UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

PROYECTO DE TESIS

ROJAS FERNÁNDEZ CARMEN

SOPLAPUCO FERNÁNDEZ DANIELA

Trujillo – Perú

2019
I. Generalidades.
1. Título:
Especies nativas de Bacillus solubilizadores de fosfato aisladas de la rizosfera de Saccharum
officinarum
2. Autor(es):
2.1 Nombres:
Carmen Rojas Fernández
Daniela Soplapuco Fernández
2.2 Condición:
Alumnos
2.3 Dirección:
Av. Juan Pablo II S/N
2.4 E-mail:
eliifernandez@gmail.com
desf.19962501@gmail.com
3. Asesor:
3.1 Nombre:
Aníbal Quintana Díaz
3.2 Grado Académico:
Maestro en Microbiología Industrial y Biotecnología
3.3 Departamento Académico:
Microbiología y parasitología
3.4 E-mail:
aqdperu@yahoo.com
4. Tipo de investigación:
4.1 De acuerdo al fin que se persigue: Básica
4.2 De acuerdo a la técnica de contrastación: Descriptiva
5. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto:
Localidad: Trujillo
Institución: Universidad Nacional de Trujillo Facultad de Ciencias Biológicas departamento
de Microbiología y Parasitología.
6. Duración de la ejecución del proyecto: 4 meses
 7. Cronograma de trabajo:

2019
ACTIVIDADES RESPONSABLE
ABRIL MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SETIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE
Elaboración Tesistas
proyecto de
investigación
Asesor X X X X
Tesistas
Recolección
de datos X X
Tesistas
Análisis de
Datos
Asesor X X
Redacción de Tesistas
Informe
Científico
Asesor X X
Tesistas
Sustentación
X
8. Recursos.
8.1 Disponibles.
8.1.1. Personal.
Tesistas y Asesor
8.1.2. Equipos e instrumentos.

Equipos e instrumentos MARCA CANTIDAD

Autoclave RAYPA 1 unidad

Incubadora BINDER 1 unidad
Refrigeradora COLDEX 1 unidad
Balanza analítica s/m 1 unidad

8.1.3. Material y reactivos.

Material y reactivos Marca cantidad

Bandeja s/m 2 unidad

Bolsas Slider 10 unidades
Palana Truper 1 unidad
 Laminas Slides 1 caja
Laminillas Cover Glass 1 caja
Cooler Basa 1 unidad
Refrigerantes Thermo 6 unidades
Asa bacteriológica S/M 2 unidad
Asa drigalsky Vidrafoc 2 unidades
Mechero S/M 2 unidad
Agar nutritivo GranuCult™ 1 frasco
Agar Merck 1 frasco
Agar TSI Merck 1 frasco
8.1.4.
Locales:

Laboratorio de Microbiología Industrial de la escuela de Microbiología y Parasitología

de la Universidad Nacional de Trujillo.

8.2. No disponibles y presupuesto.

2.1.2 1.1. Bienes.

2.3.15.12. Papelería en general, útiles y material de oficina.

Artículo Marca Cantidad Presentación Precio Total

unitario (S/.) (S/.)

Plumón Faber Castell 04 Un. 3.00 12.00

marcador
Cuaderno Arco Iris 02 Un. 15.00 30.00
empastado
Etiquetas s/m 04 Un. 2.50 10.00

Papel bond A4 Stanford 01 500 hojas 15.00 15.00

75g
Subtotal 67.00

2.3.15.31. Aseo, limpieza y tocador.

Artículo Marca Cantidad Presentación Precio Total

unitario (S/.) (S/.)

ExtranR Merck 2.5L 1 159.30 159.30

 Papel toalla Elite 02 Rollo 5.00 10.00

Franela Elite 01 Metro 4.00 4.00

Subtotal 173.3

2.3.18.21. Material, insumos, instrumental y accesorios médicos, quirúrgicos, odontológicos y de

laboratorio.

Artículo Marca Cantidad Presentación Precio Total

unitario (S/.) (S/.)

D(+)-Glucosa Merck 1 Kg 1 177.00 177.00

Fosfato tricálcico Merck 1Kg 1 998.28 998.28

Cloruro de magnesio Merck 1Kg 1 212.40 212.40
hexahidratado
Sulfato de magnesio Merck 1Kg 1 238.95 238.95
heptahidratado

Sulfato de amonio Merck 1Kg 1 177.00 177.00

Cloruro de potasio Merck 1Kg 1 177.00 177.00

Azul de bromofenol Merck 25g 1 522.15 522.15

Peróxido de Merck 1L 1 53.00 53.00

hidrógeno 3%
Oxidasa Bactident® 50 strips 1 127.33 127.33

Set colorante Gram Diagtest 1 1 112.73 112.73

de 1L

ExtranR Merck 2.5L 1 159.30 159.30

Agua destilada Scalabs 4L 1 9.00 9.00

Frascos de vidrio de Duran 1 2 17.9 35.8

250ml
Tubos de ensayo Pyrex 50 50 2.20 110.00
16mmx150mm
Tubos de ensayo Pyrex 50 50 2.95 147.50
18mmx150mm
Micropipeta Brand 1 1 807.12 807.12
10-100ul
 Tips para la Brand 500 1 35.00 70.00
micropipeta
unidades

Placas Petri de Greiner Empaque 5 1.8 90.00

plástico esteriles
X10
unidades

Frascos de vidrio de Duran 1 2 17.9 35.8

250ml
Gorros EndoMedic caja 1 15.00 15.00

Mascarilla EndoMedic Caja 1 17.00 17.00

Guantes EndoMedic Caja 1 25.00 25.00

Subtotal 4318.36

2.1.21.2. Servicios.
2.3.21. Viajes.

Tipo de servicio Nº de personas Precio unitario (S/.) Total (S/.)

Pasajes y gastos de 02 13.5 27.00

transporte
Subtotal 27.00

2.3.27. Servicios profesionales y técnicos.

Tipo de servicio Precio unitario (S/.) Total (S/.)

Identificación Fenotípica 20.00 400

Subtotal 400

RESUMEN DE PRESUPUESTO

Tipo de bien y/o servicio Costo Total (S/.)

2.3.15.12. Papelería en general, útiles y material de oficina 67.00

2.3.15.31. Aseo, limpieza y tocador 173.3

2.3.18.21. Material, insumos, instrumental y accesorios
4318.36
médicos, quirúrgicos, odontológicos y de laboratorio
2.3.21. Viajes 27.00
 2.3.27. Servicios profesionales y técnicos
400.00

Total 4985.66

9. Financiamiento:
9.1 Con recursos propios: Materiales no disponibles.
9.2 Con recursos universitarios: Materiales disponibles.
II. Plan de investigación.
1. Antecedentes y justificación

Los microorganismos son parte integral en el ciclo del fósforo en el suelo, como tales, desempeñan un rol
importante en la mediación de la disponibilidad del fósforo para las plantas1. Una alternativa para la
biodisponibilidad de este nutriente es el uso de microorganismos benéficos solubilizadores de fosfato2; estos
bioinoculantes orgánicos además de proveer sustancias promotoras del crecimiento vegetal y tener una
relación directa de eficacia entre el crecimiento de las plantas con el número de microorganismos
inoculados4, pueden reducir el uso de fertilizantes químicos, disminuyendo así los efectos nocivos para el
ambiente y la salud3.

El mecanismo de solubilización microbiana de fosfatos inorgánicos se ha atribuido a la producción de ácidos

orgánicos5, quelación, intercambio iónico6 y sideróforos7; pero principalmente este mecanismo se da a través
de ácidos orgánicos. Entre los microorganismos solubilizadores de fosfato existen bacterias como
Azotobacter tropicalis, Burkhoderia unamae, Bacillus subtilis8; entre los hongos se encuentran a: Penicillum
sp, Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger9 y actinomicetos como: Streptomyces fulvissimus AN-12,
Streptoverticillium olivoverticillatum AN-20, Streptomyces nogalater AN-24, S. longisporoflavus AN-27 y S.
cellulosae AN-3110. En Taiwán se demostró que B. smithii F18 tuvo el porcentaje más alto de fósforo soluble
seguido por B. coagulans, B. licheniformis A3, A. fumigatus O4, Bv. borstelensis SH168, S. thermophilus J57,
A. fumigatus NTU-132 y S. thermonitrificans NTU-88; demostrando que las bacterias liberan más fosforo
soluble en comparación a la inoculación con actinomicetos y hongos11.

En la India se han aislado de suelo rizosferico de maíz, un total de 8 cultivos de las cuales Alcaligenes aquatilis
y Burkholderia cepacia mostraron una alta solubilización de fosfato, estos son usados como biofertilizantes
que ayudan a la productividad de los cultivos12. En Patiala, en cultivos de garbanzos se aislaron a Serratia sp.,
Serratia marcescens y Pseudomonas sp.13 y en las regiones de Haryana se estudiaron diferentes cultivos de
garbanzo, mostaza y trigo, aislándose de la rizosfera a Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella y Enterobacter,
como bacterias solubilizadores de fosfato14.

De raices y suelos expuestos a altas concentraciones de sal, temperatura y pH se ha aislado a Pseudomonas

sp, P. fluorescens, P. aerogenes, P. aeruginosa, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus sp., teniendo la
capacidad de solubilizar fosfato15. En otro estudio teniendo en cuenta que el suelo fue alcalino, se aislaron a
Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium y Streptomyces como géneros predominantes de bacterias
solubilizadores de fosfato16.

En Assam, del suelo rizosferico de los cultivares de té se han aislado cuatro cepas bacterianas, TG1 de
Enterobacter lignolyticus, TT6 de Burkholderia sp., SN29 de Bacillus pseudomycoides y KH45 de Pseudomonas
aeruginosa teniendo la capacidad de producción de ácido indol acético (IAA), solubilización de fosfato,
producción de sideróforos y producción de amoníaco17. En raices de papa, Achromobacter xylosoxidans y
Bacillus cereus produjo IAA y solubilizó fosfato demostrando buenos resultados como biofertilizantes18.

En maíz de la rizosfera se aisló a Paenibacillus sp. promoviendo el crecimiento y desarrollo de las plantas
además de poder solubilizar fósforo orgánico e inorgánico 19, Paenibacillus polymyxa CR1 posee propiedades
beneficiosas como la capacidad de producir IAA y solubilizar fósforo inorgánico, mejorando así el crecimiento
de una variedad de plantas como maíz, papa, pepino, y tomate20.

Se ha analizado a Bacillus como solubilizador de fosfato, produciendo ácidos orgánicos como glucónico,
láctico, acético, succínico y propiónico, pero solo Bacillus megaterium no produjo ácido propiónico,
confirmándose una fuerte correlación entre las concentraciones totales de ácido orgánico y las cantidades
de fósforo liberado; aunque la mayor concentración total de ácidos orgánicos se obtuvo en un consorcio de
tres especies: Bacillus cereus, Bacillus subtilis y Bacillus megaterium6.

Se identificó a Bacillus sp. BPR7 de la rizosfera de frijol, donde solubilizó varias fuentes de fosfatos orgánicos
e inorgánicos, así como potasio y zinc21. Bacillus sp. PU-7 aislado de la rizosfera de algodón, tenía la
capacidad de solubilizar fosfato, producir IAA y sideróforos, mejorando el crecimiento de esta planta22.

Bacillus megaterium B388 se aisló de suelo rizosferico de pino, teniendo la capacidad de solubilizar fosfato,
entre otras capacidades como promotor del crecimiento vegetal, producción de IAA y control biológico23; en
la rizosfera de mostaza B. megaterium aumento el crecimiento de la planta y este se asoció a la producción
de ácido orgánico y la capacidad de solubilización de fosfato24. En suelo agrícola de 76 aislamientos se
observó que B. megaterium solubilizaba más fosfato que otros géneros, produciendo como principal ácido
orgánico al ácido succínico para la liberación de fósforo25.

En Brasil, se realizó un estudio de 40 bacterias endofíticas aisladas de raíces de árboles de plátano, de las
cuales Bacillus pumilus y Bacillus sp. presentaron la más alta capacidad en la solubilizacion de fosfato26. En
Perú, se identificaron en la rizosfera de la papa bacterias solubilizadores de fosfato encontrándose que la
mayoría de las cepas pertenecían a la especie B. amyloliquefaciens y en menor cantidad a una nueva especie
de Bacillus27.
El fósforo es un elemento abundante en los suelos y su disponibilidad está restringida, para suplir la
deficiencia de este elemento se utilizan fertilizantes químicos, estos causan problemas en el suelo de los
cultivos y tienen un impacto en el ambiente, estas preocupaciones han llevado a la búsqueda de nuevas
alternativas como la utilización de microorganismos solubilizadores de fosfato entre ellos se encuentran a las
bacterias nativas, estas representan un potencial para mejorar la productividad de los cultivos y además estas
se pueden acondicionar a diversos factores ambientales y físicos; uno de los géneros predominantes es
Bacillus tiene la capacidad de solubilizar fosfato, ser promotor del crecimiento vegetal y que se han aislado
especies de este género en diferentes cultivos de interés económico, pero aún no se han encontrado en
cultivos de Saccharum officinarum, siendo este uno de los cultivos importantes en la Libertad. Es por ello que
en este proyecto se propone aislar especies nativas de Bacillus solubilizadoras de fosfato a partir de la
rizosfera de cultivos de Saccharum officinarum.

2. Problema

¿Qué especies nativas de Bacillus solubilizadores de fosfato se aíslan de la rizosfera de Saccharum officinarum
cultivados en el sector San Idelfonso en el mes de agosto del 2019?

3. Hipótesis

Implícita

4. Diseño de investigación
Diseño de una sola casilla.

4.1 Material biológico

Población muestral: Suelo de la rizosfera procedente de los cultivos de Saccharum officinarum ubicado en el
sector San Idelfonso en la provincia de Virú, región La Libertad, en el mes de agosto del 2019.

Muestra: 100 g de suelo de rizosfera de los cultivos de Saccharum officinarum ubicado en el sector San
Idelfonso en la provincia de Virú, región La Libertad, en el mes de agosto del 2019.
Unidad de muestra: 10 g de suelo de rizosfera de los cultivos de Saccharum officinarum ubicado en el sector
San Idelfonso en la provincia de Virú, región La Libertad, en el mes de agosto del 2019.

Unidad de análisis: 1 UFC de Bacillus spp.

4.2 Recolección de muestra.

Se recolectarán 40 muestras de suelo rizosfera de Saccharum officinarum a partir de 2 hectáreas cerca al

sector San Idelfonso en la provincia de Virú (8°24’03.8”S78°46’42.6”W). De cada una de las muestras se
recogerá 50 g de suelo de rizosfera a una profundidad de 20 a 30 cm; las muestras de cada hectárea serán
homogenizadas en una bandeja por separado formando una única muestra, se retirará 100 g de suelo
rizosferico de cada bandeja, las cuales serán colocadas en bolsas de polietileno; posteriormente serán
selladas, rotuladas y colocadas dentro de un cooler a una temperatura aproximada de 4°C para ser
trasladadas al Laboratorio de Microbiología Industrial de la Universidad Nacional de Trujillo.

4.3. Aislamiento de bacterias solubilizadores de fosfato.

En 90 mL de MgSO4.7H2O 0.1 M se agregará 10 g de muestra y se agitará durante 3 minutos; luego se realizará

diluciones seriadas hasta 10-6. Se sembrará 0.1mL de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en agar NBRIP15 por
triplicado28, añadiéndole el azul de bromofenol como indicador e incubarlas a 37°C durante 7 dias29. La lectura
se determinará al observar un halo transparente alrededor y debajo de la colonia. Luego estas colonias serán
purificadas sembrándolas por el método de agotamiento en agar NBRIP e incubadas a 37°C por 7 días.
Finalmente se conservarán en agar nutritivo a 4°C para su posterior identificación.

SELECCIÓN DE CULTIVOS COMO LO HARAN

4.4 Identificación fenotípica de Bacillus sp. solubilizadores de fosfatos.

Se identificará macroscópicamente cada una de los cultivos seleccionados, teniendo en cuenta: su tamaño,
color y consistencia así mismo microscópicamente mediante una tinción Gram, luego se realizará pruebas
bioquímicas preliminares como catalasa, oxidasa, utilización y producción de ácido a partir de glucosa,
sacarosa y lactosa, los resultados obtenidos se verificaran con el Manual de Bacteriología Sistemática de

Bergey30 para confirmar el género Bacillus y para la identificación de especies se utilizará la tarjeta VITEK® 2

Bacillus (BCL).

RESULTADOS………COMO LO PRESENTARAN MO HARAN ANALISIS ESTADISTICOS

5. Referencias bibliográficas.

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