enriquecida con

estándares sustitutos. Después de descongelar, las muestras fueron posteriormente

filtrado al vacío a través de filtros de microfibra de vidrio (1.0 μm, 934-AH) y

Filtros de membrana de poliamida de 0,45 y 0,2 μm de Whatman Schleicher

y Schuell (EE. UU.) y Whatman (Dassel, Alemania). Después,

las muestras se cargaron en cartuchos de extracción en fase sólida (SPE)

Oasis HLB (200 mg, 6 ml), de Waters Corporation (Milford, Massachusetts, EE. UU.),

Previamente acondicionado con 2 ml de metanol y 2 ml

Agua de HPLC. Después de enjuagar con 5 ml de metanol / agua HPLC

(10:90 v / v) y se dejó secar durante 15 minutos, la elución se realizó con

6 ml de metanol. Finalmente, el eluato se evaporó a sequedad bajo un

corriente suave de nitrógeno, a 40 ° C, y los extractos secos se almacenaron

a −20 ° C hasta el análisis, que tuvo lugar en un máximo de 48 h.

Para la cromatografía líquida con análisis de espectrometría de masas (LC-MS2), el

eluato seco se reconstituyó en 0,5 ml de agua-metanol.

(90:10 v / v), y microfiltrado (0.22 μm). Un volumen de inyección de 20 μL

Se utilizó un gradiente de agua (A) con ácido fórmico al 0,1% y

(B) se utilizó metanol con ácido fórmico al 0,1% a 200 μL min-1. La fase móvil al

comienzo de cada ejecución fue del 90% de A y a las 9,10 min.

la fase móvil fue del 5% A (Tabla S3, Información de apoyo).

La separación cromatográfica se logró con una columna de Aguas

Spherisorb ODS2 (150 × 2,1 mm, 3 μm) (Waters Corporation, Milford,

EE. UU.) Precedido por un cartucho protector del mismo material de embalaje (10

× 4,6 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, EE. UU.), Utilizado principalmente para
Aumentar el rendimiento de la columna. Una masa híbrida de trampa de iones

cuadrupolo

El espectrómetro (LCQ Advantage MAX, Thermo Finnigan, San José, California, EE.

UU.) Se hizo funcionar en los modos de ionización por electropulverización positiva y

negativa (ESI) mediante el monitoreo de reacción múltiple (MRM)

adquisición. Se establecieron las temperaturas y los voltajes fuente y capilar.

a 200 y 270 ° C y a 4.5 kV y 10 V, respectivamente. El nitrógeno era

utilizado como gas nebulizador, con un flujo de gas envolvente de 80 arb (arbitrario

unidad) y el flujo de gas de barrido auxiliar de 20 arb. Se adquirieron dos transiciones

precursor-fragmento (MS1 y MS2), una para fines de cuantificación y la otra para fines

de confirmación. El gas de colisión

fue helio con energía de colisión normalizada que oscila entre 21 y

39% El tiempo de retención, los iones del producto y la energía de colisión también se

presentan en la Tabla S4 (Información de soporte)

2.4. análisis estadístico

El análisis estadístico completo se realizó utilizando GraphPad Prism
(6.01, GraphPad Software, Inc., San Diego, California, EE. UU.). Probar
si el conjunto de datos era de distribución gaussiana, D'Agostino – Pearson
Se usó la prueba de normalidad. Como la mayoría del conjunto de datos no era
normalmente
distribuido, con variaciones no homogéneas, pruebas no paramétricas
se aplicaron. La prueba de Kruskal-Wallis con la prueba posterior de Dunns se utilizó para
evaluar las diferencias estadísticas entre los grupos terapéuticos y las ubicaciones de
muestreo. Para la comparación entre los dos períodos de muestreo diferentes
y con respecto a muestras aguas arriba y aguas abajo, Mann-Whitney
Se usó la prueba. Los productos farmacéuticos con 0% de frecuencia de detección fueron
excluidos de esta evaluación. El nivel de significación estadística se estableció en pb 0.05.
2.5. Evaluación de riesgos ambientales (ERA)
La evaluación del riesgo ambiental del compartimento acuático se basó en la directriz
sobre la ERA de medicamentos para
uso humano (EMEA, 2006). Siguiendo esta guía, los cocientes de riesgo
(RQ) asociados a los productos farmacéuticos seleccionados fueron calculados por la
relación entre la concentración ambiental medida (MEC) y
concentración prevista sin efecto (PNEC) en organismos no objetivo
utilizando tres niveles tróficos diferentes representantes del ecosistema acuático (algas,
dafnidos y peces) (Pereira et al., 2015a; Santos et al.,
2013a; Vazquez-Roig et al., 2012).
Debe tenerse en cuenta que la elección de los datos puede obviamente
afectar el resultado y que las concentraciones individuales máximas de
los productos farmacéuticos encontrados en aguas superficiales se usaron como MEC,
para establecer un
enfoque del peor de los casos (Santos et al., 2013a; Vazquez-Roig
et al., 2012).
Los valores PNEC se calcularon aplicando un factor de incertidumbre (UF)
de 10 a los valores de concentración de efecto no observado a largo plazo (NOEC)
o de 50 y 1000, a la concentración de menor efecto observado a corto plazo (LOEC) y a la
concentración letal (efectiva)
(L (E) C50) valores, respectivamente, disponibles en la literatura. La UF es un
expresión del grado de incertidumbre en la extrapolación de la
datos de prueba de un número limitado de especies al entorno real
(EMEA, 2006). Cuando no hubo datos experimentales disponibles, L (E) C50
los valores se estimaron con ECOSAR 1.11. Un potencial ambiental
el riesgo se indica mediante una RQ ≥ 1, mientras que no se espera ningún riesgo cuando
RQ b 1.
3.1. Control analítico de calidad
El control de calidad analítico se realizó abarcando diferentes
criterios de rendimiento como sensibilidad, rango lineal, detección de método
(MDL) y límites de cuantificación (MQL), efectos de matriz (ME), precisión,
y precisión (Tabla S5, Información de soporte). Se estudió la linealidad
analizando soluciones estándar, blancos y calibraciones matriciales.
Esto se realizó por triplicado, a seis niveles de concentración, correspondientes al rango
de 25 a 250 ng L − 1
. La linealidad, lograda para cada compuesto en las soluciones estándar de trabajo, fue
confiable como lo demuestra el
hecho de que los coeficientes de correlación (r
2
) oscilaron entre 0.9997, para simvastatina (SIM), 4-hidroxidlofenaco (4-OH-DIC),
ibuprofeno (IBU) y 4-
aminofenol (4-PARA) y 1, para claritromicina (CLA), eritromicina
(ERY), ciprofloxacina (CIP), bezafibrato (BEZ), gemfibrozilo (GEM),
citalopram (CIT), desmetilcitalopram (N-CIT), norfluoxetina (NorFLU) y sertralina (SER). En
soluciones matriciales, r
2 valores a distancia
entre 0.9995, para diclofenaco (DIC), naproxeno (NAP), paracetamol
(PARA) y 4-PARA y 1 para GEM.
El MDL y el MQL se estimaron a través de la curva de calibración matricial como | 3.3Sy / x
| / by | 10Sy / x | / b, respectivamente, donde b es el
pendiente y Sy / x la desviación estándar residual de la función lineal.
Los valores de MDL y MQL variaron de 2.01 a 8.24 ng L − 1
y desde 6.10
hasta 24,96 ng L − 1
, para GEM y 4-OH-DIC, respectivamente.
Los ME igualaron el porcentaje de la calibración de matriz coincidente
pendiente (B) dividida por la pendiente de la calibración estándar en el trabajo
soluciones (A) (agua-metanol). Por lo tanto, la relación (B / A × 100) se definió como el
efecto de matriz absoluta (% ME). El valor obtenido fue
interpretado de la siguiente manera: un valor del 100% denota una ausencia de ME,
Mejora de señal N100% y supresión de señal b100%. ME fueron
considerado insignificante, ya que los valores variaron de 98.81 a 102.08%,
para SIM y 4-OH-DIC, respectivamente.
Se realizaron pruebas de recuperación para determinar la precisión y precisión del
método mediante el uso de muestras en blanco y enriquecidas en tres niveles,
50, 150 y 250 ng L − 1 (n = 3), en tres días diferentes, y cada muestra
fue analizado por triplicado. La precisión varió entre 58.88 y 99.51%,
para DIC y fluoxetina (FLU), respectivamente. Precisión, evaluada a través de
La desviación estándar relativa (RSD) de la repetibilidad intradiaria e intradiaria fue
inferior al 8,88 y al 8,54%, respectivamente.
Los valores obtenidos para el control de calidad analítico se consideran confiables y
similares a otros métodos desarrollados para el mismo propósito.
3.2. Ocurrencia
Tabla 1, Figs. 2, 3 y la Tabla S6 (Información de apoyo) resumen el
frecuencias de detección, medios de concentración, rangos y desviaciones estándar de los
productos farmacéuticos seleccionados. Debido a las bajas frecuencias y concentraciones
de detección, las concentraciones promedio fueron
calculado considerando solo muestras positivas.
En las 72 muestras de agua superficial analizadas, se detectaron 11 de 23 productos
farmacéuticos, siendo muestras contaminadas hasta 8 productos farmacéuticos. Las
hormonas fueron el único grupo terapéutico que presentó 0% de
frecuencia de detección Inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS)
presentó la frecuencia de detección más alta y estuvo presente en cada
muestras contaminadas (27.8%), muestras en las que se detectó al menos un producto
farmacéutico, seguido de antiinflamatorios y antibióticos
(23,6%), reguladores de lípidos (8,3%) y antiepilépticos (1,4%). Los productos
farmacéuticos más recurrentes fueron, en el siguiente orden, CIT (27.8%), CLA
(20.1%), DIC y PARA (19.4%), con los productos farmacéuticos restantes
presentando valores de frecuencias de detección inferiores al 7%.
Las concentraciones promedio de cada grupo terapéutico presentaron el
mismo patrón que para las frecuencias de detección: ISRS (37.9 ng L − 1
), antiinflamatorios (35.9 ng L − 1
), antibióticos (33.5 ng L − 1
), antiepilépticos
(10,9 ng L − 1
) y reguladores de lípidos (9.4 ng L − 1
) El individuo más alto
las concentraciones encontradas fueron de los antiinflamatorios PARA y DIC
(69,2 y 51,2 ng L − 1
, respectivamente), seguido de los ISRS CIT y
GRIPE (53.0 y 25.4 ng L − 1
, respectivamente) y los antibióticos CLA, ERY
y azitromicina (AZI) (39.1, 38.8 y 35.7 ng L − 1
, respectivamente).
3.2.1. Comparación aguas arriba y aguas abajo
Todos los grupos terapéuticos se detectaron con mayor frecuencia en aguas abajo (30.8%)
en comparación con las muestras aguas arriba (24.2%) (Fig. 2).
En cuanto a las concentraciones medias, se observaron los mismos patrones.
para todos los grupos terapéuticos, con un aumento del 20,7% en la suma de todos
Las concentraciones detectadas. Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticas
significativas con un valor de p de 0.1919.
Este aumento general de la concentración ya fue informado por otros
autores, ya que las PTAR son la principal fuente de contaminación farmacéutica (Al Aukidy
et al., 2012; Baker y Kasprzyk-Hordern, 2013;
Kasprzyk-Hordern et al., 2009). Sin embargo, algunos productos farmacéuticos fueron
solo presente en muestras aguas arriba o en concentraciones más altas que en
las muestras río abajo del mismo río (Tabla S6, Información de apoyo). Aunque esto solo
se observó en algunos ríos, no hubo
diferencia significativa en las concentraciones farmacéuticas, y esta observación también
se informó en otros estudios (Al Aukidy et al.,
2012; Kasprzyk-Hordern et al., 2009). Estos resultados extraños podrían ser
principalmente
relacionado con el hecho de que utilizamos muestras al azar, que reflejan las
concentraciones en un momento específico. Por razones prácticas, el muestreo aguas
abajo
y aguas arriba se realizaron el mismo día pero no al mismo
tiempo, por lo tanto, se esperaban algunas variaciones (Ort et al., 2010). Además, también
hay puntos de contaminación adicionales como otras EDAR,
descargas brutas ilegales (aún no conectadas a la red de alcantarillado) de
edificios, actividades comerciales, agricultura y producción animal.
granjas presentes a lo largo de las orillas del río que también pueden confundir la
interpretación
(Al Aukidy et al., 2012).
La muestra aguas arriba que presentó la mayor diferencia para el
las muestras aguas abajo fueron una de Sacavém (río Tajo), con 7
productos farmacéuticos presentes. Este punto de muestreo está muy cerca de Trancão
Boca del río, un pequeño afluente del río Tajo, por lo tanto, fuertemente influenciado por
su contaminación. También podemos observar un patrón similar de
contaminación en las muestras de Sacavém referidas y en Trancão
River, apoyando la influencia del río Trancão en este punto de muestreo
4. Conclusiones
El trabajo realizado permitió confirmar la presencia de 11 productos farmacéuticos en las
aguas superficiales portuguesas, presentando frecuencias de detección totales del 27.8%,
siendo cada muestra contaminada hasta 8 productos farmacéuticos, y con
concentraciones tan altas como 69.2 ng L − 1
(PARACA). Con respecto a cada grupo terapéutico, las concentraciones fueron,
en orden decreciente: ISRS (37.9 ng L − 1), antiinflamatorios (35.9 ng L − 1), antibióticos
(33.5 ng L − 1), antiepilépticos (10.9 ng L − 1) y reguladores de lípidos (9.4 ng L − 1 )
A pesar de que no se observó significación estadística, las frecuencias y concentraciones
de detección fueron más altas en las muestras posteriores,
con un aumento del 20,7% en las concentraciones, lo que implica el impacto de
PTAR en aguas superficiales.
Al observar la influencia de los caudales en las concentraciones farmacéuticas, quedó
claro al observar los resultados.
en ambas campañas de muestreo, en los diferentes ríos y la correlación con el porcentaje
de WWE en aguas superficiales, que esto
El parámetro estaba estrechamente relacionado con la concentración de productos
farmacéuticos en las aguas superficiales. Además, en períodos de sequía,
que aumentan con los cambios climáticos, las tasas de flujo pueden disminuir hasta un
mínimo de 10 veces, en comparación con el
caudales observados, lo que puede conducir a una mayor concentración
de la misma proporción.
El ERA realizado indicó RQ superiores a uno para FLU y DIC
(9.06 y 1.02, respectivamente), con respecto al pescado, y también un RQ de 1.06 para
GRIPE, en relación con las dafnidas. Sin embargo, cuando se usan las concentraciones
predichas en períodos de sequía, 5 productos farmacéuticos (CLA, CIT, FLU, SER y
DIC) presentó RQs por encima de 1, y todos los 11 productos farmacéuticos restantes
detectado tenía RQs superiores a 0.1. Estos resultados subrayan la presión ecotoxicológica
a la que la biota acuática está expuesta en las aguas superficiales, es decir, durante los
períodos de sequía, con la expectativa ecotoxicológica.
resultados negativos
Estos resultados resaltan la importancia de la contaminación farmacéutica en las aguas
superficiales, reconociendo este tema como una prioridad para las políticas ambientales y
la importancia de establecer medidas prioritarias y
estrategias sostenibles, viendo la minimización de su impacto en el
ambiente acuático. Dado que la lista de vigilancia de la Directiva 2013/39 / UE es
dinámica, sería imperativo incluir los SSRI CIT, FLU y SER en
esta lista para evaluar mejor su riesgo ambiental.
Además, evaluar el riesgo para los humanos, las aguas subterráneas y la bebida.
las aguas afectadas por las aguas superficiales más contaminadas deben
También se evaluará, considerando también las posibles variaciones en la sequía
estaciones.
Suma de las concentraciones promedio y las frecuencias de detección de los productos
farmacéuticos seleccionados en muestras aguas arriba y aguas abajo de las PTAR. Antib -
antibióticos; Lip reg - lípido
reguladores; Antiepi - antiepilépticos; ISRS: inhibidores selectivos de la recaptación de
serotonina; Anti-inf - antiinflamatorios; AZI - azitromicina; CLA - claritromicina; ERY -
claritromicina;
BEZ - bezafibrato; GEM - gemfibrozil; CAR - carbamazepina; CIT - citalopram; GRIPE -
fluoxetina; SER - sertralina; DIC - diclofenaco; PARA - paracetamol.