Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II Inta PDF

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Biotecnología. Es una organización sin fines de lucro que tiene como misión divulgar
Biotecnología
información sobre la biotecnología, contribuyendo a su comprensión a través de la
educación y estimulando su desarrollo. y Mejoramiento Vegetal II
Consideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnología y
dirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro
Editores:
cubre una necesidad importante ya que aporta información completa y actualizada Gabriela Levitus, Viviana Echenique,
sobre las tecnologías de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginski
por especialistas y en idioma español.
Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro una
excelente fuente de información.
Consejo Argentino para la Información
Para conocer más sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org y el Desarrollo de la Biotecnología
Ediciones
Instituto Nacional de
INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA
ARGENBIO - Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología Tecnología Agropecuaria
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
Editores:
Dra. Gabriela Levitus,
Dra. Viviana Echenique,
Dra. Clara Rubinstein,
Dr. Esteban Hopp
Ing. Agr. Luis Mroginski.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 1

2 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
Índice
Prefacio ............................................................................................................................... 6
Agradecimientos ................................................................................................................ 7
Lista de Autores .................................................................................................................. 7
Prólogo a la Primera Edición. Dr. Francisco García Olmedo ............................................. 11
Prólogo a la Segunda Edición. Dr. Francisco García Olmedo ........................................... 11
Parte I: Herramientas Básicas ........................................................................................... 15
Capítulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro

y Eduardo Flaschland ………………………………………………………………………………………. 17
Capítulo 2: Morfogénesis. Silvia Radice .………………………………………………….………………. 26
Capítulo 3: La citogenética molecular e inmunocitogenética en el estudio de los genomas ve-
getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germán Robledo, Aveliano Fernández y Viviana G. Solís
Neffa. .................................................................................................................................................. 34
Capítulo 4: Herramientas básicas de ingeniería genética. Ingrid Garbus, Marisa Gómez y Vi-
viana Echenique. ................................................................................................................................ 47
Capítulo 5: Marcadores moleculares. María Carolina Martínez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. 70
Capítulo 6: Construcción de mapas de ligamiento genético, localización de genes y regiones
cromosómicas asociadas a caracteres de interés en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pa-
blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... 86
Capítulo 7: Genómica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y Gustavo
Schrauf. .............................................................................................................................................. 100
Capítulo 8: Transcriptómica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... 121
Capítulo 9: Proteómica. Paula Casati y María F. Drincovich ............................................................. 136
Capítulo 10: Metabolómica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J.
Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... 146
Capítulo 11: Metagenómica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... 157
Capítulo 12: Bioinformática aplicada a la biotecnología vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz,
Paula Fernández, Verónica Lia, Corina Fusari. ................................................................................... 170
Parte II: Métodos para generar y analizar diversidad 183
Capítulo 1: Polinización y fertilización in vitro. Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo y Aurora
Picca. .................................................................................................................................................. 185
Capítulo 2: Hibridación somática. Pablo Polci y Pablo Friedrich. .................................................... 197

Capítulo 3: Epigenética y evolución. Ricardo W. Masuelli y Carlos F. Marfil .................................. 211
Capítulo 4. Mutagénesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, María Gabriela
Pacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... 217
Capítulo 5: Variación somaclonal. Susana Cardone, Sofía Olmos y Viviana Echenique. ............... 229
Capítulo 6: Aplicación de la transformación genética al mejoramiento vegetal. Marina L. Díaz,
Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Raúl D. Ríos ............................................................... 243
Capítulo 7: Usos del silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos.
Cecilia Vázquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodríguez, Natalia Almasia y Sebastián Asurmendi .. 259
Capítulo 8: Análisis de experimentos biológicos. Sofía Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ibá-
ñez, Nélida Winzer .............................................................................................................................. 271
Capítulo 9: Métodos multivariados para estimar variabilidad genética. Nélida Winzer, Miguel
DiRenzo, Sofía Olmos y Mercedes Ibáñez. ......................................................................................... 283
Parte III: Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal 295
Capítulo 1: Obtención de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Verónica Conti y Rubén Miranda
y Nicolás Gear. .................................................................................................................................... 297
Capítulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-
tonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. 311
Capítulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento genético de cultivos. Carlos Sala, Maria-
no Bulos, Analía Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... 325
Capítulo 4: Identificación y registro de variedades. Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y María
Alicia Loray ......................................................................................................................................... 339
Parte IV: Métodos de propagación y conservación de germoplasma 351
Capítulo 1: Micropropagación. Sofía Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... 353
Capítulo 2: Semilla sintética. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. 363
Capítulo 3: Conservación de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. ....................... 369
Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal 377
Capítulo 1: Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra-

ciela González, María Rosa Ferrari, Ana María García, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, Pablo
Tomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. 379
Capítulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genómica. Germán Spangenberg,
Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... 389
Capítulo 3: Caracterización molecular de la apomixis y su aplicación en la agricultura. Silvi-
na C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... 403
Capítulo 4: Avances de la biotecnología en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandón, Pa-
blo A. Marinangeli y Mariana Pérez de la Torre. .................................................................................. 421

Capítulo 5: Aplicación de la biotecnología en la mejora y conservación de especies forestales.
Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... 435
Capítulo 6: Técnicas de ingeniería genética para conferir resistencia a virus en plantas. Maria-
na del Vas, Ana Julia Distéfano, Cecilia Vázquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... 447
Capítulo 7: Obtención de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrián Vojnov, Mer-
cedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... 457
Capítulo 8: Aproximaciones biotecnológicas para un manejo sustentable del estrés fúngico
en la agricultura. Juan Carlos Díaz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martínez-Zamora; Sergio Sala-
zar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontivero
y Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... 467
Capítulo 9: Utilización de cultivos de tejidos para la obtención y conservación de plantas li-
bres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ 481
Capítulo 10: Obtención de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... 495
Capítulo 11: Aplicaciones biotecnológicas al manejo de malezas. Germán Ferrari y Julio E. De-
lucchi. .................................................................................................................................................. 507
Capítulo 12: Obtención de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abióticos. Florencia
del Viso, Andrea F. Puebla, Néstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. 519
Capítulo 13: Manipulación genética del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Ma-
ría Binaghi ........................................................................................................................................... 529
Capítulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. 539
Capítulo 15: Fitorremediación. María Eugenia Segretín, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. 545
Capítulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, María Eugenia
Segretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matías Lentz. ......................................................................... 559
Parte VI: Manejo responsable de la tecnología 569
Capítulo 1: Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de Organismos Genéti-

camente Modificados. Clara Rubinstein ........................................................................................... 571
Capítulo 2: Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados - Marcos Regulatorios.
Moisés Burachik .................................................................................................................................. 583
Capítulo 3: Flujo génico y su posible impacto ambiental. Mónica Poverene, Soledad Ureta y
Agustina Gutiérrez. ............................................................................................................................. 595
Capítulo 4: Detección de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... 603
Capítulo 5: Manejo integrado de plagas – Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y Cecilia
Roca. ................................................................................................................................................... 613
Capítulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolución y estrategias de manejo. Daniel

Tuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. ..................................................... 621
Parte VII: Biotecnología y sociedad 631
Capítulo 1: La transformación tecnológica y los nuevos desafíos. Carmen Vicién. .......................... 633

Capítulo 2: Adopción de los cultivos genéticamente modificados en Argentina y en el mun-
do. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... 639
Capítulo 3: Biotecnología en la mira: el problema de la percepción. Valeria Durand ............... 643

PREFACIO
En oportunidad de la Primera Edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, nos habíamos

propuesto responder a la necesidad de un texto en idioma español, dirigido a docentes y estudian-
tes de los cursos de Agronomía y de otras formaciones relacionadas con las tecnologías aplicadas
al mejoramiento vegetal, así como brindar un recurso de información general y consulta para no
especialistas. Esta Segunda Edición, intenta actualizar, profundizar y extender estas temáticas,
atendiendo a la rápida evolución en este campo del conocimiento.
En el contexto de los principios básicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad genéti-
ca y seleccionar características deseables, las tecnologías evolucionan rápidamente y, del mismo
modo, se acelera la transferencia del conocimiento básico a las aplicaciones. Esta edición intenta
reflejar este proceso dinámico y aportar información actualizada con ejemplos de aplicaciones al
mejoramiento de diferentes especies vegetales.
En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentes
campos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas básicas,
se ha hecho foco en las técnicas de cultivo de tejidos y micropropagación que se utilizan en sí mis-
mas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades o
como paso obligado en la construcción de plantas transgénicas. En la sección que se ocupa de las
aplicaciones de estas técnicas a casos específicos, se brindan ejemplos de mejoramiento logrado
en diferentes especies.
La tecnologías “omicas” (genómica, transcriptómica, metabolómica) constituyen una de las herra-
mientas más importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campo
de la investigación básica, en el mapeo de genes y la identificación de marcadores moleculares,
como en la identificación de funciones y redes regulatorias que influyen en las características que se
desean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestas
a diferentes tipos de estrés ambiental, entre otras.
Es claro que dentro de las tecnologías de mejoramiento, la transgénesis o transformación ge-
nética es una de las herramientas más versátiles y poderosas, ya que permite resolver problemas
que por vía del mejoramiento convencional no sería posible enfrentar. En esta edición se presentan
numerosos ejemplos de transgénesis para la obtención de cultivos tolerantes a estrés biótico y
abiótico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional.
Desde 1996, cuando se cultivaron por primera vez, la superficie mundial de cultivos transgénicos
aumentó 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectáreas en 2009. Según el último informe del
ISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnológicas) estas hectáreas fueron
cultivadas por 14 millones de agricultores de 25 países, siendo Argentina uno de los líderes en
adopción, con el 16% del área global.
Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacional
para regular el desarrollo y la aplicación de la ingeniería genética al mejoramiento de organismos
vivos (conocidos como organismos genéticamente modificados u OGMs). Si bien éstos no se limitan
a plantas, en este trabajo se presentan sólo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relaciona-
dos con los cultivos transgénicos.
Esperamos que esta nueva edición constituya una herramienta útil y accesible para docentes,
estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarán a la noble tarea de mejorar la agricultura.
Los Editores

AGRADECIMIENTOS
A todos y cada uno de los 141 autores, en su mayoría investigadores y profesionales de institu-
ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.
Al Dr. Francisco García Olmedo, reconocido investigador y catedrático español, por regalarnos
también el prólogo de esta segunda edición.
Al Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología (ArgenBio), por aus-
piciar la publicación del libro.
A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar este
proyecto.
Los Editores
El uso de fuentes y nombres comerciales en este documento es sólo para fines de identificación
y no implica ningún aval ni recomendación. Además, los contenidos u opiniones expresadas en
esta publicación son de exclusiva responsabilidad de los autores.
LISTAS DE AUTORES (por orden alfabético)
Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnología, INTA Castelar

Aguilar O. Mario IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP
Almasia Natalia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Altieri Emiliano Nidera Semillas
Asurmendi Sebastián Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Bazzini Ariel Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Bey Paula INGEBI, CONICET
Binaghi María Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Bravo Almonacid Fernando INGEBI, CONICET
Bulos Mariano Nidera Semillas
Burachik Moisés Dir. de Biotecnología, Min. de Agricultura, Ganadería y Pesca
Cardone Susana Facultad de Agronomía, UBA
Carrari Fernando Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Carrera Alicia Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur
Carrillo Néstor IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR
Casati Paula CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario
Castagnaro Atilio Pedro EEAOC, Tucumán
Cervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario
Chalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Chan Raquel L. Universidad Nacional del Litoral
Chantre Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del Sur
Conci Vilma INTA – IFFIVE
Confalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)
Conti Verónica INTA-EEA Bordenave
del Vas Mariana Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
del Viso Florencia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Delucchi Julio E. Monsanto Argentina

Díaz Marina L. CERZOS, CONICET, Universidad del Sur
Díaz Ricci Juan Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
DiRienzo Miguel Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Córdoba
Distéfano Ana Julia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Drincovich María F. CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario
Durand Valeria Ketchum Argentina - ArgenBio
Echenique Viviana Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur
Escandón Alejandro S. Instituto de Floricultura, INTA Castelar
Feingold Sergio E. INTA - EEA Balcarce
Felitti Silvina Universidad Nacional de Rosario
Fernández Aveliano Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONE
Fernández Paula Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Ferrari Germán Monsanto Argentina
Ferrari María Rosa Universidad Nacional de Buenos Aires
Filippone Paula EEAOC, Tucumán
Flaschland Eduardo Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONE
Franzone Pascual M. IGEAF INTA Castelar
Fresco Analía Nidera Semillas
Friedrich Pablo Universidad Nacional del Sur
Fusari Corina Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Galdeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONE
Gallo Leonardo INTA - EEA Bariloche
Garayalde Antonio CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Garbus Ingrid CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
García Ana María Facultad de Agronomía, UBA
García Olmedo Francisco Universidad Politécnica de Madrid
Gear Nicolás Syngenta
Gómez Marisa CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
González Graciela Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Grasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA Castelar
Greizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA
Grellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Gutiérrez Agustina Universidad Nacional del Sur
Heinz Ruth Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Helguera Marcelo INTA EEA Marcos Juárez
Hopp Esteban Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Ibáñez Mercedes Universidad Nacional de Río Cuarto
Labarta Marcelo Instituto Nacional de Semillas – INASE
Landau Alejandra Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Lavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE
Lentz Ezequiel M. INGEBI, CONICET
Levitus Gabriela ArgenBio
Lewi Dalia IGEAF INTA Castelar
Lia Verónica Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Longo Florencia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Loray María Alicia Dirección de Calidad - INASE
Luciani Gabriela CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Mamani Alicia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Marcucci Poltri Susana Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Marfil Carlos F. INTA - EEA Mendoza
Marinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Martínez Ma. Carolina Instituto de Biotecnología, INTA Castelar

Martínez-Zamora Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Masuelli Ricardo W. INTA - EEA Mendoza
Meier Mauro CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Mentaberry Alejandro Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Miranda Rubén Asociación Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del Sur
Morgenfeld Mauro INGEBI, CONICET
Mroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONE
Nisensohn Luisa Universidad Nacional de Rosario
Olmos Sofía Laboratorio de Biotecnología, INTA Pergamino
Ontivero Marta INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Ortiz Juan Pablo Facultad de Ciencias Agrarias, UNR
Pacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA Castelar
Paniego Norma Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Pérez Camargo Gladys Facultad de Agronomía, UBA
Pérez de la Torre Mariana Instituto de Floricultura, INTA Castelar
Pessino Silvina C. Facultad de Ciencias Agrarias, UNR
Picca Aurora Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur
Poggio Lidia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Polci Pablo Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur
Poverene Mónica Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur
Prina Alberto IGEAF INTA Castelar
Puebla Andrea F. Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Radice Silvia INTA Castelar
Rey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE
Ríos Raúl D. IGEAF INTA Castelar
Rivero Mercedes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Robledo Germán Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE
Roca Cecilia Dow Agrosciences
Rodríguez Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar
Roncallo Pablo CERZOS, CONICET
Rubinstein Clara Monsanto Argentina – ILSI
Sabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Sala Carlos Nidera Semillas
Salazar Sergio INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Sansberro Pedro Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE
Scarpeci Telma E. IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR
Schrauf Gustavo Facultad de Agronomía, UBA
Scocchi Adriana Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE
Segretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICET
Seijo Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE
Selva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Sharry Sandra Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de La Plata
Solís Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) – IBONE
Spangenberg Germán Victorian Department of Primary Industries (DPI)
Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del Litoral
Tonello Ursula INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumán
Torales Susana IRB, INTA Castelar
Tranquilli Gabriela IRB, INTA Castelar
Tuesca Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNR
Ureta Soledad CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur
Valle Estela M. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNR
Vázquez Rovere Cecilia Instituto de Biotecnología, INTA Castelar

Vellicce Gabriel EEAOC, Tucumán
Vicario Ana Laura Dirección de Calidad – INASE
Vicién Carmen Facultad de Agronomía, UBA
Vila Alejandro J. IBR - Facultad de Cs Bioquímicas y Farmaceuticas, UNR
Vojnov Adrián Fundación Pablo Cassará
Winzer Nélida Universidad Nacional del Sur
Wirth Sonia INGEBI, CONICET
Wulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Zappacosta Diego C. Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur
Zelada Alicia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Zelener Noga IRB, INTA Castelar
PRÓLOGOS
Prólogo a la primera edición

Recientemente, un periodista, que compartía una ensalada con un biólogo, exclamó: ¡Si yo
sólo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el biólogo le
explicó que al comer ésta no había más opción que engullir unos 25.000 genes del genoma de
Lactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-
croorganismos que habitual y cómodamente habitan en la superficie de las turgentes hojas, el
periodista quedó atónito.
Según un eurobarómetro de hace unos meses, más de dos tercios de los europeos estaban en
contra de los alimentos transgénicos. Sin embargo, en la misma encuesta se incluía una aseve-
ración - los tomates normales no tienen genes, los transgénicos sí - frente a la que también más
de dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es una
lástima que dicho eurobarómetro no registrara la proporción correspondiente al encabezamiento
“no saben, pero sí contestan”, aunque es fácil colegir que dicha fracción era alta y en extremo
vergonzante.
Los avances del conocimiento biológico y de la biotecnología destacan en el panorama cien-
tífico-técnico de este fin de siglo y han impregnado las más diversas vertientes de nuestra vida
cotidiana sin que se haya aceptado que un mínimo de estos conocimientos debería formar parte
integral de la cultura general. La ignorancia de los hechos básicos relativos a nuestra herencia
genética o a nuestra alimentación se considera incluso de buen tono. Esto se refleja de entrada
en el caos semántico que se ha creado en torno a la biotecnología, del que hay que culpar no
sólo a la ignorancia del ciudadano sino también a la torpeza de los científicos y a la dictadura de
los medios de comunicación. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir de
la ciencia, y no a sus espaldas.
Términos tales como organismos genéticamente modificados (OGMs), alimentos transgéni-
cos, ingeniería genética, ADN recombinante, transferencia génica, clonación, alimentos natura-
les, mejora genética e, incluso, biotecnología, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin orden
ni concierto. A estas alturas empieza a ser difícil normalizar la situación, pero tratemos de con-
tribuir a ello.
La definición de biotecnología abarca a todas las tecnologías mediadas por un ser vivo o por
partes de él, sean éstas células o enzimas aisladas. Bajo esta definición se incluyen desde la
propia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricación de las veinticuatro clases de
cerveza mesopotámica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la última forma de producir

insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el término de forma restringida para referirse
exclusivamente a los últimos avances basados en la biología molecular. Para esto último resulta
más adecuado el uso de la expresión “biotecnología molecular”.
Prácticamente la totalidad de lo que ponemos en nuestra mesa ha sido genéticamente modifi-
cado. La domesticación de plantas y animales supuso una alteración muy drástica de sus geno-
mas y la mejora genética subsiguiente ha ido añadiendo modificaciones extensas y sustanciales.
Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los métodos empleados para
ello. De hecho, la ingeniería genética es sólo uno de esos métodos - una modalidad más de me-
jora genética - y sólo sirve para modificar uno o pocos genes de forma muy selectiva. No serviría
para obtener razas de perro tan distintas - en su tamaño, morfología y temperamento - como el
Chihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a los
métodos genéticos más tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs sólo
a los productos de la ingeniería genética para contraponerlos a los supuestamente “naturales”.
Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayoría de
los organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivir
por sí mismos en la naturaleza. Es más, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteraciones
genéticas que les priven de infinidad de sustancias naturales que son tóxicas o inhibitorias para
el ser humano. Una variedad moderna, modificada por ingeniería genética, está tan lejos de ser
natural como las que la precedieron. ¡Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinónimo
de inocuo.
Se consideran organismos transgénicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingeniería
genética o, si se prefiere, por sastrería genética, ya que las operaciones fundamentales de esta
vía experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN
(una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una proteína (una
secuencia de aminoácidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave genética.
Mediante la nueva tecnología se puede alterar un genoma por la adición de uno o varios (pocos)
genes que previamente no formaban parte de él o por la inutilización de uno o varios genes entre
los ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminar
caracteres indeseables del organismo, respectivamente, objetivos que no difieren de los de la
mejora genética tradicional.
En lo que difieren la vieja y la nueva tecnología es en el repertorio génico que se puede mane-
jar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nue-
va - y en el modo de introducir y transferir la modificación genética, por vía sexual o por adición
exógena (transformación), respectivamente. Los organismos modificados por transformación se
suelen denominar transgénicos. Llamar transgénicos a los alimentos derivados de dichos orga-
nismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrán, “degradado es todo gen que entra
por boca de cristiano”. Es absurdo llamar transgénico al azúcar procedente de una remolacha
transgénica, ya que es un producto químico puro, esencialmente indistinguible del aislado de la
remolacha normal o de la caña de azúcar.
Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todos
los métodos, objetivos y logros de la alteración genética de las plantas con fines prácticos. Faltan
en nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra cultura
general. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo por
un único autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnología. De aquí que la
aproximación adoptada en esta obra, según la cual cada capítulo está a cargo de verdaderos
especialistas, sea la más apropiada en la actualidad.
Dr. Francisco García Olmedo, 2004

Prólogo a la segunda edición
La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedan
encadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segunda
edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, un texto que, hace seis años, supuso una es-
pléndida y afortunada aportación a la recensión de un área tecno-científica en vigorosa ebullición y
de gran relevancia práctica. La necesidad de esta edición surge de múltiples circunstancias, entre
las que cabe resaltar el enorme avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinición de
los retos entonces planteados y la aparición de otros nuevos que han diversificado los objetivos
prácticos de la disciplina. Además, entre la aparición de la primera edición y la de esta segunda, ha
ocurrido una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras, tales como la económica,
la climática o la energética.
Según todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores múltiples: la
subida del precio del petróleo, el bajo nivel de reservas, la especulación, el incremento de la pobla-
ción y del consumo per capita, el desvío de una parte sustancial de la producción agraria hacia la
fabricación de biocombustibles, la disminución de los rendimientos por el estrés debido al cambio
climático y la falta de inversión en innovación agropecuaria. Parece como si el éxito relativo de las
últimas décadas hubiera hecho bajar la guardia.
En particular, la tasa de crecimiento de la producción de alimentos ha ido por detrás de la del
crecimiento de la población durante la última década, justo el tipo de comportamiento relativo que
propuso Malthus hace más de dos siglos. En el último medio siglo, ha sido la mejora genética la
que ha tenido el protagonismo técnico en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi-
cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto conciencia
de que no se sabe bien cómo se va a conseguir el aumento de la producción de alimentos en un
70-100 % para el año 2050, necesidad que se considera mínima para alimentar una población pro-
yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, además, tendrán una demanda per cápita
significativamente superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos de ser aún más
eficaces en las próximas décadas de lo que lo hemos sido en las precedentes.
Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni serán exclusivamente técni-
cas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrán un importante componente técnico y
es sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita.
El cambio climático está alterando los estreses bióticos y abióticos a que deben hacer frente las
cosechas, lo que hace prioritaria la investigación básica y aplicada tanto en el esclarecimiento de
los mecanismos involucrados como en la adaptación de las cosechas tradicionales a las nuevas
condiciones, así como el desarrollo de nuevas cosechas que sean más apropiadas para condicio-
nes extremas.
La crisis energética ha impulsado un nuevo interés por los biocombustibles, en los que se han
centrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulación de objetivos políticos
que pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentación mundial. Así por ejemplo, los
objetivos declarados para fechas próximas, tanto por lo EEUU como por la UE, están determinando
una competencia por el suelo agrícola de la generación de biocombustibles con la producción de
alimentos que no puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el número de
hambrientos en el mundo, así como contribuir a la destrucción de bosque tropical. Por otra parte,
La búsqueda de especies y variedades aptas para la producción de biocombustibles plantea retos
formidables a la investigación de su agronomía y a su mejora convencional y biotecnológica.
Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edición de
“Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II” manifiesta su pleno potencial y debe alcanzar su máxi-
ma funcionalidad.
Dr. Francisco García Olmedo, 2010

Parte I
Herramientas básicas

I - CAPÍTULO 1 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar
de clasificar las aplicaciones que se persiguen
con el cultivo de tejidos, se podría esquemati-
Establecimiento de cultivos de zarlas en aplicaciones para:
tejidos vegetales • Estudios básicos. En este caso, los explan-
tes cultivados pueden ser diversos. Si lo único
Luis Mroginski, Pedro Sansberro y que se quiere lograr es un sistema de callos
Eduardo Flaschland para estudiar algún proceso fisiológico, se
puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula
1 Introducción viva. En este caso –en que lo único que se bus-
ca es la inducción de callos– lo ideal es cultivar
El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– explantes jóvenes, derivados de semillas en
puede ser definido como un conjunto muy hete- germinación, donde se obtienen respuestas rá-
rogéneo de técnicas que presentan en común pidas y, en general, hay menores problemas de
el hecho de que un explante (una parte sepa- contaminación con microorganismos. A veces
rada del vegetal que pueden ser protoplastos – se hace uso del cultivo de tejidos porque repre-
células desprovistas de pared celular– células, senta un sistema experimental que simplifica
tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en la complejidad generada por los fenómenos
un medio artificial de composición química de- de correlación entre las distintas partes que
finida y se incuba en condiciones ambientales normalmente están presentes en una planta
controladas. La imprecisión de esta definición entera. El explante que se usará estará condi-
puede generar muchas polémicas, pero es ac- cionado por lo que se quiere estudiar. Un buen
tualmente aceptada. Generalmente es común ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fe-
dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos cundados del tomate para estudiar los reque-
grandes grupos: a) cultivos en medios semisó- rimientos nutricionales durante el crecimiento
lidos y b) cultivos en medios líquidos, los que de los frutos. Asimismo, el cultivo de óvulos ha
a su vez pueden ser agitados (mediante el em- sido muy útil para estudiar aspectos relaciona-
pleo de agitadores de uso continuo) o estacio- dos con la formación de las fibras en algodón.
narios. También es frecuente dividir al cultivo El cultivo de discos de tallos brindó una valiosa
de tejidos atendiendo a los niveles de comple- ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro.
jidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y • Obtención de plantas con sanidad contro-
cultivo de protoplastos. Para el establecimien- lada. Es muy común la utilización del cultivo de
to de los cultivos utilizando cualquiera de los tejidos para la obtención de plantas libres de
sistemas es necesario tener en cuenta algunos virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es
aspectos generales comunes relacionados con el meristema (dependiendo de la especie, de
el explante, la asepsia, el medio de cultivo y 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y
las condiciones de incubación. La discusión de de un par de primordios foliares.
estos aspectos constituye el objetivo de este • Micropropagación. En este caso depende-
capítulo. Adicionalmente se incluye el tema de rá del sistema que se quiere utilizar. Si lo que
la aclimatación de las plantas regeneradas in se quiere explotar es la brotación de meris-
vitro, que es de gran importancia en la mayoría temas, los ápices terminales y los segmentos
de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la uninodales de ramas jóvenes constituyen ex-
agricultura. celentes explantes. En este caso el cultiva-
dor de tejidos debe conocer perfectamente la
biología de la reproducción de la planta para
2 Explante
aprovechar aquellos explantes que en forma
Varios factores deben ser tenidos en cuenta natural son propágulos. En cambio, si se pre-
en la elección del explante apropiado para el tende micropropagar mediante el empleo de
establecimiento de los cultivos in vitro, entre semillas sintéticas (ver Parte IV, capítulo 2) el
ellos: explante original deberá posibilitar la inducción

de la embriogénesis somática. En este caso, la • Establecimiento de suspensiones celula-
utilización de embriones zigóticos inmaduros u res. En este caso se recomienda iniciar los cul-
hojas, suelen ser frecuentes como explantes. tivos a partir de explantes extraídos de semillas
• Obtención de híbridos interespecíficos. en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledo-
Una de las primeras aplicaciones del cultivo de nes, raíces).
tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo
como ayuda para la obtención de híbridos deri- 2. Posibilidad de contaminación con mi-
croorganismos. De ser posible, se deben cul-
vados de cruzamientos interespecíficos, donde
tivar explantes de plantas donantes que crecen
se produce el aborto temprano de embriones.
en condiciones de invernadero, con ello se
En estos casos, el explante cultivado es el reduce sustancialmente las tasas de contami-
embrión cigótico en estadios tempranos de su nación. Por otra parte, es recomendable evitar
desarrollo. Con la misma finalidad también se el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas)
utilizan ovarios u óvulos fecundados. que provienen de plantas crecidas en macetas
• Obtención de plantas de semillas con em- o en el campo, dado que en la mayoría de los
briones rudimentarios. Para esta finalidad los casos no es posible conseguir una buena des-
explantes pueden ser semillas (por ej. orquí- infección de los mismos.
deas) o bien, se aíslan los embriones en un es-
tado temprano de desarrollo («corazón») como 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto de
en el caso de yerba mate o de algunas varieda- gran influencia en la morfogénesis. Como regla
des de duraznero. general se puede decir que cuando más joven
• Obtención de plantas haploides (consi- e indiferenciado se encuentre el explante a cul-
tivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por
derando como haploide a un esporofito que
ello que los meristemas apicales y axilares son
contiene el complemento gamético de cromo-
ampliamente usados en numerosas especies.
somas). En este caso, los explantes más uti-
En el caso de la micropropagación de plan-
lizados son las anteras, aunque también pue- tas leñosas, la edad del explante es un factor
den emplearse microsporas aisladas, óvulos y crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropro-
ovarios no fertilizados. pagación tiene mayores posibilidades de ser
• Inducción de variación somaclonal. En este exitosa que con tejidos maduros. Este hecho
caso se pueden utilizar varios explantes, pero genera la necesidad de realizar tratamientos
si la finalidad de su utilización es la aplicación de rejuvenecimiento de las plantas donantes
en planes de mejoramiento genético de plan- de explantes.
tas, los explantes utilizados deben posibilitar la
regeneración de plantas enteras. 4. Tamaño. En general, cuanto más grande
• Producción y/o conversión de sustancias sea el explante mayores serán las posibilida-
útiles. Se puede utilizar una gran variedad des de inducir la proliferación de callos o la re-
de explantes. Los de raíces suelen ser muy generación directa de órganos. Sin embargo,
a mayor tamaño de explante también son ma-
utilizados.
yores las probabilidades de que los cultivos se
• Obtención de híbridos somáticos. Para esta
contaminen con microorganismos. También es
finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. necesario tener en cuenta que existe un ta-
En la mayoría de los casos se aíslan los proto- maño mínimo del explante, que depende de la
plastos de mesófilos de hojas y de suspensio- especie y del material vegetal, por debajo del
nes celulares. cual no es fácil lograr el establecimiento de los
• Conservación e intercambio de germo- cultivos. Los explantes muy pequeños suelen
plasma. Los meristemas son los explantes requerir del empleo de medios más complejos
preferidos para el desarrollo de sistemas de o de los denominados medios acondicionados.
conservación a mediano y largo plazo (crío- 5. Epoca del año. Es un factor que suelen
conservación con nitrógeno líquido) y para el tener mucha importancia en la micropropa
intercambio de material genético. gación y que generalmente está asociado al

grado de dormición que presentan ciertos ex- te –con la ayuda de un microscopio estereos-
plantes (yemas, por ejemplo) y también con la cópico– los cultivos en forma periódica (por lo
posibilidad de mayor o menor proliferación de menos semanalmente). También se pueden
microorganismos. realizar pruebas con medios de cultivo dife-
renciales y «test» bioquímicos específicos.
3 Asepsia Para evitar y/o minimizar las contaminacio-
nes de los cultivos con microorganismos es
Uno de los principales problemas que se necesario:
presentan cuando se tratan de establecer los
cultivos es el de la contaminación de los mis- 1) Conocer el material vegetal con que se tra-
mos con diversos tipos de microorganismos baja y los posibles contaminantes específicos.
(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, vi-
rus). El ambiente generado por explante-medio 2) Realizar una adecuada preparación de la
de cultivo-condiciones físicas de incubación planta dadora de explantes, cultivándola pre-
es altamente propicio para la proliferación de ferentemente en invernaderos tratadas con
muchos de estos microorganismos que pue- productos químicos que eliminen patógenos y
den provocar la destrucción de los cultivos. Es eventuales microorganismos endófitos.
difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas,
pero en promedio, en laboratorios dedicados a 3) Proceder a la desinfección superficial de
la micropropagación se lo puede estimar en al- los explantes mediante el uso de compuestos
rededor del 10%. En el mejor de los casos, es- químicos con el objeto de eliminar los micro-
tos microorganismos no destruyen los cultivos organismos con el menor daño posible para
pero compiten con el explante por los nutrien- el explante. Si bien no es posible recomendar
tes del medio de cultivo o bien lo modifican. un procedimiento general, se puede señalar
Es muy difícil conseguir cultivos estrictamen- que el procedimiento más popularizado con-
te asépticos dado que en la mayoría de los siste en una doble desinfección mediante la
casos es altamente probable que los mismos inmersión de los explantes en etanol (70%v/v)
contengan virus y fitoplasmas, por lo que en durante 20-60 segundos seguido de hipoclo-
la práctica, cuando se refiere a cultivos asép- rito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de
ticos, en general se quiere significar que son lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,
cultivos donde no se produce la proliferación dependiendo de la naturaleza del explante.
de hongos y bacterias. Algunos procedimientos se basan en el em-
Dos son las fuentes de contaminaciones: a) pleo de únicamente etanol o de hipoclorito de
microorganismos presentes en el interior o en sodio. Finalmente, es necesario eliminar los
la superficie de los explantes y b) fallas en los restos de estos productos mediante varios la-
procedimientos de cultivo en el laboratorio. La vados con agua destilada estéril.
correcta detección de estas fuentes y del tipo En este último punto hay que aconsejar que
de microorganismo son aspectos importantes se utilice agua destilada estéril de reciente
para el éxito de los cultivos, pues por un lado preparación, dado que está demostrado que el
ayuda a determinar la fuente de contaminación almacenaje prolongado del agua estéril puede
y por otro lado, ayuda a la planificación de los ser la causa de contaminaciones con bacte-
procedimientos para controlarlos. Varios géne- rias. Es aconsejable realizar estas operacio-
ros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, nes de desinfección superficial en una cámara
Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, de transferencia con aire estéril. En lugar del
Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclori-
Mycobacterium, Corynebacterium) y de hon- to de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio
gos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema
Fusarium, Alternaria, Cladosporium y cautela con el empleo de este último compues-
Neurospora) están frecuentemente en los cul- to, dado que es altamente tóxico y además no
tivos. Es conveniente inspeccionar visualmen- es removido con facilidad del explante.

En los casos en que no se utilice etanol, la croondas. El agua caliente también puede ser
adición de agentes tensoactivos junto con el usada. En el caso de sustancias termolábiles,
desinfectante es una práctica recomendada. la esterilización se puede hacer mediante fil-
Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01 tración a través de filtros bacteriológicos.
– 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado pre- No es posible recomendar ningún sistema
vio de los explantes con agua corriente y de- de esterilización dado que la exitosa destruc-
tergentes, ayuda a una mejor desinfección. La ción de los microorganismos depende de múl-
inmersión de los explantes en soluciones con- tiples factores entre los que interesan el tama-
teniendo sustancias antibióticas y /o antimicó- ño del recipiente, el tiempo de esterilización y
ticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin
ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de embargo, se pueden dar algunas sugerencias:
gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifam- • La esterilización en estufas mediante calor
picina, anfotericina B, benomil, carbendazim) seco (aire caliente) es recomendable para es-
puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados terilizar recipientes de vidrios secos (pipetas,
en casos excepcionales. Estos productos tienen cápsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4
el inconveniente de que alteran la composición horas en estufas a 180-200 ºC brindan exce-
de los medios de cultivo y además pueden ser lentes resultados.
metabolizados por los explantes. • La esterilización con calor húmedo con va-
Últimamente han aparecido soluciones bio- por bajo presión (en autoclave o en una «olla a
cidas que matan bacterias y hongos, previenen presión»). Es el procedimiento más empleado
la germinación de esporas y a altas concen- para la esterilización de los medios de cultivo
traciones pueden eliminar contaminaciones (salvo, como se indicó más arriba, para aque-
de microorganismos endófitos. Uno de estos llos que posean componentes termolábiles).
compuestos es el PPM (Plant Preaservative En este caso, lo más común es usar una pre-
Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, sión de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con
un compuesto derivado de los furfurales de la lo que prácticamente se destruyen todas las
caña de azúcar. Este compuesto, químicamen- formas de vida. Es importante que en todos
te: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno los puntos del autoclave se alcance dicha tem-
fue desarrollado en la Universidad Central de peratura, para lo cual hay disponibles cintas
las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y detectoras colorimétricas.
fungicida de amplio espectro.
En los casos en que se utilicen plántulas cre- 5) Cultivar los explantes en una cámara de
cidas in vitro como plantas donantes de explan- transferencia con aire estéril («gabinete de flu-
tes, es necesario desinfectar las semillas para jo laminar»), localizada en un ambiente limpio
su cultivo y germinación y luego es aconsejable y no expuesta a corrientes de aire. De no dis-
desinfectar también las plántulas resultantes. poner este equipamiento, se pueden sustituir
En algunos materiales vegetales se utiliza con cuartos esterilizados previamente con luz
la preincubación de los explantes mediante lo ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en
cual éstos son desinfectados suavemente y forma directa). La mesada de trabajo y las pa-
precultivados durante 24 horas en un medio redes del gabinete deben ser desinfectadas
conteniendo sacarosa, y finalmente son desin- previamente con etanol al 70%. De la misma
fectados nuevamente y cultivados. manera deben ser desinfectados exteriormen-
4) Emplear medios e instrumentos de cultivo te todos los recipientes (conteniendo medios
esterilizados, es decir, liberados completamen- de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área
te de cualquier microorganismo vivo o espo- del aire estéril.
ras. Para la esterilización, en la mayoría de los Los operarios constituyen frecuentemente
casos se hace uso del calor en sus diversas una importante fuente primaria de contamina-
formas: llama directa, calor húmedo (en forma ción, porque es recomendable que, antes de
de vapor abierto o bajo presión), calor seco comenzar a trabajar laven sus manos y ante-
(aire caliente). Se pueden usar hornos a mi- brazos con abundante agua y jabón y se des-

infecten con etanol al 70 %. La utilización de Tabla 1: Composición de tres medios básicos
guardapolvos, guantes y máscaras protectoras usados en el cultivo in vitro de tejidos.
de la boca y de la nariz, así como los gorros 1
Compuestos Medio básico
protectores de los cabellos, ayudan a reducir
MS N6 B5
sensiblemente los niveles de contaminación.
Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, NH 4NO3 1.650 ----- -----
tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser KNO 3 1.900 2.830 2.500
KH 2PO4 170 400 -----
esterilizados antes de su uso. Muchos de es- CaCl 2.2H 2O 440 166 150
tos instrumentos pueden ser colocados en eta- (NH4) 2SO 4 ----- 463 134
nol al 95% y, antes de ser usados, se deben MgSO4.7H 2O 370 185 250
NaH 2PO 4.4H 2O ----- ----- 150
flamear cuidadosamente en la llama de un me- KI 0,83 0,80 0,75
chero. También es necesario flamear la boca MnSO 4.H2O ----- ----- 10,00
de los recipientes que contienen los medios de H 3BO 3 6,20 1,60 3,00
MnSO 4.4H 2O 22,30 4,40 -----
cultivo antes y después de cultivar el explante. ZnSO 4.7H 2O 8,60 1,50 2,00
6) Incubar los cultivos en cámaras o cuar- Na2MoO 4.2H 2O 0,25 ----- 0,25
CuSO 4.5H 2O 0,025 ----- 0,025
tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes
FeSO 4.7H 2O 27,80 27,85 27,80
de aire y bien higienizados. En lo posible se Na2EDTA 37,30 37,25 37,30
debe restringir la circulación de personas, y los CoCl 2.6H 2O 0,025 ----- 0,025
Glicina 2,00 2,00 -----
recipientes con cultivos contaminados deben
Tiamina -HCl 0,10 1,00 10,00
ser rápidamente eliminados de este sector. Es Piridoxina -HCl 0,50 0,50 1,00
conveniente que antes del lavado, estos culti- Ácido Nicotínico 0,50 0,50
1,00
vos sean esterilizados. Mioinositol 100,00 ----- 100,00
Sacarosa 30.000,00 50.000,00 20.000,00
4 Medios de cultivo
PH 5,7 5,8 5,5
-1- 1.
Un medio de cultivo puede ser definido 1) Composición en mg·L
como una formulación de sales inorgánicas y MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97.
1962)
compuestos orgánicos requeridos para la nu- N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,
trición y manipulación de los cultivos. Existen y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975)
B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell
numerosas formulaciones, cada una de las Res. 50: 151 - 158. 1968)
cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.
Para dar una idea de la cantidad de formu-
laciones disponibles, George y col., luego de
• Otros compuestos.
revisar más de 3.000 trabajos científicos des-
criben en dos tomos (casi 1.000 páginas en to-
Fuente de carbono: Prácticamente todos los
tal) más de 2.000 medios de cultivo. También
cultivos son heterótrofos (comparativamente
dos empresas multinacionales ofrecen para la
unos pocos son autótrofos) y por ende necesi-
venta más de 60 medios cada una, listos para
tan del suministro de una fuente de carbono.
su utilización especialmente en la micropropa-
La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,
gación comercial de plantas. En la Tabla 1 se
es el azúcar más utilizado. En algunos medios
presentan tres medios que son muy usados en
se la reemplaza por glucosa. En casos particu-
la actualidad.
lares se cita el empleo de maltosa o galacto-
Básicamente, los medios de cultivo se com-
sa. También myo-inositol (100 mg/L) suele ser
ponen de compuestos que suministran:
incorporado a los medios resultando un mejor
• Una fuente de carbono
crecimiento de los cultivos.
• Nutrientes minerales
Nutrientes minerales: Los medios de cultivo
• ·Sustancias vitamínicas
deben suministrar los mismos macro y micro-
• Sustancias reguladoras del crecimiento
nutrientes que son esenciales para el creci-
• Agente gelificante (en el caso de medios
miento de las plantas enteras. En general se
semisólidos)
destacan las concentraciones relativamente

altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y puré
suministrado en forma de amonio y/o nitrato. de banana. También en ocasiones es necesa-
También se pueden utilizar urea, glutamina y ria la incorporación de agentes antioxidantes
caseína hidrolizada. Es fundamental que el hie- (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolido-
rro sea incorporado juntamente con un agente na) para prevenir el ennegrecimiento tisular
quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible causado por la oxidación de polifenoles pre-
es un amplio rango de pH. sentes en los explantes. Este ennegrecimiento
puede causar la muerte de los mismos.
Sustancias vitamínicas: De todas las que La preparación de los medios de cultivo pue-
comúnmente se incorporan a los medios, pa- de llevarse a cabo de diferentes maneras, en
reciera que la tiamina es la única realmente «lecturas recomendadas» se citan manuales
imprescindible para el buen crecimiento de los de laboratorio donde se describen detallada-
cultivos. mente este punto.
Sustancias reguladoras del crecimiento: En 5. Condiciones ambientales para la

la mayoría de los casos los medios utilizados incubación.
para el establecimiento de los cultivos con-
tienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, La incubación de los cultivos se debe llevar
Dicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, a cabo en condiciones controladas. Por lo me-
ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (es- nos en lo que se refiere a temperatura, calidad
pecialmente GA3) son requeridas en algunas e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad at-
ocasiones para el cultivo de meristemas o para mosférica e higiene. Estas condiciones se lo-
la elongación de brotes. El ABA, es usado en gran con el empleo de cámaras climatizadas
algunos casos. o cuartos especialmente preparados con aire
acondicionado (frío-calor) y una buena y uni-
Agente gelificante (en el caso de medios se- forme circulación de aire en el interior y dota-
misólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el com- dos de un buen sistema de alarma para cortar
puesto más utilizado. También pueden em- la iluminación en caso de no funcionar el aire
plearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» acondicionado. En general, los cultivos son in-
(2,0-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agaro- cubados a temperatura constante de 25-28 ºC,
sa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%). con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz
es generalmente provista por lámparas fluo-
Otros compuestos: Muchas sustancias, de rescentes del tipo «luz día» con una irradiancia
variada composición química, suelen ser adi- de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad at-
cionadas a los medios básicos. Además de la mosférica debe ser elevada (80- 90%).
glicina, otros aminoácidos se pueden agregar
a los medios. Es el caso de L-tirosina, aspara- 6 Aclimatación de las plantas regenera-
gina y cisteína, aunque hay que tener presente das in vitro.
que en dosis altas pueden inhibir el crecimien-
to de los cultivos. El carbón activado (0,1 a Durante el período de incubación, los cultivos
5%) suele ser incorporado al medio, dado que son expuestos a condiciones ambientales disí-
es probable que absorba metabolitos tóxicos miles al ambiente externo. La atmósfera interna
para los cultivos. se caracteriza por presentar una considerable
variación diurna en la concentración de CO2,
En algunos medios se incorporan ácidos humedad relativa elevada, temperatura cons-
orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvi- tante e intensidad lumínica baja. A su vez, el
co y el succínico y es frecuente el empleo de medio de cultivo compuesto por concentracio-
L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy nes elevadas de azúcares (en aquellos siste-
se siguen utilizando ciertos componentes de mas heterótrofos y semiautótrofos de micropro-
composición química no bien definida como el pagación), sales y reguladores del crecimiento,

sumado a la ausencia de microorganismos, del substrato, para mantener la temperatura
generan anormalidades morfológicas, anató- por encima de los 18-20 ºC.
micas y fisiológicas que las plantas deberán Sin lugar a dudas, la opción más económica
corregir cuando son transferidas al ambiente es el empleo de la luz natural, disminuyendo su
externo. Este período de adaptación al nuevo irradiancia (20-50%) mediante el agregado de
hábitat es llamado fase o etapa de aclimata- mallas de sombreado («saram»). No obstante,
ción. La estrategia a implementarse durante el en aquellas latitudes donde el nivel medio de
mencionado ciclo deberá contemplar el control luz natural es bajo y los días son cortos du-
minucioso de los parámetros ambientales (hu- rante una parte considerable del año, la luz ar-
medad, temperatura y luz) de tal manera que tificial puede ser aplicada como complemento
permita disminuir la deshidratación y, al mismo de la luz natural. Las lámparas tubulares fluo-
tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de rescentes del tipo «luz día» son empleadas
generar un rápido crecimiento de los plantines. en horticultura para prolongar el fotoperíodo.
El retraso en el desarrollo de la cutícula y la Asimismo, las lámparas tubulares de sodio alta
escasa funcionalidad del aparato estomático presión presentan una distribución espectral
que presentan las hojas de la mayoría de las de la energía adecuada para estimular fotosín-
especies cultivadas in vitro, determinan una tesis y se emplean para tal fin en una amplia
alta tasa de transpiración que puede ocasionar variedad de cultivos.
la muerte por deshidratación. El control de este Otro aspecto importante a tener en cuenta
proceso fisiológico es de vital importancia du- lo constituye la elección del substrato, siendo
rante la aclimatación, teniendo en cuenta que la el adecuado aquel que permita el normal creci-
disminución de la transpiración será gradual y miento y desarrollo de las raíces. Se puede em-
dependerá de la rehabilitación de los estomas, plear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mez-
así como también del desarrollo de la cutícu- clas de ellos, teniendo la precaución de rea-
la. El equipamiento necesario estará sujeto a la lizar una esterilización previa. Es conveniente
especie, pudiendo utilizarse desde túneles de el agregado de fertilizantes, sea a través del
polietileno para plantas que posean un elevado substrato (fertilizantes de liberación controla-
control de la transpiración (por ej. Malus pumila da) o bien mediante el sistema de riego (fer-
o Agave tequilana) o bien, a través del empleo tilizantes solubles); empleándose proporcio-
de cámaras climatizadas (Fig.1) equipadas con nes ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio
sensores que permiten un descenso paulatino (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo
de la humedad relativa. En algunos casos pue- radicular y la rustificación de las plantas.
de resultar necesaria la aplicación exógena de En todo momento deberá realizarse un rigu-
ABA (hormona involucrada en el control del cie- roso control fitosanitario empleándose antibióti-
rre de los estomas) o bien, el empleo de sus- cos, fungicidas e insecticidas de uso universal.
tancias antitranspirantes que forman una capa En la Figura 1, se detalla un modelo de cá-
semipermeable en la superficie de la hoja. En mara de aclimatación diseñada por los autores
este último caso deberán tomarse algunas pre- y empleada por el Laboratorio de Cultivo de
cauciones debido a que pueden observarse re- Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste.
acciones de fitotoxicidad. Básicamente, está compuesta por una fase
Resulta imprescindible evitar la exposición a aérea construida en aluminio y policarbonato
temperaturas extremas tanto en la fase aérea alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que
como en el substrato. Mediante el empleo de contiene gránulos de arcilla expandida a fin de
extractores y/o acondicionadores de aire com- facilitar el drenaje. Mediante el agregado de
binados con un sistema de niebla, es posible arena u otro substrato adecuado, esta cámara
establecer la temperatura de la fase gaseosa puede ser utilizada tanto para el enraizamiento
entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de
mientras que en la época invernal es necesa- multiplicación, así como también, para el en-
rio, a veces, el empleo de mantas térmicas o raizamiento convencional (a «raíz desnuda»)
serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel de estacas de tallos u hojas.

La humedad relativa de la fase aérea es con- Debido a la latitud geográfica en que se en-
trolada por un sensor (6) ubicado por encima cuentra, la cámara está equipada con un acon-
de la tubería de riego (4). El sistema humidifi- dicionador de aire (3000 frigorías) para evitar
cador está compuesto por picos tipo «fog» y situaciones de estrés térmico en época estival.
es alimentado por una bomba de bajo caudal A su vez, y dado que la mayoría de las espe-
y alta presión (13). Con el propósito de evitar cies estudiadas son originarias de climas tro-
el goteo que pudiese ocasionar el agua rema- picales y subtropicales, el sistema cuenta con
nente en las cañerías, el sistema consta de
mantas térmicas que son colocadas por deba-
una válvula solenoide de descarga y desagüe
jo de los tubetes, manteniendo la temperatura
(7). La fase gaseosa es renovada en forma in-
del substrato durante el invierno. En este últi-
termitente mediante el empleo de extractores
ubicados en ambos extremos de la cámara (3) mo caso se agrega un material aislante entre la
los que, conjuntamente, introducen o extraen leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera
aire, generando un movimiento masal. de dirigir el calor hacia la fase aérea.

7. Agradecimientos.
Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Luna

por la planificación digital de la cámara de acli-
matación. A la Secretaría General de Ciencia
y Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-
chuera por el aporte financiero recibido para
construir la misma.
8. Lecturas Recomendadas
GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR-

GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formu-
lations and Uses). Exegetics Limited. England.
567 pág.
GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE.
1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary
and analysis). Exegetics Limited. England. 420
pág.
HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de
Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. México. 232 pág.
PÉREZ PONCE, J.N. 1998. Propagación y Mejora
Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto
de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390
pág.
POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D.
HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization
of micropropagated plants to ex vitro conditions.
Biologia Plantarum 42: 481-497.
ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda
edición). Cultivo de tejidos en la Agricultura:
Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colom-
bia, 970 pág.
TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998.
Cultura de Tecidos e Transformacao Genética
de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pág.
TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999
Cultura de Tecidos e Transformacao Genética
de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pág.

I - CAPÍTULO 2 2.- Tipos de morfogénesis. Definiciones
En condiciones de cultivo in vitro, las células

Morfogénesis
somáticas pueden regenerar embriones (Fig
Silvia Radice 1) o brotes, raíces y/o flores (Fig 2) como res-
puesta a un determinado estímulo. La regene-
1.- Introducción ración es un proceso que comprende diferen-
tes fases que se suceden de manera similar
La embriogénesis somática y la organogénesis para los tres tipos de morfogénesis citadas. De
son dos procesos morfogénicos muy frecuen- Klerk y colaboradores, en 1997, denominaron
tes en el cultivo in vitro de especies vegetales. a estas diferentes fases como adquisición de
La embriogénesis somática es el proceso por la competencia; fase de inducción y fase de
el cual se obtiene una estructura similar a un realización.
embrión cigótico sin que medie la fertilización En la primera fase, las células no respon-
de las gametas, mientras que por organogé- den al estímulo organogénico pero adquieren
nesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. esa competencia durante una fase de desdi-
Estos órganos son inducidos a partir de una ferenciación. En la segunda fase o fase de in-
célula o de un grupo de células que, según las ducción, las células son receptivas al estímulo
condiciones de cultivo, tienen la propiedad de morfogénico y hay una relación directa con el
mantenerse en activa división. tipo, concentración y combinación de regula-
Esta totipotencialidad celular fue enunciada dores del crecimiento agregados al medio de
por Haberlandt en 1902, quien propuso la teo- cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de
ría de que todas las células vegetales tienen realización, la célula sufre las sucesivas divi-
la capacidad de regenerar plantas completas. siones para formar el órgano determinado.
Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis A partir de la siembra in vitro de diferentes ex-
debido a que no pudo lograr la división celu- plantes relativamente grandes y en condicio-
lar. Los medios de cultivo que empleaba no nes de cultivo adecuadas, puede inducirse la
incluían reguladores del crecimiento debido a formación de nuevos órganos de manera direc-
que esos compuestos eran aún desconocidos. ta, sin la formación de callo. Si la formación es
Los avances en el cultivo de tejidos vegetales de brotes, raíces o flores se denomina organo-
fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, Whi- génesis directa. Si en cambio se induce la for-
te pudo mantener, en forma ilimitada, el creci- mación de embriones somáticos, este proceso
miento de raíces en medios líquidos a partir de se denominará embriogénesis directa (Figs. 1 y
ápices de tomate. Al mismo tiempo se identi- 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de
ficó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó un explante in vitro se observa la proliferación
el mantenimiento indefinido de callos de za- de células en forma desordenada y sin ninguna
nahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se función predeterminada, se iniciará la produc-
descubrió el efecto de la leche de coco como ción de callos o suspensiones celulares (Figs.
estimulante de la formación de callo sobre el 2 A y 3). La diferenciación de órganos a partir
cultivo de embriones de Datura stramonium. de callos, denominada morfogénesis indirecta,
En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos estará condicionada a la previa formación de
de callo de tabaco, demostraron la existencia los meristemoides. Morfogénesis directa o in-
de una regulación química en la parte aérea y directa fueron términos propuestos por Hicks
en la raíz. Trabajos posteriores en callos de la en1980.
misma especie, con el agregado de cinetina,
la primera citocinina descubierta, permitieron 3.- Histología de la morfogénesis
demostrar que la diferenciación de brotes, raí-
ces o de ambos, era regulada por el balance de Después de 48 horas de realizada la siembra
auxinas/citocininas. del explante en el medio de cultivo adecuado,

Figura 1: A-F embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriogénesis somática en di-
ferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de
BAP. B-D-F, embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones
zigóticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS
+ 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.
a partir de una célula epidérmica o del mesófilo renciación de los nuevos órganos. Este tipo de
foliar, como ocurre en las coníferas, se suce- meristema puede iniciarse en forma directa, a
den una serie de divisiones mitóticas. Así se partir de células diferenciadas pertenecientes a
pueden observar, a través del estudio histológi- un explante cultivado in vitro, o indirectamente,
co, pequeñas masas de células que contienen a partir de una célula o grupo de células dife-
citoplasma denso y grandes nucleolos. Este renciadas que promueven la proliferación celu-
conjunto de células, agrupadas a modo de es- lar (Fig 4 A). Su evolución determinará el cre-
feras, fueron denominadas meristemoides por cimiento de un órgano, por ejemplo una yema
Torrey en 1966, y son responsables de la dife- adventicia (Fig 4 B).

Figura 2: A-E Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, callo organogénico obtenido en
Abelia sp. (André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes (flechas) en hojas
crecidas in vitro de “Crimson Gold” (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de
Kin. C, Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0,05
mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D, brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André)
Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (André) Re-
hder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las
reglillas representan 5 mm
Las células embriogénicas son similares a las po de células embriogénicas, el desarrollo de

células meristemáticas debido a que no son las mismas no está sincronizado. Estas células
demasiado voluminosas, tienen gran cantidad son capaces de dividirse o de transformarse
de ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo en embriones según las condiciones del medio
agrandado y pequeños granos de almidón. Es- de cultivo. Aquellas células que no desarrollan
tas células, que en general se agrupan, pueden proembriones comienzan el proceso de dife-
variar en tamaño y número. Dentro de un gru- renciación, es decir se vacuolizan, disminuye

el volumen de núcleo y nucleolo y desaparecen noso, sufre divisiones polarizadas formando un
los gránulos de almidón. embrión globular. Previo a esta polarización se
Las experiencias demuestran que las células deposita almidón, luego se forma la epidermis
embriogénicas se desarrollan sólo cuando se y adquiere simetría bilateral. Sucesivamente se
modifican las condiciones de cultivo. En gene- observa el crecimiento de uno o más cotiledo-
ral, cuando se reducen las cantidades de auxi- nes, el desarrollo de los tejidos provasculares,
na y citocinina o se elimina la auxina. la iniciación de los ápices radicales y de tallo y
Las células embriogénicas desarrollan como una progresiva acumulación de almidón, lípidos
embriones cuando las condiciones experimen- y proteínas.
tales permiten que estas expresen su poten- En el caso de un origen multicelular de los em-
cial. Pueden ocurrir dos condiciones ontogé- briones somáticos pueden observarse diversos
nicas diferentes, es decir que el origen de los patrones. Los embriones somáticos se forman
embriones sea unicelular o pluricelular. a partir de grupos de células epidérmicas y
En el caso de iniciarse a partir de una célula, la subepidérmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontoge-
misma se aísla de las demás por una importan- nia de origen multicelular se llama comúnmente
te modificación en su pared celular, en particu- budding o embriogénesis adventicia. Estas cé-
lar por la gelificación de la laminilla media. Esta lulas pequeñas tienen una alta relación núcleo/
célula, rodeada por un polisacárido mucilagi- citoplasma, citoplasma denso y un nucleolo vo-
luminoso que se tiñe fuerte-
mente. Se diferencian de las
células embriogénicas por la
falta de sustancias de reser-
va, por su delgada pared ce-
lular y su frecuente división
celular. Estas estructuras se
denominan proembriones
globulares (Fig 1 A, B). En
una etapa posterior desarro-
llan una epidermis, un tejido
provascular, acumulan mate-
rial de reserva y se polarizan.
Estas estructuras globulares
desarrollan cotiledones y se
transforman en embriones
somáticos que presentan
ápices caulinar y radicular.
Para una misma especie
puede ocurrir uno u otro tipo
de inicio según las condicio-
nes de cultivo. El desarrollo
de un embrión somático de
origen unicelular es compa-
rable a la de un embrión ci-
gótico. En dicotiledóneas, la
etapa globular es seguida
Fig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos por una etapa corazón que
a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las líneas conse corresponde con la adqui-
tinuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que sición de la simetría bilateral:
las líneas quebradas indican que la morfogénesis se obtiene por vía desarrollo de la epidermis,
indirecta.

Figura 4: A-E Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A, meristemoides (flechas)
observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B, yemas
adventicias (flechas) en ápices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5
mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C, grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum
(L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20 x. D, embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L)
Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E, embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L)
Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x.
de los estratos procambiales y de manera su- la raíz y al procambium en respuesta a la elon-

cesiva el desarrollo del ápice radical. El ápice gación axial del embrión somático debido al
de tallo se desarrolla más tarde, durante la eta- transporte de auxinas (Fig 1 C).
pa cotiledonar. En los embriones somáticos de Los embriones de origen multicelular obtenidos
algunas especies hay una etapa intermedia en- por budding muestran la misma ontogenia que
tre la globular y corazón llamada oblonga, que los cigóticos, como así también la producción
corresponde a la individualización del ápice de de sustancias de reserva.

Sin el seguimiento histológico detallado, la for- nos. Por esta causa, no es posible generalizar
mación del embrión somático sólo puede ser metodologías o protocolos de trabajo debido a
confirmada por la germinación (Fig 1 F). Sin que los medios de cultivo, así como las condi-
embargo, debido al bajo porcentaje de embrio- ciones de cultivo seleccionados, deben ser es-
nes que llegan a esta etapa, esta tarea es casi pecíficos para cada situación en particular. Un
imprescindible para una correcta evaluación de ejemplo de ello es el protocolo empleado por
las respuestas encontradas con los diversos Stamp and Meredith en diferentes cultivares de
medios de cultivo empleados. Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la
Comparados con los embriones cigóticos de la obtención de embriones somáticos a partir de
misma especie, los embriones somáticos fre- embriones cigóticos, pero estos resultados no
cuentemente desarrollan de manera anormal se repitieron con el cultivar "Pinot Noir".
o son inmaduros. La anomalía más frecuente-
mente encontrada es la formación doble o tri- 4.2.- Varios son los compuestos químicos que
ple del sistema vascular, causada por la pobre influyen en los patrones morfogénicos in vitro
polarización del transporte de auxinas. También dentro de los cuales podemos considerar:
se puede encontrar un contenido excesivamen- 4.2.1.- la composición salina del medio de culti-
te alto, reducido o ausente de las reservas de vo. La composición salina más empleada para
almidón y/o proteicas, que el meristema apical o inducir la formación de callo, la organogénesis
radical no estén desarrollados o que la embrio- directa o indirecta en la mayoría de las espe-
génesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). cies vegetales, es la de Murashige & Skoog
La falta del meristema apical o una escasa (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formu-
deposición de sustancias lipoproteicas en los laciones diseñadas para inducir determinados
embriones somáticos de algunas especies no patrones morfogénicos. Existe además una es-
debe ser tomada como una anormalía. Esto trecha relación entre la composición hormonal
puede ser un síntoma de inmadurez debido del explante y la concentración de reguladores
a la rápida formación de los mismos. En este del crecimiento agregada al medio de cultivo.
caso una etapa intermedia que permita la ma- 4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estos
duración de las estructuras formadas permitirá compuestos pueden promover la morfogénesis
incrementar el porcentaje de embriones somá- aún cuando la concentración salina no sea la
ticos capaces de germinar. adecuada. En condiciones óptimas de cultivo
pueden aumentar significativamente la dife-
4.- Factores que afectan los procesos renciación de órganos. Para la inducción de
morfogénicos embriones somáticos en muchas especies ve-
getales es necesario el agregado de auxinas,
Los cuatro principales factores que condicio- como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para
nan la obtención y el crecimiento de nuevos otras, como es el caso del crotón (Codiaeum
órganos in vitro son: variegatum), es suficiente con el agregado de
thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentra-
4.1.- el genotipo ción de reguladores del crecimiento empleados
4.2.- las condiciones químicas seleccionadas están estrechamente relacionados.
para realizar el cultivo. 4.2.3.- antibióticos. En procesos de transfor-
4.3.- las condiciones físicas seleccionadas mación con Agrobacterium tumefaciens es
para realizar el cultivo. muy común el agregado de antibióticos del tipo
4.4.- el explante. cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para
la eliminación de la bacteria. En explantes de
4.1.- El genotipo es un factor determinante en hoja de diferentes cultivares de Malus domes-
todos los procesos morfogénicos, desde la ca- tica se encontró que 250 mg L–1 de cefotaxime
pacidad del explante para su establecimiento en aumentan significativamente la regeneración
condiciones in vitro a la proliferación de callo, o de brotes mientras que 500 mg L–1 de carbe-
la diferenciación y crecimiento de nuevos órga- nicilina promueven la formación de callo y la

kanamicina inhibe los procesos morfogénicos. dicionada por el tipo y tamaño del envase selec-
4.2.4.- carbón activado. En general se usa para cionado para el cultivo, así como también por el
adsorber compuestos tóxicos de la micro atmós- sistema de cobertura del mismo. Las tapas usa-
fera gaseosa o el exceso de reguladores del cre- das en cultivo in vitro varían desde el tapón de
cimiento presentes en el medio de cultivo pero algodón; papel de aluminio; película de resinite
E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de transparente o tapas rígidas de polipropileno. El
la Swedish University of Agriculture, demostraron intercambio gaseoso es diferente para cada tipo
que puede promover la embriogénesis somática de tapa, en consecuencia la atmósfera interna
debido a la incorporación de ciertos compuestos también sufrirá variaciones.
al medio de cultivo por difusión. En condiciones in vivo la atmósfera contiene 78
4.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en % de nitrógeno; 21 % de oxígeno y 0,035 % de
cuenta es la consistencia del medio de cultivo. dióxido de carbono. En cultivos in vitro se han
Puede emplearse como semi-sólido o líquido. El registrado además, etileno y otros compuestos
agente gelificante más utilizado en el cultivo in hidrocarbonados.
vitro es el agar, extraído de diversas algas ma- El nivel de oxígeno disponible para el explante
rinas. Las diferentes calidades existentes en el condiciona el crecimiento y los procesos morfo-
mercado modifican la expresión morfogénica génicos. En general se necesita una buena airea-
debido a que pueden contener sustancias inhi- ción para obtener cualquier tipo de proceso mor-
bitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el fogénico. En alfalfa se puede obtener un buen
caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis incremento de material a partir de suspensiones
(en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de celulares embriogénicas cuando la solución se
AIA + 1 mg/L de BAP) cuya respuesta morfogéni- satura con 70% de oxígeno. Por el contrario, una
ca varió según el tipo de agar utilizado. Cuando tensión de oxígeno del 5 % estimula la produc-
el gelificante empleado fue Chubut-agar, de pro- ción de plantas a partir de anteras de tabaco.
ducción nacional, se observó una gran diferen- La concentración de dióxido de carbono (CO2) en
ciación de yemas adventicias, mientras que con la atmósfera gaseosa in vitro varía según la res-
el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la piración y la actividad fotosintética de las plantas.
proliferación de callo. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa
En caso de seleccionar medios de cultivo líqui- mientras que en condiciones de luz, disminuye.
dos, la respuesta morfogénica observada varía En trabajos realizados con Ficus lyrata se han
de manera considerable. El cultivo líquido es im- encontrado concentraciones variables, entre 0,5
prescindible cuando se busca promover la mor- % y 8,5 %, según el tipo de sello o tapa emplea-
fogénesis indirecta a través de suspensiones ce- dos. Concentraciones superiores al 1 %, que son
lulares. Para ello es necesario cultivar los callos generalmente tóxicas en condiciones in vivo, pro-
en medio líquido con agitación para permitir que bablemente no fueron limitantes para la actividad
las células se disgreguen y puedan diferenciar fotosintética.
raíces, brotes o embriones somáticos en forma La presencia de etileno en condiciones in vitro
aislada. promueve diversas respuestas. Su acumulación
La elección de un medio de cultivo líquido o tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de cé-
sólido depende, además, de la especie con la lulas, callos y anteras, La cantidad de etileno
que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se producida in vitro varía con la especie, el tipo de
ha observado que el empleo de medio líquido explante, la concentración de citocininas en el
promueve una mayor diferenciación de proto- medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con la
cormos respecto del mismo gelificado. A su vez, luz. Una forma de incorporar etileno al envase de
este proceso puede mantenerse durante varios cultivo es a través de la esterilización del material
subcultivos, mientras que en medio de cultivo ge- de disección realizada con el material embebido
lificado se observó que los protocormos tienden en alcohol y flameado con mechero Bunsen. En
a formar tallos. muchos casos el etileno actúa como promotor de
4.2.6.- atmósfera gaseosa. Es un factor determi- la morfogénesis pero luego es inhibitorio del cre-
nante en los procesos morfogénicos y esta con- cimiento de los órganos diferenciados

4.3.- Entre las condiciones físicas podemos men- cultivadas en un mismo medio de cultivo, según
cionar los efectos de la temperatura, la humedad la porción de la lámina utilizada (Pedroso y Pais,
relativa y la luz. 1993). Estos investigadores cultivaron estas ho-
4.3.1.- La temperatura de incubación de los cul- jas in vitro durante seis semanas previa inmersión
tivos es un factor importante a tener en cuenta. del explante en una solución de IBA (1 mg l–1) du-
Si bien en condiciones naturales las plantas ex- rante 20 minutos (Fig 5).
perimentan diferencias térmicas durante el día y
la noche, las temperaturas in vitro se mantienen
casi estables. Es importante señalar que cuanto
más se asemejen las condiciones in vitro a las
óptimas de crecimiento de la especie estudiada,
mayor será la respuesta obtenida. En cultivos de
hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a
diferentes temperaturas se observó que la rege-
neración mayor de brotes se producía a 12 ºC
mientras que por encima de los 30 ºC, práctica-
mente no se observó diferenciación.
4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida
de la cantidad de vapor de agua contenida en
la atmósfera gaseosa, es otro de los parámetros
físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas
sello o cobertura del envase empleado. Si este morfogénicas obtenidas después de seis semanas
cierre es hermético, la humedad interior será del de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L.
según la porción de la lámina. 1, callo organogéni-
100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un
co. 2 embriogénesis somática directa. 3, regenera-
intercambio gaseoso la humedad interna pue-
ción directa de raíces. 4, callo organogénico.
de descender a niveles cercanos al 50 %. Este
importante descenso de la HR puede promover
una pérdida veloz de agua del medio de cultivo
variando la concentración de sus compuestos Lecturas recomendadas
hasta llegar a niveles tóxicos (Debergh, comuni-
cación personal). Buddendorf-Joosten J.M.C. and Woltering E.J.
4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe 1994. Components of the gaseous environment
ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad and their effects on plant growth and develop-
y período de suministro. La respuesta morfogé- ment in vitro. Plant Growth Regulation 15: 1-16.
nica de un explante puede variar según si se le De Klerk G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and
Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots,
proporciona luz o no. Para estimular la formación
shoots and embryos: physiological, biochemical
de callo, es común que se prefiera la oscuridad. and molecular aspects. Biologia Plantarum 39
El suministro de luz favorece la diferenciación de (1): 53-66.
órganos. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture
Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd
4.4.- Tal como ya se señaló anteriormente, los (ed). Gran Bretaña. 1361pp.
proceso morfogénicos dependen del genotipo, Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in
pero a esto debe sumarse el efecto del explante plant tissue culture and the problem of organ de-
seleccionado. El tratamiento de la planta madre, termination. Bot. Rev. 46: 1-23.
las condiciones físicas y fisiológicas en las que Williams E.G. and Maheswaran G. 1986. Somatic
embryogenic factors influencing coordinated be-
ésta se encuentre y el sector del cual se tome
havior of cells as an embryogenic group. Ann.
el explante determinarán a su vez la respuesta Bot. 57: 443-597.
morfogénica en condiciones in vitro. Un ejemplo
muy interesante es la diferente respuesta morfo-
génica observada en hojas de Camellia japonica

I - CAPÍTULO 3 mosómico). Esta caracterización se realiza
en metafase mitótica debido a que, en esta
fase, los cromosomas han alcanzado su máxi-
La citogenética molecular e inmu- mo grado de condensación y sus límites están
nocitogenética en el estudio de perfectamente definidos. Para este análisis ge-
los genomas vegetales neralmente se emplean tejidos meristemáticos
porque presentan un alto índice mitótico (i.e.
Guillermo Seijo; Graciela I. Lavia; la razón entre el número de células en división
Germán Robledo; Aveliano Fernández; y el número total de células observadas). Los
Viviana G. Solís Neffa órganos (ápices radicales o caulinares, óvulos,
etc.) son pre-tratados con diversas sustancias
1 Introducción que inhiben la formación del huso mitótico (col-
chicina, 8-hidroxiquinoleína, paclosol, etc.) a
La comprensión de la organización de los los efectos de acumular metafases, dispersar
genomas lograda a través del análisis citoge- los cromosomas en el citoplasma y producir
nético ha tenido un gran impacto en la evalua- una mayor condensación de los mismos. Los
ción y utilización de la biodiversidad, así como materiales se fijan y luego se tiñen con colo-
en el mejoramiento genético y la ingeniería ge- rantes nucleares (fucsina básica, orceína, car-
nética, en particular, desde el desarrollo de las mín, giemsa, etc.). Finalmente, se confeccio-
técnicas de citogenética molecular. El empleo nan los preparados por macerado y aplastado
sondas de ADN y de anticuerpos conjugados (“squash”) del material sobre un portaobjetos.
con fluorocromos en un número creciente de Con estos métodos de tinción, los cromoso-
especies vegetales ha permitido, entre otros lo- mas metafásicos observados con un micros-
gros, la localización de secuencias específicas, copio óptico aparecen uniformemente teñidos,
la identificación de cromosomas particulares, el excepto en el centrómero (constricción pri-
estudio del origen y la estructura de los geno- maria) y en algunas constricciones menores
mas de híbridos y poliploides, la comparación (secundarias).
de regiones genómicas homólogas, el estudio Mediante la observación microscópica se
del comportamiento cromosómico y el análisis determina el número cromosómico somáti-
de la expresión génica. Por ello, las técnicas de co (2n) y, a través del análisis de microfotogra-
hibridación in situ (ISH) e inmunocitogenética fías o dibujos de metafases con cromosomas
constituyen actualmente herramientas indis- bien definidos y separados (Fig. 1A), se esta-
pensables para la comprensión de la organiza- blecen los cariotipos. Para ello, se analiza la
ción y la expresión del genoma de las plantas. morfología de los cromosomas determinando
En este capítulo se describen, en primera la posición del centrómero y la longitud de
instancia, algunos de los criterios empleados los brazos corto (bc) y largo (bl), así como
tradicionalmente para la caracterización cario- la longitud total (lt) de cada cromosoma. A
típica y, posteriormente, se presentan los prin- partir de estas medidas, se calcula el índice
cipios y las aplicaciones de diferentes técnicas centromérico [IC = (bc / lt) × 100], según el
de hibridación in situ de ácidos nucleicos y de cual los cromosomas se clasifican en cuatro ti-
inmunodetección de modificaciones epigenéti- pos morfológicos: metacéntricos (m, IC = 50 -
cas de nucleótidos e histonas. 37,5), submetacéntricos (sm, IC = 37,5 - 25),
subtelocéntricos (st, IC = 25-12,5), acrocén-
2 Citogenética clásica tricos (t, IC = 12,5 - 0) y telocéntricos (T, IC
= 0). Otro aspecto a considerar para caracte-
La caracterización cromosómica de espe- rizar morfológicamente a los cromosomas es
cies o variedades de plantas se inicia con la la presencia y la posición de las constricciones
descripción del cariotipo a través del análisis secundarias, así como la presencia y el tipo
del número, el tamaño y la forma de los cro- de satélites. En general, las primeras corres-
mosomas que presentan (complemento cro- ponden a regiones organizadoras de los nu-

cleolos (NORs) y los últimos a las porciones tricos) y, dentro de cada tipo, según su tamaño
cromosómicas distales delimitadas por la cons- (de mayor a menor) ubicando los centrómeros
tricción secundaria y el telómero de los brazos alineados a una misma altura y los brazos cor-
que los portan. Los cromosomas que presen- tos hacia arriba. En las plantas diploides (Fig.
tan satélites se denominan cromosomas SAT 1C y E) y alopoliploides, el cariotipo se com-
(Fig. 1A, E y F). pone de pares de cromosomas homólogos;
Para la confección del cariotipo los cromo- mientras que en las autopoliploides (Fig. 1D y
somas del complemento se ordenan según su F) se compone de grupos de tres o más cro-
morfología (de metacéntricos a submetacéntri- mosomas de acuerdo con el nivel de ploidía.
cos, subtelocéntricos, acrocéntricos y telocén- El orden que ocupa en el cariotipo cada par o
FIGURA 1. A-D: Metafases mitóticas teñidas con coloración de Feulgen. A: Lathyrus macropus, 2n = 2x =
14, las flechas señalan los satélites de los cromosomas SAT. B: Oziroe argentinensis [citada en Fernández
y Daviña (1991) como Fortunatia biflora], 2n = 2x = 30, con un cariotipo asimétrico. C y D: Turnera sidoides
subsp. pinnatifida, C: citotipo diploide, 2n = 2x = 14 y D: citotipo tetraploide, 2n = 4x = 28. E-F: Idiogramas
de los citotipos diploide y tetraploide de Turnera sidoides subsp. pinnatifia ilustrados en C y D, respectiva-
mente. En gris se representan los satélites de los cromosomas SAT. La barra representa 10 micras en A y
B, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F.

grupo de cromosomas se indica mediante un (Fig. 2A). Además, pueden utilizarse diversos
número y, mediante una letra, el tipo cromosó- fluorocromos que tienen la capacidad de inter-
mico al que pertenece de acuerdo a su morfo- calarse preferentemente en regiones del ADN
logía. La representación gráfica del cariotipo se con una composición de bases particular. Por
denomina idiograma (Fig. 1E y F). La compo- ejemplo, las regiones ricas en adenina y timina
sición de un complemento cromosómico tam- son reveladas con DAPI (4',6-diamidino-2-feni-
bién se puede expresar mediante una fórmula lindol diclorhidrato) o quinacrina, mientras que
cariotípica, en la que se indica el número de las ricas en guanina y citosina lo son con CMA3
cada tipo morfológico de cromosomas que pre- (cromomicina A3). Las bandas pueden ser de
senta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm tamaño e intensidad diferentes y presentar una
+ 2 st + 2 t). Entre los parámetros cuantitativos distribución particular sobre los cromosomas
más utilizados para caracterizar los cariotipos de un complemento generando un patrón de
se encuentra el grado de asimetría que pre- bandeo característico (Fig. 2B). Estas técnicas
sentan los mismos. Para ello, se emplean cade bandeo cromosómico han permitido, en
tegorías o índices de asimetría cromosómi- muchos casos, la identificación inequívoca de
ca que consideran las diferencias de tamaño cromosomas homólogos, la caracterización de
entre los cromosomas del cariotipo (asimetría genomas así como el seguimiento de cromo-
intercromosómica), y las diferencias morfoló- somas o bloques cromosómicos en híbridos y
gicas de los cromosomas derivadas de la pro- líneas de introgresión.
porción entre sus brazos (asimetría intracro- La diferenciación lineal de los cromosomas
mosómica). Un cariotipo simétrico es aquel por técnicas de bandeo no siempre es eviden-
cuyos cromosomas son aproximadamente del te en todos los grupos de plantas y, aún en
mismo tamaño y en su mayoría metacéntricos, aquellas especies que presentan buenos pa-
mientras que uno asimétrico es aquel que trones de bandas, a menudo no se cuenta con
presenta cromosomas de diferentes tamaños un número significativo de marcadores como
y predominantemente submetacéntricos, acro- para integrar los mapas de ligamiento con los
céntricos o telocéntricos (Fig. 1B). La informa- mapas físicos. La posibilidad de posicionar se-
ción obtenida a partir del análisis de los cario- cuencias particulares sobre los cromosomas y,
tipos permite identificar cromosomas, clasificar de esta forma, generar un gran número de mar-
los cariotipos, realizar análisis comparativos cadores cromosómicos ha sido posible gracias
entre grupos de especies más o menos rela- al desarrollo de las técnicas de hibridación in
cionadas e inferir sus tendencias evolutivas. situ, cuyo uso se ha generalizado a partir del
Asimismo, permite detectar las anomalías nu- desarrollo de sistemas de marcado y de detec-
méricas y estructurales en los complementos ción de sondas no radiactivas.
cromosómicos de células o individuos.
En numerosos grupos de plantas, la identi- 3 Hibridación in situ fluorescente (FISH)
ficación de los diferentes pares de homólogos
del cariotipo puede resultar engorrosa debido Esta técnica se basa en reacciones de re-
a que presentan cromosomas con morfología conocimiento y asociación de bases entre un
muy similar. En estos casos, la aplicación de segmento del ADN cromosómico (secuen-
determinados tratamientos en combinación cia blanco) y una secuencia complementaria
con diferentes tipos de tinción, puede revelar marcada (sonda). La misma se aplica a pre-
regiones cromosómicas con condensación o paraciones de células somáticas o germinales,
composición cromatínica diferencial (bandas), previamente incubadas con enzimas (celulasa,
generando marcadores cromosómicos adicio- pectinasa y citohelicasa) que remueven las
nales. Así, el tratamiento de los cromosomas paredes celulares. Las preparaciones son tra-
con un álcali y la posterior tinción con Giemsa tadas con ARNasa A para evitar hibridaciones
revela regiones de heterocromatina consti- inespecíficas de la sonda con ARNs y, poste-
tutiva, mientras que la impregnación argénti- riormente, son permeabilizadas mediante la
ca (bandeo Ag-NOR) revela las NORs activas incubación con proteasas. Las sondas pueden

ser marcadas con nucleótidos unidos a hapte- Desde el desarrollo inicial de la técnica de
nos (digoxigenina, biotina, etc.) o a fluorocro- FISH, se han mejorado sustancialmente tanto
mos (Cy3, Cy5, etc.) por la reacción en cadena la sensibilidad (i.e. el tamaño mínimo de una
de la polimerasa (PCR), por una transferasa secuencia que puede ser detectada bajo el mi-
terminal o por medio de la actividad exonu- croscopio) como el poder de resolución es-
cleotídica y de la subsiguiente polimerización pacial (i.e. la distancia física mínima a la que
realizadas por la ADN pol I a partir de escisio- dos secuencias pueden ser identificadas como
nes simples causadas por una ADNasa (nick independientes). Bajo condiciones óptimas de
translation). La sonda marcada, componiendo hibridación y de detección, la sensibilidad de
una mezcla de hibridación que contiene forma- esta técnica depende de la accesibilidad de
mida y ADN bloqueante (entre otros compo- la sonda a la región complementaria sobre el
nentes) es colocada sobre las preparaciones ADN. La misma, a su vez, está determinada
cromosómicas, para luego realizar una desna- por el grado de condensación de la cromati-
turalización conjunta del ADN de los cromoso- na. El éxito de FISH se debe a las indudables
mas y de la sonda, a temperaturas que varían ventajas que ofrece frente a las técnicas clási-
entre 70 ºC y 90 ºC durante unos 10 minutos. cas para identificar homologías y, sobre todo, a
Posteriormente, los preparados son incubados la posibilidad de contar con una amplia batería
a 37 ºC durante al menos 1 hora (normalmente de sondas disponibles de acuerdo con la na-
toda la noche) a fin de inducir la hibridación. turaleza de la secuencia blanco que se quiera
En este paso, la sonda y la secuencia cromo- detectar.
sómica complementaria al blanco compiten en- En general, se pueden utilizar sondas de
tre sí, pero debido a la alta concentración de ADN de copia única, moderadamente repe-
la primera y a su menor tamaño, bajo condi- titivo o altamente repetitivo. Las secuencias
ciones óptimas, la sonda hibrida en todos los repetitivas pueden ser conservadas o varia-
sitios complementarios a lo largo de los cro- bles y estar dispuestas en tándem (i.e. una co-
mosomas. En el caso de las sondas marcadas pia está seguida de otra en arreglos de decenas
con haptenos, la detección de los sitios de hi- a miles de copias formando un locus definido)
bridación se realiza mediante una o dos rondas o dispersas (i.e. las repeticiones pueden estar
de anticuerpos conjugados con fluorocromos. dispuestas a lo largo de una región cromosómi-
Los preparados se analizan con microscopios ca, de algunos cromosomas o de todo el com-
de epifluorecencia utilizando filtros específicos plemento). Entre las secuencias repetitivas, las
para cada fluorocromo, registrando la presen- sondas de los genes ribosomales (ADNr) 45S
cia, el tamaño y el número de señales fluo- y 5S son las empleadas con mayor frecuencia
rescentes por complemento. Normalmente, para la generación de marcadores cromosómi-
se obtiene una microfotografía monocromática cos por FISH. Esto es debido a que son se-
por cada sonda utilizada y una del complemen- cuencias altamente conservadas y a que pre-
to cromosómico teñido con DAPI o ioduro de sentan una disposición en tándem que facilita la
propidio. Estas microfotografías son super- detección de los loci. Los mismos pueden estar
puestas e integradas en una sola imagen. El presentes en más de un sitio por complemen-
posicionamiento relativo de las señales con to cromosómico, proporcionando marcadores
respecto al centrómero, los telómeros u otros útiles para la identificación de cromosomas y
marcadores cromosómicos permite mapear para realizar comparaciones cariotípicas (Fig.
con precisión cada sonda sobre el complemen- 2C). Otra de las sondas de secuencias conser-
to cromosómico y representarlas en un idiogra- vadas y repetidas en tándem que se emplean
ma. A diferencia de la citogenética clásica, la habitualmente en experimentos de FISH son
identificación de cromosomas o de segmentos las teloméricas (Fig. 2D). Las mismas son
cromosómicos particulares usando sondas de utilizadas tanto para establecer con precisión
FISH es independiente de la morfología cromo- los límites cromosómicos como para revelar in-
sómica y, por lo tanto, es posible reconocerlos versiones que comprenden los segmentos cro-
en diferentes estados del ciclo celular. mosómicos distales y la ocurrencia de fusiones

cromosómicas. Las sondas de secuencias no mosómicos; mientras que las de secuencias
conservadas repetidas en tándem son muy repetidas dispersas lo son para definir regio-
útiles para el desarrollo de marcadores especí- nes cromosómicas o genomios, en particular,
ficos de cromosomas y de complementos cro- para identificar los genomas parentales en los
FIGURA 2. A: Bandeo Ag-NOR en una metafase de Arachis hypogaea donde se identifican las regiones
organizadoras del nucleolo en marrón oscuro (flechas). B: bandeo con quinacrina que distingue las regio-
nes heterocromáticas ricas en AT (en amarillo intenso) de las regiones eucromaticas (amarillo pálido) en
los cromosomas prometafásicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoi
en donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratinción realizada con
DAPI diferencia bandas heterocromáticas centroméricas ricas en AT (en blanco) de las porciones cromo-
sómicas eucromáticas (en azul). D: FISH que revela las regiones teloméricas (verde) de A. hypogaea. E:
FISH que revela la distribución preferencial de un retroelemento en el genoma A de A. hypogaea. F: GISH
doble sobre una metafase de A. hypogaea utilizando como sondas ADN genómico de A. ipaensis (rojo) y
de A. duranensis (verde) que demuestra la constitución alopoliploide del cultígeno y las especies diploides
progenitoras más probables. G y H: ARN-FISH en antera y ovario de Paspalum notatum utilizando como
sonda un ARN marcado de expresión diferencial y tejido-específica en plantas apomícticas pero no sexua-
les. La intensidad del color violeta indica cantidades relativas del ARN analizado presente en los diferentes
tejidos de plantas apomícticas. La barra representa 5 micras en A, C-F, 10 micras en B, 200 micras en G
y 100 micras en H.

híbridos interespecíficos y en los alopoliploi- genómico total y no por un fragmento de ADN
des (Fig. 2E). Ambos tipos de secuencias re- de secuencia conocida. El ADN utilizado para
petidas pueden mostrar diferencias notorias en construir estas sondas es extraído mediante
los motivos que las componen, así como en su protocolos estándares y luego es marcado por
abundancia y distribución, aún entre especies nick translation o por amplificaciones al azar
estrechamente emparentadas. El análisis del usando cebadores cortos (random priming).
conjunto de las secuencias repetitivas consti- El éxito de GISH depende del grado de dife-
tuye una herramienta excelente, en sí misma o renciación que presenten los genomios que se
como complemento de otras técnicas, para la pretende analizar. Por lo general, las secuen-
identificación de cromosomas y genomios, el cias codificantes de los genomas de dos es-
estudio de la arquitectura nuclear y los análisis pecies más o menos relacionadas no varían
filogenéticos. También nos permiten realizar substancialmente entre sí, por lo tanto, la hi-
estudios detallados de aberraciones cromosó- bridación diferencial de las sondas en GISH
micas estructurales y numéricas, hacer infe- está determinada principalmente por el grado
rencias sobre los mecanismos involucrados en de divergencia del componente repetitivo de
la evolución cromosómica y realizar el segui- los genomas en cuestión. En la medida en que
miento de cromosomas o regiones particulares los dos genomas presenten más secuencias
en las sucesivas generaciones de los progra- en común, mayor será la dificultad para distin-
mas de mejoramiento. Las sondas de secuen- guirlos. Una estrategia para mejorar la capaci-
cias únicas hibridan con el ADN cromosómico dad discriminante de esta técnica consiste en
correspondiente a un locus específico. A dife- realizar un GISH simple utilizando ADN de un
rencia de las secuencias repetidas que pueden genoma marcado (sonda) junto con una deter-
ser localizadas fácilmente por FISH, la detec- minada proporción de ADN sin marcar del ge-
ción de las secuencias únicas es más laboriosa noma que no se va a detectar (sonda fría). En
debido a que, por lo general, las regiones codi- cambio, cuando la diferencia entre las secuen-
ficantes de los genes presentan longitudes me- cias de los genomas considerados es alta se
nores que las detectables por FISH convencio- puede utilizar GISH doble o triple, colocando
nal (10 kb). El empleo de grandes bloques de sobre el preparado mezclas equimolares de las
ADN genómico clonado en vectores, como los sondas marcadas diferencialmente para cada
cromosomas artificiales de bacterias (BACs), uno de los genomas que se quiere distinguir en
en combinación con FISH (BAC-FISH), cons- una metafase. Las regiones cromosómicas que
tituye un método efectivo para el mapeo físico hibridan con una sola sonda se visualizan con
de secuencias únicas de ADN. Sin embargo, el el color original del fluorocromo, mientras que
ADN repetitivo presente en las regiones no colas que presentan complementariedad con dos
dificantes de los insertos muchas veces genera o más sondas presentan colores intermedios.
patrones de señales dispersas o inespecíficas Entre las diferentes aplicaciones de GISH,
(background). A pesar de esta dificultad, hasta se destaca el estudio de la composición ge-
el momento, BAC-FISH constituye una de las nómica de los alopoliploides y de los híbri-
mejores técnicas para correlacionar los mapas dos naturales o artificiales. En estos casos,
genéticos con los físicos, ya que se pueden de- la técnica se basa en la hibridación del ADN
sarrollar sondas específicas para cada cromo- genómico marcado de los probables ancestros
soma o locus en particular. o progenitores sobre las preparaciones cromo-
sómicas del material en estudio. La hibridación
4 Hibridación in situ genómica (GISH) diferencial de las sondas con sólo un subgrupo
de cromosomas en una metafase constituye
Esta técnica se utiliza para identificar los di- una clara evidencia de que el material estudia-
ferentes genomios presentes en un organismo do está compuesto por diferentes genomios.
híbrido o alopoliploide. Aunque aplica todos los Mediante el empleo de GISH se han deter-
principios de FISH, difiere de ésta porque las minado los progenitores probables de algunas
sondas que utiliza están constituidas por ADN especies alopoliploides cultivadas como el ta-

baco, la avena, el trigo y el maní (Fig. 2F). Otra 5 Mapeo por amplificación directa de se-
de las ventajas de analizar los híbridos y los cuencias de interés por PCR in situ (PRINS)
alopoliploides con GISH doble o múltiple, con-
siste en la capacidad que ofrece esta técnica La técnica de PRINS (“primed in situ”) es
para detectar translocaciones intergenó- considerada como una alternativa a ISH para
micas, las que pueden pasar inadvertidas la detección de ciertos tipos de secuencias
con los métodos convencionales de aná- de ácidos nucleicos. Esta técnica involucra la
lisis genómico. Aplicado a células meióti- extensión de cebadores diseñados para las
cas, GISH proporciona un método preciso secuencias blanco por medio de la Taq poli-
para el análisis de los apareamientos cro- merasa. Durante la extensión, se incorporan
mosómicos que ocurren en los genomas nucleótidos marcados con fluorocromos o
híbridos. El estudio de la capacidad de los haptenos a fin de permitir la localización física
cromosomas de aparearse en meiosis es el de las secuencias en forma directa o indirecta
procedimiento utilizado tradicionalmente mediante protocolos adicionales de detección.
para establecer las relaciones genómicas Comparada con FISH convencional, PRINS
entre diferentes especies. Sin embargo, ofrece algunas ventajas tales como: 1) el em-
en muchas configuraciones metafásicas pleo de cebadores diseñados a partir de un mí-
resulta difícil distinguir los apareamientos nimo de información de la secuencia blanco, 2)
ocurridos entre cromosomas homólogos dichos cebadores pueden hibridar con secuen-
de aquellos ocurridos entre cromosomas cias de ADN más fácil y rápidamente que las
homeólogos (i.e. parcialmente homólogos). sondas (de mayor tamaño) usadas en FISH,
Mediante GISH es posible “pintar” los cro- aún en cromatina compacta, 3) no requiere el
mosomas y, de este modo, determinar el marcado de sondas y 4) los cebadores pueden
origen genómico de los cromosomas apa- ser extendidos aún dentro de las secuencias
reados y no apareados, tanto en profase adyacentes (a diferencia de FISH que depende
como en metafase de la meiosis I. La técnica de una secuencia específica), reforzando la in-
de GISH también constituye una herramienta tensidad de la señal para una secuencia corta.
irreemplazable para el desarrollo de progra- Mediante PRINS se han localizado secuencias
mas de mejoramiento vegetal que involucran
repetitivas en tándem (secuencias teloméricas,
hibridaciones interespecíficas o intergenéricas
elementos móviles y ADNr) en cromosomas de
ya que permite: 1) confirmar el origen híbrido
leguminosas (Vicia faba y Pisum sativum) y de
de la progenie, 2) determinar el origen de los
gramíneas (Hordeum vulgare, Avena sativa y
cromosomas en las distintas generaciones,
Lolium multiflorum). Todos los loci encontrados
en particular, cuando los híbridos F1 muestran
fueron coincidentes con los hallados por FISH.
inestabilidad cromosómica tal como la elimi-
Los resultados demuestran que la técnica de
nación cromosómica uniparental, 3) identificar
PRINS es apropiada para la localización rá-
bivalentes interparentales en la meiosis de los
pida de repeticiones en tándem sobre cromo-
híbridos F1 sexuales y 4) comprobar si los cro-
somas vegetales cuando la distancia entre los
mosomas recombinantes son transmitidos a las
siguientes generaciones. Esta técnica también cebadores es pequeña (1 kb) y los blancos son
ha sido utilizada para detectar regiones croma- largos (100 – 500 kb). Sin embargo, no se ob-
tínicas introgresantes, especialmente aquellas tienen buenas señales cuando las secuencias
que portan caracteres agronómicos de interés. repetidas están muy separadas entre sí, como
Un ejemplo de ello es el análisis de una línea ocurre con el gen de la vicilina. Este gen está
élite de cebada introgresada con Hordeum bul- repetido muchas veces en el genoma de Vicia
bosum resistente a roya. Mediante una combi- faba, pero cada copia está separada por una
nación de GISH y FISH se pudo determinar la distancia mayor de 12 kb. En estos casos, el
localización de los fragmentos cromosómicos empleo de FISH resulta más adecuado dado
de H. bulbosum introgresados en el comple- que se obtienen mejores señales. Por otra par-
mento cromosómico de cebada que le confe- te, PRINS no ha presentado ventajas con res-
rían dicha resistencia. pecto a FISH convencional para la detección

de secuencias simples en la mayoría de los características hacen que los cromosomas pa-
casos, aún utilizando PRINS cíclico que invo- quiténicos constituyan el material de elección
lucra de 5 a 10 ciclos de amplificación. Una de para los estudios de FISH de alta resolución,
las mayores desventajas de PRINS es el alto en particular, para identificar secuencias blan-
grado de aparición de señales inespecíficas, co de alrededor de 10 kb y resolver dos loci
probablemente debido a la incorporación de separados por menos de 100 kb.
nucleótidos marcados en los extremos 3ÓH Por otra parte, la técnica de FISH sobre
libres que resultan de roturas espontáneas de cromosomas mitóticos extendidos utiliza
los cromosomas durante el procesamiento del cromosomas metafásicos seleccionados por
material. Estas incorporaciones indeseables citometría de flujo a partir de meristemas ra-
pueden disminuirse mediante el tratamiento dicales sincronizados. El estiramiento de los
con ligasa o incorporando 2´, 3´ - didesoxinu- cromosomas se realiza mediante una digestión
cleótidos (ddNTP) antes de PRINS. moderada con proteinasa K, antes de la fija-
En síntesis, esta técnica es útil para la de- ción con etanol-ácido acético (3:1). Mediante
tección rápida de repeticiones en tándem gran- este procedimiento, se pueden obtener cromo-
des, pero no constituye una alternativa a FISH somas con una longitud de 10 a 100 veces ma-
para la detección de genes de copia simple o yor que la original. Esto permite aumentar la re-
para el pintado de los cromosomas en plantas solución de los arreglos de secuencias génicas
mediante el uso de un cóctel de cebadores y repetidas sobre los cromosomas, sin perder
cromosoma-específicos. la información sobre la orientación relativa con
respecto al centrómero y los telómeros. Esta
6 FISH de alta resolución técnica posee una resolución similar a la que
utiliza cromosomas paquiténicos y es muy útil
Bajo este concepto se agrupan una serie de en aquellas especies en las que la obtención
técnicas que, utilizando los mismos principios de buenos preparados meióticos es dificultosa
de FISH convencional, permiten hacer hibri- o en aquellas que poseen cromosomas paqui-
daciones sobre cromosomas profásicos o aún ténicos difíciles de resolver.
sobre núcleos interfásicos. Estas estrategias
- FISH en núcleos interfásicos: esta técni-
permiten aumentar tanto la resolución como la
ca se aplica a núcleos en cortes de tejidos así
sensibilidad de la detección.
como a núcleos aislados, y permite incremen-
tar tanto la sensibilidad como la resolución de
- FISH sobre cromosomas poco conden-
FISH.
sados: consiste en el análisis de cromosomas
Para el análisis de los núcleos en tejidos,
meióticos en paquitene o de cromosomas mi-
los órganos de la planta se fijan con formalde-
tóticos extendidos.
hído o glutaraldehído (este último en baja pro-
La técnica de cromosomas paquiténicos
porción ya que puede inducir autofluorescen-
se aplica a células madres del polen fijadas en
cia), luego se cortan con micrótomo y los cortes
etanol : ácido acético (3:1) y tratadas con una
se montan directamente sobre un portaobjetos.
mezcla de enzimas (celulasa, pectiolasa y cito- Debido a que la sonda necesita penetrar en el
helicasa) que digieren la calosa de las paredes tejido para alcanzar el interior del núcleo, se
celulares. En general, los cromosomas paqui- realizan diversos pre-tratamientos tendientes
ténicos vegetales son de 7 a 40 veces más a incrementar la permeabilidad de los tejidos
largos que aquellos de metafases mitóticas, y, además, se emplean como sondas frag-
están compuestos por cuatro hebras de ADN mentos marcados cuyo tamaño no supera los
(iguales en los homocigotos), son más acce- 100-500 pb. El análisis de las hibridaciones se
sibles a las sondas (debido a que tienen una realiza con un microscopio confocal, debido a
estructura cromatínica menos condensada) y que este tipo de microscopio permite visuali-
presentan marcadores cromosómicos particu- zar las estructuras mediante la reconstrucción
lares (bloques heterocromáticos y knobs) que tridimensional de las secciones ópticas de la
permiten individualizarlos con facilidad. Estas muestra.

Para el análisis de núcleos aislados, los rondas de amplificación con anticuerpos para
tejidos se disgregan en un buffer de estabiliza- obtener una buena intensidad de las señales.
ción apropiado y la fracción de interés se ob- La principal ventaja de fiber-FISH frente a FISH
tiene por centrifugación y tamizado en mallas en núcleos interfásicos es que se logra una
con diferentes diámetros de poro. Los núcleos mayor sensibilidad (200 pb) y una resolución
aislados se colocan directamente sobre un por- a nivel genómico de 1 kb. Esta técnica es de
taobjetos y se secan al aire y deshidratan en gran utilidad para analizar clones solapantes,
serie alcohólica. Este procedimiento, que tam- detectar rearreglos cromosómicos pequeños,
bién puede ser aplicado a suspensiones celu- determinar distancias físicas entre genes y su
lares, no presenta mayores problemas de per- orientación, medir tamaños de loci y acelerar
meabilidad para las sondas. Las regiones de el clonado posicional. Sin embargo, su utilidad
hibridación de las sondas sobre las secuencias para el mapeo de secuencias es limitada de-
de copia simple se observan como señales in- bido a que sólo permite establecer posiciones
dividuales dentro del núcleo (dos señales en relativas, perdiendo la orientación real de las
los núcleos diploides), cada una de ellas co- sondas con respecto al centrómero y a los teló-
rrespondiente a cada uno de los cromosomas meros. Una variante de esta técnica es el em-
homólogos. pleo de cromatina estirada, un procedimiento
Mediante estas técnicas también se ha es- que involucra la extensión de las fibras croma-
tudiado la organización y la disposición de los tínicas sin remover las proteínas, la que resulta
centrómeros, de los telómeros y de los cro- muy útil para examinar las interacciones ADN-
mosomas en núcleos interfásicos de diferen- proteínas.
tes órganos y tejidos de trigo, arroz, tabaco y
Arabidopsis thaliana. En particular, las mismas 7 Mapas cromosómicos
resultan muy útiles para el análisis de los cam-
bios que se producen durante el ciclo celular Estos mapas constituyen una herramienta
en las diferentes estructuras cromosómicas fundamental para integrar los mapas físicos
dependientes de secuencias. También se em- (basados en el ordenamiento de secuencias y
plean para el mapeo de secuencias separadas el armado de contiguos) y los mapas genéti-
por distancias menores a 500-1000 kb, ya que cos (derivados de los análisis de ligamiento).
en los cromosomas metafásicos las señales de Los mapas cromosómicos permiten posicionar
las sondas separadas por estas distancias se genes y/o marcadores ligados a éstos, con
superponen. respecto a marcadores estructurales propios
de los cromosomas (por ejemplo, centrómeros,
- FISH en fibras de ADN extendidas (fiber- telómeros, bandas heterocromáticas y cons-
FISH): se basa en la hibridación de las sondas tricciones secundarias) o a otros marcadores
sobre fibras extendidas de ADN. Esta técnica cromosómicos desarrollados por FISH. Esta
involucra los siguientes pasos: 1) se aíslan los integración facilita el mapeo y el aislamiento de
núcleos por medio de mallas de nylon de di- genes particulares por métodos convenciona-
ferentes diámetros de poro, 2) se deposita un les y son indispensables para el aislamiento de
pequeño volumen de la suspensión de núcleos secuencias por microdisección y microclonado.
en uno de los extremos de un portaobjetos tra- Para el clonado posicional de secuencias es
tado con poli-L-lisina (este compuesto reduce importante tener una estimación precisa de la
al mínimo la aparición de señales inespecíficas razón kb/cM existente en la región del locus
y favorece la extensión de las fibras de ADN), de interés. Esto posibilita la conversión de las
3) se agrega un buffer de lisis y se realiza la distancias genéticas establecidas entre los
extensión usando un cubreobjetos de manera marcadores y el gen en estudio en distancias
similar a como se hace un frotis de sangre, y físicas. En general, se ha observado que la dis-
4) sobre estos extendidos se realizan las hibri- tancia entre loci en los mapas genéticos (y no
daciones siguiendo el protocolo convencional el orden) puede diferir mucho de la distancia
de FISH. Normalmente, se realizan dos o tres establecida en los mapas físicos. Los estudios

de los nódulos de recombinación en complejos detectar está poco representado en las mues-
sinaptonémicos han revelado que la discrepan- tras, se pueden utilizar protocolos que amplifi-
cia entre los mapas físicos y genéticos es el can la señal mediante el precipitado enzimáti-
resultado de la distribución no al azar de los co de tiramida sobre los sitios blancos (TSA,
eventos de crossing-over a lo largo de los cro- Tyramide Signal Amplification). La aplicación
mosomas. En este marco, el desarrollo de los de TSA en los protocolos estándares de ISH,
mapas cromosómicos ha cobrado importancia consiste en una detección inicial de la sonda
debido a que, dependiendo de las regiones marcada con anticuerpos o estreptavidina con-
cromosómicas que se analicen y a la frecuen- jugados con una peroxidasa (por ejemplo la
cia de recombinación propia de cada una, los de rábano picante, horseradish peroxidase o
mapas genéticos pueden ser mejores o peores HRP). Posteriormente, se agrega al preparado
estimadores de las distancias físicas reales. tiramida conjugada con algún hapteno o fluoro-
Por tal motivo, en varias especies modelo se cromo, la cual es precipitada masivamente por
ha puesto especial énfasis en el desarrollo de la HRP y unida en forma covalente al sitio de
marcadores cromosómicos por las técnicas de detección inicial. El sistema resultante es de-
ISH (principalmente BAC-FISH, y Fiber FISH) tectado mediante anticuerpos conjugados con
para poder integrar los grupos de ligamiento fosfatasas alcalinas (para detecciones cromo-
genético con cromosomas, y para relacionar génicas estándares) o directamente con mi-
las estimaciones de distancia por recombina- croscopía de epifluorescencia. Debido a que la
ción con la distancia física real (Ver capítulo de tiramida adicionada sólo se deposita en las re-
Genómica). giones próximas a la enzima, se logra aumen-
tar significativamente la sensibilidad sin perder
8 Análisis de la expresión génica en teji- resolución. La principal limitante de ARN-ISH
dos por ARN-ISH radica en que, generalmente, se puede anali-
zar una sola sonda por cada hibridación. No
Los protocolos de ISH de ARN resultan apro- obstante, esta técnica se ha utilizado para
piados para describir los patrones temporales y comparar los niveles y sitios de expresión de
espaciales de expresión de un determinado gen secuencias en numerosas especies de plan-
a nivel celular o subcelular. En los organismos tas. Uno ejemplo de ello, es el análisis espacial
multicelulares, ISH constituye un complemento de transcritos expresados diferencialmente en
de los análisis de northern blotting, RT-PCR y plantas con reproducción sexual y apomícticas
microarrays, en los que la extracción de ARN de Paspalum notatum (Fig 2 G y H).
de los tejidos resulta invariablemente en la pér-
dida de información espacial. Asimismo, si bien 9 FISH cuantitativo para estimar la expre-
los microarrays constituyen una de las técnicas sión génica (QUISH)
más poderosas para analizar la expresión de
muchos genes simultáneamente, con frecuen- A diferencia de la técnica de ARN-FISH, que
cia los resultados que se obtienen deben ser utiliza anticuerpos sobre cortes de tejidos para
verificados por métodos independientes tales la detección de la expresión génica, QUISH
como ISH. El análisis de la expresión génica se basa en la hibridación de oligonucleótidos
por ISH generalmente se efectúa sobre cortes gen-específicos marcados con fluorocromos
de tejido, aunque también puede realizarse so- directamente sobre porciones de tejidos u ór-
bre órganos enteros (“whole-mount ISH”, ISH- ganos enteros, combinada con el análisis de
WISH). La técnica se basa en la utilización de secciones ópticas realizadas con un microsco-
una sonda (generalmente cDNA) marcada con pio láser confocal de barrido. De este modo,
haptenos que se hibridará directamente sobre se logra mejorar notablemente la calidad de los
los cortes de tejido. Las detecciones se reali- resultados debido a que se eliminan los pasos
zan con anticuerpos conjugados con fosfata- que generan artefactos e impiden realizar una
sas alcalinas o con fluorocromos. cuantificación precisa. La característica clave
Para aquellos casos en los que el ARNm a de QUISH es la cuantificación de la expresión

génica utilizando como estándar a los genes de giada para realizar estudios de este tipo ya que
mantenimiento celular (genes “housekeeping”, permite unir estructuras nucleares con carac-
GAPDH y 18S ARNr). El empleo de este es- terísticas bioquímicas, tales como la actividad
tándar permite corregir la variación de la razón transcripcional, la replicación del ADN, las mo-
citoplasma/vacuola en los diferentes tipos ce- dificaciones de las histonas y la metilación del
lulares, los efectos ópticos de los tejidos y las ADN mediante la inmunodetección de distintos
señales no específicas. La naturaleza cuantita- blancos celulares con anticuerpos conjugados
tiva de esta técnica hace posible el análisis de con fosfatasa alcalina o con fluorocromos. La
la expresión génica en órganos, a nivel tisular preparación del material, la fijación, la diges-
o celular, independientemente de las diferen- tión de las paredes celulósicas, la permeabi-
cias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. lización y la incubación con anticuerpos se
Este método es mas rápido que los métodos realizan de igual modo que en FISH, aunque
tradicionales y puede utilizarse para estudiar la se omiten los pasos de desnaturalización e hi-
localización celular de la expresión de uno o bridación. Las técnicas de inmunocitogenética
varios genes en un período relativamente corto se emplean para analizar la estructura croma-
de tiempo. Asimismo, con QUISH es posible in- tínica y la disposición de las diferentes molécu-
vestigar los cambios en los niveles de los trans- las que intervienen en las divisiones celulares.
criptos durante la ontogenia o, en respuesta a En particular, estas técnicas son útiles para
cambios de las condiciones ambientales en di- estudiar la distribución de las modificaciones
ferentes líneas de plantas modelo.
histónicas y la metilación del ADN en relación
con la estructura cromatínica en cromosomas
10 Identificación de modificaciones
y núcleos durante el ciclo celular. Merecen es-
cromatínicas por inmunocitogenética
pecial mención aquellos análisis relacionados
con las modificaciones que indican estructuras
La identidad celular está determinada por
cromatínicas abiertas, con potencialidad de
un programa nuclear establecido por un pa-
transcripción, y las que delimitan estructuras
trón complejo de interacciones entre el ADN
y las proteínas. La organización del ADN en cromatínicas cerradas, con actividad transcrip-
la cromatina regula la expresión y el manteni- cional reprimida. El advenimiento de las técni-
miento de la información genética (replicación, cas de citogenética molecular y de inmunocito-
reparación, recombinación y segregación) en genética ha permitido disectar progresivamen-
forma dinámica. Las colas N-terminales de te el núcleo a nivel de microscopía óptica. La
las histonas que conforman el núcleo de los detección individual de complejos proteicos y
nucleosomas están sujetas a diferentes modi- de secuencias de ARNs y ADN ha revelado la
ficaciones pos-traduccionales (acetilación, me- existencia de muchos compartimientos nuclea-
tilación, fosforilación, ubiquitinación, etc.) las res. Las variaciones en la arquitectura nuclear
que, conjuntamente con la metilación del ADN, reflejan la relación existente entre la organiza-
controlan el empaquetamiento de los nucleo- ción nuclear y la regulación génica. El análisis
somas en arreglos de orden superior y proveen de dicha arquitectura incluye varios paráme-
señales para diversos procesos celulares. tros cuantitativos y cualitativos, tales como el
Aunque las histonas y sus modificaciones son tamaño y forma nuclear, el contenido relativo
altamente conservadas, la distribución de las y la distribución de heterocromatina, los patro-
mismas en los cromosomas puede variar a lo nes generales de modificación cromatínica, la
largo de los procesos de diferenciación y del presencia de compartimientos nucleares (nu-
ciclo celular, así como dentro y entre grupos cleolos, cromocentros, territorios cromosómi-
de eucariotas. Recientemente, se han produci- cos y cuerpos nucleares) y la organización de
do grandes avances en el esclarecimiento del los cromosomas en el núcleo (ie. la posición y
llamado código de las histonas y del intrincado la orientación de los cromosomas en el núcleo)
mecanismo de regulación epigenética. La cito- y las diferencias en la condensación cromatíni-
genética se encuentra en una posición privile- ca a nivel local.

11 Análisis de la posición de la inserción Fernández A. and Daviña J.R. 1991. Heterochroma-
de los transgenes tin and genome size in Fortunatia and Camassia
(Hyacinthaceae). Kew Bulletin, 46, 307-316.
Fransz P.F., Alonso-Blanco C., Liharska T.B., Pee-
Diferentes ensayos han demostrado que
ters A.J.M., Zabel P. and Jong J.H. 1996. High-
la expresión de los transgenes puede variar resolution physical mapping in Arabidopsis
significativamente entre especies diploides thaliana and tomato by fluorescence in situ hy-
relacionadas, entre líneas transformadas inde- bridization to extended DNA fibers. The Plant Jo-
pendientes, y aún entre generaciones de las urnal, 9, 421-430.
líneas trasformadas. Los niveles de expresión Küper H., Ort Seib L., Sivaguru M., Hoekenga O.A.
de estas secuencias pueden ser afectados por and Kochian L.V. 2007. A method for cellular lo-
diversos factores, entre ellos, la presencia de calization of gene expression via quantitative in
numerosas copias de la construcción en uno situ hybridization in plants. The Plant Journal,
o varios loci y el contexto genómico en que 50, 159-175.
Laspina N.V., Vega T., Seijo J.G., González A.M.,
se encuentran las copias. La técnica de FISH
Martelotto L.G., Stein J., Podio M., Ortiz J.P.A.,
permite mapear los trangenes en cromosomas Echenique V.C., Quarín C.L. and Pessino S.C.
metafásicos, en núcleos interfásicos o en fi- 2008. Gene expression analysis at the onset
bras extendidas de ADN y, a su vez, determi- of aposporous apomixis in Paspalum notatum.
nar el número de loci en que se encuentran los Plant Molecular Biology, 67, 615-628.
mismos. Para el mapeo se utiliza una sonda Lavia G.I., Fernández A. and Seijo J.G. 2008. Cyto-
marcada correspondiente al transgen y otras genetic and molecular evidences on the evolu-
sondas que permitan identificar los pares cro- tionary relationships among Arachis species. In:
mosómicos, un genoma o un subgenoma par- Sharma A.K. and Sharma A. (eds.). Plant Ge-
ticular (en el caso de híbridos o alopoliploides). nome: Biodiversity and Evolution. Volume 1E:
Phanerogam-Angiosperm. Science Publishers,
Uno de los ejemplos clásicos, en el cual se
Enfield, NH, USA, 2008. pp 101-134.
combinaron diferentes técnicas moleculares y Moscone E.A., Matzke M.A. and Matzke A.J.M.
citogenéticas para analizar los efectos del con- 1996. The use of combined FISH/GISH in con-
texto genómico en la expresión de los transge- junction with DAPI counterstaining to identify
nes fue realizado en tabaco. En el mismo se chromosomes containing transgene inserts in
empleó FISH para mapear los trangenes sobre amphidiploid tobacco. Chromosoma, 105, 231-
los cromosomas y GISH para identificar los ge- 236.
nomas del alopoliploide. A partir de estos es- Robledo G., Lavia G.I. and Seijo G. 2009. Species
tudios, se ha demostrado que, en general, los relations among wild Arachis species with the A
transgenes con expresión estable están locali- genome as revealed by FISH mapping of rDNA
loci and heterochromatin detection. Theoretical
zados en las proximidades de las regiones te-
and Applied Genetics, 118, 1295-1307.
loméricas y ricas en genes, mientras que los de Schwarzacher T. and Heslop-Harrison P. 2000.
expresión inestable se localizan en las regio- Practical in situ hybridization. BIOS Scientific
nes intercalares o paracentroméricas que son Publishers, Oxford, 2000. pp. 203.
más pobres en genes. Por otra parte, la combi- Seijo J.G., Lavia G.I., Fernández A., Krapovickas A.,
nación de FISH con técnicas de inmunocitoge- Ducasse D. and Moscone E.A. 2004. Physical
nética permite analizar el contexto epigenético mapping of 5S and 18S-25S rRNA genes evi-
de la cromatina circundante a los transgenes dences that Arachis duranensis and A. ipaensis
y su relación con la expresión de los mismos. are the wild diploid species involved in the origin
of A. hypogaea (Leguminosae). American Jour-
nal of Botany, 91, 1294-1303.
Lecturas / sitios recomendados
Seijo J.G., Lavia G.I., Fernández A., Krapovickas
A., Ducasse D., Bertioli D.J. and Moscone E.A.
Bennett M.D. 1995. The development and use of ge-
2007. Genomic relationships between the culti-
nomic in situ hybridization (GISH) as a new tool
vated peanut (Arachis hypogaea - Leguminosae)
in plant biosystematics. In: Brandham P.E. and
and its close relatives revealed by double GISH.
Bennett M.D. (eds.). Kew Chromosome Confe-
American Journal of Botany, 94, 1963-1971.
rence IV. Royal Botanic Gardens, Kew, 1995. pp
Solís Neffa V.G. and Fernández A. Karyotypic stu-
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Leiocarpae). 2002. American Journal of Botany,
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Stein N., Ponelies N., Musket T., McMullen M. and
Weber G. 1998. Chromosome micro-dissection
and region-specific libraries from pachytene
chromosomes of maize (Zea mays L.). The Plant
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Terkelsen C., Koch J., Kølvraa S., Hindkjær J., Pe-
dersena S. and Bolund L. 1993. Repeated pri-
med in situ labeling: formation and labeling of
specific DNA sequences in chromosomes and
nuclei. Cytogenetics and Genome Research, 63,
235-237.

I.-Capítulo 4 replicación y reparación de ADN así como de
la replicación de virus y plásmidos y la síntesis
química de secuencias de nucleótidos. De esta
Herramientas Básicas de manera, puede decirse que la tecnología del
Ingeniería Genética ADN recombinante esta integrada por diversas
estrategias metodológicas, muchas de las cua-
Ingrid Garbus, Marisa Gómez les son adaptaciones de procesos naturales de
y Viviana Echenique la genética microbiana que han sido estudia-
dos y se conocen en profundidad.
Introducción
LA CLONACIÓN MOLECULAR O
Hasta principios de los años 70, el ADN CLONACIÓN DE GENES
era la molécula de la célula que planteaba
más dificultades para su análisis bioquímico. La finalidad de la clonación molecular es la
Excesivamente larga y químicamente monóto- obtención de un determinado fragmento de
na, la secuencia de nucleótidos del DNA tan ADN, que puede corresponder a un gen, inser-
solo podía ser estudiada por caminos indirectos to en un vector capaz de replicarse, pudiéndo-
tales como la determinación de la secuencia de se posteriormente amplificar a varios millones
proteínas, o del RNA. Actualmente, es posible de copias, por ejemplo para análisis de se-
separar regiones determinadas del ADN, ob- cuencia o para obtener grandes cantidades de
tener cantidades ilimitadas de esos fragmen- un producto génico.
tos y determinar incluso la secuencia de esos El desarrollo de la tecnología del ADN re-
nucleótidos. Estos adelantos técnicos forman combinante y la clonación molecular han apor-
parte de la tecnología del ADN recombinante, tado sofisticados procedimientos que permiten
de cuyo desarrollo han sido pilares fundamen- el aislamiento, purificación y replicación de
tales el conocimiento de las enzimas de res- fragmentos específicos de ADN. La clonación
tricción, el esclarecimiento de los procesos de de segmentos de ADN, también llamada crea-
ción del ADN recombinante
requiere esencialmente de
las etapas que se enume-
ran a continuación (Fig. 1)
1. Obtención del ADN a

clonar
Según la estrategia ex-

perimental involucrada, el
ADN a clonar puede tener
diferentes procedencias.
Puede tratarse de ADN
de origen genómico, de
un producto de amplifica-
ción por PCR, provenir de
la síntesis in vitro, a partir
de una retrotranscripción
Figura 1. Etapas básicas en la clonación de un fragmento de ADN. En (ADNc) tomando como
primer lugar el ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la mis- molde el ARNm o de la
ma enzima de restricción. Luego se ponen en contacto en presencia de síntesis in vitro de secuen-
la enzima ligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que cias previamente defini-
se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el frag-
das. Cuando el material de
mento de interés.

partida es el ADN genómico, los fragmentos a copias idénticas. Los organismos hospeda-
ser clonados deben ser escindidos mediante el dores utilizados en biología molecular deben
empleo de enzimas de restricción. En algunas contener toda la maquinaria genética para la
situaciones, particularmente cuando se trata amplificación del ADN recombinante. Puede
de la clonación de productos de PCR, los frag- tratarse de organismos procariotas (bacterias)
mentos deben ser aislados en función de su o eucariotas (levaduras, células de mamíferos
tamaño. Este aislamiento se lleva a cabo a tra- cultivadas). En el caso de la utilización de sis-
vés de electroforesis en geles de poliacrilamida temas bacterianos, la introducción se realiza
o agarosa. valiéndose de los procesos naturales de la ge-
nética microbiana o modificaciones específicas
2. Elección del vector de clonación de los mismos. De estos métodos modificados,
el más ampliamente utilizado es el de transfor-
Un vector de clonación es una molécula de mación en célula competente (ver vectores de
ADN que vehiculizará al fragmento de interés y clonación). Otra forma de introducir el ADN en
permitirá su amplificación, resultando de esta la célula hospedadora, de elección para molé-
manera indispensable para la creación del culas de ADN de gran tamaño, es el proceso
ADN recombinante. Uno de los principales re- de electroporación, que consiste en la creación
quisitos para que una molécula de ADN pueda de poros en la membrana celular inducida por
actuar como vector, es la capacidad de auto- descargas eléctricas que permiten la introduc-
rreplicación que irá acompañada de la replica- ción del ADN. Los plásmidos híbridos, introdu-
ción del fragmento inserto. También es nece- cidos a través de alguno de estos procesos,
sario que los vectores tengan un tamaño que continuarán replicándose en la célula hospeda-
permita su manipulación fuera de la célula. Los dora mientras ésta crezca y se divida, siempre
más pequeños se manipulan con mayor facili- que sea mantenida la presión de selección.
dad que las moléculas de ADN más grandes,
que tienden a ser más frágiles. Los vectores de 5. Identificación y selección de las células
clonación más utilizados derivan del genoma que contienen al ADN recombinante
viral o de plásmidos bacterianos. Los compo-
nentes esenciales de un vector de clonación En el esquema de transferencia del ADN re-
son el origen de replicación, un gen marcador combinante al hospedador descripto anterior-
responsable de alguna característica fenotípi- mente, se asume que durante la transforma-
ca para la selección y al menos un sitio único ción, no todas las bacterias reciben una copia
de restricción. del vector híbrido. Es necesario seleccionar
aquellas células que han incorporado el vector,
3. Generación del ADN recombinante a través de la utilización de marcadores géni-
cos presentes en los vectores de clonación. Los
El término ADN recombinante se emplea más comúnmente empleados son los genes de
para hacer referencia al material genético a resistencia a antibióticos y el fragmento funcio-
clonar unido al vector de clonación. Para su nal de lac Z, el gen de E. coli que codifica para
obtención es requisito contar con los dos frag- la enzima β-galactosidasa (β-gal). Estos genes
mentos de ADN en forma pura, y ligarlos en- marcadores tienen insertado un sitio múltiple de
zimáticamente por acción de la enzima ADN restricción (polylinker), de manera que cuando
ligasa, en presencia de ATP. los fragmentos de ADN son clonados en el po-
lylinker del gen lacZ, anulan la actividad de la
4. Introducción del ADN recombinante en β-galactosidasa. Esta enzima hidroliza un com-
el organismo hospedador puesto químico denominado X-gal, y se libera
un colorante azul relativamente insoluble. El
Este proceso es realmente el verdadero X-gal se incorpora al medio de cultivo en placa
evento de clonación, en el cual el ADN re- de Petri donde desarrollarán las células hospe-
combinante es “clonado” para producir varias dadoras del ADN recombinante. Si el ADN clo-

nado se insertó en el polylinker y desactivó la al lector en las herramientas metodológicas de
β-galactosidasa, no se producirá pigmento azul biología molecular más ampliamente utilizadas.
y las células formarán colonias que se verán
blancas en la placa de Petri. Caso contrario las 1. VECTORES DE CLONACIÓN
colonias de las células hospedadoras se verán
de color azul. Cuando el marcador es un gen Como hemos mencionado, un vector es una
de resistencia a los antibióticos, las células se molécula de ADN a la que se unirá el fragmen-
inoculan en medio agarificado que contiene el to de interés resultando en el ADN recombi-
antibiótico cuya resistencia confiere el vector, nante y, debido a su capacidad de autorrepli-
de manera que sólo sobrevivirán aquellas cé- cación, permitirá la amplificación del fragmento
lulas que lo contienen. Luego deberá buscarse insertado. Los vectores de clonación de última
específicamente aquellas células que poseen generación son muy prácticos y sencillos de
el fragmento de interés. Estos dos marcadores manejar. Incluyen un sitio múltiple de clonación
suelen ser utilizados en forma conjunta de ma- o sitio de restricción múltiple (“polylinker”) que
nera que solo las colonias portadoras del veces un segmento corto de ADN con sitios de res-
tor crecerán en medio con antibiótico, y, para- tricción para varias enzimas diferentes, cada
lelamente, las colonias que poseen el plásmido uno de ellos único para el vector (Fig. 2). Este
recombinante serán de color blanco. sitio suele formar parte del marco abierto de
Una vez obtenidas las colonias recombinan- lectura (“ORF”) de un gen responsable de algu-
tes los pasos a seguir incluyen la amplificación
na característica fenotípica, por lo que resulta
de la colonia en medio líquido con antibiótico,
sencillo confirmar si tras la restricción se ha ob-
purificación del plásmido a partir de la suspen-
tenido el plásmido híbrido, ya que la inclusión
sión de bacterias y comprobación de la presen-
del inserto produce la pérdida de funcionalidad
cia del inserto esperado. Para la detección del
del gen mediante inactivación por inserción.
inserto, pueden utilizarse diversas estrategias.
Existen diferentes tipos de vectores de clo-
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
nación, entre los que se incluyen:
se puede utilizar cuando la secuencia del frag-
mento clonado es conocida o para identificar
la secuencia de los fragmentos clonados por A) Plásmidos:
amplificación con sondas complementarias a Son moléculas de ADN circular, de doble
la secuencia terminal del vector. La hibridación cadena, extracromosómicas, presentes en las
molecular con una sonda específica marcada bacterias, que poseen propiedades muy útiles
puede ser utilizada cuando se conoce la se- como vectores de clonación, a saber:
cuencia de interés y se dispone de dicha son- 1. Pequeño tamaño que hace sean fáciles de
da. En otros casos, se realiza la selección en aislar y manipular.
función del tamaño del inserto, para lo que el 2. Son circulares, lo que hace que el ADN sea
plásmido recombinante es digerido median- más estable durante su aislamiento químico.
te enzimas de restricción y posteriormente se 3. Su replicación transcurre independiente-
realiza una corrida electroforética en gel de mente del ADN nuclear en la célula bacteriana.
agarosa. 4. Existen múltiples copias en la célula, de-
pendiendo del plásmido y de la especie hos-
Herramientas y Procedimientos pedadora puede haber de varias a numerosas
Implicados. copias (por ej. 1000 a 3000 copias de pBR322
por célula).
A pesar de que la obtención de ADN recom- 5. La presencia de genes de resistencia a
binante pudo ser explicada a través de cinco los antibióticos que actúan como marcadores
pasos sencillos, es muy amplio el conjunto de seleccionables facilita la detección y selección
herramientas y metodologías experimentales de los clones que los contienen.
que están involucradas en su desarrollo. El El tamaño de los insertos que se pueden clo-
objetivo de esta parte del capitulo es introducir nar puede ser considerable, sin embargo si son

Figura 2. Elementos genéticos que constituyen un vector de clonación. a) Sitio de restricción múltiple que
consiste en un corto segmento de ADN con varios sitios de restricción, cada uno de ellos único para el
vector. b) representación esquemática del plásmido pBR322 con el origen de replicación (Ori) y los genes
marcadores de resistencia a tetraciclina (TETR) y ampicilina (AMPR) que contienen los sitios de restricción de
BamHI y PstI, respectivamente;
mayores de 10 kb, el plásmido se hace gene- tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHI
ralmente inestable. y se liga a un ADN, y luego se aíslan los clones
Aunque en el ambiente natural los plásmidos transformados, aquellos transformantes que
conjugativos generalmente se transfieren por posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina
contacto célula a célula, los plásmidos vecto- no portan ningún ADN clonado. Aquellas célu-
res de clonación generalmente han sido modi- las que continúan siendo resistentes a la ampi-
ficados a fin de evitar su transferencia por con- cilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen
jugación y así lograr su contención biológica. el plásmido con el fragmento del ADN clonado.
Sin embargo, en el laboratorio es posible rea- Como la resistencia a la ampicilina y a la te-
lizar la transferencia a la célula hospedadora traciclina puede determinarse independiente-
por transformación, utilizando choque térmico mente en placas con agar, resulta fácil aislar
en presencia de cloruro de calcio o mediante bacterias que contengan los clones deseados
electroporación. y eliminar las células que no los contengan.
Aunque los primeros plásmidos utilizados
existían en forma natural, los vectores de clo-
B) Bacteriófagos o fagos:
nación actuales constituyen una generación
posterior de vectores construidos in vitro, como
Fago λ: se caracteriza por ser un fago es-
el plásmido pBR322 (Fig. 2). En este plásmi-
pecializado en la transducción (transducción
do, el sitio de restricción de BamHI está dentro
especializada) por lo tanto este fago puede uti-
del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio
lizarse también como vector de clonación para
para PstI está dentro del gen de resistencia a
la ampicilina. Si se inserta un fragmento de un la recombinación in vitro. Es un vector de clo-
ADN en uno de estos sitios, la resistencia al an- nación particularmente útil porque:
tibiótico conferida por el gen que contiene este 1. Se conoce bien su estructura, genética
sitio se pierde (inactivación por inserción). Por molecular y funcionamiento

Puede insertar mayor cantidad de ADN que coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro
la mayoría de los plásmidos (entre 10 y 20 kb) del cromosoma de λ y contienen el origen de
El ADN puede ser eficientemente empaque- replicación y los genes de resistencia a los anti-
tado in vitro dentro de las partículas del fago bióticos de su plásmido parental. Cos proviene
Las partículas del fago son mucho más efi- de sitio cohesivo (“cohesive site”) en referen-
cientes en la infección de las células hospeda- cia a la terminal de simple cadena de 12 bases
doras (transfección) que la transformación. complementaria en el cromosoma de λ madu-
El fago λ tiene un mapa genético comple- ro. El sitio cos es reconocido por el sistema
jo. El tercio central del cromosoma, que con- de empaquetamiento de ADN de λ, haciendo
tiene genes requeridos para la lisogenia pero cortes escalonados que originan los extremos
no para el ciclo lítico, puede ser escindido por cohesivos complementarios en el cromosoma
restricción y substituido por ADN foráneo (Fig maduro del fago. La principal ventaja de los
3a). El ADN recombinante resultante puede ser cósmidos como vectores es su habilidad para
empaquetado en las cabezas del fago in vitro, insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.
pudiéndolas el fago inyectar en E. coli, que se
replica produciendo colonias bacterianas que D) Fásmidos (fagémidos):
contienen los fragmentos a clonar.
Dado que el fago λ silvestre tiene excesiva Son vectores híbridos entre el fago M 13 y
cantidad de sitios de restricción, no es indica- el plásmido pBR323 que contienen los oríge-
do como vector de clonación por lo que se han nes de replicación de ambos. Normalmente la
construido fagos λ modificados (Charon), en replicación depende del plásmido, pero cuando
los cuales los sitios de restricción no deseados una célula que contiene un fásmido se infecta
han sido modificados con un fago de tipo salvaje, el origen del fago
Fago M13 es un fago filamentoso que con- es responsable de la replicación y se generan
tiene ADN monocatenario y se replica sin ma- copias monocatenarias. Este ADN monocate-
tar a su hospedador. Sin embargo, para po- nario es empaquetado en viriones y puede ais-
der usar M13 para la clonación es necesario larse fácilmente y ser utilizado para secuenciar.
disponer de una forma bicatenaria ya que las Habitualmente los fásmidos pueden transportar
enzimas de restricción sólo trabajan sobre de forma estable un fragmento de ADN clonado
ADN bicatenario. El ADN bicatenario de M13 mayor que un vector típico derivado de M13.
puede obtenerse de células infectadas, donde
se encuentra en forma replicativa bicatenaria. E) Cromosomas artificiales:
La mayor parte del genoma del tipo silvestre
contiene información genética esencial para A partir de la creación de proyectos de se-
la replicación. Sin embargo existe una peque- cuenciación de genomas completos se gesta
ña región, llamada secuencia intergénica, que la necesidad de obtener vectores que alber-
puede ser utilizada como sitio de clonación. guen porciones de ADN de mayor tamaño para
Es posible clonar ADN de longitudes variables efectuar el análisis genómico y obtener mapas
hasta 5kb sin afectar la viabilidad del fago. El físicos de cromosomas. El primer sistema de
ADN monocatenario de M13 y de sus vectores clonado de grandes fragmentos de ADN fue
derivados, ha sido extremadamente útil para informado en 1987 por Burke y colaborado-
secuenciar ADN. res, los cromosomas artificiales de levaduras
Tanto en el fago λ como el M13 se ha inser- (YACs), minicromosomas con la capacidad de
tado como marcador el gen lacZ. contener insertos de ADN de 200-500 kbp (Fig.
3b). Los YACs son vectores de DNA lineares
C) Cósmidos: que contienen los elementos esenciales de los
cromosomas de la levadura, como por ejemplo
Son híbridos entre plásmidos y el fago λ y el origen de replicación ARS (Autonomously
combinan las ventajas de ambos como vecto- Replicating Sequence). Introducidos en la cé-
res. Poseen la habilidad del plásmido para re- lula de levadura, los YACs se replican y segre-
plicarse autónomamente en las células de E. gan junto con el complemento cromosómico

Figura 3. Vectores de clonación. Se muestran los elementos genéticos que constituyen los vectores de
clonación. a) Fago lambda. El cromosoma se organiza de acuerdo con las proteínas codificadas por los
genes: C&C: cabeza y cola, genes de proteínas de la cápside, de unión cabeza-cola y de estabilización y
empaquetamiento de ADN, rec: genes de recombinación, proteínas para la integración y escisión del ADN
del fago en el cromosoma de la bacteria hospedadora, reg: genes regulatorios, para el cambio entre los
distintos ciclos del fago, rep: región de replicación, con el origen de replicación y los genes O y P, lisis:
genes que posibilitan la lisis celular, b) Cromosoma artificial de levadura (YAC). ARS: origen de replicación,
CEN: centrómero, TEL: telómeros, URA: gen marcador seleccionable para el desarrollo en medio con ura-
cilo. Amp: gen marcador seleccionable en medio con ampicilina. El ADN es clonado en el sitio BamHI. C)
Cromosoma artificial de bacterias (BAC). Deriva del factor bacteriano F. Su esqueleto contiene regiones
esenciales que le otorgan estabilidad y bajo número de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS:
origen de replicación unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE:
gen de proteína autoregulatoria esencial para la replicación desde oriS. pBeloBAC11, el vector BAC mas
utilizado, tiene tres sitios únicos de clonado, HindIII, BamHI y SphI dentro del gen marcador lacZ.
habitual. El marcador seleccionable suele ser junto con la falta de familiaridad en el manejo
un gen de tipo silvestre que le confiere la cade levaduras entre biólogos moleculares, limi-
pacidad prototrófica a la célula hospedadora. taron el uso de los YACs. Para superar estas
El mas comúnmente utilizado es URA3+, que dificultades fueron desarrollados los cromo-
confiere a las auxótrofos URA3- la capacidad somas artificiales de bacterias (BACs) consti-
de desarrollarse en un medio de cultivo sin ura- tuyen un sistema de clonación que mantiene
cilo. Durante la meiosis los YACs se aparean un bajo número de copias en cada bacteria,
con cualquier YAC homólogo presente, resul- garantizando una recombinación mínima entre
tando en una alta frecuencia de recombina- diferentes fragmentos de ADN y son de sencilla
ción entre los fragmentos clonados. Esta alta manipulación. Los BACs se basan en el plás-
frecuencia de quimerismo lleva a predicciones mido F de 7kb de E. coli y pueden llevar inser-
inexactas en los mapas físicos moleculares y, tos de 300 kb aunque el promedio es de 100

kb (Fig. 3c). Contienen como elementos esen- la de ADN y ser transformadas se denominan
ciales una copia del origen de replicación de E. competentes. Estas células secretan el factor
coli, un marcador de selección que suele ser de competencia, que es una pequeña proteína
un gen de resistencia a antibióticos y un siste- que induce la síntesis de otras 8 a 10 nuevas
ma de recombinación sitio-especifico (cre-lox), proteínas requeridas para la transformación.
cuyo rol consiste en forzar la circularización de La transformación es un proceso que ocurre
grandes insertos. Los cromosomas artificiales sólo en algunas especies bacterianas.
derivados del fago P1 (PACs) permiten la clo-
nación de fragmentos de 80-100 Kpb y, al igual Transducción: se refiere a la transferen-
que los BACs, presentan bajo grado de qui- cia del ADN de una célula a otra por medio de
merismo. El fago P1 se replica primero como un fago, denominación utilizada para los virus
plásmido de bajo número de copias y luego cuando se trata de hospedadores bacterianos.
como un largo segmento de ADN compuesto Esta transferencia de genes puede ocurrir de
por múltiples copias de la secuencia repetida dos maneras:
(concatemero), que es empaquetado en la ca- a) transducción generalizada: una frac-
beza del fago por un mecanismo similar al del ción del ADN celular, que puede proceder del
fago lambda. Las propiedades de los clones cromosoma o del plásmido del hospedador,
PAC permiten la iniciación de empaquetamien- durante el ensamblaje del virus pasa a formar
to en las etapas de clonación, escisión de las parte del ADN de la partícula vírica madura, re-
secuencias de alto número de copias después emplazado el genoma del fago. Una vez que
de la infección bacteriana y la inducción de la son liberados, estos fagos anormales pueden
replicación inmediatamente antes la amplifica- pegarse a otras células y donar ADN, pero no
ción del ADN. Utilizan al igual que los BACs el dan lugar a lisogenia ni a lisis dado que no pue-
sistema cre-lox. den replicarse independientemente por carecer
de gran parte del ADN fágico. Si los genes del
Introducción del vector en la célula donador no sufren recombinación homóloga
hospedadora con el cromosoma de la bacteria de la célula
receptora se perderán.
En el caso de la utilización de sistemas bac- b) transducción especializada (restringi-
terianos, la introducción del vector en la célula da): ocurre sólo en algunos virus atempera-
hospedadora se realiza valiéndose de los me- dos, es decir, aquellos que se integran en el
canismos naturales de la genética microbiana genoma como parte de su ciclo biológico. En
dado que en los procariotas existen mecanis- este mecanismo el ADN de una región especí-
mos de intercambio genético, que permiten fica del cromosoma del hospedador se integra
tanto la transferencia de genes como la recom- directamente en el genoma del fago, reempla-
binación del inserto, a través de uno de los si- zando algunos de sus genes. El genoma fági-
guientes procesos genéticos: co recombinante puede empaquetarse segui-
damente en una cabeza de fago y el resto del
Transformación: es un proceso por cual fago puede ensamblarse normalmente. Este
el ADN libre del medio ambiente se incorpora fago puede carecer de la capacidad de repli-
en una célula receptora, trayendo aparejado car, no obstante puede inyectar su ADN, que
un cambio genético. Una cadena de este ADN contiene además algunos genes de la célula
libre, llamado donador, es captada y puede receptora a una nueva célula receptora. Pue-
transformar genéticamente la célula receptora de también ocurrir recombinación homóloga,
por recombinación con una región homóloga sin embargo, como el ADN donador bacteria-
del cromosoma. El movimiento de las molécu- no está formando parte del genoma de un fago
las de ADN a través de la membrana y den- atemperado se presentan dos posibilidades:
tro del citoplasma de la célula receptora es un que el ADN se integre en el cromosoma del
proceso activo, que requiere energía. Las cé- hospedador durante la lisogenización, o que el
lulas que son capaces de tomar una molécu- ADN se replique en el receptor como parte de

cada extremo del transposón porta con ella
(generalmente) seis nucleótidos de la molécula
una infección lítica. En ambos casos, la partí- hospedadora. (Estas secuencias terminales de
cula vírica transductora es normalmente defec- simple cadena se denominan secuencias aco-
tiva como virus, ya que los genes víricos han plantes). El transposón escindido se circulariza
sido reemplazados. Si bien no todos los fagos entonces como resultado del apareamiento de
tienen la capacidad de transducir, ni todas las entre las secuencias acoplantes. Parece pro-
bacterias son transducibles, el fenómeno está bable que sólo se transfiera una simple cadena
lo suficientemente extendido como para asu- al receptor, y que la cadena complementaria se
mir que desempeña un importante papel en las sintetice, en el receptor, antes de la inserción.
transferencias genéticas que se producen en Las estrategias de introducción de vectores
la naturaleza. en células hospedadoras utilizadas en las téc-
nicas in vitro del ADN recombinante, han sido
Conjugación: mecanismo de transferencia desarrolladas en base a modificaciones de es-
genética mediada por un plásmido que requiere tos procesos naturales de transferencia de ma-
contacto de célula a célula. Ciertos plásmidos y terial genético en procariotas.
transposones conjugativos confieren a sus cé-
lulas hospedadoras la capacidad de transferir 2. Enzimas utilizadas eN la
ADN a otras células por conjugación. La conju- generación de ADN recombinante
gación requiere una célula donadora, que con-
tiene un tipo particular de plásmido conjugativo, El requisito primordial para la clonación
y una célula receptora que carece de él. El pro- de un gen o segmento de ADN de interés es
ceso de conjugación, presenta características poder contar con dicho fragmento en forma
diferenciales según se trate de bacterias Gram individual, aislado desde su entorno génico.
positivas o Gram negativas. En el primer caso, Para ello, la tecnología del ADN recombinan-
las células receptoras secretan un péptido de te cuenta con una herramienta indispensa-
pequeño tamaño que provoca que la célula doble, las endonucleasas de restricción. Estas
nadora sintetice un componente adhesivo en la enzimas reconocen secuencias específicas
superficie celular. El ADN plasmídico es pos- de ADN de 4 a 8 bases de extensión y es-
teriormente transferido desde el donador a la cinden los enlaces fosfodiéster del material
célula receptora adherida. Estos cruzamientos genético en dichos sitios, denominados sitios
pueden tener lugar en medios líquidos. En el de restricción. Para actuar como sustrato de
segundo caso, el plásmido codifica, entre otras estas enzimas, el ADN debe hallarse como
proteínas, las subunidades de la proteína del doble hebra.
pelo sexual, mediante el cual se realiza el con- Son extraídas de organismos procarióti-
tacto. El pelo constituye un puente de conjuga- cos, donde actúan como un mecanismo de
ción a través del cual pasa el ADN permitiendo defensa para degradar material genético
el apareamiento específico. Durante la conju- extraño que entra en la célula, proveniente
gación, pueden resultar movilizados otros ele- principalmente de fagos. Para diferenciar el
mentos genéticos, como grandes bloques del ADN propio del extraño, las bacterias tienen
cromosoma del hospedador u otros plásmidos. la capacidad de metilar su propio ADN inme-
diatamente después de la replicación, ha-
Transposición conjugativa: es una con- ciéndolo de este modo irreconocible por las
jugación independiente del plásmido, un tipo endonucleasas.
de conjugación facilitada por un transposón Las endonucleasas se nombran en relación
conjugativo, que pueden encontrarse tanto en a las bacterias de las que fueron aisladas por
el cromosoma como en los plásmidos. El con- primera vez, considerando que la primera le-
tacto entre las bacterias donadora y receptora tra representa el género de la bacteria, las
induce la escisión del transposón en el dona- próximas dos indican la especie, una cuarta
dor: en cada extremo del transposón (integra- letra indica la cepa, y un número al final indi-
do), se producen un par de cortes alternos de ca el orden en que fue identificada la enzima
modo que al escindirse una de las cadenas en en esa cepa. Según este criterio, la enzima
EcoRI, representa a la primer endonucleasa

Figura 4. Corte del ADN por enzimas de restricción. Reconocimiento y escisión de secuencias palindró-
micas originando: a) extremos cohesivos o b) extremos romos. En este caso puede utilizarse la enzima
transferasa terminal para la incorporación de extremos cohesivos. c) reconocimiento y corte de secuencias
no palindrómicas. Las flechas indican los sitios de corte mientras que las secuencias reconocidas se se-
ñalan en negrita.
aislada en el género Escherichia, especie Las escisiones realizadas por las endo-
coli, cepa RV 13. Se utiliza el término isoqui- nucleasas de tipo II, pueden resultar en
zómeros para las enzimas que reconocen la extremos romos o cohesivos. En el primer
misma secuencia de ADN pero han sido ob- caso, se producen cortes escalonados
tenidas de diferentes especies de bacterias. que crean colas cortas de cuatro bases de
Pueden diferenciarse tres tipos de enzi- cadena simple en cada extremo del frag-
mas de restricción. Las de tipo I y III escin- mento. Estas colas tienden a asociarse
den en sitios alejados de la secuencia de re- con una cadena complementaria por apa-
conocimiento, requiriendo de ATP para reali- reamiento de bases (Fig. 4a), a secuen-
zar el traslado del sitio de reconocimiento al cias complementarias de otro fragmento
de acción y tienen actividad de restricción y con colas generadas por la misma enzima.
metilación simultáneamente. En cambio, las Cuando se generan extremos romos, el
de tipo II cortan en el sitio de reconocimien- ADN es clivado en el centro de la secuen-
to, tienen actividad de restricción exclusiva- cia de reconocimiento, en el mismo punto
mente y reconocen secuencias palindrómi- en ambas cadenas, no quedando bases
cas (secuencias que se leen igual en ambas desapareadas en los extremos por lo que
direcciones). Estas últimas son las utiliza- no presentan tendencia a unirse con otros
das para el clonado de ADN, aunque tienen fragmentos por complementariedad (Fig.
otras aplicaciones como las construcción de 4b).
mapas de restricción de un plásmido o bac- Aunque por su especificad y versatilidad
teriófago, fragmentación del ADN genómico las endonucleasas de restricción son las
para su separación por electroforesis con enzimas las mas renombradas, la tecno-
aplicación en técnicas como “Southern Blot” logía del ADN recombinante no sería fac-
o fingerprinting o la generación de fragmen- tible sin la participación en el proceso de
tos para ser usados como sondas. otras enzimas de roles diversos (Tabla 1).

Enzima Acción Aplicación
Endonucleasas de tipo Clivaje sitio-especifico del ADN Generación de fragmentos de

II ADN
Ligasa de ADN Unión de dos fragmentos de Forma enlaces covalentes

ADN con extremos romos, en entre el extremo 5’ de una
presencia de ATP. cadena polinucleotídica y el
extremo 3’ de otra cadena
Transcriptasa reversa Síntesis de una hebra de ADNc Construcción de bibliotecas de

utilizando como molde ARN. cDNA. Amplificación por PCR
Polinucleotido kinasa Incorporación de un grupo Permite ligado con otro
fosfato al e xtremo 5´de un polinucleótido o incorporación
polinucleótido. de fosfato marcado.
Transferasa Terminal Adición de colas Genera extremos cohesivos
homopoliméricas al extremo oligo dT u oligo dA
3ÓH de ADN doble hebra
lineal
Exonucleasa III Remoción de nucleótidos del Expone los extremos 5´.
extremo 3´ de un ADN doble
hebra.
Exonucleasa del fago l Remoción de nucleótidos del Expone los extremos 3´.
extremo 5´ de ADN doble
hebra.
Fosfatasa alcalina Remoción de fosfatos Impide autoligado de vectores.
terminales de extremos 5´ Permite la incorporación de
fosfato 5´ marcado.
Fragmento klenow Fragmento de una enzima ADN Genera extremos romos desde
polimerasa, con actividad DNA el ext remo 3´, por síntesis
polimerasa y exonucleasa en complementaria o clivaje de
dirección 3'?5'. nucleótidos desapareados.
Tabla 1. Algunas enzimas utilizadas en la tecnología del ADN recombinante
3. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ciones (0,5 - 2%) forman un gel semisólido al

ADN: Electroforesis en gel enfriarse, constituido por una matriz o trama tri-
dimensional de fibras poliméricas, que retarda
La electroforesis es una técnica que permite el paso de las moléculas de ácido nucleico a su
la separación de moléculas en función de su di- través, en función de su tamaño. Los geles de
ferente movilidad en un campo eléctrico, sien- poliacrilamida se forman por la polimerización
do el parámetro esencial su diferencia en carga de acrilamida y bis-acrilamida, catalizada por
eléctrica. Sin embargo, determinados soportes el agente oxidante persulfato de amonio y la
como los geles de agarosa o poliacrilamida, amina terciaria TEMED como agente reductor.
ofrecen una resistencia notable al avance de La variación de la concentración de acrilamida
las moléculas. Aunque el parámetro que rige posibilita la modificación controlada el tamaño
el avance es la relación carga/masa, como en del poro. Estos geles presentan menor rango
los ácidos nucleicos la carga eléctrica es pro- de separación que los geles de agarosa, pero
porcional a la longitud en nucleótidos, la rela- mayor poder de resolución, pudiendo discrimi-
ción carga/masa es la misma para todas las nar fragmentos de ADN con diferencia de ta-
moléculas. Como resultado, el efecto de retar- maño de sólo una base. Se usan además para
do del gel depende del tamaño molecular por la separación y caracterización de proteínas.
lo que la electroforesis separa los fragmentos Para establecer el tamaño de fragmentos
de ácido nucleico según su tamaño o longitud. separados se utilizan marcadores moleculares,
La agarosa es un polisacárido, cuyas disolu- que consisten en una mezcla de fragmentos de

ADN de tamaño conocido, a partir de los que
se puede inferir el tamaño de la muestra anali-
zada. Se establece una curva de calibrado en
la que se consigue la linealidad graficando el
tamaño en función de la inversa de la movili-
dad o el logaritmo del tamaño respecto de la
movilidad.
Dentro de las aplicaciones más comunes de
la electroforesis en gel en biología molecular,
podemos mencionar chequeo de la amplifica-
ción de fragmentos de PCR, identificación de
polimorfismos y la identificación de genes me-
diante el establecimiento de sus patrones de
restricción.
4. Hibridación. Análisis molecular

de ADN, ARN y proteínas
La hibridación es la construcción artificial de

un ácido nucleico bicatenario por apareamien-
to (emparejamiento) de bases complementa-
rias de dos ácidos nucleicos monocatenarios.
Para que exista la formación de híbridos esta-
bles debe haber un alto grado de complemen-
taridad. Se define formalmente como sonda
(“probe”) a un fragmento determinado de ARN
o ADN marcado química o radioactivamente,
utilizado para localizar determinadas secuen-
cias de ácidos nucleicos mediante hibridación.
A) Análisis de ADN por hibridaciones

Southern Blot Figura 5. Método de hibridación de Southern. a) Es-
Los procedimientos utilizados, para separar cisión enzimática o mecánica del ADN; b) inclusión
ácidos nucleicos y proteínas se rigen por el del ADN en el gel de agarosa y corrida electroforé-
mismo principio, pero involucran algunas dife- tica; c) transferencia de las moléculas de ADN des-
rencias de técnicas debidas a las característi- de el gel de agarosa hacia un filtro de nitrocelulosa
cas particulares de cada clase de moléculas. por capilaridad, previa desnaturalización del ADN;
En 1975, E. M. Southern, publicó un nuevo d) hibridación con la sonda monohebra, seguida de
lavados y detección por autorradiografía.
procedimiento que permitió a los investiga-
dores ubicar los genes y otras secuencias de
ADN sobre fragmentos de restricción separa-
dos por electroforesis en gel. La principal ca- sus dos cadenas), ya sea antes o durante la
racterística de esta técnica es la transferencia transferencia, mediante tratamiento alcalino.
de las moléculas de ADN que han sido digeri- Una vez completada la transferencia, el ADN
das por endonucleasas de restricción y separa- es inmovilizado sobre la membrana por expo-
das por electroforesis en gel a una membrana sición a elevada temperatura o a radiación UV.
de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se Una sonda de ADN conteniendo la secuencia
denomina Southern Blot, en honor al científi- de interés es entonces incubada con el ADN
co que desarrolló la técnica (Fig. 5). Para rea- inmovilizado. La sonda sólo va a hibridar con
lizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en moléculas de ADN que contienen la secuencia

de nucleótidos complementaria a su secuencia. agente desnaturalizante de las proteínas. Los
El excedente de sonda no hibridada se elimina polipéptidos separados por electroforesis tam-
mediante repetidos lavados de la membrana. bién pueden ser transferidos del gel a una mem-
Las sondas pueden marcarse por diferentes brana de nitrocelulosa y pueden ser detectados
métodos: con elementos radioactivos, o com- utilizando anticuerpos específicos. Esta trans-
puestos que producen color o luminiscencia, ferencia de proteínas se denomina Western
etc. Luego de la hibridación, la membrana se blotting y se realiza utilizando una corriente
somete a diferentes procedimientos para poner eléctrica para trasladar las proteínas desde el
en evidencia la sonda, de acuerdo al método gel a la superficie de la membrana. Después
con el que haya sido marcada. de la transferencia, la proteína de interés es
identificada mediante la unión a un anticuerpo
B) Análisis de ARN por transferencia e hi- específico que está conjugado (marcado) ya
bridación: Northern Blot sea con isótopos radioactivos, que permiten la
De manera similar al tratamiento realizado detección por autoradiografía, o con enzimas
con las moléculas de ADN, las moléculas de que producen un producto visible cuando se
adiciona el sustrato correspondiente.
ARN también pueden ser separadas por elec-
troforesis en geles de agarosa, transferidas a
5. amplIficacion del adn: reacción
membranas y analizadas. La transferencia de
en cadena de la polimerasa (PCR)
ARN se denomina Northern blot, en reconoci-
miento al hecho de que el procedimiento es la
imagen de espejo de la técnica Southern blot. La PCR constituye una tecnología poderosa
Ambos procedimientos son esencialmen- que involucra la síntesis enzimática in vitro de
te idénticos. Sin embargo, las moléculas de millones de copias de un segmento específico
ARN son muy sensibles a la degradación por de ADN. La reacción se basa en la hibridación
enzimas ARNasas. Por lo tanto, se debe tener de un par de oligonucleótidos, diseñados en
mucha precaución para evitar la contaminación base a la secuencia de interés y sintetizados
de los materiales con estas enzimas. Además, artificialmente, a la secuencia de ADN (Fig 6).
la mayoría de las moléculas de ARN contienen Estos oligonucleótidos funcionan como inicia-
estructuras secundarias (producidas por apa- dores o cebadores (“primers”) que delimitan la
reamiento complementario intracadenas), por secuencia a ser amplificada. La primera etapa
lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas de la reacción involucra la desnaturalización
durante la electroforesis para poder separar- del ADN de doble cadena, por elevación de
las en base a su tamaño. La desnaturalización la temperatura a 92-95°C. Posteriormente co-
se provoca incorporando formaldehído u otro mienzan los ciclos de PCR, que comprenden:
químico desnaturalizante a la solución tampón desnaturalización de la doble cadena, unión
(“buffer”) utilizada en la electroforesis. Después por complementariedad del cebador al ADN
de la transferencia a la membrana apropiada, de simple hebra y replicación del ADN a par-
las moléculas de ARN pueden hibridar con tir del cebador, catalizada por la enzima Taq
sondas de ADN o ARN. polimerasa. La temperatura de unión de los
cebadores al ADN de cadena simple depende
C) Análisis de proteínas por transferencia de la secuencia y tamaño del oligonucleótido,
e inmunodetección o Western Blot así como de la estrategia especifica de trabajo,
La electroforesis en gel de poliacrilamida es comprendiéndose en términos generales entre
una herramienta muy importante para la sepa- los 35-60°C. La fase de síntesis de ADN com-
ración y caracterización de proteínas. Debido a plementario se lleva a cabo a la temperatura
que muchas de las proteínas están compues- óptima para que la Taq polimerasa realice la
tas por dos o más subunidades, las cadenas replicación a partir de cada extremo 3´ de los
polipeptídicas individuales son separadas por cebadores. Se trata de una ADN polimerasa
electroforesis en presencia del detergente do- termo-resistente aislada de Thermus aqua-
decil sulfato de sodio (SDS), que actúa como ticus, bacteria que vive en fuentes termales.

Figura 6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). a) Representación de una reacción de PCR de tres
ciclos. En cada ciclo se suceden tres etapas: i- desnaturalización por calor del ADN (94°C) para separar
las hebras, ii- unión por complementariedad de los cebadores a las monohebras (en este ejemplo 55°C),
iii- reacción de polimerización de por la enzima TAQ polimerasa, dando la hebra complementaria al molde
de ADN (72°C); b) Comportamiento de una fragmento de ADN blanco de los cebadores, a través de los
mencionados ciclos de PCR. En cada ciclo, se incrementa la cantidad de ADN blanco, siguiendo la relacion
2n, donde n es el número de ciclos. En el ejemplo, con tres ciclos de PCR, se obtienen 23 copias. c) Verifi-
cación de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En la calle de la izquierda se muestra el marcador
de peso molecular. En la primera calle, se observan dos fragmentos de 700 y 650 pares de bases (bp),
respectivamente, sugiriendo que el cebador ha encontrado complementariedad en más de un sitio en el
genoma. Las calles 2 y 3 presentan banda única de 700 y 550 bp aaproximadamente en cada caso.
Este ciclo es repetido por algunas decenas de Después de apenas 20 ciclos se logra más
veces y, como el producto de cada polimeri- de un millón de veces la cantidad inicial de la
zación sirve como molde para el siguiente, en secuencia de interés. Esta escala de amplifi-
cada ciclo se duplica la cantidad de producto cación permite, por lo tanto, iniciar el proceso
sintetizado. Es necesario tener en cuenta que, con cantidades mínimas de ADN (del orden de
además de la enzima, los cebadores y el ADN pico o nanogramos) y terminar la reacción con
de interés, para que se produzca la amplifica- grandes cantidades de una secuencia de inte-
ción es necesaria la presencia de un medio rés. La versatilidad de esta reacción es enorme
tamponado y desoxinucleótidos (dNTPs) y clo- y la combinación de la PCR y la secuenciación
ruro de magnesio que actúa como cofactor de constituye una poderosa herramienta para el
la enzima. El resultado de la reacción es un análisis de genes.
fragmento de ADN de doble cadena cuyos ex- Como hemos mencionado, la técnica de
tremos corresponden a los extremos 5´ de los PCR es de suma utilidad para amplificar ADN
cebadores y su tamaño a la distancia entre los a partir de fragmentos clonados en distintos
mismos. A pesar de que se forman moléculas vectores, donde los cebadores son comple-
más largas a partir del molde original en cada mentarios a los sitios del vector que flanquean
ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no el fragmento inserto. La versatilidad de la PCR
contribuyen significativamente a la masa final incluye la amplificación a partir de ADN de ma-
de secuencia blanco. terial embebido en parafina por varios años,

de material momificado, de restos fósiles, etc. sigla (RT- PCR). De lo expuesto es obvio, la ne-
Dentro de los usos mas frecuentes, podemos cesidad de ser específicos en las denominacio-
mencionar la detección de enfermedades gené- nes, sobre todo cuando se combinan ambas téc-
ticas, determinación del sexo en embriones hu- nicas: “Real Time de RT – PCR”
manos, clonación de genes, mutagénesis in vitro
y mapeo y secuenciación de genomas. B) PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiem-
po real (RT-PCR).
A) RT-PCR Una variante de la PCR convencional que se
Se trata de una reacción de PCR, secundaria basa en la detección y cuantificación simultánea
a la transcripción reversa del ARNm, catalizada de la fluorescencia emitida por los productos de
por la enzima transcriptasa reversa (RT). Esta PCR que se acumulan durante el proceso de
enzima es capaz de sintetizar ADN utilizando amplificación. La PCR cuantitativa ofrece la po-
ARN como molde y forma parte de la batería sibilidad de detectar, en tiempo real, el nivel de
enzimática de los retrovirus, virus de ARN que amplificación de una secuencia de interés, con
requieren la síntesis de ADN para ser integrados el objeto de estimar la cantidad de esa secuen-
en el genoma del hospedador. El esquema ge- cia presente en la muestra original. En la PCR a
neral de la RT-PCR consiste en un primer paso tiempo real, los procesos de amplificación y de-
de síntesis de ADN complementario (ADNc) de tección se producen en el mismo vial cerrado, sin
cadena simple tomando como molde el ARN. En necesidad de ninguna acción posterior. Además,
esta etapa, llamada síntesis de la primera hebra mediante detección por fluorescencia se puede
(first strand synthesis) se utilizan cebadores que medir durante la amplificación la cantidad de
pueden ser específicos para el gen de interés, ADN sintetizado en cada momento, ya que la
hexámeros de secuencia al azar u oligodT, se- emisión de fluorescencia producida en la reac-
gún se busque sintetizar sólo el ADNc específico ción es proporcional a la cantidad de ADN forma-
o los ADNc correspondientes a todos los ARNs do. Esto permite conocer y registrar en todo mo-
del tejido en cuestión. Por lo tanto, mientras que mento la cinética de la reacción de amplificación.
el uso de primers específicos aumenta la espe- Los termocicladores para llevar a cabo la PCR
cificidad, los otros dos tipos de cebadores maxi- a tiempo real incorporan un lector de fluorescen-
mizan el número de moléculas de ARNm que cia y están diseñados para poder medir, en cual-
pueden ser analizadas en una muestra peque- quier momento, la fluorescencia emitida en cada
ña de ARN. El uso de hexámeros al azar, puede uno de los viales donde se realice la amplifica-
ocasionar distorsiones por exceso en el número ción. Los sistemas de detección por fluorescen-
de copias de un determinado ARNm, compara- cia empleados en la PCR a tiempo real pueden
do con los cebadores específicos. La segunda ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas
etapa consiste en subsecuentes ciclos de PCR específicas marcadas. Los agentes intercalantes
con los cebadores específicos para la secuen- son fluorocromos cuya emisión de fluorescencia
cia de interés, lo que permite obtener cantida- aumenta notablemente cuando se unen a ADN
des apropiadas del ADN para diversas mani- de doble hélice. El más empleado en PCR a
pulaciones genéticas. Esta estrategia conjunta tiempo real es el SYBR Green I. El incremento
de retrotranscripción y PCR puede ser utilizada de ADN en cada ciclo se refleja en un aumen-
para el estudio de ARNm a nivel de una célula to proporcional de la fluorescencia emitida. Este
individual. Los principales alcances de esta téc- sistema de detección es de fácil implementación
nica incluyen la determinación de la presencia o y mas económico que el uso de sondas especí-
ausencia de un transcripto, estimación del nivel ficas. Sin embargo, presenta baja especificidad.
de expresión y para el clonado de ADNc sin la El riesgo de amplificaciones inespecíficas pue-
construcción de una genoteca. de disminuirse iniciando la reacción de PCR a
La técnica de PCR por transcriptasa reversa temperaturas elevadas (hot-start PCR). Pueden
es denominada como “RT-PCR”, la cual desafor- utilizarse polimerasas recombinantes que funcio-
tunadamente, puede ser confundida con la PCR nan después de ser activadas por temperatura
de Tiempo Real, ya que ambas tienen la misma o polimerasas unidas a anticuerpos que mantie-

nen bloqueado el centro activo de la enzima has- lidad en la eficiencia de amplificación es menos
ta que son desnaturalizados por calor. Además, importante.
la mayoría de los equipos de RT-PCR tienen la
posibilidad de determinar el Tm de los fragmen- C) Variantes de la qPCR
tos amplificados, que depende de su longitud y PCR múltiple: es una variante de la PCR
de la composición de sus bases, resultando ca- cuantitativa en la que se amplifican simultánea-
racterístico de cada fragmento. Las sondas de mente dos o más secuencias blanco en una
secuencia específica, están marcadas con dos única reacción. Este análisis en simultáneo de
tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. varias secuencias optimiza el aprovechamiento
Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, de la muestra cuando se trata de materiales de
denominadas también sondas TaqMan que con- disponibilidad limitada y ofrece la posibilidad de
tienen un fluorocromo de extinción de fluores- realizar controles internos, por ejemplo, la expre-
cencia (Q, quencher) unido en el extremo 3´ y sión de un gen constitutivo en ensayos de expre-
otro reportero (R) en el extremo 5´. Cuando se sión. La PCR múltiple suele ser más complicada
produce la extensión de la cadena de la sonda que la simple adición de varios cebadores a la
por acción de la Taq polimerasa, como resultado PCR cuantitativa simple. Se requiere extremar
del clivaje del extintor por su actividad de exo- los cuidados en cuanto al diseño específico de
nucleasa es emitida la fluorescencia. La fluores- cebadores, sugiriéndose que tengan igual tem-
cencia detectada durante cada ciclo de la PCR peratura de fusión (meeting point, Tm), un conte-
será proporcional a la cantidad de ADN que se nido de GC del 45-60% y que carezcan de homo-
está amplificando. logía entre sí. La alta eficiencia de los cebadores
La confiabilidad de los resultados obtenidos en la PCR individual, no asegura el éxito en la
mediante esta técnica requiere de la realización PCR múltiple, pero aumenta considerablemente
en paralelo una curva patrón en las mismas con- las posibilidades de obtenerlo. La combinación
diciones para conocer la cantidad total de ADN de flouróforos a utilizar en los diferentes cebado-
que se está amplificando. res también debe elegirse de manera cuidadosa,
Ente las principales aplicaciones de PCR en para que no exista superposición entre los es-
tiempo real, podemos mencionar: pectros absorción y emisión entre ellos.
Amplificación y detección de ADN o ARN Análisis de curvas de disociación. Se basa
específico en una muestra. Los blancos de de- en la aplicación de un gradiente de temperatu-
tección pueden estar asociados a la presencia ras creciente después de la PCR para monitori-
de agentes patógenos, resultando una herra- zar la cinética de disociación de los fragmentos
mienta de extrema utilidad para fines de diag- amplificados, pudiéndose establecer su Tm para
nóstico clínico. En el caso del ARNm, debe ser comprobar su especificidad. También permite el
previamente retrotranscripto a cDNA, mediante análisis de mutaciones puntuales, usando una
una transcriptasa reversa que posee actividad sonda complementaria con el ADN de tipo salva-
endo H, es decir, remueve el ARNm permitiendo je, que abarque la posición del polimorfismo. El
que se forme la segunda hebra de ADN. Tam- híbrido formado entre sonda y ADN de tipo salva-
bién puede aplicarse al estudio de las variantes je tendrá una estabilidad mayor que el formado
de “splicing” (corte y empalme de intrones) del entre la sonda y el ADN mutado, puesto que en
ARNm. este caso la complementariedad no es absoluta,
Cuantificación del ADN o ARN diana en la reflejándose en una Tm superior. Adicionalmen-
muestra. Se puede cuantificar la concentración te, permite establecer además, de forma relati-
inicial de ADN (o ARN) diana en la muestra de va, la cantidad de ADN de tipo salvaje y la de
manera muy sencilla, a través de la construcción tipo mutado cuando ambos están presentes en
de una curva de calibrado. El control de la am- la misma muestra.
plificación como medida de la concentración en En la Sección IX, Capítulo 4, se detalla más
la muestra se obtiene en las fases iniciales de este punto y se aplica esta técnica para la de-
la reacción, en las que la concentración de los tección de organismos genéticamente modifi-
reactivos no es limitante y el efecto de la variabi- cados (OGMs).

6. Genotecas nitrógeno liquido para impedir cambios cuali o
cuantitativos de la expresión. La susceptibili-
Una genoteca (“gene library”) es una colec- dad del ARN al clivaje por ARNasas, requiere
ción de fragmentos de ADN clonados que re- de cuidados especiales en el material del labo-
presentan en su conjunto el ADN total de un ratorio a ser empleado en el aislamiento. A par-
organismo de interés o bien el ADNc, que re- tir del ARN total es posible separar el ARNm,
presenta el conjunto de genes que se están tomando ventaja de la característica cola de
expresando en un órgano o tejido determinado poliadeninas que posee en el extremo 3´, me-
o bajo una situación particular o momento de diante cromatografía de afinidad, utilizando
crecimiento o desarrollo. En el primer caso ha- columnas de celulosa que tienen ligados oligo-
blamos de una genoteca genómica, donde se nucleótidos compuestos solo por desoxitimina
encuentran todas las secuencias que se expre- -oligo(dT). Al pasar el ARN por la columna, el
san y no se expresan en el organismo mientras ARNm queda unido por complementariedad
que en el segundo se trata de una genoteca de al oligo(dT), a través de la cola de poliA. Una
ADNc, donde se encuentran solo las secuen- vez separado del ARN total, el ARNm es eluído
cias expresadas. de la columna utilizando una solución tampón
Estas genotecas consisten en una colección adecuada.
bacterias, conteniendo cada una un vector con Estas colas de poliA también son utilizadas
el ADN inserto, dispuestas en pocillos. Las ge- en el próximo paso de clonado, donde fun-
notecas carecen de un catálogo a través del cionan como sitio de unión de los cebadores
cual se pueda saber cuál es el clon que con- oligo(dT), para la reacción catalizada por la
tiene una secuencia de interés, por lo que es enzima transcriptasa reversa. El producto de
necesario realizar un relevamiento de las colo- la reacción es un híbrido ARN-ADN. La princi-
nias bacterianas. Para ello se utiliza una sonda pal limitación de esta técnica radica en que en
de ADN complementaria a la secuencia o gen los casos en los que el ADNc es muy largo, al
buscados, que puede ser conocida o deducirse comenzar en el extremo 3´, muchas veces no
a partir de la secuencia de aminoácidos de la llega la retrotranscripción al extremo 5´. Para
proteína purificada. subsanar esta dificultad, se utilizan primers al
Una de las principales dificultades en el clo- azar de 6 a 10 nucleótidos de longitud y es-
nado de ADN genómico es que algunas se- tán confeccionados de manera de representar
cuencias están representadas una sola vez en muchas secuencias diferentes, por lo que la
el genoma y es difícil hallarlas. Para superar reacción comienza a partir de muchos sitios
esta limitación de la metodología, puede clo- diferentes, no solo del extremo 3´. Cualquiera
narse directamente el ADNc, ya que el número de estas estrategias conduce a la obtención de
de copias del ARNm en el tejido correspondien- un híbrido ARN-ADN, a partir del cual median-
te a un gen que se esta expresando es más te PCR, se obtiene ADN de doble cadena que
elevado. El problema se plantea cuando no se puede clonarse en el vector apropiado.
sabe en qué circunstancias o en qué tejido se Para obtener la segunda cadena, se desarro-
expresa un gen en particular. Actualmente es lló inicialmente un método que tomaba ventaja
posible clonar un ADNc a partir de mensajeros de una “vuelta” o “giro” que da la hebra recién
poco abundantes en la célula, con concentra- sintetizada, como un efecto de cambio de rum-
ciones de 1 a 2 moléculas por célula. bo de la transcriptasa reversa al llegar al final
de la cadena de ARN. Este artefacto provee un
A) Genotecas de ADNc cebador adecuado para la síntesis de la segun-
El primer paso en la construcción de una ge- da cadena de ADN y puede eliminarse, una vez
noteca de ADNc consiste en el aislamiento del obtenida la segunda cadena, con una nucleasa
ARN a partir del tejido o condición experimental S1, perdiéndose parte de la secuencia corres-
planteada. Los cambios en la expresión génica pondiente al extremo 5’ del mensajero.
asociados a la exposición a estímulos diversos, Existe una segunda técnica, que presenta
hacen necesaria la preservación del material dos ventajas sobre la anterior. Una es que ge-

nera moléculas de ADNc más largas y la se- do del fago . Para ello se utiliza la transferasa
gunda es que contiene prácticamente toda la terminal, que adiciona colas de poliA o poliT,
secuencia correspondiente al extremo 5´. Se o se agregan adaptadores, que son sitios ar-
basa en la utilización de la enzima RNasaH, tificiales de reconocimiento de alguna enzima
que reconoce moléculas híbridas ARN-ADN y de restricción que se unen a los extremos de
digiere la cadena de ARN dejando trozos pe- la secuencia. Se trata de oligonucleótidos ar-
queños que permanecen unidos a la primera tificiales (8-12 bp) que se unen al fragmento
cadena del ADNc y sirven como primers para utilizando una ligasa de ADN y son cortados
la ADN polimerasa I, que usa el ADNc original con la enzima de restricción apropiada (Fig.
como molde para sintetizar la hebra comple- 7). Ambos procedimientos sirven para generar
mentaria de ADN. Solo queda un pequeño seg- extremos cohesivos a fin de unir el fragmento
mento de ARN en el extremo 5´. La segunda al vector, que posee extremos cohesivos corta-
cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos por la misma enzima.
dos que son sellados por una ligasa de ADN. Si se utilizan como vectores los plásmidos,
Estas moléculas de ADNc de doble cadena se introducen en las células huésped (bacte-
están listas ahora para ser insertadas en un rias) por transformación, Si se eligen los fa-
vector, que puede ser un plásmido o un deriva- gos, son empaquetados in vitro para formar
Figura 7. Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. El ADN del fago contiene dos sitios de restricción
EcoRI. El ADN de la región central no esencial del fago se reemplaza por ADN foráneo, uniendo los frag-
mentos del fago con el ADN a clonar a través de la enzima ADN ligasa. Es necesario previamente adicionar
al ADNc adaptadores que llevan sitios EcoRI, para generar extremos cohesivos para acoplarse con el ADN
del fago. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por sitios
cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, que se utilizarán
para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de una
molécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. Para la localización del gen de
interés en la genoteca, es necesario hacer una copia de la placa en membrana de nylon, que luego será
hibridada con una sonda para el gen marcada apropiadamente. Si la marcación es radiactiva, por ejemplo,
será revelada por autoradiografía y el clon se identifica por comparación entre la marca de la membrana
de nylon y la placa de bacterias.

partículas víricas, que introducirán su ADN en Por ello, estas sondas oligonucleotídicas están
el hospedador apropiado por infección de un constituídas por una mezcla de todas las com-
césped de bacterias crecido sobre la superficie binaciones posibles. Una de ellas correspon-
de una placa de agar (Fig. 7). Si bien los vecto- derá a la secuencia correcta del gen buscado.
res plasmídicos son más fáciles de manipular, El problema de esta estrategia es el elevado
las genotecas construídas en los fagos poseen número de falsos positivos que pueden dar las
fragmentos de mayor tamaño. secuencias adicionales. Una variante consiste
Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) en usar un menor número de oligonucleótidos
de la genoteca, se obtienen cientos de miles a o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nu-
un millón colonias bacterianas o de placas de cleótidos), eligiendo una región de la proteína
fagos (zonas claras o de lisis resultado de la que contenga el menor número posible de co-
producción de particulas víricas), dependiendo dones degenerados, utilizando el conocimiento
del vector utilizado, cada una conteniendo un de los codones más probables para la especie
fragmento clonado, distribuidas sobre la placa en estudio.
de agar. A fin de realizar la búsqueda de un gen Existen otras técnicas para localizar genes
particular (“screening”), la genoteca es replica- en las genotecas de ADNc, como hibridación
da en membranas de nylon o nitrocelulosa, de diferencial, si se trata de genes expresados en
manera tal que el patrón de placas en la caja diferentes tejidos o la utilización de sondas de
original se vea exactamente reproducido en la regiones conservadas en familias de proteínas
membrana de nylon o filtro (Fig. 7). La búsque- para encontrar genes relacionados o bien la
da se lleva a cabo por hibridación con una son- utilización de vectores de expresión.
da de ácido nucleico, lo cual requiere un cono-
cimiento previo de la secuencia de interés. B) Genotecas Genómicas
Elección de la sonda: En algunos casos, Un genoteca genómica puede obtenerse de
donde parte del gen ha sido clonado, este se cualquier tejido ya que todas las células de un
utiliza para buscar las partes faltantes. Si se organismo tienen la misma constitución genéti-
usa un sonda donde la homología es completa ca. Se encuentran en ella, no solo las secuen-
el “screening” puede realizarse en condiciones cias expresadas sino también las correspon-
de alta rigurosidad (es decir, con lavados más dientes secuencias regulatorias. Pueden utili-
fuertes, que tienden a despegar lo que se ha zarse fagos como vectores, pero sucede que
unido inespecíficamente). Si la sonda no es muchos de los genomas eucariotas son muy
completamente homóloga el “screening” de- grandes, el de mamíferos por ejemplo contie-
berá realizarse a menores temperaturas y uti- ne 3x109 pb de ADN. Si el promedio típico de
lizando concentraciones salinas más elevadas inserto es de 15.000 pb, se necesitarán unos
en los lavados. Si no se tiene conocimiento 200.000 fagos para contener el genoma com-
previo de la secuencia puede construirse una pleto. Para asegurar que todas las secuencias
sonda a partir de la secuencia de aminoácidos estén representadas al menos una vez, los
de la proteína. Cuando se utiliza esta estrate- cálculos estadísticos dicen que deberán ana-
gia, el tamaño mínimo de la sonda debe ser lizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de
de 15 a 16 nucleótidos (que permite encontrar fagos.
secuencias únicas en genotecas de ADNc eu- Por este motivo, especialmente cuando se
carióticos. Generalmente se utilizan sondas de trata de genomas muy grandes, como es el
17 a 20 nucleótidos (correspondientes a 6 ami- caso del genoma humano o de varias especies
noácidos contiguos). Otra consideración a te- vegetales y animales, se utilizan las genotecas
ner en cuenta cuando se construye la sonda es de YACs o BACs.
que existe más de un codón o triplete para defi-
nir la mayoría de los aminoácidos (es lo que se Genotecas genómicas en cromosomas
conoce como la “degeneración” del código ge- artificiales
nético) por lo que un aminoácido puede estar La capacidad de clonar fragmentos de más
especificado por hasta 6 codones diferentes. de 100 kb es crucial para la genómica estruc-

tural, funcional y comparativa de organismos Separación de grandes trozos de ADN:
complejos. Las primeras genotecas genómicas electroforesis de campo pulsáti. Las técni-
fueron construidas utilizando como vectores los cas estándar de separación de ADN en geles
YACs, aunque por sus limitaciones se prefiere de agarosa no son adecuadas para moléculas
actualmente el uso BACs y PACs como vecto- mayores de 10 kb. Esta limitación ha sido sub-
res. Cuando se trata de genomas de plantas, sanada con la electroforesis de campo pulsátil,
pueden utilizarse como vectores los cromoso- en la que el campo eléctrico en el gel de aga-
mas artificiales de bacterias binarios (BIBACs), rosa cambia periódicamente de orientación. De
que presentan la ventaja adicional de pueden esta manera pueden separarse moléculas tan
usarse directamente para transformar plantas grandes como los cromosomas de levaduras
utilizando Agrobacterium tumefaciens. (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación de
Para preparar una genoteca genómica el las moléculas de este tamaño depende de su
ADN es escindido con enzimas de restricción relativa facilidad o dificultad para reorientarse
o mecánicamente al azar, si se desea evitar la en respuesta a direcciones cambiantes de un
presencia de fragmentos demasiado largos o campo eléctrico. Esta técnica puede utilizarse
cortos. Un paso crítico en el proceso es el ais- para hacer mapas físicos a gran escala.
lamiento de moléculas intactas de ADN de ele- Preparación de una genoteca de BACs.
vado peso molecular, esencialmente ADN cro- Como todo proceso de clonación, consiste en
mosómico. Para ello las células se embeben la preparación del vector, aislamiento y diges-
en bloques de agarosa de baja temperatura tión del ADN, selección de los fragmentos por
de gelificación y se tratan con enzimas y otros tamaño, transformación de las bacterias y en-
reactivos para separar el ADN de las proteínas samblado de la genoteca.
celulares y del RNAs. La función del bloque de El vector debe estar purificado, digerido y
agarosa es proteger a las grandes moléculas, defosforilado (cuando se corta con una sola
que, embebidas en esta matriz, se someten enzima, se eliminan los fosfatos terminales,
a la digestión con enzimas de restricción que para evitar la recircularización). La digestión
realicen cortes poco frecuentes (“rare cutters”). del ADN es crítica para obtener fragmentos
La preparación de ADN de alta calidad en plan- adecuados para clonar. Los fragmentos son
tas es más complicada que la correspondiente
seleccionados por electroforesis de campo pul-
para el caso de animales debido a la presencia
sátil y se separan de la matriz de agarosa por
de la pared celular, que dificulta el embebido
digestión de la misma con agarasa o gelasa, o
en bloques de azarosa. Para superar esta difi-
por elusión del ADN desde el gel. Esto permite
cultad se trabaja directamente con los núcleos
construir genotecas con fragmentos de tama-
aislados. Si se desea separar estos fragmen-
ños similares, de aproximadamente 150 kb.
tos por electroforesis, los bloques de agarosa
Estas genotecas de grandes insertos son
conteniendo el DNA digerido pueden ser direc-
consideradas recursos de largo plazo para in-
tamente embebidos en la matriz del gel que se
vestigación genómica y deben ser mantenidas
correrá.
continuamente, especialmente cuando son uti-
La cantidad de clones BACs que constitu-
yen una genoteca, se relaciona con el tama- lizadas para proyectos de secuenciación y ma-
ño del genoma, el tamaño promedio de los peo a gran escala. En general, cuando se va
insertos y la cobertura genómica esperada. a construir una genoteca debe elegirse cuida-
Considerando el tamaño de inserto promedio dosamente el genotipo de la especie utilizada
de los clones BACs, para cubrir cinco veces el como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc.,
genoma, una genoteca de BACs de la especie dado que la misma puede utilizarse para varia-
modelo Arabidopsis thaliana, cuyo genoma es dos propósitos.
pequeño, requerirá la obtención de 7.000 clo- En la Fig. 8 se esquematiza la búsqueda de
nes BACs, mientras que una de trigo candeal, un gen en una genoteca de BACs. Más de-
cuyo genoma es dos ordenes de magnitud ma- talles acerca del ensamblado de los distintos
yor, tendrá que estar compuesta por 500.000 fragmentos clonados puede encontrarse en el
clones. capítulo correspondiente a genómica.

Figura 8. Búsqueda de un gen específico en una genoteca de BACs mediante PCR. Las 180 placas de
cultivo, de 96 pocillos cada una, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, agru-
padas de a 4, en filtros o membranas. Se realiza luego una reacción de PCR con el cebador específico al
ADN obtenido de un tubo que contiene los clones correspondientes a tres filtros, representando 12 placas,
que fueron previamente agrupados. Como control positivo se utiliza el ADN vegetal total, también amplifi-
cado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presencia
del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de los tubos, conteniendo el ADN de 12 placas
de 96 pocillos, en la figura, corresponde al tubo 1, que contiene los clones de las placas 1, 2 y 3. Se rea-
liza en mismo procedimiento con tubos que contienen los clones de cada placa. Cuando se chequean los
conjuntos individuales se encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 3. El producto de PCR se hibrida
luego con este filtro y esto nos dará la posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el
gen de interés.
C) Genotecas de cromosomas específi- dora reconoce el patrón fluorescente típico de

cos o de segmentos de cromosomas cada cromosoma. Algunos cromosomas son
Cuando se busca un gen que se sabe está muy similares por lo que no pueden ser sepa-
ubicado en un cromosoma específico simplifica rados. Se necesita un millón de cromosomas
mucho el trabajo hacer una genoteca de ese para hacer una genoteca. Equipos automáti-
cromosoma solamente. Se trata de una técnica cos pueden hacer este trabajo en unas pocas
que permite separar cromosomas metafásicos horas.
teñidos con el colorante fluorescente Hoechst También puede microdisectarse un cromo-
33258 para regiones ricas en AT y cromomicina soma, tomando un segmento del mismo que
A, para regiones ricas en GC. Los cromosomas tenga la región de interés. En principio se uti-
teñidos fluorescerán cuando se expongan a luz lizó esta técnica para cromosomas grandes,
UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm fácilmente distinguibles por microscopía de
(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A). contraste de fase. Actualmente, la combinación
Las cantidades y proporciones de colorantes con PCR posibilita la aplicación de la técnica a
varían para cada cromosoma y una computa- cualquier cromosoma. Estos son teñidos con

Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son crilamida donde, mediante autorradiografía, se
cortadas con agujas de vidrio ultrafinas y clo- determina el patrón de bandas, que refleja la se-
nadas. Cebadores posicionados en el vector cuencia del ADN (Fig 9). Actualmente se utilizan
permiten amplificar secuencias desconocidas. digitalizadores de imágenes para la lectura de la
El ADN amplificado se clona en un vector apro- autorradiografía.
piado y la localización cromosómica de cada Messing desarrolló una serie de vectores de
clon se determina utilizando hibridación in situ clonado basados en el fago filamentoso M13,
(ver III.5) muy útiles para el secuenciado enzimático, con
los que se utiliza un cebador universal que se
7. Secuenciación del ADN clonado posiciona en un lugar adyacente al sitio de po-
liclonado del vector. La ventaja es que solo una
Una vez que se ha obtenido el clon con el frag- de las cadenas del vector es empaquetada en
mento de interés, el paso siguiente es secuen- las cabezas del fago. Este ADN de simple cade-
ciarlo. La determinación de la secuencia puede na es ideal para utilizar con el método de Sanger.
realizarse por el método químico de Maxam y Actualmente se utilizan fásmidos. La adición de
Gilbert o por el método enzimático de Sanger. El un “fago ayudante” (“helper phage”) a las células
primero consiste en la utilización de compuestos que lo contienen, hace que el ADN del mismo,
que destruyen selectivamente una o dos de las de simple cadena, sea replicado, empaquetado
bases que constituyen el ADN, partiendo de mo- y extruído de la célula. Al ser de menor tamaño
léculas de ADN marcadas radiactivamente en un (aprox. 3000 bp) que M13 permite la inserción
extremo. La destrucción no debe ser total, sino de fragmentos de ADN más largos.
que en promedio cada molécula de ADN indivi- Los proyectos de secuenciación genómica han
requerido métodos de secuenciado más veloces
dual, debe ser clivada una vez. En función del
y económicos. Para ello se ha desarrollado una
compuesto químico utilizado y de las condiciones
técnica llamada Multiplex, que permite manejar
de reacción, se obtienen fragmentos de ADN hi-
mayor cantidad de muestras en menor tiempo.
drolisados a la altura de las bases G, A+G, T+C o
Se utilizan 20 vectores plasmídicos que permi-
C. Se generan fragmentos de distinto tamaño en
ten construir 20 genotecas diferentes a partir del
función de la distancia de la base destruida al ex-
mismo ADN. Cada vector lleva dos secuencias
tremo marcado del fragmento a secuenciar. Los
únicas que flanquean al sitio de clonado, que
productos de las 4 reacciones se corren en un
pueden ser usadas como etiquetas (“tags”) para
gel de poliacrilamida que es revelado por auto-
el ADN clonado y estarán presentes sobre cada
rradiografía y la secuencia del fragmento queda
fragmento a ser secuenciado. Se toma un clon
determinada por el patrón de bandas. de cada una de las genotecas plaqueadas (20
El método de Sanger, se basa en la interrup- colonias) y se mezclan. Se hace crecer el culti-
ción controlada de la replicación enzimática del vo, se aísla el ADN y se secuencian los plásmi-
ADN, añadiendo a la reacción de síntesis junto dos utilizando el método Maxam y Gilbert. Los
con los cuatro desoxinucleótidos, un 2´,3´- di- productos de 12 conjuntos de reacciones de se-
desoxinucleótido (ddNTP) marcado. Los ddN- cuenciación se corren en un gel y se transfieren
TPs pueden ser incorporados al ADN por la ADN a una membrana de nylon. El filtro se hibrida se-
polimerasa pero interrumpe la síntesis de la ca- cuencialmente (es decir, se despega una sonda
dena por carecer del OH en posición 3´, nece- para luego hibridar con las siguiente y así su-
sario para la formación del enlace con la base cesivamente), utilizando como sonda la etiqueta
siguiente. Se preparan cuatro reacciones con de cada uno de los 20 vectores. En cada caso
el ADN molde, el cebador, los cuatro dNTPs, y se van leyendo las secuencias correspondien-
en cada una de ellas diferencialmente un ddN- tes a cada uno de los distintos vectores. De esta
TPS. Con la proporción ddNTP:dNTP adecua- manera, una sola reacción produce datos de 20
da, se generan fragmentos de distinta longitud, clones a la vez.
dependiendo de la distancia de la última base Actualmente existen equipos robotizados
incorporada al extremo marcado del ADN. Estos que pueden llevar a cabo dos de las reaccio-
fragmentos son separados en un gel de polia- nes más limitantes en el proceso de secuen-

Figura 9. Esquema de la secuenciación de ADN por el método de didesoxinucleótidos, de manera a) ma-
nual, usando marcación radiactiva ó b) automática, utilizando ddNTPs que emiten color. Se representa a
la hebra de ADN a secuenciar con el cebador unido por complementariedad. La reacción de síntesis del
ADN complementario por la enzima ADN polimerasa (PCR) se desarrolla: a) en cuatro tubos individuales,
cada uno con los cuatro desoxinucleótidos (dNTPs) y un didesoxinuleótido particular (ddNTP). En general,
el dNTP marcado radiactivamente es dATP; ó b) en un único tubo, con cada ddNTP unido a un marcador
fluorescente diferente. Luego, realiza la corrida electroforética en gel de poliacrilamida y la secuencia es
leída desde la banda más corta (extremo 5’) hacia el de mayor longitud (extremo 3’) de manera: a) manual
ó b) digital, luego de la excitación con láser y emisión de fluorescencia, obteniéndose un cromatograma.
ciado: la detección de las bandas de ADN y la completada los productos de las 4 reacciones
traducción de un patrón de bandas en uno de se mezclan y se corren en una sola calle de un
secuencia. Estos equipos utilizan nucleótidos gel, en un secuenciador automático. A medida
marcados con fluorocromos. Se utilizan 4 co- que los fragmentos pasan a través del láser,
lorantes diferentes, que al ser exitados por lá- sus marcas fluorescentes se excitan y emiten
ser emiten luz de diferente longitud de onda. luz que se detecta mediante un fotomultiplica-
Los colorantes pueden utilizarse para marcar dor. Después de ser procesada por una com-
el primer universal de secuenciación de M13 putadora, la secuencia es mostrada como una
o cada uno de los 4 terminadores de cadena serie de picos o cromatograma, donde cada
didesoxi. En este caso, cada mezcla de reac- uno de los 4 colores representa a un nucleótido
ción con un terminador diferente se marca con diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro:
un colorante diferente. Cuando la reacción es guanina y azul: citosina) (Fig. 9).

Lecturas Recomendadas
Madigan M. T., Martinko J. M. and Parker J. 1999

Brock, Biología de los Microorganismos. Octa-
va edición revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid,
España.
Singleton P. 2004. Bacterias en Biología, Biotecno-
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Sambrook J., Fmitsch E. F. and Maniatis T. 1989.
Molecular cloning: a laboratory manual, second
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Cold spring Harbor.
Southern E. M. 1975 Detection of specific sequen-
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Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levi-
ne M. and Losick Y. R. 2006. Biología Molecular
del Gen. 5ª Edición, Ed. Médica Panamericana.
Madrid.

I. Capítulo 5. identificación visual tales como forma de hoja,
pubescencia, color de fruto, etc. En todos los
casos debe tratarse de caracteres de heren-
Marcadores Moleculares cia monogénica y predecible según las leyes
de Mendel. Muchos de ellos se convierten en
María Carolina Martínez, Marcelo Helguera, importantes descriptores a la hora de inscri-
Alicia Carrera. bir nuevas variedades. Por ejemplo, alrede-
dor de 50 caracteres de plántula, tallo, hoja,
5.1. Introducción espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para
Desde sus comienzos, el objetivo del mejo- inscribir e identificar variedades de trigo en la
ramiento vegetal ha sido seleccionar genoti- Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca
pos superiores a partir de la identificación de y Alimentación de la Argentina. Este tipo de
fenotipos superiores. El grado de éxito en este marcadores contribuyó significativamente al
proceso depende de: i) el número de genes in- desarrollo teórico del concepto de ligamiento
volucrados en el control genético del carácter genético y a la construcción de los primeros
(herencia monogénica o poligénica) y las rela- mapas genéticos de plantas (como por ejem-
ciones interalélicas (dominancia o aditividad), ii) plo, en tomate y maíz). En el mejoramiento de
la influencia del ambiente, que se mide normal- girasol, los primeros híbridos se obtuvieron
mente a través del parámetro heredabilidad. utilizando “color de hipocótile” como marcador
El proceso de caracterización y/o selección se ligado al gen ms de androesterilidad; de este
vuelve más eficiente a través del uso de mar- modo las plantas verdes que eran androesté-
cadores genéticos, definidos como caracteres riles se utilizaban como líneas maternas y las
que presentan polimorfismo o variabilidad ex- plantas con antocianas que eran fértiles se eli-
perimentalmente detectable en individuos de minaban del lote de producción al comienzo de
una población segregante y un tipo de herencia su desarrollo.
predecible según las leyes de Mendel. Esta va- Las principales limitaciones de los marcado-
riación puede considerarse a diferentes niveles res morfológicos son: i) se encuentran disponi-
biológicos, desde cambios fenotípicos heredables en un número restringido de especies ve-
bles significativos (marcador morfológico) hasta getales, utilizadas como sistemas modelo para
la variación de un solo nucleótido de ADN (mar- estudios genéticos, tales como el maíz, el to-
cador molecular). El marcador ideal debería ser mate y la arveja, ii) bajo nivel de polimorfismo,
altamente polimórfico (dentro y entre especies), iii) pueden producir alteraciones fenotípicas
de herencia mendeliana no epistática, insensi- que dificultan el desarrollo de la planta (albinis-
ble a los efectos ambientales, codominante (ca- mo), iv) generalmente de herencia dominante
paz de diferenciar individuos heterocigotas de y en algunos casos poligénica y, v) muchos de
homocigotas), de rápida identificación y simple ellos se expresan en estadio de planta adulta,
análisis, y de detección en los estadios tempra- lo cual prolonga los tiempos de evaluación en
nos del desarrollo de la planta. los programas de mejoramiento.
En la actualidad existe una gran variedad Un enorme espectro de especies vegetales
de marcadores genéticos y a lo largo de este carece de información a este nivel. No obstan-
capítulo desarrollaremos aquellos más frecuente, los marcadores morfológicos permanecen
temente utilizados en plantas. Para una mejor como caracteres útiles en la identificación de
comprensión se propone clasificar los marca- materiales dado que representan un conjunto
dores en las siguientes categorías: i) marcado- de genes que pueden ser evaluados con méto-
res morfológicos, ii) marcadores bioquímicos, dos sencillos y a bajo costo.
iii) marcadores moleculares, iv) marcadores
funcionales o de expresión, vi) marcadores ba- 5.3 Marcadores Bioquímicos
sados en SNPs. Son polimorfismos presentes en ciertas pro-
teínas detectados a través de técnicas bioquí-
5.2 Marcadores Morfológicos micas. El desarrollo de los marcadores bioquí-
Son características fenotípicas de sencilla

micos produjo una revolución en los estudios no presentes en los homocigotas, que se ge-
genéticos en plantas, que hasta el momento neran por la combinación de sub-unidades co-
habían contado con un limitado número de dificadas por los distintos alelos o loci (Figura
marcadores morfológicos. La técnica permitía 1). Finalmente, iv) Compartimentalización
incluir potencialmente a todas las especies de subcelular: se encuentran formas enzimáticas
plantas. En esta parte del capítulo nos referi- localizadas en citoplasma, cloroplasto o mito-
remos a las Isoenzimas y a las Proteínas de condria, codificadas todas por genes nucleares
reserva. pero con diferentes velocidades de migración.
5.3.1 Isoenzimas
Las isoenzimas se definen como diferentes
formas moleculares de una enzima, que po-
seen una actividad catalítica común, es decir
actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cam-
bios en el ADN que codifica estas enzimas
(mutaciones) pueden resultar en cambios en la
composición de aminoácidos, originando pro-
teínas con la misma actividad biológica pero
con diferente carga neta y por lo tanto con dife- Figura 1.
rentes velocidades de migración en un campo
eléctrico. Estas diferencias determinan patro-
nes característicos de migración electroforética Las isoenzimas se extraen por homogenei-
de las formas iso-enzimáticas. Varios factores zación del tejido (semilla, raíz, hoja) en condi-
definen el patrón de bandas o zimograma: i) ciones no desnaturalizantes (que preservan la
Número de genes que las codifican: la pre- actividad catalítica de la enzima) y se analizan
sencia de varios genes codificando para una mediante electroforesis en un soporte sólido,
misma enzima ha sido atribuida a procesos de generalmente almidón. El gel puede ser corta-
duplicación génica y subsecuente divergen- do en capas horizontales y cada una se desti-
cia a través de mutaciones diferentes en cada na a una solución de revelado específica que
caso; ii) Estados alélicos: el proceso más sim- consta de un sustrato, un colorante y cofacto-
ple de generación de nuevas formas enzimá- res, disueltos en un buffer apropiado. La reac-
ticas es la mutación de un gen estructural, las ción que ocurre entre las enzimas presentes
variantes alélicas se denominan aloenzimas. en el gel y el correspondiente sustrato generan
Estos marcadores muestran codominancia productos coloreados que conforman el patrón
(en un individuo diploide ambos alelos de un de bandas. Las metodologías empleadas en
locus son expresados y visualizados). A modo la extracción y electroforesis son relativamen-
de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa te sencillas y rápidas y el equipamiento es de
(ADH), puede comprender varios loci y alelos bajo costo.
con denominación Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Las isoenzimas han tenido un rol prominente
Adh-2b, Adh-2c, etc.; iii) Estructura cuaterna- en estudios de poblaciones vegetales para de-
ria de los productos proteicos: la enzima fun- terminar variabilidad y estructura genética, sis-
cional puede estar compuesta por un número temática y biología evolutiva así como en des-
variable de sub-unidades. En las formas más cripción de germoplasma e identificación de
simples o monoméricas los individuos homoci- variedades. Su aplicación en la construcción
gotas presentan una banda y los heterocigotas de mapas se ha visto limitada por el número
simplemente la suma de ambas. Cuando la es- de marcadores isoenzimáticos disponibles (en
tructura cuaternaria se vuelve más compleja, general menor a 50), y por su reducido poli-
encontramos enzimas activas compuestas por morfismo (2-4 alelos). Por otro lado, las formas
dímeros, tetrámeros, etc. En este caso el indivi- enzimáticas extraídas de hoja o raíz (no así las
duo heterocigota presenta bandas adicionales de semilla) presentan variaciones en relación a

las condiciones ambientales de crecimiento y nados conformando familias. Varios estudios
a la edad del tejido, lo cual afecta la reproduci- demuestran que durante la evolución de estos
bilidad de los zimogramas. No obstante, estos genes se han detectado duplicaciones, trans-
loci representan importantes marcas de refe- locaciones, inserciones de elementos móviles,
rencia para relacionar mapas obtenidos a partir entre otros rearreglos cromosómicos, que se-
de distintos marcadores de ADN. rían los responsables de generar un alto ni-
vel de polimorfismo protéico entre y dentro de
5.3.2 Proteínas de reserva especies.
Las proteínas de reserva son un grupo he- Por ejemplo, en el caso del trigo, las principa-
terogéneo de proteínas presentes en la semi- les proteínas de reserva del grano se denomi-
lla de planta que tienen por función proveer nan gluteninas y gliadinas, estas proteínas son
energía al embrión en los primeros estadios de capaces de polimerizar durante el amasado de
crecimiento. Estas proteínas han sido extensa- la harina formando una red denominada gluten
mente estudiadas en cereales y oleaginosas y de importancia fundamental en la elaboración
se relacionan directamente con la calidad del de pan. Desde un punto de vista genético, las
grano. gluteninas se hayan codificadas en los loci Glu-
Las proteínas de reserva se extraen me- 1 y Glu-3 y las gliadinas en Gli-1 y Gli-2 pu-
diante procedimientos sencillos a partir de las diendo tener cada uno de estos loci 1, 2 o más
semillas y se separan mediante electrofore- genes; mutaciones en estos genes generan
sis en geles de poliacrilamida en condiciones nuevas variantes alélicas. Numerosos estudios
desnaturalizantes (con detergentes). No se electroforéticos han revelado alto grado de po-
requiere detectar actividad enzimática, las pro- limorfismo en el número y la movilidad electro-
teínas se visualizan directamente por tinción forética de estas proteínas y muchos de estos
con Azul de Coomassie evidenciándose los polimorfismos son utilizados como marcadores
polimorfismos como diferencias en la movilidad genéticos para mejorar la calidad panadera del
electroforética. trigo, principalmente en el caso de las glute-
En la mayoría de los cereales, estas proteí- ninas (Figura 2). Las gliadinas muestran pa-
nas están codificadas por varios genes relacio- trones electroforéticos más complejos que las
Figura 2.

gluteninas y han sido utilizadas en la descrip- 5.4.1 Marcadores basados en la hibridación
ción de germoplasma e identificación de varie- del ADN
dades. Como en el caso de las isoenzimas, la
aplicación de proteínas de reserva en la cons- 5.4.1.1 RFLP (Restriction Fragment Length
trucción de mapas genéticos es limitada por el Polymorphism) o polimorfismo en la longitud
número de marcadores genéticos disponibles, de fragmentos de restricción (Botstein et al.,
sin embargo estos loci representan importantes 1980)
marcas de referencia, por ejemplo, para los cro- Son los marcadores moleculares más anti-
mosomas 1 y 6 de trigo, donde están presentes guos y aún son usados para algunas aplica-
los principales genes de gluteninas y gliadinas. ciones importantes como mapeo comparativo y
Para más información sobre estructura, pro- estudios de sintenia entre especies (ver Parte
piedades y rol de las proteínas de reserva en III, Capítulo 2 "Aplicaciones de los Marcadores
grano se recomienda la lectura de la revisión de Moleculares").
Branlard et al. (2001). Este marcador se basa en la comparación de
La principal ventaja de los marcadores bio- perfiles de bandas generados a partir del ADN
químicos es su fácil implementación en el labo- de distintos individuos por digestión con enzi-
ratorio ya que involucran metodologías senci- mas de restricción. Los fragmentos obtenidos
llas, rápidas y de bajo costo. Como desventajas se separan por su tamaño mediante electrofore-
se pueden citar: baja cobertura del genoma, di- sis y se transfieren a una membrana donde son
desnaturalizados y luego hibridados con una
ficultades en la interpretación de los resultados
sonda. Esta sonda es un fragmento de ADN de
(principalmente para las Isoenzimas) y, en el
cadena simple (de secuencia conocida o no)
caso de las proteínas de reserva, dado que mu-
que está marcado radioactivamente. La sonda
chos de los genes codificantes suelen estar es-
se unirá a aquellos fragmentos de restricción
trechamente ligados (familias multigénicas), no
con secuencia complementaria a la misma (ver
se puede asumir independencia entre los loci.
enzimas de restricción y método de Southern
Blot en Parte I, Capítulo 4 “Herramientas bási-
5.4 Marcadores moleculares cas de Ingenieria Genetica”).
Un marcador molecular es simplemente un Para la visualización, la membrana se ex-
segmento de ADN con una ubicación especí- pone a una placa radiográfica. En cuanto a
fica en un cromosoma (punto de referencia) la sonda empleada esta puede ser genómica
cuya herencia puede seguirse en individuos de (con alta proporción de ADN no codificante, no
una población. La secuencia puede pertenecer perteneciente a ningún gen) o de ADNc (cuan-
a regiones codificantes (genes) o sin función do proviene de un transcripto). También puede
conocida. obtenerse a partir de ADN de organelas (mi-
Con el advenimiento de las técnicas moder- tocondrias o cloroplastos). Pueden emplearse
nas de biología molecular (para más detalle ver sondas aisladas de especies relacionadas (por
I.- 4), surgieron diversos métodos de detección ejemplo, sondas aisladas de tomate pueden
de polimorfismo genético directamente a nivel emplearse en papa y viceversa).
de ADN. En la actualidad, se puede obtener un La variabilidad genética presente en el mar-
número prácticamente ilimitado de marcado- cador molecular proviene de diferencias en la
res en cualquier organismo vivo que permiten secuencia del ADN genómico debidas a mu-
analizar la totalidad de la información genética taciones puntuales en los sitios de restricción,
(genoma) de un organismo. a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc.,
Para describir los distintos tipos de marca- que modifican la distancia entre pares de si-
dores moleculares, se seguirá una clasificación tios de restricción generando fragmentos po-
arbitraria en base a las metodologías que em- limórficos (de diferentes tamaños) (Figura 3).
plean para su detección. Todas estas técnicas Un locus RFLP está definido por la combina-
parten, como primer paso, de extraer ADN ge- ción de una enzima de restricción y una sonda.
nómico de la planta bajo estudio. Individuos homocigotas poseen el mismo pa-

satélites, son repeticiones de secuencias de 9 a
100 pares de bases. El número de repeticiones
es variable pero en general es menor a 1000.
Existen dos formas de detectar los VNTR: por
hibridación o por técnicas de PCR. En el pri-
mer caso, el ADN genómico es digerido con
enzimas de restricción que reconocen sitios
adyacentes a la región repetida. Los fragmen-
tos se separan por electroforesis, se inmovili-
zan en una membrana y se detectan mediante
sondas. La longitud de los fragmentos de res-
tricción producidos en diferentes individuos va-
ría de acuerdo al número de repeticiones del
minisatélite. La diferencia básica entre RFLP y
VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En
la técnica de VNTR las sondas están constitui-
das por secuencias homólogas a las secuen-
cias repetidas de los minisatélites, por lo tanto
todos los loci hipervariables del genoma son
detectados simultáneamente, mientras que en
RFLP, las sondas son homólogas a secuencias
únicas del genoma, detectando así uno o po-
cos loci cada vez. De esta manera, en el auto-
rradiograma, al contrario del patrón simple de
bandas obtenido por RFLP, para minisatélites
se obtiene un perfil complejo de bandas múlti-
Figura 3.
ples. Los VNTR tienen la ventaja que además
de explorar el polimorfismo en la longitud de
los fragmentos de restricción en cada locus hi-
pervariable, utilizan también el polimorfismo en
trón de restricción en ambos cromosomas ho- el número y distribución de estos loci a lo largo
mólogos y por lo tanto producen una sola ban- del genoma, posibilitando así la visualización
da. Ejemplos de nomenclatura utilizada para simultánea de diversas regiones del mismo.
loci RFLP son XNpb136 de arroz o Xpsr912-2A Las limitaciones para esta técnica, son las mis-
de trigo, que hacen referencia al laboratorio de mas descriptas oportunamente para RFLP.
origen y a las sondas utilizadas. Los minisatélites también pueden ser detec-
Las ventajas de los RFLPs radican en que tados mediante la amplificación por PCR de los
son altamente reproducibles, codominantes segmentos conteniendo diferente número de
y multialélicos. Por otro lado, cuentan con las repeticiones, utilizando iniciadores o "primers"
desventajas de ser muy laboriosos, difíciles de que flanqueen los VNTR y luego su visualiza-
automatizar, se necesita disponer de las son- ción mediante electroforesis y tinción con bro-
das para la especie en estudio y requieren de muro de etidio. Esta opción se ha vuelto más
infraestructura adecuada para mantener las frecuente con el aumento de información de
sondas y trabajar con radiactivo, lo que los secuencias en bases de datos que permiten el
hace relativamente costosos. diseño de iniciadores flanqueantes a determi-
nados minisatélites. Sin embargo estos marca-
5.4.1.2 VNTR (Variable Number of Tandem dores han sido poco utilizados en plantas.
Repeats) o repeticiones en tandem de número
variable 5.4.2 Marcadores basados en la amplifica-
Los VNTR, también conocidos como mini- ción arbitraria o semi arbitraria del ADN

5.4.2.1 RAPDs (Random Amplified tre distintos individuos consiste en la presencia
Polymorphic DNAs) o ADN polimórfico ampli- o ausencia de fragmentos de ADN amplificado
ficado aleatoriamente (Williams et al. 1990, debido a mutaciones en el sitio de reconoci-
Welsh y McClelland 1990) miento del iniciador, deleciones, inserciones.
La metodología de RAPD fue desarrollada Este marcador no permite diferenciar indivi-
de forma independiente por dos grupos de duos heterozigotas, por lo que es un marca-
Estados Unidos. Un grupo la denominó RAPD y dor dominante. Los marcadores RAPD están
el otro AP-PCR (Arbitrarily Primed-Polymerase basados en una técnica sencilla, de bajo costo
Chain Reaction o reacción en cadena de la po- de implementación, automatizable y no radio-
limerasa con iniciadores arbitrarios). activa. A diferencia de los marcadores basados
La técnica de RAPD es una variante de PCR en PCR convencional no se requiere informa-
que utiliza un solo oligonucleótido de 10 bp ción nucleotídica previa para su desarrollo, se
que hibrida al azar con el ADN en estudio. Para dispone de un número ilimitado de marcadores
que se genere un fragmento RAPD es nece- y el nivel de loci polimórficos es alto. La princi-
sario que el oligonucleótido iniciador hibride pal desventaja de esta técnica es su baja re-
en las dos cadenas del ADN en orientaciones producibilidad entre laboratorios, en el sentido
opuestas suficientemente cercanas (menos de de que pequeñas modificaciones en la técnica
3000 bp) como para permitir la amplificación. como por ejemplo, concentración de ADN ini-
La secuencia del oligonucleótido es aleatoria cial, modelo de termociclador, origen de ADN
al igual que los sitios de hibridación en el ADN, Polimerasa termoestable, etc., pueden alterar
por lo tanto la secuencia amplificada es desco- el patrón de fragmentos de ADN generados por
nocida. El iniciador puede hibridar en distintos RAPD de una muestra.
sitios del ADN sin necesidad de complementa- Relacionados con los RAPDs encontramos
riedad exacta de bases, dado que la PCR se a los marcadores DAF (DNA Amplification
hace con temperaturas de unión del iniciador Fingerprinting) (Caetano Anollés et al. 1991)
bajas, generando varios fragmentos que son y AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) (Welsh y
resueltos mediante electroforesis y posterior McClelland 1990). DAF y AP-PCR son técni-
tinción (Figura 4). Cada banda del patrón de cas similares a RAPD. DAF involucra el uso
amplificación es considerada un locus RAPD, de iniciadores arbitrarios de 5 pares de bases
definido por la secuencia del iniciador y el peso de longitud. Esto incrementa la probabilidad de
molecular. El polimorfismo que se observa en- apareamiento con el ADN molde respecto al
Figura 4.

RAPD y, por lo tanto, resulta en un perfil más va empleando un nucleótido arbitrario (amplifi-
complejo de bandas. La visualización se lleva cación +1 o preamplificación) y luego, este pro-
a cabo por medio de geles de poliacrilamida ducto de amplificación obtenido es empleado
teñidos con plata. AP-PCR utiliza iniciadores como molde en una nueva amplificación em-
ligeramente más largos que la técnica anterior pleando iniciadores que poseen 2 nucleótidos
(aprox. 20 pares de bases). Los productos de selectivos adicionales al anterior (amplificación
amplificación son marcados radiactivamente y +3 o amplificación final); iv) El análisis de los
también pueden ser resueltos por electrofore- fragmentos así amplificados se realiza me-
sis en geles de poliacrilamida. Las ventajas y diante electroforesis en geles de poliacrilami-
limitaciones de estas técnicas son similares a da desnaturalizantes. Si uno de los iniciadores
las descriptas para los RAPD. empleados está marcado radiactivamente, se
visualizará mediante autorradiografía, si uno de
5.4.2.2 AFLPs (Amplified Fragment Length los iniciadores está marcado con un compues-
Polymorphism) o polimorfismos en la longitud to fluorescente, puede ser resuelto empleando
de fragmentos amplificados (Vos et al. 1995) un secuenciador automático. Alternativamente,
Los marcadores AFLP constituyen una he- se puede visualizar mediante tinción con nitra-
rramienta poderosa de análisis del genoma to de plata (Figura. 5).
dado que poseen un alto poder de detección
de la variabilidad genética. El ensayo de AFLP
combina la especificidad, resolución y poder
de muestreo de la digestión con enzimas de
restricción con la velocidad y practicidad de la
detección de polimorfismos mediante PCR, sin
necesidad de disponer de información previa
del genoma a estudiar. Desde su desarrollo y
divulgación esta técnica se utiliza ampliamente
en el análisis de plantas.
Consiste esencialmente en cuatro etapas: i)
el ADN genómico es cortado con dos enzimas
de restricción. Generalmente una es de corte
raro (ej. EcoRI), que reconoce de 6 a 8 pares
de bases y otra es de corte frecuente (ej. MseI)
que reconoce 4 pares de bases; ii) fragmen-
tos de ADN doble cadena de 20 a 30 pares de
bases llamados adaptadores se ligan en forma
específica a los extremos de los fragmentos
obtenidos en el paso anterior, generando así el
molde para la amplificación posterior del ADN;
iii) se amplifican selectivamente fragmentos
por PCR. En esta etapa, se utilizan iniciadores
de aproximadamente 20 nucleótidos que con-
tienen una secuencia específica complementa-
ria a la secuencia de los adaptadores y ade-
más, 1 a 3 nucleótidos selectivos adicionales
de secuencia arbitraria en su extremo 3´. Dado
que sólo una subpoblación de los fragmentos
originales es amplificada, se obtiene un patrón
de bandas que permite un registro adecuado.
La amplificación descripta en iii) se realiza en
dos etapas: una primera amplificación selecti- Figura 5.

La base genética del polimorfismo de AFLP marcadores incluidos en la presente categoría
es la ausencia o presencia de fragmentos am- requieren del diseño de iniciadores específicos
plificados de un tamaño determinado dado por para la amplificación de un locus en particular.
mutaciones puntuales, inversiones, insercio-
nes y deleciones que llevan a la pérdida o ga- 5.4.3.1 Microsatélites (Litt y Luty 1989)
nancia de un sitio de restricción o la alteración Los microsatélites son regiones hipervaria-
de la secuencia reconocida o amplificada por bles del genoma que contienen arreglos de se-
los iniciadores. Al igual que en los RAPDs, no cuencias simples en tandem de mono, di, tri,
es posible distinguir individuos heterocigotas tetra o pentanucleótidos que se repiten entre
por lo que se trata de un marcador dominante. 10 y 100 veces. Los marcadores microsatéli-
Una banda AFLP se interpreta como un locus, tes, también denominados Simple Sequence
definido por las dos enzimas de restricción, Length Polymorphism (SSLP), Simple
una combinación de primers que incluyen las Sequence Repeat Polymorphism (SSRP),
bases selectivas (Ej. EcoRI-ATC/MseI-AAG) y Simple Sequence Repeats (SSR) o Sequence-
un peso molecular. Tagged Microsatellite Sites (STMS) se encuen-
Su implementación en laboratorio requie- tran distribuidos por todo el genoma de la ma-
re de una infraestructura considerable, son yoría de las especies eucariotas.
relativamente laboriosos para su obtención Los microsatélites se detectan mediante su
y el costo es medio a alto. Estos marcadores amplificación por PCR usando iniciadores es-
presentan un alto poder de detección de la pecíficos de 20 a 30 pb de longitud que hibri-
variabilidad genética, ya que se explora simul- dan en la región que flanquea al tandem de
táneamente el polimorfismo de ausencia/pre- repeticiones (microsatélite). Estos marcadores
sencia de sitios de restricción (como los RFLP) se resuelven por electroforesis en geles de po-
y la ocurrencia o no de amplificación a partir liacrilamida en condiciones desnaturalizantes,
de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). mediante tinción con plata o por autoradiogra-
Es un marcador mucho más robusto que los fía (en el caso de usar un iniciador marcado
RAPDs, ya que en la amplificación se utilizan radioactivamente). Si se dispone de un se-
oligonucleótidos más largos, que aumentan cuenciador automático, se pueden resolver por
significativamente la especificidad de la reac- tamaño en este equipo mediante el empleo de
ción sin perder las ventajas de la amplificación un iniciador marcado con un fluoróforo, posibi-
de secuencias al azar (no requiere información litando un análisis automatizado.
previa de secuencia de ADN). Asimismo, se La base genética del polimorfismo detecta-
pueden emplear distintas enzimas de restric- do en microsatélites se basa en la variabilidad
ción e iniciadores selectivos, resultando en una del número de repeticiones en tandem y, con-
ilimitada posibilidad de generar polimorfismos. secuentemente, en el tamaño del microsatéli-
Otra ventaja de los AFLPs es el número de te amplificado en individuos de una especie.
fragmentos (marcadores) obtenidos por reac- Estas diferencias son originadas durante la re-
ción y resueltos por electroforesis (oscila entre plicación del ADN debido a fallas en la acción
30 - 50 contra los 4 – 10 de RAPDs). de la ADN polimerasa durante el copiado de
Una variante de esta técnica es la llama- una región repetida donde incorpora o elimina
da cDNA-AFLP que, en vez de ADN genómi- repeticiones. Otro mecanismo responsable de
co, parte de ARN mensajero que es copiado la variación es el entrecruzamiento desigual
a ADNc. Esta metodología es empleada en entre cromosomas homólogos. En este caso
análisis de expresión diferencial de genes, es- se generan alelos con diferencias mayores en
tudios del transcriptoma y genómica funcional. el número de repeticiones.
El desarrollo de marcadores microsatélites
5.4.3. Marcadores moleculares basados en requiere del conocimiento de las secuencias
la amplificación sitio-específica del ADN flanqueantes adecuadas para el diseño de
En contraste con los marcadores basados en los iniciadores específicos. Los primeros SSR
la amplificación de secuencias arbitrarias, los se desarrollaron a través de un proceso ex-

perimental complejo que implicó la obtención calizado entre ellas. Conceptualmente, sería
de genotecas enriquecidas en microsatélites, similar a RAPD empleando un iniciador con la
secuenciación, diseño de iniciadores aptos secuencia repetida del microsatélite.
para amplificar microsatélites por PCR y se- ISSR (Inter-SSR amplification): se basan en
lección de loci con patrones de herencia sim- la amplificación por PCR empleando iniciado-
ple. Actualmente, las secuencias flanqueantes res que contienen en su secuencia repeticiones
pueden obtenerse a partir de las secuencias de di o trinucleótidos junto con 4 bases nucleo-
depositadas en las bases de datos (búsqueda tídicas determinadas en uno de sus extremos.
in silico). El uso de programas informáticos es- Esto permite la amplificación parcial de todas
pecializados en la búsqueda de microsatélites las regiones (potencialmente) amplificadas por
ha revelado que existen secuencias con estas el marcador MP-PCR, descripto anteriormente,
características formando parte de secuencias aumentando la reproducibilidad, que es una de
que se expresan (genes), denominándose SSR las limitaciones del uso de los MP-PCR. Al te-
génicos o EST-SSRs. Aunque tendrían un nivel ner en el iniciador esas 4 bases extras, a este
de polimorfismo menor, serían más fácilmente tipo de marcador se lo conoce también como
transferibles entre especies relacionadas. microsatélite anclado (AMP-PCR, Anchored
Un locus SSR está definido por las secuen- Microsatellite-Primed PCR).
cias de los iniciadores flanqueantes al micro- SAMPLE (Selective Amplification of
satélite. Por el alto polimorfismo que suelen Microsatellite Polymorphic Loci) o amplificación
presentar por locus (multialelismo) se los con- selectiva de loci microsatélites polimórficos. En
sidera los marcadores ideales para el mejora- esta metodología se amplifican loci microsatéli-
miento en especies autógamas como el trigo. tes a partir de un iniciador arbitrario empleando
Estos marcadores son codominantes (ambos dos técnicas: microsatélites y AFLP. Se reali-
alelos de un individuo heterocigota pueden ser zan todas las etapas de AFLP, es decir, diges-
visualizados), genoma-específicos y altamente tión con dos enzimas de restricción, ligación de
polimórficos en comparación con los RFLPs y adaptadores, preamplificación y amplificación
RAPDs. Su implementación en un laboratorio selectiva del ADN. Sólo que en la amplificación
requiere de mayor infraestructura y presupues- selectiva final, se emplea el iniciador de AFLP
to que los RAPDs, siendo semejantes en este con sus tres nucleótidos selectivos en combi-
aspecto a los AFLPs. nación con un iniciador SAMPLE. Este inicia-
dor, posee en su secuencia bases complemen-
5.4.3.2 Otros marcadores basados en los tarias a un microsatélite. La banda polimórfica
microsatélites resultante de la amplificación del ADN con el
Una de las limitaciones para la utilización de marcador SAMPLE puede ser convertida en un
los marcadores microsatélites es la necesidad marcador microsatélite convencional, a parir
de conocer las regiones que flanquean a las del clonado y secuenciación de la misma.
repeticiones para poder desarrollar los inicia-
dores específicos. Así, se desarrollaron mar- 5.4.3.3. STS (Sequence-Tagged Sites) o
cadores moleculares buscando explorar las sitios marcados por secuencias (Olson et al.
repeticiones microsatélites sin necesidad de 1989)
secuenciar el ADN. Entre esta clase de marca- STS es un término general dado a un locus
dores podemos encontrar: en particular definido por las secuencias de sus
MP-PCR (Microsatellite-Primed PCR): en el iniciadores específicos. Un STS puede ser ge-
desarrollo de este marcador molecular, se uti- nerado para cualquier sitio del genoma siem-
liza un iniciador que contiene las repeticiones pre y cuando ese sitio (locus) pueda ser clona-
de un microsatélite específico para amplificar do y secuenciado. Un STS debe satisfacer dos
el ADN. En las regiones del ADN que poseen condiciones: se debe conocer su secuencia,
las dos secuencias inversamente orientadas que permite diseñar iniciadores específicos
de este microsatélite específico hibridará el que permitirán su amplificación por PCR, y te-
iniciador y amplificará el fragmento de ADN lo- ner una localización única en el cromosoma o

genoma estudiado. Estos marcadores son su- Una segunda variante de los STS son
mamente usados en mapeo físico detallado de los marcadores CAPS (Cleavage Amplified
genomas grandes para ensamblar, por ejem- Polymorphic Sequence) o "secuencia poli-
plo, clones de BAC entre sí. mórfica amplificada y clivada”, (Konieczny y
Alternativamente, para una utilización más Ausubel 1993). En esta técnica, también cono-
eficiente de marcadores moleculares en pro- cida como RFLP-PCR, un fragmento de ADN
gramas de mejoramiento existe la posibilidad es amplificado por PCR, luego digerido con
de convertir marcadores complejos y costosos enzimas de restricción y resuelto por electrofo-
o inestables como RFLPs, AFLPs y RAPDs, en resis en agarosa o poliacrilamida. Este método
marcadores PCR alelo-específicos, que son aprovecha la capacidad que posee la técnica
económicos, robustos y de sencilla implemen- de PCR de amplificar segmentos específicos
tación en cualquier laboratorio de biología mode ADN con la capacidad que poseen las en-
lecular (los marcadores PCR alelo-específicos zimas de restricción de cortar el ADN en se-
también serían STS en el sentido de que se tra- cuencias blanco de la enzima de restricción. La
ta de una secuencia de ADN corta que identifi- base genética del polimorfismo detectado por
ca un locus específico del genoma y puede ser el marcador CAPS es la presencia/ausencia de
amplificada por PCR). La estrategia consiste en sitios de restricción en la secuencia amplifica-
aislar el fragmento de ADN polimórfico del gel, da por PCR. Este marcador permite identificar
se clona, se secuencia y se diseñan iniciadores individuos heterocigotas, por lo que se compor-
específicos de alrededor de 20 pb, para amplifi- ta como marcador codominante (Figura 6).
car por PCR dicho fragmento. Cuando se parte Los marcadores STS y sus variantes SCAR
de un fragmento RAPD, el marcador derivado y CAPS, tienen la ventaja de requerir un ensa-
mediante este proceso ha sido descripto como yo metodológico sencillo y altamente reprodu-
SCAR (Sequence Characterized Amplified cible por los que son fácilmente transferibles a
Region, Paran y Michelmore 1993). otros laboratorios, permitiendo que sean muy
El problema que enfrentan estas estrategias usados en selección asistida por marcadores.
suele ser el bajo nivel de polimorfismo entre Asimismo, según las características de su dise-
variedades de una misma especie (trigo, soja, ño, pueden ser codominantes y ser analizados
etc), lo que disminuye las posibilidades de en- en simultáneo varios loci STS en un mismo gel.
contrar mutaciones útiles para desarrollar estos Actualmente, dada la disponibilidad de se-
marcadores. De todos modos, existen antece- cuencias en base de datos es posible también
dentes exitosos de desarrollo de marcadores diseñar marcadores STS directamente a partir
de PCR alelo-específicos en trigo para carac- de secuencias de interés (secuencias genómi-
teres de interés agronómico como pueden ser cas, secuencias ESTs, etc) evitándose de este
alelos de gluteninas, genes de resistencia a modo el trabajo previo de secuenciación del
patógenos, genes vinculados a adaptación, etc. STS.
Figura 6.

5.5 Marcadores Funcionales o de Los GTMs se basan en polimorfismos dentro
Expresión de genes, independientemente de si se cono-
cen o no sus funciones. Estos marcadores se
En la actualidad, las tecnologías de marca- pueden desarrollar a partir de secuencias dis-
dores moleculares en plantas superiores han ponibles en las bases de datos (cDNA/EST/se-
sufrido un cambio. Así, la mayoría de los mar- cuencias genómicas que representan genes) o
cadores descriptos anteriormente derivan del a partir de genotecas de ADN genómico enri-
ADN genómico, y por lo tanto pueden perte- quecidas para secuencias de genes. Un ejem-
necer a regiones transcriptas y no transcriptas plo de GTMs son los Análogos a Genes de
del genoma. Estos marcadores basados en Resistencia (Resistance Gene Analogs, RGAs)
ADN derivado de cualquier región del geno- que son marcadores basados en secuencias
ma, han sido descriptos como marcadores de derivadas de genes de resistencia a patóge-
ADN al azar (RDMs: Random DNA Markers). nos. Las secuencias RGAs son útiles para la
Sin embargo, durante los últimos años se ha identificación de nuevos genes de resistencia a
observado una fuerte tendencia hacia el desa- patógenos en plantas.
rrollo de marcadores moleculares derivados de
la región transcripta del genoma (genes). Esto 5.5.3 Marcadores Funcionales propiamente
ha sido posible gracias a la disponibilidad de dichos (FM: Functional Markers)
un gran número de secuencias de clones de El desarrollo reciente de varios proyectos de
ADNc (ARNm transcripto a ADN empleando genómica estructural y funcional en especies
transcriptasa reversa, también conocidos como cultivadas, ha generado un enorme caudal de
Expressed Sequence Tags o ESTs), en bases información a nivel de secuencias y esto ha po-
de datos públicas (TIGR, NCBI; EBI, etc., ver sibilitado el desarrollo de un nuevo tipo de mar-
Parte I, Capítulo 12, Análisis informático de se- cadores denominados marcadores funcionales
cuencias moleculares). (FM). Estos marcadores derivan de motivos
Los tipos de marcadores desarrollados a polimórficos (mutaciones) dentro de los genes,
partir de la región expresada del genoma son y estos polimorfismos afectan directamente la
numerosos, complejos y variados. Sólo se des- expresión fenotípica del carácter asociado al
cribirán en detalle aquellos marcadores más gen (Andersen y Lübberstedt 2003). Los FM
relevantes y que no fueron enunciados ante- reciben también el nombre de marcadores
riormente, recomendándose la lectura de la re- diagnósticos, marcadores de genes blanco o
visión de Gupta y Rustgi (2004) para informa- marcadores perfectos (perfect markers).
ción adicional. El desarrollo de FM requiere de secuencias
alélicas de genes caracterizados funcional-
5.5.1 Marcadores COS (Conserved mente, a partir de los cuales puedan identifi-
Orthologue Set) carse motivos polimórficos funcionalmente res-
Los marcadores COS representan genes ponsables de afectar el fenotipo de la planta.
funcionales conservados en un amplio rango El primer paso en el desarrollo de FM es dis-
de plantas dicotiledóneas. Inicialmente, estos poner de la secuencia de un gen con una fun-
marcadores fueron desarrollados a partir de ción asignada. En Arabidopsis, menos del 10%
la comparación de la secuencia genómica de de sus aproximadamente 25.000 genes han
Arabidopsis con la base de datos de ESTs de sido caracterizados funcionalmente. En otras
tomate. Se postula que estos marcadores po- especies, el número de secuencias caracteri-
drán ser aplicados en el mapeo comparativo zadas funcionalmente es sustancialmente me-
entre genomas emparentados y, por lo tanto, nor. Sin embargo, considerando la identidad de
serán útiles para estudios taxonómicos y en la secuencias es posible asignar funciones putati-
deducción de las relaciones filogenéticas. vas (probables) a un 30-50% de las secuencias
expresadas (ESTs) en otras especies. Esta es-
5.5.2 Marcadores GTMs (Gene Targeted trategia de considerar genes candidatos y las
Markers) relaciones sinténicas (similitud) entre genomas

de plantas ha sido explotada exitosamente para de FM sobre caracteres de importancia agro-
identificar genes agronómicamente importantes. nómica, por ejemplo, altura de planta en cerea-
El segundo paso en el desarrollo de FM es la les; tiempo de floración en maíz, requerimien-
búsqueda de secuencias polimórficas o alelos tos de vernalización en Brassica y trigo, tama-
del gen en cuestión. Para ello se deben anali- ño de fruto en tomate, calidad de alimento en
zar las secuencias del gen en más de un geno- arroz; resistencia a enfermedades y respuesta
tipo por especie. Las estrategias de desarrollo a stress en varias especies, etc. Sin embargo,
de marcadores funcionales varían desde la de- aún en especies modelo, sólo el 10% de los
tección de polimorfismos de un solo nucleótido genes han sido caracterizados funcionalmente
(SNPs), el descubrimiento en regiones génicas mientras que para especies no modelo, este
de secuencias tipo microsatelites (SSRs), la número es probablemente menor al 5%.
identificación de sitios de restricción que dife- Los FM derivan de estudios de asociación
rencien alelos (CAPs), la detección de inser- realizados en grandes colecciones de genoti-
ciones y/o deleciones (InDels), las variaciones pos o de la comparación de líneas isogénicas,
a nivel de secuencias que se pueden revelar las cuales tienen un costo alto para su desarro-
empleando la metodología de conformación de llo, limitando el estudio inicial a uno o unos po-
ADN simple cadena en electroforesis parcial- cos fondos genéticos. Luego estos FM deben
mente desnaturalizantes (SSCP), etc. ser evaluados en otros fondos genéticos, con
Posteriormente, se debe probar la existen- lo cual, para todo esto es necesario desarro-
cia de variación fenotípica asociada al alelo en llar un marco experimental, estadístico y bio-
cuestión. Esto puede realizarse indirectamente, informático para la acumulación de datos y las
por estudios de asociación en poblaciones se- evaluaciones a lo largo de diferentes estudios.
gregantes, o directamente, mediante la compa- Teniendo en cuenta estos factores y el la-
ración de genotipos isogénicos generados por borioso desarrollo de los FM, la generación de
mutagénesis específica en la secuencia del gen FM debería concentrarse en genes que confie-
mediante TILLING, Targeting-Induced Local ran una variación fenotípica sustancial. Así, la
Lesions In Genomes (McCallum et al., 2003), selección de “genes claves” para caracteres de
etc. interés agronómico será crucial y el paso limi-
En varias aplicaciones, la gran ventaja que tante para el desarrollo de FM útiles.
presentan los FM es su ligamiento completo
con motivos (mutaciones) funcionales. En con- 5.5.4 Arreglos de ADN para estudios de ex-
traste con los marcadores tradicionales (distri- presión de genes
buidos al azar en el genoma), los FM permiten: Los arreglos de ADN (arrays) permiten, en-
i) la aplicación confiable de marcadores en po- tre otras cosas, analizar sistemáticamente el
blaciones sin necesidad de mapeo previo; ii) el patrón de expresión génica de un organismo
uso de marcadores en poblaciones segregantes en escala genómica. De este modo, es posible
sin el riesgo de perder información debido a la examinar la expresión simultánea de cientos a
recombinación; iii) una mejor representación de miles de genes en varios estadios del desarro-
la variación genética en poblaciones naturales o llo, en respuesta a diferentes condiciones am-
de mejoramiento. bientales y en tejidos específicos.
En general, los FM son útiles para: i) la fija- Los arreglos de ADN son soportes sólidos,
ción más eficiente de alelos en cualquier pobla- comúnmente vidrio o nylon, en los cuales es-
ción segregante; ii) el análisis de alelos tanto en tán fijadas de forma ordenada gran cantidad de
poblaciones naturales como de mejoramiento; secuencias de ADN de interés (marcadores) .
iii) la combinación de alelos de FM que afectan Estas secuencias pueden ser genes comple-
idénticos o diferentes caracteres en mejora- tos o parciales. El empleo de estos arreglos
miento de plantas; iv) la construcción de haplo- como herramienta para el estudio de expresión
tipos de FM ligados. de genes a escala genómica sigue típicamen-
En la actualidad se encuentran disponibles te los siguientes pasos: i) la construcción del
varios genes con potencial para el desarrollo arreglo de ADN; ii) la preparación de sondas

(a partir de ARNm de las distintas situaciones de accesiones de germoplasma, desarrollo de
a comparar); iii) la hibridización del arreglo; iv) plantas tolerantes a diferentes tipos de estrés,
la detección de la señal y análisis de los datos etc. Asimismo, la identificación de genes ex-
por herramientas computacionales apropiadas. presados diferencialmente, en especial aque-
Existen diferentes sistemas de arreglos se llos cuya expresión no es abundante o están
ADN, dependiendo de la fuente de ADN de involucrados en cascadas de transducción de
interés, naturaleza del soporte sólido y el sis- señales, ampliará enormemente los horizontes
tema de detección de la hibridización. El sis- una vez que esos genes puedan ser emplea-
tema más simple es el que requiere menos dos como marcadores para selección asistida
inversión, comúnmente se lo llama macroarre- (Galbraith, 2006).
glo (macroarray) y emplea una membrana
de nylon como soporte en combinación con 5.6 Marcadores SNPs (Single Nucleotide
sondas radiactivas. El sistema más sofistica- Polymorphisms)
do utiliza láminas de vidrio y sondas fluores-
centes y se lo llama microarreglo (microarray). Si bien, son una clase particular de marca-
Asimismo, en los macroarreglos se depositan dores moleculares que podrían ser incluidos
dentro del punto 5.4, se los decidió tratar apar-
centenas de secuencias de ADN mientras que
te dado que los SNPs pueden derivar tanto de
en los microarreglos la densidad de secuencias
secuencias genómicas codificantes (que se ex-
es al menos un orden de magnitud mayor. Es
presan) como no codificantes.
importante destacar la existencia de distintos Recientemente, de la mano de los proyectos
términos empleados para describir estos arre- de secuenciación de genomas enteros de plan-
glos, de modo que glass array, chips de ADN y tas, una nueva clase de marcadores molecu-
biochips son denominaciones usadas para los lares denominados SNPs (polimorfismo de un
microarreglos sobre placas de vidrio, en cuanto nucleótido), está siendo utilizada en distintos
que nylon array y high density membranes son estudios genéticos. Estos marcadores se ba-
para los macroarreglos sobre nylon. san en la detección de polimorfismos resultan-
En el área vegetal, la utilización de arreglos tes de la alteración de una única base en una
de ADN para el análisis de la expresión génica secuencia de ADN. En la figura 7 se muestran
aumentó significativamente de la mano de los secuencias de ADN ejemplificando algunas va-
proyectos de secuenciación completa del ge- riaciones de punto, las cuales se definen como
noma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa SNPs. Algunos autores consideran SNPs sólo
(arroz) (para mas detalles ver Rensink y Buell, cuando ocurre una sustitución de base, otros
2005). consideran también la inserción/deleción de
Además de la contribución para el entendi- una base (InDel).
miento de la expresión génica a gran escala, Los SNPs pasaron a tener mayor importan-
se vislumbra la posibilidad de emplear la técni- cia a partir de la secuenciación del genoma
ca de arreglos de ADN en mejoramiento asis- humano, al descubrirse que el 90% de polimor-
tido por marcadores, fingerprinting, selección fismo encontrado en el genoma eran SNPs.
Figura 7.

Recientemente en el área vegetal, la secuen- fragmentos genómicos equivalentes de regio-
ciación a gran escala de genomas completos y nes génicas específicas del ADN de varios in-
de secuencias expresadas (ESTs), ha permitido dividuos y comparar sus secuencias buscando
evidenciar la presencia de SNPs en especies SNPs. La adopción de esa estrategia involucra
como Arabidopsis thaliana, melón, soja, girasol, el diseño de iniciadores para amplificar seg-
arroz, maíz, cebada, trigo, y caña de azúcar en- mentos de ADN de entre 400 a 700 pb, deri-
tre otras. vados frecuentemente de genes de interés o
Los marcadores genéticos SNP poseen na- provenientes de ESTs. Para la amplificación
turaleza bialélica y son muy abundantes en el se emplean ADNs de varios individuos, prefe-
genoma, siendo la frecuencia de SNPs de 1 rencialmente representativos de la diversidad
cada 100-300 pb para los genomas de plantas. de la población de interés. Estos productos
Los SNPs pueden localizarse en regiones codi- de amplificación resultantes se secuencian
ficantes, regulatorias y no codificantes. Cuando directamente y las secuencias resultantes se
están presentes en regiones codificantes, alinean, empleando programas bioinformáticos
muestran 100% de asociación con el carácter apropiados para la identificación de polimorfis-
de interés, por lo que son muy útiles en MAS mos (SNPs).
(marker assisted selection o selección asistida Actualmente, la secuenciación a gran esca-
por marcadores) y en el aislamiento de genes. la del genoma de varios organismos permite la
Debido a su frecuencia de distribución, los identificación de SNPs mediante la compara-
SNPs surgen como importantes marcadores ción de millares de secuencias depositadas en
para la obtención de mapas genéticos de alta las bases de datos, incluyendo clones genómi-
resolución. Estudios llevados a cabo utilizando cos y, principalmente, secuencias de ADNc y/o
Arabidopsis como organismo modelo, han de- ESTs.
mostrado que estos marcadores posibilitan la Independientemente del método utilizado
obtención de mapas de una resolución cerca de para identificar los SNPs es indiscutible la con-
100 veces superior a la obtenida con los marca- tribución de la bioinformática en dicho proceso.
dores convencionales. Por otra parte, la necesidad de la validación
Los SNPs son estables desde el punto de experimental de los datos es indispensable.
vista evolutivo, lo que facilita su empleo en es- Actualmente, están disponibles distintos mé-
tudios de poblaciones. Otra característica im- todos de validación y genotipado (detección),
portante es que la genotipificación de los SNPs uno de ellos son los chips de ADN o microarre-
no está basada en la medida del tamaño de los glos de ADN. Como se dijo anteriormente, es-
alelos como ocurre con los otros marcadores tos chips consisten en arreglos de oligonucleó-
moleculares, y la distinción de los alelos puede tidos de secuencia conocida depositados sobre
ser automatizada. Por lo tanto, los SNPs, por un soporte sólido. Para el caso de la detección
tener una tasa de mutación relativamente baja, de SNPs, los oligonucleótidos difieren entre sí
ser mucho más frecuentes en el genoma y ser en sitios específicos en nucleótidos individua-
detectables en forma automatizada, surgen les (en el sitio del SNP). La técnica es apro-
como importantes marcadores genotípicos. piada para analizar varios SNPs en paralelo
En tiempos recientes se han desarrollado a partir de cada muestra (en forma multiplex).
varias metodologías para detectar SNPs que En una columna del arreglo cuatro oligonucleó-
utilizan diferentes estrategias para comparar tidos diferirán solamente en el sitio del SNP
regiones específicas del ADN obtenidas de va- (tendrá cada uno, una de las cuatro bases en
rios individuos. La elección de uno de los mé- la posición del SNP). Cuando este arreglo es
todos dependerá de muchos factores: costos, hibridado con productos de PCR o fragmentos
potencial para el procesamiento de los datos de ADN genómico obtenidos por nebulización
generados, los equipamientos necesarios y la (romper el ADN en fragmentos de un tamaño
dificultad de los ensayos. determinado y al azar), estos se unirán solo
Inicialmente, los abordajes para la detección a los oligonucleótidos perfectamente comple-
de SNPs consistían en amplificar y secuenciar mentarios y los productos no perfectamente

complementarios (con mismatch) serán lava- hipótesis. Se considera que muchos de estos
dos. La unión perfecta de cada caso podrá ser SNPs están localizados en el interior de se-
tomada por un sistema de detección. Así, en cuencias génicas, esto puede significar una
un único microarreglo (chip) es posible analizar importante reducción en el tiempo y costos
miles de SNPs, correspondientes a distintos para el descubrimiento de genes de interés,
loci en simultáneo. comparado con los marcadores actualmente
Otros métodos de análisis de SNPs incluyen: disponibles. Asimismo, el desarrollo constante
cromatografía liquida de alta resolución desna- de tecnologías para su aplicación permitirá au-
turalizante (DHPLC), espectrometría de masa, tomatizar el mapeo de alta densidad y, conse-
ensayos con extensión de iniciadores, PCR cuentemente, reducir los costos de su empleo
en tiempo real, minisecuenciación, secuen- en estudios moleculares a gran escala.
ciación de una única base, digestión por enzi-
mas de restricción (RFLP), CAPS, entre otros. 5.7 Lecturas recomendadas
Puede encontrarse una revisión detallada de
estos métodos en Kwok (2001), Tsuchihashi y Andersen J.P & Lübberstedt T. 2003. Functional
Dracopoli (2002). markers in plants. Trends Pl. Sc. 8: 554-560.
Botstein D., White R.L., Skolnick M. & Davis R. W.
En cuanto a las aplicaciones y perspectivas
Construction of a genetic linkage map in man
de los marcadores SNPs cabe destacar que
using restriction fragment length polymorphisms.
han sido fundamentales para el análisis de Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331. 1980.
genes y el descubrimiento de la base genéti- Branlard G., Dardevet M., Saccomano R., Lagout-
ca molecular de importantes características te F. & Gourdon J. 2001. Genetic diversity of
agronómico-industriales. Como por ejemplo en wheat storage proteins and bread wheat quality.
arroz, el descubrimiento de SNPs involucrados Euphytica 119: 59-67.
en la calidad de cocción, procesamiento y aro- Caetano-Anollés, G., Bassam, B.J. & Gresshoff,
ma del grano (Larkin y Park, 2003). P.M. 1991. DNA amplification fingerprinting using
La comparación directa de SNPs también very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/
Technology 9: 553-557. Se puede borrar
ha sido empleada en estudios de genética de
Galbraith D.W. 2006. DNA Microarray Analysis in
poblaciones y filogenia, identificación de va- Higher Plants. OMICS: A Journal of Integrative
riedades, construcción de mapas genéticos y Biology. 10(4): 455-473.
físicos, análisis funcionales, análisis de asocia- Gupta P.K. & Rustgi S. 2004. Molecular markers
ción en mejoramiento genético vegetal etc. from the transcribed/expressed region of the ge-
El uso de métodos masivos de análisis, nome in higher plants. Funct Integr Genomics
como los arreglos de alta densidad de oligonu- 4:139-162.
cleótidos, se están empleando en la actualidad Konieczny A., & F. Ausubel. 1993. A procedure for
para identificar Single Feature Polymorphisms mapping Arabidopsis mutations using co-domi-
nant ecotype-specific PCR based markers. Plant
(SFPs, Polimorfismos de Característica Única)
J. 4:403–410.
como una alternativa atractiva para detectar Kwok P-Y. 2001. Methods for genotyping Single Nu-
SNPs y otro tipo de mutaciones entre genoti- cleotide Polymorphisms. Annu. Rev. Genomics
pos. Los SFPs son detectados sobre arreglos Hum. Genet. 2: 235-258.
de alta densidad de oligonucleótidos (chips) Larkin P.D. & Park W.D. 2003. Association of waxy
y representan polimorfismos de secuencia de gene single nucleotide polymorphsim with starch
ADN entre dos genotipos dentro de un oligonu- characteristics in rice (Oryza sativa L.). Mol
cleótido individual, el cual se detecta por dife- Breed 12:335-339.
rencia en la afinidad de hibridación. El término Litt M. & Luty J.A. 1989. A hypervariable microsate-
llite revealed by in vitro amplification of a dinu-
“característica (feature)” refiere a la señal de
cleotide repeat within the cardiac muscle actin
hibridación dada por una sonda (oligonucleóti- gene. Am. J. Hum. Genet. 44:398-401. 1989.
do) en el arreglo (Zhu y Salmeron, 2007). McCallum C.M., Comai L., Greene E.A. & Henikoffet
El descubrimiento de los SNPs, asociado a S. 2003. Targeting induced local lesions in ge-
la posibilidad de utilizarlos como marcadores, nomes (TILLING) for plant functional genomics.
permite a los investigadores explorar nuevas Plant Physiol. 123:439-442.

Olson M., Hood L., Cantor C. & Dotstein D. 1989. A
common language for physical mapping of the
human genome. Science 245:1434-1435.
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of reliable PCR based markers linked to downy
mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl.
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pression profiling resources for plant genomics.
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Steinmetz L.M. 2000. Combining genome sequen-
ces and new technologies for dissecting the ge-
netics of complex genotypes. Trends Pl. Sc. 5(9):
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Tsuchihashi Z. & Dracopoli N.C. 2002. Progress in
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Vos P., Hogers M., Bleeker M., Rijans M., Van de
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J., Kuiper M. & Zabeau M. 1995. AFLP: A new
technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids
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Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski L.A.
& Tingey S.D. 1990. DNA polymorphism ampli-
fied by arbitrary primers are useful as genetic
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Zhu T. & Salmeron J. 2007. High-definition genome
profiling for genetic marker discovery. Trends Pl.
Sc. 12(5): 196-202.

I CAPITULO 6 llo de mapas genéticos altamente saturados
permite el clonado posicional de genes.
Construcción de mapas de 2. Introducción a la construcción de ma-
ligamiento genético, localización pas genéticos en vegetales
de genes y regiones Para comprender mejor las bases teóricas
cromosómicas asociadas a y metodológicas empleadas en el mapeo ge-
caracteres de interés en plantas nético es necesario recordar algunos concep-
tos básicos de genética Mendeliana. Gregor
Gerardo D L Cervigni, Mendel realizó sus experimentos en Pisum
sativum (arveja cultivada) efectuando cruza-
Juan Pablo A Ortiz, Sergio E Feingold
mientos controlados entre individuos que se
1. Introducción diferenciaban en determinadas características
La posibilidad de construir mapas de liga- (como por ejemplo el color de la flor, tipo de
miento genético en especies vegetales o ani- tegumento de las semillas y largo de los tallos),
males es una de las contribuciones de mayor y estudió la forma en que estos caracteres se
impacto de las técnicas de marcadores mole- transmitían a la descendencia. A partir de datos
culares en las ciencias biológicas. Los marca- experimentales formuló una hipótesis simple
dores moleculares utilizados pueden corres- para explicarlos y posteriormente diseñó expe-
ponder a regiones intergénicas no codificantes rimentos para contrastarla. Sus trabajos permi-
o a segmentos génicos, en cuyo caso son de- tieron inferir la existencia de “factores” heredi-
nominados funcionales y constituyen marca- tarios y sus mecanismos de transmisión antes
dores “ideales” a los efectos de selección de de conocer la existencia del ADN como mate-
genotipos. Un mapa genético establece de ma- rial de transmisión genético. En base a sus da-
nera probabilística el arreglo lineal de un grupo tos experimentales Mendel formuló su prime-
marcadores (o genes) sobre el genoma de una ra ley, o ley de la segregación. Ella establece
especie. Si bien el concepto data de principios que los miembros de un par génico (alelos) se
de siglo XX, a partir de los trabajos de Morgan segregan (se separan) uno de otro durante la
y Bridges con mutantes de Drosophila, recién formación de las gametas. Como consecuen-
a partir del advenimiento de los marcadores cia, la mitad de las mismas portan un alelo y
moleculares fue técnicamente posible construir la otra mitad el otro. La progenie es luego for-
mapas genéticos saturados en la mayoría de mada por la combinación al azar de las game-
las especies vegetales de interés agronómico. tas de ambos progenitores. La segunda ley de
Usando este tipo de mapas es posible iden- Mendel, o ley de la segregación independiente,
tificar la posición y el efecto de genes sobre indica que la segregación de los alelos de un
caracteres de importancia mediante asocia- gen es independiente de la segregación de los
ciones estadísticas entre los valores fenotípi- alelos de otro gen. Estas dos leyes fueron los
cos y las variantes alélicas de los marcadores. puntos de partida sobre los cuales se elaboró
La disponibilidad de mapas genéticos permite toda la teoría de herencia que hoy conocemos.
también la selección indirecta de genotipos de- Incluso aún en el presente, los análisis de las
seables, comúnmente denominada MAS (del frecuencias en que aparecen los caracteres
inglés Marker Assisted Selection), mediante el en las progenies de cruzamientos controlados
seguimiento de marcadores localizados en re- son una parte fundamental de los análisis ge-
giones genómicas determinadas. La utilización néticos. Los caracteres genéticos pueden estar
de marcadores comunes permite comparar la controlados por uno o pocos genes, o poseer
estructura del genoma de diferentes especies un control complejo que involucra muchos ge-
(comparative mapping) e identificar rearreglos nes, denominados loci de caracteres cuantitati-
cromosómicos a pequeña y gran escala (micro vos o QTLs (del inglés Quantitative Traits Loci),
y macro sintenia) para estudios de filogenia y a menudo afectados por el ambiente. La dis-
evolución molecular. Por otro lado, el desarro- ponibilidad de un gran número de marcadores

(loci) polimórficos, no afectados por el medio mitan la construcción del mapa genético. En
ambiente, neutros, sin efectos deletéreos y ausencia de polimorfismos genéticos los aná-
cuya herencia pude determinarse con relativa lisis de segregación y ligamiento son imprac-
facilidad, simplificó enormemente los análisis ticables. En general los cruzamientos entre
genéticos en especies vegetales y animales. especies alógamas presentan mayor grado de
La construcción de un mapa de ligamiento ge- polimorfismo que entre autógamas. La falta de
nético es esencialmente una representación polimorfismos es común en poblaciones deri-
gráfica lineal del orden más probable de mar- vadas de cruzamientos entre progenitores de
cadores moleculares o genes a partir de los va- base genética estrecha, como los realizados
lores de recombinación observados entre ellos. entre distintos cultivares de la misma especie
Cada arreglo lineal es denominado “grupo de o entre individuos de especies silvestres deri-
ligamiento”. En teoría un mapa saturado debe vados de la misma población natural. En teoría
contener el mismo número de grupos de liga- es posible desarrollar varios tipos de poblacio-
miento que número básico de cromosomas. nes segregantes y la decisión de cual utilizar
En este Capítulo se desarrollarán los con- depende de la resolución que se desee alcan-
ceptos básicos del mapeo genético en vegeta- zar con el mapa y la posibilidad y/o facilidad
les y algunas de sus aplicaciones. De ninguna de desarrollarla. En la Figura 1 se muestra un
manera se pretende abordar el tema en toda esquema del desarrollo de 5 poblaciones bási-
su extensión debido a que la misma supera cas de mapeo. Las poblaciones de tipo retro-
largamente los objetivos de este libro. Aquellos cruza (backcross o BC1) y F2 son generalmente
lectores que deseen ampliar y profundizar los adecuadas y fáciles de generar en la mayoría
temas que aquí se desarrollan pueden consul- de las especies cultivadas como: trigo, maíz
tar los textos que se citan en la lista de referen- y soja. Las poblaciones F2 proveen mayor in-
cias bibliográficas al final del Capítulo. formación genética que las retrocruzas para el
Los pasos fundamentales a seguir en la mismo número de individuos debido a que pue-
construcción de un mapa genético de una de- den evaluarse dos cromosomas recombinan-
terminada especie o el mapeo específico de un tes por planta. En especies autoincompatibles
gen (locus) de interés pueden resumirse en: 1) y altamente heterocigotas las poblaciones F1
selección de progenitores y desarrollo de una también son segregantes y pueden emplear-
población segregante (población de mapeo), 2) se para mapeo. Estos 3 tipos de familias son
generación de un número suficiente de marca- efímeras, es decir, que cada individuo segre-
dores y registro de los mismos en cada uno de
los individuos de la población (genotipado), 3)
determinación de las frecuencias de recombi-
nación entre marcadores y determinación de
grupos de ligamiento y 4) determinación del or-
den de los marcadores y conversión de la fre-
cuencia de recombinación (r) en unidades de
mapeo o centiMorgan (cM).
2.1. Poblaciones de mapeo

El primer paso en todo proyecto de mapeo
es el desarrollo de una población segregan-
te para una o más características de interés.
La selección de los progenitores es un punto
importante debido a que no sólo deben ser
contrastante para la característica en estudio,
sino que además deben presentar diferencias
a nivel de secuencias del ADN y así obtener
suficientes marcadores polimórficos que per- Figura 1.

gará las combinaciones génicas que porta en de la F1. La desventaja de este método es que
la siguiente generación. Si no es posible man- es necesario disponer de un protocolo eficiente
tenerlas clonalmente como por ejemplo a partir para la regeneración de plantas in vitro a partir
de órganos vegetativos o por cultivo in vitro, la del cultivo de anteras y la posterior duplicación
información obtenida en ellas debe ser transfe- cromosómica.
rida a una nueva población utilizando algunos Una vez establecido el tipo de población a
de los marcadores que fueron previamente lo- utilizar, el número de individuos es también un
calizados (mapeados) de manera de conservar punto importante debido a que la resolución del
puntos de referencia entre ambas. mapa y el ordenamiento de los marcadores en
En el caso de requerirse múltiples ensa- los grupos de ligamiento dependen de éste. En
yos, (repeticiones intra experimento, ensayos general, poblaciones de 60 a 100 individuos
en distintas localidades o en varios años), son adecuadas para trabajos de tipo acadé-
es necesario desarrollar poblaciones de ma- mico, como la localización de un determinado
peo inmortales como las Líneas Endocriadas locus en el genoma o el mapeo de un carác-
Recombinantes (RILs por Recombinant Inbred ter cualitativo. Sin embargo, para proyectos de
Lines) o poblaciones de Haploides Duplicados mapeo de QTLs o la construcción de mapas de
(DHs). Ambas poblaciones se componen de un alta resolución son necesarias poblaciones de
conjunto de líneas homocigotas que pueden 500 a 1000 individuos.
ser replicadas por semillas varias veces y por
varios ciclos de cultivo. Estas características 2.2. Registro de marcadores moleculares
las hacen especialmente adecuadas para ma- y clasificación de la población
pear QTLs. Las RILs son generadas a partir de Los marcadores moleculares útiles para ma-
una población F2 por descendencia de semilla peo deben existir en 2 o más formas alélicas
única de un número determinado de individuos distinguibles, de manera que los genotipos de
durante cinco o más generaciones. Finalmente, cada individuo puedan ser claramente identifi-
cada línea representará los diferentes bloques cados. Los mismo pueden ser de tipo dominan-
de ligamiento presentes en un individuo F2 de te (presencia o ausencia de una banda como
la población original, pero en estado homoci- en RAPD y AFLP) por lo cual no es posible
gota. Una vez estabilizadas, las RILs pueden distinguir entre el genotipo homocigota (AA)
ser mantenidas y multiplicadas por semillas del heterocigota (Aa) o co-dominantes (todos
año tras año. Una de las desventajas de este los alelos pueden identificarse, por ej., usan-
método es que algunas regiones del geno- do SSR y RFLP), donde los 3 genotipos de un
ma pueden seguir en el estado heterocigota mismo locus dialélico pueden ser discriminados
a pesar de las múltiples autofecundaciones. (AA, Aa y aa). Como criterio general una vez
Por otro lado, no es posible desarrollarlas en que se dispone de entre 100-200 marcadores
especies autoincompatibles. Las poblaciones en una determinada población es posible identi-
DH se generan a partir del cultivo de tejidos de ficar grupos de ligamiento, regiones genómicas
anteras de individuos F1. En algunas especies específicas y mapear genes o QTLs. Asimismo,
es posible regenerar plantas enteras a partir prácticamente cualquier nuevo marcador que
de microgametofitos haploides (grano de polen se agregue pude integrarse a los preexistentes.
en el estado uninucleado). Si la planta dado- El genotipo de cada individuo de la población,
ra es una F1, sus granos de polen portarán las para cada uno de los marcadores debe ser de-
gametas derivadas de la meiosis con diferen- terminado (genotipado). En general se toman
tes combinaciones alélicas. Posteriormente, como marcadores informativos aquellos que
por tratamientos de duplicación cromosómica muestran relaciones de segregación, por pre-
con colchicina, las plantas haploides obtenidas sencia/ausencia, que se ajusten a las frecuen-
pueden diploidizarse llevando todos los loci al cias esperadas considerando el tipo de pobla-
estado homocigota. Como resultado se obtiene ción y marcador molecular utilizado (por ej.: 1
una serie de líneas que representan las com- Aa: 1 aa en una retrocruza o 3 A_: 1aa en una
binaciones génicas presentes en las gametas F2), por medio de la prueba del ji-cuadrado (Χ2).

2.3. Estimación de las frecuencias de para que el número de plantas recombinantes
recombinación y detección de grupos de sea igual al de no recombinantes, se dice que
ligamiento los mismos segregan independientemente. Por
otro lado, si el número de plantas recombinan-
2.3.1. Concepto de ligamiento tes es menor al esperado (50%) se considera
Dos loci que se encuentran muy cercanos que ambos loci están ligados genéticamente.
en el mismo cromosoma no segregan indepen- De esta manera, determinando la frecuencia
dientemente durante la meiosis. Esta relación de aparición de individuos con combinaciones
se denomina ligamiento genético y explica la alélicas recombinantes es posible realizar una
aparición de una proporción mayor de indivi- medida relativa de la distancia entre ellos. 2.3.2
duos portando combinaciones alélicas paren-
tales que lo esperado según la Segunda Ley Detección del ligamiento
de Mendel. Los genes ligados pueden ser se- El primer paso en el estudio del ligamiento
parados por un intercambio físico de partes de entre 2 loci (por ej., A y B) consiste en deter-
cromosomas (cromátidas hermanas) durante minar si los mismos segregan individualmen-
la meiosis por el proceso de entrecruzamiento te de acuerdo al modelo esperado (1:1, 3:1,
o “crossing-over” (CO), el cual genera game- 1:2:1, etc.), y posteriormente, si lo hacen en
tas recombinantes, distintas de las parentales forma independientemente o no. En ambos
(Figura 2). casos la prueba estadística adecuada es el Χ2
Figura 2.
Existe una relación entre la distancia física considerando un nivel de significancia prede-
a la que se encuentran 2 loci y la probabilidad terminado (p ≥ 0,05 o 0,01), aunque también
de que se produzca un CO entre ellos. Cuanto es posible utilizar el LOD score (ver punto 2.4).
más alejados estén uno del otro mayor será Si la probabilidad asociada al Χ2 obtenido para
la probabilidad de que ocurra un entrecruza- cada locus en forma individual es superior a la
miento y se generen gametas recombinantes. predeterminada, se considera que ambos mar-
Consecuentemente, si dos loci están lo sufi- cadores segregan de acuerdo a lo esperado.
cientemente separados en el cromosoma como En el segundo paso, el número de progenies

observadas en cada clase genotípica se con- 1 producto de cada 100 meiosis es del tipo re-
trasta con los valores esperados para una se- combinante. Un ejemplo de los pasos a seguir
gregación independiente (Tabla 1). en la estimación del ligamiento entre dos ge-
nes se muestra en la Figura 3.
Tabla 1: Segregaciones esperadas para 2 loci inde-
pendientes en distintas poblaciones de mapeo.
(i)
F1 P2
Tipo de Marcador Marcador A B a b
x
población dominante co-dominante
a b a b
BC 1 1:1:1:1 1:1:1:1 (ii) Datos derivados del cruzamiento prueba
Gametas Fenotipos Genotipos No.

F2 9:3:3:1 1:2:1:2:4:2:1:2:1 AB AB AaBb 60
Parentales
ab ab aabb 59
RILs 1:1:1:1 1:1:1:1 Gametas
F1 Ab Ab Aabb 4
Recombinantes
DH 1:1:1:1 1:1:1:1 aB aB aaBb 3
Total 126
BC1: población de retrocruzamiento; F2: población tipo F2 (iii) Prueba de segregació n de factores simples A/a y B/b
derivada del cruzamiento entre 2 progenitores heteroci-
gotas; RIL: población de líneas endocriadas recombinan- Número de individuos con fenotipo A = 60 + 4 = 64
tes (RILs por Recombinant Inbred Lines) y DH: población Número de individuos con fenotipo a = 59 + 3 = 62
de haploides duplicados. X2 1 g.l .= 0.03 n.s
Número de individuos con fenotipo B = 60 + 3 = 63
Número de individuos con fenotipo b = 59 + 4 = 63
X2 1 g.l = 0.00
La hipótesis nula (Ho) es que ambos loci se-
gregan independientemente y la hipótesis al- (iv) Prueba de segregació n independiente de locus A y B
ternativa (HA) es que ambos loci están ligados. Fenotipos Frecuencia No. No.
Si los desvíos obtenidos entre los valores ob- (genotipos)

AB (AaBb)
esperada
¼xn
esperado
31,5
observado
60
servados y esperados tienen una probabilidad Ab (Aabb) ¼xn 31, 5 4
de ocurrencia menores que 1/20 o 1/100 (p < aB (aaBb) ¼xn 31, 5 3
0,05-0,01), se considera que los loci A y B no ab (aabb) ¼xn 31, 5 59
segregan independientemente y por lo tanto se Total 126
acepta HA que indica la existencia de ligamien- X 2( E O )2

E
= 99, 56*
to entre ellos (ver ejemplo Figura 3). *(P < 0.001)
(v) Cálculo del porcentaje derecobminación (% r)
2.3.3. Estimación de la frecuencia de número de gametas recombinantes (4 3)

recombinación %r
número total de gametas

126
0,0555 o 5,55 %
Una vez verificada la existencia de ligamien-

to entre 2 loci es posible estimar la frecuencia Figura 3.
de recombinación (r) entre ellos. En el caso
más simple de una retrocruza, todas las clases
fenotípicas (o genotípicas) pueden ser identi-
ficadas (Figura 3). El valor de r expresado en En este caso la frecuencia de recombinación
porcentaje se calcula: entre A y B es de 5,55 %. Como la frecuen-
cia de recombinación es una proporción, su
variancia (derivada de la distribución binomial)
número de gametas recombinantes está dada por la expresión: R (1-R)/N, donde
r(%)= x100 R es la frecuencia de recombinación y N es el
número total de gametas
número total de los individuos de la población.
Una estimación de r = 0,01 (1 %) es definida Por lo tanto, un valor de r = 5,55 % (como el
como una unidad de mapeo (u.m), y corres- de nuestro ejemplo), posee el siguiente error
ponde a la distancia entre dos loci en la cual estándar:

B nunca hubiéramos detectado estos dobles
0,055x(1-0,055)/126]=0,020. entrecruzamientos. Extendiendo este razona-
miento, en realidad tampoco sabemos si entre
A-B hubo entrecruzamientos dobles y, por lo
De esta manera es posible establecer el gra-
tanto, haber subestimado la proporción de re-
do de ligamiento entre 2 loci. Sin embargo, en
combinantes entre ellos. Cuanto más grande es
algunos tipos de poblaciones como las F2, no
la distancia entre 2 marcadores, más inexacta
todas las clases genotípicas pueden ser iden-
será la medida de la distancia. Asimismo, otro
tificadas fácilmente, especialmente cuando se
hecho que debe considerarse es el fenómeno
trabaja con marcadores co-dominantes. Esto
de interferencia (I). La interferencia se relacio-
es debido a que no es posible diferenciar si los
na con la imposibilidad física de que adyacente
dobles heterocigotas derivan de 1 o 2 game-
a un punto de entrecruzamiento se produzca
tas recombinantes. Para estos casos se han
otro en la misma meiosis debido a un impedi-
desarrollado procedimientos alternativos para
mento físico entre ellos (se "interfieren"). Estas
estimar las distancias genéticas. El método
características hacen que las frecuencias de
de máxima probabilidad (maximum likelihood
recombinación no sean magnitudes aditivas
method) es el más utilizado. Debido a que se
para grandes segmentos cromosómicos. Para
trata de un método estadístico de estimación
solucionar esto, los valores de r se convierten
de probabilidades las fórmulas empleadas
en unidades de mapeo (centMorgan – cM) me-
en los cálculos son generalmente complejas.
diante la aplicación de las funciones de mapeo.
Allard (1956) desarrolló el método de los sco-
Las ecuaciones para convertir r en cM derivan
res para derivar las fórmulas, estimar las dis-
de funciones de distribución y son fundamen-
tancias genéticas y calcular las desviaciones
talmente dos, la función de Haldane (1919) y la
estándares para varios tipos de poblaciones.
de Kosambi (1944). La diferencia básica entre
Afortunadamente en el presente se dispone de
ellas es el supuesto que asumen con respec-
programas de computación que utilizan estas
to a la interferencia en la ocurrencia de dobles
fórmulas y permiten trabajar con grandes ar-
CO. La función de Haldane considera interfe-
chivos de datos derivados de poblaciones de
rencia nula (I=0) mientras que la función de
un gran número de individuos. Entre los más
Kosambi estima el valor de I. Estos valores ge-
populares se encuentran el Mapmaker (Lander
neralmente se encuentran entre 0 y 1 (interfe-
1987) y el JoinMap (Stam et al. 1993).
rencia completa). El valor real de interferencia
se ubicará entonces en algún lugar en medio
2.3.4. Ordenamiento de los marca-
de ambos valores. Los valores de cM estima-
dores y conversión de frecuencias a
dos con ambas funciones son equivalentes
unidades de mapeo
cuando se consideran valores de r de hasta 10
Cuando se estudia el ligamiento simultáneo
%, para valores mayores la transformación de
entre 3 o más marcadores (por ej. A, B y C),
Kosambi es más exacta.
se puede establecer un orden en base a las
distancias relativas entre ellos (mapeo de 3
puntos). Suponiendo que el orden sea ABC, la
2.4. Programas de mapeo
La utilización de programas de mapeo
distancia estimada en la prueba de 2 puntos
como el Mapmaker 3.0 (Lander et al. 1987;
entre A y C será aproximadamente igual a la
suma de la distancia entre A-B + B-C. Sin em- http://www.nslij-genetics.org/soft/mapmaker)
bargo, frecuentemente la distancia entre A y C o JoinMap 1.4 - 4.0 (Stamp 1993; http://www.
(medida como prueba de dos puntos) suele ser kyazma.nl), permiten el análisis simultáneo de
menor a la de A-B + B-C. Esto se debe a la muchos marcadores en poblaciones de gran
presencia de entrecruzamientos dobles entre número de individuos, mediante la utilización
A y C cuyo resultado final es la formación de de métodos de estimación de parámetros
gametos parentales AC y ac que se computan como el de máxima probabilidad o mínimos
como "no recombinantes", cuando en realidad cuadrados. Estos programas poseen diferen-
sí lo son. Si no hubiéramos mapeado el gen tes procedimientos, o rutinas, que permiten la

estimación de r entre pares de marcadores, 3. Mapeo de QTL
la identificación de los grupos de ligamiento y Muchas de las características de importan-
la determinación del orden de los marcadores cia agronómica presentan una distribución
dentro de cada grupo. El programa Mapmaker continua de valores, esto es, dentro de una
utiliza el test estadístico LOD score para eva- población determinada no existe una clara dis-
luar el valor de r estimado y la posición más tinción en clases fenotípicas. La base genética
probable de un marcador en el grupo de liga- de estas características fue esclarecida poco
miento. El LOD score (logaritmo de los odds) después del redescubrimiento de las leyes de
es el logaritmo en base 10 del cociente entre la Mendel, cuando Yule en 1902 propuso que
probabilidad de obtener los datos observados esa variación era la consecuencia de la acción
en caso de que los loci considerados estuvieran aditiva de muchos genes. Entre éstos se sue-
ligados, sobre la probabilidad de obtener los da- le identificar a genes de efectos pronunciados,
tos en ausencia de ligamiento. Un LOD = 3 para denominados genes mayores y genes con pe-
un par de marcadores indica que es mil veces queños efectos que fueron inicialmente deno-
más probable que los loci estén ligados respec- minados poligenes. Sin embargo, la distinción
to a que no lo estén. El programa Mapmaker entre poligenes y genes mayores (también lla-
también utiliza LOD score para comparar dife- mados oligogenes) no resultó satisfactoria ya
rentes órdenes posibles entre varios genes. Al que el efecto de un gene depende del entorno
orden más probable le asigna un 0 y a los res- genético, el ambiente y del alelo presente en
el locus del gen. Geldermann (1975) propuso
tantes le asigna valores negativos. Por su par-
denominar a estos loci controladores de carac-
te, el programa JoinMap (Stam, 1993) permite
terísticas cuantitativas como QTLs (del inglés
trabajar con distintos tipos de poblaciones e in-
Quanitative Traits Loci). Esta nomenclatura re-
clusive con distintos tipos de segregación den-
sultó más adecuada ya que no asocia al gen
tro de la misma población. Este programa fue
con la magnitud de su efecto.
especialmente diseñado para estimar datos de
Si bien la genética cuantitativa ha propues-
ligamiento genético en poblaciones derivadas
to y utilizados modelos biométricos con gran
de especies altamente heterocigotas y/o donde éxito a lo largo de la historia del mejoramiento
no es posible obtener líneas puras. Otra de sus de plantas y animales, estos modelos se ba-
principales ventajes es que permite “combinar” san en la estimación de los efectos génicos y
mapas derivados de distintas poblaciones (o no tanto en el número de genes involucrados.
datos bibliográficos) si disponen marcadores en Utilizando marcadores moleculares ligados a
común (Stam 1993). Debido a que las unidades los QTLs, es posible estimar el genotipo, los
de mapeo genético están basadas en frecuen- efectos genéticos y tener una aproximación
cia de recombinación su significado en cuanto menos sesgada del número de o genes/QTLs
a distancia física (número de nucleótidos) entre determinantes del carácter. Es indispensable
dos loci varía según la especie considerada, el que el lector no considere la metodología de
cromosoma y la localización dentro del mismo. marcadores moleculares sustituta de de los
Es conocido que existen regiones de alta fre- modelos genéticos-estadísticos utilizados por
cuencia de recombinación localizadas sobre los la genética cuantitativa, por el contrario, ellos
brazos cromosomales (comúnmente llamados son la base de los estudios de mapeo de ge-
hotspots) y regiones donde la recombinación nes/QTL utilizando marcadores moleculares.
está fuertemente restringida como por ejemplo
cerca de los centrómeros o telómeros. Aunque Una de las técnicas de identificación de
se corre el riesgo de cometer un error grosero QTLs es la denominada asociación con mar-
puede considerarse que en promedio 1 cM equi- cas simples o marcadores individuales. En este
vale aproximadamente a 1 Mpb (un millón de caso, la utilización de un mapa genético no es
pares de bases) en humanos y entre 500 y 750 necesaria, aunque un mapa genético ayuda a
kpb (mil pares de bases) en plantas superiores la interpretación de los resultados. Las posibi-
(como el arroz y tomate, respectivamente). lidad de identificar un QTL usando marcadores

moleculares depende de la distancia genética Efecto aditivo
existente entre el marcador y el QTL, y de la
MM - mm
magnitud de los efectos genéticos, aditivo (a) y a=
de dominancia (d) (ver más abajo), del propio : 2(1 - 2r )
QTL. La estimación de estos efectos es indi-
recta pues se realiza con base en el marcador Efecto de dominancia:
ligado al QTL. Además, la estimación de estos MM + mm
efectos será más o menos exacta dependien- Mm -
do de la técnica de mapeo utilizada, siendo la d= 2
más adecuada aquellas técnicas derivadas del (1 - 2r ) 2
mapeo por intervalo.
Consideremos M/m el locus del marcador Razón d/a (grado medio de dominancia):
molecular y Q/q el locus del QTL. Para saber
si M y Q están ligados, son necesarias las si- d 2 Mm - MM + mm d
=
guientes etapas: a (1 - 2r )( MM - mm)
• obtener una población segregante para
ambos loci M y Q(población de mapeo), Si el QTL no estuviera ligado al marcador,
• medir la característica fenotípica (Y) con- (r = 0,5) las diferencias entre las tres medias
trolada por el QTL (Q), no serán estadísticamente significativas. De la
• obtener el fenotipo del marcador (M) en misma forma, si a y d fuesen iguales a cero (au-
cada planta de esta población, y registrarlo sencia de efecto), no se detectarían diferencias
en una matriz de datos. estadísticas entre las medias. De esta manera,
sólo si r < 0,5 es posible detectar asociaciones
Considerando el caso de un único locus entre M y Q, dependiendo esta detección del
(Q/q), en que el alelo Q aumenta el valor de grado de ligamiento o magnitud de r (pequeños
la característica, y haciendo µQQ, µQq y µqq valores de r facilitan la detección) y del efecto
las medias de los individuos con genotipos QQ, del alelo Q sobre el carácter.
Qq y qq, respectivamente, y µ = (µQQ + µqq)/2
la media entre los genotipos homocigotos, los Formalmente tenemos: Ho: µMM=µMm=µmm;
siguientes efectos genéticos pueden ser obte- HA1: µMM ≠ µMm; HAa2: µMM ≠ µmm; HA3:µMm ≠ µmm.
nidos una población F2:
Medias de los genotipos

µqq µ µQq µQQ
d Valores genotípicos
-a a
a) efecto aditivo (a) y (d) efecto de la domi- La asociación Marcador-QTL se confirma

nancia donde: si las diferencias entre las medias fenotípicas
QQ qq QQ qq de grupos de marcadores son estadísticamen-
a d = Qq te diferentes de cero (se rechaza de Ho). Las
2 2
diferencias pueden ser evaluadas por medio
án una generación F2 cuyos genotipos mar- del análisis de la varianza (ANOVA) o prueba
cadores MM, Mm y mm estarán presente en la t, eligiendo un nivel de significancia de P ≤ 0,05
frecuencia de 1/4, 1/2 y 1/4, respectivamente. como se ejemplifica en la Tabla 2.
En este caso los efectos a, d y d/a son estima- En una población F2, la asociación entre el
dos con base en el marcador ligado al QTL, marcador y el QTL puede ser valorada a través
como sigue: de la regresión entre los genotipos y su corres-

Tabla 2: ANOVA entre los tratamientos MM, Mm y mm
obtenidos de una población F2 Observe que:
FV GL SC CM F P
a = g1 - g2
Tratamiento 2 202791,97 101395,98 54,94 0,0000 y d = g2 + g1
Residuo 142 262030,95 1845,28
Total 144 464822,93 por lo que para estimar los efec-
tos a y d en una población de retro-
FV: fuente de variación, GL: grados de libertad, SC: suma de cuadra- cruzamiento debe retrocruzarse la
dos, CM: cuadrados medios, F: valor del estadístico F (CM Tratamiento/ F1 con cada uno de los progenito-
CM Residuo) y P: probabilidad de rechazar una Ho verdadera. Cuando
res. Un problema adicional es que
P < 0,05 indica asociación entre el marcador (M) y el QTL (Q).v
a y d pueden anularse. Si existiera
dominancia completa de Q sobre q
pondiente fenotipo. En este caso, es necesario (d = a), g1 = 0 y si existiera dominancia comple-
codificar los tres genotipos (MM, Mm y mm) ta de q sobre Q (d = -a), g2 = 0.
como 1, 0 y -1 para el modelo aditivo, y 0, 1 y 0
para el modelo dominante. El análisis de ANOVA y la regresión son téc-
nicas que permiten la identificación de mar-
El modelo de regresión adoptado es: cadores ligados a QTLs, pero poseen ciertas
limitaciones:
Yi = β0 + β1X1j +β2X2j + εj. 1) no indican si hay uno o más QTLs asocia-
dos al marcador,
donde: 2) no estiman la posición del QTL y
Yi= valor de la característica; X1j= código del 3) el efecto del QTL puede ser subestimado
marcador para efecto aditivo (MM = 1, Mm = 0, debido a que es confundido con la frecuencia
mm = -1); X2j= código del marcador para efec- de recombinación.
to dominante (MM = 1, Mm = 0, mm = -1); β0
= intercepto de la regresión (media de la ca- 3.2. Mapeo por intervalos
racterística); β1 = inclinación de la recta para el El mapeo por intervalo (interval mapping) fue
modelo aditivo; β2 = inclinación de la recta para propuesto originalmente por Lander y Botstein
el modelo dominante y εj = error aleatorio para (1989) y es la base de todos los métodos de
j-ésimo individuo. mapeo de QTL utilizados actualmente. Para
conceptualizar esta metodología podemos
Una vez evaluado y confirmado el modelo considerar el cruzamiento entre dos progenito-
completo (modelo aditivo + dominante), debe res homocigotos cuya F1 posee la constitución
analizarse la importancia relativa de cada uno genética que se ejemplifica en la Figura 4.
de los modelos, por ejemplo mediante la me- A diferencia del mapeo por marcas simples,
todología de regresión múltiple de eliminación en el mapeo por intervalo es indispensable
por paso (stepwise). poseer un mapa genético ya que la unidad de
En poblaciones de retrocruzamiento, sólo el análisis es el intervalo genético y no un marca-
genotipo heterocigoto (Qq) y uno de los homo- dor individual. De manera resumida el mapeo
cigotos (QQ o qq) están presentes por lo que por intervalo utiliza la siguiente estrategia: 1)
el efecto aditivo y dominante quedan confun- como la distancia entre cada par de marcado-
didos, en este apartado denominados g1 y g2, res es conocida, el método estima los paráme-
respectivamente, y estimados como sigue: tros del modelo a incrementos de distancias
genéticas predefinidos, 2) los parámetros del
modelo pueden ser estimados mediante la fun-
g1=MM-Mm = (a-d)(1-2r) ción de verosimilitud o regresión, 3) la hipótesis
H0: ausencia de QTL/ HA: QTL en un intervalo
Yg2=Mm-mm = (a+d)(1-2r) entre marcadores, son contrastadas a través

entre los marcadores, el genotipo de QTL más
probable dentro del intervalo sería QQ. Así,
la única variable indicadora que asume valor
es x* y ese valor es 1 (p = 1), pues no exis-
ten desvíos debido a la dominancia y el alelo
Q incrementa el valor del carácter. El intervalo
M1M1M2m2 fue generado por una gameta pa-
rental y otra recombinante. Ahora es probable
que dentro del intervalo genético el genotipo
del QTL sea QQ o Qq con probabilidades 1-p
y p, respectivamente. El valor 1-p será máximo
cuando estemos cerca del genotipo marcador
M1M1 y mínimo cuando estemos próximos de
Figura 4. M2m2. Lo contrario sucederá con el valor de
p. Las variables x* y z* asumirán valores 1-p
de la razón de dos verosimilitudes, LR (LR por y p, respectivamente, cuyos valores variaran
Likelihood Ratio) o LOD score y 4) la presencia conforme nos desplacemos en el intervalo a
de un QTL es inferida cuando el máximo valor distancias ra. Con el mismo razonamiento se
de LR o de LOD obtenido es mayor a un um- pueden encontrar las probabilidades condicio-
bral previamente establecido (punto 3.4). nales de los genotipos QQ, Qq y qq para los
Haley y Knott (1992), presentaron un modelo intervalos M1M1m2m2 y M1m1M2m2.
de mapeo por intervalos basados en regresión.
El modelo adoptado para poblaciones F2 es: Según el modelo de Según Haley y Knott
(1992) una regresión es realizada para cada
Yj = µ + ax* + dz* + εj. valor de ra entre los marcadores M1 y M2. El
valor de ra que produzca el mayor valor de R2
donde: Yj = valor de la característica Y en el (coeficiente de determinación), LR o de LOD
individuo j; µ = media de la característica en la indica la localización del QTL. El test de sig-
población; a = efecto aditivo del locus que está nificancia de hipótesis, LR, según puede ser
siendo estudiado, sobre la característica Y; d = expresado como:
efecto de dominancia del locus que está siendo SCR (reducido)
estudiado, sobre a característica Y; x* y z* son LR 2 ln
SCR
las variables indicadoras (utilizadas para esti- (completo)
mar los efectos a y d del QTL) y dependen de

los genotipos de los marcadores flanqueantes educido)
= Suma de cuadrados del residuo del
del QTL, en el individuo j y εj = error aleatorio modelo reducido: Yj = µ + ej; SCR(completo) = Suma
para j-ésimo individuo. de cuadrados del residuo del modelo completo:
Yj = µ + ax* + dy* + εj ( para F2), Yj = µ + g1x*
Expliquemos como se obtienen los valores + εj (para Retrocruzamientos) y Yj = µ + ax* +
de las variables indicadoras x* y z* presenta- εj (para RIL y DH). Los valores de LOD se en-
dos en la Tabla 3. Para adjudicar estos valores cuentran dividiendo el valor LR por 4,61 (LOD
debemos respondernos la pregunta: Dado un = LR / 4,61).
intervalo genético de marcadores moleculares,
cuyo fenotipos son conocidos, ¿cuál es la pro- 3.3. Mapeo por intervalo compuesto
babilidad que dentro del intervalo el genotipo En el mapeo por intervalo, los tests de hi-
del QTL sea QQ, Qq o qq?. Consideremos el pótesis no son independientes de otros QTLs
intervalo genético M1M1M2M2. El genotipo de ligados al intervalo siendo analizado. Para
los marcadores indica que fue generado por QTLs no ligados al intervalo el efecto no es tan
el encuentro al azar de las gametas parenta- dramático, pero deben hacerse las siguientes
les M1M2. Dado que no existió recombinación consideraciones: 1) la segregación del QTL no

Tabla 3: Esperanza de los efectos genotípicos medios para un QTL para todos los po-
sibles genotipos de los marcadores flanqueantes, en una población F2, cuando no se
considera la ocurrencia de recombinaciones dobles en el intervalo.
Genotipo Probabilidad condicional Variables indicadoras

Marcador QQ Qq qq (a)x* (d)z*
M1 M1 M2 M2 1 0 0 1 0
M1 M1 M2m 2 1-p p 0 1-p p
M1 M1 m2m2 (1-p)2 2p(1-p) p
2
1-2p 2p(1-p)
M1m1 M2 M2 p 1-p 0 p 1-p
M1m1 M2m 2 cp(1-p) 1-2cp(1-p) Cp(1-p) 0 1-2cp(1-p)
M1m1 m2m2 0 1-p p -p 1-p
M1m1 M2 M2 p2 2p(1-p) (1-p)2 -(1-2p) 2p(1-p)
m1 m1M2m 2 0 p 1-p -(1-p) p
m1 m1m2m2 0 0 1 -1 0
p=ra/r ; (1-p)= rb/r; c=r2/[r2+(1-r)2] (Tomado de Schuster & Cruz, 2004).
ligado contribuye a la variación fenotípica; blación F2 pueden ser estimados los efectos
2) interfiere en la estimación del efecto del QTL aditivo y de dominancia, en un RC el efecto g1
y 3) removiendo el efecto de la segregación o g2 y sólo el efecto aditivo en poblaciones de
del otro QTL se reduce la varianza residual RILs y DH. Para determinar si el valor de cada
del intervalo en consideración, aumentando el efecto estimado es diferente de cero se usan
poder de detección y precisión. El mapeo por las estadísticas LR o LOD. En muchos trabajos
intervalo compuesto (Jansen 1993, 1994; Zeng de mapeo un valor de LOD superior a 2 – 3
1993, 1994), combina el mapeo por intervalo es utilizado como criterio para declarar la pre-
con la regresión múltiple. Esta última, permite sencia de un QTL. Esta forma de determinar el
incluir en el mapeo marcadores ubicados por valor umbral o crítico es arbitrario y la mayoría
fuera del intervalo como cofactores, incremen- de los autores no lo consideran el más adecua-
tando el poder de detección y precisión en la do, pues la probabilidad e detectar al menos un
estimativa de la posición del QTL. La pregunta falso positivo (declarar la real la presencia de
de cuántos cofactores deben utilizarse no es un QTL inexistente) en alguna región del ge-
de fácil respuesta. En principio los dos marca- noma es prácticamente 1 (100 %). Se propuso
dores que flanqueen el intervalo deben ser in- disminuir este sesgo determinando un nivel de
cluidos, al igual que aquellos que resulten sig- significancia para cada cromosoma. En este
nificativos en una regresión múltiple. Definidos caso, el nivel de corte para cada cromosoma
los marcadores que se utilizarán como cofac- correspondería al del genoma completo dividi-
tores, la metodología de mapeo por intervalo do el número de cromosoma o grupos de liga-
compuesto se aplica exactamente igual a la de mientos obtenidos. También es posible definir
mapeo por intervalo simple. un nivel de significancia para cada intervalo, di-
vidiendo la significancia del cromosoma por el
3.4. Test de hipótesis y nivel de número de intervalos en el grupo de ligamiento
significancia (número de marcadores menos uno).
La formulación de hipótesis adecuadas y Finalmente, el valor crítico de corte puede
utilización de estadísticos apropiados, para la establecerse empíricamente mediante el test
evaluación de las mismas, es esencial para de permutaciones que es actualmente el más
declarar la presencia de un QTL. En una po- usado. Para realizar este test deben numerar-

se los individuos de 1 a n. Los valores fenotípi- establecer el número, posición y efecto indivi-
cos de las características son tomados al azar dual de cada uno de los loci involucrados. Sin
y atribuidos a los individuos conforme vayan embargo, la identificación de QTLs en diversos
siendo retirados. El primer valor fenotípico reti- cultivos no ha concluido con la identificación de
rado es asignado al individuo 1, el segundo va- los genes responsables del fenotipo, cuya exis-
lor fenotípico al individuo 2, así sucesivamente, tencia se presume en el intervalo comprendido
se asignan todos los valores fenotípicos a cada entre marcadores flanqueantes de los mismos.
uno de los individuos. Los datos permutados Como consecuencia, la función biológica (o el
son analizados para detectar la presencia de modo de acción) de los genes responsables de
QTL, almacenando el mayor valor de LOD ob- los efectos de los QTLs es aún desconocida en
tenido. El proceso se repite de forma completa la mayoría de los casos reportados. Asimismo,
N veces, finalmente, los valores de LOD rete- la posibilidad de realizar un “caminado cromo-
nidos, son ordenados por orden de magnitud sómico” (cromosome walking) desde el marca-
permitiendo estimar el valor critico de cada dor flanqueante al QTL hacia la región física
test. El valor crítico de cada intervalo tendrá la donde reside el gen responsable con el fin de
magnitud N(1- α), o sea, si se realizaron 1000 aislarlo, depende de la distancia de recom-
permutaciones, la significancia de 5% será el binación entre el marcador y el gen, y de la
950 º valor ordenado. Se procede de la mis- relación de esa distancia con la distancia físi-
ma forma para obtener el valor de corte para ca real, que puede estar afectada por varios
un determinado grupo de ligamiento o para el otros factores, como fuera mencionado antes
genoma completo (conjunto de grupos de li- en este capítulo.
gamientos) considerando uno u otro en el test La creciente disponibilidad pública de infor-
de permutación. Cuanto mayor el número de mación de secuencias de transcriptos de ADN
permutaciones, mayor la precisión en el valor mensajero (Expressed Sequence Tags, ESTs),
crítico. junto con el grado de homología evidenciado
entre especies, ha permitido la generación de
4. Mapas y marcadores funcionales los llamados marcadores génicos o funciona-
En la historia del desarrollo de los marcado- les, cuya característica relevante es la de es-
res moleculares se ha priorizado la detección tar localizados en regiones codificantes del
de polimorfismos en regiones no codificantes genoma.
del genoma. Esto ha sido en función de asegu- ticipan en las llamadas mutaciones silencio-
rar la neutralidad fenotípica de los marcadores sas. Esto es, cuando el cambio nucleotídico se
y posibilidad de maximizar la variación entre produce en la tercera base del codón sin alte-
diferentes genotipos. Esta última caracterís- rar el aminoácido para el cual codifica. La iden-
tica está sustentada en que las regiones no tificación de SNPs puede inferirse directamen-
génicas del genoma no han sufrido presión de te a partir de datos de secuencias públicas, si
selección sobre las mutaciones que pudieran estas corresponden a distintos genotipos, o por
haber ocurrido en el transcurso de la evolución secuenciación de fragmentos de genes amplifi-
y por consiguiente ser más variables. La aso- cados por PCR de individuos diversos.
ciación de los marcadores con caracteres de Aunque históricamente se ha asumido que
interés, como se ha visto anteriormente, está las secuencias tipo microsatélites son propias
determinada por la distancia de recombinación del ADN no codificante, hoy sabemos que las
(o física) del marcador con el gen responsa- mismas pueden encontrarse también en regio-
ble del fenotipo. De esta manera, los mapas nes génicas. Si bien la frecuencia relativa de
genéticos basados en marcadores molecula- estos motivos es baja (< 5 %) la gran abun-
res han posibilitado la localización de regiones dancia de secuencias de ESTs en diversos cul-
cromosómicas estadísticamente asociadas a tivos, ha ocasionado que varios estudios ha-
caracteres de tipo cualitativos (monogénicos) yan usado esta estrategia para el desarrollo de
o cuantitativos (poligénicos o QTLs). Como ya marcadores moleculares. La selección de mo-
se ha visto, la determinación de QTLs permite tivos de trinucleótidos, aumenta la posibilidad

de encontrar SSRs polimórficos en regiones (RGAs) o genes pertenecientes a rutas meta-
codificantes, minimizando los posibles cam- bólicas particulares (por ejemplo: síntesis de
bios en el marco de lectura ocasionados por carbohidratos), o a integrantes de una familia
una variación en el número de repeticiones de génica (por ejemplo: genes de la familia P450).
motivos de di, tetra o pentanucleótidos. Estos Los mapas genéticos funcionales posibilitan
marcadores, denominados SSRs génicos o establecer una estrategia de genes candidatos
EST-SSRs, presentan las mismas ventajas en la identificación de factores responsables de
que los SSRs neutros que han sido enunciadas QTLs a nivel molecular, a través de la coinci-
en el Capítulo 5. dencia en la localización de QTLs y marcadores
Los marcadores CAPs requieren la existen- génicos. Un marcador funcional se convierte en
cia de un sitio de restricción polimórfico en la gen candidato cuando está asociado al carác-
secuencia génica, y si bien se han reportado ter fenotípico a través de un análisis de marcas
casos, los mismos son de baja ocurrencia. simple, o cuando en un mapa su localización
La aproximación más sencilla para el desa- coincide con un QTL. En el primer caso, tanto el
rrollo de un marcador funcional es a través de marcador como el carácter fenotípico deben es-
una amplificación por PCR de un fragmento de tar evaluados en la misma población, mientras
un gen y estableciendo la existencia de polimor- que en el segundo caso esto no es necesario, y
fismo entre genotipos a través de la resolución es factible comparar la posición de un marcador
del producto en geles de SSCP. Los polimorfis- funcional con QTLs de mapas de otras poblacio-
mos detectados mediante esta técnica se basa nes de la misma u otra especie. Por ejemplo, se
en que hebras simples de ADN con secuencias ha encontrado que el locus del gen Lin5 del cro-
distintas, migrarán diferencialmente en un cam- mosoma IX del tomate correspondiente a una
po eléctrico, en función de un diferente plega- invertasa vacuolar (responsable de la degra-
miento intra-cadena dado por la complementa- dación de sacarosa en glucosa y fructosa) co-
riedad de bases. Patrones de bandas distintos localizada con el QTL Brix9-2-5 de rendimiento
entre genotipos estarían indicando una varia- de azúcar de fruto, mientras que en papa el gen
ción de secuencia en el fragmento amplificado. ortólogo invGE está asociado a variaciones en
Sin embargo, no puede asegurarse identidad el nivel de azúcares reductores en tubérculos de
de secuencia de dos fragmentos amplificados, una población segregante, y su posición coinci-
por no observarse diferencias en los patro- de con el QTL Sug9a, responsable del endulza-
nes de electroforesis, ya que la detección de miento por frío en tubérculos de otra población
las mismas es un balance entre el número de de papa. Análogamente se ha encontrado que
SNPs presentes y el tamaño del fragmento am- marcadores funcionales, basados en análogos
plificado. Los polimorfismos presentados por a genes de resistencia (RGAs) se asocian en
los marcadores funcionales pueden entender- diferentes especies a resistencias a distintas
se como variantes alélicas, que pueden o no enfermedades fúngicas y virales.
estar asociados a una variación a nivel protei- Asimismo, en caracteres complejos donde se
co, ya sea en estructura o expresión. De todos hayan establecido múltiples QTLs, los marcado-
modos, estos marcadores, análogamente a lo res funcionales permiten establecer la interac-
enunciado antes en este capítulo, pueden uti- ción entre éstos a la luz de las rutas metabólicas
lizarse para generar mapas genéticos, que al involucradas, pudiéndose identificar enzimas
estar formados por marcadores funcionales se claves para la manifestación del carácter. Esta
denominan mapas funcionales. información genera un marco adecuado para
Los mapas funcionales en general están ba- estudios de ingeniería metabólica.
sados en mapas pre-existentes de marcadores El mejoramiento genético asistido por marca-
neutros con el agregado de marcadores fun- dores moleculares (MAS) encuentra en los mar-
cionales. Estos marcadores funcionales pue- cadores funcionales una situación ideal en la
den corresponder a genes sin relación entre sí, que la recombinación entre el gen responsable
como por ejemplo en mapas de ESTs-SSRs, y el marcador es nula, ya que ambos guardan
o incluir análogos de genes de resistencia identidad.

Al estar diseñados sobre genes, la transfe- recombination frequency. En: The genetic analy-
rencia de estos marcadores a través de espe- sis of quantitative traits. (First edition). Chapman
cies está beneficiada, dada la mayor conserva- & Hall. London. pp. 120-132
ción de las secuencias codificantes. Asimismo, LANDER, E. S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.;
BARLOW, A.; DALY, M. J.; LINCOLN, S. E. y
la comparación de mapas funcionales aporta
NEWBURG, L. 1987. MAPMAKER: an interac-
información en estudios de sintenía (conserva- tive computer package for constructing primary
ción del tipo y orden de marcadores entre es- genetic linkage maps of experimental and natu-
pecies relacionadas), evolución y especiación ral populations. Genomics 1:174–181.
entre diferentes organismos. LANDER, E.S. y BOTSTEIN, D. 1989. Mapping
Del mismo modo, la utilización de marcadores mendelian factors underlying quantitative traits
funcionales en la conservación de los recursos using RFLP linkage maps. Genetics 121: 185-
genéticos permite ponderar la diversidad gené- 199.
tica existente en base a las variantes alélicas ORTIZ, J. P. A.; PESSINO, S. C.; BATH, V.; HAY-
intra e inter-específicas. Concordantemente, WARD, M. D. y QUARÍN, C. L. 2001. A genetic
linkage map of diploid Paspalum notautm. Crop.
los estudios de genética de asociación (o ma-
Science 41: 823-830.
peo de asociación), basados en el desequilibrio RUSSELL, P.J. 1996. Mendelian Genetics. En: Ge-
de ligamiento entre un marcador y un carácter netics, Chapter 2 (4th Edition). Harper Collins
fenotípico en una población de individuos no College Publishers, New York. pp. 17- 46
relacionados (como es el caso de los bancos SAX, K. (1923) The association of size differences
de germoplasma) se presenta robustecido por with seed coat pattern and pigmentation in Pha-
el uso de marcadores génicos. seolus vulgaris. Genetics 8:552-560
Finalmente, la correlación de los marcadores SCHUSTER, I. y CRUZ, C. D. 2004. Estatística ge-
funcionales con datos fenotípicos o con QTLs nômica aplicada a populações derivadas de cru-
sólo sugiere la función putativa de un gen y zamentos controlados. Primera Edición. Viçosa,
Brasil. Ed. UFV. pp 568.
sus variantes alélicas. Es por esto que la con-
STAM, P. 1993. Construction of integrated genetic
firmación definitiva de la función génica debe linkage maps by means of a new computer pack-
realizarse mediante estrategias más directas age: JoinMap. Plant J. 3:739–744.
como ensayos de complementación y/o silen- WEISING, K.; NYBON, H.; WOLFF, K. y KAHL, G.
ciamiento génico. 2005. Linkage analysis and genetic maps. En:
DNA Fingerprinting in plants. Principles, Me-
thods, and Applications (2nd Edition). CRC Press,
5. Bibliografía y lecturas recomendadas: Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida. pp.
277-289
YOUNG, N.D. 1994 Constructing a plant genetic
ALLARD, R. W. 1956. Formulas and tables to faci- linkage map with DNA markers. En: DNA-based
litate the calculation of recombination values in markers in plants. Advances in cellular and mo-
heredity. Hilgardia 24: 235–278. lecular biology of plants. Vol. 1. (PHILLIPS, R. L.
FEINGOLD, S. E.; LLOYD, J.; NORERO, N.; BO- y VASIL, I. K. Editors). (1st edition). Kluwer Aca-
NIERBALE, M. y LORENZEN, J. 2005. Map lo- demic Publishers. Dordrecht, The Netherlands.
cation and diversity values for new potato SSRs pp. 39-57
developed from EST databases. Theor. Appl. YULE, G.U. 1902. Mendel´s laws and their probable
Genet. 111: 456-466. relation to intra-racial heredity. New Phytol. 1:
GELDERMANN, H. 1975. Investigations on inheri- 193-207.
tance of quantitative characters in animals by
gene markers. I. Methods. Theor. Appl. Genet.
46: 319-330.
HALEY, C. S. y KNOTT, S.A. 1992. A simple regres-
sion method for mapping quantitative trait loci in
line crosses using flanking markers. Heredity 69:
315-324.
JANSEN, R. C. 1993. Interval mapping of multiple
quantitative trait loci. Genetics 135: 205-211.
KEARSEY, M. J. y POONI, H.S. 1996. Estimation of

I CAPÍTULO 7. se encuentran disponibles las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de miles de genes
y productos génicos codificados por los ge-
Genómica nomas de varios organismos complejos. Esta
información se utiliza para el estudio de en-
Viviana Echenique; Juan P. Selva; Mauro Meier; fermedades humanas complejas y para com-
Pablo Roncallo; Gustavo Schrauf prender fenómenos tales como la fisiología
celular, el desarrollo, la conducta, la evolución,
etc. También aportan información acerca de to-
1 Introducción dos los aspectos del crecimiento y desarrollo
La «genómica» se desarrolló en las ulti- vegetal, diferenciación y respuesta a estreses
mas dos décadas como consecuencia de los bióticos y abióticos. Gracias al potencial de re-
avances realizados en biología molecular e lacionar fenotipos biológica y económicamente
Informática, dos áreas de la ciencia que han importantes con los genes responsables de los
tenido un desarrollo tecnológico enorme, gene- mismos actualmente es posible identificar ge-
rando una revolución en el conocimiento y en nes de interés para ser transferidos a otros or-
la comprensión de los procesos biológicos. ganismos por medio de tecnología génica. Por
El término fue acuñado en 1986 por Thomas otro lado, el conocimiento de la secuencia de
Roderick para referirse a la subdisciplina de la los genes posibilita el desarrollo de marcadores
genética que se ocupa del mapeo, secuen- perfectos, basados en la secuencia del mismo
ciación y análisis de las funciones de geno- gen, lo cual facilita la selección y la transferen-
mas completos y sirvió de nombre para una cia de los mismos a variedades de interés. La
revista especializada en la publicación de los conjunción entre tecnología génica, marcado-
mencionados temas, “Genomics”. Consiste res moleculares, genómica y bioinformática ha
en la caracterización molecular de genomas revolucionado el mejoramiento genético vege-
enteros y aporta información acerca de la se- tal, dando origen a lo que se denomina mejo-
cuencia y de la función de cada sector del ge- ramiento molecular y se están desarrollando
noma en diferentes situaciones de desarrollo nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1).
y bajo diferentes condiciones ambientales, así La genómica puede dividirse en:
como de los mecanismos implicados en la re-
gulación de la expresión e interacción génica. - Genómica estructural, que se ocupa de
Para ello, las herramientas que se utilizan la caracterización física de los genomas.
para el análisis individual de genes o peque-
ñas regiones cromosómicas, se aplican al aná- - Genómica funcional, que caracteriza el
lisis global de genomas completos, estudian- transcriptoma, que está constituido por el
do en conjunto los miles de genes, proteínas conjunto completo de transcriptos producidos
y metabolitos que constituyen un organismo, por un organismo, el proteoma o conjunto de
así como las complicadas redes de interac- proteínas codificadas por un genoma, y el me-
ciones que operan entre ellos. La información taboloma o conjunto total de metabolitos de
generada es enorme y es clave para la identi- una célula, consecuencia de la función de los
ficación y el aislamiento de genes de interés y ARN y proteínas.
permitirá interpretar, en términos moleculares,
los procesos biológicos. Para ayudar en este El objetivo de la genómica es la dilucidación
proceso han surgido poderosas herramientas completa y exacta de la secuencia de ADN de
bioinformáticas que permiten almacenar e in- un genoma haploide representativo de una es-
terpretar esta información. pecie. Cuando esta secuencia se conoce, abre
Las aplicaciones de la genómica alcanzan a la puerta a numerosas posibilidades.
todos los ámbitos de la actividad humana re- Por análisis computacional de la misma y
lacionados con la biología, como la salud, la utilizando principios conocidos de genética es
alimentación y el medio ambiente. Actualmente posible:

Figura 1: La conjunción entre tecnología génica, marcadores moleculares, genómica y bioinformática re-
volucionaron el mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos cultivares. Los nuevos genes
hallados son introducidos en plantas por tecnología génica. Esto a su vez permite establecer la funciona-
lidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permite la obtención de mapas, marcadores perfec-
tos y realizar selección asistida por marcadores moleculares (MAS), así como el fenotipeado molecular.
Gentileza de G. Spangenberg.
• Comparar secuencias similares presen- nes codificantes y no codificantes del genoma.

tes en diferentes entidades biológicas y Catalogar las variaciones genéticas entre indivi-
comprender la función de las mismas. duos ayudará a identificar aquellos cambios que
• Realizar predicciones acerca de to- conducen a enfermedades genéticas, investi-
das las proteínas codificadas por una gar nuevas terapias y establecer la resistencia
especie. o susceptibilidad a diferentes factores. Para la
• Establecer las variaciones genéticas comparación de secuencias se utiliza el algorit-
entre distintas poblaciones de una mismo BLAST (basic local alignement search tool:
ma especie. herramienta de búsqueda de alineación local
Comparar secuencias de diferentes espe- básica), para lo cual existen distintos programas
cies y entender procesos evolutivos. que permiten hallar regiones similares entre di-
ferentes genes (Parte I, Cap. 12).
Esto ha dado origen a la genómica compa- En Febrero de 2001, coincidiendo con el cin-
rativa y ha demostrado que existe considerable cuenta aniversario de la publicación del modelo
sintenia, es decir, una localización conservada estructural del DNA por Watson y Crick, la revis-
de genes en posiciones equivalentes en espe- ta Nature publicó el primer borrador del genoma
cies relacionadas (Fig. 2). También ha sido una humano, que ha sido secuenciado completa-
excelente herramienta para identificar motivos mente. También se han secuenciado otros ge-
de secuencia altamente conservados y, por lo nomas como maíz, colza, soja, trébol, raigrás,
tanto, funcionalmente importantes en regio- etc. (Tabla 1).

Tabla 1. Ejemplos de genomas secuenciados en los últimos años.
Especie Tamaño del genoma
Haemophilus influenzae 1.830.137 pb

Mycoplasma genitalium 580.070 pb
Methanococcus jannaschii 1.660.000 pb
Bacterias Helicobacter pylori 1.667.867 pb
Escherichia coli 4.639.221 pb
Bacillus subtilis 4.214.810 pb
Treponema pallidum 1.138.006 pb
Levadura (Saccharomyces cerevisiae ) 12.052.000 pb
Trichomonas vaginalis 160 Mpb

Nematodo (Caenorhabditis elegans) 97 Mpb
Organismos Mosca del vinagre ( Drosophila melanogaster ) 120 Mpb
Eucariotas Mosquito de la malaria ( Anopheles gambiae ) 278 Mpb
Mosquito del dengue y fiebre amarilla (Aedes aegypti ) 1.380 Mpb
Abeja (Apis mellifera) 236 Mpb
Protozoo malaria ( Plasmodium falciparum ) 22 Mpb
Sorgo (Sorghum bicolor ) 700 Mbp

Plantas Arroz (Oryza sativa ssp. japonica e indica) 420 - 466 Mpb
Pez globo (Tetraodon nigroviridis ) 300 Mpb

Gallo rojo de la jungla ( Gallus gallus) 1.000 Mpb
Zarigüeya (Marsupial, Monodelphis domestica) 3.475 Mpb
Ratón (Mus musculus ) 2.500 Mpb
Vertebrados Rata (Rattus norvegicus ) 2.750 Mpb
Perro (Canis familiaris ) 2.411 Mpb
Chimpancé (Pan troglodytes ) 2.843 Mpb
Macaco rhesus (Macaca mulatta) 2.870 Mpb
Humano (Homo sapiens ) 3.000 Mpb
Figura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramíneas. El genoma de arroz contiene grupos de mar-
cadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden
sintetizarse básicamente como compuestos por «bloques de ligamiento de arroz». En la figura se muestra
el alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras mayúsculas)
de varias gramíneas con los del arroz (centro). El genoma del maíz tiene dos copias semejantes de cada
bloque de genes por lo que está representado por dos anillos del círculo. Las líneas externas punteadas
conectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Modificado de Gale y Devos (1998).

También es posible estudiar todos los genomas 2 Genómica estructural
bacterianos asociados a genomas más complejos, Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma
sin necesidad de aislar y de cultivar especies micro- es caracterizar la estructura del genoma. Conocer
bianas particulares. Esto se denomina metagenó- la estructura de un genoma individual puede ser de
mica (Parte I, Cap. 11). Para este estudio se extrae utilidad para manipular genes y segmentos de ADN
todo el ADN de una comunidad microbiana de un en una especie particular. El análisis comparativo
ambiente particular (suelo, agua de mar, intestino de diferentes genomas posibilitará deducir reglas
humano, etc.), se determina que genes se encuen- generales que gobiernan la estructura de todos los
tran presentes, cuales son sus funciones y las dife- genomas.
rencias que existen entre distintas comunidades a La genómica estructural procede a través de ni-
este nivel. veles incrementales de resolución analítica, comen-
Más recientemente ha surgido la denominada zando con la asignación de genes y marcadores a
“Genómica Sintética”, que pretende crear formas cromosomas individuales, mapeando estos genes y
sintéticas de vida recreando genomas artificiales, marcadores dentro de los cromosomas, finalizando
células con vías metabólicas predeterminadas y pro- con la preparación de un mapa físico a través de
piedades catalíticas especificas. Involucra el redise- la secuenciación. Es decir, que se procede desde
ño y la fabricación de sistemas biológicos. Como un mapeo genético de baja resolución, basado en
ejemplo podemos citar el transplante de un genoma el análisis de recombinación meiótica, hacia uno de
de una célula bacteriana a otra. alta resolución, basado en marcadores moleculares,
A continuación se brinda un panorama global llegando a la realización de un mapa físico, basa-
acerca de la forma en que se articulan los proyec- do en la secuencia de fragmentos clonados parcial-
tos de genómica, algunos resultados relevantes, las mente solapantes (Fig. 3).
aplicaciones en agricultura y el estado de la investi-
gación en Sudamérica. Los pasos a seguir son:
1) -Asignación de genes a los cromosomas
2) -Mapeo Cromosómico
marcador 2
marcador 1 gen marcador 3
3) -Mapeo de Restricción
gen marcador 2
3) -Mapeo Físico
gen fragmentos
clonados
Figura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. La genómica estructural procede desde un

mapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación meiótica, a uno de alta reso-
lución, basado en marcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico, basado en la secuencia
de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2004).

- Mapeo cromosómico de baja resolución físico determinando qué fragmentos poseen marca-
(ubicación de genes que producen fenotipos mutan- dores en común. Las distancias físicas se miden en
tes conocidos y algunos marcadores). Las distan- kilobases (kb) o megabases (Mb).
cias genéticas se basan en frecuencias de entrecru- - Anclado del mapa genético en el mapa físi-
zamientos («crossing overs») y son medidas como co.
porcentaje de recombinación en centimorgans (cM). - Secuenciación de ADN a gran escala, que
- Mapeo genético de alta resolución de cada brinda un mapa completo de cada cromosoma.
cromosoma (con marcadores moleculares ubicados - Anclado del mapa genético y del mapa físi-
muy próximos entre sí). co en el de secuencia. Las distancias físicas ge-
- Mapeo físico, basado en distancias molecula- neralmente no se correlacionan directamente con
res, resultantes de mapas de fragmentos de restric- las distancias genéticas porque las frecuencias de
ción parcialmente superpuestos. La distancia entre recombinación no son siempre proporcionales a las
dos marcadores puede ser medida determinando el distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las
tamaño de los fragmentos de restricción que los con- dos correlacionan razonablemente bien en regiones
tienen, siendo el fragmento más pequeño que lleva eucromáticas de los cromosomas (aquellas menos
ambos marcadores una estimación de la distancia condensadas, que se colorean de manera más difu-
entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y sa). En humanos, un cM es equivalente, en prome-
enzimas de restricción puede construirse un mapa dio, a aproximadamente 1 Mb de ADN.
1) -Asignación de genes a los cromosomas
2) -Mapeo Cromosómico
marcador 2
marcador 1 gen marcador 3
3) -Mapeo de Restricción
gen marcador 2
3) -Mapeo Físico
gen fragmentos
clonados
Figura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. La genómica estructural procede desde un

mapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación meiótica, a uno de alta reso-
lución, basado en marcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico, basado en la secuencia
de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2004).

2.1 Asignación de loci a crosomas intervalos recombinacionales entre genes co-
específicos. nocidos contienen cantidades muy grandes de
ADN. Estos intervalos o «gaps» no pueden ser
Se utilizan los siguientes métodos: completados utilizando análisis de ligamiento
- Ligamiento a loci conocidos: análisis debido a la ausencia de marcadores en esas
tradicional basado en cruzamientos, en espe- regiones. Para llenarlos y construir mapas de
cies en las que es factible hacerlo. alta resolución surgieron los marcadores mole-
- Electroforesis de campo pulsátil: se usa culares, entre los que se encuentran los RFLP
en el caso de especies que poseen cromoso- y los SSLP (mini y microsatélites)(Parte I, Cap.
mas pequeños, separables por esta técnica, 5). Estos marcadores permiten la construcción
como sucede con los de levaduras. Las ban- de mapas genéticos con una densidad de un
das en el gel corresponderían a cromosomas marcador/centimorgan (cM). Aunque tal reso-
individuales y pueden utilizarse para locali- lución es un logro muy importante, un centi-
zar nuevos genes por hibridación. Prime- morgan representa, en humanos, una mega-
ro, utilizando sondas de localización conocida base, lo que equivale a un millón de pares de
se establece que banda corresponde a cada bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolución
cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de actualmente existen los SNP, que son marca-
ubicación desconocida se utiliza como sonda dores basados en el polimorfismo de un solo
para asignarle una posición en un cromosoma nucleótido.
determinado. - Hibridación in situ: cuando se dispone de
- Híbridos celulares interespecíficos, un gen clonado éste puede ser utilizado como
por ejemplo humano-ratón. Se utiliza exclusi- para hibridar con los cromosomas in situ, para
vamente en mapeo del genoma humano o de lo cual se lo marca radiactivamente o por fluo-
especies animales. Se establecen bancos de rescencia. Puede, de ese modo, identificarse
líneas celulares que contengan todos los cro- a los cromosomas portadores de la secuencia,
mosomas del roedor y un cromosoma huma- determinar si son secuencias específicas de un
no particular. Siempre incluye un cromosoma cromosoma y determinar la posición del gen en
humano que lleva un alelo salvaje defectivo el mismo. En el caso de fluorescencia, la téc-
para una función bioquímica determinada en el nica se denomina FISH («fluorescence in situ
genoma del ratón. Si sobreviven en un cultivo hybridization»). La localización del fragmento
deficiente para el factor que no sintetizan es en el cromosoma se visualiza como un punto
porque llevan el alelo humano equivalente, que brillante (Parte I, Cap. 3).
complementa la función faltante. - Mapeo físico de los cromosomas: apor-
ta un nivel de resolución mayor. Se trata de
2.2 Ubicación de los genes a lo largo del identificar un conjunto de fragmentos de ADN
cromosoma clonados superpuestos que, juntos represen-
El próximo nivel de resolución consiste en ten un cromosoma o un genoma completo. Los
determinar la posición de un gen o marcador mapas así obtenidos se llaman mapas físicos,
molecular sobre el cromosoma. Este paso es porque el ADN es el material físico del genoma.
importante porque los mapas genéticos pue-
den alinearse con los mapas físicos y utilizarse 2.3 Secuenciación a gran escala del
para validar los mismos. genoma
- Generación de bancos de EST (etique-
- Mapeo por recombinación: en los casos tas de secuencias expresadas)
en que ha sido factible hacerlo (organismos La complejidad de los genomas eucariotas
experimentales como levaduras, mosca de la hace aconsejable, como primera aproxima-
fruta, ratón, Arabidopsis, etc.) ha posibilitado la ción, no abordar el estudio del genoma comple-
construcción de mapas que a lo largo de los to. Es preferible estudiar sólo una fracción del
años aparecen repletos de genes con efectos mismo, es decir, aquellos genes que se están
fenotípicos determinados. Sin embargo, los expresando en un momento determinado de la

ADN Genómico
Genoteca de BACS
Clones organizados
en Contigs
BAC a ser secuenciado
Subclones (‘shotgun clones’)
Secuenciado
Ensamblado
Figura 4: Estrategia de secuenciado jerárquico («hierarchical shotgun sequencing strategy»). El primer

paso consiste en construir una genoteca por fragmentación del ADN e introducción del mismo en vectores
que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los fragmentos de ADN representados en la misma
son organizados en un mapa físico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados para lo cual
se hace una nueva genoteca de trozos más pequeños («shotgun library»). La secuencia de los clones se
ensambla finalmente para reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicación del Interna-
tional Human Genome Sequencing Consortium, 2001
vida del organismo. Para ello se obtienen po- genoma completo. Para ello, el ADN genómi-
blaciones de ADNc (que reflejan sólo secuen- co total se digiere con enzimas de restricción
cias expresadas) que se secuencian de forma apropiadas o se fragmenta mecánicamente en
masiva para generar miles de secuencias par- fragmentos de gran tamaño (100-300 kb.), que
ciales conocidas como ESTs (Parte I, Cap. 8). se clonan en vectores apropiados, para cons-
Estas secuencias de entre 300-500 pb. suelen truir genotecas que contienen, al menos, una
ser suficientes para la identificación de los ge- representación completa del genoma, que pue-
nes mediante comparación con las secuencias de estudiarse en detalle y secuenciarse (Parte
existentes en las bases de datos públicas (ej. I, Cap. 4). A fin de distinguir las regiones codi-
Genbank, EMBL), utilizando para ello progra- ficantes de las no codificantes, las secuencias
mas de análisis informático (Parte I, Cap.12). se comparan con las de ESTs y ADNc previa-
Si la información contenida en la secuencia mente estudiados.
parcial no es suficiente, habría que determinar
la estructura del ADNc completo para estudiar Para reconstruir la secuencia del genoma
su función por otros métodos. original a partir de los fragmentos clonados se
utilizan las siguientes estrategias:
- Secuenciación genómica
La aproximación anterior no permite iden- a) Secuenciación de los clones y
tificar genes que se expresan a bajo nivel o ensamblado de los fragmentos
en situaciones fisiológicas no consideradas o El clonado comienza obteniendo un número
regiones no representadas en el ARNm. Para elevado de fragmentos al azar que se clonan
obtener esta información debe secuenciarse el en un vector apropiado. En la preparación de

mapas físicos de genomas se utilizan vectores genomas completos (whole genome shotgun
como los cósmidos, YACs, BACs y PACs, que sequencing) (Fig. 5). Todos los estadios del
aceptan insertos de gran tamaño (Parte I, Cap análisis genómico como la preparación de clo-
4). El contenido de estos clones se caracteriza nes, el aislamiento de ADN, la electroforesis y
y se ordenan, buscando los puntos de solapa- la secuenciación han sido bien adaptados a di-
miento o superposición. Un conjunto de clones ferentes máquinas o robots, automatizando el
solapantes se llama contiguo. Para establecer trabajo.
el solapamiento de clones se secuencian re-
giones cortas del inserto proximas al sitio de b) Ordenamiento de los clones
clonado utilizando primers posicionados en el Se utilizan varias técnicas para ordenar los
vector. Los intervalos sin secuencias (gaps) se clones en contiguos. Entre ellas:
completan utilizando el final de un fragmento - FISH: para localizar las posiciones aproxi-
clonado para llegar al siguiente (primer wal- madas de insertos grandes.
king). A medida que se van caracterizando los - Fenotipificación (fingerprinting): se cor-
clones, los contiguos se alargan y van conta el clon con enzimas de restricción que ge-
vergiendo unos con otros. El proyecto termina neran un grupo de bandas que representan
cuando se tiene un conjunto de contiguos que un «fingerprint» o «huella digital» del clon. Las
equivale al número de cromosomas de la es- bandas generadas por varios clones pueden
pecie en estudio. En la Figura 4 se resume una alinearse visualmente o por un programa de
estrategia de secuenciación jerárquica (hierar- computación para determinar si se superponen
chical shotgun sequencing). Esta se usa para o solapan.
genomas grandes. Para genomas más peque- - STS («sequence tag sites» o sitios de
ños se utiliza otra, llamada secuenciación de secuencia marcada): son secuencias cortas
Figura 5: Montaje de un genoma complejo mediante la secuenciación completa del genoma por tiros de
escopeta («whole genome shotgun sequencing»). En primer lugar, se construyen los contiguos con las
secuencias que se superponen. Finalmente se utilizan los extremos apareados para cubrir los intervalos
sin secuencia y así orientar y ordenar los contiguos en unidades llamadas andamios (scaffolds) Modificado
de Griffths et al. (2004).

de insertos grandes clonados. Se reúne un mismo. El mismo actúa como punto de partida
conjunto de clones al azar y se cortan en frag- para el caminado cromosómico (chromosome
mentos más pequeños que se clonan en λ y se walking), donde los fragmentos finales del mar-
secuencian pequeñas regiones de cada uno. cador ligado son utilizados como sondas para
Para ello se diseñan primers que amplifican seleccionar otros clones de la genoteca. Del
una secuencia corta de ADN (STS). segundo grupo de clones (los que solapan con
el inicial) se hacen mapas de restricción y los
Actualmente existe una tecnología más fragmentos obtenidos son utilizados para rea-
moderna para el secuenciado de genomas, lizar una nueva ronda de selección de clones
la pirosecuenciación. Esta técnica utiliza es- superpuestos. Así el proceso de «caminado»
feras atrapadas en una placa que contiene se mueve hacia ambos lados a partir del sitio
1.600.000 microceldas. Cada esfera (una por inicial, que culmina cuando se llega al gen de
microcelda) permite realizar una reacción de interés. Existe otra técnica relacionada llamada
secuenciación individual, basada en la síntesis salto cromosómico, que permite saltar a través
complementaria de un ADN de cadena sencilla, de áreas distantes y potencialmente no clona-
previamente multiplicado por PCR y alineado a bles del ADN y genera «marcas», ampliamen-
cada esfera. La incorporación de cada nucleó- te espaciadas a lo largo de la secuencia, que
tido durante la síntesis de ADN libera una mo- pueden utilizarse como puntos de inicio para
lécula de pirofosfato (PPi), que al interactuar múltiples caminatas cromosómicas bidireccio-
con enzimas presentes en el medio (luciferasa, nales. Esta técnica consiste en crear fragmen-
entre otras) produce una señal quimioluminis- tos grandes (entre 80-150 kb) por restricción
cente captada por una cámara de detección del ADN en la región que se cree contiene al
de fotones, la traducida en una computadora gen de interés. Cada fragmento de ADN es
como la adición de un nucleótido determinado, luego circularizado, poniendo en contacto los
generando una secuencia individual por cada extremos libres. Este procedimiento acerca
celda. Esta tecnología, desarrollada por la em- puntos relativamente distantes de la región
presa 454 Life Sciences, dio lugar a la creación de genoma en estudio. Se trata de generar en
del primer equipo de secuenciación masiva esa unión un sitio que no sea cortado en una
(Secuenciador GS 20™) diseñado para se- posterior restricción, de manera que esas dos
cuenciar genomas bacterianos, con una capa- regiones que estaban distantes en el genoma
cidad para descifrar 20 millones de bases por ahora estén unidas en un fragmento. El círculo
corrida (4hrs) en secuencias individuales de se corta con una nueva enzima de restricción
±100 bases. En el proyecto del género Bacillus, y los fragmentos obtenidos, entre los que se
que tiene un genoma de aproximadamente 4 encuentran los sitios de unión, se clonan en
Mb, con seis corridas se descifraron 129.6 Mb, fagos.
con una cobertura mayor a 20x de su genoma. Esto es lo que se llama una «genoteca de
En comparación, por el método de Sanger, se saltos». Una sonda del sector de comienzo de
logró una cobertura de 3x (12,5Mb). la región que contiene al gen de interés puede
utilizarse como punta de partida para comenzar
3 Utilización de mapas genómicos para el a «saltar» por el genoma. Un salto puede, por
análisis genético ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de
Los mapas genéticos y los físicos son un im- interés. Una vez allí, el otro extremo de la unión
portante punto de partida para varios tipos de del fragmento inicial se corta y se usa para
análisis genético, incluyendo el aislamiento de buscar el siguiente punto de salto en la geno-
genes y genómica funcional. teca. O sea que a través de las uniones se va
Por ejemplo: avanzando hacia el punto donde se encuentra
- Aislamiento de genes por clonado po- el locus. Cada posición de salto es un punto de
sicional: para ubicar un gen cuya secuencia partida para una caminata cromosómica. Estas
se desconoce se puede partir de un marcador regiones se van secuenciando. Allí comienza
conocido que esté estrechamente ligado al la búsqueda de genes utilizando programas

de predicción y se seleccionan las secuencias 4 Análisis funcional de los genes
candidatas. Esta estrategia de saltos se utilizó Una vez secuenciado el genoma completo
para clonar el gen de la fibrosis quística, que pueden identificarse la mayoría de los genes
es una enfermedad humana que resulta fatal y de una especie. Restaría entonces determinar
es causada por mutaciones en un gen de gran cuál es la función de cada uno de ellos y cómo
tamaño localizado en el cromosoma 7. interaccionan para definir un fenotipo determi-
- Estrategia del gen candidato: la caracte- nado. La genómica funcional intenta resolver
rización de una región cromosómica hace que esta cuestión a través del estudio de:
aparezcan varios genes de función descono-
cida. Si un gen de interés es mapeado en esa - El transcriptoma: se refiere al estudio de
región, estas secuencias pasan a ser «candi- los perfiles de expresión de todos los genes
datas». Para cada una de ellas, o para la más presentes en el genoma. Para ello se extraen
probable, de acuerdo al análisis de secuencia, todos los ARNm contenidos en una célula, te-
se diseñan experimentos tendientes a determi- jido u órgano en un determinado momento de
nar en cuales tejidos se expresa, en qué condi- desarrollo o situación fisiológica. El método
ciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. más utilizado es el de micromatrices de ADN,
Si el patrón de expresión encontrado coincide que permite analizar simultáneamente la ex-
con el patrón esperado es altamente probable presión de miles de genes, pudiéndose dis-
que hayamos encontrado el gen de interés. El poner entre 5000-50.000 genes (ESTs, ADNc,
experimento ideal para confirmar esto, sería la oligonucleótidos) sobre un portaobjetos utili-
transformación de un individuo mutante para zando un sistema robotizado. Sobre este chip
esta función con el gen normal. Si se produ- de ADN se realizan experimentos de hibrida-
ce la reversión del fenotipo mutante (comple- ción con muestras marcadas radiactivamente
mentación), tendremos la prueba irrefutable o con fluoróforos apropiados, y los resultados
de que estamos frente al gen buscado. se cuantifican mediante análisis con phospho-
- Genes con patrones complejos de he- rimager o microscopía confocal. De esta mane-
rencia: no todos los genes muestran patrones ra se pueden identificar, de forma simultánea,
simples de herencia. Puede suceder que: los patrones de expresión de miles de genes
- La variación fenotípica sea cuantitativa, en un momento del desarrollo o en respuesta
como peso o altura. Este tipo de variación se a diferentes estímulos ambientales. El análisis
debe a la interacción acumulativa entre alelos bioinformático de estos datos permite asociar
+ y – de varios genes y el ambiente. grupos de genes que se expresan de forma co-
La disponibilidad de miles de marcadores ordinada y proporciona información importante
moleculares como los SSLP, dispuestos a lo sobre la función de los mismos (Parte I, Cap. 8).
largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo - El proteoma: comprende el conjunto to-
de algunos de estos genes que contribuyen a tal de proteínas expresadas por un genoma
la variación cuantitativa cuyos loci son llama- completo, incluyendo las modificadas des-
dos QTL (quantitative trait loci) (Parte I, Cap. pués de la traducción. El estudio del transcrip-
5 y 6). Para abordar este problema, se buscan toma debe ser complementado con el análisis
dos tipos de líneas que muestren fenotipos de las proteínas codificadas por los transcrip-
contrastantes para un carácter cuantitativo y se tos, puesto que estas macromoléculas están al
cruzan para generar descendencia homocigota final de la ruta de expresión génica. El método
que contenga solo un segmento o un peque- más utilizado para estudiar la abundancia re-
ño número de segmentos de una de las líneas. lativa de cientos de proteínas es la electrofo-
Estos individuos pueden caracterizarse por su resis bidimensional en geles de poliacrilamida
fenotipo y puede estimarse la contribución de (2DPAGE), que permite separar con gran reso-
los segmentos específicos a la variación obser- lución la mayoría de los polipéptidos celulares
vada. Los SNP (polimorfismos de un nucleó- combinando de forma secuencial diferencias
tido simple) aceleran el mapeo de caracteres en carga y en masa molecular. Utilizando sis-
complejos. temas computarizados de análisis de imagen

se seleccionan las proteínas cuya abundan- en cuenta la envergadura de un proyecto de
cia relativa cambia durante el desarrollo o en secuenciado, los emprendimientos genómicos
respuesta a diferentes estímulos ambientales tomaron especies modelo, representativas de
(Parte I, Cap.9). un genoma vegetal. El primer modelo vegetal
- El metaboloma: comprende el conjunto fue una dicotiledónea, Arabidopsis thaliana.
total de metabolitos de una célula. En plan- Le siguió una monocotiledónea, el arroz, cuyo
tas, el metabolismo secundario (reacciones genoma es seis veces menor que el del maíz
que no son vitales para el individuo y que con- y 37 veces menor que el del trigo. El estudio
ducen a la producción de compuestos que a de estas dos especies permitirá arribar a cono-
veces ayudan a su supervivencia, como por cimientos clave para el mejoramiento vegetal.
ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, Arabidopsis thaliana es una dicotiledónea
taumatina, vainillina, menta, etc.) produce una que posee uno de los genomas vegetales
enorme variedad de compuestos diferentes. más pequeños. Carece de importancia
Se han identificado más de 40.000 y se esti- económica pero resulta ser un excelente or-
ma que aún quedan por descubrir alrededor de ganismo para la investigación puesto que es
100.000. Los investigadores que trabajan en fácil de transformar y su ciclo de vida tarda sólo
este nuevo campo de la química aplicada a la 7 semanas, de semilla a semilla. Alrededor de
biología (metabolómica) consideran que sólo 12.000 científicos trabajan coordinadamente
de esta forma se podría definir, en términos en esta pequeña planta, conformando el más
moleculares, un fenotipo concreto. En meta- avanzado sistema de experimentos en biología
bolómica se emplean herramientas analíticas vegetal del mundo. Su secuencia genética es
muy sensibles (tales como espectrometría de de libre acceso en el sitio http://www.arabi-
masa, cromatografía líquida o gaseosa y re- dopsis.org. En un artículo publicado en Nature
sonancia magnética nuclear) para analizar los (2000) se analiza el genoma de Arabidopsis a
cambios metabólicos provocados por mutacio- partir de las 115.4 megabases secuenciadas
nes génicas o por la expresión de transgenes. (de un total de 125). Su evolución involucró
La metabolómica puede ser aplicada al monito- una duplicación completa del genoma, seguida
reo de estreses inducidos, para identificar pa- por una subsecuente pérdida y duplicación de
sos metabólicos limitantes, para el análisis de genes, lo cual dio origen a un genoma dinámi-
mutantes y hasta para realizar la evaluación de co, enriquecido por una transferencia lateral
manejos agronómicos, tales como el efecto de de genes de cianobacterias. Contiene 25.498
fertilizantes sobre el metabolismo, etc. (Parte I, genes que codifican para 11.000 familias de
Cap. 10). proteínas, con una diversidad funcional similar
- La bioinformática intenta dar sentido a la a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis
información derivada de las técnicas anterior- elegans. Arabidopsis posee varias familias
mente descriptas. La importancia de esta cien- de proteínas nuevas pero carece de otras co-
cia resulta obvia cuando se considera que los munes, indicando que los grupos proteicos en
genomas poseen miles de millones de pares común han experimentado una expansión y
de bases (Parte I, cap. 12). contracción en estos tres grupos eucariotas.
El genoma de arroz está compuesto por 19
5 Modelos bloques génicos que, reordenados como “blo-
El mapeo comparativo ha demostrado que ques de Lego”, permiten reconstruir el genoma
la organización de los genes dentro de los de las Tritíceas, maíz, Setaria, caña de azúcar
genomas ha permanecido muy conservada y sorgo (Fig. 6). Considerados como una uni-
a través de la evolución, existiendo estrechas dad genética representarían el genoma ances-
relaciones de colinearidad entre los geno- tral de las gramíneas, el cual tendría un único
mas de casi todas las gramíneas cultivadas, par de cromosomas.
entre las solanáceas, entre las brasicaceas La familia de las gramíneas es probable-
cultivadas y Arabidopsis, entre los pinos, rosá- mente la mejor caracterizada en este aspecto,
ceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo contando con una buena cantidad de mapas

Figura 6: El genoma de arroz está compuesto por 19 bloques génicos que, reordenados como «bloques
de Lego», permiten reconstruir el genoma de las Tritíceas, maíz, Setaria, caña de azúcar y sorgo. Estos
bloques, considerados como una unidad genética, representarían el genoma ancestral de las gramíneas,
el cual tendría un único par de cromosomas.
genéticos comparativos que demuestran las muy diferente entre estas especies, ¿cuál es la
relaciones interespecíficas (Fig. 7). En térmi- base de la mayor complejidad en los humanos?
nos genéticos, las gramíneas representan una La explicación estaría en el proteoma, más
familia muy diversa. Se estima que el genoma que en el genoma. Las proteínas codificadas
de las mismas divergió hace alrededor de 65 por los genes pueden agruparse en familias en
millones de años desde un antecesor común. base a su similitud y muchas de estas familias
El nivel de ploidía y el número básico de cro- proteicas son compartidas por todos los grupos
mosomas son muy variables, así como el ta- mencionados, aunque el número de miembros
maño del genoma. por familia es mayor en humanos.
Esto es particularmente evidente en aque-
6 Algunas generalizaciones acerca de los llos genes involucrados en el desarrollo. Los
genomas humanos tenemos 30 genes para factores
Los estudios en especies modelo han per- de crecimiento del fribroblasto, mientras que
mitido arribar a varias generalizaciones. Una Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2.
de ellas es que el número de genes no es Las nuevas proteínas surgen a través de cor-
la base de la complejidad. La mosca de la tes y empalmes alternativos de un mismo ARN
fruta tiene unos 13.000 genes, Caenorhabitis mensajero (alternative splicing), lo que permi-
elegans 18.000, Arabidopsis 26.000 y los hu- te aumentar considerablemente la diversidad
manos 30.000. Si el número de genes no es proteica a partir de los mismos mensajes. Las

Figura 7: Alineamiento de cromosomas de arroz (3, 6) y maíz (9).
predicciones indican que el 60% de los genes los exones (secuencias del mensajero que se
humanos tiene dos o más alternativas de em- encuentran representadas en la proteína, las
palme. En Caenorhabitis el 22%. secuencias correspondientes a los intrones no
Un elevado número de factores de trans- lo están) comprenden un porcentaje bajo del
cripción y modificaciones postraduccionales genoma, mientras que los intrones compren-
también conducen a una mayor complejidad. den el 24%. Los genes no están distribuidos en
En el caso de Arabidopsis, cerca del 9% de forma pareja. Algunos se encuentran agrupa-
los genes son factores de transcripción (FT). dos en ciertas regiones del genoma mientras
Si se compara la proporción con los genomas que otros se encuentran aislados. En la mosca,
de otras especies, se observa que Arabidopsis el nematodo y Arabidopsis la disposición de los
no sólo tiene más genes que algunos anima- genes es mucho más regular.
les pequeños, sino que la proporción de FT es Aproximadamente la mitad del genoma hu-
más alta que en cualquier clase de organismo mano consiste de secuencias repetitivas,
estudiado. Esto parece reflejar el hecho de siendo la mayoría elementos transponibles
que las plantas deben adaptarse a una amplia que se propagan replicándose e insertando
variedad de condiciones medioambientales, a una copia de sí mismos en otras regiones del
diferencia de los animales, que pueden movili- genoma. En la actualidad solo dos tipos de ele-
zarse y cambiar de lugar si este no les resulta mentos son activos, Alu y LINE1. La mayoría
propicio. de los mismos se encuentran en regiones ricas
En humanos, los genes ocupan una cuarta en A y T, mientras que los genes se encuen-
parte del genoma, y sólo el 1,5% codifica para tran en áreas con elevado contenido de G y
proteínas. Las secuencias correspondientes a C. Fragmentos de estos elementos también

se encontraron en las secuencias regulatorias 7 Genómica y Agricultura
que controlan la expresión de varios genes, por Especialistas en varias disciplinas han lle-
lo que se ha sugerido que, de alguna manera, gado a la conclusión de que el alcance de la
podrían afectar positivamente su expresión y genómica será mayor en lo que se refiere a la
evolución. economía y la calidad de vida que en el ám-
Los genomas vegetales también están pla- bito de la salud humana. Gracias al aporte de
gados de secuencias repetitivas (transposo- grupos de investigación de todo el mundo se
nes y retrotransposones), que constituyen un dispone de bases de datos públicas con infor-
porcentaje muy importante del ADN nuclear y mación genómica de utilidad para los mejora-
han contribuido, a lo largo de la evolución, a dores. El conocimiento de cómo actúan los ge-
la expansión de los genomas. En maíz repre- nes en una especie puede ayudar a los mejo-
sentan del 50 al 80% del genoma y en trigo el radores a perfeccionar su función en otra. Las
80% (Fig. 8). De esta manera los genomas de secuencias de los genomas de Arabidopsis y
los cereales pueden considerarse como islas de arroz proporcionan información relevante
de genes que se hallan dispersas en un mar de acerca de otros cultivos, como el maíz y el tri-
secuencias repetitivas. go. Dado que estos tres cereales representan
Figura 8: a) Elementos repetitivos en un fragmento cromosómico de maíz. b) Diagrama que muestra como
los elementos transponibles en gramíneas son responsables del incremento en el tamaño del genoma.
El arroz, sorgo, cebada y maíz derivaron de un ancestro común hace aproximadamente 70 millones de
años. Desde entonces, los transposones y retrotransposones se han ido acumulando a diferentes niveles
en las especies. Los cromosomas son más largos en maíz y cebada, cuyos genomas contienen grandes
cantidades de retros con LTR (long terminal repeats). En verde se señalan los elementos transponibles y
en naranja los genes. Modificada de Griffths et al. (2000).

más de la mitad de la producción alimentaria La genómica comparativa, basada en el
mundial y que el arroz es el alimento básico de análisis de ESTs de diferentes plantas tole-
más de la mitad de la población del planeta, la rantes a estreses abióticos, ha permitido la
trascendencia de la genómica en la agricultura identificación de redes de genes comunes aso-
es indiscutible. ciados con estreses ambientales, tales como
La similitud entre las especies de cereales salinidad, sequía, bajas y altas temperaturas.
también implica que cuando se trasladan ge- El análisis de especies tolerantes a situaciones
nes de una especie a otra, tenderán a funcio- extremas ha identificado genes involucrados
nar bien y en la misma forma con una mínima en los mecanismos que las hacen tolerantes.
manipulación genética. Dichos genes podrán entonces ser transferidos
A través de esfuerzos públicos y privados se a especies de cultivo.
trabaja en la identificación de genes asociados Como ejemplos pueden citarse Agrostis
con caracteres como rendimiento, resistencia a adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a sali-
la sequía, calidad de los alimentos, resistencia nidad, Microlaena stipoides, tolerante a alumi-
a insectos y tolerancia a herbicidas. nio y Deschampsia antarctica, tolerante a bajas
De esta manera se ha acelerado significa- temperaturas (la única gramínea que crece en
tivamente el aporte de nuevas variedades al la Antártida) (Fig. 9).
mercado, ya sea por modificación genética o También se ha mencionado que los factores
por selección con marcadores moleculares o de transcripción serían las “llaves” para des-
utilizando criterios de selección a partir de la bloquear funciones génicas que aprovechen la
información molecular. diversidad de la naturaleza para producir mejo-
Figura 9: Categorización funcional de ESTs de Deschampsia antarctica. El objetivo de este proyecto es

encontrar genes involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos, por tecnología
génica, a especies de cultivo. Gentileza de G. Spangenberg.

res cultivos. Estos son genes que virtualmente bacteria fijadora y la planta sino también entre
controlan todo carácter importante, desde el la planta y otro simbionte, las micorrizas (aso-
punto de vista agrícola, en las plantas, inclu- ciación de un hongo con la raíz de una planta
yendo rendimiento, resistencia a las enferme- superior. Esta asociación no es específica de
dades, protección contra las heladas y sequía, especie como el caso de Rhizobium y las legu-
producción de químicos, proteínas usadas en minosas. El hongo puede ser de varios géner-
farmacéutica, etc. La mayoría de los caracte- os y aporta fósforo a la planta). Recientemente
res vegetales a los que interesa aplicar la inge- se logró la identificación, en alfalfa, de un re-
niería genética son multigénicos (ej. tolerancia ceptor requerido para el reconocimiento de se-
al estrés hídrico) y los genes involucrados se ñales bacterianas de nodulación, los llamados
expresan en cascadas de forma tal que genes factores NOD.
primarios activan a genes secundarios que a Las plantas medicinales aportan el 25% de
su vez activan a genes terciarios. Los factores los compuestos activos utilizados actualmente
de transcripción serían los responsables de ha- por la industria farmacéutica. Entre estos com-
cer funcionar a los genes primarios, obtenién- puestos se encuentran los citocromos P450,
dose largas cascadas de expresión de genes que participan en la biosíntesis de muchos
por la manipulación de un solo gen. compuestos anticancerígenos, alcaloides,
fitoesteroides, antioxidantes y antimicrobia-
Durante los últimos años se ha obtenido una nos. También tienen un rol muy importante en
gran colección de FT de plantas, funcional- la detoxificación de xenobióticos (herbicidas y
mente caracterizados, no sólo en Arabidopsis, pesticidas). Se han identificado 1052 citocro-
sino también en especies como tomate, maíz mos P450 y el objetivo actual es, utilizando
y soja. En total hay cerca de 1900 FT en herramientas de metabolómica, determinar su
Arabidopsis pero en el contexto de la genómi- función bioquímica precisa.
ca funcional el interés recae en unas 60 famil- Otro de los objetivos de la metabolómica es
ias que tienen funciones reconocidas. La her- el estudio de la síntesis de las esencias que
ramienta primaria que se utiliza para conocer confieren perfume a las flores y el mejoramien-
la función de los FT consiste en sobreexpre- to del sabor de algunas plantas utilizadas en
sarlos y/o detener la expresión de algunos de alimentación humana, como por ejemplo man-
ellos. Se puede, por ejemplo, medir el efecto dioca, donde el objetivo sería la eliminación de
de cada FT en la composición de los lípidos en los glucósidos cianogénicos que le confieren
las semillas aceiteras y la composición de lípi- sabor amargo.
dos en las hojas, la composición de azúcares, La devastación de los bosques es motivo su-
de esteroides, etc., estudiar procesos básicos, ficiente para invertir en proyectos de genómica
a través de la dilucidación de sus efectos en el tendientes a la identificación de genes involu-
desarrollo vegetal y la resistencia a las enfer- crados en perennidad, desarrollo, interacción
medades, o tratar de identificar el FT que regu- con herbívoros, respuesta a estrés y síntesis
la el consumo de nitrógeno (N). El N es uno de de metabolitos secundarios como lignina y
los insumos más costosos para la agricultura, celulosa. Se han generado ESTs de álamo,
por lo que identificar los genes que controlan y abedul, abeto, pino y eucaliptos. El álamo se
modifican la respuesta al N sería de gran valor. utiliza como sistema modelo para el análisis
También existen proyectos genómicos rela- de los genes involucrados en la formación de
cionados con leguminosas y con sus simbiontes madera. Otro objetivo en este campo es la
fijadores de nitrógeno. Recientemente se han búsqueda de estrategias para inducir floración
secuenciado los genomas de las especies de temprana, que es un factor crítico en el mejora-
Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han pro- miento de forestales.
ducido cientos de miles de EST de Medicago La secuenciación de los genes y la diluci-
truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el dación de las vías que controlan la floración en
caso de M. truncatula no sólo se han disectado los cereales, que difiere en varios aspectos con
los pasos que controlan las señales entre la los correspondientes en Arabidopsis, ha sido

otro de los logros de la genómica. También se maíz, sorgo, arroz, trigo y cebada conservan la
localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, presencia y el orden de marcadores y genes,
los genes VRN1 y VRN2, que son los genes aunque en algunos casos la correspondencia
centrales en la vía de vernalización en trigo, cromosómica fue modificada por duplicacio-
cebada y otros cereales invernales. Este cono- nes, inversiones o translocaciones. De esta
cimiento es clave en agricultura, ya que per- manera se logró consensuar un mapa unifica-
mitiría, potencialmente, controlar la floración do de gramíneas en el que se detallan secuen-
en cultivos de gran importancia económica, cias y genes conservados en diferentes geno-
como los cereales y los forrajes. mas (Fig. 2). Utilizando estas herramientas fue
posible transferir información proveniente de
8 Aportes de la genómica al mejoramien- plantas de genomas pequeños (arroz, sorgo)
to de cereales a plantas de genomas más complejos como el
El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; trigo. Esto ha facilitado la localización más pre-
AABBDD) es uno de los principales cultivos cisa de genes para tolerancia a estrés biótico y
alimenticios ya que provee cerca del 55% de abiótico (prebrotado, dormición, vernalización,
los carbohidratos consumidos por el hombre. frío y otros) y el desarrollo de marcadores útiles
La genética de este cultivo resulta compleja, para el mejoramiento. También ha conducido a
es de naturaleza hexaploide, con tres geno- la obtención de mapas consenso específicos
mas homeólogos denominados A, B y D que para trigo pan, candeal, maíz y cebada.
aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los
genes redundantes son una norma, con sets Las nuevas técnicas de genómica funcional,
homoalélicos triplicados en la mayoría de ellos. epigenética, mapeo por asociación, “TILLING”
El genoma del trigo hexaploide es el de may- y los ARN interferentes (ARNi), entre otras,
or tamaño (17000 Mbp trigo, 2800 Mbp maíz, contribuirán a un mayor conocimiento del
800 Mbp sorgo, 450 Mbp arroz). Más del 80% funcionamiento del genoma de este cereal.
del mismo está constituido por secuencias de Existen genotecas de BACs/BIBACs para to-
ADN altamente repetitivo. El restante 20% está dos los genomas de trigo. Estas representan
compuesto por secuencias de bajo número de un importante complemento para saturar los
copias o copia única, donde se encuentran la mapas.
mayoría de los genes. Si bien las secuencias En los últimos años fueron confeccionado
altamente repetitivas varían de especie en es- numerosos mapas genéticos de trigo pan, can-
pecie, las secuencias génicas, en general, son deal y cebada a partir de poblaciones de RILs
conservadas. Esta característica permite el uso (líneas recombinantes endocriadas) o haploi-
de sondas heterólogas (de otros genomas) des duplicados, que resultan útiles en estudios
en experimentos de hibridación de tipo RFLP de identificación de QTL asociados a calidad
(Parte I, Cap. 5) para identificar secuencias y estreses bióticos (enfermedades) y abióticos
conservadas en especies diferentes dentro de (sequía, salinidad). Para ello se utilizaron y
una misma familia taxonómica (Devos y Gale, desarrollaron miles de marcadores molecula-
2000). res, incluyendo RFLPs, SSRs, AFLPs, SNPs,
En 1989 se publicó el primer mapa genético y marcadores DArT (Diversity array techno-
molecular de trigo, correspondiente a los cro- logy), (estos últimos basados en matrices de
mosomas homeólogos del grupo 7, observán- diversidad). La información generada posibilitó
dose que el orden de los genes y marcadores el desarrollo de marcadores perfectos, a partir
se conserva en gran parte de los tres geno- de la secuencia del gen a seleccionar, en lugar
mas de trigo hexaploide. Esta fue la primera de marcadores genéticamente ligados. Como
prueba de colinearidad en gramíneas y posibil- ejemplo pueden citarse los genes de las enzi-
itó el desarrollo de la genética comparativa en mas polifenol oxidasas, lipoxigenasas y fitoeno
cereales. sintasa, entre otros. También posibilitó la con-
En trabajos posteriores se comprobó que fección de mapas consenso para trigo pan,
largos segmentos de los cromosomas de candeal y cebada.

El acceso a los principales genes que afectan Traits Loci de expresión) y han sido utilizados
la calidad ha abierto nuevas vías para el desa- para identificar funciones de genes individuales.
rrollo comercial de diferentes productos deriva- Toda esta información permite inferir que la
dos del trigo. Es posible obtener variedades con biotecnología puede cambiar el escenario de los
diferente calidad de almidón, diferente textura cereales en dos áreas principales: (1) protegien-
de grano, diferente composición de gluteninas, do al cultivo de estreses bióticos y abióticos y
gliadinas y secalinas en función del uso indus- (2) modificando el concepto de producción de
trial. El descubrimiento de genes valiosos de «commodities» por el de producción de «spe-
otros genomas y la posibilidad de incorporarlos cialities», por ejemplo para derivados de trigo
al trigo por transgénesis permitirán resolver pro- con mayor valor agregado, como noodles (clase
blemas del cultivo, como pueden ser limitantes de fideo muy utilizado en Asia), galletitas dulces,
debido a estreses bióticos y abióticos o desa- crackers (un tipo de galletita que se rompe fácil-
rrollar nuevas generaciones de transgénicos en mente), masa congelada, pan de molde, pasta,
función de las necesidades del consumidor, con almidones, plásticos biodegradables, etc.
mayor contenido de aminoácidos esenciales Se han identificado cinco áreas de investiga-
como la lisina, vitaminas, etc. ción a desarrollar en los próximos años para el
La complejidad del genoma del trigo ha he- mejoramiento de trigo, que pueden aplicarse a
cho aconsejable abordar los estudios genómi- los cereales en general: (i) mapeo genético, (ii)
cos a través del transcriptoma. Para ello se han análisis de QTL, (iii) mejoramiento molecular,
establecido consorcios internacionales como (iv) mapeo por asociación, y (v) desarrollo de
el International Wheat Genome Sequencing software.
Consortium (IWGSC) o el International Triticeae
Mapping Initiative (ITMI), el cual coordina gru- 9 Genomas trabajadores
pos de investigación de distintos países en la La genómica aplicada a dilucidar los meca-
construcción de mapas moleculares del geno- nismos por los cuales funcionan los microorga-
ma de trigo. Existe colaboración internacio- nismos puede conducir al aislamiento de sus
nal para otros cultivos como el arroz, donde el componentes para desarrollar nanoestructuras
Internacional Rice Genome Sequencing Project que lleven a cabo funciones complejas. Como
(IRGSP) coordina esfuerzos de 10 países y como ejemplos pueden citarse:
resultado de esto, en 2002, fueron colocadas en
bases de datos públicas secuencias de alta cali- Methanococcus jannaschii: es una bacteria
dad que representaban 366 Mbp del genoma de que produce metano, una importante fuente de
arroz. En el 2005 se llegó a 371 Mbp, que repre- energía. Contiene enzimas que soportan tem-
sentan el 95% del mismo. Las bases de datos peraturas y presiones elevadas por lo que son
de EST han crecido exponencialmente en la úl- potencialmente útiles para fines industriales.
tima década, de manera que en Septiembre de Deinococcus radiodurans: soporta niveles
2008 había 55 millones de ESTs depositadas en de radiación extremadamente elevados por lo
el National Center for Biotechnology Information cual tiene un alto potencial para limpiar dese-
dbEST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ chos radiactivos.
dbEST). Esto incluye cerca de 1.607.934 de Thalassiosira pseudonana: se trata de una
ESTs de trigo hexaploide y sus parientes más diatomea marina que es la principal participan-
cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum te en el bombeado biológico de carbono hacia
vulgare L.; especies diploides y tetraploides de las profundidades de los océanos, por lo que
Triticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides posee un elevado potencial para mitigar los
Tausch. Estas ESTs se utilizan para el desarro- cambios climáticos del planeta.
llo de marcadores funcionales, la preparación
de mapas de transcriptos y la construcción de 10 Proyectos de Genómica en Sudamérica
matrices de ADNc. Actualmente el estudio de En Sudamérica se han desarrollado y se
ARN interferentes, TILLING y la “genética de ex- encuentran en ejecución algunos proyectos
presión” lideran el mapeo de eQTL (Quantitative genómicos. Frente al estado del desarrollo de

estas áreas en el mundo, existen en la región interés agrícola. Otro proyecto de genómica,
serias carencias, tanto de recursos humanos en este mismo país, apunta a desarrollar plata-
entrenados como de infraestructura y equi- formas tecnológicas en genómica forestal con
pamiento. En Brasil se estableció una red de el objeto de mejorar la posición competitiva del
cooperación que secuenció completamente el sector forestal chileno.
genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ata- En el marco del Programa Cooperativo para
ca a los cítricos causando importantes pérdidas el Desarrollo Tecnológico Agroalimentario y
económicas. También incursionó en el estudio Agroindustrial del Cono Sur (PROCISUR),
de genómica funcional de células cancerosas los Institutos Nacionales de Investigación
y de secuenciación del genoma de caña de Agropecuaria de Argentina, Bolivia, Brasil,
azúcar, Saccharum oficinalis. En Argentina se Chile, Paraguay y Uruguay han conformado
ha trabajado en la secuenciación de Brucella una plataforma regional para enfrentar los de-
abortus, agente causal de la brucelosis bovina. safíos que impone la secuenciación del geno-
Investigadores argentinos participan tam- ma de la papa. Esta iniciativa es desarrollada a
bién en proyectos de genómica en coopera- nivel mundial por el Consorcio Internacional de
ciones internacionales, como el consorcio in- Secuenciación del Genoma de la Papa, que li-
volucrado en la secuenciación del genoma de dera la Universidad de Wageningen de Holanda
Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llevó a la y en la que están comprometidos China,
clonación y caracterización de los genes de ver- Estados Unidos, Holanda, India, Inglaterra,
nalización en trigo o el proyecto de búsqueda Irlanda, Nueva Zelanda, Polonia, Rusia y los
de genes de tolerancia a frío en Deschampsia sudamericanos Chile, Perú, Argentina y Brasil.
antarctica. En Chile se ha completado recien- Estos últimos, en conjunto, secuenciarán el
temente la secuenciación de Piscirickettsia sal- cromosoma 3 del genoma de la papa y en total
monis, patógeno intracelular de salmones que se deberán secuenciar los 12 cromosomas de
causa importantes pérdidas en esta industria. la especie.
También se trabaja activamente en especies En varios países se han secuenciado
hortícolas, principalmente frutales. fragmentos de genomas de virus y viroides
Otros ejemplos son el desarrollo de marca- (Argentina, Chile, Uruguay). En Argentina se
dores microsatélites (Parte I, Cap. 5) de di- esta realizando la caracterización biológica
versas especies, como girasol (colaboración y molecular del virus del mal de Río Cuarto
de INTA-Argentina con empresas semilleras (MRCV) con el fin de estimar la diversidad ge-
locales), vides (INIA-Chile como parte de un nética de las poblaciones del virus, detectar la
consorcio internacional), alpacas y otros camé- existencia de razas y limitar la propagación de
lidos sudamericanos (INIA-Chile), pasto llorón esta enfermedad de importancia para el maíz.
(CERZOS, UNR, INTA Castelar), entre otros. El En el año 2003 la Agencia Nacional de
girasol es una especie de importancia económi- Promoción Científica y Tecnológica de
ca en la Argentina y es el eje de varios proyec- Argentina (ANPCyT) lanzó una convocatoria
tos genómicos. Algunos de los objetivos son la para Proyectos de Área de Vacancia (PAV),
caracterización de la diversidad funcional del donde la genómica era una de las prioridades.
girasol y la identificación de SNPs asociados a En respuesta a esta convocatoria se formó una
caracteres agronómicos de importancia como Red de laboratorios dedicados al análisis ge-
la resistencia a estreses bióticos y abióticos. nómico funcional y comparativo en especies
Por otro lado, el desarrollo de marcadores mide interés agropecuario, forestal o ambiental
crosatélites, ESTs y el mapeo genético de las (PAV137). Los objetivos fueron generar una in-
mismas es utilizado para asistir al mejoramien- fraestructura operativa y comunicacional ade-
to y realizar identificación varietal. cuada y formar recursos humanos necesarios
En Chile se ha desarrollado un programa de para apoyar el desarrollo de iniciativas e inves-
genómica funcional coordinado por diversos tigaciones en áreas de genómica funcional y
ministerios, destinado a enfrentar problemas bioinformática críticas para la biología agrope-
de postcosecha y enfermedades en plantas de cuaria, forestal y ambiental. La red pudo capa-

citar recursos humanos orientados a la bús- liza el estudio de genes y sus productos, in-
queda, prospección y/o análisis funcional de volucrados en los mecanismos moleculares de
genes con interés básico o aplicado. Se abor- susceptibilidad y resistencia a estreses bióti-
daron cinco áreas de desarrollo e integración: cos, a través de estudios de genómica funcio-
a) transcriptómica, b) proteómica, interactómi- nal, utilizando ESTs y unigenes y micromatri-
ca y metabolómica, c) genómica comparativa, ces de ADNc.
d) genómica evolutiva para la caracterización Los objetivos para programas de genómica
de la diversidad genética y e) ecogenómica sudamericanos deberían enfocarse hacia el
(aplicada a la evaluación de impacto ambien- aumento de la productividad y la mejora de la
tal) y epidemiología molecular. En los dos pri- calidad de los productos, desarrollando capaci-
meros subproyectos se encararon trabajos de dades para identificar genes del germoplasma
prospección y caracterización funcional de re- regional, de manera de disminuir la dependen-
giones genómicas de interés en plantas supe- cia de variedades y genes desarrollados y ais-
riores y bacterias zoonóticas mediante el aná- lados por países del primer mundo y buscar so-
lisis de perfiles de transcripción, interacción de luciones para problemas propios de la región,
proteínas y perfiles metabólicos (girasol, citrus, que difícilmente pueden ser enfrentados por
soja, solanáceas, Mycobacterium y otros). En programas de mejoramiento genético ajenos a
el c) se caracterizaron molecularmente regio- la misma.
nes genómicas involucradas en características
reproductivas (apomixis) de especies forra- 11 Lecturas / sitios recomendados
jeras, de resistencia a estreses en especies
cultivadas, así como de características pro- Cenci A., Chantret N., Xy K., Gu Y., Anderson O.D.,
ductivas en girasol y caprinos. El área d) sirvió Fahima T., Distelfeld A. Y Dubcovsky J. 2003.
para evaluar la diversidad genética de recursos Construction and characterization of a half mil-
biológicos naturales o cultivados, en particular lion clones Bacterial Artificial Chromosome
en especies leguminosas y en forestales. La (BAC) library of durum wheat. Theor Appl Genet
107: 931-939.
e) permitió estudiar la dinámica poblacional de
Cervigni G., Paniego N., Díaz M., Selva J.P., Zap-
variantes alélicas en ecosistemas (impacto del pacosta D., Zanazzi D., Landerreche I., Felitti
cultivo de maíces transgénicos en potenciales S., Pessino S., Spangenberg G. And Echenique
genes de resistencia en insectos plaga, cuanti- V. 2008. Expressed sequence tag analysis and
ficación de diversidad genética de especies en development of gene associated markers in a
peligro de extinción en ecosistemas naturales near-isogenic plant system of Eragrostis curvula.
explotados por el hombre) y encarar la epide- Plant Molecular Biology. 67: 1-10.
miología molecular de la fiebre aftosa y de la Devos K.M Y Gale M.D. 2000. Genome relationship:
peste porcina clásica. the grass model in current research. Plant Cell
Este proyecto acaba de finalizar (septiembre 12: 637-646
Echenique V., Stamova B., Wolters P., Lazo G.,
de 2008) y, si bien aún no se ha realizado la
Carollo V. Y Dubcovsky J. 2002. Frequencies of
evaluación final del mismo, varios de los ob- Ty1-copia and Ty3-gypsy retroelements within
jetivos fueron cumplidos exitosamente, ya que the Triticeae EST databases. Theor. Appl. Genet.
se formaron varios doctores en el área en dis- 104: 840-844.
tintas Universidades del país, entrenados para Gale M. Y Devos K. 1998. Plant comparative genet-
trabajar en equipos multidisciplinarios, además ics after 10 years. Science, 282: 656-658.
de lograr avances en el conocimiento en las Gibson D.G., Benders G.A., Andrews-Pfannkoch
mencionadas áreas. C., Denisova E.A., Baden-Tillson H., Zaveri J.,
El INIA (Uruguay) cuenta con proyectos de Stockwell T.B., Brownley A., Thomas D.W., Al-
desarrollo y validación de herramientas bioin- gire M.A., Merryman C., Young L., Noskov V.N.,
Glass J.I., Venter J.C., Hutchison Iii C.A. Y Smith
formáticas para integrar información genómica
H.O. 2008. Complete chemical synthesis, as-
en programas de fitomejoramiento y selección sembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium
de germoplasma. Dentro de los proyectos de genome. Science, 319: 1215-1220.
genómica de arroz, el EMBRAPA (Brasil), rea- Glass J.I., Assad-Garcia N., Alperovich N., Yooseph

S., Lewis M.R., Maruf M., Hutchison Iii C.A., Smi- Moore G. 2000. Cereal chromosome structure, evo-
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I CAPÍTULO 8 tos de posición (originados en el mapeo gené-
tico) con los datos de expresión (originados en
el análisis del transcriptoma) posibilita la selec-
Transcriptómica ción de candidatos responsables de disparar
un determinado carácter de interés.
Silvina Felitti y Silvina Pessino Este capítulo tiene como objetivo presentar
en forma abreviada una serie de metodologías
que son utilizadas habitualmente para el análi-
El análisis de los niveles de representación sis del transcriptoma de plantas. Debido al muy
de ARN mensajeros proporciona información
rápido cambio y perfeccionamiento en las téc-
importante sobre la actividad de un gen, evi-
nicas empleadas para abordar el estudio de la
denciando si está siendo copiado para poste-
representación de mensajeros tanto a nivel de
riormente dirigir la síntesis de la proteína a la
mesada como bioinformático, algunas de las
cual codifica. En los últimos años los proce-
metodologías mencionadas aquí ya han sido
dimientos para la detección de los niveles de
reemplazadas y se usan actualmente en forma
ARN mensajeros han progresado velozmente
poco frecuente. Sin embargo hemos decidido
desde el análisis de genes únicos específicos
incluirlas, dada su gran importancia histórica
(como el Northern, slot, y dot blotting, la RT-
en relación al cambio de abordaje conceptual
PCR semicuantitativa y cuantitativa y los en-
que va desde el análisis de la actividad de ge-
sayos de protección de nucleasas) hacia otros
nes únicos al estudio integral de la expresión
enfocados en la identificación de múltiples
transcriptos que difieren en su representación génica. Comenzaremos describiendo las técni-
entre las diversas muestras experimentales cas en orden cronológico de desarrollo.
(como la hibridización substractiva, el display
diferencial, el ADNc-AFLPs, la secuenciación Hibridización substractiva
de etiquetas expresadas o ESTs, el análisis se- Los métodos de hibridización substractiva
rial de la expresión de genes o SAGE y la hi- fueron creados a principios de los años 80 con
bridización de microarreglos). La organización el propósito de construir bibliotecas de ADNc
posterior de las secuencias dentro de grupos para obtener sondas de genes expresados
funcionales basada en los datos de homología diferencialmente. Fueron los primeros que se
proporciona un marco básico para conducir utilizaron de manera amplia con el propósito
nuevos estudios dirigidos a definir el rol bioló- de identificar genes regulados positiva o nega-
gico de cada producto génico. Por otra parte, la tivamente en una escala global. Sus ventajas
aplicación de técnicas de PCR en tiempo real y incluyen la habilidad de aislar genes de función
de hibridización in situ de tejidos permiten una relacionada sin tener conocimientos previos
validación más precisa de los datos de expre- de su secuencia o identidad y el uso de téc-
sión diferencial obtenidos por métodos ante- nicas comunes de biología molecular que no
riormente citados. requieren equipos especializados de detección
La capacidad tecnológica creciente permi- y análisis. El procedimiento general consiste
te ahora capturar sectores de tejidos o inclu- en la hibridización de un ADNc proveniente
so células aisladas y analizar su contenido de de una muestra prueba (tester) con un exceso
ARNm, lo que provee información específica de ARNm proveniente de una muestra control
sobre la representación del transcriptoma para (driver). Los transcriptos expresados en ambas
tipos celulares únicos. La asociación de los da- muestras (tester y driver) forman moléculas de
tos provenientes de la secuenciación genómica ARNm/ADNc híbridas, mientras que las se-
con aquellos originados en la transcriptómica y cuencia de ADNc que están presentes única-
la proteómica facilita la predicción de la exis- mente en la muestra tester permanecen como
tencia de fragmentos codificantes en sectores hebras simples. Las moléculas de hebras sim-
acotados del genoma, y da información sobre ples y dobles se separan usando cromatogra-
la posible función de los candidatos en tejidos fía en hidroxilapatita. Los ADNcs expresados
particulares. Además, la asociación de los da- diferencialmente pueden entonces ser recu-

perados y clonados o usados directamente el display diferencial esto se logra utilizando
como sondas para analizar una biblioteca. Dos como cebador de la transcripción reversa a un
limitaciones importantes del protocolo original poliT anclado con una o más bases adicionales
son: i) el requerimiento de grandes cantidades al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplo
de ARNm y ii) una tendencia a una menor efi- (T)12AC). Estos oligonucleótidos se fijan al ARN
ciencia en la identificación de transcriptos poco mensajero a través de la unión de las bases
abundantes. adicionales, impidiendo que el poliT “resbale”
La hibridización substractiva es aplicable sobre distintas zonas del poli A. El único grupo
sólo a comparaciones de pares de muestras y de ARNms que es transcripto en forma reversa
debe ser realizada por duplicado con el tester y es el integrado por las moléculas que llevan las
el driver invertidos para detectar tanto aumen- bases complementarias a las bases adiciona-
tos como disminuciones en los niveles de ex- les del poliT en el extremo del mensajero adya-
presión. Además no genera una medida cuanti- cente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utiliza
tativa y aunque es eficiente en la identificación oligonucleótidos de secuencia arbitraria para la
de genes que están completamente ausentes transcripción reversa. Estos cebadores tienen
en el driver no revela fácilmente a aquellos que normalmente 10 bases de largo y se unen a
están presentes en ambas muestras en distinta sus secuencias complementarias permitiendo
proporción. Se realizaron modificaciones para formar una hebra de ADNc desde este sitio.
mejorar el protocolo original que incluyen la En este caso el subgrupo de ARNms que su-
producción de ADNc con marcas de biotina o fre transcripción reversa estará integrado por
oligo(dT)30-látex de manera de refinar la se- aquellas moléculas que presenten la secuen-
paración de las moléculas de cadena simple cia complementaria a la del cebador orientada
y doble. También se incorporó la amplificación en el sentido adecuado.
de ADNcs selectos por PCR para disminuir la Luego de haberse realizado la síntesis de la
cantidad inicial de ARNm requerido y aumen- primer hebra del ADNc, se amplifican segmen-
tar la eficiencia de clonado de los transcriptos tos de los transcriptos usando pares múltiples
seleccionados. También se ha utilizado un pro- de cebadores de PCR. Tanto para el display
tocolo ingenioso conocido como hibridización diferencial como para el RAP-PCR, el cebador
substractiva de supresión (SSH) que fue dise- superior es un oligonucleótido arbitrario de 10
ñado para favorecer la detección de transcrip- pares de bases. El cebador inferior es el mis-
tos raros expresados diferencialmente. Este mo oligonucleótido poliT anclado (para el caso
incluye una normalización en la representación del display diferencial) o el decámero arbitrario
de los transcriptos diferenciales basada en la (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alter-
inhibición de la amplificación de aquellos que nativamente para hacer la transcripción rever-
son más abundantes, eliminando también la sa. Se ha estimado que los productos de PCR
necesidad de separar moléculas de cadena de 240 combinaciones particulares de pares de
doble y simple (ver Figura 1). cebadores de display diferencial (por ejemplo
todas las combinaciones de 20 oligonucleó-
Display diferencial y RAP-PCR tidos arbitrarios y 12 oligonucleótidos ancla-
Las técnicas conocidas en general como dos) representan estadísticamente a todos los
“huellas digitales de ARN” (ARN fingerprinting) ARNm originalmente presentes en la muestra.
incluyen al display diferencial (DD) y la PCR Los productos de PCR pueden ser marcados
de ARN cebada arbitrariamente (RAP-PCR). por incorporación de un nucleótido radiactivo
Ambos métodos están basados en una am- o de una molécula que pueda ser detectada a
plificación por PCR de subgrupos al azar de través de su interacción con un anticuerpo con-
transcriptos a partir de dos o más muestras. jugado a un sistema de detección (por ejemplo
La primera etapa de ambos procedimientos es digoxigenina). También puede usarse un ce-
común y consiste en generar ADNcs haciendo bador unido a un fluoróforo u optarse por no
una transcripción reversa de una fracción de marcar los fragmentos amplificados y usar lue-
las moléculas de ARNm de una muestra. En go una tinción con nitrato de plata para revelar

cDNA “driver” (en exceso)
cDNA “tester” con el adaptador 1 cDNA “tester” con el adaptador 2
Primera hibridización
Segunda hibridización: mezcado de muestras,

agregado de “driver” desnaturalizado y
anillado
a, b, c, d + e
Rellenado de los extremos
Agregado de los cebadores +

Amplificación por PCR
a , d no hay amplificación
b´ b b´ no hay amplificación
c amplificación lineal
e amplificación exponencial
Figura 1.
los geles. La visualización de los productos de la otra, o aquellos que están presentes con di-
PCR se logra luego de la electroforesis en ge- ferentes intensidades relativas en los distintos
les de poliacrilamida seguida de la apropiada tratamientos experimentales, representan po-
generación y detección de imágenes, que son tenciales transcriptos de ARNm de expresión
evaluadas comparando la intensidad relativa diferencial. Típicamente, las bandas son eva-
de las bandas producidas a partir de diferentes luadas sólo si amplifican en forma consistente
muestras experimentales. Los fragmentos que en reacciones de PCR duplicadas para cada
están presentes en una muestra y ausentes en muestra (ver la Figura 2).

Muestra de RNA 1 Muestra de RNA 2
)A n (A)A
)A
(A
A)A A) A)
n
(n A A(n A A)A
A ( AA
AA
AA AA A( (n A
A
n AA AA
A
n A
AA
A)A(n AA
A)A( nAA
A A
AAA(A)nA
AAA(A)nA
A)A( AA AAA A
n A
AA
(A) A A)A( nAA
( nAA AAA
n
A)AA(AA AAA(A AA
(A) A
A n) )n A
( nA
n
AA A)A
AA
AA
A(A
(A
(A
)n A
AA
)A
)A
n
n
A
A
A(A
An )
Transcripción reversa usando
cebador ancla del tipo 5’T(T)nTXY3’
Muestra de cDNA 1 Muestra de cDNA 2
PCR usando el cebador ancla

5’T(T)nTXY3’ y un decámero al azar
Muestra 1 Muestra 2
Figura 2.
La fase final del display diferencial consiste casos debe realizarse un alineamiento de las
en la identificación de la secuencia del trans- imágenes de los fragmentos de amplificación
cripto representado por el producto de PCR y con el gel de poliacrilamida seco. En los casos
la confirmación de que éste realmente se ex- en que se utiliza tinción con nitrato de plata no
presa en forma contrastante. Estas etapas se es necesario realizar este paso, por lo cual la
logran localizando físicamente y escindiendo la recuperación de la banda es mucho más efi-
sección del gel de poliacrilamida que contiene ciente. Los productos de PCR son purificados
al producto de interés. En la mayoría de los del gel y reamplificados. Para ello el fragmento

de poliacrilamida se procesa en fragmentos pe- de la secuencia. Sin embargo, es probable que
queños con un bísturí que se transfieren a una distintos alelos o incluso diferentes miembros
solución tampón adecuada para la elución de de una familia génica hibridicen en conjunto en
los fragmentos. Luego de una centrifugación, el experimento de Northern, o que los diseños
el sobrenadante se purifica con fenol/clorofor- de cebadores para real time PCR no permitan
mo y el ADN se precipita con etanol, se diluye diferenciarlos. También puede ocurrir que en
en agua y se reamplifica por PCR. los experimentos de DD se detecte una he-
Se han utilizado varias estrategias para bra antisentido sobreexpresada en una de las
confirmar la expresión diferencial de los trans- muestras. Si la hebra sentido está expresada
criptos, que incluyen el uso de los fragmentos en la otra, los experimentos de real time no
como sondas de Northern, la siembra de los permitirán la detección de la expresión diferen-
fragmentos en membranas para someterlos a cial. Estos son sólo algunos de los muchos ca-
análisis de Northern inverso y el clonado y se- sos posibles en los cuales el northern y la PCR
cuenciación de los productos para diseñar ce- en tiempo real no reproducirán los datos de
badores específicos que permitan realizar PCR DD, pero no precisamente porque el DD haya
semicuantitativas, así como también la hibridi- generado un falso positivo, sino simplemente
zación in situ de tejidos. porque estas técnicas están basadas en prin-
Dos ventajas importantes de los métodos cipios de detección diferentes. Muchos de los
de fingerprinting de ARN con respecto a los de supuestos “falsos positivos” detectados por DD
hibridización substractiva son la capacidad de en el pasado (cuando no se tenía conciencia
comparar muestras experimentales múltiples sobre la frecuencia de la expresión antisenti-
en forma simultánea y la de identificar genes do) pueden englobarse seguramente en estas
que están regulados tanto positiva como ne- categorías.
gativamente en una muestra respecto de las Otro problema es que estas técnicas deben
otras. Sin embargo, los métodos de fingerprin- aplicarse en general a muestras provenien-
ting de ARN comparten con el SSH la limitación tes del mismo individuo sometido a distintas
de que no son cuantitativos. condiciones o sobre individuos genéticamen-
Uno de los problemas que suelen atribuirse te idénticos (por ejemplo isolíneas). Cuando
a display diferencial es la amplificación de fal- se comparan los perfiles de ARNm de indivi-
sos positivos o sea fragmentos de genes que duos diferentes genéticamente, pueden apare-
parecen estar diferencialmente expresados cer falsos positivos que son resultado de una
pero son luego cosiderados artefactos de PCR amplificación diferencial debida a una varia-
porque no pueden validarse por Northern blot ción en la secuencia de los transcriptos más
o PCR en tiempo real. Es necesario dar una que a diferencias en su representación. Ese
mirada más detallada a este punto. Es cierto problema puede ser evitado utilizando estra-
que es imprescindible realizar las amplificacio- tegias de análisis de segregantes en grupo
nes de DD PCR por duplicado o triplicado para (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN.
asegurarse que la amplificación es reproduci- Finalmente, la investigación de todos los ge-
ble y no se trata de una banda espuria. Pero nes que potencialmente se expresan en forma
una vez superado este punto de la reproduci- diferencial requiere el uso de equipamiento de
bilidad de la amplificación, hay que considerar última generación y una inversión extensiva de
que no siempre las diferencias detectadas con tiempo y trabajo para detectar y confirmar la
esta técnica pueden ser validadas por Northern expresión diferencial de cada uno de los genes
o por PCR en tiempo real. Por ejemplo, cuando individuales.
existe expresión alélica diferencial entre mues-
tras, o cuando diferentes miembros de una Polimorfismos en el largo de los fragmen-
misma familia génica son expresados diferen- tos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP)
cialmente, es posible que se detecten polimor- La tecnología de AFLP, generalmente utili-
fismos en los geles de DD, como consecuencia zada para producir huellas genéticas de DNA
de que los primers se unan a sitios variables genómico, puede ser aplicada también a pre-

paraciones de ADNc de doble hebra para ob- de adaptadores de cadena doble a los extre-
tener un perfil del transcriptoma. Los patrones mos de los fragmentos de restricción, iv) ampli-
obtenidos por esta técnica son una herramien- ficación de un subgrupo de los fragmentos de
ta confiable y eficiente para la identificación de restricción usando dos cebadores complemen-
ARNms expresados diferencialmente. La téc- tarios al adaptador que llevan bases selectivas
nica de ADNc-AFLP detecta fragmentos de
adicionales en el extremo 3´ v) electroforesis
restricción de DNA por medio de amplificación
de los fragmentos de restricción amplificados
por PCR. Comprende las siguientes etapas: i)
generación de ADNc, ii) restricción del ADNc en geles de poliacrilamida, vi) visualización de
con dos endonucleasas específicas, preferible- las huellas digitales genéticas mediante el uso
mente una que reconoce sitios de 6 bases y de autoradiografías, fosfoimágenes y otros mé-
otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligación todos (ver Figura 3).
mRNA AAAAAAAAAAAAAn(A)A
TTTTTTTTTTTTTT
Cebador Oligo dT
AAAAAAAAAAAAAn(A)A
TTTTTTTTTTTTTT
Síntesis de cDNA
cDNA
Digestión con las endonucleasas

de restricción
Ligación de los adaptadores
Preamplificación con los

cebadores
Amplificación selectiva
de fragmentos XY
YX
XY
YX
Huella digital (Fingerprint)
Figura 3.

Las mayores ventaja del uso de la tecno- normalizadas para ecualizar la abundancia
logía de ADNc-AFLP son: i) no se requiere de clones que corresponden a los diferentes
información previa de secuencia; ii) se puede transcriptos. Los EST secuenciados a partir
estudiar una fracción muy grande de todos los de estas últimas pueden ser comparados para
genes expresados, iii) es una técnica muy sen- identificar transcriptos que se expresan en una
sible que permite la detección de transcriptos biblioteca y están completamente ausentes en
de baja abundancia, iv) los fragmentos son ex- otra, pero si se pretende obtener datos cuanti-
traídos fácilmente de los geles y las secuen- tativos exactos que describan abundancia re-
cias correspondientes pueden determinarse lativa se debe recurrir indefectiblemente a bi-
sin necesidad de clonados previos. bliotecas de ADNcs no normalizadas. También
existen productos comerciales que permiten la
Etiquetas de secuencia expresadas construccion de bibliotecas donde los transcrip-
(Expressed sequence tags, ESTs) tos han sido amplificados pero manteniendo la
La secuenciación exhaustiva de ESTs proporción relativa de unos respecto a otros,
(Expressed Sequence Tags) es considerado lo que facilita la comparación cuantitativa entre
principalmente un método para la caracteriza- muestras.
ción de la expresión génica, a pesar de que la Las ESTs requieren de varias etapas de pro-
generación de ESTs resulta también importan- cesamiento, ensamblado en grupos (contigs)
te para deducir la presencia de genes no pre- y anotación para que se pueda extraer infor-
dichos en ausencia de datos genómicos. Las mación biológica a partir de las mismas. Para
ESTs son obtenidas a gran escala por secuen- esto, resulta muy importante el almacenamien-
ciación de una sola hebra de clones de ADNc to, la organización y la anotación de estas se-
(aproximadamente 500 pb) provenientes de cuencias utilizando distintas herramientas in-
bibliotecas que representan distintos tejidos o formáticas (revisadas por Nagaraj et al., 2007).
condiciones experimentales. Las ESTs repre-
sentan descripciones parciales de las regiones Análisis serial de la expresión de genes
que se transcriben de un genoma. Una canti- (SAGE)
dad creciente de centros de investigación han El análisis serial de la expresión de genes
construído y secuenciado bibliotecas de ADNc (SAGE) consiste esencialmente en una versión
en los últimos años. Esta tendencia se ve refle- acelerada de la secuenciación de ESTs. Está
jada en el número de ESTs depositadas en la basada en el concepto de que una etiqueta
base de datos del NCBI (ESTdb), el que al 6 de corta de unas pocas bases es suficiente para
Junio de 2008 es de 2994249 provenientes de identificar inequívocamente a un transcripto,
261 especies de plantas. siempre y cuando esté ubicada en una posición
En teoría, la abundancia de una EST es di- definida dentro de la secuencia del mensajero.
rectamente proporcional a la representación en Una etiqueta SAGE consiste típicamente en
número de copias de un transcripto en un teji- 9-14 bases de secuencia ubicadas por debajo
do determinado. El proceso de generación de del último sitio de reconocimiento de una en-
ESTs es relativamente lento y costoso, lo que donucleasa específica en el transcripto blanco.
hace difícil que se logre la saturación de una Múltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un
biblioteca. Teóricamente, si se secuencia el nú- vector de clonado de manera que una reacción
mero suficiente de ESTs, este método permite de secuenciación de 300 a 500 pb genera las
analizar incluso aquellos genes que presentan secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiem-
niveles de expresión bajos, pero si el número po (ver Figura 4). Como cada etiqueta SAGE
de secuencias obtenidas es limitado conviene representa un único transcripto de ARNm, es
recurrir a técnicas de amplificación comple- posible obtener una visión general de todos
mentarias (ADNc-AFLP o DD) para detectar los genes expresados en la muestra original.
transcriptos poco abundantes. Las diferencias en la expresión de genes en-
Las secuencias ESTs a menudo se generan tre muestras experimentales pueden entonces
a partir de bibliotecas de ADNc que han sido ser identificadas comparando la abundancia

AAA(A)nA
TTT(T)n T
AAA(A)nA
TTT(T)n T
AAA(A)nA
TTT(T)n T
Corte con la “enzima ancla” (EA)
Unión a esferas de estreptavidina
AAA(A)nA
TTT(T)n T
AAA(A)nA
TTT(T)n T
AAA(A)nA
TTT(T)n T
División a la mitad y
añadido de los adaptadores A y B
CATG AAA(A)nA CATG AAA(A)nA
A GTAC TTT(T)n T B GTAC TTT(T)n T
Corte con la “enzima de etiquetado” (ET)

GGATGCATGXXXXXXXXX GGATGCATGOOOOOOOOO
Cebador A CCTACGTACXXXXXXXXX Cebador B CCTACGTACOOOOOOOOO
TE AE Etiqueta (tag) TE AE Etiqueta (tag)
Ligación y amplificación con los cebadores A y B
Cebador A GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC
CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACGTAGG Cebador B
Etiqueta doble (ditag)
Corte con la “enzima ancla” (ET),
purificación de las “ditags”,
concatenado y clonado
CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG
GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC
AE Tag 1 Tag 2 AE Tag 3 Tag 4 AE
Ditag Ditag
Figura 4.
relativa de etiquetas SAGE específicas en dife- ca su abundancia en la muestra en estudio. A

rentes bibliotecas. Los genes o las secuencias diferencia de los microarreglos, la técnica de
ESTs representados por las etiquetas SAGE SAGE permite detectar transcriptos de los cua-
son localizados en las bases de datos detec- les no se conoce su secuencia previamente a
tando aquellos transcriptos que tengan la eti- la realización del experimento, es decir es una
queta SAGE en la posición adecuada. técnica conocida como “abierta” (pueden reco-
Esta técnica se utiliza para identificar y cuan- nocerse genes nuevos).
tificar transcriptos. Fue descripta por primera A partir de un experimento de SAGE se pue-
vez por Velculescu y colaboradores en 1995 den obtener unos 50.000 a 100.000 fragmen-
(ver bibliografía recomendada). Brevemente, tos, los que representan de 20.000 a 40.000
se utiliza una enzima de restricción tipo II (en- genes únicos. Estos fragmentos brindan infor-
zima de etiquetado) que libera fragmentos de mación cualitativa de los transcriptos detecta-
entre 9 y 14 pb a partir de los ADNc previa- dos, mientras que el número de copias de cada
mente digeridos con otra enzima de restricción uno de ellos brinda información cuantitativa y
(la más comúnmente utilizada es NlaIII). Estos refleja la abundancia de los transcriptos en la
fragmentos son luego ligados entre si para muestra. Generalmente se observa que algu-
formar un concatémero que es clonado y se- nos de los fragmentos detectados por SAGE
cuenciado. Los fragmentos detectados en una presentan más de 100 copias, otros entre 2 y
muestra representan a los transcriptos que los 100 copias y la mayoría de ellos (70-80%) se
originaron y su frecuencia de detección indi- encuentran en copia única. En la mayoría de

los casos se observa que entre el 50-70% de del transcripto tales como las resultantes de
los fragmentos presentan similitud con genes splicing alternativo o SNPs presentes en la eti-
o transcriptos de función conocida, mientras queta pueden resultar en distintos fragmentos
que entre 30-50% no son similares a ninguna que en realidad se correspondan con un mis-
secuencia conocida. Es esperable que estos mo gen), experimentales (artefactos introduci-
porcentajes que son usuales actualmente se dos en las secuencias como consecuencia de
modifiquen en el futuro a medida que aumente la técnica utilizada) y por redundancia de trans-
el número de genes caracterizados y la canti- criptos. Las bases de datos de referencia se
dad de etiquetas promedio secuenciadas por construyen con secuencias que son altamente
proyecto. redundantes. Las mismas son agrupadas en
Se ha observado una especificidad relativa- función de la homología de secuencias, lo que
mente alta de un fragmento de entre 9 y 14 pb puede originar que se encuentren transcriptos
para su asociación con transcriptos conocidos que corresponden a un mismo gen en grupos
en el caso de genomas relativamente simples. distintos (como en el caso de que hubiera spli-
Sin embargo, la especificidad disminuye cuan- cing alternativo) o que se agrupen transcriptos
do se estudian genomas más complejos. Se correspondientes a genes distintos porque pre-
han hecho intentos para mejorar la especifi- sentan un alto grado de homología de secuen-
cidad aumentando el largo de los fragmentos. cia. Es importante mencionar que las bases de
LongSAGE aumenta el largo de los fragmentos datos de referencia pueden ser incompletas,
a 21 pb y SuperSAGE a 26 pb, utilizando dife- debido a que comúnmente se incluyen en las
rentes enzimas de etiquetado. Esta estrategia mismas secuencias de alta calidad y anotadas
mejoró la especificidad de un dado fragmento para aumentar la especificidad. Sin embargo,
para representar a un transcripto único (aun- esta estrategia disminuye en gran medida el
que no completamente) y también la probabi- número de transcriptos representados en la
lidad de que dicho fragmento se localice una base de datos. Esto origina que muchos de
única vez en el genoma. Sin embargo, el hecho los fragmentos obtenidos por SAGE sean cla-
de trabajar con fragmentos más largos aumen- sificados como desconocidos incluso cuando
ta los costos de secuenciación de la técnica. sus transcriptos correspondientes hayan sido
Por estos motivos, el usuario debe considerar previamente identificados. Además, un mismo
cuidadosamente cuál es la longitud de los frag- fragmento puede presentar homología con más
mentos a utilizar para cada caso particular. de un gen, lo que presenta un desafío adicional
Los fragmentos obtenidos mediante SAGE para la clasificación de los mismos. Por todos
no se pueden utilizar directamente en bús- estos motivos, es necesario verificar la asigna-
quedas de homología con secuencias conteni- ción de un fragmento mediante otras técnicas.
das en bases de datos debido a que son muy Entre las más utilizadas se pueden mencionar
cortos. Para poder asignar un gen a un dado el RACE (Rapid Amplification of ADNc Ends)
fragmento es necesario contar con una base y GLGI (Generation of Long ADNc from SAGE
de datos de referencia construida previamen- tags for Gene Identification).
te. Esta base de datos contiene información de Los fragmentos obtenidos por SAGE pueden
fragmentos obtenidas in silico a partir de se- organizarse en tres grupos: de alta, intermedia
cuencias conocidas de transcriptos o de genes y baja abundancia. Sin embargo, no se ha ana-
de la especie en estudio. Si un fragmento aisla- lizado exhaustivamente aún si el número de
do experimentalmente presenta homología con copias de un fragmento obtenido por SAGE
una secuencia presente en la base de datos refleja exactamente en todos los casos la can-
SAGE de referencia, entonces se considera tidad de ARNmensajero real contenida en la
que el transcripto que lo originó proviene del muestra. Dado que el SAGE involucra numero-
gen que había sido asignado a esa secuencia. sas amplificaciones por PCR, pueden originar-
La confiabilidad de la asignación de genes uti- se errores específicos para un dado fragmento.
lizando estas bases de datos está influenciada Además se ha observado que las secuencias
por factores biológicos (por ejemplo, isoformas obtenidas por esta técnica presentan un ma-

yor contenido de G+C, lo que sugiere una pre- dad de la técnica se ve reflejada en su amplia
ferencia de amplificación que compromete la variedad de aplicaciones que abarca desde
exactitud de la cuantificación. el análisis de expresión génica hasta estu-
Dos ventajas importantes del SAGE sobre dios de ADN genómico (como Comparative
la hibridización substractiva y el display dife- Genomic Hybridization - CGH- y Chromatin
rencial es que los datos obtenidos son cuan- Immunopurification microarrays - conocidos
titativos y acumulativos. Si se genera la sufi- como ChIP-chips). Sin embargo, en este ca-
ciente cantidad de información de secuencia pítulo sólo describiremos los microarreglos de
se obtienen perfiles exactos de la expresión de ADNc y de oligonucleótidos, ya que son los más
los transcriptos, que describen la abundancia utilizados para el análisis del transcriptoma.
de todos los genes expresados en una célula Los microarreglos de ADN pueden ser crea-
o tejido. Existe una base de datos pública de dos de dos maneras: fijando las moléculas de
expresión génica que ha sido creada para el ácidos nucleicos sobre una superficie sólida o
almacenamiento y análisis de secuencias de por síntesis in situ de oligonucleótidos. En el
SAGE cuyo poder continuará creciendo a me- primer caso las moléculas de ADN pueden ser
dida que se contribuya con más información. ADNcs amplificados por PCR, oligonucleótidos
Otra característica de los datos de SAGE es o fragmentos de ADN genómicos clonados en
que pueden complementar otros de ESTs ge- BACs (Bacterial Artificial Chromosomes).
nerados a partir de bibliotecas de ADNc nor- La utilización de clones de ADNc amplifica-
malizadas o substraídas. Los ESTs brindan in- dos por PCR como sondas es el método de
formación de secuencia mientras que el SAGE elección cuando se interrogan muestras de or-
provee datos cuantitativos describiendo la ganismos cuyo genoma no está secuenciado.
abundancia de los transcriptos. Finalmente, a Estos microarreglos son generalmente fabrica-
pesar de que el SAGE requiere capacidad de dos utilizando robots. Los mismos contienen
secuenciación de última generación, la canti- un cabezal de puntas que es sumergido en
dad de datos que aporta puede ser 20 veces soluciones de sondas de ADN disueltas en el
mayor que el que posibilita la misma cantidad buffer correspondiente y que luego son depo-
de secuenciación EST. sitadas sobre un sustrato de vidrio modificado
químicamente. Las puntas se cargan de sonda
Hibridización de microarreglos por capilaridad y la tensión superficial entre el
Los microarreglos han revolucionado la bio- buffer y el vidrio actúa para descargar las son-
logía molecular. Esta técnica utiliza cientos a das. Las perturbaciones en la estructura de las
miles de sondas altamente organizadas sobre descargas son frecuentes y son una fuente sig-
una superficie sólida para interrogar de mane- nificativa de variación de la señal. Si bien exis-
ra simultánea a todas las moléculas de ARN ten otras alternativas, la utilización de robots
(definidas como blancos) contenidas en una es la más popular debido a su disponibilidad,
muestra biológica. Las muestras a ser analiza- alta flexibilidad y bajos costos. Los sustratos
das se marcan fluorescentemente o radiactiva- inertes sobre los cuales se depositan las son-
mente y se aplican al microarreglo. Los ácidos das son variados. Los portaobjetos de vidrio
nucleicos marcados hibridan con las moléculas cubiertos con poli-L-lisina fueron gradualmente
de ADN complementarias que se encuentran reemplazados por sustratos con aminosilano
inmovilizadas en el microarreglo. La fuerza de comerciales debido a su mayor consistencia
la señal fluorescente o radiactiva capturada por en cuanto a la morfología de las descargas.
las sondas de ADN en el arreglo es detectada y Para este tipo de químicas, las sondas son
digitalizada para su cuantificación. inicialmente unidas por atracción electrostáti-
Los microarreglos fueron originalmente dise- ca y luego fijadas por ligación cruzada (cross-
ñados para identificar diferencias de expresión linking) al sustrato mediante radiación UV o
génica en dos muestras distintas basadas en calor. Posteriormente se introdujeron sustratos
las cantidades relativas de blancos unidos a reactivos y sondas modificadas que permiten
una sonda determinada en el arreglo. La utili- una mayor discriminación de secuencia debido

Muestra prueba Muestra de referencia
Transcripción reversa
y marcaje con fluoróforos
Clones de DNA
Impresión robótica
Hibridización
al microarreglo
Laser 2
Excitación
Laser 1
Emisión
Análisis computacional
Figura 5.
a que hay un único punto de unión y una mayor Originalmente, las sondas de ADN eran di-
retención de la sonda al sustrato. También se sueltas en soluciones con alto contenido de
han desarrollado otros sustratos para producir sales. Luego se introdujo la utilización de de-
señales más intensas y que demanden me- tergentes para mejorar la morfología de las
nores cantidades de sondas. Para lograrlo se descargas. Sin embargo, algunos investigado-
aumentó la cantidad de grupos reactivos sobre res informaron que la presencia de detergen-
la superficie. Esto se puede lograr cubriendo tes resulta en un mayor arrastre de la sonda
los portaobjetos con dendrímeros, mezclas de y una mayor variabilidad entre una deposición
epoxisilano y aminosilano o con polímeros que y la siguiente. La utilización de soluciones de
se auto-absorben. descarga conteniendo agentes higroscópicos

permitió mejorar la estructura de los puntos y dos al desarrollo de nuevas tecnologías, van a
aumentar las intensidades de señal obtenidas. permitir reducir los niveles de variabilidad sis-
La desventaja de la utilización de aditivos hi- temáticos resultantes de la fabricación de los
groscópicos es que producen aumentos en el microarreglos.
área ocupada por la sonda, sin embargo, este La mayoría de los laboratorios ensayan la
efecto se puede reducir disminuyendo la velo- calidad de sus microarreglos antes de reali-
cidad del robot o aplicando micro-vibraciones zar los experimentos de hibridación con las
de las puntas. Disminuir la temperatura de la muestras biológicas de interés. Generalmente
cámara del robot donde se generan los mi- se controla la bondad de la impresión y se de-
croarreglos y utilizar soluciones hidrofóbicas tectan errores tales como puntos que no están
contribuye también a reducir el tamaño prome- bien formados, aquellos de tamaños mayores
dio de las descargas. La variedad de solucio- a los deseados o faltantes. Los puntos pueden
nes de descarga que existe sugiere que no ser visualizados utilizando tinturas fluorescen-
hay un tipo de solución que resulte ideal para tes de unión a ADN. También se pueden em-
todas las aplicaciones y que la elección de la plear métodos más precisos como son la hi-
misma depende en gran medida del tipo de mi- bridación con mezclas de oligonucleótidos al
croarreglo que se quiere construir. Las puntas azar de 9-mer marcados fluorescentemente o
de los cabezales que se utilizan son normal- con oligonucleótidos marcados que hibridizan
mente de acero inoxidable o de titanio y contie- con secuencias marcadoras cortas que están
nen un capilar generado mediante descargas presentes en todas las sondas de ADN del
eléctricas o la utilización de un láser. Se ob- microarreglo. Para controlar la calidad de la
serva una variación sistemática en la extensión producción de microarreglos es recomendable
de la descarga, porque ésta es una función del desarrollar, documentar y emplear protocolos
formato de la punta, y existe variabilidad du- estándar (Standard Operating Procedures-
rante la fabricación de las mismas. Se han de- SOPs). Se pueden encontrar ejemplos de los
sarrollado nuevas tecnologías para solucionar mismos en la página http://www.flychip.org.uk.
este problema como por ejemplo la generación Esta práctica no solamente aumenta la con-
de puntas de cerámica más uniformes. sistencia entre experimentos dentro de un la-
La evaporación durante el proceso de impre- boratorio, sino que facilita la transferencia de
sión de los microarreglos es la principal causa información entre laboratorios.
de variabilidad. La evaporación reduce el vo- El segundo método posible para la construc-
lumen de solvente en las microplacas de 384 ción de microarreglos es la síntesis de oligo-
pocillos y dentro del reservorio capilar de las nucleótidos in situ, inicialmente desarrollada
puntas, lo que produce un aumento de concen- por Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, EEUU).
tración de las sondas y altera las caracterís- Este método usa una conjunción de fotolitogra-
ticas de la solución de descarga. Como con- fía y de química combinatoria que resulta en
secuencia de esto, las propiedades del punto la síntesis de chips de ADN de alta densidad.
sembrado y la distribución de la sonda de ADN También NimbleGen (NimbleGen, Madison,
dentro del área del mismo se modifican. Este EEUU), Xeotron (Xeotron, Houston, EEUU) y
problema se puede solucionar en parte regu- Febit (Febit, Mannheim, Alemania) han desa-
lando las condiciones de humedad y tempera- rrollado otros procesos para lograr la síntesis
tura dentro de la cámara del robot donde se de oligonucleótidos in situ. Todos estos pro-
realiza la impresión de los microarreglos. Dado cesos se basan en la utilización de radiación
que existen numerosas interacciones entre UV. En cambio Combimatrix (Combimatrix,
los distintos componentes del proceso, no es Mukilteo, EEUU) usa electroquímica localiza-
sencillo predecir en forma exacta cómo va a da. En el caso de Affymetrix se logra la síntesis
resultar la combinación entre una solución de in situ mediante fotoactivación y desprotección
siembra y un sustrato determinados. Sin em- de ácidos nucleicos. Se utilizan fotomáscaras
bargo, se están realizando constantemente es- para dirigir la radiación UV a sectores espe-
tudios para examinar este proceso que, suma- cíficos del microarreglo, de modo de lograr

la síntesis en forma selectiva. En el caso de secuencia. Por lo tanto, los estudios de expre-
NimbleGen, Xeotron y Febit, todos ellos usan sión usando arreglos de tipo “tejado” permiten
métodos que no requieren la utilización de fo- obtener una visión mucho más completa del
tomáscaras. En este caso, la radiación UV es transcriptoma y de su relación con el genoma.
dirigida mediante miles de espejos regulables La necesidad de descripciones precisas de
y el ADN es sintetizado utilizando nucleótidos experimentos de microarreglos para permitir el
modificados con fosfoamidita. En el caso de almacenamiento de los datos experimentales
CombiMatrix, numerosos microelectrodos son y su análisis posterior ha originado la creación
utilizados para sintetizar distintas moléculas de del “Minimum Information About a Microarray
ADN en paralelo. La reacción química para la Experiment (MIAME) Standard” (MIAME
síntesis de oligonucleótidos ocurre en el área Standard). Al igual que con las secuencias de
que rodea a cada microelectrodo a la que se ADN o con las estructuras de proteínas, es
suele denominar “vaso virtual” (virtual flask). cada vez más común el requerimiento de en-
Una estrategia para estudiar la expresión gé- viar los resultados a bases de datos de este
nica de todo un genoma es la detección de la tipo antes de su publicación. Estos estándares
actividad transcripcional completa de los cro- son necesarios para permitir que la información
mosomas usando “arreglos solapados o en te- esté públicamente disponible en un formato
jado” (tiling arrays). En este caso, en lugar de único, y también para uniformar la nomenclatu-
utilizar sondas específicas para cada gen, el ra empleada lo que hace posible la integración
genoma completo incluyendo regiones intergé- y comparación de resultados obtenidos de dis-
nicas está representado en el arreglo. Además tintas fuentes. MIAME administra descripcio-
de detectar transcriptos estos chips permiten nes técnicas detalladas (plataforma utilizada,
métodos de marcación e hibridación, medición
realizar hibridaciones comparativas de geno-
de datos y diseño del arreglo), pero no provee
mas para detectar deleciones y polimorfismos,
información relevante específica del organismo
estudiar los perfiles de metilación y analizar
en estudio que es necesaria para comprender
muestras de inmunoprecipitación de cromati-
el experimento planteado. Por este motivo, se
na. Affymetrix desarrolló los primeros arreglos
diseñó la base MIAME/Plant, la que incluye de-
de este tipo para Arabidopsis. Los estudios
talles biológicos para describir experimentos
realizados utilizando arreglos de tipo “tejado”
de microarreglos realizados en plantas.
permiten la identificación de numerosos sitios
El análisis de los datos originados en un mi-
transcripcionalmente activos que no habían
croarreglo resulta mucho más laborioso que su
sido detectados mediante algoritmos predicti- generación. En el mismo se consideran la hipó-
vos y/o en colecciones de ADNc. Muchos de tesis de trabajo y los objetivos experimentales
estos nuevos transcriptos son expresados a para lograr identificar a los genes candidatos
partir de la hebra complementaria y en antisen- en las condiciones de estudio. El análisis puede
tido con respecto a transcriptos anotados pre- dividirse en dos fases: 1) el procesamiento de
viamente. O sea, mientras que en determina- datos y 2) la identificación de genes de interés
dos tejidos y/o condiciones se expresa la hebra y la interpretación biológica de los resultados.
sentido, en otros se transcribe la antisentido. El procesamiento de los datos incluye la de-
Sumado a esto, también se demostró que las terminación del nivel de ruido, la cuantificación
regiones centroméricas presentan actividad de las señales fluorescentes, el examen de la
transcripcional en ambos sentidos resultando calidad de los datos, la eliminación de los erro-
esta observación sorprendente, ya que hasta res técnicos y la normalización de los datos. La
hace muy poco tiempo atrás se suponía que identificación de los genes candidatos incluye
en estas regiones no había transcripción ac- la reducción del volumen de la información a
tiva. Esta metodología permite asimismo el un nivel manejable y más fácil de visualizar, el
estudio del metiloma, de las regiones de ADN reconocimiento de patrones de expresión es-
regulatorias, del procesamiento alternativo de pecíficos y la interpretación del significado bio-
ARN y del descubrimiento de polimorfismos de lógico de los mismos.

Conclusiones sión. Las colecciones de ESTs presentan alta
Los métodos descriptos en este capítulo son especificidad para los transcriptos en estudio
tecnologías eficaces que expanden los estu- pero baja sensibilidad para aquellos de esca-
dios de expresión desde los genes únicos has- sa abundancia. La técnica de SAGE disminuye
ta el nivel del transcriptoma completo. Ninguno el largo secuenciado por transcripto lo que au-
de estos procedimientos per se es óptimo para menta la velocidad de relevamiento, pero esta
todas las aplicaciones y la mejor estrategia simplicidad resulta en una alta sensibilidad
para situaciones específicas puede ser crear pero a costa de una menor especificidad. Una
combinaciones de varios de ellos. El continuo comparación de las características de cada
refinamiento de las técnicas de transcriptómica técnica se presenta en la Tabla 1.
y de la bioinformática relacionada proporciona- La combinación de la información genera-
rá a los investigadores nuevas herramientas da por la transcriptómica (nivel y localización
para estudiar la expresión de la información he- espacio/temporal de la expresión génica) y la
reditaria y lograr un mejor entendimiento sobre de los proyectos de secuenciación de geno-
el control genético de los procesos fisiológicos. mas (secuencias completas de los genes y sus
Cada plataforma empleada actualmente para promotores) permite realizar asociaciones de
estudiar el transcriptoma tiene sus ventajas y expresión y homología estructural que en mu-
desventajas. Por ejemplo, los microarreglos chos casos facilitan la inferencia de la posible
son una técnica de alto rendimiento pero sólo función de los genes identificados. Por supues-
se pueden aplicar a transcriptos de secuencia to esto constituye una instancia inicial en la
conocida. Los métodos de ADNc- AFLP y DD definición de la función de cada gen. Para de-
son abiertos, es decir permiten detectar ge- terminar su rol preciso deben hacerse estudios
nes noveles y son especialmente útiles cuan- particulares en general dirigidos a bloquear o
do se trabaja fuera de los modelos, pero son aumentar su expresión por ingeniería genética
cualitativos o semicuantitativos y requieren de y a modificar estructuralmente la molécula de
un complemento de PCR en tiempo real para manera de alterar la actividad de los diferentes
validar y cuantificar las diferencias de expre- dominios de la proteína que codifica.
Tabla 1: Comparación de los principales métodos de relevamiento del transcriptoma.
Características SAGE/ESTs Microarreglos DD/cDNA- Hibridización

AFLP sustractiva
Detecta transcriptos conocidos Sí Sí Sí Sí
Detecta transcriptos desconocidos Sí No Sí Sí
Detecta transcriptos con splicing Sí Sí o no Sí No
alternativo
Detecta transcriptos antisentido Sí Sí o no Sí Sí
Cuantificación Absoluta Relativa Relativa Relativa
Sensibilidad Alta Moderada Alta Alta
Especificidad Moderada Alta Moderada Moderada
Reproducibilidad Buena para Buena para datos Requiere Buena para
transcriptos obtenidos con la realización de transcriptos
abundantes misma plataforma duplicados o abundantes
triplicados
Comparable entre si Buena para Buena para Buena para Buena para
transcriptos transcriptos transcriptos transcriptos
abundantes abundantes abundantes abundantes
Costo Más alto que el de 5-10 veces menor Muy bajo Muy bajo
microarreglos que el de SAGE
Adaptado de Wang 2006 understanding SAGE data, Trends in Genetics.

Para maximizar el potencial de la transcrip- transcripts induced by phytohem-aglutinin and
tómica es necesario un cambio de paradigma phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem.
respecto a la interpretación de los resultados 240:90–97.
obtenidos en este tipo de experimentos. Este Liang, P., A. B. Pardee. 1992. Differential display
of eukaryotic messenger ARN by means of the
cambio de paradigma implica comprender que
polymerase chain reaction. Science (Wash DC)
los datos de expresión no están libres de erro- 257:967–971.
res y aceptar que la variabilidad biológica es- Meyers B.C., Galbraith, D.W., Nelson T. and Agraw-
pacio-temporal es una parte inherente y cuan- al, V. 2004. Methods for transcriptional profiling
tificable de este tipo de experimentos. A pesar in plants. Be fruitful and replicate. Plant Physiol.,
de que los continuos cambios en la expresión 135, 637-652.
de genes en tiempo y espacio colocan al inves- MIAME Standard: http://www.mged.org/Work-
tigador en un escenario de arenas movedizas, groups/MIAME/miame.html
es mucha y muy relevante la información que Moody D. E. 2001. Genomics techniques: an over-
puede obtenerse de este tipo de estudios. Esta view of methods for the study of gene expres-
sion. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135.
transición en la interpretación de los resultados
Nagaraj S.H., Gasser R.B. and Ranganathan S.
será más fácil si se delinea claramente la dife- 2007. A hitchhiker’s guide to expressed se-
rencia entre proponer una función biológica a quence tag (EST) analysis. Brief Bioinform., 8,
partir de simples datos de expresión y postu- 6-21.
lar una hipótesis que debe luego validarse en NimbleGen: http://www.nimblegen.com
base a datos experimentales concretos. Okubo, K., N. Hori, R. Matoba, T. Niyama, A. Fu-
kushima, Y. Kojima, K. Matsubara. 1992. Large
Biblografía Recomendada scale ADNc sequencing for analysis of quantita-
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subtraction based on selective suppression of
polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell

I Capítulo 9 Luego de la separación electroforética, se
lleva a cabo la tinción de los geles y el aná-
Proteómica lisis de las imágenes para visualizar y cuan-
tificar cada proteína. Los métodos de tinción
Paula Casati y María F. Drincovich utilizados van desde los más convencionales,
como la tinción con azul de Coomassie o ni-
trato de plata, hasta métodos más sensibles
1. Introducción
como la tinción fluorescente. Por otro lado han
La proteómica, entendida como el estudio
sido desarrollados recientemente varios com-
del patrón proteico de una célula u órgano,
puestos fluorescentes que permiten múltiples
se encuentra ya en su segunda década como
tinciones de un mismo gel, técnica que permite
campo de estudio. Durante la primera década,
la tinción y visualización de diferentes grupos
la mayor parte de los estudios se realizaron
de proteínas o diferentes subproteomas (por
principalmente mediante el uso de geles en dos
ejemplo, el fosfoproteoma o el glicoproteoma)
dimensiones seguidos de técnicas de tinción
de manera secuencial en un mismo gel. La se-
convencionales. Si bien estos métodos conti-
paración en geles bidimensionales puede dar
núan siendo utilizados de manera importante,
lugar a un mapa proteico complejo, y algunas
durante esta segunda década otros métodos
veces la reproducibilidad de estos geles puede
más sensibles y que además presentan mayor
ser problemática debido a la naturaleza diversa
reproducibilidad han comenzado a ser utiliza-
de las distintas proteínas, sumado a la tarea de
dos. Estas técnicas han sido clasificadas como
identificar el mismo punto proteico en distintos
“proteómica cualitativa”. Muchos de estos mé-
geles. Esto se debe a que cuando se realizan
todos están siendo aplicados en experimentos
estudios comparativos es necesario analizar
de biología vegetal. Por ejemplo, la electrofore-
múltiples geles que pueden contener 1000
sis bidimensional DIGE (del inglés, differential
puntos proteicos cada uno. Así, a pesar del uso
gel electrophoresis) y el marcado isotópico de
de programas avanzados para el análisis de
proteínas y péptidos, son técnicas utilizadas en
geles 2D, se requiere una validación manual fi-
la actualidad para el estudio de diversos pro-
nal. Existen distintos paquetes de computación
teomas. En el presente capítulo se describen
para el análisis de las imágenes que permiten
primero los métodos utilizados en proteómica
asistir con la substracción del ruido de base,
en la actualidad, seguido de una descripción
la detección de los puntos proteicos, el ajuste
de las aplicaciones de estas técnicas en la bio-
de las imágenes, la detección e identificación
logía de plantas.
de puntos entre geles, y la cuantificación me-
diante un análisis estadístico. Los geles bidi-
2. Electroforesis en dos dimensiones
mensionales son una herramienta para la reso-
El procedimiento más utilizado para los es-
lución y visualización de isoformas proteicas,
tudios de proteómica es la separación elec-
productos de degradación y modificaciones
troforética por isoelectroenfoque (IEF) de las
postraduccionales; además de permitir el cál-
proteínas seguido de una segunda separación
culo empírico de la masa molecular, punto iso-
en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
eléctrico y niveles de expresión. Las limitacio-
(SDS-PAGE). Esta técnica se denomina co-
nes de la técnica son la no automatización, la
múnmente electroforesis bidimensional (2D),
dificultad para resolver proteínas de membrana
donde las proteínas se separan en base a su
y proteínas muy básicas o ácidas.
carga y masa molecular. Los avances recien-
Una técnica que aumenta la sensibilidad y
tes en la resolución del IEF gracias al uso de
disminuye la variabilidad que existe entre dis-
geles comerciales en tiras han aumentado la
tintos geles es la llamada electroforesis diferen-
reproducibilidad y la resolución de los geles 2D
cial en gel o DIGE. En esta técnica, las mues-
en proteómica. En particular, la disponibilidad
tras proteicas se preincuban con compuestos
de tiras comerciales de diferentes tamaños y
fluorescentes activos que se unen a residuos
rangos de pH permiten un análisis detallado
de Lys o Cys que pueden ser utilizados para
del proteoma.

cuantificar la abundancia de cada proteína en sus subunidades, que se observan en filas ver-
una población. La mayor ventaja de esta téc- ticales de puntos proteicos en los geles 2D.
nica es la posibilidad de correr dos muestras Esta técnica complementa a los geles 2D IEF/
distintas en un mismo gel, siempre y cuando SDS-PAGE.
las muestras se hayan marcado con marcado-
res fluorescentes con distintos espectros de 3. Cuantificación por espectrometría de
emisión. Esto disminuye los problemas que se masa (MS)
generan durante la identificación de los puntos Luego de la selección de las proteínas
y la cuantificación. En teoría, la cantidad máxi- de interés en un gel 2D, éstas pueden ser
ma de muestras que se pueden separar en un identificadas por espectrometría de masas.
mismo gel se limita al número de compuestos Básicamente, luego de la digestión de las pro-
fluorescentes que se encuentren disponibles teínas cortadas del gel con una proteasa (típi-
y que no muestren espectros de emisión que camente tripsina), la mezcla compleja de pép-
se superpongan, aunque en general se utilizan tidos es analizada. Existen distintos tipos de
sólo tres: dos para el marcado de las muestras espectrometría de masas, que utilizan distintos
a comparar, y el tercero se utiliza para marcar métodos para la ionización de las muestras.
un control interno. La imagen de los geles es Por un lado, la espectrometría de masa por
generada utilizando un escáner de fluorescen- desorción por ionización mediante láser asis-
cia capaz de adquirir las imágenes provenien- tida por una matriz (del inglés matrix-assisted
tes de cada uno de los fluorescentes utilizados. laser desorption ionisation (MALDI))-tiempo
Esta técnica es muy sensible, ya que permite de vuelo (time-of-flight (TOF)), se utiliza prin-
resolver alrededor de 1000 puntos proteicos cipalmente para realizar huellas dactilares de
con solo 50 µg de proteínas sembradas, por lo péptidos y proteínas. Por otro lado, la espec-
que el límite de detección es del orden de pico- trometría en tandem por electropulverizado
a femtomolar de proteína en cada punto. (ESI), usualmente se acopla a una separación
Una ventaja de realizar estudios de proteó- previa en un sistema de cromatografía de alta
mica mediante separación en geles bidimen- presión (HPLC) y se utiliza para la elucidación
sionales es que estos experimentos pueden de la secuencia e identificación de la proteína
ser realizados utilizando muestras de cualquier correspondiente (Figura 1).
especie vegetal, sin necesidad de que el ge- En estos momentos, existe una actualización
noma de la especie en estudio se encuentre constante en los distintos tipos de espectróme-
secuenciada. Además, esta técnica es ideal tros de masa que se encuentran disponibles
para experimentos en donde se observen po- en el mercado, y la sensibilidad, selectividad
cos cambios en los patrones proteicos. y precisión de los equipos son cada vez mayo-
Una alternativa a las separaciones 2D por res. Los principios de esta técnica pueden ser
IEF/SDS-PAGE es la técnica de separación en resumidos en cuatro funciones del equipo:
electroforesis nativa en presencia de azul de 1-Ionización: la molécula de interés sufre un
Coomassie (BN-PAGE, del inglés “blue-nati- cambio en la carga neta, formándose un anión
ve”). Esta técnica es utilizada para la separa- o un protón. Dependiendo del método de io-
ción de proteínas hidrofóbicas y proteínas en nización utilizado, es posible que se generen
su estado nativo, ya que éstas no se separan iones fragmentados. En el caso de usos en
correctamente en los geles IEF/SDS-PAGE. proteómica, los métodos de ionización utili-
Esta técnica se basa en la integración de una zados son MALDI y electrospray/microspray/
carga neta negativa en las proteínas y comple- nanospray.
jos proteicos por adición del colorante azul de 2-Separación: las especies iónicas son se-
Coomassie, y permite la separación en condi- paradas de acuerdo a su relación masa/carga
ciones nativas en la primera dimensión. En la (m/z),
segunda dimensión se realiza un SDS-PAGE, 3-Medida de la masa: las masas son asig-
donde los complejos proteicos que migraron nadas según las medidas de algún parámetro
juntos en la primera dimensión se separan en físico.

Figura 1. Técnicas de MS para identificación de proteínas a partir de geles bidimensionales. Los
puntos de interés del gel 2D son cortados y colocados en tubos. La proteína del bloque de acrilamida es
digerida con una proteasa, y los productos obtenidos son analizados por distintas técnicas para su identi-
ficación. Adaptado de Nesatyy and Suter (2007).

4-Medida de la abundancia: la medida de la sión electrostática que hace que se liberen io-
abundancia de cada ion se realiza en base a nes gaseosos que son acelerados en el espec-
la altura o área del pico en el espectro, permi- trómetro de masas. Cuando los péptidos entran
tiendo una semicuantificación o cuantificación al espectrómetro de masa, algunos iones pep-
de cada ion. tídicos son seleccionados y fragmentados por
colisión con un gas para producir un número
3.1. MALDI-TOF y huella dactilar de péptidos: de fragmentos iónicos. Las relaciones m/z de
En esta técnica, los péptidos generados lue- estos fragmentos son registrados para dar el
go de la digestión con tripsina son mezclados espectro de fragmentación de ese péptido. Un
a una matriz en solución, que está formada péptido se puede considerar como una cade-
por una solución concentrada o saturada de na aminoacídica que se puede fragmentar en
un compuesto de bajo peso molecular ácido y cualquier punto; sin embargo la fragmentación
que absorbe el UV. En el caso de péptidos, el ocurre preferencialmente entre la unión de N y
compuesto más utilizado es el ácido α-ciano- C entre aminoácidos, por lo que la secuencia
4-hidroxicinámico. Aproximadamente 1µL de de un péptido puede determinarse por el patrón
la mezcla muestra/matriz es colocada en una de picos que se obtienen del espectro de frag-
placa para MALDI y se permite co-cristalizar en mentación. El espectrómetro de masa realiza
un único punto. Como la matriz se coloca en el registro de todos los picos de fragmentación,
exceso con respecto a la muestra y absorbe y luego de completada la separación y espec-
UV, cuando se irradia con un láser de UV esta trometría de masa de todos los péptidos, los
energía es absorbida por la matriz y pasada a espectros son enviados a una base de datos
la muestra de manera que se ioniza pero no se para la identificación de la proteína en estudio
fragmenta. Estos iones son luego acelerados por comparación al patrón de ionización teórico
por el espectrómetro de masa: los iones mas de los péptidos de la proteína.
livianos viajan más rápido que los pesados, por
lo que el tiempo en el que llegan al detector 3.3. Bases de datos para la identificación de
puede ser utilizado para determinar la relación proteínas:
masa/carga de cada ion, obteniéndose un es- Existen numerosas bases de datos para la
pectro que contiene todos los iones acelera- identificación y caracterización de proteínas
dos, y se obtiene una lista de las masas de los luego de la espectrometría de masas, búsque-
picos que presentan mayor intensidad. La lista da de semejanzas, patrones de fragmentación
de picos es enviado a una base de datos que y perfiles, predicción de sitios de modificación
compara las masas de los picos de los espec- postraduccional, etc. Entre ellos se encuen-
tros con los teóricos de las proteínas digeridas, tran MASCOT, ProteinProspector, ExPASy
y produce una lista de las posibles identidades Proteomics. Muchos de estos sitios son acce-
utilizando un sistema de puntaje. sibles luego de una suscripción, mientras que
otros están disponibles en la web a todos los
3.2. Espectrometría de masas en tandem usuarios interesados. La tabla 1 muestra las
por electropulverizado. páginas correspondientes de algunos de los
Este proceso analiza los péptidos genera- sitios.
dos luego de la digestión con tripsina. En este
caso, el espectrómetro de masas esta acopla- 4. Alternativas a los geles bidimensionales
do a un equipo de HPLC. Durante la ionización Algunas alternativas al uso de geles en dos
por electropulverizado, los péptidos se separan dimensiones son los métodos basados en es-
previamente por HPLC (usualmente son utili- pectrometría de masa para comparar la abun-
zadas columnas de C18) y luego entran a una dancia de péptidos. Luego de la digestión de
fuente de ionización. Un voltaje alto es aplicado las proteínas (sin que se realice ninguna se-
a una aguja por donde pasan las muestras que paración previa), la mezcla compleja de pép-
llegan como gotas, produciendo una carga en tidos se separa por cromatografía previo al
la superficie. En la gota se genera una repul- análisis por MS. La espectrometría de masas

Tabla 1. el que la marca es introducida a la proteína o
a los péptidos, y cómo son extraídos los datos
Páginas disponibles correspondientes a bases de
datos para identificación de proteínas para el de cuantificación. A continuación se describen
análisis posterior a la espectrometría de masas brevemente los distintos tipos de marcado.
ExPASy Proteomics http://us.expasy.org/tools
MASCOT http://www.matrixscience.com 4.1. Marcado isotópico in vivo.
Prosight PTM http://prosightptm.scs.uiuc.edu Este es un método comúnmente utilizado
Protein Prospector http://prospector.ucsf.edu en proteómica comparativa. Para estos expe-
GPM http://thegpm.org
PROWL http://prowl.rockefeller.edu
rimentos, una de las muestras se crece en una
atmósfera de nitrógeno natural, mientras que
la muestra a comparar se crece en presencia
del isótopo pesado. Esto puede hacerse por la
puede ser corrida de manera independiente o introducción de algún aminoácido marcado en
bien acoplada a la separación por HPLC. Los cultivos celulares o utilizando 15N como única
péptidos producidos por la digestión de las pro- fuente de nitrógeno, típicamente en la forma
teínas totales son ionizados para adquirir el es- de K15NO3. Como resultado, las masas de los
pectro de MS de todos los iones presentes en péptidos de las poblaciones a comparar serán
la mezcla. Algunos péptidos son seleccionados diferentes, permitiendo una comparación di-
y son fragmentados individualmente para ob- recta de las intensidades de los iones de las
tener un segundo espectro MS (MS/MS) que dos mezclas. En principio, las dos muestras a
permite obtener la secuencia de aminoácidos comparar pueden ser mezcladas al comienzo
del péptido. La señal o integración de los picos del experimento, por lo que se eliminan virtual-
de los iones puede ser utilizada como técnica mente todas las potenciales variaciones téc-
de cuantificación, ya que en teoría la intensi- nicas. Debido a que la diferencia isotópica de
cada péptido es la misma entre los espectros
dad de los picos es proporcional a la cantidad
de las dos muestras, el estudio del proteoma
de proteína de la cual proviene el ion peptídi-
completo puede ser problemático debido a la
co. Sin embargo, la variabilidad técnica, tanto
complejidad de los espectros, por lo que esta
a nivel de la cromatografía líquida como a nivel
técnica es recomendable para sub-proteomas,
de los pasos de ionización, hacen que la com-
como por ejemplo el fosfoproteoma.
paración de las intensidades no sea confiable.
Por ello, se han desarrollado diferentes técni-
4.2. Marcado isotópico in vitro.
cas de marcado de las proteínas que permi- Una alternativa es introducir la marca en los
ten una directa comparación de los picos en péptidos de manera química durante o luego
un mismo espectro MS o MS/MS. La base de de la digestión de las proteínas. Una ventaja de
todas estas técnicas es la misma: se introdu- esta técnica es que cualquier muestra protei-
cen marcas inertes, estables e isotópicas a los ca puede ser marcada, eliminando la limitación
péptidos de manera que los patrones de ioni- que existe al querer introducir la marca en una
zación y las propiedades cromatográficas de célula viva. La mayor desventaja es el cuidado
los péptidos marcados sean similares a los de que hay que tener para no introducir variacio-
las muestras de origen, pero pueden ser dife- nes técnicas durante la obtención de la mues-
renciados luego del análisis por un leve corri- tra proteica (en especial si existe algún paso de
miento en el espectro de MS. De esta mane- fracción subcelular).
ra, las dos muestras a comparar pueden ser
corridas de manera simultánea y analizadas 4.2.1. Marcado con 18O durante la digestión
a partir de un mismo experimento. Por ello, la con tripsina
separación de los péptidos seguida de la cuan- Durante la hidrólisis de las proteínas con
tificacion de los iones refleja la abundancia re- tripsina, el oxígeno del agua se incorpora al
lativa de cada proteína intacta de la cual deriva C terminal del péptido tríptico. Por lo tanto, si
el péptido cuantificado. Los distintos métodos la digestión de una muestra se realiza en pre-
de marcado se diferencian en el momento en sencia de H218O mientras que la de la muestra

a comparar se realiza en un medio con H216O, los péptidos de múltiples espectros de LC-MS/
en teoría se generan péptidos que difieren MS. Una vez identificado el mismo péptido en
en cuatro unidades de masa en el espectro. distintos espectros, éstos se comparan y se
Experimentalmente, sin embargo, la incorpo- genera una relación de expresión luego de un
ración es siempre incompleta, generándose análisis estadístico.
espectros que se solapan. Por esta razón este
método no es tan elegido como otros, aunque 4.4. Cuantificación absoluta utilizando pépti-
presenta bajo costo comparado a los que se dos AQUA
describen a continuación. Los métodos descriptos anteriormente son
capaces de determinar cantidades relativas
4.2.2. Marcado isotópico con sondas por afi- de proteínas o péptidos. Para convertir datos
nidad (ICAT). relativos a absolutos se requiere la inclusión
Otro método de marcado se basa en la mode estándares internos de concentraciones
dificación covalente de Cys con compuestos conocidas, que deben estar marcados para
químicos biotinilados que sólo difieren en la distinguirse de la proteína nativa. Para ello se
inclusión de isótopos pesados y livianos lue- utiliza la técnica de marcado isotópico estable,
go de la digestión. El uso de biotina permite el en la que péptidos sintéticos son marcados
rápido enriquecimiento de los péptidos marca- con un aminoácido pesado en una o más posi-
dos, y debido a que la mayoría de las proteínas ciones (llamado péptido AQUA). Debido a que
contienen pocas Cys, sólo algunos péptidos de las propiedades cromatográficas e ionizantes
cada proteína son analizados. Por ello, este de los péptidos AQUA son idénticas a las de
método permite el análisis de muestras com- los péptidos nativos, al analizar e integrar los
plejas. Sin embargo, dado que una de cada cromatogramas de los iones del par isotópico,
siete proteínas no contiene residuos de Cys, se obtiene una relación entre el péptido nati-
existen limitaciones en el análisis. vo y el sintético de concentración conocida.
Estos péptidos pueden ser sintetizados para
4.2.3. Marcas isobáricas para cuantificación múltiples proteínas de interés y usados para
relativa y absoluta (iTRAQ). determinar concentraciones absolutas en una
Un método alternativo involucra la modifica- muestra. Además, pueden ser utilizados para
ción de aminas primarias con marcas isobári- cuantificar modificaciones postraduccionales.
cas. Esta técnica es similar a ICAT en cuanto a
que cada muestra es marcada con una marca 5. Aplicaciones de la proteómic
diferente, pero con los reactivos iTRAQ todos El análisis del proteoma de órganos o teji-
los péptidos trípticos son marcados. Además, dos de plantas se ha llevado a cabo para ana-
esta técnica permite el análisis de hasta 8 lizar, por ejemplo, la respuesta a hormonas o
muestras de manera simultánea si se utilizan moléculas señal, la respuesta a estímulos del
distintos reactivos iTRAQ para marcar las dis- ambiente, cambios durante el desarrollo o tam-
tintas muestras. bién para analizar los patrones proteicos de lí-
neas con diferente base genética. Proteomas
4.3. Cuantificación libre de marca. subcelulares también han sido analizados en
A pesar de los problemas de variabilidad des- diversas especies y, más recientemente, se
criptos anteriormente en la cuantificación direc- ha utilizado este tipo de estudio para analizar
ta de la intensidad de los picos de MS luego de interacción de proteínas o modificaciones pos-
la cromatografía líquida, debido a la aparición traduccionales. Además, se han analizado por
de espectrómetros de masa de última genera- esta técnica la equivalencia y seguridad de ali-
ción y al aumento de la reproducibilidad de las mentos derivados de plantas transgénicas, así
separaciones en las cromatografías gaseosas, como el estudio de la presencia de alergenos,
esta técnica ha comenzado a ser utilizada nue- entre otros. Así, los campos de aplicación de la
vamente. Para ello, varios programas de com- proteómica en plantas ha ido en aumento en
putación han sido desarrollados para comparar los últimos años (ver revisiones: Cánovas et al.

2004; Rossignol et al. 2006; Jarrín et al. 2007) dores específicos. Cabe destacar que muchas
y a continuación se detallarán algunos de los de las proteínas identificadas en los diversos
aspectos más estudiados. La Tabla 2 resume compartimentos provienen de anotaciones de
las áreas más relevantes en las que se ha apli- genes con función desconocida, por lo cual el
cado la proteómica en plantas. conocimiento de la localización de la proteína
5.1. Análisis de proteomas subcelulares de que codifican permite comenzar a identificar la
plantas función de dichos genes.
El mayor avance en proteomas subcelulares El análisis de proteomas de plastidios, es-
se ha llevado a cabo en plastidios, mitocon- pecialmente de cloroplastos, ha brindado in-
drias y membranas. Estos estudios no sólo han formación sobre nuevas proteínas localizadas
contribuido a la localización de proteínas espe- en membrana externa y en tilacoides. Estos
cíficas, sino también que ha brindado informa- estudios, llevados a cabo fundamentalmente
ción relevante sobre transporte, metabolismo, en arabidopsis y espinaca, han evidenciado
vías de secreción, diferenciación y respuesta a diversos procesos de procesamiento y trans-
estrés. A pesar de que la purificación de plas- locación y modificaciones postraduccionales
tidios es una técnica fácil y que brinda frac- de proteínas. Gracias al uso de extracciones
ciones de alta pureza, el aislamiento de otras con diversos solventes, se han identificados
organelas o fracciones subcelulares es técni- nuevas proteínas candidatas a ser transporta-
camente más dificultosa. En todos los casos, dores de membrana. La técnica de electrofore-
siempre se debe estimar el nivel de contamina- sis nativa en presencia de azul de Coomassie
ción de la fracción purificada utilizando marca- (BN-PAGE), seguida por segunda dimensión e
Tabla 2 Aplicaciones de la proteómica en plantas: Especies analizadas, tipos de proteomas estudiados,

procesos biológicos y aspectos prácticos donde se ha analizado el proteoma.
Especies analizadas Proteomas Procesos Biológicos Aspectos prácticos
Sistemas modelos Individuales Desarrollo Identidad de marcadores

Arabidopsis thaliana Genotipos Germinación moleculares
Medicago truncatula Mutantes Maduración polen
Trangénicas Embriogénesis Caracterización del
Cereales Respuesta a hormonas genotipo
Maíz Fracciones subcelulares Muerte celular programada
Arroz Cloroplasto Equivalencia de OGM
Trigo Mitocondria Estrés abiótico
Plastidio Sequía Identificación alergenos
Leguminosas Citosol Osmótico
Alfalfa Pared celular Temperatura
Arveja Membrana Anoxia
Soja Vacuola Deficiencia nutricional
Lenteja Metales pesados
Órganos y Tejidos UV-B
Otros Raíces
Papa Semillas Estrés biótico
Tabaco Coleoptiles Patógenos
Tomate Haces vasculares Herbívoros
Vid Hojas Estrés oxidativo
Espinaca Tricomas
Polen
Estados de desarrollo
Germinación
Plantas maduras
Plantas jóvenes

identificación de las proteínas por MS, técnica los últimos años un gran número de trabajos
ampliamente utilizada para el estudio de com- se han realizado con el objetivo de identificar
plejos mitocondriales, también ha sido utilizada los cambios proteicos que ocurren asociados
para el estudio de la composición de los com- al crecimiento y desarrollo, con la finalidad de
plejos proteicos de la membrana tilacoidal. identificar las proteínas claves implicadas en
El estudio del proteoma mitocondrial se ha dichos procesos. Así, se han descrito los cam-
dividido en la identificación de proteínas so- bios en el proteoma asociados al crecimiento o
lubles, proteínas periféricas y proteínas inte- desarrollo del grano de polen, semillas, raíces,
grales de membrana. En este caso, el uso de haces vasculares, entre otros.
BN-PAGE seguido por 2-DE e identificación de Muchos son los estudios que demuestran
las proteínas, se ha utilizado para analizar la que los análisis de proteómica pueden generar
composición de los diversos complejos respi- información relevante para dilucidar los meca-
ratorios, identificándose nuevos componentes nismos moleculares involucrados en procesos
y diferencias con complejos respiratorios de de desarrollo. Por ejemplo, estudios llevados
otros organismos. a cabo en raíces de maíz han indicado que,
El análisis de proteínas de membrana es uno de las proteínas identificadas luego de 5-días
de los desafíos más difíciles, debido a proble- de germinación, sólo el 28% permanece en las
mas de metodología por la baja abundancia de últimas etapas del desarrollo, identificándose,
las proteínas y sus características hidrofóbi- además, proteínas asociadas a la formación de
cas, siendo muchas de ellas proteínas trans-
raíces laterales. Procesos como la embriogé-
membrana. Para el análisis de este tipo de pro-
nesis somática también han sido analizados en
teínas, se han empleado partición de proteínas
diversas especies por proteómica, identificán-
en distintas fases de solventes seguido de frac-
dose proteínas de membrana, nucleares, así
cionamiento teniendo en cuenta las propieda-
como proteínas involucradas en metabolismo y
des fisicoquímicas de las proteínas. Por ejem-
producción de energía, en diversas etapas de
plo, el proteoma de la membrana plasmática
este proceso. En muchos casos, se han iden-
de arabidopsis fue analizado, siendo uno de
los primeros que, además, se sometió a aná- tificado proteínas cuyos ARNm no fueron iden-
lisis de proteínas fosforiladas, identificándose tificados por estudios de transcriptoma, como
más de 300 sitios de fosforilación. El proteoma es el caso del análisis del grano de polen en
vacuolar de arabidopsis, tanto de la membra- arabidopsis, entre otros.
na como de las proteínas solubles, también ha
sido analizado, confirmándose dicha localiza- 5.3. Proteomas en respuesta a estrés
ción subcelular para algunas de las proteínas abiótico
identificadas por otras técnicas. El estudio de la interacción de las plantas
Además, se han llevado a cabo estudios con el ambiente ha sido clásicamente aborda-
para identificar proteínas de pared celular y do mediante estudios bioquímicos, genéticos y
extracelulares –identificándose la presencia de más recientemente, a nivel de transcriptoma,
varias proteasas-, proteínas nucleares –muy mediante PCR en tiempo real (qRT-PCR), mi-
difícil debido a su baja cantidad y a sus asocia- croarreglos, entre otros. Sin embargo, la pro-
ción con el Retículo Endoplasmático-, y proteo- teómica, desde su aplicación en este tipo de
mas mixtos del aparato de Golgi y del Retículo situaciones, ha comenzado a brindar contribu-
endoplasmático. ciones relevantes en cuanto a los elementos
involucrados tanto en la percepción de la situa-
5.2. Proteomas durante el desarrollo de ción ambiental como en la traducción de dicha
órganos señal en la planta. Los tipos de estrés analiza-
Uno de los primeros objetivos de la pro- dos mediante proteómica han sido: sequía, es-
teómica en plantas fue generar mapas de re- trés salino, alta temperatura, alta luz, radiación
ferencia de proteínas solubles de un órgano UV-B, deficiencia nutricional, niveles elevados
en un determinado estado de desarrollo. En de CO2, anoxia, metales pesados y herbicidas.

Este tipo de aplicación de la proteómica in- quitinasas, proteasa, inhibidores de protea-
cluye típicamente análisis de 2-DE/MS para sas), antioxidantes (catalasas, SODs, peroxi-
estudiar variaciones proteicas entre especies dasas), chaperonas, HSPs, proteínas LEA. En
sensibles y resistentes frente a una determi- el segundo grupo, varias enzimas asociadas
nada situación de estrés. Se analizan las dife- a metabolismo como la glucólisis, fotosínte-
rencias cuantitativas y cualitativas de proteínas sis, ciclo de Krebs, asimilación del nitrógeno o
con la finalidad de correlacionar estos cambios implicadas en metabolismos secundarios han
con las diferencias fenotípicas. Se estudian sido encontradas. Es notable que los estudios
también plantas mutantes o transgénicas, don- basados en análisis del transcriptoma han ana-
de una línea es resistente y otra sensible. Así, lizado en mucha mayor medida el primer grupo
las proteínas diferenciales se seleccionan con- que el segundo. Sin embargo, la presencia de
trastando los proteomas entre líneas resisten- mayor concentración de proteínas implicadas
tes versus susceptibles, o entre líneas crecidas en metabolismo primario en genotipos resis-
en condiciones óptimas versus estresadas. tentes versus sensibles podría indicar una ven-
taja genética para defenderse frente al ataque.
5.4. Proteomas en respuesta a estrés biótico
En los últimos años, muchos estudios se 5.5. Proteómica para el estudio de simbiosis
han llevado a cabo para analizar la respues- en plantas
ta de los proteomas de diversos órganos fren- La proteómica se ha aplicado también para
te al ataque por hongos, virus o bacterias. el estudio de las proteínas involucradas en la
Típicamente, extractos crudos de hojas, semi- formación de nódulos en especies legumino-
llas, raíces o cultivos celulares se analizan a sas. Mapas de proteínas de raíces de especies
distintos tiempos luego del tratamiento y se se- hospedadoras, nódulos, cultivos de bacteroi-
paran organelas o subfracciones para el aná- des fueron generados y comparados, con el
lisis de los cambios en el proteoma. Además, objetivo de identificar proteínas involucradas
se analiza el efecto de elicitores o moléculas en la simbiosis. Además, se analizaron las pro-
claves de la señalización (como ácido sali- teínas involucradas en distintas etapas de la
cílico, peróxido de hidrógeno u óxido nítrico) nodulación.
sobre el proteoma. Por otro lado, se estudian
los proteomas de especies tolerantes o resis- 5.6. Modificación postraduccional e interac-
tentes versus el de sensibles. Estos estudios, ción de proteínas
junto con el estudio del proteoma de diversos Una de las modificaciones postraducciona-
compartimentos celulares (apoplasto, tricoma, les de proteínas estudiadas mediante proteó-
sap de floema o xilema, entre otros), han evi- mica es la fosforilación. En estos estudios,
denciado que varias proteínas relacionadas a se han identificado los cambios cuantitativos
la defensa frente al ataque de patógenos están y cualitativos de las proteínas fosforiladas en
presentes incluso en ausencia del mismo y que respuesta a diversas señales. Además, se han
las mismas proteínas responden a tipos varia- analizado las proteínas modificadas en su esta-
dos de estrés. Además, muchas proteínas de- do redox en diferentes sistemas, identificándo-
rivadas de genes de función desconocida, han se muchos candidatos putativos de ser blanco
sido encontradas en estos estudios. de reducción por tioredoxinas. Recientemente,
En general, la mayoría de las proteínas se ha comenzado a analizar el patrón de pro-
identificadas en los estudios de proteomas teínas sujetas a ubiquitinación en plantas, me-
de genotipos resistentes comparadas con los diante estudios de proteómica.
de sensibles, han mostrado dos tipos gene- En cuanto al estudio de interacción de pro-
rales de proteínas: proteínas relacionadas a teínas mediante proteómica, los estudios lle-
la defensa y enzimas asociadas al metabolis- vados a cabo en plantas son todavía muy po-
mo del carbono o nitrógeno y al metabolismo cos comparados con los llevados a cabo en
secundario. Dentro del primer grupo, se han otros sistemas, como mamíferos y levaduras.
encontrado proteínas PR (como glucanasas, Algunos ejemplos incluyen estudios de com-

plejos formados por virus de plantas y proteí- Rossignol M., Peltier J-B., Mock H-P., Matros A.,
nas del huésped, análisis de inmunoprecipita- Maldonado A. M. and Jarrín J. V. 2006. Plant
dos de proteínas que interaccionan con fitocro- proteome analysis: A 2004-2006 update. Pro-
mos, así como proteínas que interaccionan con teomics, 6, 5529-5548.
cobre.
6. Perspectivas
Los resultados obtenidos mediante estudios
de proteómica en sus distintas aplicaciones
han indicado que los estudios de genómica
y transcriptoma no son suficientes, dado que
la proteómica generalmente evidencia pro-
cesos no detectados por los otros estudios
mencionados.
Esto se debe fundamentalmente a que las
proteínas son física y químicamente más diver-
sas que los ácidos nucleicos. Además, debido
al procesamiento del ARN y a las modificacio-
nes postraduccionales, las proteínas de un
dado organismo exceden en número la can-
tidad de genes. Otro nivel de complejidad se
presenta si se tienen en cuenta la interacción
de proteína-proteína, lo cual modifica las pro-
piedades de las proteínas individuales.
De esta manera, el estudio del proteoma,
en paralelo con el del transcriptoma, llevado a
cabo sobre el mismo sistema, podrá dilucidar
los mecanismos de control de expresión de
proteínas y evidenciará los procesos biológicos
llevados a cabo en una determinada situación.
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I Capítulo 10 general, la metabolómica indica la totalidad de
los patrones metabólicos de los sistemas bio-
Metabolómica lógicos, también conocidos como perfiles me-
tabólicos. Como los metabolitos son el produc-
to de reacciones enzimáticas, ellos brindarán
Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci,
información importante sobre las propiedades
Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y
regulatorias o catalíticas de un producto génico
Estela M. Valle.
dado. Los metabolitos presentes en un sistema
biológico bajo condiciones específicas (esta-
Definición de metaboloma
díos de desarrollo, condiciones ambientales,
Se conoce como metabolismo al conjunto
modificaciones genéticas) se pueden analizar
de reacciones químicas que ocurren en las cé-
mediante el uso de técnicas cromatográficas
lulas vivas, tejidos u organismos, mediante el
de separación en distintas fases (gaseosa, lí-
cual estos participan del intercambio de mate-
quida, de alta presión, etc) y de identificación
ria y energía con su entorno. El origen de la
mediante espectrometría de alta resolución
palabra metabolismo procede del griego me-
que han comenzado a establecerse reciente-
tabolé que significa cambio, transformación.
mente en Argentina, como la espectrometría
En los sistemas biológicos los metabolismos
de masa (MS) gaseosa o líquida y técnicas es-
se encuentran interconectados formando re-
pectroscópicas como la resonancia magnética
des bioquímicas. En los últimos años y en esta
nuclear (RMN). A su vez, el acoplamiento de
era post-genómica, se ha acuñado el término
los sistemas de separación con los de identi-
“metaboloma”, para indicar la totalidad de los
ficación mencionados más arriba permite la
metabolitos que actúan en las redes metabóli-
obtención de perfiles metabólicos de muestras
cas de un sistema biológico. Es decir, el meta-
complejas como por ejemplo, extractos crudos
boloma implica la identificación y cuantificación
obtenidos de órganos fotosintéticos de plantas.
simultáneas de todos los metabolitos del mate-
rial investigado.
Diseño experimental, técnicas, entrena-
El metaboloma está conformado por dos ti-
miento. Métodos cromatográficos (fase ga-
pos de compuestos: los metabolitos primarios y
seosa y líquida).
los secundarios. Los metabolitos primarios son
El análisis de los metabolitos presentes en
compuestos que están involucrados en funcio-
muestras complejas (como las que pueden ob-
nes básicas de la célula, como la respiración o la
tenerse a partir de extractos crudos de plantas)
biosíntesis de aminoácidos. Todos los organis-
puede realizarse en primer lugar a partir de la
mos comparten básicamente los mismos tipos
separación de las moléculas que las compo-
de metabolitos primarios y en términos gene-
nen. Existen diversos métodos de separación
rales se puede decir que se trata de moléculas
con distintos grados de resolución y sensibili-
simples y de bajo peso molecular. En cambio,
dad. La cromatografía en fase gaseosa (GC)
los metabolitos secundarios son específicos de
ha sido extensamente usada justamente por
la especie y muchos de ellos están implicados
su alta resolución y sensibilidad. Consiste en la
en la defensa de la planta contra estrés biótico
separación de las moléculas por su capacidad
(siendo los terpenos los más abundantes), en
móvil en una fase gaseosa impulsada por un
procesos de desarrollo específicos de la espe-
gas usualmente inerte (por ejemplo Helio -He-)
cie (hormonas) y en estrategias de atracción
de modo de evitar reacciones con la matriz a
de polinizadores (pigmentos de las flores). En
analizar. Luego de su obtención y acondicio-
las plantas, se estima que el número total de
namiento, los extractos son inyectados en una
metabolitos supera los 200.000. El análisis del
cámara de vaporización a alta presión y tem-
metaboloma de un sistema biológico dado es
peratura, donde la muestra es volatilizada para
conocido como metabolómica. Este término no
luego ser transportada a una columna bajo un
siempre tiene el mismo significado, ya que la
flujo constante de gas. Existen diferentes pro-
metabolómica es multifuncional y depende del
tocolos en cuanto a las condiciones y tiempos
diseño experimental y del objeto de estudio. En

de corrida y se utilizan columnas diferentes pleja. Si bien se han desarrollado diferentes
en función del tipo de muestras y moléculas a métodos de derivatización, esta etapa consti-
analizar. Las moléculas se separan de acuerdo tuye la principal desventaja de la cromatogra-
a sus propiedades físicas y químicas y al final fía gaseosa dada la diversidad de propiedades
de la columna, un detector emite una señal que fisico-químicas de las miles de moléculas que
es registrada como una serie de picos los que componen un extracto crudo. La principal di-
constituyen el cromatograma. En la figura 1 se ficultad radica en la exacta identificación de
observa un cromatograma obtenido luego de los fragmentos obtenidos luego de la ioniza-
aproximadamente 40 minutos de corrida de ción de las distintas moléculas (ver siguiente
una muestra de extractos de frutos de tomate. sección: “Espectrometría de masas. Principios
El ápice de un pico dado representa el momen- básicos”).
to de mayor intensidad registrado y se lo co- En este sentido, la aplicación de la cromato-
noce como el tiempo de retención (RT) de ese grafía en fase líquida (LC) constituye un com-
grupo de moléculas. El RT es una propiedad de plemento importante a la gaseosa y contribu-
las moléculas que permite la identificación de ye a expandir el rango de aplicaciones de las
las mismas en el cromatograma. técnicas cromatográficas en metabolómica. Si
Sin embargo, dada la necesidad de volatili- bien la resolución de ésta es menor que la ga-
zar los extractos, es necesario un tratamiento seosa, permite la separación de compuestos
previo de los mismos a fin de transformar las de mayor peso molecular y polaridad sin la ne-
moléculas en compuestos menos polares y cesidad del paso de derivatización previamen-
más volátiles. Este paso, denominado deriva- te mencionado.
tización, consiste en la adición de grupos quí- No obstante los avances en el conocimiento
micos (tales como sililo -Si(CH3)3- y metoxi) a en cuanto a la separación e identificación de
las moléculas que componen la muestra com- compuestos orgánicos, la cromatografía no ha
Figura 1. Cromatograma obtenido luego de aproximadamente 40 minutos de corrida de un extracto crudo

de fruto de tomate. Sobre las abscisas se observan los tiempos de retención para grupo de moléculas en
una columna en fase gaseosa. Sobre las ordenadas se grafican las intensidades relativas de cada grupo
de moléculas separado. Bajo condiciones experimentales definidas estas intensidades son proporcionales
a la cantidad de la molécula en análisis presente en una muestra dada.

resuelto aún la exacta identificación de molé- produce luego una corriente gaseosa que con-
culas individuales presentes en una muestra duce a los iones obtenidos hacia los detectores
compleja. El empleo de sistemas de cromato- del espectrómetro. Durante esta corriente los
grafía acoplados a espectrometría de masas iones generados son separados de acuerdo
resulta de gran utilidad en la identificación de a su masa y carga que al impactar sobre los
moléculas que se encuentran en trazas en una detectores generan una señal eléctrica que es
muestra compleja con un grado de exactitud de registrada de acuerdo a su intensidad. La ma-
hasta 3-4 decimales. nera gráfica de representar estas señales es
lo que se conoce como espectro de masas de
Espectrometría de masas. Principios una molécula. En la figura 2 se observa un es-
básicos. pectro de masas del aminoácido fenilalanina.
La espectrometría de masas es un método
que permite la identificación de moléculas a Preparación de muestras. Extracción y
partir del patrón de fragmentos que se generan derivatización.
luego de la ionización de las mismas. A este pa- La obtención de muestras biológicas para el
trón se lo denomina espectro de masas y cons- análisis de sus perfiles metabólicos, como cual-
tituye la “huella digital” de una molécula dada. quier otra técnica que involucre la identificación
Esta es una de las funciones primarias de los y cuantificación de metabolitos, requiere la in-
espectrómetros de masas. Existen varias mé- mediata inactivación del metabolismo de modo
todos para la ionización de moléculas: ioniza- de evitar efectos de su manipulación sobre el
ción química (CI), por impacto de electrones mismo. La inhibición rápida del metabolismo se
(EI), bombardeo rápido de átomos (FAB), por logra mediante la disminución brusca de tem-
campo eléctrico (FI), por láser (LIMS), desor- peratura (≤ -60°C) por inmersión de las mues-
ción asistida por láser (MALDI) e ionización por tras en N2 líquido. A su vez, los procedimientos
electrospray (ESI). Este último método es uno posteriores de extracción requieren el uso de
de los más utilizados para la generación de los materiales (tales como tubos plásticos o de vi-
espectros de masas de moléculas orgánicas el drio) de alta calidad y pureza de modo de pre-
cual consiste en un impacto con electrones de venir fuentes de eventuales contaminaciones.
alta energía aplicado sobre una corriente de A su vez, dado que una de las aplicaciones
moléculas en fase líquida. Esto produce la ne- comunes de estas técnicas es la comparación
bulización y fragmentación de las moléculas y del estado metabólico de organismos frente a
mediante cambios rápidos de temperatura se perturbaciones ambientales (por ejemplo de
Figura 2. Espectro de masas del aminoácido fenilalanina. Sobre las abscisas se observan las relaciones
masa/carga (m/z) de los diferentes fragmentos obtenidos luego de la ionización de la molécula. Sobre las
ordenadas se grafican las intensidades relativas de cada fragmento obtenido. Bajo condiciones experi-
mentales definidas estas intensidades son proporcionales a la cantidad de la molécula en análisis presente
en una muestra dada. Fuente: adaptado de “The Golm Metabolome databases”.

plantas de cultivo en ambientes extremos) y/o como apolar, a los efectos de este ejemplo,
a cambios en la constitución genética de los los pasos siguientes se concentran en la ob-
mismos (por ejemplo de plantas transgénicas tención de la fase polar. Mediante un paso de
que expresen diferencialmente una proteína extracción con cloroformo-agua, las alícuotas
involucrada en señalización por azúcares) una de la fase polar son concentradas y liofilizadas
necesidad básica es las consideraciones de para su posterior derivatización.
controles tanto de los materiales “per se” como Tal como se mencionó previamente, la de-
de las condiciones en las que las muestras son rivatización consiste en la modificación de las
extraídas y procesadas. A su vez, la aplicación moléculas a fin de disminuir su polaridad y per-
de algoritmos estadísticos a los datos obteni- mitir la volatilización de las mismas. Existen va-
dos requiere la determinación del grado de varios métodos y reactivos derivatizantes. Entre
riación dentro de la población de muestras a los más usados para esta aplicación, el MSTFA
ser analizadas. (N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida) ha de-
A efectos explicativos, en este capítulo nos mostrado ser uno de los más reactivos en re-
concentraremos en un ejemplo de muestreo, emplazar los hidrógenos lábiles de un amplio
acondicionamiento y extracción de muestras rango de compuestos polares por grupos sililos
de hojas de plantas (de tomate, papa, tabaco o y el hidroxicloruro de metoxiamina es usado en
Arabidopsis) en condiciones ambientales con- un segundo paso de derivatización a fin de pro-
troladas (22-24°C, 250 µmol fotones.m-2.s-1 y teger grupos aldehídos y cetonas de las molé-
16 h de luz/8 h de oscuridad). El momento del culas presentes en la matriz.
día para el muestreo debe ser cuidadosamen- Los extractos así preparados son inmedia-
te controlado. Como regla general, la mitad tamente inyectados en el cromatógrafo aco-
del periodo de luz es el más indicado debido plado al espectrómetro de masas. Tanto las
a que numerosos reportes en la literatura dan condiciones de corrida (tiempo, rampa de
cuenta de los ritmos diurnos en los cambios en temperaturas, frecuencia de captura de datos,
la composición metabólica de plantas. El otro etc) como las especificaciones de flujo de gas
punto importante a tener en cuenta es el es- y columnas cromatográficas deben ser pues-
tado fenológico de las plantas y los órganos a tas a punto para cada aplicación particular. En
muestrear. La posición de las hojas en la planta este sentido, en los últimos años se dispone
y el área de las mismas también debe ser te- de programas de computación especialmente
nido en cuenta. Además, una vez que las por- diseñados por los fabricantes de espectróme-
ciones de hojas fueron cortadas de la planta, tros que controlan toda la operación y posterior
se debe registrar la masa exacta de la muestra procesamiento de datos. A su vez, la disponi-
y congelarlas inmediatamente. Las muestras bilidad de colecciones de espectros de masas
deben mantenerse a la temperatura indicada en bases de datos de acceso público (ver sitios
durante todo el proceso de extracción. Para recomendados) permite la rápida evaluación
ello es conveniente enfriar todos los instrumen- de los datos adquiridos.
tos necesarios para la toma de muestras, tales
como tijeras, pinzas, sacabocados, tubos, etc. Resonancia magnética nuclear. Principios
Para el ejemplo mencionado, la cantidad de te- básicos
jido necesario puede variar entre 100-150 mg La resonancia magnética nuclear es un mé-
(peso fresco). La muestra debe ser homoge- todo de análisis espectroscópico no destruc-
nizada en N2 líquido, las enzimas inactivadas tivo, que se basa en la absorción de energía
mediante el agregado de metanol y al mismo en la zona de radiofrecuencia por parte de los
tiempo deben agregarse estándares internos núcleos de algunos átomos, en presencia de
(en concentraciones conocidas) no presentes un campo magnético. La MS es la técnica más
en la muestra a analizar. La extracción se reali- utilizada en metabolómica. Sin embargo, la
za luego calentando la muestra a 70°C con agi- técnica de RMN está ganando terreno en este
tación constante. Si bien este protocolo puede sector, como una técnica que brinda informa-
aplicarse a la obtención tanto de la fase polar ción complementaria, ya que amplía el rango

de metabolitos detectados y provee informa- estos niveles, que es el fenómeno de Resonancia
ción estructural detallada de las moléculas (figura 3).
presentes. Más aún, la RMN permite identificar La frecuencia de absorción 0 depende del cam-
sustancias previamente no halladas en mues- po aplicado (B0), el cual está fijo para cada equipo,
tras similares. y la constante giromagnética nuclear (γ) que es ca-
La RMN explota una propiedad de los núcleos racterística de cada núcleo (figura 3). Es decir que
atómicos, el spin nuclear. El spin nuclear posee cada núcleo tendrá una frecuencia de absorción
un momento magnético, es decir que se compor- característica. Es importante tener en cuenta que,
ta como un pequeño imán. Normalmente, estos como se trata de una propiedad del núcleo atómi-
momentos magnéticos están orientados al azar y co, dado un elemento químico, los distintos isóto-
tienen la misma energía (figura 3). Si se aplica un pos del mismo presentarán distintas propiedades
campo magnético fijo (B0) con una dada dirección, magnéticas. Algunos isótopos (dependiendo de su
estos momentos magnéticos quedarán alineados composición) pueden carecer de spin, y por lo tan-
a favor o en contra del campo magnético externo to no serán activos en RMN y este es el caso de
(figura 3). Según su orientación con respecto al 12
C, 16O y 32S. Por simplicidad, en este capítulo se
campo Bo, los núcleos tendrán ahora distinta ener- considerarán sólo los núcleos con spin ½, que son
gía. La diferencia de energía (ΔE) entre estos dos los de interés biológico. Dentro de los núcleos de
niveles está en el orden de las ondas de radio, es spin ½ se encuentran los núcleos de 1H, 13C, 15N y
decir con frecuencias de MHz. Si ahora aplicamos 31
P, que pueden ser estudiados por RMN. Cada nú-
al sistema orientado la frecuencia correspondien- cleo posee una sensibilidad determinada, que está
te a esa ΔE (0), se inducirá una transición entre determinada por su constante giromagnética. El or-
Figura 3. Esquema en donde se muestra los niveles de energía de los núcleos en presencia o ausencia de
un campo magnético externo (B0) y las transiciones de los núcleos entre un nivel de energía y otro superior
al absorber una frecuencia (υ0) correspondiente a la diferencia de energía (∆E).

den de sensibilidad de estos núcleos es: 1H > 31P > como es el fosfato inorgánico, nucleósidos tri-
13
C > 15N. La detección de 1H o 31P, además de su fosfatos, fosfomonoésteres, etc.
alta sensibilidad, está favorecida por la alta abun-
dancia natural de estos isótopos (99,9% y 100%, Desplazamiento químico
respectivamente). En cambio, los isótopos de 13C La frecuencia de absorción de cada núcleo
y 15N poseen una abundancia de 1,1% y 0,4%, lo depende de su constante giromagnética γ a un
cual dificulta más aún su detección. Este inconve- campo dado. Por ejemplo, a un campo de 9,4 T,
niente se puede sortear enriqueciendo la muestra los 1H absorben a 400 MHz, los 13C a 100,6 MHz
con el isótopo activo de interés. Cabe destacar que y los 15N a 40 MHz. Sin embargo, no todos los
ninguno de estos isótopos es radioactivo, lo que fa- 1
H ni todos los 13C absorben a la misma frecuen-
cilita la manipulación de las muestras. cia. La frecuencia de absorción de cada protón
Todos los elementos con isótopos magnéticos depende de la ubicación del núcleo en las molé-
detectables por la técnica RMN pueden ser usados culas, es decir, de su ambiente químico. Las dis-
para identificar metabolitos en tejidos de plantas y tintas posiciones de los núcleos en un espectro
sus extractos. El 1H es el isótopo magnético más se cuantifican con un parámetro llamado despla-
utilizado debido a su alta sensibilidad intrínseca zamiento químico (, cuyo valor no sólo informa
y su abundancia natural. La concentración límite la frecuencia precisa de absorción, sino que nos
para poder detectar un metabolito por RMN de 1H permite distinguir el tipo de protón (por ejemplo
en un extracto es alrededor de 10 µM. Para una alifático, aromático, amídico, etc.). La intensidad
muestra dada, la sensibilidad aumenta con el cam- de una señal de resonancia, o sea el área bajo
po magnético del instrumento utilizado. cada pico, es proporcional al número de núcleos
Los metabolitos fosforilados pueden ser iden- de ese tipo (figura 4).
tificados y cuantificados por RMN utilizando el
isótopo magnético 31P. De esta manera se pue- Espectrómetro de RMN
den estudiar un número pequeño de moléculas Cada equipo de RMN trabaja a un cam-
abundantes y de gran importancia metabólica po magnético fijo. En general es conveniente
Figura 4. Dependencia ubicación del núcleo en las moléculas y su frecuencia de absorción.

trabajar con un campo magnético alto porque volumen de extracto utilizado es dependiente
esto trae aparejado una mayor sensibilidad y del ensayo pero varía entre 250 y 400 μl.
resolución. Cada equipo se suele denominar
no por la magnitud del campo (por ejemplo, 16 Utilización de la técnica RMN en
Tesla), sino por la frecuencia de absorción del metabolómica
1
H a ese campo (para el caso mencionado, 600 1-Identificación y cuantificación de me-
MHz). La mayoría de los análisis metabólicos tabolitos en tejidos vegetales: ventajas y
se realizan con instrumentos que operan en el desventajas
rango de 300 a 900 MHz para 1H. Existen diversas ventajas de la técnica de
El campo magnético está generado por RMN para el análisis de perfiles metabólicos.
Helio líquido a bajas temperaturas (4 K), que Las mayores ventajas con respecto a otras téc-
es superconductor, y se encuentra en un termo nicas son: (1) no se requiere tratamiento pre-
que rodea la muestra, que constituye el imán vio de la muestras (pudiéndose utilizar extrac-
o magneto. Los pulsos de excitación de radio- tos crudos); (2) es un método no destructivo,
frecuencia se generan mediante bobinas que lo cual permite el análisis subsiguiente de la
están alrededor del tubo donde se encuentra la muestra con otros métodos; (3) se puede ob-
muestra, complementadas con un conjunto de tener información sobre una amplia variedad
bobinas que permiten la detección de la señal de metabolitos en un único experimento; (4) no
resultante. existen restricciones en cuanto a la volatilidad,
polaridad de los compuestos, o la presencia
Preparación de las muestras de determinados cromóforos que interfieran; y
Se pueden obtener espectros de RMN a (5) la técnica puede ser aplicada con escaso
partir de una amplia variedad de materiales: conocimiento previo de la composición de la
extractos vegetales (por ejemplo: jugo de to- muestra.
mate), suspensiones celulares e inclusive plán- Otra gran ventaja de ésta técnica para el
tulas intactas. análisis cualitativo de metabolitos es que no
En el caso de realizar RMN de 1H, es con- requiere del conocimiento de ningún paráme-
veniente liofilizar las muestras para eliminar el tro equivalente a los coeficientes de extinción
agua. Esto se realiza con el fin de reducir la necesarios para cuantificar muestras mediante
señal correspondiente al solvente, que (por su técnicas espectrofotométricas. Esto se debe a
alta intensidad) dificulta la detección de seña- que la magnitud de la señal de resonancia de
les de los metabolitos. Luego se resuspende un isótopo es directamente proporcional al nú-
la muestra liofilizada en agua deuterada (D2O). mero de núcleos que contribuyen a dicha se-
La adición de D2O a la muestra hará que no se ñal. Lo anterior implica que, por una parte, no
puedan detectar las señales de protones inter- se requieren curvas de calibración para efec-
cambiables con el solvente, como los de grupos tuar el análisis cuantitativo, y por otro lado no
amida o alcohol. En caso de que sea necesario es necesario conocer el espectro de un com-
poder identificar los mismos, deben realizar- puesto puro ya que por lo general basta con
se experimentos que permitan la eliminación identificar señales debidas a una porción dada
selectiva de la señal del solvente. En caso de de la molécula para obtener la información de-
que se deseen extraer algunos componentes seada. La información cuantitativa se obtiene a
específicos, también pueden utilizarse solven- partir del área integrada bajo la curva.
tes orgánicos, de preferencia deuterados (que
se venden comercialmente). Conviene utilizar Ejemplo 1: caracterización de extractos
solventes químicamente inertes y volátiles, lo de frutos de tomate
que permite eliminar el solvente en caso de La Figura 5A muestra un espectro de RMN
que la muestra deba ser analizada por otra téc- de 1H en una muestra de jugo de tomate. En
nica. Esto es posible debido a que la técnica la región de campo alto (3,1-0,3 ppm) del es-
de RMN es no destructiva. Las muestras se co- pectro de protones contiene la resonancia de
locan en tubos de vidrio borosilicato puro y el los grupos alifáticos de los aminoácidos y áci-

dos orgánicos pertenecientes al metabolismo RMN. A fin de minimizar esto se puede combi-
de los ácidos tricarboxílicos. En particular, las nar esta técnica con una de separación croma-
señales provenientes de treonina, alanina, glu- tográfica, de manera que el extracto se fraccio-
tamato, glutamina, GABA, aspartato, citrato y ne, disminuyendo la complejidad de la mues-
malato fueron identificadas claramente. Las re- tra y por ende del espectro de RMN. Esto es
sonancias encontradas en la región del espec- análogo a lo que se realiza cuando se acopla
tro de campo intermedio (desde 3,2 a 5,3 ppm) la cromatografía gaseosa a un espectrómetro
corresponden en su mayoría a sacáridos, de de masa. La segunda opción para incrementar
los cuales D-glucosa y D-fructosa son los com- la resolución espectral es adquirir espectros bi-
ponentes principales. En la región de campo dimensionales, distribuyendo las señales a lo
bajo (5,5-9,4 ppm) del espectro se encuentran largo de dos ejes de frecuencia. Estos méto-
las señales correspondientes a aminoácidos dos bidimensionales pueden además utilizarse
aromáticos y compuestos fenólicos. Debido a para incrementar la sensibilidad de isótopos
la baja intensidad de la señal, las asignaciones menos abundantes como 13C, y establecen co-
se realizaron parcialmente. Estos resultados nexiones entre las señales de 1H y 13C lo cual
muestran que la técnica RMN puede ser una es útil para la identificación de los metabolitos.
herramienta útil para ser usada en la caracteri-
zación de tomates.
La principal desventaja de la técnica de RMN
es su baja sensibilidad. El advenimiento de ins-
trumentos de RMN de alto campo, de técnicas
especiales de detección y el diseño de crioson-
das (de mucha mayor sensibilidad) ha mejora-
do este aspecto. De todas formas, rara vez se
usa RMN para el análisis de un componente
que se encuentra en trazas. Generalmente, el
problema de la baja relación señal-a-ruido en
los espectros de RMN (que sucede principal-
mente con isótopos poco abundantes) puede
ser superado haciendo varios espectros de
manera automática, y sumándolos. Esto re-
dunda en mayor tiempo de adquisición del ex-
perimento. Sin embargo, si se tiene en cuenta
que cada experimento permite seguir muchos
metabolitos a la vez, este aspecto negativo se
ve compensado.
La técnica de RMN aplicada a heteronúcleos
(tales como 13C, 15N o 31P) es útil debido al he-
cho de que estos núcleos presentan una gran
dispersión en sus señales, dado que el rango
de desplazamientos químicos de los mismos
es mayor que el de 1H. En el caso particular de
13
C o 15N, como ya se mencionó, los núcleos
son menos sensibles y abundantes, por lo cual
es conveniente realizar una marca isotópica.
Generalmente, se utiliza la estrategia de mar-
cado isotópico selectivo (no uniforme) para el
análisis de flujos metabólicos, más que para Figura 5. Perfil metabólico correspondiente a una
realizar perfiles metabólicos. muestra de jugo de tomate (A) espectro de 1H RMN
Otra de las desventajas de la técnica es el en una dimensión y (B) en dos dimensiones (COSY)
solapamiento de las señales obtenidas en 1H de la zona de azúcares y alifáticos

La gran cantidad de información que se puede plantas que posean específicamente algu-
de extraer de estos espectros bidimensiona- na ruta metabólica alterada. Un ejemplo de
les compensa el hecho del mayor tiempo que esto es el análisis de plantas de tabaco que
lleva realizarlos. Estos experimentos explotan producen constitutivamente el ácido salicílico,
las interacciones entre los distintos isótopos las cuales son más resistentes a infecciones.
detectables por RMN en una molécula y re- Los perfiles metabólicos que se obtuvieron por
sultan en lo que se denomina correlación ho- RMN mostraron que las plantas transgénicas
monuclear, donde los dos ejes de frecuencia tenían alterados los niveles de distintos com-
corresponden al mismo núcleo, por lo general puestos como flavonoides, azúcares, aminoá-
1
H, o correlación heteronuclear en donde uno cidos, etc. Este ejemplo muestra claramente
de los ejes de frecuencia corresponde al 1H y la potencialidad de utilizar la técnica de RMN
el otro a 13C, 15N y menos frecuentemente 31P. para estudiar cambios metabólicos.
Los experimentos de correlación homonuclear
son particularmente útiles para realizar perfiles 2-Mapas de distribución espacial de me-
metabólicos, permitiendo que subgrupos de pi- tabolitos en tejidos vegetales
cos que se encuentran juntos en el espectro La técnica 1H RMN puede ser utilizada in vivo
de una dimensión puedan ser identificados y para obtener información acerca de la distribu-
asignados a compuestos particulares. La co- ción espacial de un número limitado de meta-
rrelación heteronuclear también es útil cuando bolitos. Este método se utiliza generalmente
los extractos derivan de tejidos que han sido para el H2O ya que es la señal más fuerte de-
marcados con 13C o 15N. tectada in vivo. Las imágenes brindan informa-
Con el objeto de realizar una asignación ción acerca de la anatomía del tejido y el movi-
completa de las señales resonantes a com- miento del H2O dentro del mismo. También se
puestos específicos presentes en el jugo de puede obtener información acerca de la distri-
tomate, se realizaron diversos experimentos bución espacial de ciertos metabolitos menos
de RMN bidimensionales. La Figura 5B corres- abundantes que el H2O como ser aminoácidos
ponde a un COSY de la zona de azúcares y y carbohidratos. Debido a que es una técnica
alifáticos. Usando la información de conectivi- no destructiva y no invasiva, se pueden moni-
dad y aprovechando la mayor separación de torear cambios temporales en ciertos metabo-
las señales en la dimensión adicional, muchas litos. Es posible a partir de la misma muestra
de las señales fueron asignadas sin ambigüe- grabar una serie de espectros in vivo y luego
dad. En los casos en donde la asignación fue analizar en el tiempo cómo es la respuesta me-
dudosa, se adicionaron los compuestos puros tabólica frente a cambios en el estado fisiológi-
al extracto para corroborar así la identidad del co del tejido vegetal.
metabolito analizado. Se utilizaron las tablas
de desplazamientos químicos existentes en la RMN versus MS
literatura como guía para asignar correctamen- La espectrometría de masa acoplada a cro-
te las señales. matografía gaseosa (GC-MS) es la técnica
más utilizada en metabolómica. Sin embargo,
Ejemplo 2: caracterización de plantas la técnica de RMN está siendo utilizada como
transgénicas una técnica que brinda información comple-
El desarrollo de técnicas para la generación mentaria a la que se obtiene con GC-MS.
de plantas transgénicas ha revolucionado el La sensibilidad es tal vez el requisito más im-
área de la biología de plantas. Estas plantas portante que debe cumplir una técnica analítica
transgénicas pueden tener perturbaciones en para ser utilizada en metabolómica, ya que una
las rutas metabólicas debido a la introducción alta sensibilidad favorece el análisis rápido de
del transgen en el genoma de la planta. La téc- una fracción mayor del metaboloma. La técnica
nica de RMN permite tener un pantallazo ge- 1
H RMN , que tiene un límite de detección de
neral del estado metabólico de las plantas lo 5 nmoles, es varios órdenes de magnitud me-
cual es de suma utilidad para generar líneas nos sensible que la técnica GC-MS, cuyo límite

de detección es de 10-12 mol. Esta diferencia Resumiendo, una comparación entre RMN
se incrementa aún más si se tiene en cuenta y GC-MS muestra que esta última técnica es
la técnica de RMN con otros isótopos menos más sensible aunque el procesamiento de las
abundantes. muestras es más laborioso y la eficiencia de
Se estima que con la técnica de GC-MS se extracción y derivatización no sería homoge-
puede identificar menos del 5 % de los metabo- nea para todos los metabolitos. Por otro lado,
litos de una célula vegetal si bien todo el meta- la facilidad con la que se generan los espec-
boloma es potencialmente detectable. Este ar- tros y se cuantifican los metabolitos y la infor-
gumento ignora cualquier diferencia que pudie- mación complementaria (como ser estructural)
se existir en la eficiencia de extracción y deri- que suministra hacen de la técnica RMN una
vatización de metabolitos cuyas características herramienta de gran utilidad para los estudios
son muy diversas. Otro obstáculo que impide metabolómicos.
un análisis completo tanto en RMN como en
GC-MS es la dificultad de detectar componen- Lectura y sitios recomendados
tes minoritarios en presencia de señales más
intensas. Fiehn O. Metabolomics – the link between geno-
Existen otros factores que influyen en la types and phenotypes. Plant Molecular Biology
elección de una técnica o la otra. Uno de ellos 48:155-171
es el procesamiento de las muestras. Como se Köckenberger W. Nuclear magnetic resonance mi-
cro-imaging in the investigation of plant cell me-
ejemplifico mas arriba, en el caso de GC-MS,
tabolism. Journal of Experimental Botany. 2001,
es necesario realizar una extracción con sol- 52(356): 641-656.
ventes y además derivatizar los compuestos Krishnan P, Kruger NJ y Ratcliffe RG. Metabolite
por lo que la preparación de las muestras es fingerprinting and profiling in plants using NMR.
más laboriosa y además es más probable que Journal of Experimental Botany. 2005, 56(410):
en la muestra no estén representados todos 255-265.
los metabolitos que existen en el tejido de par- Lisec J, Schauer N, Kopka J, Willmitzer L y Fernie
tida. Este no sería el caso de las muestras que AR. Gas chromatography mass spectrometry–
son analizadas por RMN, en donde se pueden based metabolite profiling in plants. Nature pro-
obtener espectros a partir de una amplia va- tocol. 2006, 1(1): 387-396.
Ratcliffe RG y Hill YS. Probing plant metabolism
riedad de materiales sin necesidad de realizar
with NMR. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol
extracciones con solventes. Biol. 2001, 52: 499-526.
La técnica de RMN tiene una ventaja para el Silverstein RM y Webster FX. Proton magnetic reso-
análisis cuantitativo y es el hecho de que los nance spectrometry. En: Spectrometric identifi-
espectrómetros modernos son muy estables cation of organics compounds, 1998, 6° edición,
en comparación con los GC-MS en donde es Wiley & Sons.
necesario realizar calibraciones frecuentes y la Sobolev AP, Segre A, Lamanna R. Proton high-field
variabilidad en los tiempos de retención pue- NMR study of tomato juice. Magnetic Resonance
den complicar significativamente el análisis in Chemistry, 2003, 41: 237-245.
cuantitativo. Ambas técnicas generan usual- Verpoorte R, Choi YH, Kim HK. NMR-based metab-
olomics at work in phytochemistry. Phytochem
mente múltiples señales lo cual es una ventaja
Rev. 2007, 6:3–14.
para la identificación de metabolitos, pero a la Weckwerth W. Metabolomics. Methods and Proto-
vez representa una desventaja en términos de cols. Methods in Molecular Biology Series 358.
complejidad espectral. Sin embargo, en MS, Humana Press 2007.
algunas de estas multiplicidades se deben al www.metabolomicssociety.org (Sociedad de Meta-
fraccionamiento de la molécula ionizada, com- bolómica).
plicando el análisis cuantitativo. En cambio, w w w. s p r i n g e r o n l i n e . c o m / s g w / c d a / f r o n t p a -
para el caso de RMN, las señales múltiples ge/0,11855,5-40109-70-34409863-0,00.html (Si-
provienen de la misma molécula, lo cual per- tio web de la revista científica Metabolomics, re-
mite una verificación cruzada de los datos de vista oficial de la la Sociedad de Metabolómica).
www.metabolomics-nrp.org.uk (Norwich Research
cuantificación de los metabolitos.
Park – Metabolomics and plants).

www.metabolomics.bbsrc.ac.uk (Rothamsted: The www.metalign.nl (Software para pretratamiento
National Centre for Plant and Microbial Metabo- suavizado, estimación del ruido, corrección de la
lomics). línea base, alineamiento, etc de datos de GC y
http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd. LC)
html (Max Planck Institute of Molecular Plant http://metacyc.org (La base de datos MetaCyc in-
Physiology / The Golm Metabolome databases cluye información sobre las rutas metabólicas,
consortium). sustratos, reacciones, enzimas, etc de más de
www.noble.org (Noble Foundation / Plant Biology / 150 organismos diferentes).
The Sumner group).
www.infometrix.com (Diversos paquetes informá-
ticos para alineamiento de datos cromatográfi-
cos y espectroscópicos y análisis multivariados:
PCA, SIMCA, etc).

I CAPÍTULO 11 suelos y agua, mejoramiento de la producción
agrícola, producción de biocombustibles, fer-
mentar alimentos para el hombre, etc.
Metagenómica Alrededor de la década de 1950, los micro-
biólogos disfrutaban la percepción de haber lo-
O. Mario Aguilar1 y Daniel H. Grasso2 grado un conocimiento satisfactorio de los mi-
croorganismos del suelo. Así, en el año 1931 el
Introducción microbiólogo Waksman, quien contribuyó signi-
Encaramos este capítulo reconociendo el ficativamente al conocimiento de microorganis-
protagonismo de los microorganismos en la
mos del suelo productores de antibióticos, con-
vida de nuestro planeta, desde su origen más
cluía “… disponemos de una buena informa-
remoto. Tenemos el caso de nuestra atmós-
ción que nos da un panorama claro del mundo
fera rica en oxígeno resultante de la activi-
microscópico del suelo…”. Sin embargo, otros
dad fotosintética de los primeros organismos
investigadores con iniciativas aisladas y dis-
microbianos, y aún hoy los microorganismos
persas, persistían en su afán por demostrar la
aportan la mayor capacidad fotosintética del
existencia de otras poblaciones microbianas
planeta. Cada proceso en la biósfera hace uso
ignoradas, recogiendo evidencias experimen-
de la casi ilimitada potencialidad de los micro-
tales que cuestionaban esa aparente tranqui-
organismos para transformar el medio que los
lidad científica. En 1985, Staley y Konopka a
rodea. El resto de los organismos vivos de-
partir de la revisión de los datos relacionados a
pendemos en gran parte de ellos gracias a su
capacidad de transformar compuestos en nula capacidad de cultivo de microorganismos de
trientes asimilables, accesibles y requeridos muestras ambientales, concluyen en la llama-
para nuestra forma de vida. En este sentido da “gran anomalía del conteo en placa”. Esta
mencionemos los siguientes ejemplos: La ca- anomalía es la discrepancia entre los valores
pacidad de transformar el nitrógeno molecular de recuento de células obtenidos mediante mi-
atmosférico en una forma asimilable por las croscopía y los valores de recuentos en placa.
diferentes formas de vida se encuentra restrin- La conclusión latente, de un conocimiento limi-
gida a los microorganismos. Miles de millones tado de los microorganismos del suelo, restrin-
de microbios benignos que habitan el intestino gida esencialmente a aquellos que los micro-
nos ayudan a digerir los alimentos, degradar biólogos habían sido capaces de cultivar in vi-
potenciales toxinas y combatir otros microorga- tro en sus laboratorios, ha sido tanto abundante
nismos patógenos. También, nos beneficiamos como sólidamente documentada durante la úl-
de aquellos microorganismos que son capaces tima década. El concepto de organismo viable
de mantener el medio ambiente libre de conta- pero no cultivable se hizo evidente con Vibrio
minantes y xenobióticos. cholerae, el cual es viable y virulento cuando se
La capacidad de adaptación de los procario- aísla de un medio acuático pero crece en culti-
tas, que les permite prosperar y poblar cada vo hasta después de su pasaje por el intestino
ambiente, aún aquellos de condiciones extre- humano o de ratón. Este tipo de evidencias co-
mas tales como los respiraderos hidroterma- menzaron a redirigir la atención hacia el mundo
les del fondo del océano y los drenajes ácidos de los organismos no cultivables, entre las cua-
de las minas y efluentes industriales, es con- les destacamos dos descubrimientos que han
secuencia de su gran diversidad metabólica tenido una gran relevancia en esta área. En el
y fisiológica. Además de su importancia debi- primero de ellos se describió mediante curvas
do a su rol esencial en la biósfera, los micro- de reasociación DNA-DNA la diversidad de las
organismos han sido objeto del desarrollo de bacterias del suelo, encontrándose que era al
numerosas tecnologías que han contribuido a menos 100 veces mayor que la que puede ser
mejorar la calidad de vida. Son empleados in- estimada mediante técnicas dependientes de
dustrialmente para producir la mayoría de los cultivo. El segundo descubrimiento fue la de-
antibióticos y muchas otras drogas de uso clíni- mostración de Helicobacter pylori como agente
co, también como agentes de remediación de etiológico de úlceras y cáncer gástrico. Pese a

que hace más de un siglo que esta bacteria ha término metagenómica al análisis del genoma
sido observada en la mucosa gástrica, hasta de comunidades independientemente de las
que no fue cultivada no se aceptó su rol en la tareas de aislamiento y cultivación. El conjunto
enfermedad. de métodos desarrollados para acceder al co-
La ecología microbiana ha experimenta- nocimiento fisiológico y genético de comunida-
do una gran transformación en los últimos 25 des, comprende la extracción directa de ADN
años debido a la introducción de la filogené- de muestras ambientales, clonado de fragmen-
tica, revolucionando la forma de ver a los mitos de ADN en general o resultante de la am-
croorganismos. El primer hito fue el trabajo de plificación de secuencias del gen 16S rRNA o
Carl Woese quien propuso a los genes rARN genes asociados a funciones tales como meta-
como cronómetros evolutivos (Woese, 1987). bolismo nitrogenado, antibiosis, etc. (Figura 1).
Posteriormente, Pace y colaboradores utiliza- El avance y los logros ya alcanzadas por la
ron el análisis de las secuencias de 5S y 16S metagenómica están asociados al desarrollo
rARN para describir la diversidad de los micro- de capacidades técnicas de secuenciación de
organismos (cultivables y no cultivables) pre-
sentes en muestras ambientales (Pace, 1997).
Estos primeros trabajos se realizaron secuen-
ciando directamente el ARN o sus respectivas
copias de cADN. El desarrollo de la tecnolo-
gía de PCR y el diseño de los cebadores que
permiten amplificar el gen completo, permitió
un acceso mayor a este procedimiento por una
comunidad científica más amplia y a una mayor
diversidad de nichos ecológicos. La aplicación
de la amplificación por PCR de los genes 16S
rARN a partir del ADN total de una comunidad,
seguido del clonado y secuenciación, ha gene-
rado una gran cantidad de datos y ha redefinido
la diversidad procariota. Si la muestra ambien-
tal contiene varios tipos diferentes de organis-
mos, se espera entonces encontrar diferentes
secuencias de rARN, cuya diversidad será una
medida de la complejidad de la comunidad y
en el contexto de un árbol filogenético nos dirá
quienes son sus miembros. Se ha empleado
para caracterizar el perfil poblacional de diver-
sos ambientes naturales. Así, mediante este
tipo de análisis se ha demostrado que el suelo
es el hábitat de la Tierra más rico en diversidad
procariota, aún cuando los métodos basados
en el cultivo in vitro no ponen de manifiesto esa
alta diversidad.
El advenimiento de nuevas tecnologías y
procedimientos de análisis de muestras am-
bientales, metodologías independientes del
cultivo de los microorganismos, con potencia-
lidades distintas para revelar componentes de Figura 1. Bibliotecas metagenómicas. Esquema del
la comunidad microbiana, impulsó un nuevo proceso de obtención y análisis de bibliotecas cons-
enfoque de estudio ampliando los horizontes truidas con ADN extraído directamente de muestras
del conocimiento. Se ha denominado con el ambientales.

ADN con alta eficiencia de generación de datos de humedad, pasando desde una saturación
primarios y a la bioinformática que ha desarro- por persistentes lluvias o defectos de drenaje
llado herramientas útiles para el procesamien- hasta períodos de aridez. Esto sugiere que la
to y análisis de datos. composición de la comunidad microbiana ex-
Los microbiólogos encontraron la oportuni- perimenta ajustes periódicos en respuesta a
dad para dirigir sus esfuerzos a una descrip- esos cambios ambientales, aunque se ignora
ción amplia de la diversidad filogenética de am- la manera cuali y cuantitativa del impacto de
bientes comunes y exóticos tales como aguas esos efectores.
oceánicas de superficie y profundidad, rumen El suelo es un reservorio muy importante de
de animales, superficie de redes y cañerías de carbono, y son los microorganismos quienes
agua, aguas termales surgentes y suelo. Más desempeñan roles protagónicos en el reciclado
allá de permitirles realizar una descripción de del carbono. Asimismo, funciones importantes
la comunidad microbiana, con un nivel de reso- tales como la captación del nitrógeno molecu-
lución taxonómico preciso, promovió la acep- lar, la movilización de fósforo inorgánico, y la
tación y difusión del concepto ecológico de formación de nitratos residen en actividades
consorcio microbiano para lo cual el estudio de microbianas, los cuales impactan en la fertili-
microorganismos aislados y cultivados in vitro dad de los suelos (Daniel, 2005).
resulta insuficiente para explicar la funcionali- Teniendo en cuenta la complejidad fisico-
dad y dinámica poblacional. química del suelo y la diversidad de funciones
Mirar más allá de los microorganismos que que transcurren en el mismo, es posible ima-
se pueden aislar, alcanzando al metagonoma ginar al suelo como un cuerpo orgánico con
permitirá responder no sólo la pegunta cuáles capacidades metabólicas asociadas a pobla-
son los componentes de una determinada co- ciones microbianas diversas, que su vez se
munidad sino aún más importante qué hacen complementan entre sí en forma semejante a
o serían capaces de hacer. lo encontrado entre los órganos de un cuer-
En el desarrollo de este capítulo se describi- po. Coincidentemente con este paralelismo,
rán las potencialidades de la metagenómica en se ha renovado el enfoque del estudio de los
general, haciendo énfasis en el suelo. genomas dirigido a la consideración global de
las interacciones mutuas y la coordinación de
El suelo: Un hábitat complejo la complejidad del sistema, que se lo conoce
El suelo constituye un soporte para la vida como biología de sistemas (“system biology”).
formado por partículas minerales de diferen- Actualmente, el estudio del tamaño y la diver-
tes formas, tamaños y composición química, sidad de las comunidades del suelo, es un de-
compuestos orgánicos en distintas etapas de safío para los microbiólogos de suelo, que se
degradación, e inmersos en este medio encon- proyecta en aspectos aplicados tales como la
tramos a la biota. A nivel macroscópico se de- fertilidad de los suelos y su sustentabilidad.
tectan complejos de arcilla, materia orgánica, Se ha estimado que un gramo de suelo con-
partículas de arena, todo en su conjunto for- tiene aproximadamente 4 x 107 células pro-
mando agregados que constituyen una matriz. cariotas. El estudio de esta diversidad puede
Los procariotes son los componentes predomi- encararse aplicando métodos de cultivo directo
nantes de la biomasa del suelo, los cuales se o métodos moleculares de metagenómica. Los
encuentran adheridos o adsorbidos a las partí- métodos tradicionales de aislamiento y cultivos
culas del suelo. Dada la heterogeneidad de la en medios nutritivos y condiciones de labora-
matriz del suelo, los microorganismos pueden torio son apropiados pero insuficientes. Se ha
constituir micro-ambientes sobre la superficie estimado que solamente entre 0.1% y 1.0% de
y en los poros que se forman. La persistencia las bacterias de suelo son cultivables, lo cual
y el metabolismo de los microorganismos del remarca la magnitud de la comunidad aún no
suelo dependen de la disponibilidad de agua examinada. Estos números dan una idea de la
y nutrientes. El suelo es un ambiente que ex- magnitud de la complejidad, y del tamaño de
perimenta cambios drásticos en sus niveles la “caja negra” que representa descubrir los

elementos de esa biodiversidad presentes en el protocolo de extracción aplicado y la natura-
una “pizca” de suelo. Es importante tener en leza del suelo. Por otro lado y aplicando un pro-
cuenta que la metagenómica es aplicable no cedimiento basado en cinética de reasociación
sólo a examinar la diversidad microbiana de un de ADN, se ha estimado que 1 gramo de suelo
ambiente natural con el objetivo último de lo- comprendería entre 2.000 y 18.000 genomas.
grar el ensamble de genomas a partir de datos - Según el vector usado para el clonado del
fragmentados (“meta análisis”), sino también ADN metagenómico de suelo, se estima reco-
revelar un espectro amplio de productos géni- mendable examinar más de 10 7 clones plas-
cos con potencialidades biotecnológicas. mídicos o 106 clones BACs , con insertos de
un tamaño de 5 kb y 100 kb, respectivamente.
Métodos de análisis Para lograr representación significativa de los
El análisis metagenómico implica el aisla- genomas de miembros raros de la comunidad
miento del ADN de la muestra, clonado de frag- (menos del 1%) se ha calculado necesario se-
mentos de ADN usando vectores plasmídicos cuenciar 10.000 Gb del ADN extraído de suelo.
y transformación en alguna cepa apropiada de Por otro lado, se ha estimado en 1013 genes en
la bacteria E. coli (Figura 1). Aparentemente, un gramo de suelo provinentes de al menos 103
el procedimiento es experimentalmente muy especies, lo que indicaría que hay al menos 106
directo sin embargo el metagenoma compren- genes nuevos en 1 gramo de suelo (Schloss y
de a numerosos genomas individuales que Handelsman, 2006). El objetivo de establecer
contribuyen, con distintos grados de represen- el metagenoma teniendo en cuenta estos nú-
tatividad, al tamaño y la complejidad del mis- meros adquiere un valor relativo cuando se los
mo. Esto impacta en el tamaño de la muestra pone en el contexto de los recursos tecnológi-
a examinar. cos y financieros necesarios para su abordaje.
La etapa siguiente al clonado molecular Actualmente, con el desarrollo de tecnologías
constituye la oportunidad de aplicar estrategias de secuenciación de alta generación de da-
alternativas y en general exigen la creatividad tos, basadas en el denominado procedimien-
del investigador a los efectos de maximizar las to de pirosecuenciación que no requiere de la
posibilidades de alcanzar resultados deseables construcción de bibliotecas metagenómicas,
e interesantes. En términos generales, los pro- el tiempo requerido para la resolución de un
cedimientos de análisis de clones interesantes metagenoma adquiere una dimensión real. Sin
se pueden agrupar en aquellos basados en se- embargo, la limitación de estos procedimientos
cuenciación masiva de ADN y en aquellos otros consistente en generar lecturas relativamen-
basados en la expresión heteróloga de funcio- te cortas –aproximadamente entre 100 y 200
nes buscadas. Adoptaremos en este texto el nucleótidos- complica la tarea posterior de en-
anglicismo screening para referirnos a la etapa samble de secuencias parciales en un genoma
experimental de análisis de clones e identifica- completo.
ción de genes y secuencias de interés. No obstante, y aún haciendo uso de la tecno-
Para lograr una idea de la envergadura de la logía precedente basada en el procedimiento
tarea de screening hagamos la siguiente refe- de Sanger, el costo de secuenciación masi-
rencia a algunas estimaciones numéricas so- va es caro en general, y más aún para nues-
bre el tamaño del ADN metagenómico. tro país. Sin embargo, y como se trata en las
- Es muy probable que el número de geno- secciones siguientes de este capítulo, existen
mas distintos presentes en el suelo refleje el estrategias alternativas a la secuenciación de
tipo y características del mismo; aquellos de- bibliotecas metagenómicas, que “asisten” la
dicados a la agricultura con un buen nivel de búsqueda y resultan útiles para revelar diversi-
materia orgánica y humedad presentarán una dad y descubrir nuevos genes.
diversidad más amplia que un suelo oligotrópi-
co y características extremas de pH, humedad Screening basado en el análisis del gen
y/o salinidad. A partir de 1 gramo de suelo se 16S rARN
puede obtener entre 1-500 ug de ADN, según Este método está basado en el análisis de la

secuencia del gen que codifica para el gen que ción acerca de la diversidad y de la evolución
codifica la subunidad 16S r ARN de los ribo- de poblaciones microbiana, sin embargo el gen
somas procarióticos. Todos los microorganis- 16S representa aproximadamente el 0.05%
mos poseen este ARN que presenta una alta de un genoma procariota. Se ha demostrado
similitud entre ellos pero con diferencias sufi- que microorganismos que poseen secuencias
cientes para su uso como medida de distancias de 16S rADN idénticas pueden poseer geno-
evolutivas. Existe una amplia base de datos de mas muy distintos y presentar diferentes fisio-
secuencias del 16S rARN de organismos diver- logías y temperaturas óptimas de crecimiento.
sos que ha permitido elaborar un árbol filoge- Los miembros de una comunidad microbiana
nético llamado árbol de la vida. Esto permite pueden diferir enormemente en sus activida-
usar los datos metagenómicos de 16S rADN des bioquímicas e interacciones, no sólo entre
generado a partir de una determinada muestra especies sino dentro de una misma especie.
ambiental, para posicionar filogenéticamente a Por ende la filogenética nos dice en el mejor
las distintas secuencias, y eventualmente inde los casos quiénes son los miembros de la
ferir la biología y ecología de los mismos. El comunidad pero muy poco acerca de qué es
análisis del (los) gen (es) 16S rARN es econó- lo que hace cada miembro. Uno de los prin-
micamente accesible a los laboratorios y es útil cipales objetivos de la ecología microbiana es
para evaluar diversidad microbiana. En parti- el poder asociar la identidad de los diferentes
cular, ha sido efectivo para revelar la abundan- microorganismos dentro de un hábitat con los
cia de especies, y la estructura poblacional de procesos que ellos llevan a cabo en ese am-
muestras de suelo (Aguilar et al., 2006). biente. Los métodos metagenómicos, que se-
La amplificación mediante la PCR, usando rán discutidos más adelante, comienzan a dar
oligonucleótidos cebadores que hibridan las respuestas a esta segunda cuestión.
regiones conservadas de los genes 16S rARN
de bacterias y arqueas, genera fragmentos Construcción de bibliotecas genómicas
que pueden ser clonados y secuenciados. El ambientales
tamaño del ADN resultante de la amplificación, Muchos de los métodos corrientemente uti-
de aproximadamente 1,4 Kb se inserta en un lizados en la construcción de bibliotecas am-
plásmido vector tipo TA, seguido de transfor- bientales, son adaptaciones de las técnicas
mación de E. coli. El ADN usado como molde empleadas para la construcción de bibliotecas
puede ser el ADN metagenómico o también de insertos grandes de organismos eucariotas,
el proveniente de una biblioteca metagenómi- tales como clonado en cromosomas artificiales
ca (Furlong et al., 2002). Los datos primarios (BACs) y lísis celular en tacos de agarosa. Sin
pueden ser examinados con programas com- embargo, en la construcción de genotecas am-
putacionales apropiados que permiten evaluar bientales se encuentran obstáculos que no se
la predominancia de especies (DOTOUR), y el presentan en la construcción de bibliotecas de
grado de similitud entre los miembros de dos organismos aislados. La diversidad de nichos
comunidades (SONS, LIBSHUFF, http://www. ecológicos plantea desafíos interesantes a la
libshuff.mib.uga.edu). hora de diseñar una estrategia adecuada para
El método tiene sus limitaciones. Por ejem- la obtención de un ADN de calidad apropia-
plo, a- provee un marco filogenético de la coda y que el mismo represente la población de
munidad pero da información escasa sobre la microorganismos presentes en ese ambiente.
funcionalidad de la misma; b- como todo pro- En la actualidad se han preparado diversas bi-
cedimiento basado en PCR, no todos los ge- bliotecas metagenómicas de variados ambien-
nes rARN amplifican igualmente, resultando en tes, en esta sección discutiremos algunos de
la sub-estimación de especies, y c– los genes los aspectos críticos a tener en cuenta en su
16S rARN pueden existir en múltiples copias preparación.
no idénticas. La primera biblioteca ambiental se constru-
Es claro entonces que el análisis genético yó a partir de ADN de microorganismos oceá-
empleando 16S rARN provee valiosa informa- nicos, los que fueron concentrados a partir de

agua de mar antes de la extracción de ADN. de resinas de intercambio catiónico, seguido
Sin embargo en el caso de otros habitat tales de gradiente de densidad o centrifugación dife-
como el suelo, existen procedimientos alterna- rencial. En este caso el ADN obtenido es casi
tivos, cada uno con sus ventajas y desventajas. exclusivamente procariótico. Además, el ADN
La construcción de una biblioteca metagenó- recuperado por este método parece ser me-
mica de suelo se inicia con la toma de muestra. nos contaminado con compuestos de la matriz
Como las muestras de suelo son heterogéneas, compuestos, entre ellos sustancias húmicas.
los datos fisicoquímicos tales como tamaño de Además, el tamaño medio de los ADN aislados
partícula, tipo de suelo, contenido de agua, pH, es mayor que el que suele obtenerse mediante
temperatura y las plantas que lo cubren son lisis directa y, por lo tanto, es más adecuado
útiles para la evaluación y comparación de los para la generación de bibliotecas de insertos
resultados obtenidos en estos estudios. Dado grandes.
que las poblaciones microbianas son grandes, Como los diferentes microorganismos del
los volúmenes de muestras pueden ser peque- suelo tienen diferentes susceptibilidades a los
ños. Durante la toma de muestra necesaria- métodos de lisis celular, las secuencias pre-
mente se generan perturbaciones que pueden sentes en el ADN aislado y en las bibliotecas
modificar la composición de las comunidades dependen del método de extracción. No se ha
microbianas del suelo, por lo que es importante estudiado cuál es el sesgo que se introduce en
disminuir al mínimo el tiempo de transporte y las bibliotecas debido al método de extracción,
almacenamiento de la misma. sin embargo es de presumir que el ADN aisla-
Los métodos de extracción de ADN se pue- do por lisis directa represente mejor la diversi-
den dividir en dos categorías: a) lisis directa de dad microbiana de una muestra de suelo, ya
las células contenidas en la matriz de la mues- que este no incluye el paso de separación de
tra seguido de la separación del ADN de la malas células, por lo tanto serán lisados aún los
triz y los desechos celulares, o b) la separación microorganismos que se adhieren fuertemente
de las células de la matriz del suelo seguido por a las partículas.
lisis celular. El ADN crudo recuperado por am- El análisis metagenómico puede requerir de
bos métodos se purifica por los procedimientos bibliotecas con insertos de tamaño grande o
pequeño. Las bibliotecas de insertos pequeños
habituales. La recuperación de ADN aislado de
son suficientes en el caso en que el análisis in-
diferentes tipos de suelo utilizando ambos tipos
volucre el estudio de un único gen o un peque-
de protocolos van desde menos de aproxima-
ño grupo de genes. Por el contrario, se requie-
damente 1 μg a 500 μg de ADN por gramo de
ren insertos mayores para el estudio de rutas
suelo, sin embargo el rendimiento es entre 10
metabólicas completas, procesos complejos u
y 100 veces mayor por lisis directa cuando se
organización genómica. Independientemente
compara para una misma muestra. Para lograr
del tamaño de inserto requerido, la prepara-
la lisis celular directa, se utilizan una combina-
ción de ADN es crítica para el éxito del análisis.
ción de tratamientos enzimáticos, detergente y
En el caso de emplear digestiones parciales de
altas temperaturas. Además del ADN de las cé-
ADN para la construcción de la biblioteca se re-
lulas procariotas lisadas, también se recupera quiere partir de un ADN de un tamaño prome-
ADN extracelular y eucariota. dio 3 veces mayor al de los insertos deseados.
Los métodos de extracción de ADN basa- Por ende si se desea un inserto de 100 kb se
dos en la separación de células como una deberá partir de un ADN de tamaño promedio >
etapa previa a la lisis de las mismas, aunque 300 kb. Un ADN de este tamaño es muy vulne-
menos eficientes en términos de cantidad de rable a las fuerzas de cizalla que se producen
ADN recuperado son menos dañinos para la en el manipuleo de las soluciones, centrifuga-
integridad del mismo. La separación de los mi- ciones, congelado-descongelado, etc. Por ello
croorganismos de la matriz del suelo se logra en estos casos la lisis de las células para la
mediante suaves fuerzas mecánicas como los liberación del ADN y su posterior digestión par-
procedimientos de mezcla, la rotación del pilón cial con enzimas de restricción, se realiza en
en mortero o químicos, tales como la adición tapones de agarosa.

Dependiendo del tamaño promedio de los in- ADN ambiental debe contener el/los gen(es)
sertos, las bibliotecas se construyen emplean- que codifican las funciones buscadas, y es
do diferentes tipos de vectores. Así las de indeseable que las secuencias correspondien-
sertos pequeños (menores a 15 kb) emplean tes se encuentren representadas en una fre-
vectores plasmídicos, en tanto que las de in- cuencia alta en el ADN ambiental; segundo,
sertos de hasta 40 kb hacen uso de cósmidos o los procedimientos de preparación del ADN
fósmidos, y BACs para más de 40 kb. Los vec- metagenómico y de clonado molecular deben
tores tipo BACs con número de copia inducible permitir la recuperación e integridad de genes
son particularmente útiles, dado que permiten y operones; y finalmente, los genes deben ser
un mantenimiento en la célula huésped a bajo detectables genéticamente o fenotípicamente.
número de copia, pero permiten el incremento Resulta obvio al encarar un proyecto de este
del número de copias para facilitar el estudio tipo, que la correcta selección del ambiente
de expresión. apropiado, constituya una de las etapas fun-
Si bien el huésped de elección para la cons- damentales para darle una base probabilística
trucción y mantenimiento de todas las bibliote- razonable de éxito a nuestro diseño experi-
cas publicadas es E.coli, es fácil de notar que mental. Por ejemplo, en un trabajo publicado
la búsqueda de fenotipos interesantes se verá por Rhee et al., (2005), cuyo objetivo fue el
restringida a aquellos que nos permita expre- aislamiento de genes nuevos codificantes de
sar este huésped. Se han construido vectores enzimas termoestables con actividad esterasa,
cosmídicos y BACs que permiten la transferen- se realizó la búsqueda sobre el metagenoma
cia de bibliotecas producidas en E. coli a otros de muestras de suelo de sitios con aguas ter-
especies huéspedes tales como Streptomyces males cuyas temperaturas fueron entre 65 y 90
o Pseudomonas (Martínez et al., 2004; Wexler o
C (Rhee et al., 2005). Esta consideración da
et al., 2005). cierta certeza sobre la presencia de las funcio-
nes buscadas en la muestra pero, no asegura
Screening basado en la expresión que la representación de los genes buscados
funcional en el metagenoma, sea suficientemente alta
Otra forma de acceder al metagenoma, par- para lograr su recuperación. Por ejemplo, la
ticularmente cuando se trata de ambientes búsqueda de clones con actividad lipolítica en
complejos en cuanto a su diversidad poblacio- una biblioteca proveniente de ADN de suelo,
nal y a su alta densidad de microorganismos resultó en la identificación de un clon entre
diferentes, es la búsqueda de genes que ge- 730.000 clones examinados. Con el propósito
neren productos definidos e identificables, o de aumentar la probabilidad de detección de
asociados a determinadas actividades que se genes de interés se ha recurrido a la inclusión
pueden evaluar in vitro aplicando bio-ensayos. en el diseño experimental de etapas de enri-
La ventaja más importante de este aborda- quecimiento previas a la construcción de las
je es el desarrollo de un proyecto acotado de bibliotecas génicas. En la mayoría de estos
menor envergadura que el análisis alternativo estudios, las fuentes de carbono y/o nitrógeno
dirigido a la secuenciación masiva del metage- han sido los criterios selectivos de especies mi-
noma. Este criterio de screening comprende crobianas con genes deseados que son reque-
varias estrategias agrupadas dentro de la lla- ridos para su desarrollo en esas condiciones
mado metagenómica funcional. A continuación de incubación. El análisis metagenómico de
se describirán algunas estrategias que ilustran cultivos enriquecidos ha demostrado su poten-
formas ingeniosas de abordar el conocimiento cialidad para el aislamiento de genes determi-
del metagenoma con un propósito directo de nantes de funciones catalíticas, degradativas,
descubrimiento y uso de propiedades específi- y nuevos antibióticos a partir de suelo y otros
cas codificadas por el metagenoma. ambientes (Entcheva et al., 2001; Gupta et al.,
El usufructo exitoso de actividades micro- 2002; Knietsch et al., 2003; Daniel et al., 2004;
bianas o vías metabólicas requiere del logro Mori et al., 2008). Sin embargo, se deben con-
de varias etapas críticas. En primer lugar, el siderar sus limitaciones: Las poblaciones mi-

crobianas que contienen los genes deseados rasas que forman un grupo nuevo. Estos ge-
no responden eficientemente a las condiciones nes resultaron del análisis de una biblioteca
de enriquecimiento, su crecimiento lento deter- consistente en 4 Gb de ADN, equivalente a 106
mina baja representación en la muestra previa genes, sugiriendo la obvia y baja representa-
a la extracción de ADN. ción de dichos genes en la biblioteca. El uso
Los métodos de screening funcional son po- del procedimiento experimental de selección
tencialmente útiles para descubrir nuevas va- positiva hizo posible su detección que de otra
riantes de funciones interesantes. Su eficiencia, manera –por ejemplo mediante secuenciación-
usando bibliotecas metagenómicas, depende a hubiera resultado una tarea casi imposible. No
su vez de la eficiencia y sensibilidad del ensa- obstante, el número de clones/muestras indi-
yo in vitro y también de la compatibilidad del viduales de una biblioteca que son necesarios
sistema de trascripción y traducción de la cé- examinar, sigue siendo experimentalmente un
lula hospedadora para transcribir y traducir el/ número grande. Con el objetivo de encontrar
los gen(es) contenidos en el clon transgénico. resultados en tiempo real y examinar un univer-
Aunque la bibliografía demuestra que el hospe- so grande, se han diseñado estrategias de alta
dador más usado es Escherichia coli, el rango productividad (en Inglés son referidas como
de hospedadores se ha ampliado en los últi- “high-throughput screen”), las cuales incorpo-
mos años a otras microorganismos tales como ran sistemas automatizados y robotizados con
Streptomyces lividans, Pseudomona putida, alta tecnología instrumental.
y Rhizobium leguminosarum (Martínez et al., Otro enfoque es el estudio de antibióticos
2004; Li et al., 2005) e incluso eucariotes (Al nuevos en metagenoma de suelo el cual ha
Hasani et al., 2003). Esto permitirá un mayor expandido nuestra visión de las comunicacio-
acceso hacia la expresión de un amplio rango nes entre comunidades microbianas. Se ha
de actividades génicas del medio ambiente. encontrado que concentraciones sub-inhibido-
El análisis metagenómico basado en identi- ras de crecimiento inducen respuesta del tipo
ficación de clones que expresan una determi- quórum sensing, aún cuando los compuestos
nada función ha sido exitoso cuando se lo ha no muestran similitud con las conocidas homo-
combinado al uso de mutantes de E. coli. Por serina lactonas que han sido descritas como
ejemplo, Daniel y su grupo usaron mutantes de inductores naturales en bacterias. Esto sugiere
E. coli deficientes en sus sistemas antiporter la existencia de un diálogo comunicativo entre
Na+ (Li+)/H+ para descubrir dos antiporters nue- microorganismos que activan funciones en el
vos a partir del screening de una biblioteca de entorno. Además, este hallazgo ha sido adop-
aproximadamente 1,5 x 106 clones. El procedi- tado para el screening de moléculas que fun-
miento experimental consistió en transferir los cionan como inductoras de quórum sensing y
clones a E. coli, y evaluar el crecimiento de los eventualmente también como antibióticos. Esta
transformantes en cajas de petri conteniendo oportunidad condujo al diseño de un procedi-
un medio de cultivo con 7,5 mM LiCl (Majernik miento de screening con alta eficiencia cuanti-
et al., 2001). Aplicando un procedimiento simi- tativa de análisis de clones e identificación de
lar se identificaron genes participantes en la compuestos que funcionan como inductores de
biosíntesis de biotina, a partir de ADN de suelo genes que se encuentran bajo el control de
(Entcheva et al., 2001). un promotor sensible a quórum sensing. Este
Por otro lado, la selección por resistencia sensor consiste en el promotor del gen luxR fu-
a antibióticos ha conducido al aislamiento de sionado al gen reportero gfp, residente en un
nuevas formas de resistencia a tetraciclina y a plásmido replicativo en una variante de E. coli
aminoglicósidos a partir de muestras de la bio- que no induce quórum sensing. En el caso que
ta de la boca humana, y de suelo, respectiva- el ADN metagenómico exprese un inductor del
mente. El descubrimiento de resistencia a ami- promotor luxR, se sintetizará la proteina GFP
noglicósidos es un buen ejemplo del uso del revelándose fluorescencia. Este procedimiento
screening funcional. Se identificaron 9 clones, acoplado a cell sorting activada por fluorescen-
de los cuales 6 codifican para 6´-acetiltransfe- cia, permite capturar aquellos clones potencial-

mente productores de compuestos de quorum las poblaciones provenientes del suelo con-
sensing (Figura 2) (Lynn et al., 2005; Uchiyama centrando aquellas asociadas a una función
et al., 2005). (por ejemplo degradación de un compuesto
Otro método de enriquecimiento se basa en hidrocarburo que es asimilado). Sin embargo,
el uso de isótopos estables, en el cual se admi- el método tiene sus limitaciones principalmente
nistra -como única fuente de carbono- un sus- generadas por el llamado “cross feeding”, en
trato marcado con 13C a una comunidad de miel cual bacterias carentes de esa propiedad
croorganismos provenientes de suelo. Aquella pueden desarrollar en el medio a expensas
comunidad bacteriana capaz de utilizar ese de metabolitos provistos por otras bacterias
sustrato incorporará 13C en sus macromolé- (Radajewaski et al., 2000)
culas, particularmente en ADN, determinando
que el ADN será más denso que el ADN normal Lo no cultivable se vuelve cultivable
de la bacteria. El procedimiento continúa con El estudio metagenómico del biofilm que
la ultracentrifugación del ADN en gradientes de se forma sobre las aguas que drenan de una
densidad de CsCl para separar el ADN marca- mina de hierro abandonada, ubicada en la Iron
do del ADN normal o no marcado. Este ADN Mountain en Richmond, California ha permitido
puede separarse de la columna de gradiente, establecer la estructura de la comunidad y las
someterse a diálisis y posteriormente concen- funciones metabólicas y biogeoquímicas. Esa
trarse por precipitación etanólica. El ADN se agua de drenaje constituye un medio extrema-
fragmenta y clona en vectores plasmídicos. La damente adverso, su acidez es de pH 1.0 y
biblioteca resultante puede analizarse median- posee un alto contenido en metales. También
te un screening funcional, o haciendo uso de es rica en pirita (FeS2). No hay fuentes asimi-
sondas dirigidas a revelar un determinado gen. lables de carbono o nitrógeno más allá de las
El método tiene potencialidad para fraccionar que pueden derivar del aire. Tyson et al. (2004)
Figura 2. Aislamiento de clones provenientes de un biblioteca metagenómica, que expresan productos

génicos inductores/activadores de quórum sensing. LuxR es un producto génico que interacciona con
moléculas efectoras producidas por microorganismos, activador de un promotor sensible fusionado al gen
reportero para GFP (green fluorescent protein) facilitando su detección.

secuenciaron una biblioteca construida con la formulación del medio de cultivo y logro
ADN extraído del biofilm, y lograron ensam- de su cultivación in vitro.
blar a partir de datos metagenómicos los ge-
nomas de miembros del grupo Leptospirillum Potencialidades de la metagenómica
y Ferroplasma tipo II, también una sustanciosa Las posibilidades que este nuevo campo
información de otros miembros de la comuni- ofrece son alucinantes. Descifrar la enorme
dad. El análisis de estos resultados fue muy gama de procesos e interacciones que ca-
sugestivo. Los autores notaron que no habían racterizan las comunidades microbianas en la
detectado la presencia de Leptospirillum fe- Tierra puede conducir a avances en la salud
rrooxidants, la especie fijadora de N2. Por el humana, la mejora de la comprensión a gran
contrario, el genoma de la comunidad reveló escala de los cambios climáticos y atmosfé-
la presencia de miembros pertenecientes a ricos, los métodos para obtener cultivos más
los grupos II y III de Leptospirillum. El género fuertes y nutritivos, nuevos enfoques para la
Leptospirillum ha sido sub-dividido en 3 gru- limpieza de la contaminación ambiental, y el
pos, de los cuales aún no se había logrado cul- desarrollo de nuevas fuentes de energía reno-
tivar a representativos del grupo III. El estudio vable. Estos son sólo algunos ejemplos de las
también reveló la presencia de genes nif (ge- muchas posibles aplicaciones prácticas de la
nes de fijación biológica de nitrógeno) que los metagenómica.
autores asociaron al genoma de Leptospirillum El ser humano siempre vivió en un mundo
grupo III. Estos datos permitieron concluir que dominado por los microbios, y la estrecha re-
la contribución de esta población al consorcio lación entre los microbios y los seres humanos
del biofilm de la mina ácida, es el aporte de es un tema antiguo. Las células microbianas
nitrógeno asimilable, y además, el conocimien- que viven en el cuerpo humano adulto son diez
to de las capacidades metabólicas inferidas veces más numerosos que las células huma-
de los datos metagenómicos guió los pasos nas. Los genomas microbianos de las comuni-
siguientes dirigidos a lograr la cultivación en dades que viven dentro y en el cuerpo humano
el laboratorio de Leptospirillum grupo III y a la (el microbioma humano) contiene muchos más
definición de la especie L. ferrodiazotrophum genes que el genoma humano. Estudiar el mi-
(Tyson et al., 2005). De la misma manera, estu- crobioma humano puede dar lugar a valiosas
diando los datos resultantes, se ha especulado nuevas herramientas en nutrición humana y
que Ferroplasma y Leptospirillum sp derivarían animal, el descubrimiento de medicamentos,
la energía a partir de la oxidación del hierro. y en medicina preventiva. Este estudio tam-
Además, se encontró que todos los genomas bién puede ampliar mucho la profundidad de
muestran genes asociados con la remoción de nuestra comprensión de enfermedades com-
elementos potencialmente tóxicos, tales como plejas tales como obesidad, el cáncer y ciertas
sistemas de flujo de protones y bombas de ex- enfermedades inmunológicas, como el asma
clusión de metales (Tyson et al., 2004). (Turnbaugh et al., 2006).
El estudio de las comunidades en el drenaje La inmensa mayoría de nuestros microorga-
de aguas de la mina ácida de Richmond, es un nismos asociados viven en el intestino. Estos
modelo de complementariedad de funciones 10 a 100 billones microorganismos desempe-
asignables a miembros del consorcio micro- ñan funciones tales como la extracción de nu-
biano. Es posible imaginar que la proyección trientes y calorías de componentes de nuestras
de este modelo de estudio a otros sistemas dietas y la síntesis de vitaminas esenciales y
ambientales no resulte fácil. La extrema adver- aminoácidos. Las bacterias intestinales tam-
sidad de la mina ácida limita la diversidad de bién ayudan a detoxificar productos químicos
genomas en la comunidad y facilitó el análisis potencialmente nocivos que pueden estar pre-
sentes en lo que comemos. Algunos de los mi-
El mensaje intrínseco de este descubri- crobios que viven en y sobre el cuerpo humano
miento de componentes importantes de las desempeñan un papel fundamental en la de-
comunidades del suelo, aplicando un análi- fensa contra agentes patógenos. Esta relación
sis metagenómico, es su uso como guía en mutuamente beneficiosa nos ayuda a prote-

gernos de enfermedades al tiempo que se da vectores de tipo BAC. Se generaron dos biblio-
a los microbios un lugar para vivir. El uso de tecas metagenómicas una con un tamaño de
metagenómica para obtener un conocimiento inserto promedio de 27 kb y otra de 44.5 kb.
más profundo de las comunidades microbianas Pese a que el tamaño de inserto no es mayor al
en el cuerpo humano podría ser inmensamente de una biblioteca convencional construida con
valioso en la comprensión tanto de microbios vectores de tipo cósmido o fago lambda, es la
dañinos como de beneficiosos y puede con- primera publicación en la que se informa el clo-
ducir a formas más efectivas de diagnosticar, nado de fragmentos de ese tamaño a partir de
tratar y prevenir enfermedades. las poblaciones microbianas de suelo. A partir
El enfoque metagenómico ofrece la posibi- de estas bibliotecas logran identificar clones
lidad no sólo de analizar la diversidad filoge- que expresan fenotipos tales como, lipasas y
nética de diversos ambientes y biofilms, sino
amilasas. De igual modo Brady y col, recupe-
también de localizar los genes y operones que
raron a partir de una biblioteca cosmídica de
codifican propiedades de interés biotecnoló-
ADN de suelo el conjunto de genes necesarios
gico. La metagenómica ha dado lugar al des-
para la síntesis de violaceína, un antibiótico de
cubrimiento y caracterización de una amplia
gama de biocatalizadores, que revela mucho amplio espectro,.
acerca de la diversidad natural de las enzimas Aunque las bibliotecas metagenómicas
y los factores que influyen en sus funciones. constituyen en la actualidad la herramienta
Uno de los principales enfoques para la de- más poderosa para evaluar la diversidad fun-
tección de nuevos biocatalizadores implica la cional de comunidades microbianas naturales,
detección funcional lo que requiere la expre- no cubren los genomas de baja abundancia en
sión de genes heterólogos generalmente en ambientes complejos como los suelos. Como
Escherichia coli. Mediante el enfoque metage- resultado, la frecuencia de clones con un feno-
nómico se estudian hábitats tan diversos como tipo deseado en una biblioteca puede ser muy
intestinos de termitas, el rumen de rumiantes baja. Esto implica la búsqueda y selección en
como ciervos o vacas, las muestras de suelo miles de clones, lo que significa una tarea larga
de los desiertos y glaciares, así como hábitats y tediosa. En la actualidad se dispone de equi-
extremos como géiseres, mar abierto de agua pos con tecnologías que facilitan la recolección
o chimeneas hidrotermales de aguas profun- de colonias, y la inoculación en placas de nu-
das. Es de esperar que la composición genó- merosos clones al mismo tiempo.
mica de las poblaciones microbianas en estos Mientras que la industria de alimentos y de
hábitats se diferencien unos de otros, y con detergentes se concentran en un número limi-
ella los biocatalizadores y biomoléculas que tado de reacciones enzimáticas y sustratos, las
componen las respectivas bibliotecas metage- industrias química y farmacéutica trabajan con
nómicas. La metagenómica industrial se cen- miles de moléculas química y estructuralmente
tra principalmente en procariotes, ya que sus diversas, y la producción de cada uno de estos
genomas puede ser objeto fácilmente de las requiere soluciones enzimáticas individuales.
herramientas de selección funcional disponi- En consecuencia, debido a la riqueza de bio-
bles en la actualidad, y porque se supone que
catalizadores potencialmente útiles, el uso de
la mayor diversidad se encuentra entre estos
recursos microbianos es cada vez más difun-
microorganismos. Las enzimas se utilizan en
dido en las industrias químicas y son conside-
una amplia gama de aplicaciones e industrias.
rados indispensables para la química orgánica
Su versatilidad permite su uso tanto en los pro-
cesos para degradar polímeros naturales entre moderna. Es obvio que existe una amplia de-
ellos almidón, celulosa y proteínas, así como manda de nuevos enzimas y biocatalizadores,
para las síntesis enantioselectiva asimétrica de y la metagenómica aparece como una de las
productos químicos, aunque hay muchas más tecnologías con mayor potencialidad para pro-
aplicaciones. veer de las moléculas necesarias.
En el año 2000 Rondon y col. publican las Es creciente la conciencia y la percepción
primeras bibliotecas de suelos clonados en global de que la disponibilidad de combusti-

bles fósiles no renovables no es sostenible de los disacáridos en azúcares simples. Este
en el futuro próximo, y se deberá superar esa gen fue aislado a partir de microbios presen-
dependencia energética. Además, las emisio- tes en el rumen de vaca. Mediante ingeniería
nes de gases de invernadero como resultado genética este gen ha sido modificado de forma
de la quema de combustibles fósiles son una tal de dirigir el producto de su expresión hacia
de las causas principales del calentamiento vacuolas, de esta forma las enzimas digestivas
global. Estos factores determinan la búsqueda permanecen almacenadas hasta su cosecha
de combustibles renovables, y amigables para (Sticken, 2008). Estos son algunos ejemplos
el medio ambiente sea una de las principales que ponen de manifiesto la potencialidad de
prioridades para el mundo. Una fuente de ener- los enfoques metagenómicos tanto en su pro-
gía emergente es el etanol (alcohol de grano)- pósito biotecnológico como en el análisis de
un biocombustible de alto octanaje de derivado las comunidades ambientales. En definitiva, la
de maíz, caña de azúcar, o de otro tipo de fuen- metagenómica surge hoy como una disciplina
tes agrícolas. El etanol celulósico se fabrica a nueva que nos permitirá ampliar nuestro cono-
partir de la celulosa que se encuentra en el co- cimiento de la microbiología hasta dimensio-
mún de los desechos agrícolas tales como la nes aún inimaginables.
fibra de maíz, tallos de maíz, paja de trigo, y
otras como la biomasa derivada del mijo y el Lecturas recomendadas
miscanthus. Pero el proceso que convierte la
celulosa a partir de residuos agrícolas a eta- Aguilar O.M., M. V. López , M. Donato, B. Morón,
nol utilizable depende de un ingrediente esen- M. E. Soria-Diaz, C. Mateos, A. Gil-Serrano, C.
cial: las comunidades microbianas. En primer Sousa, and M. Megías. 2006. Phylogeny and
nodulation signal molecule of rhizobial popula-
lugar, varios tipos de microorganismos deben
tions able to nodulate common beans -other than
trabajar en conjunto para transformar la celulo- the predominant species Rhizobium etli- present
sa a partir de desechos agrícolas en azúcares. in soils from the Northwest of Argentina. Soil Bio-
Luego, los azúcares son fermentados-también logy and Biochemistry 38:573-586.
por los microbios- para producir etanol. Al-Hasani, K., Simpfendorfer, K., Warden, H., Vado-
Las vacas, con la ayuda de las bacterias, las, J., Zaibak, F., Villain, R., and Ioannou, P.A.
son capaces de convertir las fibras vegetales 2003. Development of a novel bacterial artificial
(celulosa) en energía, pero este es un proceso chromosome cloning system for functional stu-
complejo para mimetizarlo para la producción dies. Plasmid 49:184-187.
de biocombustibles. Brady SF, Chao CJ, Handelsman J, Clardy J. 2001.
La enzima que permite que una vaca digiera Cloning and heterologous expression of a natu-
ral product biosynthetic gene cluster from cDNA.
los pastos y otras fibras vegetales puede ser
Org Lett 3:1981-1984.
usada para convertir otras fibras vegetales en Daniel, R. 2005. The metagenomics of soil. Nature
azúcares simples. Transformar las fibras ve- 3:470-478.
getales en azúcar requiere de tres enzimas. Entcheva P., Liebl, W., Johann, A., Hartsch, T., and
Estas tres enzimas han sido recientemente in- Streit, W.R. 2001. Direct cloning from enrichment
troducidas en una variedad de maíz denomi- cultures, a reliable strategy for isolation of com-
nada Spartan III, que deriva de dos versiones plete operons and genes from microbial consor-
anteriores. La primera versión contiene una tia. Appl. Environ. Microbiol. 67:89-99.
enzima que procede de un microbio que vive Environmental Microbiology www.blackwell-syner-
en agua manantial caliente, y que es capaz de gy.com/toc/emi/7/12
transformar el gran polímero de celulosa en Furlong, M.A., Singleton, D.R., Coleman, D.C. and
Whitman, W.B. 2002. Molecular and Culture-Ba-
fragmentos de menor tamaño. La segunda ver-
sed Analyses of Prokaryotic Communities from
sión contiene un gen de un hongo natural que an Agricultural Soil and the Burrows and Casts
codifica para una enzima capaz de clivar estos of the Earthworm Lumbricus rubellus. Appl. En-
fragmentos de celulosa en disacáridos. En la viron. Microbiol. 68:1265-1279.
última versión se introdujo el gen codificante Knietsch, A., Bowien, S., Whited, G., Gottschalk, G.
de una enzima capaz de catalizar la hidrólisis and Daniel, R. 2003. Identification and Charac-

terization of Coenzyme B12-Dependent Glycerol grini, V., Mardis, E.R., and Gordon, J.I. 2006.
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super(+))/H super(+) Antiporter Activity on Es- an Acidophilic Microbial Community. Appl Envi-
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tive Lipase Family, Cloned from a Metagenomic
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Turnbaugh, P.J., Ley, R.E., Mahowald, M.A., Ma-

I. CAPÍTULO 12 sido adoptado por la comunidad científica des-
de el inicio de las iniciativas genómicas para fa-
cilitar la organización y la difusión de los datos.
Bioinformática aplicada a la Esto hace que se distingan distintas categorías
biotecnología vegetal de bases de datos, entre las principales están
aquellas que son repositorios públicos a gran
escala y bases de datos específicas de iniciati-
N Paniego; R Heinz; P Fernández; V Lia;
vas comunitarias
C Fusari
Los repositorios públicos a gran escala son
bases de datos estables, generalmente man-
Introducción
tenidas por agencias gubernamentales, que
La Bioinformática es una disciplina científica
archivan principalmente información estática,
que ha evolucionado rápidamente en los últi-
un ejemplo típico es Genbank. La información
mos años respondiendo al avance y a las ne-
disponible en esa base de datos en particular
cesidades de procesamiento, almacenamiento
puede ser accedida a través de ENTREZ, un
y análisis de datos biológicos derivados de las
buscador que combina la interrogación simul-
tecnologías asociadas a las ómicas, para ge-
tánea de 35 bases de datos disponibles en
nerar nueva información y conocimientos en
el sitio NCBI. Algunas de éstas son bases de
el área de la biología. El campo de la bioinfor-
datos secundarias que agregan información a
mática es multidisciplinario abarcando el de-
los datos primarios (secuencias nucleotídicas),
sarrollo de bases de datos, el alineamiento de
entre las cuales podemos mencionar Gene,
secuencias, la predicción de estructuras protei-
UniGene, HomoloGen o RefSeq.
cas, la construcción de árboles filogenéticos,
Dentro de las bases de datos comunitarias
entre otros. En este capítulo nos dedicaremos
están aquellas que almacenan datos deriva-
específicamente a la bioinformática aplicada
dos de estudios sobre especies modelo, gene-
a la biotecnología vegetal, particularmente a
ralmente focalizando en una especie o en un
cultivos agronómicos y plantas modelo, con
grupo de especies relacionadas. La primera
el propósito de guiar al estudiante de un cur-
base de datos de esta categoría establecida
so inicial de biotecnología vegetal o de biolo-
para especies vegetales es “The Arabidopsis
gía molecular de plantas en la aplicación de
Information Resource” (TAIR), que reúne la
los conceptos y las herramientas básicas de la
información asociada a esta especie modelo
bioinformática, complementando los conceptos
en relación a secuencias, genes y proteínas,
introducidos en la primera edición de este libro.
marcadores, alelos, mapas, vías metabólicas,
Este material no pretende cubrir la totalidad de
literatura, protocolos, microarreglos, ontología
los recursos existentes para la materia, el obje-
de genes, anotaciones, disponibilidad de ger-
tivo es motivar el interés de los estudiantes en
moplasma/semillas y herramientas de análi-
la exploración y el uso de recursos y métodos
sis. En los últimos años, ha surgido una nueva
computacionales básicos para el desarrollo de
generación de bases de datos que integran la
su actividad científica o profesional futura. Para
información de muchas especies para permitir
ello, describiremos en primer lugar algunas ba-
la comparación de genomas, entre ellas está
ses de datos específicas de iniciativas genó-
Gramene que integra recursos para la compa-
micas de plantas e introduciremos el concepto
ración de mapas genéticos y físicos de arroz
de anotación de datos genómicos. La segunda
y otras especies de gramíneas; LIS permite
parte del capítulo esta dedicada a la bioinfor-
la comparación genómica y de transcriptos de
mática aplicada a estudios de expresión, la
distintas especies de leguminosas; finalmente
búsqueda de marcadores moleculares funcio-
Phytozome (http://www.phytozome.net: Tool for
nales y el análisis de su variabilidad genética.
green plant comparative genomics) reúne la in-
formación competa de 14 genomas vegetales,
Bases de datos generales y específicas
agrupamientos de genes ortólogos, parálogos
de especie
y familias de genes y herramientas de análisis
El uso de tecnologías de bases de datos ha

como BLAST para hacer comparaciones con- en el proceso de anotación funcional, se basa
tra los proteomas de cada una de las especies en la característica que tienen las proteínas ho-
representadas en la base de datos. La Tabla 1 mologas de conservar la misma función y se
condensa un número importante de bases de sustenta con bases de datos de secuencias de
datos específicas junto con sus accesos Web proteínas curadas cuidadosamente como por
para facilitar la exploración de las mismas. ejemplo SwissProt o PIR.
Asimismo, existen bases de datos específi- No obstante, puede asumirse en general que
cas de patógenos que afectan cultivos agronó- las bases de datos de proteínas asociadas a
micamente importantes. Estas bases aportan organismos modelo se encuentran correcta-
información sobre la secuencia del genoma de mente anotadas y pueden usarse como refe-
los patógenos, la cual puede ser asociada a la rencia para inferir posibles funciones molecu-
información derivada de estudios funcionales lares. Sin embargo, para que los procesos de
de transcriptos inducidos durante la interacción anotación dentro y entre especies en organis-
con la planta huésped, permitiendo el diseño mos no-modelo sean lo más eficiente y compa-
de estrategias de mejoramiento de los cultivos rable posible, lo óptimo es referir la anotación
para lograr resistencia. Entre estas bases de asignada a vocabularios estructurados u onto-
datos se pueden mencionar a: Phytophthora logías. Existen diferentes iniciativas para es-
Functional Genomics Database y PathoPlant. tablecer vocabularios controlados, una de las
más frecuentemente usadas es la “Ontología
Anotación funcional de los datos de genes” (Gene Ontology, GO), que establece
genómicos tres categorías o jerarquías: (1) las funciones
El proceso de anotación de los datos genó- moleculares, (2) los procesos biológicos y (3) la
micos a nivel de proteínas consiste en tratar de localización sub-celular o componente celular.
deducir a partir de los datos de secuenciación El proceso de anotación es un proceso conti-
nucleotídica, las características funcionales del nuo que debe ser constantemente actualizado
genoma de un organismo, explorando y descri- con el fin de agregar nueva información y refi-
biendo los niveles intermedios de organización nar la información existente.
como funciones y procesos moleculares, ce-
lulares, fisiológicos, compartimentalización de Anotación de secuencias en especies de
las funciones, etc. Este proceso de anotación plantas no-modelo
demanda una gran integración de los datos e Acorde a lo mencionado, la anotación genó-
información disponible para la especie o para mica llevada a cabo en la mayoría de los pro-
especies relacionadas, haciendo uso de herra- yectos y en especial en los proyectos de peque-
mientas de la bioinformática para la compara- ña envergadura dedicados a la caracterización
ción y la extracción de datos y de las bases de transcriptos o ESTs, se basan en el uso del
de datos generales y específicas, del conoci- algoritmo BLAST. La calidad de los resultados
miento biológico acumulado en publicaciones en todos los casos depende de los parámetros
y de los análisis transcriptómicos o genómicos definidos para recuperar secuencias similares
disponibles. en la comparación usando BLASTX o BLASTP,
Una de las primeras etapas en este proceso recomendándose como parámetros óptimos E
es la de tratar de asignar una función molecu- valores menores de e-10, identidades mayores
lar a la mayoría de las secuencias incógnitas a 30% y coberturas mayores o iguales a 50%.
mediante la comparación con genes de función Las bases de datos contra las cuales se rea-
conocida. La forma más precisa para hacer lizan las comparaciones juegan también un rol
esta comparación es a nivel de productos de importante en relación al número y calidad de
genes, o sea, trabajando con las secuencias los “hits” recuperados. Algunas de las bases de
de aminoácidos obtenidas a partir de la tra- datos de nucleótidos y proteínas más utilizadas
ducción de las secuencias nucleotídicas a los para la anotación de secuencias de plantas son
seis marcos de lectura posibles. Este método los Índice de Genes (DFCI: http://compbio.dfci.
de comparación de secuencias, que es central harvard.edu/tgi/), Unigenes (NCBI) y PlantGDB

(http://www.plantgdb.org/). Las bases de datos que adjudica una numeración basada en una
de proteínas que se utilizan en general son: clasificación esquemática de enzimas según la
NR, SwissProt, Trembl, Uniprot, Uniprotsw, reacción que se encuentran catalizando y el
Uniprot-tr, Uniref100 y bases de proteínas de Consorcio KEGG (The Kyoto Encyclopedia of
proyectos específicos (Tabla 1). Genes and Genomes) que genera anotación
En base al mejor valor de similitud obteni- de vías metabólicas para aquellas especies
do en la comparación, se asigna una función que presentan su genoma secuenciado o en
génica probable a cada secuencia analizada. vías finalización. La anotación funcional basa-
Posteriormente, dicha anotación se mapea da en ontologías puede realizarse usando soft-
contra una base de datos de Gene Ontology ware libre por ejemplo Blast2GO o GOtcha.
para finalmente anotar los productos de ge-
nes acorde a las normas del Consorcio de Expresión de Genes
Ontología Génica (GO). Otros vocabularios El análisis de patrones de expresión consis-
controlados complementarios a GO, son la te en la identificación de todos los transcrip-
Comisión de Enzimas (Enzyme Comisión, EC) tos presentes en una determinada muestra
Tabla 1: Bases de datos genómicas específicas de especie.
Bases de datos generales URL
NCBI Plant Genomes Central www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html

PlantGDB: plant genome database www.plantgdb.org
MIPS plants databases mips.gsf.de/proj/plant/jsf/genomes.jsp
Bases de datos multiespecie para genómica comparativa
Phytozome: comparative genomics of plants www.phytozome.net

Gramene: a Resource for Comparative Grass Genomics www.gra mene.org
LIS: Legume Information System www.comparative -legumes.org
SALAD: Surveyed Alignment and Associating Dendrogram salad.dna.affrc.go.jp/salad
SGN: Solanaceas genomic network www.sgn.cornell.edu
Bases de datos de genomas de iniciativas genómicas
completas y parciales
TAIR: The Arabidopsis Information Resource www.arabidopsis.org

Rice Annotation Project Database (RAP -DB) rapdb.dna.affrc.go.jp
Grain Genes 2.0: a Database for Triticeae and Avena wheat. pw.usda.gov/GG2/index.shtml
MaizeDB www.maizegdb.org
Medicago truncatula: a model for legume research www.medicago.org
Lotus japonicus genome www.kazusa.or.jp/lotus
Wheat Applied Genomics masw heat.ucdavis.edu
SoyBase and the Soybean Breeder's Toolbox soybase.org
SoyMap: An integrated map of soybean for resolution and dissection
of multiple www.soymap.org/
Brassica rapa genome www.brassica -rapa.org/BRGP/index.jsp
Compositae genomics projec t compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php
Cotton Marker Database www.cottonmarker.org
Dendrome: a collection of forest tree genome databases and other
forest genetic dendrome.ucdavis.edu
International Grape Genome Project www.vitaceae.org
Popu lus Genome Integrative Explorer www.popgenie.db.umu.se
Bases de datos de diversidad
PanZea: Molecular and Functional Diversity of the Maize Genome www.panzea.org

ToL: Tree of Life Web Project www.tolweb.org

de tejido. El desarrollo de tecnologías de alto las actuales técnicas de secuenciación masiva
procesamiento de datos ha permitido abordar que prometen en un futuro cercano capacidad
estudios de expresión génica en forma concer- de procesamiento elevada a costos accesibles
tada para miles de genes a partir de distintos a la comunidad en general. Aún con el adveni-
genotipos en determinados órganos, tejidos, miento de proyectos genómicos de gran esca-
y condiciones de crecimiento. El diseño de los la, la secuenciación de ESTs permite la identifi-
experimentos de expresión, así como las he- cación de genes que se expresan en pocos te-
rramientas de análisis de la información gene- jidos y/o su expresión es muy baja, mediante la
rada constituyen factores claves para obtener construcción de colecciones de ADNc normali-
información con significado biológico. zadas o enriquecidas en determinados trans-
Las distintas estrategias que permiten eva- criptos como las colecciones derivadas de téc-
luar perfiles transcripcionales pueden dividirse nicas de hibridación sustractiva o “Suppressed
en dos grupos. Un primer grupo corresponde Subtracted Hybridization” Asimismo, el agru-
a estrategias en las que la estimación del ni- pamiento de ESTs derivados de distintas co-
vel de la expresión se basa en la intensidad lecciones de ADNc para una dada especie en
relativa de una señal de hibridación e incluye grupos o clusters de secuencias no redundan-
los tradicionales experimentos de northern blot tes, utilizando rutinas de análisis como las es-
y los microarreglos de ADNc, en los cuales se quematizadas en la Figura 1 permite estimar el
toma la intensidad relativa de la señal como número de genes de una especie.
medida de la trascripción. El otro grupo de Respecto al análisis de expresión génica,
estrategias se basa en una cuenta directa del los ESTs contribuyen a estos estudios a través
número de cada transcripto presente en una de dos vías: 1) la proporción de ESTs corres-
muestra, incluyendo la secuenciación de se- pondientes a un determinado gen respecto a
cuencias expresadas o “Expressed Sequence un conjunto de ESTs generados en distintas
Tags” (ESTs), el análisis de la expresión génica condiciones experimentales refleja el nivel de
en serie o “Serial Analysis of Gene Expresión” expresión del mismo; y 2) en segundo lugar las
(SAGE) y la secuenciación masiva en paralelo bases de ESTs se utilizan para el diseño de oli-
o “Massively Parallel Signature Sequencing” gonucleótidos en experimentos de microarre-
(MPSS). En este capítulo se discutirán las es- glos de ADNc para evaluar expresión génica.
trategias de análisis de expresión que permiten
la evaluación concertada de un gran número Los experimentos de microarreglos repre-
de genes en forma procesiva. sentan una de las herramientas más frecuen-
tes para aproximarse a los análisis de expre-
Expressed Sequence Tags (ESTs): sión de genes a gran escala. Una vez que se
La secuenciación de moléculas de ADN obtienen los resultados surgen interrogantes
complementario (ADNc) sintetizadas a partir como ¿Cuáles son los genes sobre o sub-ex-
de ARN mensajeros obtenidos de muestra bio- presados en el experimento?, ¿Cuáles son los
lógica en particular, realizada a través de una perfiles de expresión que pueden revelarse en
única lectura, da origen a un conjunto de se- general a partir de este experimento? En esta
cuencias denominadas ESTs, que representan sección ejemplificaremos un caso de estudio
secuencias parciales de las colecciones origi- para ilustrar el proceso de análisis utilizando
nales de ADNc. programas de libre distribución basados en el
Actualmente, la división EST de GenBank lenguaje estadístico R (Bioconductor).
cuenta con un total aproximado de 6.000.000 En el Instituto de Biotecnología de INTA
secuencias y se encuentran representadas Castelar (IB) se diseñó un microarreglo de
más de 100 especies de plantas. ADNc conteniendo 317 secuencias de tipo
La secuenciación de ADNc constituyó una ESTs previamente desarrollados en base a
herramienta alternativa de los proyectos genó- secuencias órgano-específicas de una línea de
micos para el descubrimiento de nuevos genes girasol cultivado). Para la impresión de los mi-
para distintas especies, cuando la secuencia- croarreglos de ADNc sobre soporte de vidrio,
ción de genomas complejos no contaba con se amplificaron por PCR los fragmentos re-

Figura 1: eBiopipeline. A. vista esquemática; B. página inicial, menú de programación y salidas
del programa.
presentativos de los unigenes anotados en las da de la misma para la posterior interpretación

bibliotecas previamente caracterizadas. Estos que se obtendrá como resultado.
microarreglos fueron hibridados con ARN total
de plantas crecidas en invernáculo y someti- Normalización
das a dos condiciones de estrés abiótico dife- La normalización es un término genérico que
renciales: frío y salinidad. Una vez impresos, se refiere a la resolución de errores sistemáti-
los vidrios fueron escaneados (usando cana- cos y desvíos producidos en un microarreglo
les para ambos fluoróforos) a tres intensidades debido a condiciones experimentales inevita-
diferentes, usando el lector de fluorescencia bles y propias de la plataforma utilizada. La
VersArray Chip Reader (BioRad). Las imáge- normalización y el análisis de expresión global
nes obtenidas fueron analizadas utilizando el se realizaron en este caso a través de pro-
programa de acceso libre Spotfinder (www. gramas generados utilizando el programa R
tm4.org/spotfinder.html), cuantificándose la in- (University of Auckland) a través de su versión
tensidad de señal para cada spot. Luego, se R 1.9.0 (http://www.rproject.org). Los datos de
realizó una integración de los datos de las imá- cada vidrio fueron normalizados corrigendo la
genes escaneadas (Figura 2). dependencia por intensidad mediante la utiliza-
ción del suavizador no paramétrico LOWESS
Preprocesamiento de los datos (regresión local ponderada). Se realizó una in-
La imagen obtenida a partir de un microarre- tegración de los datos de las réplicas técnicas
glo corresponde a la información cruda de un dentro de cada soporte (cada spot fue impreso
experimento de estas características. Es así 4 veces) y las réplicas técnicas entre sopor-
que los algoritmos computacionales convierten tes (intercambio de fluoróforos o “dye-swap”).
la imagen en información numérica que cuan- Luego de este paso el producto obtenido es
tifica dicha expresión: este es el primer paso una matriz de expresión génica cuyo análisis
en un análisis de datos de microarreglos, y es se focaliza en la identificación de genes con
fundamental la calidad y la rigurosidad obteni- expresiones diferenciales.

Figura 2: Imagen de una micromatriz de dos canales (Bello y col. 2006)

Limpieza de datos y transformación la tasa de falsos positivos, presentan a su vez
Una vez obtenida la matriz de expresión gé- la dificultad de generar una alta tasa de falsos
nica, existe una serie de pasos que se llevan a negativos. Por consiguiente, la metodología
cabo para asegurar una alta calidad en el aná- utilizada en este trabajo consistió en comple-
lisis. Ellos son: la remoción de spots dudosos o mentar las técnicas de inferencia clásicas con
conflictivos (flagged features), que se resuelve un criterio de selección basado en el ordena-
ya sea eliminando los spots con error aparente miento de genes y tratamientos en el espacio
(con el consiguiente riesgo de pérdida de da- generado por los dos primeros ejes principa-
tos valiosos), o marcándolos para luego refe- les obtenidos de un análisis de componentes
rirlos a la imagen original en el momento de su principales de la matriz de expresión génica.
análisis; la corrección y/o sustracción del ruido Posteriormente, y dentro del conjunto de genes
de fondo (corrección o sustracción de back- seleccionados en el paso anterior, se realizó el
ground). La señal de fondo es indicadora de reconocimiento de grupos de genes con perfiles
una hibridación inespecífica siempre y cuando de expresión similar mediante la aplicación de
la intensidad del spot de interés sea mayor que un algoritmo de clasificación no supervisada,
la intensidad del ruido de fondo. Si ocurre al k-centroides para nuestro caso de estudio. El
revés, existe la posibilidad que esté represen- análisis transcripcional mediante la aplicación
tando un problema local en el microarreglo y la de k-centroides permitió detectar 3 grupos de
intensidad del spot se convierta en información genes bien diferenciados en sus patrones de
no confiable; y por último la transformación lo- expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado
garítmica de los valores para hacer constante por 126 genes, no mostró variación en sus ni-
la variabilidad a todos los niveles de intensidad veles medios a través de los tratamientos. En
detectados. cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes)
evidenció sobre-expresión respecto del control
Análisis estadístico de los datos cuando las plantas fueron sometidas a estrés
(por frío o por salinidad). De manera análoga,
Evaluación de consistencia en las 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este
repeticiones caso se observó una sub-expresión respecto
Para evaluar las diferencias asociadas a las del control en ambos tratamientos.
repeticiones biológicas de este experimento se
obtuvo una ordenación de las mismas en un Obtención de la lista de genes
plano de ordenación generado mediante aná- diferencialmente expresados
lisis de componentes principales aplicado a la Para combinar esta aproximación, basada
matriz de expresiones génicas. Esta aproxima- en la ordenación de genes por ACP y el criterio
ción tuvo en cuenta la información de todos los clásico de prueba de hipótesis para igualdad
genes simultáneamente y permitió establecer de medias, se consideraron sólo aquellos ge-
si una repetición se comportaba de manera atí- nes que para la prueba clásica de análisis de
pica o no. la varianza tuvieran un p-valor menor o igual a
0,05 y que estuvieran a un distancia del origen
Identificación de grupos de genes con expre- en la Figura 3 mayor que 9 (correspondiente,
sión diferencial. aproximadamente al percentil 70 de la distribu-
El análisis de la matriz de expresión génica ción de distancias al origen). Este criterio de
se focalizó en la identificación de genes con ex- corte se seleccionó teniendo en cuenta el gen
presiones diferenciales. Existen diversas estra- T411 (Genbank AN BU671801), que había sido
tegias para obtener un listado de genes candi- previamente validado experimentalmente.
datos. La estrategia más sencilla es aplicar una Para cada uno de los 80 genes seleccio-
prueba de hipótesis tradicional gen a gen. Esta nados como genes candidatos se graficó el
aproximación tiene el inconveniente de gene- perfil de expresión según su comportamiento
rar un gran número de falsos positivos. Los en cada tratamiento a través de un gráfico de
métodos correctivos, basados en el control de colores de expresión diferencial (heatmap) de

Figura 3. Bi-plot que muestra genes con p-valor para un test F< 0,05 y con una distancia al origen < per-
centilo 70 de la distancia al origen de la distribución (círculos rellenos).
modo de analizar cualitativamente el gradiente dos para las condiciones evaluadas, producto
diferencial por tratamiento y por gen mediante final de un análisis de microarreglos.
un gráfico de perfiles de expresión individua-
les. De estos resultados surgieron genes can- Búsqueda de marcadores funcionales en
didatos de interés para su análisis de expresión bases de datos genómicos
diferencial, de los cuales 15 fueron selecciona- Como mencionamos anteriormente, la se-
dos para validar mediante la técnica de PCR cuenciación completa de los genomas de es-
cuantitativa (qPCR). pecies modelo o parcial de especies de interés
Este último paso de validación es de una ha generado una rápida acumulación de infor-
herramienta indispensable en el análisis de mación biológica que es depositada en bases
microarreglos ya que por todo lo expuesto de datos genómicas y es fácilmente accesible
anteriormente podemos inferir que los genes a través de Internet. Esta información, que de-
obtenidos son producto de transformaciones riva en muchos casos de la caracterización de
numéricas y una evaluación subjetiva al crite- líneas elite de una misma especie, de especies
rio estadístico aplicado. Es así que podemos de un mismo género o de distintas fuentes re-
concluir que la validación experimental confie- lacionadas, constituye el recurso que permite
re rigurosidad biológica a un conjunto de su- sistematizar el desarrollo de marcadores mo-
puestos genes candidatos obtenidos a partir de leculares potencialmente asociados a la varia-
una lista de genes diferencialmente expresa- ción fenotípica para caracteres de interés. El

potencial de descubrir marcadores molecu- se realizan los alineamientos base a base para
lares funcionales analizando las secuencias cada uno de los grupos de secuencias y los
depositadas en las bases de datos generales, mismos son analizados para detectar las dife-
fundamentalmente de ESTs, ha permitido su- rencias nucleotídicas o SNPs. La rigurosidad y
perar una de las limitaciones más importantes detallada evaluación de esta instancia es fun-
de los marcadores moleculares locus-específi- damental para encontrar verdaderas variantes
co que es el costo inicial de desarrollo. alélicas dentro de los diferentes grupos. Es
por ello que se encuentran disponibles diver-
Identificación in silico de SNPs sas herramientas estadísticas que permiten di-
Los polimorfismos de nucleótido simple ferenciar los errores de secuenciación de las
(SNPs) o los generados por pequeñas inser- verdaderas variantes alélicas basándose en
ciones/deleciones (Indels) se han convertido el valor de calidad de la base secuenciada y
en una de las herramientas más utilizadas en medidas de exactitud de la secuencia. Los
para la caracterización genética tanto de plan- programas desarrollados para la detección de
tas como de animales debido a su baja tasa de SNPs, tanto para uso académico (PolyBayes
mutación y a su gran abundancia, ubicuidad y y PolyPhred) como aquellos sujetos a licen-
dispersión en los genomas. Su uso se ha ex- cias comerciales (Sequencher, Gene Codes
tendido a aplicaciones tales como la construc- Corporation) utilizan los datos de calidad de
ción de mapas genéticos de alta resolución, secuencia para eliminar los falsos positivos o
mapeo de asociación, estudios de diversidad incorporan el concepto de velocidad de muta-
genética y conservación, identificación y análi- ciones esperadas para distinguir los verdade-
sis de la estabilidad de cultivares, delimitación ros SNPs. Asimismo, estos programas ofrecen
y asignación de grupos heteróticos, análisis fila ventaja de presentar una interfase gráfica
logenéticos, selección asistida por marcadores y pueden ser usados tanto para comparación
y caracterización de recursos genéticos. de secuencias cortas como para estimar SNPs
Un SNP representa una diferencia en una dentro de largas regiones genómicas. Muchos
base nucleotídica entre 2 secuencias de ADN grupos han explorado además métodos alter-
y puede ser categorizada como transición (C/T nativos de detección de SNPs basados en el
or G/A) o transversión (C/G, A/T, C/A, o T/G) de uso de microarreglos de ADN de alta densidad.
acuerdo a la sustitución nucleotídica observa-
da. El uso de marcadores SNP para cualquiera Identificación in silico de SSRs
de las aplicaciones mencionadas requiere de Los microsatélites (repeticiones en tandem
una primera etapa de detección y desarrollo de mono, di, tri, tetra o pentanucleótidos) son
que puede ser abordada a partir de una estra- herramientas muy útiles como marcadores
tegia “de laboratorio” (ej. secuenciación y com- genotípicos debido a que son relativamente
paración de genes o regiones candidatas en un abundantes, multialélicos (hipervariables con
conjunto de materiales de interés) o bien estar respecto al número de repeticiones), hereda-
basada en aproximaciones in silico que hacen dos en forma estable y codominantes (se dis-
uso de la información de secuencia disponible tinguen los alelos de un locus), permitiendo
en las bases de datos biológicas. En este úl- distinguir materiales estrechamente relaciona-
timo caso, el procedimiento de búsqueda ge- dos. Desde el punto de vista metodológico, son
neralmente involucra un protocolo de pocos fáciles de detectar mediante PCR, requiriendo
pasos. Primero se identifican secuencias con poca cantidad de ADN para el análisis y poco
alta similitud entre múltiples individuos a partir equipamiento.
de una o varias bases de datos previamente La identificación in silico de SSRs a partir de
seleccionadas en función del organismo o tipo la abundancia de secuencias genómicas dis-
de carácter que se desee estudiar, utilizando ponibles para genomas vegetales, al igual que
habitualmente los algoritmos de búsqueda de para los SNPs, se ha convertido en la alterna-
similitud de secuencias de tipo BLAST (Basic tiva más económica de desarrollar este tipo
Local Alignment Search Tool). Posteriormente, de marcadores haciendo uso de herramientas

computacionales eficientes. Asimismo, es muy plemento de las aproximaciones convenciona-
frecuente poder asociar una función molecular les (ej. Mapeo de QTLs) y han ido cobrando
determinada por similitud a la secuencia que cada vez más importancia como herramientas
alberga la repetición convirtiéndolo en un mar- para alcanzar un mayor grado de resolución.
cador funcional. En pocas palabras, el razonamiento subyacen-
Existen distintas herramientas computa- te al mapeo de asociación consiste en utilizar
cionales basadas en la web para el descubri- eventos de recombinación históricos a lo largo
miento de SSRs y el diseño de iniciadores es- de un linaje, y no solamente aquellos ocurridos
pecíficos para la amplificación de los mismos. en una determinada población de mapeo, para
Se pueden mencionar como ejemplos el pro- establecer posibles relaciones entre genotipo
grama SSRPoly accesible desde el sitio http:// y fenotipo. Los polimorfismos responsables de
acpfg.imb.uq.edu.au/ssrpoly.php, que permite la variación fenotípica no son observados en
la identificación de SSR polimórficos que se forma directa, si no que surgen a partir de in-
distinguen de las variantes monomórficas por ferencia estadística. La base para la detección
la representación de tamaños variables del mide tales correlaciones es la asociación no alea-
crosatélite identificado en alineamientos múlti- toria entre un polimorfismo dado y la variación
ples de secuencias representadas en la bases fenotípica para cierto rasgo de interés, es decir
de datos. Otra herramienta valiosa disponible la identificación de desequilibrio de ligamiento
en la web es CUGI SSR Server (http://www.ge- (DL) entre las variantes genéticas causales de
nome.clemson.edu/cgi-bin/cugi_ssr). la variación del carácter y los polimorfismos
analizados.
Análisis de la variabilidad genética Previo a cualquier estudio de mapeo por aso-
Finalizada la etapa de desarrollo de marca- ciación, y para realizar un diseño experimen-
dores moleculares, la fase siguiente general- tal apropiado, es necesario conocer el grado
mente consiste en la genotipificación de gran- y la estructura genómica del DL en la especie
des cantidades de individuos a fin de determinar a evaluar, ya que éste es variable tanto entre
las variantes alélicas presentes en cada uno de especies como para las diferentes regiones de
ellos para cada uno de los marcadores detec- un mismo genoma. Las dos medidas preferi-
tados. La elección de la metodología mas apro- das en la literatura para cuantificar DL son el
piada dependerá de los recursos disponibles y coeficiente de desequilibrio estandarizado (D’)
del nivel de procesamiento que se desee al- y la correlación de frecuencias alélicas al cua-
canzar. Entre las más utilizadas para el caso de drado (r2). La estimación del DL generalmente
los SNPs pueden mencionarse: secuenciación involucra grandes cantidades de marcadores,
directa, amplificación alelo-especifica por reac- razón por la cual suelen resultar útiles las he-
ción en cadena de la polimerasa (PCR), mé- rramientas de software que permiten sistemati-
todos de digestión enzimática, hibridación con zar el cálculo de ambas medidas y representar
oligonucleótidos alelo-específicos, y por último gráficamente las asociaciones halladas (por
las plataformas de microarreglos GoldenGate ej.: DNAsp, Arlequin, Gold, GoldSurfer).
e Infinium desarrolladas por Illumina (Illumina, El desarrollo de un estudio de mapeo por
San Diego, CA, USA). asociación involucra la evaluación fenotípica
La tecnología de SNPs presenta un gran po- del carácter agronómico de interés (ej. peso
tencial para la identificación de las formas aléli- del grano, contenido de aceite, días a flora-
cas que controlan procesos biológicos comple- ción, AUDPC, etc) y la genotipificación de un
jos, como la resistencia a los estreses bióticos conjunto apropiado de SNPs para cada una de
y abióticos que afectan la productividad de los las entidades a comparar (líneas, variedades,
cultivos. Sin embargo, para ser aprovechado etc). El número y naturaleza de los polimorfis-
en su totalidad, este potencial debe ser com- mos a caracterizar dependerá de la estrategia
binado con metodologías analíticas apropia- de análisis que se haya seleccionado. Si se
das. En los últimos años las metodologías de desea explorar todo el genoma (genome-wide
mapeo por asociación han surgido como com- analysis) el número de SNPs será mucho ma-

yor (entre 10.000 y 100.000) que el requerido Lecturas recomendadas
si sólo se estudian los polimorfismos corres-
pondientes a un grupo de genes candidatos. Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and
Sin embargo, en este último caso es necesario D.J. Lipman. 1990. Basic local alignment search
un conocimiento previo de la base genética del tool. J Mol Biol 215:403-10.
carácter fenotípico en estudio. Otro aspecto Ashburner, M., C.J. Mungall, and S.E. Lewis. 2003.
Ontologies for biologists: a community model for
importante del diseño experimental es la selec-
the annotation of genomic data. Cold Spring Harb
ción de individuos. En humanos generalmente Symp Quant Biol 68:227-35.
es la utilización de metodologías basadas en Ashburner, M., C.A. Ball, J.A. Blake, D. Botstein, H.
poblaciones de enfermos vs. controles sanos Butler, J.M. Cherry, A.P. Davis, K. Dolinski, S.S.
(case-control) o aquellas que involucran indi- Dwight, J.T. Eppig, M.A. Harris, D.P. Hill, L. Issel-
viduos relacionados o familias en donde algún Tarver, A. Kasarskis, S. Lewis, J.C. Matese, J.E.
individuo es enfermo (Transmission disequi- Richardson, M. Ringwald, G.M. Rubin, and G.
librium tests). En plantas, los individuos de la Sherlock. 2000. Gene ontology: tool for the unifi-
población en estudio usualmente incluyen ger- cation of biology. The Gene Ontology Consortium.
moplasma de distinto origen geográfico con el Nat Genet 25:25-9.
Bairoch, A. 2000. The ENZYME database in 2000.
objeto de abarcar la mayor cantidad posible de
Nucleic Acids Res 28:304-5.
variación genética y fenotípica. Bairoch, A., and R. Apweiler. 1996. The SWISS-
Las inferencias estadísticas del mapeo por PROT protein sequence data bank and its new
asociación para rasgos continuos son general- supplement TREMBL. Nucleic Acids Res 24:21-5.
mente realizadas a través de análisis de regre- Balding, D.J. 2006. A tutorial on statistical methods
sión lineal, si bien también son aplicables otras for population association studies. Nat Rev Ge-
aproximaciones. Dado que existen diversos net 7:781-91.
factores que pueden llevar al establecimiento Cervigni, G.D., N. Paniego, M. Diaz, J.P. Selva, D.
de asociaciones espurias, se han desarrolla- Zappacosta, D. Zanazzi, I. Landerreche, L. Mar-
do modelos específicos en donde es posible telotto, S. Felitti, S. Pessino, G. Spangenberg,
and V. Echenique. 2008. Expressed sequence
incorporar las distintas variables intervinien-
tag analysis and development of gene associ-
tes y controlar su efecto en la detección de ated markers in a near-isogenic plant system of
asociaciones. Entre los procesos que pueden Eragrostis curvula. Plant Mol Biol 67:1-10.
interferir en el análisis se encuentran: la sub- Conesa, A., and S. Gotz. 2008. Blast2GO: A Com-
estructuración de las poblaciones estudiadas, prehensive Suite for Functional Analysis in Plant
las interacciones epistáticas y pleiotrópicas, Genomics. Int J Plant Genomics 2008:619832.
las interacciones entre genotipo y ambiente, el Diatchenko, L., Y.F. Lau, A.P. Campbell, A.
tamaño muestral pequeño, la complejidad del Chenchik, F. Moqadam, B. Huang, S. Lukyanov,
carácter en estudio y la calidad de los registros K. Lukyanov, N. Gurskaya, E.D. Sverdlov, and
fenotípicos. El software Tassell es uno de los P.D. Siebert. 1996. Suppression subtractive hy-
bridization: a method for generating differentially
paquetes más utilizados para los estudios de
regulated or tissue-specific cDNA probes and li-
asociación en plantas ya que incluye metodolo- braries. Proc Natl Acad Sci U S A 93:6025-30.
gías que permiten tener en cuenta la estructura Fernandez, P., N. Paniego, S. Lew, H.E. Hopp, and
poblacional y el grado de parentesco entre los R.A. Heinz. 2003. Differential representation of
individuos analizados. sunflower ESTs in enriched organ-specific cDNA
En conclusión, el mapeo por asociación libraries in a small scale sequencing project.
constituye una poderosa herramienta para la BMC Genomics 4:40.
disección genética de caracteres complejos, Fernandez, P., J. Di Rienzo, L. Fernandez, H. Hopp,
siendo los SNPs marcadores ideales para la N. Paniego, and R. Heinz. 2008. Transcriptomic
implementación de tales estudios dada su alta identification of candidate genes involved in sun-
flower responses to chilling and salt stresses
frecuencia y ubicuidad en los genomas.
based on cDNA microarray analysis. BMC Plant
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Gupta, P.K., J.K. Roy, and M. Prasad. 2001. Single
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Barker. 2003. The Protein Information Resource.
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PARTE II
Métodos para generar
y analizar diversidad

II CAPÍTULO 1 (células papilares del estigma) que permiten
su adhesión, hidratación y germinación, ex-
Polinización y fertilización in vitro tendiendo su intina y generando un tubo po-
línico, cuya función es transportar las células
Susana Cardone, Gladys Pérez Camargo, espermáticas hacia el óvulo. En ese momento
Aurora Picca se desorganiza el núcleo vegetativo mientras
que la célula generativa dará lugar a las dos
1 Introducción células espermáticas que se vuelcan en una
Durante la reproducción sexual de las An- de las sinérgidas, ésta se desorganiza y uno
giospermas los procesos de polinización y fe- de los núcleos espermáticos se fusiona con la
cundación conducen a la unión de las gametas oósfera para dar el cigoto, que luego producirá
masculina y femenina para formar el embrión, el embrión. El otro núcleo masculino se reunirá
que junto con el endosperma darán origen a la con dos núcleos femeninos para dar la célula
semilla, que generará una nueva planta. La fe- madre del endosperma que es, por lo tanto, tri-
cundación contribuye a la diversidad genética ploide (Fig 1).
y proporciona la base sobre la que se trabajará Durante la evolución de las plantas supe-
en fitomejoramiento. riores, surgieron diferentes barreras de cruza-
El hecho más notable de la fertilización in miento que controlan la transferencia de genes
vivo de las Angiospermas es el de la “doble de una especie a otra o dentro de la misma
fecundación”, que es un fenómeno muy com- especie.
plejo en comparación con lo que acontece en A veces, el polen no puede germinar sobre el
todos los demás seres vivos. Para que la poli- estigma de la flor aunque éste se halle recep-
nización se produzca, durante el desarrollo in tivo. Este hecho puede deberse a limitaciones
vivo, deben ocurrir una serie de interacciones genéticas o fisiológicas. Estas barreras se de-
y señales entre el grano de polen y los diferen- nominan de prefertilización o precigóticas y
tes tejidos del pistilo. El grano de polen hace pueden ser eludidas mediante las técnicas de
contacto con las células receptivas del pistilo polinización in vitro.
Figura 1. Corte longitudinal de un óvulo mostrando la doble fecundación en Angiosperma

Otras veces, a pesar de la ocurrencia de la proyectos de genómica, posibilitarán una me-
polinización, la fecundación no puede llevarse jor comprensión de los procesos de reconoci-
a cabo, por diversos motivos. El término “ferti- miento gamético, fusión y activación de seña-
lización in vitro” se utiliza para aquellos casos les intracelulares que participan en los eventos
donde la fusión de las gametas aisladas se lo- tempranos de desarrollo del huevo y formación
gra por distintos métodos como la electrofusión, del cigoto. Estos conocimientos permitirán una
altas concentraciones de calcio o elevado pH. aplicación más eficiente de estas técnicas en
En este capítulo se utilizarán indistintamen- los programas de fitomejoramiento.
te los términos “fecundación” y “fertilización”
como sinónimos, refiriéndose a la unión de las 2 Polinización in vitro
gametas masculina y femenina para originar En algunas especies, las barreras de pre-
un nuevo individuo. fertilización impiden la autofecundación o
En ocasiones, la fecundación ocurre normal- el cruzamiento, por diferentes mecanismos
mente pero el embrión aborta en forma pre- genéticos o bioquímicos. La incapacidad del
coz. Esto es lo que se conoce como barreras polen de germinar en estigmas propios o ex-
posfertilización o poscigóticas, que pueden traños se denomina incompatibilidad. Esta
contrarrestarse con técnicas de rescate em- puede deberse a varias razones: por ejemplo
brionario. que el tubo polínico se deshaga en el estilo, o a
Frente a todas estas limitaciones, las técni- la incapacidad del tubo polínico para alcanzar
cas de cultivo in vitro y manipulación de célu- el óvulo debido a una lenta velocidad de creci-
las aisladas resultan apropiadas para lograr el miento, o a una excesiva longitud del estilo. En
proceso completo de desarrollo del embrión estos casos, el ovario aborta antes de que el
y del endosperma y la obtención de semillas tubo polínico alcance la base del estilo.
normales. Una de esas técnicas, desarrollada Las barreras que obstaculizan los cruza-
por Kanta y colaboradores (1962), demostró mientos interespecíficos no son demasiado co-
que en algunas especies de Papaveráceas los nocidas, aunque es evidente la existencia de
granos de polen tenían la capacidad de germi- interacciones en el proceso de reconocimiento
nar in vitro, directamente sobre los óvulos en polen-pistilo. Los mecanismos que originan la
cultivo. A partir de la misma, surgen una serie imposibilidad de los cruzamientos intraespecí-
de metodologías que se conocen en general ficos son mucho más conocidos. Por ejemplo,
como técnicas de polinización in vitro. el de la autoincompatibilidad, que involucra
Las técnicas de micromanipulación desa- interacciones polen-pistilo que determinan la
rrolladas durante los años 80 permitieron el inhabilidad de una planta hermafrodita para
aislamiento y la fusión in vitro de gametas de producir cigotos, a través de la autopoliniza-
Angiospermas. La combinación de estas técni- ción. En este sistema, el intercambio de infor-
cas con métodos de cultivo de células únicas, mación entre el polen y el tubo polínico per-
posibilitaron la fertilización in vitro. Se pudo mite al estigma y al estilo discriminar el polen
entonces concretar el desarrollo de cigotos de plantas idénticas del proveniente de otros
y de endospermas en forma individual, in vi- miembros de la misma especie.
tro, demostrando que son capaces de autoor- Existen dos grandes sistemas de autoin-
ganizarse en cultivo, independientemente del compatibilidad, que se diferencian en sus es-
tejido materno. Tanto los cigotos obtenidos in trategias moleculares y genéticas:
vitro como los que son aislados después de la
polinización in vivo desarrollan en embriones a) autoincompatilidad esporifítica, en ella,
normales y posteriormente en plantas fértiles. el resultado de la polinización está detemina-
Los sistemas de polinización y fertiliza- do por el genotipo de la planta en la que se
ción in vitro pretenden salvar las barreras pre ha formado el grano de polen. En este tipo de
y postfertilización para obtener plantas férti- incompatibilidad, presente en la familia de las
les. Los recientes progresos relacionados con Brasicáceas, proteínas de bajo peso molecu-
estas metodologías, conjuntamente con los lar provenientes del polen, difunden desde la

exina e interactúan de manera alélica con un • El injerto del estilo, en la cual los gra-
receptor quinasa, localizado en las células del nos de polen germinan en un estilo com-
estigma. Dicha interacción estimula la activi- patible y luego se los une al ovario de la
dad fosforilante del receptor y se produce el planta madre que se desea fertilizar.
bloqueo de la hidratación específica del grano
de polen, impidiendo su germinación. • La polinización de óvulos aislados que
se cultivan directamente sobre el medio
b) autoincompatibilidad gametofítica en la de cultivo. En esta técnica los óvulos son
cual, la ocurrencia de la polinización está de- separados de su placenta; por esta cau-
terminada por el genotipo haploide del polen. sa es un procedimiento mucho más com-
Bajo este sistema se encuentran dos mecanis- plicado, que ha sido empleado con éxito
mos diferentes: sólo en pocas especies de plantas.
• Uno es típico de las Papaveráceas. En • La polinización placental, técnica en

este, las señales de autoincompatibili- la cual los óvulos se ponen en contacto
dad se traducen por medio de proteínas, con el polen por remoción de la pared
codificadas por un gen específico, que del ovario o a través de un corte en la
generan la movilización del calcio, fosfo- parte superior del mismo. En esta meto-
rilando proteínas del polen que desenca- dología los porcentajes de supervivencia
denan la muerte celular del tubo polínico. son muy buenos, ya que los óvulos no
resultan dañados durante las manipula-
• En el otro mecanismo, presente en Sola- ciones involucradas en su aislamiento.
náceas, un locus específico, el locus S, El cultivo del óvulo junto con la placenta
codifica para RNAsas que actúan sobre incrementa, en general, las posibilidades
los tubos polínicos degradando al ARN del de un rápido desarrollo embrionario.
polen propio, inhibiendo su crecimiento.
La polinización placental in vitro se ha
Para sortear estas incompatibilidades sur- utilizado con éxito para salvar las barreras de
gieron técnicas de polinización in vitro. La incompatibilidad precigóticas (autoincompati-
primera, desarrollada en Papaver somniferum, bilidad e incompatibilidad interespecífica), en
ha sido también empleada exitosamente en 14 varias especies, inclusive cuando, experimen-
familias de Angiospermas, resultando más ade- talmente, se intentó el cruzamiento a partir de
cuada su aplicación en aquellas especies que óvulos de Angiospermas con polen provenien-
poseen ovarios grandes y que contienen mu- te de Gimnospermas. En este caso, al realizar-
chos óvulos. Dentro de las especies de plantas se el análisis embriológico de los óvulos de la
en las que se abordó la técnica se pueden citar especie Melandrium album, fijados tres días
Dianthus caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. después de la polinización con polen de Pinus
rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia ca- wallihiana, se observó la presencia de rema-
lifornica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y nentes de tubos polínicos y embriones bicelu-
Dicranostigma franchetianum. lares en los sacos embrionarios.
Bajo el nombre de “polinización in vitro”
se suele englobar a varias metodologías que • La polinización con polen mentor Se
surgieron a partir de modificaciones del proce- ha utilizado, en muchas especies de
dimiento inicial, que si bien poseen puntos en plantas, una estrategia para salvar las
común, difieren en otros. Entre estas metodo- barreras de incompatibilidad, involucran-
logías se encuentran: do mezclas de polen no compatible con
polen compatible muerto (denominado
• La polinización estigmática, que con- “mentor”). El rol del polen mentor es pro-
siste en cultivar el pistilo in vitro y colocar veer alguna función, por ejemplo, a tra-
el polen sobre el estigma. vés del aporte de sustancias proteicas,

las que facilitan la polinización del polen repitió luego con éxito en varias especies de
incompatible. Alguna de las especies en Angiospermas. Para el aislamiento de gametas
las que se ha utilizado son: Populus, Ma- femeninas existe un método que se emplea a
lus, Petunia y Nicotiana. menudo y que consiste en un tratamiento con
enzimas diluídas para disolver las paredes ce-
Finalmente, en todos los casos, la gameta lulares, acompañado de la micromanipulación
femenina es fecundada por células espermá- para separar las otras células del saco embrio-
ticas, liberadas por el tubo polínico, en forma nario.
“casi” idéntica a la vía natural, con la consi- En 1991, Kranz y col. reportaron la primera
guiente formación de semilla normal en un fusión de gametas de maíz in vitro, pudiendo
medio de cultivo apropiado. En general, todos reproducirse actualmente en esta especie el ci-
los medios de cultivo para germinación de los clo de vida completo, comenzando con la elec-
granos de polen poseen altas concentraciones trofusión de la célula espermática con la ovo-
de sacarosa y de ácido bórico. célula, dando como resultado un cigoto, un em-
No obstante, para que los procedimientos brión y finalmente una planta. Pese a que se ha
anteriormente citados sean exitosos es crucial tomado al maíz como sistema vegetal modelo,
realizar el aislamiento de los óvulos y del polen en el cual estudiar los procesos de fusión de
en el estado fisiológico adecuado, por lo que gametas y posterior embriogénesis, también
es indispensable llevar a cabo la determinación se han realizado trabajos exitosos de fusión
de la duración de los distintos estadios del de- de gametas en trigo, donde Kovacs (1995) lo-
sarrollo de ambos, como por ejemplo: gró la fusión de gametas in vitro, obteniendo
como resultado estructuras multicelulares y en
a) Determinar los tiempos de antesis, dehis- algunos casos del tipo de microcallos. En los
cencia de las anteras y polinización, b) Precisar últimos años se ha logrado finalmente la fusión
el momento en que el estigma esté receptivo, de gametas en Nicotiana tabacum, la que pu-
c) Especificar el instante oportuno para la po- diendo ser una especie modelo en dicotiledó-
linización y d) Establecer el tiempo adecuado neas para estudiar la fertilización in vitro, dada
para recoger el polen. su capacidad para la regeneración de plantas,
presenta sin embargo el inconveniente de que
3 Fertilización in vitro las gametas no se fusionan fácilmente.
Durante años los científicos intentaron imitar Tradicionalmente, se consideró que todas
los mecanismos de fecundación que aconte- las células espermáticas tenían igual posibili-
cen in vivo, utilizando técnicas de fertilización dad de fusionarse con la célula huevo. Sin em-
in vitro de gametas aisladas; esta aplicación bargo, actualmente se sabe que existen meca-
fue más sencilla en animales y en plantas in- nismos de fusión preferencial a nivel gamético,
feriores pero no pudieron ser aplicadas a las donde un determinado morfotipo de célula es-
plantas superiores hasta comienzos de la dé- permática es reconocido. Cuando está presen-
cada de los noventa. Esto se debió a que la te este mecanismo hay una identificación de
fertilización in vivo en las plantas superiores es las dos células espermáticas, candidatas para
un proceso muy diferente al que ocurre en los la fusión celular y una elección de la que se fu-
sistemas animales y de plantas inferiores, don- sionará con la ovocélula. La discriminación se
de las gametas son de vida libre. basa en las diferencias de las células espermá-
ticas respecto de su heteromorfismo citoplas-
El primer aislamiento de células espermáti- mático en: tamaño, forma, volumen, superficie,
cas vivas fue reportado por Cass en 1973, en contenido de organelas y asociación física con
el cuál se aislaron gametos masculinos de ce- el núcleo vegetativo. Por otro lado, el contacto
bada por ruptura de granos de polen en una del polen con el gameto femenino parece esti-
solución de sacarosa al 20%. A partir de este mular la maduración del mismo, incluyendo la
aislamiento se pudieron describir las carac- acumulación de calcio necesaria, la organiza-
terísticas celulares de ese gameto. Esto se ción de la célula huevo, la migración nuclear,

y la progresión del ciclo celular. Este último
factor parecería ser crítico en la combinación
exitosa de gametas. Además, hay señales, su-
ministradas por el saco embrionario, que per-
miten estimular el crecimiento y la maduración
del tubo polínico.
Para que la fertilización tenga lugar, in vitro,
no sólo deben aislarse las gametas femeninas
y masculinas sino que deben ser inducidas a fu-
sionarse, en ausencia de las células asociadas.
Para obtener un embrión in vitro, los pasos a
seguir son los siguientes:
Aislamiento y selección de las gametas

Se han desarrollado métodos de aislamiento y
selección de gametas para una amplia varie-
dad de especies vegetales, entre ellas: maíz
(Zea mays), trigo (Triticum aestivum), cebada
(Hordeum vulgare), raygrass (Lolium perenne)
y algunas brasicáceas. A fin de realizar eficien-
temente este paso se debe:
Conocer exhaustivamente la morfología flo-
Figura 2. Fertilización in vitro mediante electrofu-
ral de la especie a utilizar, con el objetivo de sión
ubicar el saco embrionario y sus células cons-
tituyentes. b) Aislar las gametas masculinas, a
partir de los granos de polen mediante choque una solución con células nodrizas y algunos de
eléctrico, osmótico y/o de pH. c) Aislar el saco ellos desarrollarán en proembriones.
embrionario y las gametas femeninas median-
te microdisección individual en asociación con Fusión de las gametas. En maíz, la secuen-
maceración enzimática. cia de eventos para que se verifique la fusión in
Este paso es crítico y limitante ya que pue- vitro es la siguiente: las gametas masculinas se
den obtenerse pocas gametas femeninas y el obtienen a partir de granos de polen fresco so-
proceso de manipulación es muy delicado. El metidos a un “shock” de pH en una solución 0,5
tratamiento de las espigas, previo a la poliniza- M de manitol. Las ovocélulas y los protoplastos
ción con 2,4-D, que induce a la expansión del de las células centrales del saco embrionario
ovario, facilita el proceso resultando en ovarios se aislan de los óvulos por tratamiento con en-
más grandes y óvulos más blandos, incremen- zimas celulolíticas y microdisección manual.
tando la eficiencia en el aislamiento de las ovo- Las dos gametas aisladas se colocan de a
células. pares, bajo condiciones de esterilidad, en un
medio de fusión simple compuesto por manitol
Fertilización in vitro propiamente dicha y cloruro de calcio (CaCl2). Para realizar este
Puede realizarse mediante la microinyección procedimiento se utilizan microagujas de vidrio
de células espermáticas o núcleos espermáti- que permiten poner en contacto las gametas
cos aislados, en células individuales obtenidas femeninas y masculinas, a fin de facilitar y di-
de los sacos embrionarios, o por electrofusión. rigir la fusión. La adhesión y posterior fusión
En este último caso las gametas se ponen en de las gametas es rápida (aproximadamente
contacto en una cámara de electrofusión por 10 segundos). A los 20 minutos de realizada
alineación dielectroforética y se fusionan me- la fusión, deja de visualizarse el núcleo mas-
diante pulsos eléctricos (Fig. 2). Los productos culino y 20 horas después es posible observar
de fusión pueden ser entonces cultivados en mediante microscopio óptico, con contraste de

fases la presencia de dos núcleos, de manera El óvulo presenta una gran cantidad de re-
similar a lo que se observa in vivo. querimientos nutricionales, que varían con el
La formación del endosperma ocurre cuando estadio de desarrollo del mismo y que es nece-
se fusiona el núcleo de la célula espermática sario identificar para cada especie en particu-
con los dos núcleos polares. Los estudios in lar. Por consiguiente un aspecto fundamental
vitro, sobre los primeros eventos después de a tener en cuenta en el rescate de embriones
la fusión de las células y núcleos, indican que es la selección correcta del medio de cultivo
las primeras células del endosperma resultan- adecuado para cumplir con los requerimientos
te desarrollan un tejido característico capaz de durante las distintas etapas del desarrollo em-
auto-organizarse en forma separada del tejido brionario, siendo necesario a veces la transfe-
materno. Este proceso se completa, en esta rencia de los embriones de un medio de cultivo
especie, aproximadamente dos horas después a otro para garantizar un óptimo crecimiento.
de la fusión in vitro de las células que forman Se pueden reconocer dos fases en el desa-
el embrión. rrollo embrionario con respecto a la nutrición:
4 Cultivo de óvulos y embriones in vitro • la fase heterotrófica en la que el em-

El cultivo de óvulos es un procedimiento brión es dependiente del endosperma y
muy complejo debido a que la manipulación demás tejidos maternos que lo rodean, y
del material es difícil. El óvulo es una estructu- • la fase autotrófica, en la cual el em-
ra delicada, muy pequeña, altamente hidrata- brión es capaz de sintetizar las sustan-
da, que puede ser dañada con suma facilidad. cias requeridas para su crecimiento a
Es imprescindible realizar la microcirugía con partir de sales minerales y azúcares. La
rapidez para evitar que los tejidos sufran de- etapa crítica de pasaje de una fase a otra
secación durante el proceso. Pese a las dificul- varía con las especies.
tades de la técnica, en algunos cruzamientos
interespecíficos como los realizados en papa, La introducción de agua de coco y extrac-
algodón y Hevea brasiliensis, se comprobó que tos de endospermas en el medio de cultivo han
el cultivo de óvulos completos es más exitoso sido muy útiles ya que activan el crecimiento
para el rescate de embriones que el cultivo de y desarrollo de los embriones en el cultivo de
los embriones aislados. óvulos de algunas especies vegetales. Por otro
El rescate de embriones consiste en aislar lado, no existe demasiada evidencia acerca de
los embriones de los óvulos de una planta y la absoluta necesidad de los reguladores de
cultivarlos en un medio estéril que contenga los crecimiento para el desarrollo de los embriones
nutrientes esenciales que les permita concluir extraídos, sean inmaduros o maduros, excepto
su desarrollo normal. Esta técnica es relati- en el rol que cumplen en la ruptura de la dor-
vamente fácil de llevar a cabo en embriones mición.
maduros y sus posibilidades de éxito son muy La concentración osmótica es un factor im-
buenas. Las dificultades se incrementan cuan- portante en el desarrollo de óvulos y embrio-
nes, dependiendo del estado de madurez de los
to más inmaduro sea el embrión a rescatar, ya
mismos. La sacarosa presente en los medios
que los requerimientos nutricionales son más
de cultivo no sólo provee la fuente de carbono
específicos en las etapas tempranas de desa-
necesaria para el crecimiento sino que además
rrollo del embrión.
mantiene la osmolaridad requerida para cada
etapa del desarrollo. Está demostrado que una
Factores externos que condicionan el presión osmótica elevada previene la germi-
cultivo de óvulos y embriones nación precoz de los embriones inmaduros,
evitando así la ocurrencia de malformaciones
Entre los factores externos más importantes estructurales. A medida que van creciendo, los
que afectan el cultivo de óvulos y de embriones embriones necesitan ser transferidos a medios
se citan: el medio de cultivo, la osmolaridad y con progresivas disminuciones en los niveles
los reguladores de crecimiento. de sacarosa.

Respecto de los requerimientos de tempera- ratura tuvo un efecto positivo en el crecimiento
tura, los embriones de la mayoría de las espe- de la progenie en condiciones de frío, logrando
cies presentan un buen crecimiento en un ran- acumular más peso seco que en progenies ob-
go de temperaturas que va de los 25º C a los tenidas sin la selección previa del polen.
30º C. Aunque algunos estudios indican que El cultivo de óvulos y de embriones vege-
la luz no es crítica para el crecimiento de los tales se emplea en mejoramiento vegetal cuan-
embriones, se demostró que en el caso de la do se desea: rescatar embriones abortivos de-
cebada la luz disminuye las probabilidades de rivados de la hibridación interespecífica o inter-
germinación precoz en los embriones inmadu- genérica, superar problemas de abscisión pre-
ros. Entre los medios de cultivo más difundidos coz del fruto, recuperar embriones de cruzas
para el cultivo de óvulos y embriones se pue- interespecíficas que conducen a la obtención
den citar el de Murashige y Skoog (1962), Mon- de haploides y acortar el período de latencia
nier (1976), Randolph y Cox (1943), Gamborg que ocurre en algunas semillas por presen-
y col. (1976), Liu y col. (1993). tarse, en el endosperma o en la cubierta de la
misma, inhibidores del desarrollo del embrión.
5 Aplicaciones de las Técnicas de Los siguientes ejemplos ilustran las diversas
Fertilización in vitro aplicaciones:
5.1 Aplicaciones en el Mejoramiento Durante la producción comercial del tritica-

Genético Vegetal le, especie obtenida artificialmente mediante
Las técnicas antes mencionadas han sido el cruzamiento de trigo y centeno, el cultivo
utilizadas para salvar algunos obstáculos que o rescate de embriones se utilizó para supe-
rar el alto grado de incompatibilidad del cruza-
se le presentan al mejorador de plantas cuan-
miento inicial, ya que los embriones abortaban
do desea realizar cruzamientos, para el logro
en estadios tempranos del desarrollo debido a
de ciertos objetivos de mejoramiento. A conti-
una incompatibilidad con el endosperma. Esta
nuación se mencionan ejemplos de aplicación
técnica y la aplicación de colchicina en plantas
de las metodologías de polinización y fertiliza-
híbridas, fueron de fundamental importancia
ción in vitro:
para salvar los problemas que se presentaron
En algunas combinaciones de cruzamientos,
en el cruzamiento inicial y la marcada esteri-
la polinización placental in vitro permitió que
lidad que poseía la F1. El perfeccionamiento
se superen las barreras de incompatibilidad de estas dos metodologías fue decisiva para
precigótica, obteniéndose embriones híbridos la producción de un gran número de triticales
y aún plantas híbridas, imposibles de obte- hexaploides y octoploides, cruzando el centeno
ner mediante técnicas convencionales. Así se con trigos duros y harineros, respectivamente,
realizaron los cruzamientos de las siguientes logrando finalmente un alto grado de fertilidad.
especies: Zea mays x Z. mexicana, Nicotiana
tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album Las técnicas de rescate de embrionario son
x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta. necesarias como complemento en la produc-
La polinización in vitro se empleó también ción artificial de haploides. En ellas, se cultivan
como vía para la obtención de plantas resisten- embriones que se forman por partenogénesis
tes a estreses ambientales, ya que permite se- o por eliminación de cromosomas luego de la
leccionar para la fecundación aquellos granos hibridación interespecífica o intergenérica. En
de polen que tuvieron capacidad de germinar algunos casos los embriones haploides se dis-
bajo diferentes condiciones de estrés, acele- tinguen morfológicamente de los normales, de
rando así la obtención de plantas resistentes. manera que se extraen y se los cultiva in vitro,
Esta estrategia se desarrolló en maíz, con po- en medios y condiciones adecuados (ver en
len cosechado de plantas creciendo a tempe- este libro Parte IV-Capítulo 1). Otras veces es
raturas elevadas y condujo a la obtención de necesario esperar a obtener las plantas para
plantas tolerantes a estrés por calor. En Bras- determinar el nivel de ploidía. Esta técnica se
sica rapa, la selección de polen a baja tempe- ha utilizado con éxito en cebada, trigo y tabaco.

También se emplea el cultivo de embriones a partir de nucelas de óvulos jóvenes. Este
en casos en que el endosperma no se desa- es el caso de Citrus sp, Vitis vinifera, Malus do-
rrolla normalmente, como sucede en los cru- mesticus, Psidium guajava y Pyrus serotina.
zamientos de cultivares diploides y tetraploides
de Citrus, o cuando el mismo se desintegra La técnica de rescate de óvulos fecunda-
después de la fecundación, como en Oenothe- dos se utiliza también en aquellos cruzamien-
ra biennis x O. muricata o O.biennis x O. latos en los que la barrera de incompatibilidad se
marckiana. Esta técnica también es de utilidad encuentra a nivel del ovario como en el cruza-
para sortear barreras de dormición o en casos miento Trifolium repens x T. hybridum.
donde la viabilidad de la semilla es baja, como
en yuca y otras especies del género Manihot. Las técnicas de fertilización in vitro pue-
den complementar, además, las metodologías
El cultivo in vitro de embriones es también de transformación de plantas. Por ejemplo, a
una alternativa para el intercambio de semilla través de la obtención de un embrión a partir
a través de fronteras internacionales. En un de cigotos transgénicos que han sido mani-
proyecto de mapeo de genes con resistencia al pulados, utilizando un protocolo que involucra
virus del mosaico, en yuca, desarrollado entre la microinyección de genes en el cigoto. Esta
CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tro- técnica evitaría la utilización de antibióticos y
pical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto genes de resistencia a herbicidas, como mar-
Internacional de Agricultura Tropical, con sede cadores, durante el proceso de selección de
en Nigeria) fue necesario trasladar “stocks” de las células transformadas.
semillas desde Sudamérica al continente afri-
cano, el cultivo de embriones resultó ser un Otra ventaja de la fertilización in vitro es la
excelente método para transferir germoplasma posibilidad de realizar cruzamientos entre plan-
con mínimos riesgos fitosanitarios. tas que son filogenéticamente distantes, fusio-
nando in vitro sus respectivas gametas para
El cultivo de embriones ha ayudado tam- producir cigotos híbridos. Se evitan así los in-
bién al mejoramiento genético de especies le- convenientes que frecuentemente se observan
ñosas que tienen dificultad en la germinación en la hibridación somática, como por ejemplo la
de sus semillas, como en Taxus mairei, o con ocurrencia de inestabilidad del híbrido respecto
escasa producción de semillas como es el caso del número de cromosomas o las dificultades
de Pseudotsuga macrolepis. núcleo e inter-citoplasmáticas (ya que en este
caso es la célula huevo la que contribuye con
El cultivo de embriones inmaduros puede el citoplasma del cigoto híbrido. Además, en la
ser aplicado para disminuir el tiempo necesa- fusión gamética, el desarrollo temprano del ci-
rio en la obtención de un nuevo cultivar. Por goto está regulado por genes pertenecientes a
ejemplo en soja se requieren unos diez años la célula huevo, los que brindan señales celula-
para este fin. Si se consiguen realizar varias res propias, haciendo que progrese el ciclo ce-
generaciones por año, en contraestación, se lular en forma exitosa con el resultado de proe-
acelera el proceso. El cultivo de embriones in- mbriones producto de las sucesivas divisiones
maduros ahorraría, además, el tiempo de ma- celulares. Pese a la potencialidad de la técnica
duración de la semilla. En este y en cada caso de hibridación distante a partir de gametos, es
en particular, se debe realizar la evaluación del importante la elección de especies parentales
beneficio económico para decidir la utilización adecuadas para minimizar las dificultades que
de estas técnicas. surgen producto de las diferencias filogenéti-
cos, fisiológicas y del ciclo celular.
Cultivo de nucelas En las plantas leñosas,
los explantos de tejidos maduros pierden la ca- 5.2 Aplicaciones para dilucidar aspectos
pacidad de regeneración, se ha inducido en- básicos del desarrollo en plantas
tonces con éxito la embriogénesis somática Las dificultades en el aislamiento de los ga-

metos de las plantas superiores ha obstaculi- Los estudios sobre la embriogénesis somá-
zado durante mucho tiempo la comprensión tica también han permitido identificar patrones
de la fisiología gamética y de los mecanismos de expresión génica relacionados con este pro-
que desencadenan la embriogénesis; los em- ceso, que se desencadena a través del cultivo
briones cigóticos en su medio natural ofrecen de tejidos. El sistema mejor estudiado, en re-
dificultades debido a su tamaño pequeño y al lación con la embriogénesis somática, es el de
hecho de estar inmersos en el tejido materno. suspensiones celulares de zanahoria (Daucus
A partir del aislamiento de células espermá- carota). En este sistema, la remoción del 2,4-D
ticas, células huevo y cigotas, se han podido (ácido 2, 4-diclorofenoxiacético) del medio de
realizar estudios moleculares de las células cultivo, genera una respuesta embriogénica
germinales, evitando las interferencias que por la cual los agregados celulares forman em-
resultan de la interacción con el tejido somáti- briones que crecen, de a millares, en un medio
co. Asimismo se ha facilitado el análisis de los líquido (ver en este libro Parte II-Capítulo 1).
efectos genéticos, epigenéticos e interacciones Los embriones somáticos constituyen una ex-
núcleo-citoplasmáticas inherentes a los game- celente herramienta para estudiar los procesos
tos como también el estudio del desarrollo del de desarrollo en plantas, ya que facilitan el ac-
embrión y el endosperma. De este modo, la ceso a gran cantidad de embriones libres.
fertilización in vitro de las plantas superiores Las plantas parecen poseer un programa
se ha convertido en un área de investigación embriogénico preestablecido que se desen-
importante, resultando actualmente uno de los cadena en respuesta a condiciones específi-
campos principales de la biología vegetal. cas. El proceso de fertilización dispara la em-
Tabla 1. Resumen de los avances metodológicos posibilitados por las técnicas de fertilización in vitro
para el estudio del proceso de la doble fecundación de las Angiospermas (Modificado de Wang y col.,
2006).
Cultivo in vitro de cigotos Fusión in vitro de Aislamiento de células

y embriones gametas generativas
Cada una de estas técnicas ha posibilitado:
Investigar los requerimientos Investigar los mecanismos Estudiar la ultraestructura de

del embrión durante su de activación del cigoto las células generativas
desarrollo
Investigar los aspectos Hibridar especies distantes Investigar las diferencias entre
moleculares de la las células del saco
embriogénesis embrionario
Determinar la rec eptividad Obtener bibliotecas de Realizar electroforesis de

del cigoto para la ADNc de cigotas productos de células
transformación generativas
Construir bibliotecas de ADNc

de células generativas

briogénesis cigótica, cuyos estadios normales estudiaron la contribución de los genes de las
de desarrollo se muestran en la Fig. 3. Una células espermáticas, la célula huevo y la cigo-
serie de investigaciones han demostrado que ta y obtuvieron evidencias de que hay clusters
hay requerimientos para que los gametos se de genes que están presentes en la célula hue-
fusionen in vivo, por ejemplo la presencia de vo y espermáticas, que persisten en el cigoto,
calcio, elemento que posee una actividad al- mientras que hay una gran cantidad de genes
tamente fusogénica y que además activaría que son propios del cigoto, produciendo en
el desarrollo del cigoto. Además, al estudiar la éste nuevos transcriptos.
ultraestructura celular se han encontrado dife- En el caso particular de la gameta masculina,
rencias en la arquitectura de los microtúbulos se sabe que cada una de las funciones para las
entre la célula huevo no fertilizada y el cigoto, cuales está destinada (reconocimiento, fusión
demostrando que este cambio está inducido y adhesión con la gameta femenina), está con-
por la fertilización. trolada por la activación de genes. Por ejem-
El cultivo in vitro y las tecnologías diseñadas plo, Xu y colaboradores (1999) identificaron y
para estudiar la expresión génica han permiti- caracterizaron dos genes de histonas gcH2A y
do analizar por separado la función de genes gcH3 que actúan durante la maduración de la
presentes de manera específica en las células célula espermática y también el gen LGC1 que
que participan en el proceso de fertilización. se expresa exclusivamente en las células ga-
Con la utilización de técnicas de especiales méticas masculinas. El producto de este último
de electroforesis bidimensional se han podido gen (una proteína) fue localizado en la super-
identificar proteínas de células gaméticas y ci- ficie de las células gaméticas masculinas su-
góticas, encontrándose pocas diferencias en- giriendo un posible rol en la interacción célula
tre los patrones proteicos de embriones somá- espermática-célula huevo, en el momento del
ticos y cigóticos. Ning y colaboradores (2006) reconocimiento o señalización. Además, este
mismo grupo de investigación aisló, a partir de
una biblioteca de ADNc, dos genes, NtS1 y
NtS2, que codifican para una poligalacturona-
sa, enzima que tendría la función de modificar
la pared celular durante la diferenciación de las
células espermáticas.
Pese a las dificultades que presenta el aisla-
miento de las gametas femeninas (hay menor
eficiencia en la obtención de células que en
las masculinas), también se han logrado pro-
gresos en el esclarecimiento de sus funciones.
Por ejemplo, recientes investigaciones han
esclarecido detalles acerca de la expresión
de genes involucrados en el gameto femenino
que determinan la guía del tubo polínico y la
maduración de las anteras, como por ejemplo
el gen ZmEA1, en maíz, que posee una función
en la atracción del tubo polínico a la micrópi-
la. Cuando este gen está regulado negativa-
mente, la señal direccional del tubo polínico a
la micrópila es insuficiente y no se produce la
fertilización.
En relación a la expresión de genes en la
embriogénesis del maíz, se han identificado al-
gunos diferencialmente expresados en la célu-
Figura 3. Estadíos de la embriogénesis en
Arabidopsis thaliana la basal y apical del embrión bicelular. En esta

misma especie la célula huevo mostró un incre- charge. Zygote 16:179-186 Cambridge University
mento en la abundancia de transcriptos que in- Press.
volucran funciones como la comunicación celu- DUMAS C.; MORGENSEN, H. 1993. Gametes and
fertilization: Maize as a model system for experi-
lar, el crecimiento y la división celular, la síntesis
mental embryogenesis in flowering plants. Plant
de ADN y factores relacionados con estreses y Cell. 5: 1337-1348.
transducción de señales. Por otro lado, las célu- FAURE J.; DIGONNET, C.; DUMAS, C. 1994. An in
las centrales del saco embrionario muestran una vitro System for Adhesion and Fusion of Maize
abundancia de transcriptos involucrados con los Gametes. Science Vol 263, pp 1598-1600.
procesos relacionados con el metabolismo de la FAURE J.; ALDON, D.; ROUGIER, M.; DUMAS, C.
energía y la síntesis proteica. En cada caso, es- 1996. Emerging data on pollen tube growth and
tos productos parecerían reflejar categorías fun- fertilization in flowering plants. Protoplasma, Vol
193, Iss 1-4, pp 132-143.
cionales representadas en el futuro desarrollo
Gamborg O.; Murashige, T.; Thorpe,
del embrión y el endosperma. Como en el caso T.;Vasil, I. 1976. Plant tissue culture media. In
ya citado de la célula espermática, se han iden- Vitro 12: 473- 478.
tificado también en la célula huevo y la cigota GE L.; TIAN, H.; RUSSELL, S. 2007. Calcium func-
genes de histonas que podrían representar un tion and distribution during fertilization in An-
mecanismo regulatorio de varios genes. giosperms. American Journal of Botany 94 (6):
El número de herramientas disponibles en la 1046-1060.
actualidad para manipular las gametas de las GUEVARA C.; OSPINA, J.; MAFLA, G.;VERDIER
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plantas superiores provee numerosas oportu-
culenta Crantz: a practical approach for the safe
nidades para realizar progresos científicos y internacional movement of cassava seed stocks.
tecnológicos. La investigación en el área de la Plant Genetic Resources Newsletter 115:33-38.
biología reproductiva de las Angiospermas ha Holm P.; Olsen O.; Schnorf M.; Brinch-Pe-
entrado en una nueva fase, donde los métodos dersEn H.; Knudsen, S. 2000. Transforma-
de la biología molecular permiten responder mu- tion of barley by microinjection into isolated zy-
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desarrollo embriogénico temprano. Un resumen
0521587840, 9780521587846.
de las técnicas de fertilización in vitro que han KANTA K.; RANGASWAMY, W.; MAHESHWARI, P.
permitido el acceso a nuevas investigaciones en 1962. Test tube fertilization in a flowering plant.
el área molecular de este tema, se muestran en Nature 194:1214-1217.
la Tabla 1. KOVACS M.; BARNABAS, B.; KRANZ, E. 1995.
El desarrollo de sistemas experimentales en Electrofused isolated wheat (Triticum aestivum
varias especies, particularmente en dicotiledó- L.) gametes develop into multicellular structures.
neas, son necesarios para confirmar los resul- Plant Cell Rep. 15:178-180.
Kranz E.; Bautor J.; LÖrz H. 1991. In vitro
tados obtenidos en gramíneas, a fin de comple-
fertilization of single, isolated gametes of maize
mentar la información molecular acerca del pro- mediated by electrofusion. Sex Plant Reprod
ceso de fertilización y mejorar los métodos para 4:12-16.
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II CAPÍTULO 2 ello, la obtención de plantas híbridas somáticas
requiere del previo aislamiento de protoplastos
mediante la digestión enzimática de las pare-
Hibridación Somática
des celulares, para luego proceder a la fusión
de protoplastos de distintos tipos parentales
Pablo Polci y Pablo Friedrich
(distintos genotipos) y posterior regeneración
de plantas a partir de los productos de fusión.
1 Introducción
La hibridación somática en plantas comenzó a
La mejora genética de las plantas cultivadas
desarrollarse a principios de 1970 con la apli-
en procura de incrementar la producción vie-
cación de métodos químicos de fusión, y se ex-
ne siendo practicada por el ser humano desde
tendió en los ´80 con el empleo de métodos de
hace miles de años, seguramente desde el ini-
electrofusión.
cio mismo de la agricultura. Para ello, el hom-
Es relevante destacar que, a los fines del
bre ha empleado los cruzamientos con el fin
mejoramiento genético, el sistema de proto-
de incrementar la variabilidad genética, paso
plastos no sólo se emplea para la obtención de
inicial en el proceso de mejoramiento. De esta
híbridos somáticos, sino que también constitu-
manera la hibridación entre especies diferentes
ye un material apropiado para la incorporación
permitió aumentar de modo significativo la pro-
de ADN exógeno. Asimismo, la fusión de proto-
ductividad de diversos cultivos, como por ejem-
plastos tiene un uso mucho más amplio que
plo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos
el estrictamente de interés agronómico; en tal
esta estrategia no resultó exitosa a causa de
sentido, es de gran utilidad en estudios de bio-
esterilidad sexual o incompatibilidad genética.
logía celular así como para otras aplicaciones
La hibridación somática, es decir, la obten-
biotecnológicas, por ejemplo, la producción de
ción de plantas híbridas a partir de la fusión de
anticuerpos monoclonales.
células o de protoplastos derivados de células
somáticas, surgió hace unos 30 años como
2 Hibridación somática vs. hibridación
una herramienta muy promisoria para sortear
sexual
problemas de incompatibilidad precigótica..
En relación a su potencialidad para producir
Esta técnica, si bien presenta algunas limita-
híbridos, existen diferencias importantes entre
ciones, como una elevada esterilidad o impo-
la fusión de protoplastos somáticos y el cruza-
sibilidad de regenerar plantas en algunos ca-
miento sexual:
sos, demostró ser útil en la mejora genética de
plantas, principalmente por permitir la introgre-
• La hibridación sexual entre organismos
sión limitada de genes de especies silvestres
de diferentes especies está limitada por
en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando
barreras de incompatibilidad. En algunos
se quiere transferir resistencia a enfermeda-
casos estas barreras son precigóticas,
des o tolerancia a estreses. También permite
es decir, no permiten que se produzca
la obtención de citoplasmas híbridos (cíbridos).
la fecundación. Tal limitante no existe en
La hibridación asimétrica y cibridización sirve
la fusión de protoplastos, dado que este
como puente para la transferencia de genes
proceso es no-específico, permitiendo la
individuales
fusión de células de orígenes muy diver-
La técnica de fusión de protoplastos se de-
sos, incluso de organismos muy distan-
sarrolló en la década de 1950-60, a partir de
ciados filogenéticamente (por ejemplo,
la observación de que ciertos virus pueden
células animales y vegetales). Ello no
inducir la fusión de células animales. Sin em-
significa que pueda regenerarse un or-
bargo, recién en la década de 1980-90 tuvo un
ganismo viable y fértil a partir de cual-
mayor auge debido a la aparición de métodos
quier tipo de combinación entre células.
químicos y eléctricos más apropiados para la
De hecho, la búsqueda de híbridos de in-
fusión de células vegetales. La pared presen-
terés agronómico ha demostrado que el
te en estas células representa una barrera que
principal aporte de esta metodología es
normalmente impide la fusión entre ellas. Por

la introgresión, en los cultivos, de genes tencia horizontal a enfermedades y otros
provenientes de plantas silvestres empa- son poligénicos, por lo que su transfe-
rentadas. rencia es factible por hibridación somáti-
• La hibridación sexual ocurre normalmen- ca pero no por transformación genética.
te por fusión de células haploides (n + n), Sin embargo, en la actualidad, con las
mientras que en la hibridación somática nuevas herramientas aportadas por la
se fusionan dos protoplastos con sus ge- genómica se está avanzando en el co-
nomas completos (2n + 2n) o con uno de nocimiento de todos los genes involucra-
ellos conteniendo sólo parte de su geno- dos en diversas vías metabólicas. Estos
ma. podrían ser transferidos en conjunto vía
• Otra diferencia está dada por la heren- transgénesis.
cia de los genes extranucleares, esto es,
plastídicos y mitocondriales. Mientras 4 Tipos de híbridos somáticos
que en la reproducción sexual el genoma Cuando se realiza la fusión de protoplastos
citoplasmático es aportado casi exclusi- se obtienen células con el aporte de cromoso-
vamente por la gameta femenina, en la mas de dos o más núcleos. Si los protoplastos
hibridación somática se combinan orga- involucrados en la fusión proceden de distin-
nelas de ambos progenitores, producien- tos tipos parentales se originan “heterocario-
do nuevas combinaciones de genes cito- nes”, y si proceden del mismo tipo parental se
plasmáticos. originan “homocariones”. Cuando en el hete-
rocarión ocurre la fusión de los núcleos (cario-
3 Hibridación somática vs. transforma- gamia), se forma una “célula híbrida”.
ción genética A partir de una célula híbrida, que contiene
La preponderancia que han tomado las téc- dos genomas completos, se puede regenerar
nicas de transformación genética ha relegado una planta que, según cual haya sido el destino
a la hibridación somática a un papel de menor del material genético nuclear durante las divi-
significación como herramienta biotecnológica siones celulares que siguen a la fusión, puede
aplicada al mejoramiento de los cultivos. Com- ser de tres tipos:
parando ambas metodologías, podemos des-
tacar las siguientes diferencias: 1. Híbrido simétrico, que tiene el genoma
nuclear completo de cada tipo parental.
2. Híbrido asimétrico, que tiene el genoma
• En la transformación genética se incor- nuclear completo de uno de los parenta-
poran uno o pocos genes exógenos en les y sólo una parte del genoma nuclear
una planta, mientras que en la hibrida- del otro parental.
ción somática el número de genes intro- 3. Cíbrido, que contiene el genoma nuclear
ducidos es mayor dado que se transfie- completo de uno de los parentales, re-
ren cromosomas de una especie a otra teniendo sólo material genético extranu-
o se combinan dos genomas completos. clear del otro parental.
• La hibridación somática permite trans-
ferir caracteres sin necesidad de contar Es usual que en el proceso de regeneración
con un conocimiento detallado de los de plantas híbridas ocurra una eliminación gra-
mecanismos moleculares que determi- dual de cromosomas de uno de los tipos pa-
nan la expresión de dichos caracteres. rentales, produciéndose de este modo híbridos
Por el contrario, la transformación gené- asimétricos o cíbridos. La práctica de la hibri-
tica requiere la previa identificación y ais- dación somática en plantas demostró que, en
lamiento de los genes que determinan la general, los híbridos asimétricos y cíbridos son
expresión del carácter de interés. más valiosos que los simétricos producidos
• Caracteres tales como productividad, to- entre plantas alejadas filogenéticamente. Por
lerancia a ciertos tipos de estrés, resis- esta razón se han desarrollado métodos para

inducir la hibridación asimétrica o cibridación, viamente con inhibidores metabólicos.
alterando el genoma de uno de los protoplas- En este caso sólo pueden sobrevivir, por
tos parentales. En este caso se dice que se complementación metabólica, los hete-
transfiere parte del genoma de un protoplasto rocariones conteniendo el núcleo del re-
donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo ceptor y el citoplasma del donante enu-
en cuenta el material de partida empleado para cleado.
la fusión, pueden producirse tres tipos de célu-
las híbridas: La segregación de los plástidos y mitocon-
drias de los dos tipos parentales también consti-
1. Células híbridas simétricas, por fusión tuye una fuente importante de variabilidad en la
de dos protoplastos con sus genomas regeneración de plantas híbridas. Es frecuente
completos. que ocurran recombinaciones de los genomas
2. Célula híbrida asimétrica, por fusión de mitocondriales de ambos tipos parentales, pero
un protoplasto conteniendo su genoma ello es poco común entre plástidos. Dado que
completo con otro conteniendo su núcleo las organelas segregan independientemente
inviable o sólo una parte de su genoma unas de otras, la regla es que al cabo de pocas
nuclear. Los protoplastos donantes son divisiones mitóticas las células formadas con-
irradiados con rayos X o Gamma, lo que tengan plástidos provenientes de uno u otro
provoca la fragmentación de los cro- tipo parental. Así, una célula híbrida origina
mosomas. Una vez producida la fusión, una colonia de células que exhiben diferentes
dichos fragmentos tienden a eliminarse combinaciones de genes citoplasmáticos, pero
en las sucesivas mitosis, pero algunos con una mayor frecuencia de células que po-
de ellos pueden integrarse con el geno- seen mitocondrias recombinantes y plástidos
ma del receptor produciendo un híbrido de uno u otro tipo parental. El destino que su-
asimétrico. El tratamiento de irradiación fre el material genético nuclear y extranuclear
parece no tener efectos deletéreos o durante las divisiones celulares determina que,
mutagénicos sobre los genomas de or- a partir de una población de células híbridas
ganelas, probablemente debido a que similares, se puedan regenerar plantas con di-
cada célula posee varias copias de ellas. ferentes combinaciones de genes nucleares,
También puede producirse una célula hí- plastídicos y mitocondriales.
brida asimétrica fusionando protoplastos
receptores con microprotoplastos, con- La Figura 1 muestra un esquema de las eta-
teniendo uno o pocos cromosomas. Los pas involucradas en la hibridación somática,
microprotoplastos se obtienen inducien- las cuales son tratadas a continuación.
do la formación de micronúcleos por tra-
tamientos con agentes antimicrotúbulos. 5 Aislamiento de protoplastos
3. Cíbridos, por fusión de un protoplasto El desarrollo de métodos enzimáticos de ais-
conteniendo su genoma nuclear com- lamiento a partir de 1960 brindó la posibilidad
pleto con un protoplasto enucleado o de obtener grandes cantidades de protoplas-
con su núcleo inviable. Los protoplastos tos vegetales. Ello tuvo gran influencia en di-
enucleados o citoplastos pueden obte- ferentes áreas de la biología y la biotecnología
nerse centrifugando los mismos a alta de plantas, dada la utilidad de los protoplastos
velocidad en un gradiente de densidad como sistema experimental para estudios fisio-
isosmótico. Asimismo, el método de lógicos, bioquímicos y moleculares, así como
irradiación con rayos X o Gamma pue- para su aplicación al mejoramiento genético.
de generar cíbridos en casos en que se Los protocolos de aislamiento emplean en-
produzca la eliminación total de los frag- zimas fúngicas con actividad celulasa y pec-
mentos cromosómicos. Los protoplastos tinasa, siendo necesario en algunos casos el
que poseen su genoma nuclear comple- agregado de hemicelulasas. Las celulasas y
to (receptores), pueden ser tratados pre- hemicelulasas degradan la pared celular, en

Planta parental 1 Planta parental 2

Aislamiento de protoplastos
Protoplastos parentales 1 Protoplastos parentales 2

Modificaciones genómicas para producción de

híbridos simétricos/cíbridos y/o pretratamiento
para posterior selección (opcionales)
Protoplastos parentales 1 Protoplastos parentales 2

(originales o modificados) (originales o modificados)

Fusión de protoplastos
Mezcla de protoplastos parentales

y productos de fusión

Selección de
células híbridas
Protoplastos híbridos
Cultivo de protoplastos o Cultivo de la mezcla de protoplastos

híbridos y regeneración de en medio selectivo (opcional) y
plantas regeneración de plantas
Figura 1: Materiales y procesos involucrados en la hibridación somática.

tanto que las pectinasas digieren la matriz de Durante el aislamiento se produce la li-
pectina que mantiene adheridas a las células. sis de algunas células, que liberan enzi-
El uso de enzimas disponibles comercialmen- mas hidrolíticas y compuestos oxidantes
te posibilitó el aislamiento de protoplastos de que pueden dañar los protoplastos, por
prácticamente cualquier tejido vegetal, siempre lo que se suelen agregar inhibidores de
que el mismo no esté lignificado. Se ha podido proteasas y antioxidantes tales como el
aislar protoplastos de una gran cantidad de es- Polivinilpirrolidona-10. El agregado de un
pecies vegetales y regenerar plantas a partir estabilizador osmótico a la solución en-
de los mismos, permitiendo el uso de este sis- zimática es esencial para evitar la ruptu-
tema para la propagación clonal y la modifica- ra de los protoplastos a medida que son
ción genética de plantas. liberados, siendo más estables si la so-
El número de protoplastos aislados, su viabi- lución es ligeramente hipertónica. Para
lidad y la pureza de la suspensión obtenida de- ello se utilizan solutos osmóticamente
penden de varios factores, debiendo estable- activos, comúnmente manitol o sorbitol,
cerse en forma empírica las condiciones ópti- en concentraciones que varían entre 0,3
mas para un sistema determinado. Las etapas a 0,8 M según el tipo de protoplasto. La
del aislamiento y los factores a considerar en solución enzimática es generalmente
cada una de ellas se describen a continuación: suplementada con sales, comúnmente
CaCl2, que incrementan la estabilidad de
1. Selección del material de partida. In- la membrana (Fig. 2B).
fluye en el resultado del aislamiento así 3. Limpieza y purificación de los proto-
como en el proceso de regeneración pos- plastos. Una vez lograda la liberación de
terior. Generalmente se emplean hojas y los protoplastos, se procede a la remo-
células en cultivo líquido o sólido. Cuan- ción de las enzimas y de los restos de
do se emplean hojas, la edad y las con- tejido y de células rotas. La suspensión
diciones de cultivo de la planta afectan el se pasa por un filtro de nylon o metáli-
rendimiento. Se obtienen mejores resul-
tados con hojas jóvenes totalmente ex-
pandidas que con hojas viejas (Fig. 2A).
Para facilitar el contacto de las enzimas
con las células, las hojas suelen cortarse
en trozos pequeños, muy finos en el caso
de las monocotiledoneas. Algunas veces
se extrae la epidermis inferior antes de
colocar la hoja en la solución enzimáti-
ca, como sucede con las dicotiledoneas.
Cuando se emplean células en suspen-
sión, se obtienen mejores resultados si
se encuentran en la fase exponencial de
crecimiento.
2. Tratamiento enzimático. La concentra-
ción de la enzima y el tiempo de incuba-
ción requeridos para lograr la liberación
de los protoplastos dependen del pro-
ducto comercial utilizado. El pH gene-
Figura 2: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A.
ralmente se ajusta en un rango de 4,7 Eliminación de las nervaduras centrales y seccio-
a 6, y la temperatura entre 25 y 30 °C. nado de la hoja en trozos pequeños. B. Digestión
La duración del tratamiento enzimático enzimática de las paredes celulares. C. Centrifuga-
y la relación volumen de solución/canti- ción y obtención de protoplastos libres de restos de
dad de tejido influyen en el rendimiento. tejidos vegetales.

co con un diámetro de poro (30-100 µm) combinación del método original del PEG y el
que permita el paso de los protoplastos de Ca++ y pH elevados. Los protoplastos de
y retenga los restos de tejido y grupos dos tipos parentales se mezclan en una so-
de células no digeridas. Posteriormente, lución conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso
se efectúan 3 ó 4 lavados centrifugando molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30
la suspensión por 5 minutos a baja velo- minutos. La temperatura de incubación óp-
cidad (50-100 g). Finalmente, los proto- tima para inducir la fusión es de 35 a 37 °C
plastos sedimentados se resuspenden pero, en la práctica, suele ajustarse a 24 °C.
en una solución salina que contenga un La densidad de protoplastos adecuada para
estabilizador osmótico. De este modo se la formación de heterocariones es de 4 a 5 %
eliminan las enzimas y restos celulares. (volumen de protoplastos/volumen de suspen-
Para lograr una mayor pureza de la sus- sión). La remoción del PEG se lleva a cabo en
pensión es conveniente centrifugarla en forma gradual, siendo esto fundamental para
un gradiente de densidad (Fig. 2C). Para asegurar una elevada frecuencia de heteroca-
el recuento de protoplastos se emplea un riones. Para ello, la suspensión se somete a
hemocitómetro. La viabilidad se determi- sucesivos lavados con una solución alcalina
na generalmente empleando colorantes (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo
que son incorporados (rojo neutro, dia- progresivamente la concentración de PEG con
cetato de fluoresceína) o excluídos (azul cada lavado.
de Evan) por las células viables; también En la fusión de los protoplastos ocurren, en
pueden evaluarse la actividad fotosintéti- forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las
ca (emisión de fluorescencia) y la respi- membranas plasmáticas de protoplastos adya-
ratoria (consumo de O2). centes entran en íntimo contacto, (2) se pro-
ducen alteraciones en sitios localizados de las
6 Métodos de fusión mismas, formándose puentes citoplasmáticos
entre protoplastos vecinos, y (3) las interco-
6.1 Métodos químicos nexiones citoplasmáticas se expanden, provo-
Los primeros casos informados de fusión cando la fusión. La carga negativa neta de la
controlada y reproducible de protoplastos ve- superficie de las membranas produce la repul-
getales y de regeneración de híbridos somáti- sión entre ellas; el tratamiento con Ca++ y pH
cos se produjeron a principios de la década de elevados neutraliza las cargas superficiales,
1970, empleando nitrato de sodio como agente favoreciendo el contacto entre protoplastos. El
fusógeno. La frecuencia de formación de hete- PEG actuaría como un puente molecular cau-
rocariones en tales casos era muy baja. Pos- sando alteraciones en las membranas plasmá-
teriormente, se lograron mejores resultados ticas que promueven la adhesión y formación
fusionando protoplastos de células del mesó- de puentes citoplasmáticos entre protoplastos
filo de Nicotiana en un medio conteniendo alta vecinos, produciéndose finalmente la fusión.
concentración de Ca++ (50 mM) y pH elevado
(10,5). Sin embargo, el fusógeno que alcanzó 6.2 Electrofusión
mayor aceptación es el polietilénglicol (PEG) En 1973 se descubrió que pulsos de eleva-
debido a que, en comparación con los otros do potencial eléctrico en un rango muy estre-
agentes químicos, produce mayor proporción cho de intensidad y duración conducen a un
de heterocariones y, para muchos tipos celu- incremento reversible, experimentalmente con-
lares, resulta menos tóxico. Además, el trata- trolable, de la permeabilidad de la membrana
miento con PEG genera una mayor proporción celular. Este efecto se denominó ruptura eléc-
de heterocariones binucleados, con menor trica reversible para enfatizar la habilidad de la
ocurrencia de fusiones entre más de dos proto- membrana para reparar tales perturbaciones.
plastos. El voltaje mínimo para un protoplasto (umbral)
El procedimiento de fusión con PEG más con el cual se produce la formación de poros
ampliamente utilizado es esencialmente una disminuye a mayor duración del pulso eléctrico.

Este fenómeno de ruptura reversible también den formarse puentes lipídicos entre las mem-
es aplicado en la técnica de electroporación, branas de las dos células. En otras palabras,
con la que se pueden introducir en las células las membranas no se vuelven a sellar sepa-
construcciones de ADN y otras moléculas de radamente en la zona de contacto. Los puen-
alto peso molecular. tes formados de esta manera, con continuidad
El método de electrofusión en esencia invo- citoplasmática entre las dos células, conducen
lucra dos pasos: a un radio de curvatura muy pequeño y a altas
tensiones superficiales. Como consecuencia
Los protoplastos, colocados en un medio de se forma una nueva célula esférica, ya que el
baja conductividad entre dos electrodos se po- proceso es favorecido energéticamente (Fig.
nen en contacto al aplicar corriente alterna de 3B y C). La ruptura es reversible si el número y
alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo tamaño de los poros es pequeño en relación al
eléctrico no uniforme. Las cargas se separan total de la superficie de la membrana. Fuerzas
dentro de las células formando un dipolo y ge- de campo supracríticas, así como largos pe-
nerando, por lo tanto, un potencial de mem- ríodos de exposición, rompen áreas mayores
brana. La fuerza del campo a ambos lados de de membrana y pueden producir la destrucción
una célula es diferente (campo no uniforme), total de la célula.
dando origen a una fuerza neta que la empu-
ja a una región de mayor intensidad de campo
(hacia uno de los electrodos). Este proceso se
denomina dielectroforesis. La polaridad de la
célula incrementa el campo local no uniforme,
atrayendo a las células vecinas. Luego, los
protoplastos se aproximan unos a otros y for-
man cadenas paralelas a las líneas de campo
aplicadas (Fig. 3A).
La fuerza ejercida sobre la célula bajo condi-
ciones dielectroforéticas depende (1) de la in-
tensidad de campo eléctrico, (2) del gradiente
del campo, (3) del volumen del protoplasto, y
(4) de la diferencia entre las constantes dieléc-
tricas de la célula y su ambiente (así como la
correspondiente diferencia entre sus conducti-
vidades).
El segundo paso consiste en la aplicación de

uno o más pulsos cortos de corriente directa de
15 a 100 µseg. con una intensidad de campo
elevada (1 a 3 Kv/cm), suficiente para causar
la ruptura reversible de la membrana. Para que Figura 3: Electrofusión de protoplastos de mesófilo
esto ocurra es necesario que el voltaje críti- de pasto llorón. A. Dielectroforesis de células. Las
co de membrana sea alcanzado en cuestión diferencias en intensidad de campo eléctrico hacen
de nanosegundos a microsegundos. Ocurre que las células se muevan hacia la zona cercana al
entonces la fusión de las dos células cuyas electrodo. B. Aplicación de pulsos cortos de corrien-
membranas están en estrecho contacto (1 a 2 te directa, que inducen la formación de poros en
la membrana, generando puentes entre las mem-
nanómetros de distancia). El proceso de rese-
branas de las células adyacentes. C. Los puentes
llado es principalmente atribuído a las molécu- con continuidad citoplasmática poseen un radio de
las lipídicas debido a que su coeficiente de di- curvatura muy pequeño. Las altas tensiones super-
fusión es dos órdenes de magnitud mayor que ficiales generadas en ese sector conducen a la for-
el de las proteínas. Durante este proceso pue- mación de una nueva célula esférica.

campo eléctrico y tiempo durante el cual
• La frecuencia de fusión depende de va- es aplicado. Cadenas más largas darán
rios factores: mayor frecuencia de fusión que las cade-
• El genotipo. nas cortas. Pulsos de corriente más lar-
• La procedencia de los protoplastos den- gos y de mayor voltaje producen un au-
tro del mismo genotipo. Diferentes pobla- mento de los eventos de fusión múltiple;
ciones de protoplastos exhiben frecuen- obviamente, pulsos muy largos y voltajes
cias de fusión diferentes, aún cuando muy elevados pueden matar a los proto-
provengan del mismo genotipo. En ge- plastos.
neral, los protoplastos obtenidos a partir • La composición y propiedades de la
de hojas se fusionan más fácilmente que membrana plasmática pueden ser afec-
los provenientes de raíz o de cultivos ce- tadas por la actividad metabólica de los
lulares. protoplastos y por el tipo de enzimas em-
• El tamaño de los protoplastos. Los más pleadas en el proceso de aislamiento, in-
grandes se fusionan más facilmente. fluyendo en consecuencia en el proceso
• La densidad de los protoplastos. de fusión.
• El número, la duración y la fuerza de los
pulsos de corriente directa. La duración Las condiciones experimentales deben ajus-
del pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. tarse de modo de obtener la mayor frecuen-
El tiempo requerido para la fusión que cia de fusión posible (número de protoplastos
sigue a la aplicación de un pulso varía fusionados sobre el total de protoplastos), in-
desde pocos segundos a varios minun- tentando maximizar la proporción de heteroca-
tos. Esto probablemente esté relaciona- riones (productos de la fusión de protoplastos
do a la diferencia de fluidez de la mem- diferentes) formados por sobre la de homoca-
brana en los distintos tipos celulares y a riones (productos de la fusión de protoplastos
las propiedades del citoesqueleto dentro del mismo tipo parental), y minimizando la ocu-
de la célula. rrencia de eventos de fusión múltiple (fusión
• El medio de fusión. Un factor limitante de más de dos protoplastos). La proporción de
en la agregación dielectroforética de las cada uno de los dos tipos de protoplastos en la
células es la conductividad eléctrica del suspensión puede fijarse a fin de incrementar
medio; si ésta es muy alta, hay mucho la formación de heterocariones por sobre la de
flujo de corriente en la solución y se pro- homocariones. El tipo de protoplasto con ma-
ducen calentamientos y turbulencias que yor tendencia a fusionar se mezcla con el de
impiden la formación de cadenas. menor tendencia a fusionar en una relación de
• El potencial osmótico del medio de fu- 1:5 a 1:10. Así, durante la formación de cade-
sión. La inclusión de iones en el medio nas, los protoplastos más fusionables estarán
puede incrementar el porcentaje de fu- mayoritariamente en contacto con los menos
sión. Sin embargo, existe la limitación de fusionables, y éstos a su vez estarán ligados
que la dielectroforesis debe realizarse en entre ellos mismos. Seleccionando las condi-
un medio de baja conductividad; el medio ciones -duración y voltaje de los pulsos- que
de fusión usualmente consiste en manitol promuevan sólo la fusión de los protoplastos
(cuya concentración se ajusta según los más fusionables, los productos serán mayor-
protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. mente heterocariones.
Valores bajos de presión osmótica en el
medio de suspensión de los protoplastos Sin embargo, aún cuando las condiciones de
puede favorecer el proceso de fusión. fusión puedan fijarse de modo de incrementar
• La longitud de las cadenas de protoplas- la frecuencia de fusión y la proporción de hete-
tos formadas durante la dielectroforesis, rocariones formados, la fusión de protoplastos
que además depende de factores como a gran escala (macrofusión), tanto por méto-
la densidad de protoplastos, fuerza del dos químicos como eléctricos, resultará en una

mezcla de protoplastos parentales, homoca- como el del PEG, que: - requiere condi-
riones y heterocariones. Esto conlleva la ne- ciones no fisiológicas, - las frecuencias
cesidad de emplear métodos de selección de de formación heterocariones binucleados
lo híbridos somáticos obtenidos. Una técnica son bajas y variables, - resultan tóxicos
alternativa que ofrece la ventaja de no reque- para diversos tipos celulares, - el fusó-
rir una posterior selección de heterocariones, geno debe ser removido antes del cultivo
aunque demanda mayor manipulación, es la de los protoplastos y - bajo rendimiento
microfusión o electrofusión de pares de proto- de células fusionadas.
plastos. Esta técnica se basa en los mismos
principios que la electrofusión a gran escala 7 Selección de heterocariones
pero está diseñada para inducir la fusión en La fusión de protoplastos a gran escala pro-
pares seleccionados de protoplastos. Este sis- duce una mezcla de tipos parentales y produc-
tema emplea microelectrodos de platino fijados tos de fusión. Si no se efectúa una previa se-
a un soporte montado debajo del condensa- lección de las células híbridas, la regeneración
dor de un microscopio invertido. Los pares de de plantas y la posterior identificación de los
protoplastos seleccionados se colocan en mi- híbridos demandará mucho trabajo y recursos.
crogotas de medio de fusión sobre un soporte, Dicha selección es particularmente necesaria
recubiertas por aceite mineral. En cada evento cuando se emplean métodos químicos, que
de fusión, los microelectrodos se posicionan producen una baja proporción (<10%) de cé-
a cada lado de una microgota conteniendo un lulas híbridas. Por el contrario, los métodos
par de protoplastos, y se aplican los pulsos eléctricos no requieren necesariamente del
eléctricos. Después de la fusión, los heteroca- posterior proceso de selección dado que nor-
riones resultantes son transferidos a gotas con malmente producen frecuencias de fusión muy
medio de cultivo para la posterior regeneración elevadas o porque, en el caso de la microfu-
de plantas híbridas. La tasa de fusión es de sión, no se generan mezclas heterogéneas de
aproximadamente 30 pares de protoplastos fu- protoplastos debido a que se fusionan dos cé-
sionados y transferidos a medio de cultivo por lulas por vez. Cualquiera sea el caso, la con-
hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fu- dición de híbrido debe verificarse en la planta
regenerada mediante diferentes análisis que
sión cercanas al 50 %.
se explican más adelante.
Ventajas de la electrofusión:
La selección de células híbridas puede lle-
1. El proceso entero puede ser seguido bajo
varse a cabo empleando los siguientes méto-
microscopio por lo que los híbridos pue-
dos:
den ser facilmente identificados y trans-
• Selección en base a caracteres morfo-
feridos a un medio nutritivo o selectivo.
fisiológicos. En ciertos casos es posi-
2. Puede preseleccionarse el número de
ble diferenciar los callos híbridos de los
células a ser fusionadas. Las formacio-
parentales. Por ejemplo, en algunos cru-
nes de dos células son favorecidas por
zamientos, los callos híbridos poseen
bajas densidades en la acanaladura en- un color intermedio al de los parentales.
tre los electrodos. Para obtener produc- Cuando se produce un cruzamiento entre
tos de multifusión deben emplearse ele- un parental con capacidad para regene-
vadas densidades. rar planta con uno recalcitrante, los híbri-
3. El proceso de fusión es sincrónico, ya dos somáticos normalmente regeneran
que el pulso provoca la fusión de todas plantas, ya que este carácter se compor-
las células expuestas al campo. ta como dominante. Si los protoplatos del
4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 - genotipo respondedor son tratados con
100 %) y cariogamia. inhibidores metabólicos irreversibles (io-
5. La viabilidad de las células fusionadas es doacetamida, dietilpirocarbamato, etc.)
muy buena. no sobrevivirán, y solamente podrán re-
6. Este método ofrece ventajas sobre otros generarse los híbridos.

• Selección por complementación. La nicas de micromanipulación con micropipeta.
selección se produce porque el medio Puede realizarse cuando los protoplastos pa-
de cultivo resulta restrictivo para el cre- rentales presentan rasgos que los distinguen al
cimiento de los parentales pero no para microscopio, permitiendo reconocer las células
el de los híbridos. La complementación híbridas. Por ejemplo al fusionar protoplastos
puede lograrse por las siguientes vías: del mesófilo (verdes) con protoplastos de sus-
a) Empleando dos parentales con defectos pensiones celulares (incoloros). También pue-
metabólicos o genéticos no alélicos. Si dichos den colorearse las células de ambos progeni-
caracteres son recesivos, la fusión produce tores con diferentes colorantes vitales, como el
una célula híbrida en la que los defectos se rojo neutro y azul brillante de cresilo.
anulan por complementación. Por ejemplo, la b) Citometría de flujo. Los protoplastos pa-
fusión de dos variedades albinas no alélicas rentales se marcan con diferentes colorantes
(nucleares) de tabaco, permitió obtener plan- fluorescentes, por ejemplo, rodamina (rojo) y
tas verdes. fluoresceína (verde amarillento). El aislamien-
to de los heterocariones marcados con ambos
AAbb (albina) x aaBB (albina) colorantes se realiza utilizando un citómetro de
flujo (FACS, fluorescence-activated cell sorter),
↓ que es preciso y muy rápido. El equipo posee
fotocélulas que detectan fluorescencia, pudien-
AaaaBBbb (verde) do separar los protoplastos marcados con un
solo fluorocromo (parentales) de aquellos do-
Asimismo, a partir de dos líneas mutantes no blemente marcados (híbridos).
alélicas de tabaco deficientes en nitrato reduc-
tasa, se obtuvieron colonias capaces de crecer 8 Cultivo de protoplastos
en un medio conteniendo nitrato como única La habilidad para regenerar plantas a partir
fuente de nitrógeno. de células y tejidos en cultivo es un componen-
b) Fusionando parentales que expresan cate esencial en la biotecnología para la manipu-
racteres dominantes tales como resistencia a lación genética y el mejoramiento vegetal. Esto
antibióticos o herbicidas. Para ello se emplea resulta relativamente fácil para las dicotiledó-
una línea resistente a cierta droga, y otra re- neas herbáceas, pero ha sido bastante difícil
sistente a una segunda droga, efectuándose la para las monocotiledóneas, particularmente
selección de las células híbridas en un medio las gramíneas.
conteniendo ambas drogas a concentraciones Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri
que resultan letales para las líneas parentales. en medio líquido o semisólido, rico en compues-
c) Una línea que presente una mutación au- tos orgánicos e inorgánicos, suplementado con
totrófica (por ejemplo: albinismo, deficiencia a reguladores del crecimiento, y en presencia de
nitrato reductasa) y un carácter dominante (por un estabilizador osmótico. Suelen ser cultiva-
ejemplo resistencia a antibióticos o herbicidas) dos en cajas de Petri con medio agarificado,
es de gran utilidad para la selección. Los híbri- donde se mezcla la solución de protoplastos
dos producidos por el cruzamiento de estos pa- con un medio de cultivo líquido a 40°C conte-
rentales con cualquier genotipo silvestre pue- niendo 1,2% de agar, perferentemente agarosa
den ser seleccionados en medio mínimo suple- (Fig. 4A). Los protoplastos quedan, así, atrapa-
mentado con el antibiótico o herbicida, que no dos en el medio semisólido y, luego de varios
permite el crecimiento de los parentales. días, se ven las colonias formadas (Fig. 4B).
• Selección por aislamiento de los he- Sin embargo, el medio líquido da mejores re-
terocariones o células híbridas. Es el sultados por varias razones: (a) los protoplas-
sistema más confiable y de más amplio tos de varias especies solo pueden dividirse en
espectro de aplicación. El aislamiento medio líquido, (b) la presión osmótica del me-
puede realizarse de dos maneras: dio puede ser fácilmente reducida a los pocos
a) Selección mecánica directa utilizando téc- días en cultivo, (c) la densidad celular puede

ser modificada agregando medio de cultivo o • Los requerimientos nutricionales: se han
las células con especial interés pueden ser ais- utilizado en muchos casos los mismos
ladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degra- medios de cultivo que se utilizan en el
dación de algunos componentes del medio por cultivo de células y tejidos, pero en ge-
la población de protoplastos puede producir neral son enriquecidos con vitaminas,
algunas sustancias citotóxicas, cuya concen- azúcares, aminoácidos, reguladores de
tración alrededor de las células será menor en crecimiento y también con aditivos ines-
el medio líquido. Una técnica muy eficiente que pecíficos como leche de coco, hidroliza-
combina medio sólido y líquido es la de cultivo do de caseína, extracto de levadura, etc.
en perlas de agarosa, donde los bloquecitos • El potencial osmótico del medio de cul-
con los protoplastos inmovilizados en agarosa tivo: los protoplastos requieren de pro-
son cortados en cuatro mitades y colocados en tección osmótica antes de regenerar la
medio líquido, donde se cultivan en contínua pared celular. Normalmente se ajusta
agitación. con el agregado al medio de cultivo de
Los protoplastos regeneran la pared celular manitol o sorbitol.
luego de uno a cuatro días en cultivo. La pre- • La densidad celular: la densidad inicial de
sencia de pared es esencial para lograr una protoplastos varía de 104 – 105 protoplas-
división regular. Luego de dos a tres semanas, tos/ml de medio de cultivo. Los cultivos
producto de mitosis sucesivas, se forman mi- con altas densidades producirán, a partir
crocolonias derivadas cada una de una célu- de cada protoplasto, colonias que debe-
la, que dos semanas después se pueden ver rán separarse tempranamente para evi-
a simple vista. Estos callos son transferidos a tar quimeras. Si deseamos colonias bien
un medio de cultivo y a condiciones apropiadas separadas para asegurar que provengan
para regenerar plantas (Fig. 4). de un solo protoplasto, la densidad inicial
debe ser baja, de 100 – 500 protoplastos/
Los principales factores a tener en cuenta ml. Hay protoplastos de varias especies
para el cultivo de protoplastos son: y tipos que no logran dividirse a bajas
Figura 4: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de mesófilo. B y D. Cultivo de los protoplastos

en perlas de agarosa suspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación de callo a partir de proto-
plastos. E. Callo en medio de regeneración. F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G.
Planta regenerada.

densidades de cultivo. Para estos casos to cromosómico permite revelar si el hí-
se desarrolló la técnica de cultivo con cé- brido posee el total de cromosomas de
lulas nodrizas o alimentadoras. Esta téc- cada parental, si se han fusionado más
nica consiste en exponer una suspensión de dos protoplastos, el grado de aneu-
de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis ploidía y posibles translocaciones inter-
que inhiben la división celular pero que genómicas. Mediante hibridación in situ
quedan metabolicamente activas. Estas empleando sondas de ADN repetitivo
células se plaquean en un medio agarifi- específico de especie puede evaluarse
cado, y luego se colocan por sobre éstas con más profundidad la contribución de
los protoplastos sin irradiar, de los cuales los genomas parentales y reestructura-
se formarán las colonias. También suele ciones cromosómicas en el híbrido.
utilizarse papel de filtro para separarlas 3. Isoenzimáticos. El patrón de bandas
de las células nodrizas. Otra técnica utili- isoenzimáticas del híbrido debe mostrar
zada es el cultivo en microgota, donde se bandas de ambos parentales, pudiendo
puede cultivar hasta un solo protoplasto. haber otras bandas que resultan de nue-
Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 vas combinaciones de las subunidades
µl de medio de cultivo, logrando densida- enzimáticas. Habitualmente se analizan
des de 2 – 4 x 103 protoplastos/ml. Con los patrones de glucosa-6-fosfato deshi-
ayuda de un micromanipulador se coloca drogenasas, fosfoglucoisomerasas, glu-
la célula y se la cubre con aceite mineral tamato oxalacetato transaminasas, este-
para evitar la deshidratación del medio. rasas, peroxidasas y fosfatasas ácidas.
• Los tratamientos físicos: tratamientos de Las isoenzimas son extremadamente va-
choque eléctrico y térmico estimulan la riables entre tejidos vegetales, por lo que
división de los protoplastos.. para el análisis se deben emplear los
• Las condiciones de cultivo: en general mismos tejidos u órganos, y en el mismo
los protoplastos son sensibles a la luz, estadío fenológico.
por lo cual durante el cultivo se los man- 4. A nivel de ADN. La demostración de la
tiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. presencia de ADN de ambos parentales
• El origen de los protoplastos: el estado es la prueba más directa de la hibrida-
fisiológico del tejido del cual provienen ción. El análisis de ADN es independien-
y la calidad de los protoplastos son muy te del tejido empleado y de la edad de la
importantes para obtener una elevada planta. Puede llevarse a cabo por RFLP
eficiencia en la respuesta al cultivo. (polimorfismos en la longitud de los frag-
mentos de restricción), RAPD (polimor-
9 Identificación de las plantas híbridas fismos en el ADN amplificado al azar)
La condición de híbrido debe verificarse o Southern blot, empleando sondas de
en la planta regenerada aún cuando se haya ADN repetitivo específico de especie o
efectuado algún tipo de selección para el cul- de genes de ARN ribosomal.
tivo de las células híbridas. A tal fin es conve-
niente efectuar diferentes evaluaciones, lo que 10 Logros y tendencias de la hibridación
permite una mejor caracterización del híbrido. somática
Comúnmente se llevan a cabo los siguientes La hibridación somática ha permitido produ-
estudios: cir híbridos que no se habían podido obtener
1. Morfológicos. Los híbridos somáticos por cruzamientos sexuales, incrementando
pueden presentar rasgos morfológicos así el flujo de genes en los cultivos. La tabla 1
característicos. Los mismos pueden ser muestra algunos ejemplos de híbridos somá-
intermedios a los de los parentales, la ticos que presentan algunas ventajas agronó-
suma de ellos, u otros completamente micas.
nuevos. En sus inicios, algunos esperaban que la hi-
2. Citológicos. El análisis del complemen- bridación somática permitiera producir nuevas

Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhiben algún carácter de interés agronómico
Híbrido Carácter
Híbridos simétricos
Solanum tuberosum x S. brevidens Resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de
papa (PLRV), al hongo Phytophtora infenstans y a
la bacteria Erwinia cartovora.
S. tuberosum x S. circaeifolium Resistencia a P. infenstans y al nemátodo
Globodera pallida.
S. tuberosum x S. phureja Mayor productividad de tubérculo.
S. melongena x S. integrifolium/S. saintwongseis Resistencia a la bacteria Pseudomonas
solanacearum .
Híbridos asimétricos
Brassica oleracea x B. campestris Resistencia al hongo Phoma lingam.
B. napus x B. carinata/B. juncea Resistencia a P. lingam
.
Nicotiana tabacum x N. Repanda/N. glutinosa Hipersensibilidad al virus del mosaico del tabaco
(TMV).
Cíbridos
B.campestris (silvestre) x B.napus/B. campestris Resistencia al herbicida atrazina y esterilidad
(cultivar) masculina
citoplasmática (CMS).
especies que expresaran las características nómica es el estado de diferenciación de los

deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, tipos celulares involucrados en la fusión. Por
por hibridación entre tomate y papa, se buscó ejemplo, cuando se fusionan células en fase
producir plantas que desarrollaran tomates en de crecimiento activo con células del mesófilo,
la parte aérea y tubérculos en la raíz (pomato). que no se dividen, generalmente se pierden los
La experiencia mostró que difícilmente pue- cromosomas de estas últimas.
dan lograrse estos híbridos espectaculares, Los híbridos somáticos o sexuales entre es-
debiéndose más bien dirigir la técnica hacia la pecies silvestres y cultivadas contienen mu-
introgresión de pocos genes silvestres en las chas características no deseadas de la prime-
especies cultivadas mediante hibridación asi- ra, además de aquéllas deseadas. El retrocru-
métrica o cibridación, manteniendo las carac- zamiento con la especie cultivada es requerido
terísticas generales del cultivo. para remover los genes no deseados del pa-
Uno de los factores que dificulta la obtención rental silvestre, pero ello no siempre es posible
de híbridos simétricos es la progresiva pérdi- debido a que los híbridos suelen ser estériles.
da de cromosomas de uno de los parentales La hibridación asimétrica y la cibridación tie-
que normalmente ocurre durante la regenera- nen la ventaja de incorporar sólo uno o pocos
ción. Si bien la fusión de protoplastos permite caracteres provenientes del parental silvestre
sortear las barreras precigóticas, siguen exis- en la especie cultivada, y producir plantas con
tiendo barreras genómicas que resultan en la mayor fertilidad..
eliminación espontánea de cromosomas du- Algunos caracteres deseables están codifi-
rante las divisiones celulares. El mecanismo cados por el genoma extranuclear, tales como
que determina la eliminación de cromosomas la androesterilidad citoplasmática y ciertos ti-
no está bien comprendido, pero generalmente pos de resistencia a enfermedades y a herbici-
se retienen los cromosomas del parental que das. Para estos casos es de particular utilidad
tiene el ciclo celular más corto. Uno de los fac- la cibridación dado que es un método simple
tores que puede producir incompatibilidad ge- para transferir estos genes.

11 Algunos ejemplos 12 Lecturas recomendadas
Se han obtenido híbridos intergenéricos de
Panicum maximum (+) Pennisetum america- Bhojwani, S.S., Razdan, M.K. 1996. Protoplast iso-
num (Ozias-Atkins et al., 1986), Saccharum lation and culture. Somatic hybridization and cy-
officinalis (+) Pennisteum americanum, Oriza bridization. En: Plant Tissue Culture: Theory and
sativa (+) Echinochloa oryzicola, Triticum mo- Practice, Capitulos 12 y 13. S.S. Bhojwani y M.K.
Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp.337-406.
nococcum (+) Pennisetum americanum, Festu-
Lindsey y Jones, 1992. Biología celular de la ingeni-
ca arundinacea (+) Lolium multiflorum. El pri- ería genética. En: Biotecnología vegetal agrícola,
mer caso de regeneración de plantas maduras Capítulo 6. Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza.
de híbridos intergenéricos (simétricos y asimé- Pp.105-142.
tricos) en gramíneas fue el Festulolium. Matsumoto, K. 2001. Híbridos somáticos. Biotec-
A pesar de los esfuerzos realizados, la apli- nología Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo /
cación de esta estrategia no ha conducido a junio: 26-28.
la obtención de nuevos híbridos de especies Zimmermann,U. 1983. Electrofusion of cells: prin-
importantes, fundamentalmente debido a pro- ciples and industrial potential. Trends in Biotech-
blemas de baja o nula fertilidad. Los métodos nology, 1,5:149-156.
actuales de transferencia de genes aislados
han desplazado el interés en la hibridación so-
mática. Sin embargo son una excelente herra-
mienta para estudiar las interacciones núcleo-
citoplasmáticas entre genomas.

II CAPÍTULO 3 ADN de un grupo metilo en la posición 5´ del
anillo de citosina (5mC) (Figura 1a). En plantas
la 5mC se distribuye en sitios donde se encuen-
Epigenética y evolución
tran dinucleótidos del tipo CG o trinucleótidos
CNG (donde N es cualquiera de los cuatro nu-
R.W. Masueli y C.F. Marfil
cleótidos). A su vez la metilación del ADN pue-

de dividirse en metilación de sitios simétricos
1. Introducción
Uno de los principios básicos de la biolo- y asimétricos. En el primer caso la metilación
gía es que la variabilidad genética es un pilar se produce en sitios CG y CNG donde las ci-
fundamental de la evolución. Sin variabilidad tosinas metilables se encuentran de a pares
la selección natural no podría actuar y la uni- ubicadas en hebras opuestas, mientras que la
formidad genética conduciría a la población o metilación en sitios asimétricos se produce en
especie a un callejón sin salida en el proceso citosina ubicadas en un contexto diferente en
evolutivo. Este concepto propuesto por Char- el ADN. La metilación simétrica es la más co-
les Darwin en 1859 fue corroborado por el re- mún y permite que los patrones de metilación
descubrimiento de las leyes de Mendel y por se mantengan a través de la enzima ADN me-
trabajos de genetistas un siglo después. Sin tiltransferasa que cataliza la transferencia de
embargo, la noción de que la variabilidad ge- un grupo metilo de la S-adenosil metionina a
nética se encuentra asentada únicamente en las citosinas del ADN. En Arabidopsis thaliana
la secuencia de nucleótidos ha sido puesta en los genes CMT3 y MET1 codifican para las en-
tela de juicio en los últimos años. Trabajos re- zimas Cromometiltransferasa 3 y Metiltransfe-
cientes especialmente en el área de la Genéti- rasa 1, respectivamente, la primera metila los
ca Molecular muestran que la variabilidad he- grupos CNG y la segunda los sitios CG. Des-
redable también se explica por cambios que no pués de la replicación del ADN sólo la hebra
necesariamente implican alteraciones en las
secuencias de bases del ADN. Variaciones he-
redables en los patrones de expresión génica
se pueden producir debido a “mecanismos epi-
genéticos” con total ausencia de variabilidad
genética. El término “epigenética” se refiere a
cambios heredables en el fenotipo, y por lo tan-
to en la regulación génica, que no son causa-
dos por alteraciones en la secuencia del ADN.
Se han descrito tres mecanismos de codifica-
ción de la información que no están basados
en la secuencia de ADN. Estos son: a) Metila-
ción del ADN, fundamentalmente de citosinas;
b) Modificaciones post-traduccionales de histo-
nas (acetilación, fosforilación, metilación, etc)
y c) Mecanismos basados en el ARN. A su vez
estos tres mecanismos actúan en forma con-
junta para mantener el grado de compactación
de la cromatina. En esta sección nos referire-
mos específicamente a como la hibridación in-
terespecífica y la poliploidía inducen cambios
en los patrones de metilación y dan lugar a
nuevas fuentes de variabilidad.
Figura 1. A. Agregado del grupo metilo al carbono
2. La metilación del ADN 5´ de la citosina. B. Mantenimiento de los patrones
Uno de los mecanismos epigenéticos más de metilación del ADN por las enzimas ADN metil-
estudiados en eucariotas es la incorporación al transferasas durante la replicación del ADN.

molde mantiene el patrón de metilación origi- isoesquizómeros HpaII y MspI, sensibles a la
nal. Las enzimas ADN metiltransferasas se en- metilación, que permiten detectar la metilación
cargan de metilar la hebra nueva de acuerdo al externa o interna de las citosinas en el sitio de
patrón de metilación de la hebra molde en los reconocimiento 5´-CCGG- 3´ de las enzimas
sitios CG y CNG (Figura 1b). Este mecanismo (Figura 2). Otro método desarrollado que per-
permite que se hereden los patrones de meti- mite analizar la metilación es la secuenciación
lación tanto entre células (mitóticamente) como previo tratamiento del ADN con bisulfito, que
entre generaciones (meióticamente). La proteí- convierte las citosinas no metiladas en uraci-
na DDM1, la cual es un factor remodelador de lo quedando las citosinas metiladas intactas.
la cromatina, también participa en el manteni- Luego la secuencia tratada se amplifica por
miento de patrones de metilación específicos PCR reemplazando los uracilos por timinas
a lo largo del genoma. Los mutantes de Ara- para su posterior secuenciación. A través de
bidopsis ddm1 (Deficient in DNA Methylation) estos métodos es posible analizar el estado de
tienen una reducción del 70% en los niveles metilación de secuencias aleatorias (MSAP) o
de 5mC, lo cual provoca una amplia variedad de secuencias específicas (secuenciación por bi-
defectos en el desarrollo de las plantas al in- sulfito) y determinar la variación epigenética en
ducir cambios heredables en otros loci. Si bien poblaciones naturales.
los patrones de metilación son heredables, se
ha demostrado que no son estáticos y que el
estado de desarrollo de la planta y condiciones
ambientales alteran estos patrones. Por otro
lado, la metilación está asociada a cambios en
la expresión génica. En general el incremento
en la metilación (hipermetilación) de un locus
no solo produce la reducción en la expresión o
el total silenciamiento del mismo, sino que tam-
bién reprime transcripcionalmente e inactiva
transposones capaces de movilizarse a través
del genoma. Se demostró que anulando (knock
out) los genes CMT3 y MET1 se desmetila el
genoma activándose elementos transponibles
y genes que se encontraban silenciados. Estos
estudios mostraron que la pérdida de metila- Figura 2. Esquema que representa el análisis de
ción produce aberraciones tales como cambios metilación del ADN a través de la técnica de MSAP
morfológicos en hojas y flores, como así tam- (Methylation Sensitive Amplified Polymorphism). El
bién en el tiempo de floración. ADN se corta con las enzimas de restricción EcoRI y
HpaII/MspI, luego se ligan adaptadores específicos
3. Métodos para analizar la variación epi- para las enzimas y se amplifican los fragmentos con
genética primers que reconocen la secuencia de los adapta-
Los métodos comúnmente utilizados para dores. Si las citosinas del sitio de reconocimiento de
HpaII (CCGG) se encuentran metiladas, esquema
analizar la variabilidad genética, tales como
de la derecha, la enzima no corta y por lo tanto no
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymor-
se amplifica el fragmento generando polimorfismo.
phism), RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Po-
lymorphism) o SSR (Microsatélites) no son
adecuados para medir la variabilidad epigené- 4. Epigenética y variación natural
tica. Una modificación de la técnica de AFLP, El grado de metilación de genes puede va-
llamada MSAP (Methylation Sensitive Am- riar entre plantas produciendo cambios en la
plified Polymorphism), en la que se reempla- expresión y nuevos fenotipos que son hereda-
za la enzima de corte frecuente MseI por los bles. A las secuencias génicas que difieren en

el grado de metilación se les llama “alelos epi- especies diferentes aunque relacionadas. Tan-
genéticos o epialelos”. Se han descrito varios to en el caso de la alopoliploidía como en la
ejemplos de epialelos que ocurren naturalmen- hibridación interespecífica dos genomas diver-
te. Un ejemplo clásico es el gen CYCLOIDEA gentes se unen en un núcleo híbrido, desen-
en Linaria vulgaris, que codifica para un acti- cadenando una serie de cambios genéticos y
vador de la transcripción cuyo efecto es la pre- epigenéticos que dan lugar a una gran variabi-
sencia de un fenotipo floral de simetría radial lidad fenotípica (Figura 3). En híbridos alopoli-
y otro de simetría bilateral. A través del análi- ploides sintéticos de Arabidopsis se demostró
sis molecular de este gen se demostró que en que se producen inestabilidades fenotípicas
la naturaleza existían dos epialelos, uno más asociadas con cambios en la metilación y en
metilado que produce la simetría radial y otro la expresión génica. Por otro lado en genera-
con menor metilación asociado a la simetría ciones tempranas de híbridos alopoliploides
bilateral. Mediciones de los patrones de me- de trigo y Brassica se reportaron cambios ge-
tilación entre introducciones de Arabidopsis néticos estructurales tales como eliminacio-
thaliana muestran variaciones en los patrones
de metilación de más del 34% siendo meno-
res al 1% las variaciones en metilación entre
plantas dentro de una misma introducción. En
una población natural de la especie silvestre de
papa Solanum ruiz-lealli se encontró que plan-
tas que tenían una variación genética menor al
1% (medida por AFLP) presentaban variacio-
nes en los patrones de metilación (medida por
MSAP) superiores al 18%. Estas variaciones
no son producidas por polimorfismo de nucleó-
tidos sino por variaciones en los patrones de
metilación. Resultados similares se obtuvieron
analizando introducciones de algodón donde la
diversidad detectada por MSAP fue superior a
la obtenida analizando patrones de RFLP.
5. Cambios epigenéticos producidos por

hibridación interespecífica y poliploidía
La hibridación interespecífica y la poliploidía
son dos mecanismos profundamente relacio-
nados que han jugado roles muy importantes
en la evolución vegetal. Una de sus caracte-
rísticas más sobresalientes es la capacidad
de generar una amplia variación fenotípica de
gran importancia en la microevolución adapta-
tiva. La poliploidización implica la generación
de un organismo con un número aumentado de
complementos genómicos completos. Los jue- Figura 3. Esquema que representa el “estrés o
shock genómico” producido por efecto de la hibri-
gos cromosómicos adicionales pueden prove-
dación interespecífica. El cruzamiento de dos es-
nir de la misma especie (autopoliploidía) o de pecies que han divergido induce alteraciones en
una especie divergente (alopoliploidía), impli- los patrones de metilación en el núcleo híbrido que
cando en este último caso un proceso de hibri- producen cambios en la transcripción y reestruc-
dación interespecífica. A su vez, la hibridación turaciones genéticas tales como: movimiento de
interespecífica se define como la formación de transposones, rearreglos cromosómicos y cambios
un nuevo organismo por cruzamiento entre dos en la cromatina.

nes de secuencias. En nuestro Laboratorio mostró cambios en los patrones de metilación
se obtuvo un híbrido interespecífico entre un de las plantas híbridas en relación a las espe-
haploide de la papa cultivada Solanum tube- cies progenitoras. Estos resultados obtenidos
rosum (2n=2x=24) y la especie silvestre Sola- en distintos híbridos interespecíficos sugieren
num kurtzianum (2n=2x=24). Algunas plantas que existe una correlación entre la remodela-
híbridas presentaban malformaciones florales, ción general de la metilación del genoma híbri-
similares a las descritas en Arabidopsis, que do, los cambios genéticos y la alteración de la
incluían cambios en la morfología floral, péta- actividad génica y el fenotipo.
los disectados, anteras atrofiadas y estilos re- En resumen, tanto la poliploidía como la hi-
torcidos entre otras. Por otro lado, los híbridos bridación interespecífica inducen cambios ge-
presentaban nuevos fragmentos de AFLP y nómicos como producto del estrés generado
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) por la duplicación génica o por la reunión de
que no estaban presentes en los padres. Así dos genomas divergentes en un núcleo híbri-
mismo, el análisis de la metilación por MSAP do. Además de la metilación del ADN otros me-
Figura 4. Análisis de la segregación de los patrones de metilación en plantas de las generaciones F1 y

RC1. A, porción de los patrones de amplificación MSAP de S. tuberosum (tbr), S. kurtzianum (ktz), dos
híbridos F1 (H1 y H4) y tres plantas de la retrocruza 1 (RC1) H1 x S. kurtzianum y H4 x S. kurtzianum. El
ADN extraído fue digerido con EcoRI/HpaII (H) y EcoRI/MspI (M). El Patrón de metilación del fragmento 1
cambia en las progenies sucesivas. El fragmento 2 muestra un patrón de metilación altamente conservado.
B, interpretación gráfica de los fragmentos MSAP 1 y 2 del panel A. Los cuadrados representan el sitio
de reconocimiento doble cadena (CCGG) de los isoesquizómeros HpaII/MspI. Cuadrados negros indican
citosinas metiladas.

canismos tales como, acetilación y metilación vas de reproducción sexual (Fragmento 2 de la
de histonas, activación de transposones y re- Figura 4). Desde un punto de vista evolutivo la
gulación por pequeños ARNs y ARN de interfe- variabilidad generada por mecanismos epige-
rencia pueden causar cambios en la expresión néticos amplía la variabilidad genética ya que
génica de híbridos y poliploides. aparecen nuevos epialelos que pueden ser
seleccionados en poblaciones naturales. Ade-
6. Herencia de los patrones de metilación más, las variantes epialélicas son potencial-
La obtención de mutantes que afectan la mente reversibles y generarían fenotipos más
metilación del ADN ha permitido un amplio de- flexibles que se adaptarían a ambientes cam-
sarrollo de esta área. Las anormalidades en el biantes. A partir de este tipo de evidencias, un
desarrollo observadas en mutantes ddm1 de concepto que está ampliamente documentado
Arabidopsis son trasmitidas a la progenie, in- para fenómenos genéticos, debe ser ampliado
clusive en líneas que segregan respecto a la de manera que abarque la información epige-
mutación ddm1. Estas observaciones morfo- nética: en cada generación se reconstituye un
lógicas de plantas ddm1 se correlacionan con reservorio epigenético enteramente nuevo, del
datos moleculares, ya que la reducción en la cual surgen los individuos que son los blancos
metilación que afecta a la mayoría de las sede la selección natural en esa generación.
cuencias del genoma de estas plantas, tanto
repeticiones como secuencias de bajo número 6. Lecturas recomendadas
de copias, pueden ser heredadas establemen-
te a través de la mitosis y meiosis. Esto indica Adams K.L. and Wendel J.F. 2005. Novel patterns
que la información epigenética, en forma de of gene expression in polyploid plants. Trends in
metilación diferencial del ADN, puede ser tras- Genetics 21:569-543.
mitida en plantas a través de generaciones de Jablonka E. and Lamb M. 1995. Epigenetic inherit-
ance and evolution. The Lamarckian dimension.
reproducción sexual. Otro modelo experimen-
Oxford University Press, New York, 346 pp.
tal que ha permitido obtener importante infor- Kalisz S. and Purugganan M.D. 2004. Epialleles vs
mación acerca de la dinámica en los patrones DNA methylation: consequences for plant evolu-
de metilación es la obtención de alopoliploides tion. Trends in Ecology and Evolution 19:309-314.
e híbridos interespecíficos sintéticos. La ob- Madlung A. and Comai L. 2004. The effect of stress
tención de progenies a través de cruzamientos on genome regulation and structure. Annals of
sexuales controlados permite una comparación Botany 94:481-495.
precisa entre la generación parental y la des- Marfil C.F., Camadro E.L. and Masuelli R.W. 2009.
cendencia. En la Figura 4 se ejemplifica cómo Phenotypic instability and epigenetic variability
a través de análisis MSAP se pueden inferir los in a diploid potato of hybrid origin, Solanum ruiz-
lealii. BMC Plant Biology 9:21.
patrones de metilación de secuencias CCGG.
Rapp R.A. and Wendel J.F. 2005. Epigenetics and
Estudiando generaciones sucesivas de repro- plant evolution. New Phytologist 168:81-91.
ducción sexual (Filial 1-F1; Retrocruza 1- RC1; Riddle N.C. and Birchler J.A. 2003. Effects of reu-
etc.) se puede evidenciar si ocurren cambios nited diverged regulatory hierarchies in allopoly-
en la metilación y qué estabilidad tienen los ploids and species hybrids. Trends in Genetics
mismos. Datos obtenidos en híbridos interes- 19:597-600.
pecíficos sintéticos diploides y poliploides de
varias especies indican que en el genoma de
las plantas existen secuencias particularmen-
te sensibles a remodelar su metilación (Frag-
mento 1 de la Figura 4). Por otro lado, hay se-
cuencias con patrones de metilación altamente
conservados evolutivamente, ya que especies
diferentes comparten un mismo patrón, el cual
a su vez se hereda invariablemente en todas
las plantas obtenidas en generaciones sucesi-

II. Capítulo 4 ha contribuido considerablemente a dilucidar
procesos biológicos fundamentales para la vida
vegetal y para la productividad de los cultivos.
Mutagénesis, TILLING y Las investigaciones en busca de mejorar la
EcoTILLING efectividad y la especificidad de los tratamien-
tos mutagénicos sobre las plantas cultivadas, y
Alberto Prina, Alejandra Landau, de procedimientos de manejo y selección más
María Gabriela Pacheco y Esteban H Hopp eficientes, tuvieron un gran auge en las déca-
das del 50, 60 y 70.
3.1. Mutagénesis clásica Hoy existe un renovado interés por esta te-
3.1.1. Introducción mática al que sin duda contribuyó el enorme
El concepto de mutación en Biología fue in- conocimiento generado por la biología molecu-
troducido a principios del siglo pasado por de lar, que alejó viejos fantasmas sobre la variabi-
Vries, para designar a los cambios heredables lidad inducida, y el reciente desarrollo de técni-
de aparición súbita. Hoy en día las mutaciones cas moleculares de gran capacidad de análisis
se explican por alteraciones en el ADN, que van como la técnica de genética reversa denomina-
desde cambios en una o unas pocas bases (mu- da TILLING (del inglés, Targeting Induced Local
taciones de punto) hasta pérdidas, adiciones o Lesions in Genomes).
translocaciones de grandes porciones de ADN A continuación se discuten los principales
(cambios estructurales) o incluso cromosomas factores a tener en cuenta para la aplicación efi-
y genomas enteros; también podrían incluirse ciente de la metodología clásica de mutaciones
entre ellas las alteraciones heredables de na- inducidas en plantas cultivadas. La descripción
turaleza epigenética, por ejemplo los cambios detallada de protocolos puede consultarse por
en la metilación del ADN (ver Grant-Dwonton ejemplo en: Neuffer, 1993; IAEA, 1995; Koorn-
y Dickinson, 2005). Las mutaciones son el ori- neef, 2002.
gen primario de la variabilidad genética y, por lo
tanto, cierto control sobre su frecuencia y/o es- 3.1.2. Tratamientos mutagénicos
pectro puede considerarse una herramienta de 3.1.2.1. Agentes mutagénicos
gran valor para el mejoramiento de las plantas Los agentes artificiales utilizados en mutagé-
cultivadas. A fines de la década del 20, Stadler nesis clásica pueden dividirse según su natura-
desarrolló magistralmente las bases de la mu- leza en dos grandes grupos: físicos o químicos.
tagénesis experimental en plantas cultivadas, Otra manera artificial de incrementar la tasa
hecho que fue contemporáneo a los trabajos de mutaciones es a través de las condiciones
pioneros de Muller sobre mutagénesis en Dro- especiales del cultivo in vitro de células o de
sophila. El primer éxito comercial consistió en tejidos (variación somaclonal). También existen
una mutante de tabaco de hoja clara y de gran factores de naturaleza biológica que causan al-
calidad obtenida por Tollenar (Holanda) que lle- gún tipo de inestabilidad genética mayor a la
gó a cubrir una importante área de cultivo en habitual de la especie, como la producida por
Indonesia a mediados de la década del 30. Hoy ejemplo por genes relacionados con los siste-
en día existen en el mundo miles de cultivares mas de reparación de ADN o por la activación
inscriptos obtenidos por esta metodología. Se de transposones.
incluyen en esta lista, cultivos de gran importan-
cia económica, como los principales cereales, Agentes físicos
oleaginosas, así como, numerosas especies de Entre éstos tenemos distintos tipos de radia-
hortalizas y cultivos industriales. Los caracteres ciones ionizantes como los rayos X, los rayos
que han sido mejorados son muy diversos: to- gamma, los neutrones, los protones y las partí-
lerancia a herbicidas, a estrés bióticos o abió- culas alfa, cada una de ellas con diferente po-
ticos, calidad nutricional, industrial, etc. (para der de ionización y de penetración.
más información ver IAEA 1995, Datta 2005). Las radiaciones ionizantes al atravesar la
Además, la ampliación de la variabilidad dis- materia producen iones radicales inestables
ponible por medio de las mutaciones inducidas y electrones libres, que a su vez originan una

serie de reacciones químicas directas (por io- los neutrones ligeros. Las consecuencias ge-
nización de un átomo en una molécula), o in- néticas típicas de las radiaciones ionizantes
directas (por reacción de las macromoléculas son las aberraciones cromosómicas, como las
con productos radiolíticos, mayormente con los deleciones y translocaciones, que han resulta-
radicales OH del agua). Entre otros cambios do de utilidad para la ubicación de numerosos
químicos que afectan el ADN ocurre la deami- genes sobre los cromosomas. Las deleciones
nación de bases y producción de 8-hidroxiade- producidas por las radiaciones densamente io-
nina y de varios glicoles de timina, oxidación nizantes son de mayor tamaño y se agrupan,
de alcoholes de la desoxirribosa y roturas de formando clusters, siendo más difíciles de re-
las uniones carbono-carbono. Los tratamientos parar. Las de mayor tamaño difícilmente sor-
con radiaciones ionizantes implican habitual- tean el filtro de la gametogénesis, por lo que en
mente altos niveles de daño cromosómico, ori- muchos casos no son transmitidas sexualmen-
ginando roturas simples y dobles de las cade- te a las progenies. Las deleciones conducen
nas de ADN, y efectos fisiológicos deletéreos, a knock outs génicos y han sido utilizadas por
que conducen a una alta letalidad celular y a ejemplo para inactivar genes que promueven
una alta esterilidad de las plantas de la prime- la susceptibilidad a algunas enfermedades en
ra generación, todo lo cual limita la obtención trigo. En combinación con la tecnología de mi-
de una alta tasa de mutaciones en la segunda croarreglos pueden permitir la identificación
generación. de genes candidatos cuya expresión pueden
cambiar drásticamente. En muchos casos, las
La magnitud y el tipo de daño ocasionado
deleciones pueden ser localizadas por medio
por las radiaciones ionizantes son marcada-
de Southern blot o PCR (reacción en cadena
mente influidos por ciertas características del
de la polimerasa).
material tratado, como el estado metabólico y
Por otro lado, las propiedades de las radia-
el contenido de agua y de oxígeno. Así tam-
ciones ionizantes para romper los cromosomas
bién, los efectos de determinada dosis pueden
y permitir así translocaciones han sido utiliza-
variar de acuerdo al mayor o menor tiempo en
das desde hace más de 50 años para transferir
que se aplica (tasa de irradiación), desde unos segmentos cromosómicos entre distintas espe-
pocos segundos o minutos (irradiación aguda) cies; técnica que se ha utilizado para mejorar la
hasta meses o años (irradiación crónica). Los resistencia a enfermedades en trigo.
efectos letales de determinada dosis pueden La luz ultravioleta es también una radiación
disminuirse, por ejemplo, cuando se aplica re- de origen electromagnético, pero a las longi-
partida en distintos momentos, con intervalos tudes de onda habitualmente utilizadas no se
de uno o varios días de recuperación o incluso considera ionizante. Su longitud de onda es
dividida en aplicaciones agudas realizadas en varios miles de veces superior a la de los ra-
años sucesivos (tratamientos recurrentes). yos X y gamma, y por su baja penetración sólo
Las radiaciones ionizantes que más se han es utilizable sobre materiales muy delgados,
utilizado para inducir variabilidad con fines de como por ejemplo granos de polen y cultivos
fitomejoramiento son los rayos X y los gamma, celulares o de tejidos. La luz ultravioleta origina
con longitudes de onda del orden de fracciones un daño muy específico sobre el ADN, consti-
de nanómetros (nm) a varios nm. Si bien los tuido mayormente por la formación de dímeros
rayos gamma tienen mayor poder de penetra- de timina que a su vez son eficientemente re-
ción que los X, los dos pueden penetrar desde parados por sistemas celulares muy especiali-
varios milímetros a centímetros, siendo por lo zados. Su efecto biológico varía considerable-
tanto adecuados para tratamientos aplicados mente de acuerdo a la longitud de onda, siendo
sobre semillas o yemas vegetativas. Ambas la de mayor absorción por el ADN aquella en el
son radiaciones de origen electromagnético rango de 250 a 290 nm.
de baja energía lineal liberada al atravesar la
materia, por lo que son clasificadas como no Agentes químicos
densamente ionizantes, en contraposición con Las primeras investigaciones sobre la capa-
las densamente ionizantes, como por ejemplo cidad mutagénica de las sustancias químicas

datan de principios del siglo pasado, pero su deleciones de pares de bases. La MNU, tam-
uso en fitomejoramiento se concretó muchos bién de baja reactividad, además de las alqui-
años después a través de los trabajos que faci- laciones mencionadas, forma mayor cantidad
litaron el uso al disminuir los requerimientos en de fosfodiésteres, los que pueden derivar en
equipamientos e instalaciones. roturas de cadenas de ADN y contribuir a la le-
Existen muchas sustancias con capacidad talidad. El mutágeno químico que más se ha
mutagénica, sin embargo los más utilizados utilizado es el EMS, que habitualmente se asu-
con fines prácticos son los denominados su- me como productor de mutaciones de punto
permutágenos, entre ellos varios agentes alqui- del tipo transición G/C a A/T. En relación a esto
lantes y la azida sódica, que pueden aumentar es interesante advertir que hay 5 aminoácidos
varios cientos de veces las tasas de mutación que en sus codones sólo tienen G o C en po-
espontánea. siciones sinónimas, por ejemplo lisina (AAA o
A diferencia de los tratamientos con radia- AAG) y tirosina (UAU o UAC), por lo que no
ciones ionizantes donde las moléculas son podrían ser cambiados por otros aminoácidos
afectadas indiscriminadamente, los mutáge- mediante transiciones del tipo G/C a A/T.
nos químicos suelen ser más específicos. Los Un mutágeno muy eficiente en algunas plan-
ejemplos clásicos son el ácido nitroso y los tas cultivadas, como cebada, arveja, trigo y
análogos de bases, productores de sustitucio- arroz, es la azida sódica. Esta droga no es de
nes del tipo transición, y las acridinas que propor sí mutagénica sino que necesita de la vía
ducen mutaciones de desfase de lectura. Los de la síntesis de L-cisteína para transformar-
mutágenos químicos que más se han utilizado se en el metabolito mutagénico azido-alanina.
en fitomejoramiento son los agentes alquilan- La azida no se ha visto como mutagénica en
tes, denominados así por incorporar grupos al- mamíferos y por lo tanto desde el punto de vis-
quilo a las macromoléculas. A este grupo per- ta de la bioseguridad, no sería peligrosa como
tenecen los alquil alcano sulfonatos, como el mutágeno en humanos, más allá de su recono-
etil metano sulfonato (EMS) y el metil metano cida toxicidad como veneno de la respiración
sulfonato (MMS), los dialquil sulfatos, como el oxidativa. En cebada, la azida sódica induce
dimetilsulfato (DMS) y el dietilsulfato (DES); y esencialmente sustituciones de bases, en su
los compuestos nitrosos, como la N-metil-N-ni- mayor parte transiciones, existiendo resulta-
troso-urea (MNU o MNH) y la N-etil-N-nitroso- dos divergentes en la bibliografía sobre su tipo:
urea (ENU). Se trata de compuestos electro- G/C a A/T o viceversa.
fílicos que reaccionan con átomos que tienen Tanto la azida como el EMS, por su propie-
un par de electrones libres como S, N y O (en dad de inducir mutaciones de punto, son mu-
ese orden, de mayor a menor fuerza nucleofíli- tágenos indicados para la obtención de series
ca), y de esta manera actúan sobre las bases y alélicas y ambos han sido utilizados para ge-
los grupo fosfatos del ADN y también sobre las nerar poblaciones para análisis de genética re-
proteínas. Los agentes de mayor reactividad, versa como el TILLING (ver más adelante). Ac-
como el MMS y el DMS, tienen afinidad por los tualmente, las técnicas de TILLING están apor-
centros más nucleofílicos y en el ADN atacan tando una enorme cantidad de información so-
mayormente el nitrógeno 7 de la guanina (N7- bre el efecto molecular de los mutágenos. Esto
G) y muy poco al O6-G o al grupo fosfato. Por ha permitido detectar que más del 50 % de las
el contrario, los agentes de menor reactividad mutaciones inducidas por EMS o azida sódica
como ENU, tienen un mayor espectro de sitios son de sentido cambiado, y más del 20 % son
de alquilación y afectan en mayor proporción al mutaciones silenciosas. En términos genera-
O6-G. Esto tiene su importancia si considera- les aplicando estos agentes en varias plantas
mos que la O6-alquilG sería la principal causa cultivadas se han identificado polimorfismos en
de apareamientos erróneos de G con T, mien- nucleótidos simples (SNPs) con una frecuencia
tras que la N7-alquilG origina depurinación y que va de 1/50 a 1/500 kb.
errores de reparación, que tienden a derivar Se cree importante señalar que además de
en roturas cromosómicas y ocasionalmente en las propiedades particulares de los mutágenos

hay factores biológicos que influyen sobre la efecto de los mutágenos. Luego del tratamien-
tasa y el espectro de mutaciones, como la fase to químico, la semilla se lava cuidadosamen-
en que se encuentre la célula en el momento te y se seca, y una vez eliminada la humedad
de ser tratada (G1, S o G2), la composición de superficial estará lista para la siembra. En la
bases y el tamaño del gen y, dependiendo del semilla tratada se inicia la generación M1, esta
tipo de daño, la eficiencia de los distintos sis- nomenclatura denota la primera generación de
temas de reparación celular y las condiciones mutantes y se diferencia de una F1 en que NO
en que estos actúen. Todo esto hace que dosis es resultado de un cruzamiento, sino de un tra-
similares de un mismo mutágeno puedan tener tamiento mutagénico.
efectos biológicos muy dispares. En las plantas de propagación vegetativa los
equivalentes a las semillas son los órganos de
3.1.2.2. Materiales tratados multiplicación como yemas, rizomas, etc. Éstos
Órganos seleccionados para el tratamiento son también órganos multicelulares y la com-
En el caso de especies propagadas por se- plejidad de crecimiento de los sectores muta-
millas, éstas han sido el órgano preferido a trados es aún mayor que en las semillas. No obs-
tar, ofreciendo la ventaja de un manejo sencillo tante, esto no ha sido impedimento para que,
que permite trabajar con grandes cantidades en la práctica, se hayan obtenido numerosos
de material en condiciones relativamente fáci- cultivares mejorados. En general los órganos
les de controlar. La principal dificultad del tra- vegetativos son más sensibles que las semillas
tamiento de semillas radica en la constitución a los efectos tóxicos de los mutágenos quími-
multicelular del embrión, que hace que los indi- cos y resulta más difícil lograr aplicaciones ho-
viduos originados a partir de la semilla tratada mogéneas. Por ello, las radiaciones ionizantes
resulten quiméricos, es decir compuestos por con suficiente penetración han sido las más
células o clones celulares de distinta constitu- utilizadas en estos casos. Por medio de irra-
ción genética. Esto es así porque en cada cé- diación de yemas con altas dosis puede redu-
lula, los cambios genéticos o mutaciones que cirse el número de células del vástago y así
potencialmente puede producir el mutágeno tender a la obtención de vástagos mutantes no
pueden tener muchísimas alternativas diferen- quiméricos.
tes, haciendo cercana a cero la probabilidad de El problema del quimerismo de las plantas
que un grupo de células meristemáticas muten M1 puede evitarse tratando órganos unicelu-
simultáneamente en el mismo gen y posición lares como óvulos, polen o proembriones uni-
nucleotídica Los clones celulares que forman celulares, y en el caso de plantas de multipli-
la planta adulta tienen un crecimiento irregular cación vegetativa, por tratamiento de yemas
de difícil predicción que complica el diseño de adventicias o de cultivos in vitro de células o
un manejo eficiente del material experimental. tejidos. La utilización de mutagénesis inducida
A pesar de esto, el tratamiento de semillas ha en combinación con el cultivo in vitro presen-
dado numerosísimos éxitos aplicados al mejo- ta además la ventaja de permitir una selección
ramiento de diversos cultivos. Como se señaló sobre un gran número de células mutageniza-
anteriormente los tratamientos físicos de semi- das. Si bien esta selección está limitada a ca-
llas deben hacerse con radiaciones que tengan racteres que puedan ser evidenciados en estas
suficiente penetración, por ejemplo rayos X, condiciones, son varios los casos que han re-
rayos gamma, o neutrones ligeros, así como sultado exitosos, por ejemplo con respecto a
también se deberá prestar atención a los diver- mejorar la tolerancia a temperaturas extremas
sos factores que influyen en el efecto biológico y resistencia a algunas enfermedades y herbi-
de las radiaciones. Por otro lado, los tratamien- cidas.
tos químicos de semillas se aplican mediante
inmersión en solución acuosa y con agitación Elección de los genotipos parentales
constante durante varias horas. Los tratamien- La filosofía de la mutagénesis inducida apli-
tos cortos suelen aplicarse después de un re- cada al mejoramiento es en cierta medida si-
mojo en agua que potencia marcadamente el milar a la de la retrocruza, en el sentido que se

busca cambiar un gen (o unos pocos) conser- las cuales se formará la planta M1 y por lo tan-
vando un fondo genético determinado. Por otro to en éstas tenderá a aumentar el tamaño de
lado, se diferencia claramente de ella en que cada uno de los clones celulares.
la variante alélica de interés es generada de C) Factores relativos al mutante inducido, es-
novo y, por lo tanto, puede ser una variante no pecialmente en lo que se refiere a su expresión
presente en el germoplasma actual de la espe- y competitividad. En especies reproducidas
cie. Es aconsejable partir de genotipos con un sexualmente los sectores mutantes tendrán
buen fondo genético, de manera que puedan que sortear dos tipos de filtros selectivos para
ser mejorados por cambios en uno o unos po- llegar a la segunda generación (M2). En esta
cos genes. Por ejemplo, puede mejorarse la re- generación, salvo excepciones, las plantas
sistencia genética a determinada enfermedad tendrán una constitución genética homogénea
conservando un fondo genético de buenas caen todo el soma. En el caso de plantas autóga-
racterísticas agronómicas y/o de calidad indus- mas, la segregación de homocigotas mutantes
trial o comercial. También por cambios en un en M2, permitirá la observación de los alelos
solo gen puede adaptarse un genotipo a una mutantes que tengan expresión recesiva. En
nueva región mediante mutantes para el largo el caso de las alógamas para que esto ocurra
de ciclo, o por ejemplo cambiar drásticamente será necesario realizar la autofecundación for-
la calidad industrial por mutantes en las carac- zada de las plantas M1. En el maíz, por ser una
terísticas del aceite de la semilla. planta diclino monoica en la que los clones ce-
lulares que forman las flores femeninas y mas-
3.1.3. Evolución de los daños de los culinas se originan en distintas células iniciales
tratamientos mutagénicos de la semilla, la autofecundación de las plan-
3.1.3.1 Desarrollo de los sectores mutantes tas M1 sólo servirá para el control genealógico
Tal como se ha descripto, el tratamiento de pero no para la segregación de homocigotas
órganos multicelulares originará plantas M1 mutantes en la M2. Esto hace que la aplica-
quiméricas en las que las mutaciones induci- ción de mutágenos sobre órganos unicelulares
das sólo ocuparán un sector. El tamaño y la que evitan la formación de plantas quiméricas,
forma de estos sectores mutantes dependerán como el polen, resulte especialmente intere-
sante en maíz.
de varios factores:
Volviendo a los filtros selectivos, primero ocu-
A) Factores inherentes al material tratado,
rrirá la selección somática o diplóntica a nivel
como el estado de desarrollo y la estructura
de los tejidos quiméricos del soma de la plan-
del embrión o del meristema vegetativo y la on-
ta M1. La competencia de un sector mutante
togenia de la especie. Esto ha sido estudiado
con su entorno puede comenzar muy temprano
principalmente mediante marcadores clorofíli-
a nivel de la célula mutante original. Luego a
cos y mutantes del polen, y más recientemente
nivel de la gametogénesis de las plantas M1
por técnicas basadas en la recombinación de
ocurrirá la selección gamética o haplóntica. Lo
ADN para activar marcadores específicos. En
arriba mencionado es válido para los genes lo-
plantas con alta capacidad de macollaje, como
calizados en el núcleo, pero en el caso de ge-
cebada o trigo, la tendencia general es que el nes localizados en las organelas citoplasmáti-
tejido germinativo de las espigas principales cas (plástidos y mitocondrias), que obedecen a
provenga de varias células iniciales (general- reglas de la herencia más flexibles, el desarro-
mente de 4 a 12) mientras que puede encon- llo de las quimeras es más complejo que para
trarse que más de una espiga lateral provenga los nucleares, sumado a que la competencia
de la misma célula inicial. del alelo mutante también puede ocurrir a nivel
B) Factores relativos al tratamiento como el intracelular entre los distintos genomas de una
tipo de mutágeno, dosis y condiciones de apli- organela. Una representación esquemática
cación. En general los tratamientos que indu- que ilustra la evolución en uno y otro caso pue-
cen alta letalidad celular, como por ejemplo al- de encontrarse en Kirk y Tilney-Bassett (1978).
tas dosis de radiaciones ionizantes, reducirán En las plantas multiplicadas vegetativamen-
el número de células meristemáticas a partir de te, la selección gamética y la recombinación

sexual estarán ausentes, a lo que se agrega de cromosomas enteros. En éstos habitualmen-
que en las yemas, las células meristemáticas te se observa una menor proporción de cam-
tienen una organización del tipo tunica corpus, bios fenotípicos drásticos que en los diploides.
es decir que están organizadas en capas histo-
génicas que cubren un cuerpo central y que al 3.1.3.2. Expresión de los distintos daños
crecer se comportan, en cierta manera, como El esquema de la Figura 1 indica los distin-
independientes. Por otro lado, estas plantas tos momentos en que pueden observarse los
son comúnmente poliploides y con un alto nivel daños producidos por el tratamiento de semi-
de loci heterocigotas, todo lo cual hace que un llas (para más detalles ver Prina, 1989). Las
espectro muy diferente de mutantes puede es- proporciones de los distintos daños tienen ten-
tar disponible para el mejoramiento vegetal. La dencias definidas de acuerdo al mutágeno y
influencia de los genes al estado heterocigota la manera en que se aplique. Si comparamos
sobre la expresión de los sectores mutantes a mutágenos como el EMS y la azida sódica con
nivel somático fue estudiada por Prina y Favret los rayos X, a iguales niveles de daño en las
(1988) utilizando como modelo la cebada. plantas M1 (sectores somáticos, aberraciones
Por otro lado, la poliploidía puede influir no- cromosómicas, letalidad), con los primeros ten-
tablemente la expresión y vitalidad de las mu- dremos tasas de mutaciones muy superiores
tantes, los genotipos poliploides tienen mayor en la generación M2. Tal información es útil
capacidad de soportar cambios drásticos como para la elección de las dosis más adecuadas
grandes deleciones de cromosomas o incluso en base a observaciones en las plantas M1. En

principio puede pensarse que a mayores do- cer las mutaciones inducidas por el tratamien-
sis se obtendrá un mayor número de mutantes to mutagénico de otras preexistentes, o de las
en la M2, pero la elección no es tan sencilla. originadas por mezcla de semillas o de polen.
En el caso de las radiaciones ionizantes sue- Por otro lado, en el caso de hallarse mutan-
le recomendarse el uso de la dosis letal 50, tes idénticas permite evaluar la probabilidad de
buscando un compromiso entre la cantidad de que se hayan originado en el mismo o en dis-
plantas sobrevivientes en la M2 y la cantidad tintos eventos mutacionales.
de mutaciones que ellas porten. Con los quími- 2- Manejo por conjunto o pool de 1 semilla
cos los efectos letales suelen no tener una co- por espiga, panoja o rama: en este caso la co-
rrelación directa con los efectos mutagénicos. secha se limita a una semilla de cada una de
Con variaciones importantes entre especies e las inflorescencias principales de las plantas
incluso entre genotipos de una misma especie, M1 con las que se formará un conjunto (pool).
las más recomendables son las concentracio- Se basa en que cada una de las semillas del
nes intermedias. En los tratamientos de azida pool provendrá de células iniciales diferentes, y
se ha visto una influencia muy marcada del pH por lo tanto en un mismo pool no se encontra-
de la solución. Con estos mutágenos, el daño rán mutantes provenientes de un mismo even-
más limitante suele ser la esterilidad de la M1. to mutacional. La formación de varios pools
Es importante señalar que no siempre es reco- como el descrito aumentará la probabilidad de
mendable utilizar los tratamientos que den las aislar una mutante determinada pero, por otro
más altas tasas de mutaciones en M2, ya que lado, no permitirá distinguir sobre el origen mu-
si bien esto aumenta la probabilidad de obtener tacional de mutantes idénticas que aparezcan
una mutante buscada analizando una determi- en pools diferentes. Este manejo es adecua-
nada cantidad de material, también aumenta do cuando se quiere seleccionar mutantes de
la probabilidad de inducir mutaciones simultá- efectos moderados y/o de expresión altamente
neas en una misma célula lo que luego puede influida por el ambiente para lo que es reco-
requerir un trabajo considerable para eliminar mendable comenzar la selección en familias de
por retrocruza los alelos no deseados. la generación M3.
3-Manejo en masa: se cosechan en masa o
3.1.4. Manejo y selección bulk todas las plantas M1 de un mismo trata-
La semilla M1 usualmente se siembra a miento. También puede limitarse el tamaño de
campo semilla por semilla para permitir la in- los bulks haciendo varios por tratamiento. Para
dividualización de las plantas a la cosecha. En este manejo se recomienda una siembra den-
lo posible, debe realizarse en lote aislado, geo- sa para limitar el crecimiento de las plantas M1
gráfica y/o temporalmente de otras parcelas y así aumentar el número de los sectores M1
del cultivo. Para mutantes de efecto marcado que serán analizados en M2 los que, de esta
que son fácilmente distinguibles a nivel de indi- manera estarán más homogéneamente repre-
viduos habitualmente la selección comienza en sentados. Este manejo sólo es aplicable cuan-
la M2. En el caso de mutantes que conducen a do se dispone de una metodología de selec-
cambios fenotípicos leves o cuya expresión tie- ción individual barata y de aplicación masiva.
ne una importante influencia ambiental, es más Al principio es menos laborioso que los anterio-
confiable realizar la selección entre familias de res, pero no distingue la variabilidad inducida
generaciones más avanzadas. de la preexistente, ni las mezclas de semilla o
En forma simplificada podemos describir tres polen. Además, puede incrementar notable-
tipos básicos de manejo del material mutageni- mente el trabajo posterior si es que se obtienen
zado para pasar de M1 a M2: muchas mutantes similares y se quiere distin-
1-Manejo genealógico por progenies de es- guir si se originaron de manera independiente,
pigas, panojas o ramas: fue propuesto por Sta- o si provienen del mismo evento mutacional.
dler en 1930, en los albores de la mutagénesis En cuanto a la cantidad de material a tratar
experimental. Implica un mayor trabajo inicial, es obvio que a mayor cantidad de sectores
pero tiene el beneficio de que permite recono- mutantes representados en el momento de la

selección, será mayor la chance de aislar una mutagenizado en función del crecimiento de
mutante determinada. Cada uno de los mane- los sectores mutados en las plantas de la pri-
jos mencionados estará limitado en forma dife- mera generación y, de ser posible, con un con-
rente por el trabajo de conducción. Los cálculos trol genealógico adecuado, que permita distin-
teóricos sobre la cantidad de material a mane- guir sobre el origen de mutantes similares.
jar en M1 y M2 son de relativa validez dada la 3) Una vez que los alelos mutantes puedan
multiplicidad de factores a tener en cuenta, mu- ser detectados, aplicar una metodología de se-
chos de los cuales son sólo parcialmente con- lección eficiente que permita analizar grandes
trolables o predecibles. Habitualmente estos cantidades de material.
cálculos se basan en probabilidades de knock Si bien la mutagénesis inducida tradicional
out génicos, considerando a todos los genes es un proceso con un amplio espectro de re-
con igual chance de ser afectados. La crianza sultados posibles y dependiente de múltiples
de la M1 habitualmente requiere poco esfuerzo factores, que pueden ser relativamente con-
y espacio en comparación con las otras eta- trolados, lejos está de ser una técnica que de-
pas, por lo que es recomendable criar material pende totalmente del azar. Al éxito de esta me-
adicional para asegurar una población M2 sufi- todología contribuirán los conocimientos de la
cientemente grande, lo que además puede per- biología de la especie y del genotipo particular
mitir seleccionar entre tratamientos de acuerdo a tratar, la información disponible sobre su res-
a observaciones sobre la M1. Algunos autores puesta a los tratamientos mutagénicos, el co-
señalan que al trabajar con Arabidopsis, a me- nocimiento de las bases genéticas del carácter
nudo se prefiere criar gran cantidad de plantas a mejorar, etc. Sin duda que los resultados de
M1 y luego someter a la selección unas 2000 esta metodología se verán potenciados por un
a 125000 plantas M2. Mientras que en el caso trabajo multidisciplinario de genetistas, fisiólo-
del maíz, que por ser alógama requiere una au- gos y mejoradores, sin descartar el aporte que
tofecundación controlada para poder seleccio- puedan hacer muchas otras especialidades. El
nar mutantes recesivas, se considera que 1000 potencial de la mutagénesis clásica sin duda se
plantas M1 no quiméricas obtenidas por trata- ve hoy en día enormemente acrecentado por
mientos de polen, pueden ser suficientes para su uso en combinación con las nuevas técni-
tener chance de obtener al menos una mutante cas de la biología molecular y la biotecnología.
recesiva por locus. En autógamas, donde ob-
viamente la autopolinización de las plantas M1 3.2. TILLING y EcoTILLING
no insume un trabajo adicional, es recomenda- TILLING (del inglés Targeting Induced Local
ble incrementar el número de plantas M1 que Lesions in Genomes) es una técnica de bús-
pasan a la generación M2 a varios miles. queda de mutaciones focalizada en un gen o
secuencia nucleotídica conocida, que permite
3.1.5. Conclusiones el análisis de muestras de muchos individuos
Podemos señalar entonces, tres pasos fun- que provienen de una población previamente
damentales y complementarios en la mutagé- mutagenizada en forma artificial; o que pueden
nesis inducida aplicada al fitomejoramiento, portar variación natural sin necesidad de trata-
ellos son: mientos mutagénicos, en este último caso se la
1) Realizar tratamientos mutagénicos apro- denomina EcoTILLING. Dado que se la utiliza
piados para originar una importante cantidad para averiguar la función de un gen o secuen-
de células mutantes, pero en lo posible con cia incógnita, se la considera como una técnica
una o unas pocas mutaciones cada una (evi- de genética inversa (a partir de modificaciones
tando la multiplicidad de cambios mutacionales genotípicas se evalúan los efectos fenotípicos
en una misma célula) y, adicionalmente, con de las mismas para descifrar la funcionalidad
bajos niveles de otros daños que afecten la de la secuencia), con ventajas sobre el knock
viabilidad y/o vitalidad de las células y/o de los out tradicional porque los sistemas de reempla-
individuos mutantes. zo alélico son ineficientes en plantas superio-
2) Hacer un manejo eficiente del material res. Otra ventaja es que la mutagénesis con

mutágenos como el EMS o la azida sódica no mutagenizan semillas o granos de polen para
necesariamente anulan completamente la fun- inducir la aparición de mutaciones puntuales a
ción del gen, como sí lo hace el knock out o el lo largo del genoma. Las plantas derivadas de
knock down que se obtiene cuando se utiliza estas semillas tratadas con mutágenos se de-
ARN interferente o cuando se utilizan radiacio- nominan M1 y, como ya se mencionó, suelen
nes ionizantes que producen deleciones (como ser quiméricas y las mutaciones inducidas se
tratamiento mutagénico). Esto, potencialmen- encuentran en heterocigosis. Usualmente a las
te, permite evaluar los efectos de reemplazo plantas M1 se las endocría dejándolas autofe-
de cada uno de los nucleótidos individuales del cundar en el caso de autógamas, o se procede
gen. a la autopolinización forzada en alógamas para
El TILLING permite identificar estas muta- poder tener control de las genealogías y asegu-
ciones puntuales aunque para poder utilizarlo rar su conservación. Usualmente se cosecha
se requiere conocer previamente la secuencia una semilla por planta M1 para pasar a la próxi-
nucleotídica del gen o segmento genómico que ma generación, pero esto bien puede hacerse
se desea estudiar; sin embargo, no es necesa- con una semilla por inflorescencia principal
rio conocer la secuencia completa del genoma. con muy bajo riesgo de repetir en la muestra
El método fue desarrollado originalmente en dos mutantes provenientes del mismo evento
Arabidopsis thaliana y su uso se extendió pos- mutacional. Por la endocría de las plantas M1
teriormente a plantas cultivadas como el maíz, los genes mutados tenderán a hacerse homo-
la papa, el trigo, la soja, el tomate, la lechuga cigotas, sin embargo no es imprescindible que
y el girasol. Ha sido muy utilizada con fines de alcancen la homocigosis para que puedan ser
mejoramiento agronómico porque tiene la ven- detectados por TILLING. La generación M2 es
taja de que no conlleva las regulaciones a las segregante: cada individuo podrá ser homoci-
que están sometidas las plantas genéticamen- gota mutante, heterocigota u homocigota sal-
te modificadas. Entre los genes estudiados vaje en cada uno de los genes afectados, pero
están los relacionados a la calidad de almidón serán de constitución genética homogénea en
en granos (en mutantes con mayor amilopec- todo su soma, es decir no quiméricos. De cada
tina como los waxy), senescencia, enanismo, planta M2, que debe ser debidamente identifi-
resistencia a oidios, larga vida en estante (en cada, se extrae ADN de las hojas para el aná-
tomate y lechuga), reducción de isoflavonas y lisis de el/los gen/es de interés. Por otro lado,
alérgenos en soja, modificación de la composi- se guardan sus semillas para poder disponer
ción de aceites en girasol, etc. en el futuro de sus descendencias (poblacio-
El EcoTILLING en cambio, se orientó a la uti- nes M3). De este modo es posible conservar
lización de ecotipos como fuente de diversidad las mutaciones detectadas mediante el análisis
para estudiar genes relacionados a la resis- de ADN, y adicionalmente disponer de pobla-
tencia a estrés abiótico (como por ejemplo los ciones que puedan distribuirse internacional-
codificantes para dehidrinas) o para encontrar mente entre los consorcios de investigación
nuevos marcadores moleculares funcionales de cada especie (es común que se comparta
de tipo SNP (polimorfismos de un solo nucleó- el material de las poblaciones mutantes de las
tido, ver capítulo correspondiente en este mis- especies más estudiadas, como Arabidopsis
mo libro). y maíz, entre los consorcios internacionales).
La técnica consiste esencialmente de dos Para reducir costos, los ADNs procedentes
pasos: 1) la aplicación de mutagénesis química de distintas plantas M2 (usualmente entre 2 y
inducida tradicional como se describió en este 10) se pueden mezclar para su análisis en un
capítulo, usualmente empleando EMS (etilme- mismo tubo. Sobre una parte de la mezcla se
tanosulfonato); y 2) la utilización de una nove- realizará una amplificación por PCR, utilizando
dosa estrategia de búsqueda y detección de oligonucleótidos con secuencias flanqueantes
las mutaciones inducidas sobre un determina- al segmento genómico de interés (previamente
do gen o secuencia nucleotídica de interés. En diseñados en base a la secuencia conocida).
la Figura 2 ilustra el proceso. Usualmente se Los productos de amplificación, que consis-

tirán en una mezcla de secuencias normales igual tamaño en carriles pertenecientes a co-
y mutadas, se desnaturalizan sometiéndolos lumnas y filas permite identificar la intersección
a alta temperatura y se les permite rehibridar en la que se encuentra el pocillo con el ADN
entre sí bajando la temperatura. Algunas de mutado (de un modo similar al esquema que se
las cadenas rehibridadas podrán ser heterodu- propone en la Figura 2).
plexas, es decir, una de las cadenas provendrá En el EcoTILLING, menos utilizado que el
de una secuencia mutada y otra de una normal TILLING, en lugar de analizar poblaciones pro-
produciendo una doble cadena que contiene venientes de mutagénesis inducida, los mate-
bases mal apareadas por falta de complemen- riales de partida que se utilizan como fuente
tariedad. Estas bases mal apareadas serán de variabilidad suelen ser los almacenados en
reconocidas por la enzima endonucleasa CelI, bancos de germoplasma, o bien ecotipos de
produciendo un corte donde encuentra la ano- especies no domesticadas. Los problemas de
malía. Los productos de la digestión con Cell este enfoque alternativo son varios: el acceso
se resuelven por electroforesis en geles de po- al material puede ser limitante, los fondos ge-
liacrilamida, y si los oligonucleótidos utilizados néticos son demasiado variables, las mutacio-
en la PCR fueron previamente marcados con nes que disminuyen la adaptación de una plan-
fluoróforos (de fluorescencia rojo y verde en la ta no suelen estar representadas porque son
figura), los productos del corte podrán ser iden- eliminadas por selección natural o artificial, etc.
tificados por su menor tamaño comparado con
los ADNs no cortados (ver figura). La utilización 3.3. Mutagénesis de inserción con
de 2 fluoróforos, en lugar de uno, ayuda a redu- transposones y ADN-T
cir el número de falsos positivos. Otro sistema utilizado en genética inversa
Sobre esta técnica básica se introdujeron para el análisis funcional de genes consiste
modificaciones como, por ejemplo, la utiliza- en la activación de transposones endógenos
ción de geles no desnaturalizantes de polia- (siendo el Ac-Ds de maíz el más emblemático),
crilamida o agarosa y tinción con bromuro de mediante cruzamientos entre genotipos que re-
etidio, que funcionó muy bien en trigo. En los sulten en la activación de dichos transposones
casos en que se utiliza irradiación X o gamma o mediante la introducción de transposones fo-
para la inducción de mutaciones, el paso de di- ráneos por ingeniería genética (por ejemplo, el
gestión se saltea y se analiza en geles de se- sistema Ac de maíz fue introducido en papa, el
cuenciación. Enhancer o SPM de maíz en Arabidopsis o el
A medida que se van reduciendo los costos mutador Robertsomiano Mu en maíz).
de secuenciación y se convierta en rutina la de- Una de las grandes ventajas de esta técni-
tección de SNPs, posiblemente reemplacen el ca es que el elemento insertado proporciona
tratamiento con CelI en la técnica de TILLING. un marcador molecular de secuencia conocida
Al día de hoy las publicaciones de ultra-deep (tag) en el sitio de inserción (sitio de knock out),
sequencing en virus, permiten detectar geno- que puede facilitar el aislamiento del gen muta-
mas con variaciones en mezclas que contie- do por pérdida o ganancia de función debido a
nen muchísimos genomas no mutados. Otra que la inserción es reversible. Las desventajas
variante utilizada es la DHPLC (del inglés, principales de esta aproximación son: que las
denaturing high-performance liquid chromato- mutaciones pueden ser inestables (revertir), y
graphy) basada en la utilización de columnas que la transposición tiene frecuencias bajas y
para cromatografía líquida de alta presión que no siempre la inserción es totalmente azarosa.
permiten diferenciar ADN heterodúplex del ho- Para potenciarla se pueden colocar promoto-
modúplex. Para reducir el número de muestras res fuertes como el 35S del virus del mosaico
analizadas, varios productos de PCR y poste- del coliflor (CaMV) para controlar la expresión
rior digestión con CelI se siembran en el mismo del gen de la transposasa. Las ventajas de ha-
carril de un gel (por ejemplo toda una colum- cer esto se reflejan en un aumento significativo
na). Por otro lado se siembra también toda una en la tasa de mutación (hasta 1x10-4 en maíz,
fila. De esta manera, la aparición de bandas de por ejemplo), y en que provee una secuencia

foránea conocida en el sitio de inserción, lo motores funcionales. Si el gen indicador que
cual facilita el posterior clonado molecular. no contiene promotor se inserta al azar bajo
Existen algunas variantes de esta técnica el control de algún promotor endógeno, enton-
como la captura de genes o de promotor (gene ces se activará su expresión y se visualizará
o promotor trapping), en este caso se pueden fácilmente. Otra ventaja de esta aproximación
incluir secuencias foráneas de genes reporte- es la identificación sencilla sin necesidad de
ros como uidA (GUS), gfp (GFP) y sus varian- disponer de un fenotipo mutante, lo cual es
tes de otros colores, o genes involucrados en útil cuando existen genes redundantes, hete-
la síntesis de antocianas (Lc), con o sin pro- rocigosis o cuando se analizan genes activos

en distintos estadios de desarrollo. La función Kirk J.T.O. and Tilney-Bassett R.A.E. 1978. The
génica puede caracterizarse posteriormente en plastids. Elsevier, North-Holland, Amsterdam,
las mismas líneas si la inserción ha producido 960 p.
un knock out. Koornneef M. 2002. Classical mutagenesis in higher
plants. In: PM Gilmartin and C. Bowler (eds) Mo-
La mutagénesis de inserción con ADN-T
lecular Plant Biology: Practical Approach series
(segmento T de transferencia del plásmido Ti) Number 258. Vol.1. pp 1-11.
consiste en aprovechar la propiedad del sis- May, BP, H Liu,E Vollbrecht,L Senior, PD
tema basado en Agrobacterium tumefaciens, Rabinowicz,D Roh,X Pan,L Stein,M Freeling,D
para la transformación genética de plantas. El Alexander,R Martienssen 2003 Maize-targeted
segmento T se inserta teóricamente al azar en mutagenesis: A knockout resource for maize Proc
cualquier sitio de la eucromatina de las plantas, Natl Acad Sci U S A. 100: 11541–11546.
permitiendo así generar colecciones de mutan- McCallum CM, Comai L, Greene EA, Henikoff S.
tes de inserción con las características ya men- 2000Targeted screening for induced mutations.
cionadas anteriormente para los transposones; Nat Biotechnol. 18:455-7.
McCallum CM, Comai L, Greene EA, Henikoff S.
pero con mayor estabilidad que éstos y menor
2000Targeting induced local lesions IN genomes
preferencia por el sitio de inserción. Sin em- (TILLING) for plant functional genomics. Plant
bargo, como las frecuencias de mutación son Physiol. 123: 439-42.
extremadamente bajas, sólo se utilizan actual- Neuffer M.G. 1993. Mutagenesis. En: The Maize
mente en combinación con transposones. Es Handbook (Freeling M. and Walbot V. eds.). pp
decir que se incluye un transposón activo den- 212-219.
tro del segmento T para inducir mutagénesis Prina A.R. 1989. Consideraciones sobre la apli-
por transposición en la especie transformada. cación eficiente de la mutagénesis inducida en
Una de sus desventajas, es que su uso estará fitomejoramiento. Mendeliana, 9 (1), 5-49.
limitado a aquellas especies que son transfor- Prina A.R. 1993. La mutagénesis inducida en el
mejoramiento vegetal. Bol. Genet. Inst. Fitotéc.
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II. Capitulo 5 amplificación y metilación del ADN y cambios
en el ADN de las organelas. Por ello, aunque
los caracteres morfológicos (como por ejemplo
Variación somaclonal el hábito de crecimiento, la morfología floral,
etc.) son fáciles de evaluar, otros cambios no
Susana Cardone, Sofía Olmos y se manifiestan en variantes morfológicas evi-
Viviana Echenique dentes. Una diferencia estructural en un pro-
ducto génico puede no alterar su actividad
1 Introducción biológica lo suficiente como para producir un
El cultivo in vitro representa un momento fenotipo modificado, por lo tanto, la variación
de estrés para las células y tejidos vegetales debe analizarse a varios niveles.
y puede desencadenar procesos mutagénicos Los cambios producidos son generalmente
durante el establecimiento del explanto, la in- indeseables, pero la aparición ocasional de va-
ducción de callo y la formación de embriones o riantes no encontradas en las poblaciones na-
vástagos durante el proceso de regeneración turales y que representan una ventaja desde
de plantas. Algunos de los cambios genéticos el punto de vista agronómico, permite utilizar
ocurridos en las plantas regeneradas pueden este fenómeno en programas de mejora ve-
resultar variantes atractivas, con utilidad poten- getal. Se ha utilizado, en algunos casos, para
cial en el mejoramiento vegetal para el desa- conferir caracteres deseables a cultivares de
rrollo de nuevas variedades. importancia económica, entre los que se in-
Larkin y Scowcroft (1981) llamaron varia- cluyen: resistencia a enfermedades, tolerancia
ción somaclonal a los cambios ocurridos en a suelos ácidos y a salinidad. El desarrollo de
las plantas regeneradas y que son transmitidos nuevos cultivares por esta técnica involucra un
a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurren- balance entre la cantidad de variación inducida
cia in vitro de cambios reversibles que pueden y el mantenimiento de los caracteres agronó-
modificar la expresión de ciertos genes. Es- micos del cultivar. Como ejemplo puede citarse
tos cambios que no implican alteración en la el caso de somaclones de pasto bermuda, Cy-
secuencia nucleotídica se denominan “epi- nodon dactylon, donde se encontró resistencia
genéticos” (Madlung y Comai, 2004). Algunos a la oruga militar en un cultivar que reunía otras
autores los consideran variantes somaclonales buenas características, dando origen al cultivar
mientras que otros sólo incluyen en la misma Brazos-R3.
aquellos cambios que no revierten en ciclos su- Si bien desde el punto de vista práctico no es
cesivos de reproducción sexual. una técnica muy eficiente, dado que no es po-
Los mecanismos por los cuales ocurre la va- sible predecir ni dirigir el tipo de variación y se
riación somaclonal no han sido completamente hace menester trabajar con poblaciones gran-
dilucidados. Sin embargo, se han propuesto des de plantas, es necesaria la compresión del
varias causas de posible incidencia en la ocu- mecanismo para evitarlo en casos donde se
rrencia de la misma. Entre esas causas se ci- requiere fidelidad genética, como en la micro-
tan: el genotipo, la fuente de explanto, el tiem- propagación, la conservación de germoplasma
po en cultivo, las condiciones y composición y la transformación de plantas.
del medio de cultivo y la vía de regeneración. En algunos casos puede representar una
La comprensión de estas causas ayudaría a fuente de variación rápida y de fácil acceso
mejorar la interpretación de los procesos celu- para ser utilizada en programas de mejora-
lares de respuesta al estrés y permitiría definir miento, especialmente para especies con sis-
como actúan en los procesos de evolución. temas genéticos limitados o de base genética
Entre los fenómenos que ocurren durante el estrecha, como en el caso de la apomixis, don-
cultivo in vitro se mencionan alteraciones en de la variabilidad dentro de las poblaciones na-
el cariotipo, mutaciones puntuales, recombi- turales o cultivadas puede ser limitada.
nación somática e intercambio de cromátidas Los primeros casos de variación somaclo-
hermanas, rearreglos génicos somáticos, acti- nal se registraron en plantas de reproducción
vación de elementos genéticos transponibles, agámica como la caña de azúcar y la papa,

pero el fenómeno ha sido observado en mo- Explanto. La variación observada entre
nocotiledóneas como trigo, maíz, avena, arroz, plantas regeneradas puede ser una conse-
pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorón cuencia de quimerismo en el explanto original.
(Eragrostis curvula) y en dicotiledóneas como Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto
tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas significa que dentro de una misma planta exis-
otras especies. ten diferentes linajes celulares, esto se debe
a una serie de cambios en el ADN nuclear de
2 Factores relacionados con la aparición ciertos tipos celulares producidos durante el
de variación somaclonal desarrollo. Si estos tejidos se utilizan como
Hemos mencionado, previamente, algunos explantos y sus células son inducidas a divi-
de los posibles factores que tienen influencia dirse y rediferenciarse, las diferentes líneas ce-
en la aparición de variación somaclonal. En lulares pueden dar origen a plantas genética-
este punto trataremos cada uno por separado. mente diferentes. Por lo tanto, la utilización de
Genotipo. En general se asume que la fre- explantos con tejidos quiméricos preexistentes
cuencia de cambios dependerá de variaciones puede resultar en una fuente “extra” de varia-
preexistentes en el genotipo y de las interac- ción. Sin embargo, la recuperación de quime-
ciones que surgen entre el mismo y el proceso ras a partir de explantos no quiméricos es un
de cultivo. En arroz, ciertas variedades esta- fenómeno frecuente que puede ocurrir, a par-
bles muestran niveles de variación que osci- tir de procesos organogénicos, o por causas
lan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, desconocidas. La utilización de explantos con
consideradas inestables, oscilan entre el 10 y tejidos organizados, como esquejes radicales
el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la o caulinares, es una buena opción si es nece-
variación somaclonal es genotipo dependien- sario mantener estabilidad genética durante el
te y se la utiliza como una herramienta para la cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes geno-
obtención de variedades. El nivel de ploidía del tipos reaccionan de manera distinta, aún con
genotipo es otro factor a tener en cuenta. Por explantos “seguros”. El cultivo de meristemas
ejemplo en raigrás y en papa se observó que, aislados minimiza el riesgo de variación soma-
durante el cultivo de tejidos, las variedades di- clonal. Esto no debe tomarse como regla, ya
ploides muestran estabilidad, mientras que las que utilizando técnicas moleculares fue posible
tetraploides tienden a generar aneuploidías. detectar variación en plantas de frutilla y paraí-
La explicación más razonable para este hecho so obtenidas a partir de meristemas. Ell cultivo
es que los poliploides, con más de dos juegos de protoplastos parecería inducir inestabilidad
completos de cromosomas, están “tampona- genética, como fue observado en papa y taba-
dos”, y por lo tanto toleran la ganancia o pérdi- co; esto se ha asociado a los mayores tiempos
da de cromosomas, pudiendo así cumplir con en cultivo involucrados en la regeneración de
los requisitos impuestos por la regeneración. plantas a partir de explantos tan pequeños.
En los diploides, la pérdida o la alteración de La vía de regeneración también tiene un
cromosomas que llevan genes vitales impedi- rol importante en la ocurrencia de alteraciones
rá la regeneración de las plantas, llegando con en plantas obtenidas in vitro. En especies de
éxito a esta etapa sólo aquellos explantos que los géneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la
tengan su complemento cromosómico comple- variación observada en cultivos embriogénicos
to. Existen evidencias de una mayor inestabi- fue relativamente menor que la que obtenida
lidad en híbridos interespecíficos cultivados in en cultivos organogénicos. Esto probablemen-
vitro, si se los compara con las especies paren- te se debe a la gran presión de selección im-
tales. Como ejemplo puede citarse el caso de puesta en la formación de los embriones, ma-
los híbridos obtenidos de la cruza de Hordeum yor que la requerida en la formación de vás-
vulgare x Hordeum jubatum, donde el cultivo in tagos. Se cree que el gran número de genes
vitro genera entre un 5% y un 10% de regene- requeridos para la iniciación y maduración de
rantes haploides que suelen contener sólo el embriones cigóticos y somáticos impediría la
genoma de Hordeum vulgare. acumulación de mutaciones deletéreas. Sin

embargo, también se observaron variantes en expuestas las células superficiales del callo es
plantas de café, apio y caña de azúcar regene- diferente a la de las células situadas en pro-
radas a través de embriogénesis somática. En fundidad. La anaerobiosis resultaría en la pro-
estos casos se advirtió que algunos fenotipos ducción de etanol, el cual podría comportarse
anormales de embriones somáticos se aseme- como un mutágeno. Un efecto similar podría
jan a los mutantes del desarrollo embrionario tener la acumulación de metabolitos produ-
obtenidos en Arabidopsis y maíz. cidos por las propias células durante el cultivo.
La mayor parte de la variación obtenida in Los reguladores de crecimiento, principal-
vitro parece provenir de la fase de callo. Los mente el 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético),
mecanismos de iniciación de un callo parecen han sido señalados como inductores de inesta-
ser similares a la respuesta de las plantas a bilidad. Estos ejercen profundos efectos sobre
heridas, que se sabe que activan elementos la respiración celular, el consumo de azúcares
transponibles y estimulan la inducción de en- y en el control de la división celular. Por ello se
zimas y productos específicos de situaciones especula acerca de su rol indirecto en la induc-
de estrés. La desdiferenciación que ocurre ción de cambios en el metabolismo celular y
durante la inducción del callo, altera procesos tisular de plantas creciendo in vitro. Aparente-
celulares que resultan en cambios genómicos, mente el 2,4-D induce desdiferenciación y pro-
uno de los más frecuentes es la inestabilidad voca un incremento sustancial en la transcrip-
cromosómica. La naturaleza del callo también ción. Esto puede alterar la estructura de la cro-
puede afectar el nivel de variación obtenida. Un matina, por lo cual se lo utiliza en gramíneas
callo verdadero es una masa de células desdi- como inductor de aneuploidías. La relación
ferenciadas que proliferan desorganizadamen- auxina:citosina también suele afectar en este
te, lo cual probablemente genera considerable sentido. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y
variación. En varias monocotiledóneas el callo el ANA (ácido naftalenacético) han sido señala-
representa, a menudo, una masa de órganos dos como los responsables de los incrementos
suprimidos o proembriones más que un tejido en la metilación de las citosinas, que tienen lu-
completamente desorganizado. Este tipo de gar durante el cultivo in vitro. Los sectores del
callo mantiene un alto grado de estabilidad ge- ADN donde las citosinas se encuentran meti-
nética, como se ha observado en espárrago. ladas en posición 5 son considerados puntos
En un estudio realizado en Cymbopogon se calientes de mutación, ya que la desaminación
observó que muchas de las plantas regenera- de una 5-metilcitosina resulta en un cambio de
das a partir de callos provenientes de semillas citosina a timina. Un estudio realizado en papa
fueron anormales, mientras que las obtenidas indicaría que el tipo y la concentración de los
por callos de inflorescencias fueron muy seme- reguladores de crecimiento en los estadios ini-
jantes a las plantas de las cuales provenían los ciales de cultivo in vitro no generaría variación
explantos. En ocasiones, también fue posible genética. Los efectos serían más importantes
observar variación en plantas obtenidas por re- durante el crecimiento del callo y la iniciación
generación directa, es decir, sin que medie un de los vástagos. Estos datos sugieren que la
proceso previo de desdiferenciación celular ni fase de callo sería un período sensible en el
formación de callo. cual la manipulación hormonal afecta la esta-
El estado físico del medio de cultivo tam- bilidad de las plantas regeneradas; de manera
bién influye en el nivel de variación obtenida. que las hormonas inducirían inestabilidad ge-
Un mismo explanto puede tener diferente com- nética sin ser, necesariamente, el origen de la
portamiento si se lo cultiva en medio sólido o misma.
en medio líquido. Otro factor importante es la La deficiencia o exceso de minerales en
temperatura, que puede inducir inestabilidad el medio de cultivo podrían ser causa de varia-
cariotípica y/o incrementar el número de plan- ción. Este fenómeno se ha observado también
tas albinas y también la deficiencia de oxí- en plantas creciendo en condiciones de cam-
geno que se genera durante el transcurso del po. Un ejemplo típico lo constituyen plantas
cultivo. La tensión de oxígeno a la que están de lino sometidas a exceso o deficiencias de

azufre, nitrógeno, fósforo, calcio y magnesio. diendo de la intensidad del estrés y del estado
En estas plantas se observaron cambios genó- de diferenciación de las células, en el momento
micos estables y heredables. En este caso los de experimentarlo. Estos cambios ocurrirían, en
cambios fueron inducidos por una fertilización parte, debido a una pérdida del control del ciclo
excesiva del suelo, obteniéndose así líneas es- celular. Entre las alteraciones genéticas se citan
tables, denominadas “genotrofos”, caracteriza- mutaciones puntuales, cambios en la estruc-
das por diferente contenido de ADN nuclear y tura o el número de cromosomas y activa-
citoplasmático. ción de elementos genéticos transponibles.
La edad del cultivo es otro factor que afecta Estos últimos causan reorganizaciones molecu-
el nivel de variación, aumentando la proporción lares, no solo por su transposición, sino también
de variantes en cultivos envejecidos y también porque generan amplificaciones y deleciones.
en plantas obtenidas a través de varios subcul- El cultivo in vitro también incrementa la frecuen-
tivos. Esto se ha observado en ajo, maíz, ave- cia de intercambio entre cromátidas hermanas o
na, tabaco, triticale y raigrás triploide. La varia- “crossing over" somático.
ción puede minimizarse realizando subcultivos Varias hipótesis han intentado explicar y re-
frecuentes de explantos jóvenes. El número lacionar la serie de eventos que tienen lugar
óptimo de subcultivos podría estimarse empíri- durante el cultivo in vitro, como son las pertur-
camente luego de realizar pruebas de fidelidad baciones del ciclo celular, las aberraciones cro-
genética en las plantas regeneradas, a través mosómicas estructurales y numéricas, la activa-
de subcultivos subsecuentes. Una observación ción de transposones y las mutaciones génicas.
común es que en los períodos prolongados de Kaeppler y Phillips (1993) proponen la existen-
cultivo hay una pérdida de totipotencia y que cia una base molecular común para todos estos
esto sucedería debido a la acumulación de mu- eventos mutagénicos que comprendería una al-
taciones y a la alteración de los genes que son teración en los patrones de metilación del ADN.
responsables de la regeneración. Sin embar- Estos cambios en la metilación podrían afectar
go, un estudio realizado por nuestro grupo de la expresión de genes específicos, incluyendo
trabajo en la UNS, en colaboración con el IBO- elementos transponibles o podrían afectar la es-
NE, demostró que en plantas micropropagadas tructura de la cromatina de una manera más glo-
de paraíso gigante las variaciones se producen bal, involucrando, por lo tanto, a un gran núme-
al azar en los diferentes subcultivos, no ha- ro de genes. El mecanismo por el cual suceden
biendo una relación lineal entre el número de estos cambios no ha sido totalmente dilucidado
subcultivos y la cantidad de variación obtenida. pero se los ha vinculado con una replicación
La variación en este caso se detectó mediante tardía de la heterocromatina que también pro-
la técnica de RAPDs a lo largo de de 10 subcul- vocaría eventos de ruptura cromosómica. Los
tivos (Olmos y col., 2002). cambios en los modelos de metilación causados
por el cultivo de tejidos no serían aleatorios y en
3 Cambios genómicos producidos raigrás se ha propuesto la existencia de puntos
durante el cultivo de tejidos calientes de inestabilidad en el ADN genómico.
Las plantas poseen una amplia capacidad de Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas
acomodarse a las situaciones cambiantes de bajo estrés severo de nutrientes o de agua no
su entorno, pero en algún momento esa capaci- experimentan el mismo tipo de cambios encon-
dad de amortiguación se vuelve deficiente y los trados en los regenerantes de cultivo in vitro. El
organismos caen en un estado de crecimiento cultivo de tejidos podría representar, por lo tan-
subóptimo que parece inducir mecanismos de to, un tipo muy particular de estrés, que podría
cambios genómicos. Las bases metabólicas de inducir una respuesta única y un perfil particular
la interacción entre el estrés y estos cambios de mutación. Un posible efector de esta varia-
son desconocidas. Sin embargo, en la litera- ción podrían ser los reguladores de crecimiento.
tura se menciona la posibilidad de ocurrencia En cuanto a los cambios en el número de
de alteraciones a nivel del ADN a consecuen- cromosomas, la poliploidía es el más común
cia de diferentes estreses ambientales, depende estos fenómenos, y estaría relacionada con

fallas en la mitosis, mientras que la aneuploidía cos es un requisito relevante para su imple-
puede surgir por segregación desigual en la mentación en los programas de mejoramiento.
mitosis o por fragmentación nuclear, seguida La utilización de marcadores morfológicos
de mitosis. A veces estos cambios en el núme- para detectar variantes somaclonales ha sido
ro cromosómico pueden afectar el fenotipo. En exitosa desde el punto de vista del mejoramien-
papa, se observaron fenotipos aberrantes por to y citada en varios trabajos de investigación.
aneuploidía o por duplicación cromosómica; El examen visual y la utilización de un anali-
sin embargo, no todos los regenerantes aneu- zador de imágenes posibilitaron la diferencia-
ploides o poliploides presentaban cambios fe- ción entre fenotipos normales y aberrantes en
notípicos evidentes. Pelargonium. También se detectaron cambios
La variación somaclonal también puede en altura, tamaño de hojas, número y peso de
afectar el genoma de los plástidos y las mi- semillas de plantas de maní obtenidas in vitro.
tocondrias. En plantas de sorgo androestéri- En ananá se observaron cambios estables en
les obtenidas in vitro se observó restauración el color y textura de las hojas, tamaño de los
parcial de la fertilidad y en plantas androesté- frutos y tasa de proliferación de vástagos; el
riles de maíz con citoplasma “ T ” (que eran, cultivo de tejidos de violeta africana resultó en
además, susceptibles a Helminthosporium ma- un 67% de variación en el color de las flores de
ydis) hubo reversión de la androesterilidad y de plantas regeneradas.
la susceptibilidad al patógeno. Estos cambios A nivel fisiológico, tanto en cereales como
en frutales se detectaron y seleccionaron va-
se correspondían con mutaciones en el ADN
riantes que presentaron resistencia a enferme-
mitocondrial. Otro caso de variación debida al
dades, tolerancia a herbicidas, sales y condi-
cultivo in vitro es el albinismo, problema que
ciones de acidez en el suelo, entre otros. Estos
se presenta frecuentemente en el cultivo de
estudios se basaron en la utilización de altas
anteras de Gramíneas. En plantas albinas de
presiones de selección durante la regenera-
trigo obtenidas por cultivo de anteras se obser-
ción, mediante la adición de agentes selectivos
varon deleciones y rearreglos en el ADN de los en el medio de establecimiento y regeneración,
cloroplastos. Si bien parecería que los tejidos como inóculos, toxinas, herbicidas, condicio-
somáticos son menos sensibles a la variación, nes de pH extremas o concentraciones salinas
también se ha observado albinismo en plantas elevadas.
regeneradas a partir de los mismos. El estudio del cariotipo permite revelar cam-
bios en el número de cromosomas (poliploidías,
4 Niveles de detección de la variación aneuploidías) y en la estructura de los mismos
somaclonal (translocaciones, inversiones, deleciones y
Los mecanismos que operan para inducir duplicaciones). Las alteraciones cariotípicas
variación son numerosos y diversos y, proba- constituyen una fuente importante de variación,
blemente, actúan en simultáneo, conduciendo que muchas veces es subestimada cuando se
a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. trabaja con métodos tradicionales de conteo
Detectar y analizar los distintos niveles de cromosómico. Las técnicas de bandeo cromo-
modificaciones genómicas generadas por cul- sómico brindan más información acerca de la
tivo in vitro reviste interés desde un punto de estructura cromosómica y las alteraciones que
vista práctico, ya que las mismas podrían ser pueden surgir en este sentido. Por ejemplo, en
potentes fuentes de material para seleccionar plantas de Brachycome dichromosomatica re-
variantes de interés y desde un punto de vista generadas a partir de suspensiones celulares,
teórico, ya que posibilitarían realizar estudios esta técnica permitió detectar reordenamientos
básicos acerca de las causas de la variación y cromosómicos, mientras el número cromosó-
el posible control de la misma. mico permaneció estable. La hibridación in situ
La ocurrencia de variación somaclonal pue- es otra de las técnicas que permiten examinar
de detectarse con marcadores morfológicos, los cariotipos de una forma más exacta y resul-
bioquímicos y moleculares. La correlación de ta particularmente útil para revelar anormalida-
dichos marcadores con caracteres agronómi- des en la estructura de los cromosomas.

Entre los marcadores bioquímicos utiliza- tieron comprobar la susceptibilidad diferencial
dos para analizar plantas regeneradas y sus del genotipo al pasaje por cultivo in vitro, ade-
progenies, se encuentran las isoenzimas. Las más de reunir información para encarar nuevos
mismas permitieron detectar variación en plan- cruzamientos en programas brasileros de me-
tas de Populus tremuloides regeneradas a tra- joramiento de esta especie.
vés de callos. El análisis se realizó mediante Existen numerosos ejemplos que indican que
electroforesis en geles de almidón, utilizando la variación molecular no siempre se expresa a
los sistemas isocitrato deshidrogenada (IDH) nivel fenotípico y viceversa. Por ejemplo en el
shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato género Musa, la técnica de RAPDs reveló poli-
deshidrogenasa (MDH), fosfogluco-isomerasa morfismos en plantas micropropagadas de fe-
(PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6- notipo normal. Del mismo modo, plantas rege-
PGD). Los patrones electroforéticos permitie- neradas de palmera datilera que presentaban
ron diferenciar las plantas control de las varian- fenotipos florales anormales, tuvieron patrones
tes, sin embargo, las plantas albinas obtenidas moleculares normales.
en este ensayo no presentaron polimorfismos Otros marcadores útiles son los AFLP (po-
en los loci estudiados. Tampoco se encontraron limorfismo en la longitud de fragmentos am-
variantes cuando se estudiaron líneas de callos plificados de ADN), que permitieron detectar
derivadas de embriones cigóticos y somáticos la existencia de diferencias moleculares entre
de abeto. Los 25 loci analizados, utilizando 15 plantas de banana con fenotipos normales y
sistemas isoenzimáticos, mostraron fenotipos aberrantes. Los microsatélites o SSRs, inicia-
isoenzimáticos normales. Otro ejemplo, uti- les de su nombre en inglés “simple sequence
lizando esta metodología, se llevó a cabo en repeats”, son altamente informativos, ya que
líneas isogénicas de Trifolium pratense L. que son abundantes y están dispersos a través del
diferían en su capacidad de regeneración. En genoma. Estos marcadores se utilizaron para
este caso los patrones isoenzimáticos de esas el análisis de plántulas de álamo, obtenidas
líneas resultaron idénticos para los sistemas por micropropagación, donde se observaron
de peroxidasas (PRX), glutamato deshidroge- microsatélites polimórficos, en plantas fenotípi-
nadas (GDH), alcohol deshidrogenasas (ADH) camente normales.
y esterasas (EST). A veces, para detectar una variante obtenida
Si bien las isoenzimas aportan información in vitro es necesario realizar pruebas especí-
útil acerca de la variación generada in vitro, su ficas. Por ejemplo, cuando se evaluaron so-
análisis refleja los productos de genes expre- maclones de Cynodon dactylon en laboratorio,
sados, cuya regulación puede estar en cierta invernáculo y a campo, para resistencia a la
medida afectada por factores ambientales o oruga militar. Un somaclón, el Brazos-R3, te-
fisiológicos. Por otro lado, sólo se transcribe y nía un rendimiento equivalente al del cultivar
traduce una pequeña proporción del genoma. madre, pero además era resistente a dicho in-
Los marcadores moleculares presentan va- secto. Esto se debe a que produce niveles más
rias ventajas sobre las isoenzimas ya que per- bajos de un estimulante para la alimentación
miten detectar mutaciones en diferentes tipos del insecto. Es decir que mantenía los caracte-
de secuencias y además, porque no son in- res agronómicos positivos del cultivar parental,
fluenciados por el ambiente, ni por los estadios pero tenía un cambio en la producción de un
fenológicos. metabolito secundario que confería resistencia
Los RAPDs (fragmentos polimórficos de a la oruga.
ADN amplificados al azar) permitieron detec-
tar la existencia de polimorfismos en plantas 5 La variación somaclonal y su aplicación
de Triticum tauschii obtenidas de callo. Estos en el mejoramiento genético
marcadores también se utilizaron para evaluar La base del mejoramiento genético es la op-
la fidelidad genética en plantas regeneradas timización de las interacciones génicas. Para
de pino, abeto, festuca, roble y gingseng,. En lograr combinaciones génicas óptimas o supe-
caña de azúcar, los marcadores RAPDs permi- riores se requiere de diversidad genética. Esta

diversidad, que se encuentra normalmente en En algunos casos, las variantes somaclona-
las poblaciones de individuos, puede provenir les no han avanzado de la etapa de laboratorio
de cruzamientos sexuales, mutaciones induci- o invernáculo, probablemente debido a que el
das (físicas o químicas o producidas por ADN- material seleccionado tiene poca importancia
T, por elementos transponibles o retrotraspo- práctica.
sones), hibridación somática y transformación • La baja tasa de regeneración de plantas
genética. La variación somaclonal proporcio- en cultivos de largo término. General-
naría una fuente adicional de variabilidad ge- mente en estos casos existe pérdida de
nética, potencialmente útil en programas con- la capacidad morfogénica.
vencionales de mejoramiento. • La regeneración está limitada a genoti-
pos específicos que pueden no ser de
Algunas de las ventajas que presenta la va- mucho interés para los mejoradores.
riación somaclonal pueden resumirse de la si- • Algunos somaclones son inestables (va-
guiente manera: riación epigenética).
• Es una técnica poco costosa: requiere de • Algunos presentan alteraciones no de-
un laboratorio de rutina y facilidades de seables como aneuploidía, esterilidad,
campo. etc.
• Constituye una forma rápida de generar
variabilidad genética, particularmente
para cultivos con base genética estrecha Desde el punto de vista productivo y co-
y que son difíciles de mejorar a través de mercial, una variante somaclonal debería
técnicas tradicionales. cumplir los siguientes requisitos:
• Es exitosa para eliminar uno o pocos de- • Involucrar caracteres agronómicamente
fectos en cultivares bien adaptados. útiles.
• Puede utilizarse para mejorar especies • El nivel de expresión del carácter debe
de propagación sexual y vegetativa. superar al de sus progenitores.
• Las tasas de mutación son relativamente • El carácter mejorado debe estar com-
elevadas si se comparan con las tasas binado con todos los otros caracteres
de mutaciones espontáneas. La varia- agronómicos de la variedad que son im-
ción somaclonal ocurre con una frecuen- portantes para el cultivo.
cia de 1 mutación cada 100 plantas re- • La variación debe ser heredable y es-
generadas, en contraste con la tasa estable (sin reversión) en la progenie. En
perada de mutación espontánea de 10-7 general, los mejoradores buscan en los
– 10-9 mutaciones por par de nucleótidos somaclones caracteres de importancia
por generación. práctica. El recurso es utilizar cultiva-
• El conocimiento de las condiciones que res altamente adaptados para modificar
generan inestabilidad genética durante unos pocos caracteres, ya que resulta
el cultivo in vitro, permitiría utilizar el fe- más sencillo mejorar selectivamente una
nómeno como estrategia de mejoramien- variedad de uso corriente que crear una
to y permitiría eludirlo en aquellos casos nueva.
en que se requiera estabilidad genética.
• El nivel de cambios no deseados es me- 5.1 Estrategias para la selección de va-
nor que cuando se utilizan mutágenos riantes útiles
químicos o físicos, ya que, en el caso de Las estrategias que se han utilizado para ob-
la variación somaclonal, la mayoría de tener variación somaclonal comprenden:
los cambios deletéreos producidos son
eliminados por el filtro que representa la a) Obtención de plantas por cultivo de
regeneración de plantas. células o tejidos, que luego son analizadas
para el carácter deseado.
Entre las desventajas cabe mencionar:

La Figura 1 resume los pasos a seguir para regeneradas, aquellas que expresen el carác-
la obtención de un cultivar por variación soma- ter de interés. Estas plantas (generación R0)
clonal. Para este fin se cultiva la mejor variedad se emplean para generar progenies sexuales
disponible y se seleccionan, entre las plantas (en el caso de plantas con este tipo de repro-
Figura 1. Estrategia para la producción comercial de variantes somaclonales (izauierda) y gametoclonales

(derecha), en arroz.

ducción), sobre las cuales se vuelve a realizar procede a la regeneración de las plantas, que
la selección para el carácter agronómico bus- son analizadas para ver si expresan la resis-
cado, tratando de mantener a la vez todas las tencia a campo y luego son introducidas en el
características favorables de la variedad. En programa de mejoramiento. La selección efec-
plantas autógamas, como trigo, arroz y cebada, tuada sobre cultivos celulares, in vitro, puede
se considera aceptable la evaluación de la es- llevarse a cabo mediante dos modalidades:
tabilidad del carácter hasta la generación R4. A - Selección directa en un solo paso, donde
partir de este momento pueden realizarse cru- el agente de selección es utilizado en concen-
zamientos de las plantas R4 selectas, con las traciones dobles o triples de la MIC (concen-
líneas parentales a fin de determinar mediante tración mínima que produce un 100 % de inhi-
el análisis de segregación, la base genética del bición).
carácter mejorado. Posteriormente, cuando se - Selección en varios pasos, donde la con-
tenga semilla disponible, se realizarán prue- centración del agente selectivo es gradual-
bas agronómicas en diferentes ambientes, al mente incrementada en cultivos sucesivos y
menos en dos años distintos, para evaluar los frecuentes.
efectos del componente ambiental en la expre-
sión del carácter. El programa finaliza con la El primero es un método simple y efectivo,
etapa de multiplicación de semillas para el lan- ya que las células sensibles al agente morirán,
zamiento de la variedad nueva al mercado. permitiendo el crecimiento de las tolerantes.
Una modificación para la producción de nue- Sin embargo, elevados niveles de estrés serán
vas variedades está basada en el empleo de deletéreos a nivel celular, eliminando mate-
variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utili- riales que tal vez, con un mayor nivel de di-
zan células haploides de plantas F1, como ferenciación tisular hubiesen sido capaces de
fuente de explanto, las variantes obtenidas se regenerar plantas tolerantes. La elección de un
denominan variantes gametoclonales. Los ga- método u otro dependerá de un monitoreo pre-
metoclones se refieren a genotipos haploides, liminar que brinde información acerca de la re-
derivados del cultivo de anteras. Por medio acción del tejido vegetal a las concentraciones
de esta metodología se podrían recuperar ca- letales y subletales del agente selectivo.
racteres recombinados de ambos parentales, En la Figura 2 se representan las etapas de
además de los que pudieran surgir in vitro. Las la selección in vitro. En el ejemplo, diferentes
plantas haploides obtenidas son duplicadas variedades de arroz son evaluadas para to-
mediante la exposición al alcaloide colchicina. lerancia al aluminio. La inducción y la prolife-
Las evaluaciones a campo se realizan en for- ración de callo en el medio de cultivo al que
ma conjunta a medida que los nuevos materia- se ha adicionado aluminio, es indicadora de la
les van siendo multiplicados, de manera de au- tolerancia del genotipo al metal en cuestión.
mentar las replicas bajo diferentes condiciones Una vez regeneradas las plantas, se requieren
ambientales. evaluaciones posteriores realizadas a campo,
en suelos con concentraciones elevadas de
b) Selección a nivel celular o selección aluminio, a fin de corroborar la tolerancia de-
in vitro. Se realiza con el objetivo de obtener mostrada in vitro.
resistencia a estreses bióticos o abióticos y La búsqueda de variantes a nivel celular
se utiliza generalmente para caracteres tales permite verificar y seleccionar fenotipos ade-
como resistencia a: toxinas fúngicas, herbici- cuados entre millones de células, con una in-
das, concentraciones salinas elevadas y tem- versión menor en tiempo, espacio y dinero y
peraturas extremas. ha sido extensamente utilizada en diferentes
Mediante esta práctica pueden cultivarse ex- especies entre las que pueden citarse: arroz,
plantos de distintos genotipos y observarse el clavel, cártamo, banana, vid, frutilla y trigo. Sin
comportamiento de los callos frente al agente embargo, no existe total garantía de que la re-
selectivo, en condiciones de laboratorio. Una sistencia manifestada in vitro se expresará a
vez seleccionados los genotipos resistentes se nivel de la planta entera. Hay diferentes expli-

Figura 2. Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas concentraciones de aluminio.
caciones para este fenómeno, como por ejem- cundación de plantas regeneradas. Se lograron
plo que la resistencia o tolerancia observada avances en el mejoramiento de esta especie
se deba a cambios epigenéticos, a la naturale- en caracteres cuali y cuantitativos. Ejemplos
za quimérica del material, al uso de toxinas no en éste y otros cultivos importantes, con varie-
específicas (en el caso de resistencia a enfer- dades comerciales obtenidas por esta técnica,
medades), a la complejidad del carácter a ser se detallan en la Tabla 1.
seleccionado (como por ejemplo la resistencia
a salinidad o sequía) o a la imposibilidad de Además, se pueden mencionar logros en
las células para expresar el carácter cuando otros cultivos, por ejemplo:
se diferencian. Para las dos estrategias que se En papa, se logró resistencia a Phytophthora
citaron previamente, a y b, la obtención de re- infestans, a Alternaria solani y a la colonización
sistencia sólo será posible si ésta existe en la por áfidos que transmitían el virus Y (PVY), y
población original (entonces el cultivo in vitro el virus del enrollamiento de la hoja (PLRV). En
sólo serviría para recuperar los genotipos úti- este caso la resistencia surgió a través del cul-
les) o bien si surge por variación somaclonal tivo de protoplastos provenientes de suspen-
durante el proceso de cultivo. siones celulares cromosómicamente variables
del cultivar “Russet Burbank”.
6 Variantes somaclonales liberadas co-
mercialmente En banana se obtuvo resistencia a Fusarium
en cultivares que no habían podido ser mejo-
Dentro de los primeros registros de variación rados por métodos tradicionales. No obstante,
somaclonal en cultivos de importacia econó- para lograr una variedad con rendimiento equi-
mica se encuentra la variación registrada en parable a las variedades no resistentes, se ne-
arroz, donde se informó en detalle la variación cesitó un trabajo posterior que permitió combi-
obtenida en la progenie derivada de la autofe- nar ambas características en un somaclón.

Especie Carácter Origen
Geranio Arquitectura floral Purdue Univ., USA
Batata Calidad de raíces y North Carolina Research

arquitectura del canopeo Service,USA
Caña de azúcar Resistencia a estrés abiótico Sugarcane Research

y a enfermedades Centre,Fiji
Maíz Contenido de triptófano Molecular Genetic, USA
Tomate Contenido de materia seca DNA Plant technology of New

Jersey, USA
Apio Contenido de materia seca DNA Plant technology of New

Jersey, USA
Arroz Resistencia a enfermedades Plantech Research Institute, Japan

Univ. Agricultural Sciences,
Hungary
Mostaza Rendimiento ICAR, India
Tabla 1. Especies con variedades obtenidas por la estrategia de variación somaclonal.
En tabaco, se obtuvieron cultivares toleran- yecto para obtener somaclones de pasto llorón.
tes a aluminio y resistentes a herbicidas. Se trabajó con varios cultivares de esta gramí-
nea apomíctica y luego de la evaluación de un
También, mediante la aplicación de esta es- gran número de plantas se seleccionaron los
trategia se obtuvieron cambios interesantes siguientes materiales:
para su explotación comercial en especies orna- - Una planta diploide sexual, obtenida a par-
mentales. Variaciones en el color de las flores, tir de un cultivar tetraploide apomíctico. Este
la arquitectura de la planta y el número de flores material fue registrado en el Instituto Nacional
por planta se citaron en gerbera, clavel, cri- de Semillas.
santemo, tulipán, violeta africana y begonia. - Utilizando un tratamiento de duplicación
Dentro de las especies forrajeras, se han cromosómica, se trató semilla, de una planta
observado variaciones en plantas de alfalfa re- R1 derivada de la planta anterior obteniendo
generadas por cultivo in vitro, para caracteres un genotipo tetraploide, altamente sexual, tam-
como altura y resistencia a Fusarium oxyspo- bién registrado.
rum. En gramíneas forrajeras como Lolium y
Festuca arundinacea se han citado cambios, Estos dos materiales se utilizan actualmente
en varios caracteres como por ejemplo: mor- para realizar estudios básicos acerca del modo
fología de planta, forma y tamaño de hoja y de reproducción (apomixis) y en la generación
espiga, desarrollo floral, vigor y supervivencia, de poblaciones de mapeo para el análisis del
y en pasto bermuda (Cynodon dactylon), resis- modo reproductivo y de caracteres agronómi-
tencia al moteado de la hoja cos de importancia.
En el laboratorio de Genética del Dpto. de - Dos plantas heptaploides apomícticas a
Agronomía de la UNS se llevó a cabo un pro- partir de un cultivar tetraploide apomíctico. Una

de dichas plantas fue registrada como cultivar nes), es un fenómeno a considerar cuando se
Don Luis, en honor al Ing. Luis Mroginski. Este requiera utilizar cultivo de tejidos para regene-
cultivar presenta buenas características agro- rar plantas genotípicamente estables.
nómicas.
La obtención de variación in vitro, en trigo, 7 Lecturas recomendadas
y en otros cereales como cebada es altamente
dependiente del genotipo. En trigo, se ha obte- BREGITZER P.; HALBERT, S.; LEMAUX, P. 1998.
nido resistencia a Helminthosporium sativum. Somaclonal variation in the progeny of transgen-
En cebada se encontró tolerancia en soma- ic barley. Theor. Appl. Genet. 96: 421-425.
clones regenerados en medios conteniendo el Bregitzer P.; S. Zhang; M.-J. Cho; P. G.
Lemaux. 2002. Reduced Somaclonal Varia-
herbicida glifosato. En sorgo, se obtuvo varia-
tion in Barley Is Associated with Culturing Highly
ción estable para altura, número de macollos, Differentiated, Meristematic Tissues. Crop Sci.
mayor producción de granos y tolerancia a sue- 42:1303–1308.
los ácidos y a sequía. En plantas regeneradas CASSELS A.C.; CROKE, J.T.; DOYLE, B.M. 1997.
de triticale y trigo se informaron variaciones Evaluation of Image Analysis, Flow Cytometry,
a nivel del ADN mitocondrial y de proteínas de and RAPD Analysis for the Assessment of Soma-
la semilla, como las gliadinas. En ambas es- clonal Variation and Induced Mutation in Tissue
pecies se informaron cambios estables en va- Culture Derived Pelargonium Plants. Angew. Bot.
rios caracteres como por ejemplo: longitud de 71: 125-130.
la espiga, número de granos por espiga, peso Cardone S.; Polci P.; Selva JP.; Mecchia
M.; Pessino, S.; Hermann, P.; Cambi, V.;
de granos, densidad y biomasa de la espiga,
Voigt, P.; Spangenberg G.; V. Echenique.
contenido de proteína en grano, altura de la 2006. Novel genotypes of the subtropical grass
planta, fertilidad, número de macollos, color del Eragrostis curvula for the analysis of apomixis
grano, tiempo de espigazón, dureza, sensibili- (diplospory). Euphytica 151 (2): 263-272.
dad al ácido abcísico y color de las glumas. Las CROUGHAN S.; S. QUISENBERRY; M. EI-
mutaciones observadas fueron de dominantes CHHORN; JR., P.COLYER; T. BROWN. 1994.
a recesivas y viceversa. Registration of Brazos-R3 bermudagrass germ-
El único antecedente en nuestro país de plasm. Crop Science. 34: 542.
búsqueda de variación somaclonal en trigo, es Da Silva C.; C. Mangolin; A. Mott; M. Macha-
un estudio acerca de la estabilidad in vitro de do. 2008. Genetic diversity associated with in
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tres cultivares con elevados niveles de inesta-
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caracteres tales como estructura cromosómi- EASTMAN P.; WEBSTER, F.; PITEL, J.; ROBERTS,
ca, patrón de gliadinas, color del grano y de las D. 1991.Evaluation of somaclonal variation dur-
glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y ing somatic embryogenesis of interior spruce (Pi-
morfología de la planta. Sólo se detectó, como cea glauca engelmannii complex) using culture
consecuencia del cultivo in vitro, una transloca- morphology and isozyme analysis. Plant Cell Re-
ción no descripta previamente y un patrón dife- ports 10: 425-430.
rente de gliadinas. En este caso, se concluyó EVANS D.; SHARP, W. 1983. Single gene mutations
que la técnica no fue efectiva para inducir va- in tomato plants regenerated from tissue culture.
Science.221: 949-951.
riación que pudiera ser utilizada en programas
FRANZONE P; SUAREZ Y; SOLARI R; FAVRET
de mejoramiento (Franzone y col., 1996). A; RÍOS R; DÍAZ PALEO A. 1996. Somaclonal
La variación somaclonal ha sido vastamente variation in three Argentinean varieties of Triticum
registrada y tratada en la bibliografía. Sin em- aestivum with different karyotypic instability. Plant
bargo, su utilización como estrategia para la Breed. 115: 89-93.
obtención de variantes agronómicamente apro- GALLEGO F.; MARTÍNEZ, I.; CELESTINO, C.,
vechables, es discutida. No obstante, además TORIBIO, M. 1997. Testing somaclonal variation
de su aplicación en la generación de variabili- using RAPDs in Quercus suber L. somatic em-
dad genética (que resulta particular para cada bryos. Int. J. Plant Sci. 158(5): 563-567.
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II. CAPÍTULO 6 minación de plantas transgénicas. Conviene
destacar que la transformación de plantas es
una tecnología que aporta variabilidad genéti-
Aplicación de la transformación ca conocida sin alterar el fondo genético por lo
genética al mejoramiento vegetal que puede ser considerada como una metodo-
logía conservativa de mejoramiento, similar, en
Marina L. Díaz, Diego C. Zappacosta, ese sentido, a la mutagénesis inducida o a la
Pascual M. Franzone y Raúl D. Ríos retrocruza. Este último aspecto es de gran im-
portancia ya que la creación de cultivares es un
1 Introducción proceso acumulativo, es decir, que se desea
El mejoramiento genético vegetal se originó introducir características favorables sin perder
hace aproximadamente 10.000 años, cuando las mejoras logradas anteriormente. El ger-
el hombre se hizo agricultor y comenzó la do- moplasma transgénico es posteriormente in-
mesticación de las plantas. En el siglo XX, con corporado al proceso de mejoramiento el cual
la incorporación de los cruzamientos sexua- dependerá de la especie y del tipo de cultivar
les, el conocimiento de la biología floral de las a obtener.
especies, el desarrollo de la genética y de la En 1983 se informaron los primeros experi-
estadística experimental, entre otros avances, mentos de expresión de un transgen (gen in-
se conformaron los métodos de mejoramiento troducido por vía asexual) en células vegetales
actualmente utilizados. El mejoramiento ge- y al año siguiente se obtuvieron las primeras
nético convencional se basa en la existencia plantas transgénicas (tabaco y petunia). Desde
de variabilidad genética para los caracteres entonces se ha extendido la aplicación de esta
que se desea mejorar y la manipulación de la tecnología a más de 120 especies. Las plantas
misma mediante la reproducción sexual. Esto transgénicas se obtienen por diversos méto-
hace que el aprovechamiento de la variabilidad dos, los que han sido modificados para cada
este restringido por barreras de compatibilidad especie en particular, aumentándose de esta
reproductiva. El reciente desarrollo de méto- forma la eficiencia de los mismos.
dos de transferencia de genes que no implican Entre sus aplicaciones de interés agropecua-
cruzamientos, como la transformación genéti- rio se encuentran la obtención de plantas con
ca, permite superar esta limitación, abriendo resistencia a estreses bióticos (virus, insectos,
nuevas perspectivas en el mejoramiento de las hongos y bacterias), a estreses abióticos (sa-
plantas. linidad, sequía, etc.), tolerancia a herbicidas
La transformación genética o transferencia para facilitar el control de malezas y modifica-
de genes, técnica también conocida como in- ción de la calidad nutricional de los cultivos en-
geniería genética, permite introducir en plantas tre otras. La transformación genética también
genes provenientes no solo de otras especies constituye una herramienta útil para estudios
vegetales muy alejadas desde el punto de vis- básicos que permiten conocer y/o profundizar
ta evolutivo sino incluso de hongos, virus, bac- acerca de la estructura y función de genes es-
terias y animales. Asimismo, a través de esta pecíficos, aspecto particularmente relevante
tecnología es posible modificar la expresión de en la era genómica.
genes presentes en el genoma de la planta. Si
bien se suele denominar OGMs (organismos 2 Requerimientos para la obtención de
genéticamente modificados) a las plantas ob- plantas transgénicas
tenidas mediante esta metodología, es oportu- Para todas las técnicas de transformación
no considerar que todas las plantas que han desarrolladas hasta el momento es necesario
sido mejoradas por el hombre a partir de su disponer del transgen a introducir (éste con-
domesticación, han sido modificadas genética- siste en secuencias regulatorias y codificante
mente por lo cual son OGMs y consideramos clonadas en un vector de transformación) y de
más apropiado utilizar para las plantas obteni- una metodología eficiente para su transferen-
das mediante transformación genética la deno- cia al genoma vegetal. Luego se induce el de-

sarrollo de plantas mediante distintas técnicas totipotencia expresada por las células vegeta-
de cultivo de tejidos y se procede al análisis les. En la mayoría de las especies se observa
molecular de las plantas regeneradas in vitro una importante influencia del genotipo en la
para identificar aquellas que porten y expresen respuesta al cultivo in vitro, razón por la cual
el o los transgenes en los niveles deseados. es frecuente que se utilizen genotipos modelo
Finalmente, mediante experimentos de campo (de alta respuesta) con fines experimentales
y laboratorio se estudia el comportamiento de los cuales no necesariamente presentan inte-
los individuos transgénicos y su descendencia. rés agronómico. Por ello, cuando se usa esta
Por lo tanto, los elementos básicos que se tecnología con fines de mejoramiento genético
requieren en trabajos de transformación gené- es muy importante conocer la respuesta morfo-
tica en plantas son: genética de distintos genotipos con adaptación
1. Un sistema eficiente de cultivo de tejidos local, de modo de poder transformar directa-
que permita regenerar plantas completas mente genotipos con valor agronómico. Por
y fértiles. otra parte, en el cultivo in vitro, un prolongado
2. Vectores apropiados, que permitan el período de subcultivos puede inducir la apari-
clonado del gen de interés y su transfe- ción de variación somaclonal no deseable ya
rencia al tejido blanco de transformación. que es conveniente introducir solo las modifi-
3. Un protocolo de transformación, es decir, caciones que se desean y en forma controlada.
un sistema de transferencia de genes y
de selección del material transformado. 2.2 Construcción del vector
4. Herramientas de análisis molecular para Para introducir un transgen es necesario que
detectar la presencia del transgen y los el mismo sea incorporado previamente en un
productos del mismo en la planta. vector (por ejemplo un plásmido). Para ello,
mediante la tecnología del ADN recombinante,
Antes de iniciar la descripción de los items se digiere el ADN extraído de un organismo,
anteriores, resulta importante destacar que cualquiera sea su origen, con enzimas de res-
para lograr una planta transgénica deben ocu- tricción. Estas endonucleasas tienen la capa-
rrir tres procesos en una misma célula: cidad de reconocer en el ADN secuencias es-
a) El transgen debe ser transferido al interior pecíficas compuestas por pocos nucleótidos y
de la célula, posteriormente producir cortes en las mismas.
b) El transgen debe integrarse al ADN celu- Los fragmentos de restricción así obtenidos
lar y pueden ser ligados enzimáticamente a vecto-
c) Se debe regenerar una planta completa res de clonado, obteniéndose, de este modo,
a partir de la célula transgénica en la que se clones de ADN recombinante (ver parte I). Al-
verificaron los procesos a y b. ternativamente, se puede utilizar una tecno-
logía de clonado basada en el mecanismo de
Dado que las células tienen diferente compe- recombinación sitio-específica del fago lambda
tencia o capacidad de respuesta para cada uno conocida como sistema GATEWAY (Invitrogen).
de estos procesos, la puesta a punto de un pro- Un transgen está compuesto por una secuen-
tocolo eficiente de transformación genética re- cia codificante (región traducible comprendida
quiere maximizar la cantidad de células compe- entre los codones de iniciación y terminación
tentes para todos ellos de manera simultánea. de la traducción) y por secuencias regulatorias
que determinan tanto el momento del desa-
2.1 Cultivo de tejidos vegetales rrollo de la planta como el tejido y el nivel en
Los métodos de transformación más utiliza- el que se expresará. Muchas veces los genes
dos actualmente se basan en la obtención de utilizados provienen de bacterias (procariotas)
células transgénicas y posterior recuperación y usualmente no pueden expresarse eficiente-
de plantas completas y fértiles a partir de las mente en células eucariotas. Por lo tanto, re-
mismas a través del cultivo y selección in vi- sulta necesario reemplazar las secuencias re-
tro. Esto es posible gracias a la propiedad de gulatorias bacterianas por otras aptas para su

expresión en células vegetales. En este con- gión no traducida en el extremo 3’ del mismo,
texto, la secuencia más importante es la co- que incluya la señal de corte y poliadenilación
rrespondiente al promotor, sitio del ADN al cual (terminador), necesaria para el correcto proce-
se une la enzima ARN-polimerasa para iniciar samiento del transcripto correspondiente.
el proceso de transcripción (Fig. 1). En la elec- Por otra parte, el nivel y patrón de expresión
ción del promotor a utilizar en la construcción del gen también puede estar afectado por la
del transgen, hay que considerar la especie posición del mismo en el genoma de la planta,
vegetal a transformar, ya que su nivel y patrón fenómeno conocido como “efecto de posición”.
de expresión pueden variar al ser utilizados en Esto puede deberse a la presencia de otras
especies distintas a la de origen del mismo. secuencias regulatorias cercanas como inten-
Dentro de los promotores se distinguen aque- sificadores y silenciadores, a la estructura de
llos constitutivos, que permiten la expresión del la cromatina, al patrón de metilación, etc. Este
gen en toda la planta en forma continua, los aspecto es particularmente relevante conside-
inducibles, que responden a factores ambien- rando que con los métodos de transformación
tales y finalmente los específicos de tejido que genética nuclear utilizados actualmente, las in-
permiten la transcripción en órganos y tejidos serciones de los transgenes en el genoma de
particulares (Tabla 1). Los promotores pueden la planta son al azar, Así, la cantidad de proteí-
ser modificados con el fin de aumentar la ex- na producida por un transgen comúnmente va-
presión de los genes que regulan. Así, pueden ría más de 100 veces entre individuos transfor-
truncarse, adicionárseles un intrón o unírseles mantes obtenidos en el mismo experimento. La
secuencias de otros promotores. Además, es solución para evitar los “efectos de posición” es
necesario que el transgen disponga de una redirigir la secuencia de interés a sitios específi-
Figura 1: Estructura molecular del transgen
Tabla 1: Promotores usados en la transformación genética de plantasv
nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium)

35 S (virus del mosaico del coliflor)
Constitutivos Ubi (ubiquitina de maíz)
Act 1 (actina de arroz)
TA 29 (tapete de la antera de tabaco)

Promotores faseolina (cotiledones de poroto)
Específicos de TobRB 7 (raíz de tabaco)
tejido patatina (tubérculo de papa)
glutenina (endosperma de trigo)
subunidad pequeña de Rubisco (luz)

Inducibles alcohol deshidrogenasa-1 (anaerobiosis)
proteína de shock térmico (calor)

cos del genoma vegetal, elegidos por su patrón vegetales. El T-ADN contiene genes, llamados
de expresión adecuado y estable. Esto podría oncogenes, que se expresan eficientemente
lograrse usando sistemas de recombinación en la célula vegetal infectada y producen sínte-
heteróloga sitio-específicos o mediante reem- sis de hormonas vegetales, responsables de la
plazo génico por recombinación homóloga. proliferación anormal del tejido. Además, con-
tiene los genes responsables de la síntesis de
2.3 Métodos de transformación opinas (fuente de carbono y nitrógeno para la
La pared celular constituye un obstáculo bacteria).
para la entrada del ADN a la célula que todos El sistema mediado por A. tumefaciens es el
los métodos de transformación genética tienen más estudiado y utilizado en la transformación
que superar de algún modo. Estos métodos de plantas. El T-ADN está delimitado por dos
pueden dividirse en: repeticiones directas imperfectas de 25 pares
a) Transformación mediada por Agrobacte- de bases (pb) que lo flanquean, llamadas bor-
rium, vector biológico que participa del proceso des derecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes
de transferencia. son los únicos elementos en cis necesarios
b) Métodos de transformación genética di- para dirigir el procesamiento del T-ADN. Cual-
recta, también llamados físicos, mediante los quier fragmento de ADN ubicado entre estos
cuales, por distintos mecanismos no biológi- bordes puede ser transferido a la célula vege-
cos, se introduce el ADN en la célula. tal. Contrariamente a lo que sucede con otros
tipos de secuencias móviles de ADN, como los
2.3.1 Transformación mediada por Agro- transposones autónomos, el T-ADN no codifica
bacterium los productos que median su transferencia. El
Las bacterias del género Agrobacterium son T-ADN es una región relativamente grande (ca.
Gram-negativas, aeróbicas obligadas y viven 20 Kb) que contiene genes con secuencias re-
en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar gulatorias (promotores y señales de poliadeni-
un crecimiento saprofítico o parasítico. El gé- lación) típicamente eucarióticas que permiten
nero comprende cuatro especies fitopatogéni- su expresión eficiente en células vegetales.
cas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. Desde la década de 1950 se sabe que los tu-
tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas especies mores de la agalla de la corona se desarrollan
son capaces de infectar una amplia variedad si hay A. tumefaciens patogénicas en presen-
de especies de dicotiledóneas. La patogénesis cia de heridas. Un aspecto destacable de esta
se inicia a partir de heridas, provocando la pro- bacteria es que usa la respuesta de la planta a
liferación de las células individuales infectadas. las heridas (cicatrización y defensa) como qui-
Así, A. tumefaciens causa tumores, enferme- mioatractivo y activador del proceso de pato-
dad que se conoce como ‘agalla de la corona’ y génesis. Luego de la adhesión de la bacteria a
A. rhizogenes induce la proliferación de raíces la célula vegetal, etapa en la que están involu-
dando lugar a la enfermedad denominada ‘raíz crados genes cromosómicos bacterianos (chv
en cabellera’. La capacidad patogénica de es- A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce
tas bacterias está asociada a la presencia de el procesamiento y la transferencia del T-ADN,
megaplásmidos (150-200 kilo pares de bases o mediados por los genes vir (por virulencia) que
Kb) llamados Ti (por ‘tumor-inducing’ o inductor son inducidos por azúcares y compuestos fe-
de tumores) o Ri (por ‘root-inducing’ o inductor
Plásmido TI salvaje
de raíces), presentes en algunas de las agro-
Borde Genes de Borde
bacterias. Se demostró que durante la patogé- izquierdo
Oncogenes
derecho
opinas
nesis un fragmento de estos plásmidos llama-
do T-ADN (por ‘transfer-DNA’), es transferido Plásmido TI modificado
a la célula vegetal, donde se integra al ADN Borde Gen de Gen de Borde
cromosómico y cuya expresión causa prolifera- izquierdo selección interés derecho
ción de células de la planta a través de la sín-
tesis y alteración de la respuesta a hormonas Figura 2: Estructura del T-DNA

nólicos, como la acetosiringona, producidos rios. En los vectores cointegrados la inserción
por células vegetales heridas. Se conoce con del ADN que contiene los transgenes dentro del
mucho detalle la etapa de la patogénesis que T-ADN de un plásmido Ti desarmado, se logra
ocurre en la bacteria (ver revisión de Gelvin, por recombinación homóloga. En el sistema al-
2000). La región de virulencia (de alrededor de ternativo, sobre la base de la capacidad de los
30 Kb) está organizada en operones esencia- genes de virulencia de actuar en trans, movili-
les para la transferencia del T-ADN (vir A, vir B, zando el T-ADN presente en otro plásmido, se
vir D, vir G) o que permiten incrementar la efi- construyen los denominados vectores binarios
ciencia de la transformación (vir C, vir E). El co- que contienen un T-ADN no oncogénico en un
nocimiento de la interacción de Agrobacterium plásmido pequeño con un origen de replicación
con las plantas se profundizará a partir de la funcional en un amplio espectro de hospedan-
disponibilidad (2001) de la secuencia nucleo- tes, características que permiten su fácil ma-
tídica completa del genoma de esta bacteria. nipulación genética en E. coli. La introducción
El desarrollo de la patogénesis causada por de un vector binario a una cepa de Agrobacte-
Agrobacterium representa una situación única rium que contenga un plásmido llamado ‘hel-
en la naturaleza: la transferencia de un ele- per’ de virulencia (con la región vir intacta y sin
mento genético (T-ADN) de un organismo pro- T-ADN), la hace apta para la transferencia del
cariota a un organismo eucariota superior, con T-ADN a las células vegetales. Si bien ambos
su subsiguiente integración y expresión en el tipos de vectores son herramientas eficientes
genoma hospedante. Este mecanismo de inge- para la transformación se aprecia una notable
niería genética natural es aprovechado para la preferencia por el uso de vectores binarios.
transferencia de genes de interés a las plan- La integración del T-ADN en el ADN cromo-
tas. Para ello, los oncogenes y los genes de sómico de la planta se produce al azar, por
síntesis de opinas presentes en el T-ADN, son recombinación ilegítima, preferencialmente en
reemplazados por un marcador seleccionable regiones genómicas con actividad transcripcio-
y el gen a transferir (Fig. 2). El método llama- nal y mediado por proteínas de la bacteria y
do ‘del explante’ (Horsch et al., 1984), consiste de la planta. Este sistema de transformación
en inocular un explante (órgano vegetal) con A. permite transferir fragmentos de ADN de hasta
tumefaciens, dejar la bacteria en contacto con 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especia-
el mismo durante un cierto tiempo en el cual se les que tienen características tanto de cromo-
produce la transferencia del T-ADN modifica- somas artificiales de bacterias (BACs) como
do. Posteriormente se transfieren los explantes de vectores binarios. El uso de estos vectores
a un medio de cultivo que contiene un antibió- permite clonar fragmentos de ADN de gran ta-
tico que actúa como bacteriostático para dete- maño y posteriormente transferirlos al genoma
ner el desarrollo de Agrobacterium y el agen- vegetal vía A. tumefaciens. Esta tecnología es
te selectivo correspondiente al gen marcador de gran utilidad para el clonado posicional de
seleccionable utilizado. Una vez completado genes.
el protocolo de cultivo y selección in vitro se Más de 600 especies vegetales son hospe-
recuperan las plantas transgénicas (Fig. 3). El dantes naturales de A. tumefaciens. Estas son
análisis por hibridación molecular de plantas en su mayoría dicotiledóneas y gimnospermas
transgénicas y su progenie ha demostrado que y más raramente monocotiledóneas. Para mu-
el T-ADN se incorpora al ADN cromosómico y chas de ellas se han puesto a punto protocolos
se hereda en forma estable. de transformación genética basados en este
Los plásmidos Ti sin oncogenes se denomi- vector. El interés en el desarrollo de este tipo
nan ‘desarmados’, son de gran tamaño y resul- de tecnología hizo que se expandiera el rango
ta difícil introducir genes en su T-ADN usando de hospedantes de A. tumefaciens a especies
técnicas habituales de ADN recombinante. Por que no son susceptibles a este patógeno en
esta razón se han desarrollado dos sistemas condiciones naturales. Esto fue posible debido
de vectores para introducir genes en Agrobac- al amplio conocimiento que se tiene de la in-
terium: los vectores cointegrados, y los bina- teracción Agrobacterium/célula vegetal. Así, se

ha puesto énfasis en la utilización de A. tumefa- PEG como la electroporación producen poros
ciens como vector de transformación en gramí- en la membrana plasmática por alteración de
neas y se han desarrollado protocolos en varias la polaridad de la misma y por ellos penetra el
especies de este grupo (arroz, maíz, cebada, ADN foráneo. En el último caso se somete a los
trigo y gramíneas forrajeras). Cabe notar que su protoplastos a un campo eléctrico. Ambas téc-
aplicación es rutinaria en arroz y maíz. nicas permiten el tratamiento simultáneo de un
La transformación con A. rhizogenes tiene gran número de protoplastos. La microinyección
fundamentalmente dos aplicaciones: la pro- es un método difícil y laborioso que consiste en
ducción de raíces con alta tasa de crecimiento la introducción de ADN dentro de protoplastos
capaces de sintetizar metabolitos secundarios individuales mediante el uso de capilares de in-
como productos farmacéuticos, aditivos alimen- yección y micromanipulador y con esta metodo-
tarios y cosméticos y por otra parte representa logía es posible lograr un alto grado de integra-
una valiosa herramienta para la estimulación de ción del ADN foráneo.
la rizogénesis en especies recalcitrantes, por Cabe notar que el cultivo de protoplastos es
ejemplo leñosas. la metodología más sofisticada de cultivo in vi-
tro de plantas por lo cual representa gran com-
2.3.2 Transformación directa o por méto- plejidad experimental y no está disponible más
dos físicos que para algunas especies y dentro de ellas
La primer metodología de transformación ge- particularmente en genotipos modelo. Por ello
nética de plantas desarrollada fue la de A. tume- se desarrollaron metodologías alternativas de
faciens, pero no resultó inicialmente de utilidad transformación directa como la electroporación
para abordar la transformación de especies de de tejidos, el uso de fibras de carburo de silicio
gran importancia económica como los cereales, para facilitar la entrada del ADN a las células en
debido a que éstos no son hospedantes natura- cultivo y el bombardeo con microproyectiles o
les de esta bacteria. Esta situación condujo al micropartículas siendo este último el más utili-
desarrollo de los métodos físicos de transforma- zado actualmente dentro de los métodos físicos.
ción. En ellos el transgen es introducido en la
célula vegetal mediante distintas técnicas que Bombardeo de micropartículas
se detallan a continuación: Es un proceso por el cual micropartículas
cubiertas con ADN son aceleradas por un gas
Transformación de protoplastos comprimido e introducidas en células vegeta-
La introducción y expresión de ADN foráneo les. Inicialmente la fuerza impulsora de las par-
en protoplastos fue el primer método de trans- tículas estaba dada por pólvora, pero luego fue
ferencia directa claramente demostrado en reemplazada por el sistema de helio comprimi-
plantas. Se disponía, para algunas especies, do que brinda una mejor regulación de la fuer-
de procedimientos eficientes para la regenera- za, distribución de microproyectiles y mayor
ción a partir de protoplastos, células que care- reproducibilidad entre bombardeos. Se utilizan
cen temporariamente de pared celular que es microproyectiles de oro o tungsteno (química-
la principal barrera para la introducción de ADN mente inertes) cuyos tamaños van desde 0,5 a
en las células vegetales. Los protoplastos pue- 3 μm, que al ser disparados a grandes veloci-
den ser aislados en forma mecánica o por un dades pueden atravesar pared y membranas
proceso enzimático que digiere la pared. Así se de la célula vegetal bombardeada sin causarle
obtiene una suspensión que contiene millones daños significativos (Klein et al., 1987). Como
de células individuales lo que favorece la trans- blanco de bombardeo se pueden emplear di-
formación de células aisladas. versos tipos de explante vegetal, desde célu-
Los protoplastos pueden ser transformados las o protoplastos hasta plántulas completas,
utilizando polietilenglicol (PEG), electropora- pasando por tejidos organizados en embriones
ción, microinyección o liposomas. La transfor- y meristemas. El explante es generalmente
mación de protoplastos mediada por PEG es sometido a un tratamiento osmótico pre y post
el método más comúnmente usado. Tanto el bombardeo que produce plasmólisis celular,

evitando que el impacto y la penetración de las soja, sorgo, papaya, espárrago, caña de azú-
partículas dañen las células (Fig. 3). Los vec- car y trigo, entre otras.
tores plasmídicos que se usan en este tipo de
procedimiento solo requieren un origen de re- 2.3.3 Transformación directa vs. indirecta
plicación que permita un alto número de copias Con el transcurso de las investigaciones se
de los mismos en E. coli, aspecto que facilita ha logrado optimizar los protocolos de trans-
en la práctica la preparación del ADN necesa- formación para muchas especies vegetales.
rio en grandes cantidades para la transforma- Ambas vías de transformación presentan ven-
ción genética por este método. tajas y desventajas que las hacen más o me-
Esta técnica, sin embargo, tiene limitacio- nos convenientes para los distintos fines. En
nes. Algunas especies oponen una resistencia la Tabla 2 se presenta una comparación entre
natural a la penetración de las partículas, dada la transformación del genoma nuclear mediada
por cutículas endurecidas, paredes celulares por A. tumefaciens y el método biolístico como
lignificadas o superficies vellosas. Sin embar- representante de los métodos de transforma-
go la principal limitación del método continúa ción directa.
siendo la baja relación entre el total de células Uno de los procesos necesarios para obte-
sometidas al bombardeo y el número de célu- ner plantas transgénicas, es la integración del
las que logran incorporar de manera perma- transgen al ADN cromosómico. Con relación a
nente el transgen. A pesar de esta limitación, este proceso existen diferencias entre ambos
la versatilidad de la aceleración de partículas métodos. A. tumefaciens posee un mecanismo
para introducir transgenes ha superado mu- natural muy eficiente para transferir, al núcleo
chas de las barreras asociadas a otros méto- celular, el T-ADN que contiene el transgen y
dos de transformación, como son el rango de producir una integración aleatoria en regiones
huéspedes de Agrobacterium y las dificultades cromosómicas con actividad transcripcional.
inherentes al cultivo y regeneración de proto- Generalmente, los patrones de inserción de
plastos. Este método, conocido también como transgenes son más sencillos en comparación
biolística, ha demostrado ser una buena opción a los producidos por el método biolístico. Así
para la producción de plantas transgénicas de el número de copias que se incorpora es bajo
Tabla 2: Comparación entre métodos de transformación del genoma nuclear
Agrobacterium Método biolístico
Especies a transformar dicotiledóneas y algunas sin limitaciones

monocotiledóneas
Eficiencia de transformación alta baja
aleatoria en regiones con aleatoria

Tipo de integración en el transcripción
genoma vegetal bajo número de copias multicopia en tandem
independientes
precisa imprecisa
Construcción de vectores compleja simple
Dependencia del genotipo mayor menor

vegetal

Figura 3: Comparación de técnicas de transformación directa e indirecta
y cuando hay más de una copia, éstas suelen un mismo sitio del genoma con distinto grado
distribuirse en loci independientes, lo que fa- de reordenamiento de la secuencia del trans-
cilita la posterior eliminación de las copias no gen. Este último aspecto es considerado como
deseadas por segregación. Por otra parte, el una desventaja ya que tanto desde el punto de
mecanismo involucrado hace que se transfie- vista de la percepción pública como el de la op-
ra un segmento de ADN definido: el T-ADN, timización de la expresión de los transgenes,
acompañado de proteínas que lo protejen de es deseable disponer de inserciones simples
la acción de nucleasas. Por el contrario, en el y bien definidas molecularmente. Esto es par-
método biolístico el ADN transferido no está ticularmente relevante cuando se tiene por ob-
asociado a proteínas, por lo que al ser parcial- jetivo el desarrollo de productos comerciales.
mente degradado solo parte del mismo llega al Así, el fenómeno de silenciamiento de transge-
núcleo donde se produce, con baja eficiencia, nes (pérdida de su expresión), observado en
la integración al azar en el ADN cromosómico. algunos casos, puede resultar de la presencia
En este método es común que se produzcan de varias copias del transgen. Por otra parte,
inserciones de varias copias del transgen en cuando se utiliza el método biolístico, el seg-

mento de ADN plasmídico que se integra al 2.3.4 Genes de selección e informadores
ADN cromosómico no está definido como en En el proceso de obtención de plantas trans-
el caso de T-ADN, sino que es de longitud va- génicas, los genes marcadores seleccionables
riable. (Tabla 3), generalmente de origen bacteriano,
La construcción de vectores es mucho más cumplen un rol de relevancia ya sea en forma
sencilla en el caso del método biolístico. Este individual para poner a punto un protocolo de
aspecto puede resultar importante en el con- transformación o como acompañantes del gen
texto del desarrollo de proyectos de investiga- de interés que se desea introducir. El gen mar-
ción, en los cuales muchas veces se requiere cador seleccionable otorga a las células trans-
utilizar un número considerable de vectores génicas que lo expresan una importante venta-
diferentes. ja, con respecto a las células no transgénicas,
Es conveniente destacar que en ambos mé- al permitirles crecer en un medio de cultivo que
todos la integración del transgen en el genoma contiene el agente selectivo correspondiente.
se produce al azar, como consecuencia de ello, Entonces, si el gen marcador codifica para una
diferentes plantas transgénicas provenientes de proteína que confiere resistencia a agentes fi-
un mismo experimento, presentan inserciones totóxicos como antibióticos o herbicidas, las cé-
en distintos sitios del genoma receptor. Así, la lulas que lo expresen podrán crecer y desarro-
expresión fenotípica de un transgen será dife- llarse en medio de cultivo que contenga dichos
rente en distintas plantas transgénicas que con- agentes selectivos mientras que las células no
tienen el mismo transgen, por lo cual para cla- transgénicas no lo harán (selección negativa).
rificar la situación se considera a cada una de En otros casos, la ventaja estará dada por la
ellas como eventos de transformación distintos. posibilidad de utilizar diferencialmente un sus-
La eficiencia de aplicación de cualquiera de trato. Así, el gen man A de E. coli permite a
estos métodos de transformación al mejora- las células vegetales que lo expresan utilizar la
miento vegetal, depende en gran medida de manosa como fuente de carbono, lo cual no es
la disponibilidad de genotipos con muy buena posible para las células no transgénicas (se-
respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, cabe lección positiva). Es necesario tener en cuenta
mencionar que en el caso de A. tumefaciens, que algunas especies pueden poseer una re-
debido a que se trata de una interacción biológi- sistencia natural a los agentes selectivos antes
ca planta/bacteria, la dependencia del genotipo mencionados. Por ello, es importante evaluar
es mucho más acentuada ya que influyen tam- este aspecto cuando se elige el gen de selec-
bién en la eficiencia de transformación, tanto el ción a utilizar, así como el agente selectivo y
genotipo de la planta como el de la bacteria. las concentraciones del mismo.
Marcadores
Seleccionables (Agente selectivo) Visualizables (Fenotipos asociados)

npt II (kanamicina, paromomicina, G418) gus A (color azul índigo)
hph (higromicina) luciferasa (luminiscencia)
pat o bar (phosphinotricina, bialaphos) gfp (fluorescencia verde)
CP 4 (glifosato)
man A (manosa 6 fosfato)
Tabla 3: Genes marcadores utilizados comúnmente en transformación de plantas

En la puesta a punto de las metodologías de - Reacción en Cadena de la Polimerasa
transferencia de genes son asimismo de gran (PCR): con el uso de ‘primers’ homólogos a la
utilidad los genes marcadores visualizables o secuencia del transgen se puede determinar la
informadores que posibilitan la observación di- presencia del mismo. Esta técnica permite ha-
recta de las células que los expresan (Tabla 3). cer un ‘screening’ rápido de las plantas regene-
Estos genes codifican para proteínas que no radas, aunque tiene algunas limitaciones. Así,
están presentes en las células vegetales y pro- un resultado positivo indica solamente que en
ducen un fenotipo característico de fácil y rápi- la muestra existe una secuencia que amplifica
da observación. Así, el gen gus A proveniente con los ‘primers’ utilizados pero no demuestra
de E. coli codifica para la enzima ß-glucuroni- que el transgen se encuentre incorporado al
dasa. Esta proteína puede ser detectada cua- genoma de la planta. Para esto último se re-
litativamente por tinción histoquímica. En esta quiere un estudio de hibridación molecular o
técnica, en presencia de un sustrato específico el estudio de la transmisión sexual del trans-
esta enzima cataliza la producción de un pre- gen. La robustez de esta prueba se maximiza
cipitado azul-índigo de fácil visualización. Este utilizando temperaturas de “annealing” o apa-
marcador también puede ser detectado cuan- reamiento de “primers” altas (más de 60 °C) y
titativamente usando técnicas fluorométricas. “primers” relativamente largos (más de 20 nu-
Como ejemplo de la aplicación de estos méto- cleótidos). Una variación de esta técnica, PCR
dos de detección, podemos mencionar el estu- en tiempo real, resulta de utilidad para evaluar
dio de la expresión de promotores en plantas. el número de copias del transgen incorporadas
Para ello se puede construir un vector con la al genoma de la célula vegetal (ver parte I).
secuencia codificante de gus A bajo el control
del promotor en estudio y una secuencia de - Hibridación molecular o ‘Southern blot-
terminación de transcripción, y obtener plantas ting’: es una de las herramientas moleculares
transgénicas. El estudio de las mismas per- mas poderosas para caracterizar las plantas
mite conocer el patrón de expresión espacio- transgénicas. Además de indicar la presencia
temporal del promotor (en que tipo de células y o no de la secuencia de interés, da informa-
cuando se expresa) por tinción histoquímica y ción acerca de la integración de la misma en
su nivel de expresión por fluorometría. el genoma de la célula huésped (número de
Por otra parte, el gen de la proteína fluores- copias integradas y número de loci en los cua-
cente verde, gfp (“green fluorescent protein”), les se produjo la integración). En la Figura 4
aislado de una medusa, se ha convertido en se representa el análisis de un caso hipotético
un gen marcador visualizable in vivo muy uti- de transformación mediante Agrobacterium,
lizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta aunque este es aplicable también a plantas
o luz azul, tejidos que contienen células que obtenidas por métodos directos. El esquema
expresan este gen, se observa un brillo verde 4-a representa parte del vector que contiene el
fluorescente. Al ser este un ensayo no destruc- gen de interés y el gen marcador. Si se utiliza
tivo, es decir que permite conservar vivo el ma- como sonda el T-ADN completo y la digestión
terial en estudio, representa una herramienta del ADN genómico se realiza con enzimas de
de utilidad para visualizar diferentes etapas del restricción que no cortan dentro del T-ADN, el
proceso de transformación. número de bandas del patrón representa el nú-
mero de sitios de inserción. El tamaño de las
2.4 Técnicas de detección del transgen y bandas será mayor que el T-ADN ya que se
sus productos están utilizando enzimas que cortan por fue-
Luego de la selección in vitro, las plantas ra de este. Plantas transgénicas obtenidas
regeneradas deben ser analizadas por méto- en forma independiente tendrán patrones de
dos moleculares para identificar aquellas que hibridación diferentes (4-b). Por otra parte, si
porten y expresen los transgenes en los nive- la enzima tiene un sitio de corte único dentro
les deseados. Para ello se emplean técnicas del T-ADN, utilizando la sonda antes mencio-
como: nada, esta dará dos señales de hibridación

Hind III Eco RI Sal I Sal I Hind III
BI Gen marcador Gen de interés

a)
2 kb 3 kb
b) 1 2 3 4 5 c) 1 2 3 4 5 d) 1 2 3 4 5
Sitio de Ausente dentro del T- Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre el
corte: ADN marcador y el transgen
Sonda: T-ADN (frag. Hind III) T-ADN (frag. Hind III) Gen marcador
Frag: tamaño > 5 kb > 2 kb > 2 kb
cantidad Variable El doble que en b) Igual en en b)
e) 1 2 3 4 5 f) 1 2 3 4 5
Sitio de Un sitio (Eco RI) entre el Dos sitios (Sal I) dentro del
corte: marcador y el transgen transgen
Sonda: Transgen Fragmento (Sal I) del
transgen
Frag: tamaño > 3 kb 1 kb
cantidad Igual que en d) Uno
Figura 4: Patrones de Hidridación de Southern Blot (Tomado de Bhat y Srinivasan, 2002)
para cada sitio de inserción independiente del pérdida del sitio de corte. La aparición de una
T-ADN (4-c). La aparición de un número impar banda del tamaño del T-ADN puede indicar la
de bandas indica que en un mismo sitio se in- presencia de repeticiones en tandem. Para es-
sertaron múltiples copias, ocurrieron rearreglos timar el número de copias del transgen en un
o se produjo el truncado del T-ADN. Si se di- locus transgénico, se deben utilizar enzimas de
giere la muestra con una enzima de restricción restricción con sitios flanqueantes del transgen
que posee un sitio único de corte entre el gen y como sonda el transgen. Se observará una
marcador y el gen de interés y utilizando como sola banda del tamaño del transgen, sin em-
sonda el gen marcador, se obtendrá una sola bargo la intensidad de la señal variará entre las
banda por cada inserción independiente (4-d). distintas plantas analizadas de acuerdo al nú-
Si la membrana se hibrida con el gen de in- mero de copias del mismo (4-f). Para realizar
terés (4-e) aparecerá un patrón que tendrá el esta comparación es necesario utilizar simultá-
mismo número de bandas que el anterior. La neamente estándares conteniendo un número
ausencia de una banda indica la inserción de conocido de copias del transgen. Esta deter-
una copia truncada de uno de los genes y la minación no es del todo precisa ya que puede

existir variabilidad en los resultados debido a autorización de la Comisión Nacional Asesora
diferencias en la digestión de las muestras y a de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) (ver
la posible degradación del ADN. parte VII).
En lo que respecta a la cuantificación, esta
técnica ha sido reemplazada en gran medida, 3 Aporte de la transformación genética a la
en los últimos años, por la PCR en tiempo real variabilidad genética
o “real time PCR”, antes mencionada, dado que Como ya se mencionó, la transformación ge-
esta última resulta menos costosa en reactivos nética permite introducir variabilidad genética
y tiempo y requiere menos cantidad de material novedosa en las diferentes especies vegetales.
vegetal para realizar el análisis. Este aporte puede ser realizado de diferentes
maneras:
- Análisis de ARN: Tanto las técnicas de RT- a) La expresión de secuencias codificantes
PCR (transcripción reversa seguida de PCR) no existentes en la especie (ejemplo: proteínas
como la hidridación de ARN o “Northern blot- insecticidas de origen bacteriano).
ting” pueden resultar valiosas herramientas b) La expresión de nuevas formas alélicas
para detectar los transcriptos de interés prede genes que ya están presentes en el genoma
sentes en la muestra. La RT-PCR presenta (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja).
algunas ventajas frente al Northern blotting: c) La expresión de secuencias codificantes
se requiere poca cantidad de material, posee presentes en el genoma pero bajo el control de
una alta sensibilidad y la muestra es de fácil nuevas secuencias regulatorias que modifican
preparación. Por otra parte, la hibridación del su nivel o patrón de expresión (ejemplo: proteí-
ARN utiliza como sonda el transgen, ofrece nas relacionadas a la patogénesis).
información sobre el tamaño del transcripto y d) La inhibición de la expresión de genes resi-
permite su cuantificación. Cabe destacar que dentes en el genoma.
la RT-PCR puede también ser utilizada como
técnica de cuantificación de transcriptos. Para lograr la inhibición de la expresión gé-
nica se pueden usar diferentes técnicas: cosu-
- ELISA y “Western blotting”: aquellas presión, ARN antisentido y la denominada inter-
plantas que poseen la secuencia de interés y ferencia del ARN. Todas ellas se basan en un
la expresan como transcripto, pueden ser ana- proceso denominado silenciamiento génico que
lizadas con estas técnicas inmunológicas a fin involucra la degradación del ARN mensajero
de determinar la presencia de la proteína codi- producido por un gen determinado (ver capítulo
ficada por el transgen. siguiente).
La actividad de la proteína codificada por el Un inconveniente que se encuentra tanto en
transgen debe ser medida, ya sea por ensayos el mejoramiento convencional como en la inge-
bioquímicos o por bioensayos, a fin de inter- niería genética es la incorporación de múltiples
pretar correctamente el fenotipo de la planta genes. A esto se lo llama piramidización de ge-
obtenida. Además, es conveniente confirmar nes y es necesario para la expresión de caracte-
la estabilidad meiótica de los transgenes estu- rísticas complejas de naturaleza poligénica (por
diando su transmisión sexual a la generación ej. vías biosintéticas), la obtención de resisten-
siguiente. cia a enfermedades más duradera donde se re-
Estas técnicas se encuentran descriptas de- quiere más de un gen para evitar la caída de la
talladamente en la parte I y su aplicación para resistencia, para otorgar resistencia conjunta a
el análisis de plantas transgénicas en Register varios patógenos o la incorporación de múltiples
(1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). características.
Finalmente el comportamiento de los indivi- Algunas estrategias para alcanzar este objeti-
duos transgénicos se estudia en laboratorio, vo son las siguientes:
invernáculo y campo. Cabe aclarar que para a) cruzamiento de dos plantas transgénicas
realizar experimentos de invernáculo y de con distintos transgenes
campo en Argentina es necesario contar con b) re-transformación en eventos consecutivos

c) co-transformación en el mismo evento codificadas por ellos (hasta el 47% de las
proteínas solubles totales). Cabe notar
La co-transformación es la alternativa más que el nivel de acumulación observado a
utilizada y ventajosa, ya que los transgenes partir de transgenes nucleares es gene-
co-transformados tienden a co-integrarse en ralmente inferior al 1%.
la misma posición en el genoma en la mayor 2. Es posible expresar un transgen “ope-
proporción de los eventos transgénicos. Esto rón” con varias secuencias codificantes
aseguraría la no segregación de los genes, lo bajo el control de un mismo promotor.
cual es muy útil cuando se quiere incorporar 3. No se observa efecto de posición debido
una característica poligénica. a que la integración del transgen está di-
La mayoría de los procesos metabólicos que rigida a un sitio particular del plastoma.
pueden ser sujetos a manipulación dependen Esto hace que no sea necesario obtener
de la interacción entre numerosos genes y el una gran población de transformantes, a
flujo dentro de las vías bioquímicas es a ve- diferencia de lo que actualmente ocurre
ces coordinado con otras vías, por lo que la con las plantas transgénicas nucleares.
manipulación efectiva sólo puede ser alcanza- 4. No se observa silenciamiento de trans-
da coordinando el grado de expresión de los genes.
distintos transgenes. Coordinar la expresión 5. Para las especies que tienen transmisión
de múltiples transgenes sobre una misma vía materna de los plástidos (la mayoría). Se
metabólica es muy difícil de alcanzar, ya que la minimiza la dispersión de los transgenes
expresión de los transgenes depende del lugar por el polen debido a la baja de transmi-
donde se inserten en el genoma. Existen algu- sión de los plástidos por el mismo.
nas estrategias elegidas para la manipulación 6. A pesar de la naturaleza eminentemen-
de estas características: te procariota del sistema genético de los
- transgenes policistrónicos (un promotor plástidos, se ha demostrado que estas
con varios transgenes) organelas pueden procesar proteínas
- poliproteínas eucariotas permitiendo su correcto ple-
gamiento y la formación de puentes di-
El avance técnico en esta área es uno de los sulfuro gracias a la presencia de proteí-
mayores desafíos de la biotecnología vegetal, nas chaperonas y sistemas enzimáticos
ya que las nuevas generaciones de transgéni- endógenos.
cos requieren de la incorporación de múltiples
características. Los protocolos existentes para la obtención
de plantas transplastómicas se basan en la
4 Obtención de plantas transplastómicas transferencia de genes por el método biolístico,
Las células vegetales contienen tres geno- un eficiente proceso de cultivo y selección in vi-
mas: el nuclear, el plastídico y el mitocondrial. tro, y la utilización de vectores con secuencias
Los métodos presentados en las secciones homólogas al genoma del cloroplasto. A dife-
precedentes tienen como blanco de transfor- rencia de lo que ocurre en la transformación
mación al genoma nuclear. Sin embargo en del genoma nuclear, la integración dirigida de
los últimos años la obtención de plantas trans- los transgenes en el plastoma se realiza me-
plastómicas ha recibido notable atención. Así, diante recombinación homóloga. Para lograr
el genoma de los plástidos (plastoma) se ha esto, los vectores contienen los transgenes de
convertido en un blanco atractivo para la inge- interés flanqueados por secuencias con alta
niería genética ya que esta tecnología ofrece homología al ADN plastídico. La homología
una serie de ventajas sobre la transformación entre el ADN del vector y del ADN del cloro-
del genoma nuclear: plasto determina la potencialidad del plásmido
1. Se pueden obtener altos niveles de ex- para ser utilizado en la transformación genética
presión de los transgenes y elevados del plastoma. En este contexto, la existencia
niveles de acumulación de las proteínas de secuencias altamente conservadas en el

plastoma de varias especies es explotada para transformación, lo que permitirá ampliar el ran-
el diseño de vectores universales, potencial- go de genotipos a los cuales se podrá aplicar
mente útiles en la transformación de los cloro- esta moderna tecnología. Así, se desarrolló un
plastos de numerosas especies. La expresión método eficiente y reproducible de transforma-
exclusivamente plastídica de los transgenes ción in planta para Arabidopsis thaliana. Este
queda asegurada a través de la utilización de consiste en infiltrar con vacío plantas adultas
promotores específicos del cloroplasto, cuya de esta especie, con una suspensión de A. tu-
transcripción tiene características típicamente mefaciens de modo que los tejidos y órganos
procarióticas. reproductivos sean invadidos por la bacteria.
Posteriormente se propuso una simplificación
5 Perspectivas de este método que consiste en reemplazar el
La continuidad en el desarrollo de tecnología tratamiento de vacío y sumergir la inflorescen-
de transferencia de genes en plantas es impor- cia en una suspensión bacteriana que incluye
tante tanto para ampliar el rango de especies un surfactante. Las plantas transgénicas que
a transformar como el de genotipos dentro de se obtienen por autofecundación de las plantas
cada especie. En los últimos años se nota un así transformadas, son hemicigotas y se de-
creciente interés en el control del nivel de ex- mostró que esta metodología produce la trans-
presión de transgenes así como de su regula- formación de la gameta femenina. Finalmente,
ción espacial y temporal. La expresión de los debido a la importante restricción que puede
genes nucleares eucarióticos está controlada significar la utilización de métodos de transfor-
en varios niveles que involucran la transcrip- mación genética protegidos por patentes, se ha
ción propiamente dicha, el procesamiento, está estudiando el desarrollo de métodos que
transporte y estabilidad de los transcriptos y su utilizan, a partir de herramientas derivadas de
traducibilidad, así como la estabilidad, modifi- Agrobacterium, otras bacterias como vectores
cación y compartimentalización del producto alternativos de transformación.
proteico final. Por otra parte, es necesario apro- El logro de determinados objetivos como
vechar la experiencia acumulada en cuanto a puede ser el redireccionamiento de una ruta
la expresión de transgenes, de modo de dise- metabólica o la modificación de un carácter
ñar protocolos de transferencia que minimicen complejo de interés agronómico como por
las posibilidades de silenciamiento génico. En ejemplo la resistencia durable a enfermedades
este contexto, está recibiendo notable atención fúngicas, requiere de la integración de múlti-
el estudio de la recombinación homóloga como ples transgenes y de la expresión coordinada
mecanismo para la transformación del genoma de los mismos en la planta. Este tema está re-
nuclear. cibiendo notable atención.
Del análisis comparativo de métodos presen- Los métodos de transformación que hemos
tado cabe destacar tres aspectos actualmente descripto se basan en la utilización de genes
en desarrollo. Por un lado, continúa el interés marcadores seleccionables. Sin embargo, hay
en extender el uso de la transformación media- razones por las cuales la presencia del mar-
da por A. tumefaciens a especies que no son cador no es deseable en plantas transgénicas
hospedantes naturales de la bacteria. Por otro que se liberan al ambiente. Hay un manifiesto
lado, como fuera anteriormente mencionado, rechazo por parte del público con respecto a la
los métodos de transformación genética ac- utilización de genes de resistencia a antibióti-
tualmente en uso requieren de genotipos con cos y en determinadas situaciones, el uso de
una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo genes de resistencia a herbicidas puede ser
cual resulta en una clara limitación cuando se inconveniente. Por otra parte, desde un pun-
desea aplicar esta tecnología a los materiales to de vista experimental puede ser necesario
usados por los mejoradores, los que general- transformar una misma planta varias veces con
mente no poseen esta característica. Por ello, distintos transgenes y con la metodología con-
se está tratando de reducir y si es posible evitar vencional no hay más que un número limitado
la fase de cultivo in vitro durante el proceso de de genes marcadores disponibles. Por ello se

consideran estrategias alternativas para la ob- 6 Lecturas recomendadas
tención de plantas transgénicas libres de mar-
cadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha Bhat S., Srinivasan S. 2002. “Molecular and genet-
recibido más esfuerzo hasta ahora, plantea la ics analyses of transgenic plants: considerations
remoción vía cruzamiento sexual del marca- and approaches”. Plant Science 163:673-681.
dor seleccionable luego de haber obtenido la Birch R. 1997. “Plant transformation: Problems and
strategies for practical applications”. Annu. Rev.
planta transgénica. Una posibilidad para ello
Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 48: 297-326.
es cotransformar. Esto implica que el transgen François I, Broekaert W., Cammue B. 2002. “Differ-
de interés y el marcador seleccionable estén ent approaches for multi-transgene-stacking in
presentes en vectores distintos y que posterior- plants”. Plant Science 63: 281-295.
mente se separen los genes por segregación Gelvin S. 2003. “Agrobacterium-Mediated Plant
luego de la reproducción sexual. Sin embargo, Transformation: the Biology behind the “Gene-
esta puede ser una alternativa poco atractiva Jockeying” Tool”. Microbiology and Molecular Bi-
en circunstancias particulares como cuando ology Reviews, Mar. 2003: 16–37.
no se dispone de un protocolo eficiente de co- Gepts P. 2002. “A Comparison between Crop Do-
transformación o cuando no se desea repro- mestication, Classical Plant Breeding, and Ge-
netic Engineering”. Crop Sci. 42:1780–1790.
ducir sexualmente la planta transgénica. Otra
Halpin C. 2005. “Gene stacking in transgenic plants
opción dentro de esta línea es la utilización del – the challenge for 21st century plant biotechnol-
sistema de recombinación sitio-específica de ogy”. Plant Biotechnology Journal, 3:141-155.
origen viral Cre/lox. Esta estrategia requiere Hanin M., Paszkowski J., 2003. “Plant genome
primero la obtención de plantas transgéncias modification by homologous recombination”. Cur-
portadoras del gen de la recombinasa (cre) y rent Opinion in Plant Biology 6: 157-162.
posteriormente la introducción del transgen Horsch R., Fraley R., Rogers S., Sanders P., Lloyd
flanqueado por sitios lox de reconocimento. A., Hoffman N. 1984. “Inheritance of functional
Más recientemente se ha propuesto como es- foreign genes in plants”. Science 223: 496-498.
trategia alternativa el desarrollo de métodos de Klein T., Wolf E., Wu R., Sanford J. 1987. “High ve-
locity microprojectiles for delivering nucleic acids
transformación que no usen marcadores selec-
into living cells”. Nature 327: 70-73.
cionables. La idea subyacente es incrementar Lee L. y Gelvin S. 2008. “T-DNA Binary Vectors and
la frecuencia de transformación a través del Systems”. Plant Physiology Vol. 146: 325-332.
uso de genes que promuevan la regeneración. Maliga P. 2004. “Plastid transformation in higher
Finalmente, las plantas transgénicas actual- plants”. Annu. Rev. Plant Biol. 55:289–313.
mente cultivadas comercialmente, en su mayo- Puchta H. 2003. “Marker-free transgenic plants”.
ría resistentes a herbicidas y a insectos, nos Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 123-134.
permiten ganar experiencia y acumular el co- Register J (1997) “Approaches to evaluating the
nocimiento necesario para desarrollar nuevas transgenic status of transformed plants”. TiBTech,
y mejores generaciones de productos. A pe- 15:141-6.
Small I., 2007. “RNAi for revealing and engineering
sar de estos avances en el desarrollo de esta
plant gene functions”. Current Opinion in Biotech-
tecnología, su aplicación comercial se ve limi- nology 18:148-153.
tada por el elevado costo que tiene el pasaje
por el estricto sistema de controles que regula
su aplicación. Esto restringe notoriamente las
especies a ser usadas en transformación y los
caracteres a mejorar mediante la misma.

II. CAPÍTULO 7 cial) puede también mostrar cambios visibles
o medibles, los cuales permiten evidenciar la
actividad del gen. Por ejemplo si uno reduce la
Usos del silenciamiento génico expresión de un gen involucrado en la síntesis
para el análisis funcional de de pigmentos, dicha planta puede presentar
genes candidatos. una disminución en la coloración de sus hojas.
Esta disminución dependerá del grado de re-
Cecilia Vazquez Rovere, Ariel Bazzini, ducción en la expresión del gen, pudiendo pre-
Cecilia Rodríguez, Natalia Almasia y sentar desde pequeñas manchas amarillentas
Sebastián Asurmendi o hasta la falta total de coloración foliar (Figura
1). Este capítulo considerará únicamente esta
segunda estrategia de reducción de la expre-
El progreso de las disciplinas genómicas ha sión génica mediada por el mecanismo deno-
generado una rápida acumulación de informa- minado silenciamiento génico. Los métodos
ción biológica relacionada a la estructura de basados en el silenciamiento génico presentan
los genomas, su organización, su composición varias ventajas respecto a otros empleados
en número de genes, su grado de homología en el campo de la genómica funcional. Una
y sus relaciones evolutivas. Esta información de ellas es la posibilidad de silenciar varios o
puede ser aprovechada para el análisis funcio- todos los miembros de una familia multigénica
nal de genes promoviendo un gran avance en simultáneamente. Esto es altamente relevante
diferentes aspectos como el fitosanitario o el cuando se realizan estudios de genómica en
de respuestas a estreses ambientales, entre organismos poliploides, como por ejemplo en
otros. Para el estudio de la funcionalidad de el caso del trigo en el cual existe una gran re-
genes candidatos existen diversas estrategias. dundancia genética (Travella y col., 2006). Otra
La más antigua (no por eso menos efectiva o de las ventajas es que permite obtener distin-
utilizada) consiste básicamente en sobre-ex- tos grados de silenciamiento del gen (débil, in-
presar un gen, es decir aumentar la expresión termedio y fuerte) siendo útil para el análisis de
del gen de interés a niveles tan altos que su fenotipos asociados a genes cuya disminución
función o actividad puede aumentar y así ser total resultaría letal. Finalmente, también se
medible u observable mediante técnicas mo- puede mencionar la capacidad de generar un
leculares o simplemente fenotípicamente. Por silenciamiento eficiente a partir de secuencias
ejemplo, la sobreexpresión de genes del me- de pequeño tamaño permitiendo el estudio de
tabolismo puede producir un aumento impor- genes cuya secuencia completa se desconoce
tante en el crecimiento de una planta. La se- (Lu y col., 2003).
gunda estrategia es antagónica a la primera y Actualmente existen diversas metodologías
consiste es disminuir los niveles de expresión basadas en el silenciamiento génico. Algunas
del gen en estudio. Esta reducción (total o par- de las mismas requieren de la generación de
Figura 1. Foto mostrando el blanqueo del tejido de plantas en las cuales se silenció el gen PDS en las
especies Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum res-
pectivamente de izquierda a derecha

plantas transgénicas portadoras de una cons- (Baulcombe, 2004 y Ossowski y col., 2008).
trucción capaz de silenciar al gen candidato, Distintas clases de sRNAs han sido descriptas
mientras que en otras el silenciamiento se des- dado que se originan por diferentes vías y que
encadena a partir de la replicación de un virus poseen funciones celulares diversas (ver tabla
que porta en su genoma un fragmento del gen 1). A pesar de estas diferencias, los procesos
a silenciar. Dependiendo del problema especí- de silenciamiento comparten numerosas eta-
fico a resolver se deberá considerar la tecno- pas en común. En todos los casos al inicio se
logía disponible más adecuada. Es importante produce la formación de una molécula de RNA
destacar que no todas las herramientas mole- doble cadena (dsRNA), la cual es específica-
culares pueden utilizarse en todas las espe- mente clivada por una enzima perteneciente a
cies, es decir que en la elección de la metodo- la familia de las RNasas tipo III (similar a Dicer
logía deberá tenerse en cuenta la especie con – DCL por su siglas en inglés (Fire y col., 1998)
la que se esté trabajando. Una de las metas la cual genera fragmentos de 21 a 25 nucleóti-
de la ciencia actual es masificar estas técnicas, dos de ambas polaridades (Baulcombe y col.,
es decir que independientemente del organis- 2004 y Dorokhov y col., 2007). Las dos cade-
mo (girasol, papa, hongo, etc.) uno pueda op- nas de los fragmentos resultantes son luego
tar por una variedad de técnicas moleculares separadas presumiblemente por una helicasa
para solucionar el problema planteado de la y una de las cadenas, denominada hebra guía,
forma más adecuada. Asimismo, es importan- es incorporada al complejo enzimático endó-
te mencionar que el silenciamiento génico es geno RISC (por sus siglas en ingles “RNA-in-
un mecanismo ampliamente distribuido en los duced silencing complex”) el cual es capaz de
procesos naturales de los seres vivos. Todos producir el silenciamiento de aquellos genes
los organismos regulan la expresión de sus ge- que presenten homología con la secuencia de
nes dependiendo de su información génica, del dicha cadena incorporada. Dentro de este me-
ambiente y del estado de desarrollo, y en los canismo general pueden existir variaciones a
organismos superiores una de las formas de nivel de la formación del dsRNA, de la clase de
regular negativamente (disminuir) la expresión DCL involucrada en el clivaje del RNA y de las
de sus genes es mediante el silenciamiento. moléculas efectoras que reclutan a los sRNAs
En los últimos 15 años el estudio de este me- para luego ejercer su acción. Dicha acción pue-
canismo natural, ha permitido utilizarlo de for- de ser la modificación del nivel de metilación
ma dirigida a fin de disminuir la expresión de de las secuencias regulatorias del gen blanco,
genes endógenos a elección. la degradación del RNA mensajero (mRNA) o
En este capítulo se introducirán los concep- bien la reducción específica de su traducción.
tos básicos del mecanismo de silenciamiento En consecuencia, el silenciamiento génico es
y se desarrollarán las distintas metodologías un mecanismo regulatorio que puede actuar
más frecuentemente empleadas en la actuali- en distintos niveles: transcripcional (denomi-
dad para determinar la función de los genes y/o nado silenciamiento transcripcional, TGS),
analizar su diversidad funcional. post-transcripcional (silenciamiento post-trans-
cripcional, PTGS) y traduccional (Chapman y
1. Silenciamiento génico Carrington, 2007).
El silenciamiento génico hace referencia a A continuación se explicarán brevemente los
diversos procesos que producen la reducción mecanismos de silenciamiento mencionados:
secuencia-específica de la expresión génica
y en los cuales la molécula involucrada es el 1.1 Silenciamiento transcripcional
RNA. Las moléculas de RNA que participan En el silenciamiento transcripcional, su ac-
del silenciamiento génico presentan un rango ción está dirigida hacia las secuencias regu-
de tamaño de 20 a 30 bases nucleotídicas por latorias y como consecuencia el gen río abajo
lo que se las denomina “small” RNAs (sRNAs de dicha región deja de transcribirse. En este
por su siglas en inglés) o bien “silencing” RNAs proceso los sRNAs dirigen modificaciones en
debido a su participación en este fenómeno el DNA o en las proteínas asociadas a él, por

Clase* Descripción Biogénesis y origen Función
genómico
miRNA Micro RNAs Transcriptos de genes Regulación post -
miRNAs forman transcripcional de
estructuras secundarias de los transcrip tos de
RNA doble cadena que un amplio rango de
son procesados por Dicer genes
o por RNAsas tipo III
siRNAs sRNAs Procesamiento de RNA Unión a RNAs

primarios pequeños doble cadena o de targets
interferentes estructuras secundarias complementarios,
Por miembros de la familia guía para la
Dicer iniciación de siRNas
secundarios
siRNAs sRNAs Se forman por la actividad Regulación post
secundarios pequeños de RNA polimerasas RNA transcripcional de
interferentes dependientes, las cuales los transcriptos,
generan RNAs doble formación y
cadena mantenimiento de la
heterocromatina.
tasi RNAs sRNAs que Transcriptos de genes Regulación post
(Trans actúa en TAS son clivados por un transcripcional de
acting trans mecanismo dependiente los transcriptos.
siRNAs) de miRNAs, luego son
convertidos en RNA doble
cadena por RdRP, seguido
del procesamiento por
Dicer
natsi RNAs siRNAs Pares de transcriptos Regulación post
( natural derivados de sense y antisense son transcripcional de la
antisense transcriptos procesados por Dicer expresión de g enes
transcript- antisentidos involucrados en
derived naturales mecanismos de
siRNAs) defensa y respuesta
a stress
piRNAs RNAs que El mecanismo de Supresión de
( Piwi - interaccionan biogénesis no se conoce transposones y
interacting con Piwi completamente, retroelementos en
siRNAs) sería dependiente de líneas germinales de
argonauta e independiente moscas y de
de Dicer mamíferos.
Tabla 1. Clases de sRNAs y su función.* se han mantenidos las siglas en inglés. RdRP: sigla en Inglés
para RNA polimerasa – RNA dependiente. Tabla adaptada de Carrington y col., 2007.
ejemplo produciendo la metilación de los re- y col., 2000). Vaucheret y sus colaboradores
siduos de citosina de DNA y la consecuente propusieron al silenciamiento transcripcional
modificación de la cromatina. Sin embargo la como un sistema de control de la expresión
metilación per-sé no es suficiente en todos los génica de transposones y accidentalmente de
casos para el establecimiento del silenciamien- transgenes con características similares a ellos
to. A modo de ejemplo puede citarse la exis- (2001).
tencia de mutantes de los genes sil1 y mom1,
para los cuales se ha reportado la pérdida del 1.2 Silenciamiento post-transcripcional
TGS a pesar de que las secuencias se encuen- El silenciamiento génico post-transcripcional
tran metiladas (Furner y col., 1998 y Amedeo (PTGS) es un mecanismo inducible y especí-

fico en el cual la molécula blanco es el RNA nes y recientemente también se lo ha ligado a
mensajero. Se ha propuesto que el PTGS evo- procesos de regulación de genes endógenos.
lucionó como un sistema de defensa antiviral Si bien se describió por primera vez en plan-
en plantas dado que restringe la acumulación tas, ha sido reportado en hongos (donde se
o la diseminación de los virus dentro de las denomina “quelling”), y en sistemas animales
mismas (Vance y Vaucheret 2001; Dunoyer y como nematodos, insectos o mamíferos (don-
col., 2004). Como se mencionara previamente de se lo denomina interferencia mediada por
el PTGS se desencadena contra una molécula RNA o RNAi). En plantas el PTGS es desen-
de RNA mediado por la homología de secuen- cadenado eficientemente por intermediarios de
cia del sRNA, pudiendo reconocer tanto un dsRNA que pueden tener su origen en: trans-
RNA del propio individuo como el de un orga- genes nucleares cuyos transcriptos forman na-
nismo patógeno, por ejemplo un virus. Cuan- turalmente estructuras tipo horquilla o “hairpin”
do se produce el reconocimiento del RNA viral (hpRNAi), genes que se expresan en altos ni-
durante la infección se produce la degradación veles, transcriptos aberrantes que pueden ser
del mismo que con lleva al fracaso de la in- reconocidas como dsRNA o estructuras de
fección. Este mecanismo es también respon- dsRNA que se generen durante la replicación
sable del fenómeno de co-supresión de genes de un virus. Cualquiera sea su origen, una vez
endógenos, del silenciamiento de los transge- formadas las estructuras de dsRNA, las mis-
mas son reconocidas por una enzima
RNasa DCL y procesadas dando lugar
a siRNAs de 21 a 25 pb. Estos siRNAs
se asocian al complejo RISC, el cual
es capaz de degradar específicamente
todo aquel RNA que comparta homolo-
gía con la secuencia que desencadenó
el proceso y también pueden ser utiliza-
dos como templado por las polimerasas
celulares dependientes de RNA (RdRps)
para sintetizar la segunda hebra del gen
a silenciar amplificando de esta forma la
señal de silenciamiento (Figura 2).
1.2.1 Amplificación y movimiento del

PTGS
Una de las características del meca-
nismo de silenciamiento en plantas es
la capacidad de ser sistémico, es decir
de poder propagar a toda la planta la
reducción del gen el cual resultara ini-
cialmente disminuido en un único tejido.
Por ello se ha propuesto la existencia
de una señal de silenciamiento capaz
de moverse a través del organismo pro-
pagando el mismo. Estas vías de movi-
miento de la señal se clasifican según
la distancia que alcancen. Así, en la vía
Figura 2. Esquema del silenciamiento génico inducido de movimiento de corta distancia los
por virus, por sobre expresión de transgén o expresión
siRNAs generados en una célula son
de secuencias duplicadas invertidas. Se detalla como el
RNA es procesado en siRNA de 21-25 pb (Figura adap-
capaces de migrar directamente a célu-
tada de Voinnet 2001) las adyacentes a través de los plasmo-

desmos (conexiones directas entre células) y son codificados por genes endógenos, por lo
establecer en estas últimas el silenciamiento. tanto difieren en su biogénesis. Los miRNAs
Una vez que en la célula adyacente es degra- son genes endógenos completos, con la úni-
dado el mRNA homólogo al siRNA, se generan ca particularidad de que no codifican para nin-
nuevos siRNAs, amplificando así la señal que guna proteína, sino que su RNA mensajero es
se trasladará por toda la planta. Se ha reporta- procesado generando una pequeña molécula
do asimismo que esta amplificación se genera de 21 pb aproximadamente. Los miRNAs han
a partir de la síntesis de dsRNA mediada por sido descriptos sólo en organismos eucarion-
una RNA polimerasa RNA dependiente RdRp tes, desde plantas a humanos (Bartel 2004).
(Baulcombe, 2004). En la vía de movimiento Resumidamente, los miRNAs se originan a
de larga distancia la señal se traslada a través partir de transcriptos que se pliegan sobre
del floema permitiendo el movimiento a partes sí mismos dando lugar a una estructura pre-
muy distantes del lugar de origen. Esto fue de- cursora de RNA doble cadena (denominadas
mostrado mediante experimentos que emplean pre-miRNAs), las cuales son procesados de
injertos en los que plantas silenciadas para un manera que se produce una única cadena de
dado transgen son capaces de producir el si- miRNA de pequeño tamaño (21-22 nt) mien-
lenciamiento de ese transgen en plantas no si- tras que la cadena complementaria, denomina-
lenciadas. Si bien aún no se conoce cuál es la da miRNA*, es degradada. En la Figura 3A se
señal de silenciamiento de larga distancia, es muestran ejemplos de estructuras secundarias
muy probable que sea distinta de la
señal que migra de célula en célula
debido a que los dos procesos pue- Estructura del %
den ser separados farmacológica o Construcción genética transcripto de RNA PTGS n
genéticamente (Dunoyer y Voinnet
2008). 7 27
La dispersión del silenciamiento Gen candidato
en sentido
tiene una gran importancia princi-
palmente en la defensa frente a vi-
rus, ya que a partir del sitio inicial Gen candidato 4 25
de infección, donde se indujo el sien antisentid
o
lenciamiento, se produce una señal

que genera la defensa antiviral en hpRNA (brazos de gen
candidato, gen GUS como 58 43
los tejidos adyacentes que de re- secuencia espaciadora)
sultar previa a la llegada del virus
limitará la propagación del mismo al hpRNA (brazos de gen
resto de la planta. candidato, intrón en
antisentido como secuencia
65 34
espaciadora)
1.3 Regulación génica por mi-
croRNAs hpRNA (brazos de gen
candidato, intrón en 96 23
Como hemos mencionado, el sentido como secuencia
silenciamiento es un mecanismo espaciadora)
natural por el cual se regula la ex-

presión de genes. En particular, los Figura 3. A) Se representan las típicas estructuras de rulo
microRNAs (miRNAs) son un tipo o ¨stem-loop¨ de los miRNAs. miR164 de Arabidopsis y sus
homólogos de Oryza y Populus. El segmento correspondien-
específico de moléculas de RNA
te al miRNA maduro se muestra en color rojo (adaptado de
de bajo peso molecular (21 pb) que Jones-Rhoades y col. 2006). B) Esquema del pre-miR164a
controlan la acumulación de mRNA de Arabidopsis y el pre-miR-GFP sintético. En rojo se en-
endógenos al regular finamente la cuentra el miR164 maduro y en verde la porción reemplaza-
expresión de diferentes genes. A dida para generar el miR artificial miR-GFP maduro. Se mues-
ferencia de los siRNAs los miRNAs tra la energía libre (∆G) y la entalpía (∆U) del ensamblado.

de los miRNAs. Una vez que el transcripto del basados en el mecanismo de silenciamiento
miRNA es procesado y el miRNA maduro re- génico. Entre los mismos se encuentra el uso
sultante es incorporado al complejo RISC, el de moléculas antisentido, de moléculas con
cual al dirigirse contra el mRNA blanco reprime estructura de horquilla (hpRNAi), de miRNAS
su expresión génica ya sea mediante degra- artificialmente diseñados y el silenciamiento
dación específica o inhibición de la traducción. génico inducido por virus (ver Tabla 2).
En las plantas el proceso de degradación es el A continuación se exponen algunos de los
más común, mientras que en el reino animal la métodos más usados en la actualidad para lo-
inhibición de la traducción es el proceso más grar establecer el silenciamiento génico. Cada
frecuente. (Hutvagner y Zamore, 2002; Doench uno de estos métodos presenta ventajas y
y col. 2003; Zeng y col. 2003). Estas pequeñas desventajas que determinan que sean más o
moléculas son extraordinariamente importan- menos aptos para el estudio particular del gen
tes en la regulación o modulación de los pro- asilenciar y en la especie que se desea em-
cesos celulares, un solo miRNA puede regular plear, con lo que resulta de suma importancia
la expresión muchos genes por lo tanto incidir evaluarlas antes de elegir la metodología. Es-
en la regulación de múltiples procesos ya que tas metodologías pueden a su vez agruparse
muchos de los genes blancos son factores de en dos categorías principales de acuerdo a que
trascripción, porejemplo la alteración de la ex- involucren la producción de plantas transgéni-
presión de un único miRNA en plantas puede cas o no. Siendo ésta una metodología un tan-
cambiar totalmente el fenotipo de la misma. to lenta y laboriosa.
2. Métodos que emplean el mecanismo de 2.1 Metodologías para el análisis de ge-

silenciamiento para disminuir la expresión nes candidatos que implican transgénesis.
génica en plantas La transformación estable con construccio-
Varios métodos han sido desarrollados para nes capaces de inducir el silenciamiento de un
disminuir la expresión de un gen en estudio gen candidato es quizá la aproximación más
Tabla 2: Métodos basados en el mecanismo de silenciamiento génico, para disminuir la expresión de un gen.
miRNAs
Construcción
artificiales
empleada Antisentido HpRNAi VIGS
Requerimiento
de transgénesis
para obtener
un
silenciamiento
sistémico Si Si Si No
Construcción gen blanco gen blanco gen blanco

i
miRNAs Genoma viral gen blanco
empleada
Formación de
Origen de Explota a los Los dsRNAs se forman
dsRNA por
dsRNAs que Formación de dsRNA por precursores de durante la replicación
apareamiento del
luego son apareamiento del transcripto miRNAs viral o bien por
transcripto
procesados sentido y del antisentido. endógenos para estructuras secundarias
sentido y del
por DCL. generar sRNAs. que adquiere el virus.
antisentido.

simple y antigua del uso de silenciamiento gé- largos fragmentos de dsRNA que son eficientes
nico para el análisis funcional de genes. Si bien precursores de siRNAs y en consecuencia del
estos métodos tienen la desventaja de requerir silenciamiento génico (Chuang y Meyerowitz,
la producción de plantas transgénicas, la ob- 2000, Wesley y col., 2001). La utilización de
tención de las mismas permite que el silen- esta estrategia requiere un estudio minucioso
ciamiento sea estable siendo incluso posible de la variabilidad de secuencia del gen que se
identificar líneas transformantes con diferentes quiere silenciar, por ejemplo si éste forma parte
niveles de expresión del gen en estudio. Más de una familia génica se debe considerar si de-
aún, el uso de promotores específicos y/o indu- sea disminuir la expresión de sólo un miembro
cibles permiten el estudio de genes cuya dismi- de la misma o, por el contrario, silenciar a to-
nución total sería letal en etapas tempranas del dos los miembros de la familia. Es decir que es
desarrollo vegetal. muy importante la elección de la secuencia que
se va a utilizar en la construcción ya que ésta
2.1.1 Silenciamiento mediante moléculas debe ser muy conservada, de un tamaño no
con estructura de horquilla menor a 100 pb y no debe presentar homología
Un desarrollo reciente y efectivo para desen- con secuencias de genes que no se desean si-
cadenar silenciamiento génico en plantas es el lenciar. Una vez elegida la secuencia, ésta se
uso de largos precursores que formen estruc- coloca en sentido y en antisentido de manera
turas de horquilla, es decir moléculas de do- que la dsRNA se forme fácilmente (Ver tabla
ble cadena de RNA (dsRNA). Para ello se han 2). Mediante trabajos sistemáticos en los que
diseñado y utilizado construcciones genéticas se estudian las características de las distintas
con secuencias repetidas e invertidas del gen construcciones capaces de desencadenar el
a silenciar y que al ser transcriptas dan lugar a silenciamiento se ha demostrado que aquellas
construcciones que llevan repe-
ticiones invertidas de un frag-
mento del gen candidato, sepa-
Estructura del % radas a su vez por un pequeño
Construcción genética transcripto de RNA PTGS n intrón, son las más eficiente (ver
Tabla 3) (Wesley y col., 2001).
Esta estrategia ha sido amplia-
7 27
Gen candidato mente probada en distintas es-
en sentido pecies de plantas tanto dicotile-
dóneas como monocotiledóneas
y a tal punto que actualmente
Gen candidato 4 25
en antisentid
o existen plásmidos genéricos dis-
ponibles para la generación de
hpRNA (brazos de gen
diversas plantas transgénicas
candidato, gen GUS como 58 43 (http://www.pi.csiro.au/rnai/).
secuencia espaciadora)
2.1.2 Silenciamiento mediante

hpRNA (brazos de gen miRNA artificial.
candidato, intrón en 65 34
antisentido como secuencia Un miRNA sintético o artifi-
espaciadora) cial es un pre-miRNA al cual se
le permutaron las 21-22 pb del
hpRNA (brazos de gen miRNA maduro y del miRNA*
candidato, intrón en 96 23 por otras del gen de interés pero
sentido como secuencia
espaciadora) manteniendo las características
estructurales lo más parecidas
posibles al original. En estas
Tabla 3. Evaluación de la eficacia de las estructuras disparado-
ras del silenciamiento génico. Adaptado de Wesley y col., 2001
construcciones es muy impor-

tante realizar un estudio de la energía libre y gran ventaja frente al silenciamiento clásico ya
de la entalpía del pre-miRNA sintético ya que que minimiza los riesgos de reducción de la ex-
determinarán la estructura y en consecuencia presión de genes no deseados al emplear so-
el reconocimiento de la maquinaria del proce- lamente 21 pb. Asimismo, si se desea silenciar
samiento. De esta manera el miRNA sintéti- un gen único dentro de una familia de varios
co es capaz de reconocer y controlar al gen genes muy similares la utilización de miRNAs
blanco que se desea silenciar. Utilizando esta artificiales es más adecuada que la técnica de
estrategia se han reportado el control de trans- silenciamiento por horquilla ya que es más fácil
genes (Parizotto y col. 2004), de genes endó- hallar 21 pb específicas que grandes porciones
genos que originalmente no eran blancos de (mayores a 100 pb) de secuencias únicas. Para
miRNAs (Schwab y col. 2006) e incluso se ha alcanzar mayores niveles de silenciamiento
logrado conferir resistencia a virus (Niu y col. con esta técnica se puede recurrir a tándems
2006) (Ver capítulo sobre obtención de plantas de miRNAs artificiales de diferentes porciones
resistentes a virus). En particular nuestro gru- de la secuencia blanco del gen a silenciar, aun-
po de trabajo ha diseñado un vector de miRNA que esto aumenta la complejidad de las cons-
artificial basado en la estructura del miR164a trucciones genéticas necesarias. Para finalizar,
de Arabidopsis thaliana (Figura 3B) logrando la utilización de miRNA artificiales en plantas
controlar la expresión del gen reportero GFP cultivadas es compatible con su uso a bajas
en Nicotiana benthamiana (Fig 4). temperatura (menor a 15C), mientras que el
Si bien esta estrategia requiere de construc- PTGS por horquilla podría resultar inhibido a
ciones genéticas más complejas, posee una estas temperaturas.
Figura 4. (A) y (B) Hoja de N. benthamiana agroinfiltrada con distintas combinaciones de GFP o dsGFP,
Hc-Pro, P19 y miR-GFP (micro artificial) observada bajo luz UV. (C) “Northern blot” de RNA total extraído
de las zonas infiltradas utilizando una sonda que reconoce al mRNA de GFP. (D) Detección del miR-GFP
en gel de poliacrilamida de material extraído de las zonas infiltradas. P= vector vacío.

2.2 Determinación de la actividad de vec- cido por virus, por su sigla en inglés) se aplica
tores aptos para el silenciamiento de forma a la técnica que emplea virus recombinantes a
transitoria vía agroinfiltración fin de disminuir la expresión génica de un gen
Dado que obtener plantas transgénicas es endógeno. La construcción de vectores virales
una labor dificultosa y de larga duración, se que portan en su genoma insertos derivados
pueden realizar aproximaciones útiles previas de secuencias génicas vegetales permite silen-
al desarrollo de las mismas. Así, para analizar ciar específicamente la secuencia endógena
la eficacia de una horquilla de silenciamien- homóloga al inserto introducido en el vector vi-
to o el correcto procesamiento de un miRNA ral. VIGS es una metodología que no requiere
artificial se puede realizar un test de silencia- de transgénesis por lo tanto es rápida y ver-
miento local utilizando Agrobacterium tume- sátil, siendo ideal para estudios a gran esca-
faciens. Esta técnica consiste en realizar cola. En los últimos años ha ido adquiriendo una
agronfiltraciones generalmente de hojas de gran relevancia debido a la necesidad de ana-
N. benthamiana con diferentes agrobacterias lizar la abundante información surgida de los
transformadas; una conteniendo un plásmido proyectos genómicos. Sin embargo, su mayor
expresando el gen blanco y otra conteniendo el desventaja radica en que el nivel de silencia-
plásmido silenciador a evaluar, es decir la mis- miento es variable y que depende mucho de la
ma secuencia blanco (o parte de la misma) re- especie a utilizar.
petida e invertida o el miRNA artificial. Una vez Brevemente, la metodología de VIGS con-
transcurrido el tiempo necesario para el esta- siste en el clonado del gen candidato en un
blecimiento del silenciamiento se analizan, por vector viral, la incorporación de este último en
ejemplo mediante la técnica de “Northern blot”, Agrobacterium y finalmente en la inoculación
los indicadores del silenciamiento en la zona de plantas con el cultivo bacteriano para lo cual
agroinfiltrada. Dichos indicadores son en pri- existen diversos métodos Uno de los métodos
mer lugar una reducción en el nivel de acumu- mayormente empleados es la agroinfiltración
lación esperado del gen blanco y en segundo que consiste en inyectar mediante una jeringa
lugar la aparición de sRNAs homólogos al gen sin aguja la solución de Agrobacterium en la
blanco. En la Figura 4B se muestra un típico en- cara abaxial de la hojas de una planta. Otro de
sayo de inducción de PTGS mediante agroinfil- los métodos es el denominado “agrodrench”
traciones de hojas de N. benthamiana utilizan- que consiste en regar la planta a la altura
do como gen blanco el reportero GFP y como del tallo con la solución deseada (Ryu y col.,
plásmidos silenciadores una construcción con 2004). Tras la agroinoculación de las plantas
estructura de horquilla que posee la secuen- los vectores virales son incorporados a las cé-
cia de GFP en sentido y antisentido separada lulas vegetales donde forman nuevos genomas
por un intrón (dsGFP) o bien una construcción virales causando la infección sistémica de la
que expresa el miRNA artificial que posee 22 planta. En cada una de las células infectadas
pb de la secuencia de GFP (miR-GFP). Para se produce la replicación viral induciendo el
mayor información acerca de la realización de silenciamiento del gen candidato (Ruiz y col.,
experimentos de silenciamiento empleando la 1998; Liu y col., 2002). Existen varios vectores
técnica de agroinfiltración se puede consultar virales desarrollados para VIGS (que se resu-
el trabajo de Bazzini y col. (2007). http://www. men en la tabla 4), sin embargo el sistema de
scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717- VIGS basado en el virus TRV es una de los
34582007000200002&lng=es&nrm=iso>. ISSN más utilizados en la actualidad ya que presenta
0717-3458 ciertas ventajas frente a otros vectores virales.
Este virus ocasiona un nivel menor de sínto-
2.3 Metodología para el análisis de genes mas en las plantas, puede infectar meristemas
candidatos que no requiere transgénesis: y tiene un amplio rango de hospedantes. TRV
silenciamiento génico inducido por virus es un virus de RNA de polaridad positiva con
(VIGS). un genoma bipartito. Uno de esos RNAs ge-
El término VIGS (silenciamiento génico indu- nomicas fue modificado de modo de eliminar

Tabla 4: Vectores virales para su uso en VIGS .Tabla adaptada de Godge y col., 2008.
Virus Género Hospedantes Probado en Genes Referencias

naturales silenciados
importantes
Tobacco Tobamovirus Nicotiana Nicotiana PDS, PSY Kumagai et

Mosaic tabacum benthamiana, al (1995)
Virus Nicotiana
tabacum
Tobacco Tobravirus Amplio rango N. benthamiana, Varios Liu et al
Rattle de hospedantes Arabidopsis, genes (2002b)
virus Tomate, especies PDS, PSY, Ratcliff et
de Solanum, GFP, EDS, al (2001)
pimiento RAR,
NPR1
Potato Potexvirus Solanum N. bentahmiana, PDS, GFP Ruiz et al
Virus X tuberosum Solanum (1998)
Brassicca tuberosum
Campestris
Barley Hordeivirus Trigo, cebada, Trigo, cebada PDS Holzberg et
stripe maíz al (2002)
mosaic Scofield et
virus la ( 2005)
Tomato Begomovirus Lycopersicum N. benthamiana Su(Sulfur Peele et al
goleen sculetum gene) (2001)
mosaic
virus
las proteínas no esenciales e incorporar un sidos etapas, una de iniciación y otra de mante-
tio múltiple de clonado en donde se puede in- nimiento. La primera sería absolutamente de-
troducir el fragmento del gen candidato que se pendiente de la presencia del virus, siendo los
desea silenciar, dejando las regiones no tradu- genes blancos silenciados sólo si la planta es
cibles y la región codificante de la proteína de infectada por el virus. Mientras que la segunda
la cápside intactas. Posteriormente este vec- etapa sería independiente del mismo. (Ruiz y
tor fue mejorado por el grupo del Dr. Dinesh col., 1998, Jones y col., 1999).
Kumar mediante la incorporación del promotor
35S duplicado el cual incrementa la transcrip- Consideraciones finales
ción, del terminador de la nopalina sintetasa y A lo largo de este capítulo se describieron
de la secuencia de una ribozima que permite algunas de las metodologías empleadas fre-
simular el final 3´ del genoma viral de forma cuentemente para estudios de genética rever-
más adecuada (Liu y col., 2002). sa basados en el silenciamiento génico. Como
Así, la base del silenciamiento inducido por se mencionó al inicio del capítulo el empleo de
virus puede explicarse fundamentalmente me- estas metodologías presenta ciertas ventajas
diante el mecanismo de PTGS. Estudios reali- respecto a otras, sin embargo una de las con-
zados en N. benthamiana empleando un trans- sideraciones que hay que tener en cuenta al
gén de la proteína reportera GFP muestran que usar los métodos basado en silenciamiento gé-
el mecanismo de VIGS puede ser separado en nico es la especificidad del mismo con el fin de

evitar que se altere la expresión de otros ge- alergenicidad de vegetales comestibles y estu-
nes no deseados. Estudios realizados en Ara- diar la función de los genes.
bidopsis thaliana indican que al emplear como
inserto la región completa de un gen se alteran
aproximadamente la expresión de 4 genes no Bibliografía:
deseados (Ping Xu y col., 2006). En el último
tiempo han surgido varios trabajos en donde Amedeo, P., Habu Y, Afsar K, Mittelsten Scheid O,
se proponen distintos modos de controlar y/o Paszkowski J. 2000. Disruption Of The Plant
disminuir estos efectos no deseados, entre Gene Mom Releases Transcriptional Silencing Of
ellos se encuentran el uso de programas bio- Methylated Genes. Nature, 405 (6783): P. 203-6.
Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: Genomics, biogen-
informáticos que permiten analizar cuál es la
esis, mechanism and function. Cell: 116:281–297.
mejor región a emplear de modo de obtener un Baulcombe, D.C. 2004. RNA Silencing In Plants.
silenciamiento lo más específico posible (Qiu y Nature, 431 (7006): P. 356-63.
col., 2006 y Ping Xu y col., 2006). Sin embargo Bazzini, A.A., Mongelli, V.C., Hopp, H.E., Del Vas,
estas herramientas sólo son útiles cuando el M. And Asurmendi, S. 2007. A Practical Approach
genoma del organismo ha sido completamen- To The Understanding And Teaching Of Rna Si-
te secuenciado o bien si al menos se dispone lencing In Plants. Electronic Journal Of Bio-
de gran parte de su secuencia. Por otro lado technology, 10 (2): 178-190. eISSN: 0717-3458.
también se ha desarrollado una estrategia ex- Chapman E. J., Carrington J. C. 2007. Specializa-
perimental para validar la información obtenida tion And Evolution Of Endogenous Small Rna
Pathways Nat Rev Genet. Nov;8 (11):884-96
la cual emplea genes sintéticos que codifican
Chuang, C.F. And Meyerowitz, E. M. 2000. Specific
para el gen candidato, pero que no resultan and heritable genetic interference by double-
blanco de la acción de siRNAs, de este modo si stranded RNA in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl.
el gen silenciado es el responsable del fenotipo Acad. Sci. USA 97, 4985-4990.
observado, la expresión de los mismos permi- Doench J.G., Petersen, C.P., And Sharp, P.A.
tiría la recuperación el fenotipo salvaje (Kumar 2003. siRNAs can function as miRNAs. Genes &
y col., 2006). Dev.17: 438–442.
Brevemente, no hay una técnica mejor que Dorokhov Iu, L. 2007. Gene Silencing In Plants. Mol
otra para reducir la expresión génica, sino que Biol (Mosk), 41(4): P. 579-92.
cada una posee sus ventajas y desventajas y Dunoyer P., Lecellier C.H., Parizotto E.A., Himber
C., Voinnet O. 2004. Probing the microRNA and
queda a merced del investigador elegir la/las
small interfering RNA pathways with virus-en-
más correcta/s para su sistema, considerando coded suppressors of RNA silencing. Plant Cell
principalmente los tiempos, el costo, la especie 16:1235–1250.
a utilizar, las condiciones del ambiente y el gra- Dunoyer, P. And O. Voinnet. 2008. Mixing And
do de reducción del silenciamiento con el que Matching: The Essence Of Plant Systemic Si-
uno desea trabajar. lencing? Trends Genet, 24(4): P. 151-4.
Un mensaje final para involucrarse y leer mas Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A.,
sobre este tema, es que si bien el silenciamien- Driver, S. E. And Mello, C. C. 1998. "Potent And
to es un mecanismo de regulación negativa de Specific Genetic Interference By Double-Strand-
la expresión génicas, se ha tornado uno de los ed Rna In Caenorhabditis Elegans." Nature,Vol.
391, No. 6669, P. 806-11.
temas más importantes de las últimas décadas
Furner, I.J., M.A. Sheikh, And C.E. Collett. 1998.
en biología molecular, a tal punto que los des- Gene Silencing And Homology-Dependent Gene
cubrimientos iniciales de este mecanismo les Silencing In Arabidopsis: Genetic Modifiers And
permitieron a los científicos Dr Andrew Z. FIRE Dna Methylation. Genetics, 149(2): P. 651-62.
y Dr Craig C. Mello obtener el Premio Nobel Godge MR, Purkayastha A, Dasgupta I, Kumar
de Fisiología o Medicina en el año 2006. Ac- PP. 2008. Virus-induced gene silencing for func-
tualmente se están desarrollando numerosos tional analysis of selected genes. Plant Cell Rep.
estudios en los cuales mediante silenciamien- 27(2):209-19.
to génico se logra obtener plantas inmunes a Jones, L. Hamilton A.J, Voinet O, Thomas C.L,
infecciones virales o bacterianas, disminuir la Maule, A.J Y Baulcombe D.C 1999. Rna-Dna
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Travella S., Klimm T. E., And Keller, B. 2006. RNA
Interference-Based Gene Silencing As An Effi-

II. Capítulo 8 continua puede ser manejado como si se tra-
tara de un carácter de herencia mendeliana
mediante la introgresión de un fragmento de
Análisis de Experimentos cromosoma conteniendo un QTL por retrocru-
Biológicos zamientos sucesivos en las variedades comer-
ciales. Los QTLs representan un nuevo siste-
Sofía Olmos; Miguel Di Renzo; ma de enfocar el estudio básico y el manejo
Mercedes Ibañez; Nélida Winzer práctico de los sistemas poligénicos y de la
genética cuantitativa.
1 La variación biológica
La variabilidad genética es un hecho uni- 2 Experimento científico
versal en las poblaciones reproductivas y una La ciencia, que tiene como objetivo la expli-
condición preliminar necesaria para el cambio cación y la predicción de los hechos, cuenta
evolutivo y para la respuesta al mejoramien- con el método científico como un procedi-
to genético mediante selección o hibridación. miento que contempla un proceso en flujo
Por otra parte son conocidos los peligros que desde los hechos observados hasta la pro-
implica la uniformidad y la falta de diversidad posición de hipótesis explicatorias. Un re-
en las especies cultivadas y en los animales quisito fundamental en toda ciencia fáctica es la
domésticos, como consecuencia de la erosión contrastación de las hipótesis planteadas,
genética. poniendo a prueba las mismas mediante una
La variación que presentan los individuos de confrontación con la experiencia. El diseño ex-
una población puede ser discontinua o conti- perimental crea artificialmente las condiciones
nua. Los caracteres cualitativos de variación para la contrastación de la hipótesis y brinda la
discontinua, como los marcadores molecula- metodología estadística correspondiente para
res, permiten clasificar a los individuos sin am- el análisis de los datos.
bigüedades, ya que estos caracteres están re- El experimento científico, que como queda
gidos por uno o por pocos genes y el ambiente dicho es un ensayo destinado a probar la vali-
no tiene efecto en su manifestación fenotípica. dez de una hipótesis, se basa en la reproduc-
En cambio, los caracteres cuantitativos, re- ción de ciertos fenómenos bajo condiciones
presentados por la mayoría de los caracteres controladas con el objeto de medir el efecto
de interés agronómico, presentan variación que produce la modificación de uno o varios
continua y los fenotipos, que están determina- factores en estudio (tratamientos) sobre la va-
dos por poligenes y por efectos ambientales, riable dependiente.
son difíciles de clasificar en categorías discre- El ensayo, cuidadosamente diseñado, debe-
tas. Para su análisis deben emplearse métodos rá ser lo más simple posible, evitando los erro-
biométricos, que no miden el efecto de genes res tendenciosos y sistemáticos (bias=sesgo)
individuales o de segmentos cromosómicos de manera tal que los datos recabados pro-
específicos, sino de todo el genoma. vean conclusiones con un amplio rango de va-
Durante los últimos años ha surgido un lidez. Por otra parte, para magnificar el efecto
consenso entre los mejoradores y genetistas de los tratamientos y disminuir el error experi-
moleculares sobre la conveniencia del uso de mental, se procura minimizar el efecto de otros
marcadores moleculares para asistir a la selec- factores no controlados que ejercen influencia
ción de caracteres cuantitativos (MAS, Marker en las observaciones. Esto se logra utilizando
Assisted Selection). La biotecnología ha co- materiales y condiciones experimentales lo
laborado mediante la construcción de mapas más homogéneas posibles. De esta manera,
genéticos saturados, esto es, con innumera- las variaciones observadas se deberán casi
bles marcadores moleculares a lo largo de los exclusivamente a los tratamientos.
cromosomas, que permiten ubicar regiones de Para conocer el efecto de los factores con-
actividad cuantitativa (QTLs, Quantitative Trait trolados y el de los factores no controlados
Loci). De esta manera un carácter de variación (error experimental) sobre el material experi-

mental es necesario formular claramente una (NPK), no habría un orden entre los tratamien-
hipótesis, utilizar un diseño experimental apro- tos (discreto nominal). Cuando se estudian dos
piado y analizar e interpretar los resultados ob- (o más) factores simultáneamente, los distin-
tenidos. tos tratamientos resultan de la combinación de
Por ejemplo, la aplicación de distintos tra- cada nivel de un factor con cada nivel del otro
tamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante = factor. Por ejemplo, si se estudia el efecto de
causa), producen variaciones sobre una carac- fertilizante y competencia, cada tratamiento re-
terística de interés (ej. rendimiento = efecto): sulta de la combinación de una dosis de fertili-
zante y una densidad de siembra determinada.
relación causal - Variable independiente: es la causa que
causa: ⇒ efecto: afecta los resultados del experimento y está
tratamientos cambios en la variable de interés representada por los distintos niveles del fac-
tor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos)
Esto puede graficarse de esta manera: o que se quiere controlar (bloques).
- Variable dependiente: variable respues-
ta o simplemente «variable» es el carácter de
y interés (datos u observaciones) cuya variación
permite cuantificar el efecto de la variable inde-
pendiente. Ejemplos de variables dependien-
tes: a) rendimiento (kg/ha) y diámetro de colo-
nia (mm): cuantitativas continuas, b) tiempo a
variable panojamiento (días), tamaño de camada, nú-
(rendimiento)
mero de colonias (número): cuantitativas dis-
cretas, c) marcadores moleculares (presencia/
ausencia): cualitativa binaria, d) grado de res-
puesta a un estrés o a un patógeno (tolerante,
intermedio, susceptible): cualitativa ordinal.
tratamientos x - Unidad experimental: es un individuo o
(dosis fertilizantes) grupo de individuos, objetos, porción de mate-
rial o terreno (parcela) al que se le asigna un
Y = f (x) tratamiento experimental y sobre la cual se ob-
rendimiento = f (dosis fertilizante) serva una respuesta.
- Repetición: es el número de unidades ex-
perimentales a las que se les asigna el mismo
Terminología tratamiento.
- Factor: Es la causa cuyo efecto se quiere
medir (ej. fertilizante, insecticida, medio de cul- 3 Hipótesis Estadística
tivo, genotipo, ambiente) Como se indicara previamente, el experi-
- Nivel: Es cada una de las categorías o al- mento científico es un ensayo destinado a pro-
ternativas del factor en estudio (ej. dosis de un bar la validez de una hipótesis. Las hipótesis
fertilizante, dosis de insecticida, sales y pH de estadísticas plantean supuestos referentes a
los medios de cultivo, variedades, diferentes algún parámetro poblacional. Por lo general se
años y localidades). utiliza la hipótesis nula (Ho), que se refiere
- Tratamiento: Es cada nivel del factor en a la igualdad entre los parámetros probados.
estudio. Si se estudia el factor fertilizante, cada Frente a la Ho se plantea una hipótesis alter-
dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Si se nativa (Ha).
prueba el efecto de concentraciones crecientes Para determinar si un tratamiento tuvo algún
de un fertilizante los tratamientos tendrían un efecto, se considera a la Ho como la ausen-
orden natural (discreto ordinal); pero si se prue- cia de efectos, lo que equivale probar la igual-
ban distintas combinaciones de fertilizantes dad entre las medias de los tratamientos. La

Ha plantea que al menos una de las medias son equivalentes, t2 = F. La prueba F, que es
difiere significativamente del resto o sea que un cociente de varianzas, es una generaliza-
al menos uno de los niveles del factor probado ción de la prueba t, especialmente útil cuando
tiene efecto sobre la variable de interés. Las hi- se comparan más de dos tratamientos. En el
pótesis estadísticas también prueban otras ca- análisis de la varianza (ANOVA), por ejemplo,
racterísticas poblacionales, como por ejemplo se utiliza la prueba F para verificar la igualdad
la igualdad entre varianzas o entre coeficientes de medias.
de regresión.
El ensayo y las pruebas de significancia per- Prueba F
miten calcular probabilidades bajo el supuesto Una prueba F consiste en un cociente entre
de que la hipótesis nula sea cierta. Si la pro- dos varianzas:
babilidad calculada es igual o mayor que un
nivel de significancia preestablecido (de 0,05 F = s2entre / s2dentro
por ejemplo) la Ho no se rechaza y se infiere
que no hay diferencias significativas entre las Para realizar la prueba F resulta necesario
medias de los tratamientos. Se concluye que descomponer la varianza total (s2total) en dos
los tratamientos no tienen efecto significativo componentes: s2entre y s2dentro
en la variabilidad del carácter estudiado y las
diferencias observadas no son mayores que El análisis de la varianza es un procedimien-
las que se producirían por azar. En cambio si to aritmético que permite la descomposición
la probabilidad calculada es pequeña (P≤0,05) de la varianza total en varianzas parciales. El
se rechaza la Ho y se infiere, de acuerdo con la cociente entre las varianzas permite obtener
Ha, que hay diferencias significativas entre los un valor de F calculado (Fc) el cual se com-
tratamientos. Si P≤0,01 se dice que las diferen- para con un F de tabla (Ft) para un determina-
cias son altamente significativas. do nivel de significación (por ejemplo α=0.05)
y los grados de libertad de los tratamientos y
Ho verdadera Ho falsa del error. Los programas estadísticos estiman
directamente el P, la probabilidad de obtener
Rechazo Ho erro tipo I correcto un valor de F mayor que Fc si Ho fuera cierta.
No rechazo Ho correcto error tipo II Los supuestos básicos en que se funda-
menta el ANOVA son errores independientes,
normalmente distribuidos, aditividad de efectos
El nivel de significancia, generalmente de- y varianzas homogéneas para todos los trata-
signado por α, representa hasta qué punto, en mientos. Cuando no se cumplen se ve afecta-
términos de probabilidad, estamos dispuestos do el nivel de significación, la sensibilidad de
a aceptar un error de tipo I, es decir, rechazar la prueba de F y la discrepancia real de la Ho.
una Ho que sea verdadera. Esto conlleva a que
aceptemos una Ho como verdadera con una Varianza total
probabilidad 1-. Si se fija α=0.05 estamos dis- Se puede considerar a la variación total
puestos a aceptar el error tipo I aproximada- como la resultante de dos fuentes de variación:
mente una de cada 20 veces. una fuente de variación debida a las diferen-
cias entre grupos o tratamientos, señaladas
4 Análisis univariado por los promedios de éstos y otra debida a la
Los análisis univariados emplean una varia- diferencia dentro de los tratamientos (entre re-
ble dependiente, mientras que los análisis mul- peticiones), que se calcula en base a las dife-
tivariados comparan muestras sobre la base rencias entre las observaciones o repeticiones
de varias variables que están relacionadas. de cada tratamiento.
La significancia estadística de una diferencia
entre dos medias puede verificarse mediante Varianza entre tratamientos
una prueba t o mediante una prueba F. Ambas Para aislar la variación entre los grupos ne-

cesitamos suprimir la variación dentro de los tras que la aplicación del análisis multivariado
tratamientos (entre repeticiones). Podemos preserva el valor de α y aumenta en muchos
obtener este resultado haciendo a todos los casos la potencia del test. El análisis multiva-
individuos de un mismo grupo iguales entre sí riado utiliza las relaciones (correlaciones) entre
e iguales a la media del grupo. Mediante esta las variables o entre los objetos que el método
operación, la variación entre los grupos no se univariado directamente no considera. El aná-
modifica mientras que toda la variación dentro lisis multivariado aprovecha estas relaciones
del grupo queda anulada. para buscar en los datos patrones o estructu-
ras enriqueciendo así la descripción de los mis-
Varianza dentro de tratamientos mos. En el capítulo siguiente se desarrollarán
Para obtener la varianza dentro de los gru- en más detalle algunas metodologías multiva-
pos debemos tener en cuenta solamente la variadas, seleccionándose aquellas que se utili-
riación entre las observaciones de un mismo zan con mucha frecuencia y que no requieren
tratamiento (entre repeticiones). La variación demasiados conocimientos previos.
dentro de un tratamiento se debe a las desvia-
ciones que presentan los valores individuales Análisis exploratorio y confirmatorio
en ese grupo en relación con la media de ese Con los datos provenientes de observacio-
grupo. nes realizadas sobre un hecho en particular es
necesario, en primer lugar, realizar un análisis
5 Análisis multivariado exploratorio. Posteriormente, mediante las
El análisis multivariado brinda los métodos inferencias realizadas a partir de este análisis
estadísticos para el análisis conjunto de va- y con la información que se pueda disponer
rias variables que pueden estar interrelacio- acerca de los mecanismos que originan el pro-
nadas. Esta rama de la estadística comprende ceso biológico, es posible desarrollar un aná-
procedimientos y técnicas para la síntesis, la lisis confirmatorio y así plantear un modelo
presentación y el análisis multidimensional de descriptivo de causalidad el que, a su vez, es
variables, tanto cualitativas como cuantitativas, confirmado mediante una prueba de bondad
obtenidas a partir de un número de individuos, de ajuste.
OTU (Operational Taxonomic Unit), objetos En otras palabras, toda investigación llevada
o tratamientos. a cabo especialmente en áreas nuevas, donde
Debido a que las variables se consideran en existen pocos antecedentes, comienza con una
forma simultánea estas técnicas permiten rea- exploración de los datos con el objeto de re-
lizar interpretaciones más complejas a las que conocer cualquier estructura o patrón no alea-
surgen mediante la utilización de métodos uni- torio que requiera una explicación. En una se-
variados. El análisis multivariado colabora en gunda etapa, es posible que surja la necesidad
la comprensión más adecuada y completa de de formular la pregunta, lo cual es a menudo
las ciencias biológicas, por tal motivo en este más interesante que buscar la respuesta sub-
capítulo se brindará un panorama simplificado siguiente, ya que el objetivo primordial es, en
y algunos comentarios sobre las técnicas más primer lugar, generar hipótesis interesantes que
usuales con la finalidad de poder discernir y promuevan estudios más avanzados. En este
elegir la metodología más apropiada para ana- caso, los métodos que están diseñados para
lizar la información que se disponga. responder a preguntas específicas no serían
Hay algunas razones que justifican el análi- necesarios. En cambio resultarían apropiados
sis conjunto de diferentes variables en lugar de aquellos métodos que puedan detectar un pa-
analizar cada variable separadamente por mé- trón de comportamiento no previsto en los da-
todos univariados. Por ejemplo, cuando se tratos y que, además, abran un amplio campo de
ta de probar hipótesis mediante procedimien- posibles explicaciones del proceso. Estas técni-
tos de inferencia estadística. En este caso, la cas generalmente se caracterizan por el énfasis
aplicación del análisis univariado a cada una puesto en la utilización de representaciones vi-
de las variables aumenta el error Tipo I mien- suales y gráficas y por la carencia de modelos

estocásticos, donde la significación estadística Los métodos lineales son apropiados cuan-
de los resultados pierde importancia. do se quiere interpretar combinaciones ópti-
La aplicación de los análisis confirmatorios mas de variables (por ejemplo, componentes
se vuelve mas apropiada cuando el investiga- principales en el análisis de componentes prin-
dor tiene en mente hipótesis bien definidas. Es cipales, factores en el análisis factorial, funcio-
aquí donde las pruebas de significación esta- nes discriminantes en el análisis discriminante.
dística son necesarias. Sin embargo, no existe Quienes aplican métodos lineales usualmente
una división muy estricta entre técnicas explo- asumen que los valores de las variables incre-
ratorias y confirmatorias. Por ello sería impor- mentan o decrecen regularmente y que entre
tante que el investigador tenga una perspectiva ellas no hay interacciones. Estas relaciones no
flexible y pragmática para analizar sus datos y lineales en el análisis multivariado de la varian-
una experiencia suficiente que le permita ele- za aparecen en los términos de las interaccio-
gir la herramienta analítica adecuada. El error nes y pueden revelar efectos no lineales impor-
más grave que se podría realizar en este sentantes en el análisis de datos experimentales.
tido sería arribar a conclusiones que expliquen Para examinar con mayor eficiencia datos bi-
causas a partir de datos exploratorios y des- narios (presencia/ausencia) y datos en rangos,
criptivos sin haber realizado ningún tipo de dise pueden usar otros modelos, donde las va-
seño experimental para probarlos. Se plantea riables se relacionan mediante funciones no
como causa probable de esta tendencia gene- lineales. Cuando se utilizan combinaciones de
ralizada el mal uso semántico entre las termi- variables hay que considerar que el coeficiente
nologías estadísticas y las biológicas. El uso que afecta a una variable representa la contri-
estadístico de términos como “efectos” o “va- bución de esta variable a la combinación lineal
riable independiente” no implica causalidad. y que este valor depende de las otras variables
incluidas en el análisis. No se considera correc-
Síntesis de métodos: objetivos y limita- to el empleo de estos coeficientes individuales
ciones para la interpretación de dichas contribuciones.
Los análisis multivariados más comúnmente Antes de aplicar cualquier técnica de análisis
adoptados, en orden decreciente, son: análi- resulta imprescindible realizar un examen ini-
sis de componentes principales (ACP), análi- cial de los datos. El examen inicial, básicamen-
sis de funciones discriminantes (AD), análisis te, consiste en la evaluación de datos faltantes
de agrupamientos (conglomerados o clusters), y la representación gráfica de los datos, lo que
regresión múltiple (RM), análisis multivariado permite la identificación de «outliers» (datos
de la varianza (MANOVA), análisis de corres- fuera del rango o fuera de tipo), tendencias
pondencia (AC), análisis de coordenadas prin- y/o agrupamientos preliminares e hipotetizar
cipales (ACOOP), análisis factorial (AF), corre- posibles modelos para su análisis. Además,
lación canónica (CC), modelos logarítmicos li- cuando el análisis multivariado a emplear así
neales (LOGL), escalamiento multidimensional lo requiera, se debe verificar si se cumplen los
(EMD) y la regresión logística múltiple (RL). supuestos básicos de normalidad multivariada,
En la Tabla 1 se mencionan los objetivos ge- homogeneidad en la estructura de variación y
nerales de los métodos de análisis multivariado covariación, independencia de errores y linea-
más utilizados. Los procedimientos numera- lidad.
dos del 1 al 7 utilizan combinaciones linea- Por otro lado, y al igual que en el análisis uni-
les de las variables, estos métodos son más variado, hay que tener cuidado con el uso del
eficientes con variables continuas, mientras nivel de significancia (α) que se adopte, de las
que aquellos métodos numerados del 8 al 11, subsiguientes inferencias estadísticas y de las
comprenden métodos no lineales y son más conclusiones a que se arriba luego del análisis.
apropiados cuando se cuenta con variables Las conclusiones confirmatorias solamente se
cualitativas y el método 12 es adecuado para justifican si los estudios estuvieron basados en
variables cuantitativas, cualitativas o la mezcla un muestro apropiado. Esto significa que la in-
de ambas. ferencia está justificada en relación a la forma

Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de análisis multivariados más comúnmente utilizados.
Análisis Objetivos Limitaciones
1. Regresión Estudiar la relación funcional entre una Una buena predicción no habilita por si sola
múltiple variable dependiente (Y) y varias variables a hacer inferencias sobre causalidad.
(RM) independientes (X1, X2 ... Xn). La predicción debe ser realizada sólo en
Predecir una variable dependiente a partir de situaciones similares a aquellas de donde el
variables independientes. modelo fue derivado (dentro del dominio de
Si los modelos están basados en los valores experimentados).
experimentación, investigar causalidad y El procedimiento sólo considera funciones
efectos. lineales de las variables analizadas.
La RM es apropiada para variables Y
continuas e independientes; en el caso que
se busque realizar inferencias estadísticas, los
errores deben ser normales, las varianzas
homogéneas el muestreo debe ser aleatorio.
2. Análisis Explorar la relación entre distintas variables El MANOVA debe cumplir con los
multivariado de independientes cualitativas (tratamientos) y supuestos de independencia de las
varianza varias variables dependientes cuantitativas. observaciones, homogeneidad de matrices de
(MANOVA) Es un método básicamente inferencial. varianza y covarianza para todos los grupos
de tratamientos y distribución normal
multivariada para todas las variables
dependientes. En algunos casos con un gran
número de vari ables dependientes el poder
estadístico del ANOVA excede al obtenido
con un simple MANOVA.
3. Análisis Describir las situaciones multigrupales, El procedimiento está indicado para
discriminante encontrar las combinaciones lineales óptimas vari ables independientes continuas, siendo
(AD) entre variables que permitan discriminar inef iciente para variables que no están
grupos de objetos. La ecuación de la función corregidos por varianzas o covarianzas. Con
discriminante lineal puede ser usada para AD sólo se encontrarán las combinaciones
clasificar observaciones o para predecir a de variables que sean lineales. Los grupos
que grupo pertenece una nueva observación. deben ser definidos a priori.
4. Análisis de Describir una matriz de datos de objetos y El procedimiento es propuesto
componentes variables en una dimensión más reducida, principalmente para variables continuas, es
principales usualmente mediante una representación ineficiente para datos que no están
(ACP) gráfica (biplot); fijar combinaciones lineales corregidos por varianzas o covarianzas. Con
no correlacionadas de las variables ACP sólo se encontrarán las combinaciones
originales maximizando sus varianzas. de variables que sean lineales.
Sugerir nuevas combinaciones de variables
para estudios posteri ores.
5. Análisis de Describir los datos mediante la reducción de Los resultados dependen del índice de
coordenadas las dimensiones entre objetos y mostrarlas di stancia elegido. El análisis produce un
principales mediante una representación gráfica. Se nuevo sistema coordenado que, a diferencia
(ACOOP) puede hacer con variables cuantitativas, de otros métodos, no puede indicar
cualitativas o con la mezcla de ambas. combin aciones de variables porque sólo
emplea la matriz de distancia entre objetos.
6. Análisis Factorial Reproducir una matriz de correlación entre Los métodos exploratorios de análisis de
(AF) variables originales suponiendo la existencia factores son tan estructurados que las
de uno o más factores no evidentes interpretaciones son subjetivas. El
(latentes). Descubrir est ructuras subyacentes procedimiento es ineficiente para datos que
en grupos de datos mediante la no están corregidos mediante correlaciones,
interpretación de estos factores. por lo que no resulta ideal para relaciones no
lineales o datos binarios.
7. Análisis de Analizar la correlación existente entre dos El análisis es ineficiente para datos que no
correlaciones grupos de variables del mismo grupo de están corregidos mediante correlaciones o
canónicas objetos. Esto se hace en forma simultánea en combinaciones lineales, por lo que no resulta
(CC) lugar de calcular correlaciones de a pares. ideal para relaciones no lineales o datos
binarios. No se pueden hacer rotaciones
como en el caso del AF lo cual dificulta la
interpretación de las combinaciones lineales
encontradas. Brinda una estimación de la
varianza entre combinaciones lineales y no
de la varianza extraída de las variables.
8. Regresión Modelar la relación entre una variable Una buena predicción por sí sola no permite
Biotecnología Xy cuantitativas
logíst ica
276 (RL) Mejoramiento Vegetal II
respuesta binaria (Y) y una o más variables
y/o categóricas.
hacer inferencias de causalidad. Las
predicciones sólo deberían ser llevadas a
La RL también sirve para investigar la cabo en situaciones similares a aquellas
asociación entre una variable X con otra utilizadas por el modelo propuesto (dentro
variable en la presencia de otras variables X. del dominio de los valores experimentados).
Si los modelos de causalidad están basados
en experimentación se podría estudiar causas
canónicas objetos. Esto se hace en forma simultánea en combinaciones lineales, por lo que no resulta
(CC) lugar de calcular correlaciones de a pares. ideal para relaciones no lineales o datos
binarios. No se pueden hacer rotaciones
como en el caso del AF lo cual dificulta la
interpretación de las combinaciones lineales
encontradas. Brinda una estimación de la
varianza entre combinaciones lineales y no
de la varianza extraída de las variables.
8. Regresión Modelar la relación entre una variable Una buena predicción por sí sola no permite
logíst ica respuesta binaria (Y) y una o más variables hacer inferencias de causalidad. Las
(RL) X cuantitativas y/o categóricas. predicciones sólo deberían ser llevadas a
La RL también sirve para investigar la cabo en situaciones similares a aquellas
asociación entre una variable X con otra utilizadas por el modelo propuesto (dentro
variable en la presencia de otras variables X. del dominio de los valores experimentados).
Si los modelos de causalidad están basados
en experimentación se podría estudiar causas
y efectos. La RL brinda una alternativa para
el AD entre dos grupos cuando las variables
son categóricas.
9. Modelos Investigar las relaciones conjuntas entre Las variables deben ser categóricas o bien se
logarítmicos variables categóricas. requiere una transformación a categóricas.
lineales
LOGL
10. Análisis de Explorar gráficamente las relaciones Es una técnica descriptiva aconsejable para
correspondencia contenidas en las tablas de contingencia. El análisis exploratorios. Es muy sensible a la
AC A C permite sugerir nuevas combinaciones presencia de “outliers”.
de variables para estudios posteriores.
11. Escalamiento Describir los datos me diante la redu cción de El análisis solamente utiliza información
multidimensional las dimensiones a través de una que está ordenada en rangos.
EMD representación gráfica, con el objetivo de
encontrar relaciones no lineales entre
objetos.
12. Análisis de Clasificar objetos o variables por su Si bien este método puede ser usado para las
agrupamientos o semejanza o diferencias en base a vari ables cuantitativas y/o cualitativas, los
conglomerados mediciones de similitud o distancia. Los resultados dependen de las medidas de
agrupamientos se representan en un di stancias y de los algoritmos elegidos para
dendrograma. formar los agrupamientos.
en que los datos fueron tomados y en que el ex- aplicación del análisis multivariado, puede brin-
perimento fue realizado, más que en la técnica dar conclusiones más fuertes que las logradas a
de análisis en sí misma. través de un grupo de comparaciones simples.
Las inferencias sólo están justificadas cuan- Si se tiene cuidado durante el proceso de inter-
do los datos son tomados de una muestra gran- pretación de resultados, las combinaciones de
de y bien definida. Cuando esto no ocurre los variables (componentes, factores, etc.) podrían
valores de probabilidad tal vez directamente no ser de significativa importancia para estudiar un
se deberían informar y las conclusiones a las proceso. El uso racional de la estadística mul-
que se arriba sólo deberían limitarse a los da- tivariada, el ajuste de un modelo y el conoci-
tos utilizados y a las condiciones en las que se miento biológico pueden ayudar al investigador
desarrolló el experimento. De la misma manera a diseñar con criterio un experimento crucial y a
resulta poco aconsejable elaborar generaliza- llegar a conclusiones consistentes.
ciones demasiado amplias cuando los estudios Como dijimos anteriormente, el análisis mul-
se realizan sobre casos particulares o específi- tivariado aprovecha las relaciones entre las va-
cos que no son representativos. riables para buscar patrones o estructuras en
A menudo sucede que el investigador prefie- los datos. En este sentido, podría encontrarse
re o necesita interpretar las variables en forma un origen de patrones cuando se realizan medi-
separada cuando maneja un grupo de variaciones sobre grupos de objetos similares. Pue-
bles correlacionadas. En estos casos sería más den existir casos donde no se conoce a priori
apropiado utilizar métodos univariados, con el si los grupos están ya formados, cuantos son,
complemento de pruebas de Bonferroni ajusta- o cuales objetos pertenecen a cada grupo, es
das. Sin embargo, cuando sea posible, la consi- allí donde habría que ver que tipo de análisis es
deración conjunta de las variables, mediante la más apropiado.

En general, en esta etapa se podrían usar donde a partir de la interacción genotipo-am-
métodos como los de ordenamiento de obje- biente y QTL-ambiente se pueden identificar
tos (donde se logra la reducción de dimensio- adaptaciones específicas, estabilidad, ideo-
nes entre las variables o entre objetos a una o tipos y subregiones o mega-ambientes. Los
pocas dimensiones). Otra posibilidad es hacer gráficos biplot acompañan los resultados del
análisis de agrupamientos donde los objetos análisis de componentes principales, y a través
se clasifican en categorías jerárquicas sobre la de estos se grafican de manera simultánea la
base de matrices de similitud entre los mismos. variabilidad de las observaciones y de las va-
En el primer caso, los objetos son represen- riables.
tados en un espacio gráfico en los cuales los El investigador interesado en definir grupos
ejes constituyen gradientes de combinaciones homogéneos de objetos o de variables, ba-
de variables. El método de análisis de com- sados en la similitud o diferencias, y estudiar
ponentes principales, que es un ejemplo de la estructura natural de las observaciones o
análisis por ordenamiento, utiliza para tal fin las de las variables puede aplicar el análisis de
estructuras de los autovectores (también lla- agrupamientos. Este análisis ha sido tradicio-
mados eigens ó raíces latentes) de la matriz de nalmente utilizado para propósitos explorato-
correlación o bien de una matriz de varianza- rios. Dado que no es una técnica de inferen-
covarianza entre las variables originales. cia estadística, para que los grupos exhiban la
El análisis de componentes principales y mayor homogeneidad interna y la mayor dife-
el análisis factorial tienen como objetivo en- renciación entre grupos sólo se requiere que la
contrar una estructura más simple reduciendo muestra sea representativa y que las variables
la dimensionalidad de las variables sin perder no sean multicolineales. En este análisis, se
información. Para simplificar el análisis de los deben incluir aquellas variables que contribu-
datos se reduce el número de variables a un yan a caracterizar los objetos y que se encuen-
pequeño número de índices o factores. Algu- tren relacionadas con los objetivos del análisis.
nas diferencias entre estas dos técnicas son Se recomienda que un análisis de agrupamien-
que las componentes principales están defini- tos sea posteriormente complementado con un
das como una combinación lineal de las varia- análisis de funciones discriminantes sobre
bles originales y no están basadas en un mo- los grupos previamente identificados.
delo estadístico particular y por lo tanto no se El escalamiento multidimensional, involu-
requiere el cumplimiento de supuestos previos. cra una serie de técnicas que ayudan al analis-
En el análisis factorial las variables están ex- ta a identificar dimensiones subyacentes en la
presadas como una combinación de factores, evaluación de objetos. Es especialmente utili-
está basado en un modelo especial y requie- zado en ciencias del comportamiento, ya que
re el cumplimiento de distintos supuestos. Por permite identificar dimensiones no conocidas
otra parte mediante el análisis de componentes que afectan el comportamiento. Se basa en
principales se busca explicar una gran parte de evaluaciones comparativas de objetos cuando
la varianza total, mientras que con el análisis las bases de comparación son desconocidas o
factorial se enfatiza el estudio en las relacio- indefinibles. Se transforma el comportamiento
nes entre las variables explicadas con las code quienes perciben los objetos en distancias,
varianzas o correlaciones. El análisis factorial las que finalmente se representan en un espa-
resulta apropiado cuando el objetivo consiste cio multidimensional. Si bien mediante el aná-
en encontrar un grupo de variables similares, lisis de agrupamientos los objetos se agru-
altamente correlacionadas, y postular que esas pan de acuerdo a sus características, con el
similitudes provienen del hecho de que éstas escalamiento multidimensional no se enfoca el
son variables “latentes o factores” que actúan interés en los objetos en sí sino más bien, en
en forma particular sobre el proceso estudiado. como estos son percibidos. Esta técnica mide
El análisis de componentes principales es la correlación o covarianza de los estímulos
muy utilizado para el análisis de ensayos mul- derivados de las características de los objetos
tiambientales comparativos de rendimiento, a ser evaluados. Así, las representaciones grá-

ficas enfatizan las relaciones entre los estímu- bles dependientes cuantitativas y las variables
los que se estudian. independientes son cualitativas.
El análisis de correspondencia es un pro- Las correlaciones canónicas reducen las
cedimiento de ordenación apropiado para datos dimensiones de dos grupos de variables pro-
de tablas de contingencia (frecuencias). Las ob- venientes de un mismo conjunto de objetos o
servaciones multivariadas se grafican en planos individuos de manera que se puedan estudiar
(biplot) para identificar las asociaciones de malas relaciones conjuntas entre los grupos. Es
yor peso entre las modalidades de varias varia- similar al análisis de funciones discriminantes
bles cualitativas. sólo que en las correlaciones canónicas las va-
El análisis de funciones discriminante se riables (no los objetos o individuos) son dividi-
utiliza cuando los objetos o individuos se re- das en grupos por lo que el interés se centra
únen en dos o más grupos, definidos a priori, sobre las relaciones entre los grupos de varia-
frecuentemente se plantea el problema de cómo bles. Por ejemplo, las correlaciones canónicas
describir las diferencias entre grupos sobre la se pueden utilizar cuando interesa conocer la
base de un conjunto de variables. El propósi- relación existente entre los patrones de marca-
to básico del análisis de funciones discriminan- dores moleculares, que representan diferentes
tes es estimar la relación que existe entre una genotipos, y algunas características ambienta-
variable dependiente cualitativa (machos vs les donde viven los individuos muestreados.
hembras o genotipos resistentes vs genotipos La regresión múltiple se considera el mé-
susceptibles) y entre un grupo de variables in- todo apropiado cuando se presume que los
dependientes cuantitativas con distribución nor- valores de una variable continua dependen de
mal. Lo mismo que en el caso de análisis de los valores que tomen las otras variables. Esta
componentes principales y análisis factorial, el técnica, que explora todo tipo de relaciones
análisis de funciones discriminantes se basa dependientes, tiene como objetivo predecir los
en la posibilidad de encontrar una combinación cambios en una variable dependiente cuanti-
lineal de las variables originales. Como carac- tativa en respuesta a los cambios en las dis-
terística, el análisis de funciones discriminantes tintas variables independientes o predictoras.
permite identificar aquellos grupos ya formados Los modelos de regresión múltiple constitu-
a los cuales pueden ser asignados nuevos obje- yen la base para la estimación de parámetros
tos en estudio (individuos, genotipos). Posibilita en genética cuantitativa. Son ejemplos de su
además la identificación de cual o cuales de las aplicación la descomposición del valor geno-
variables independientes contribuye más a la di- típico en el efecto medio de cada alelo y las
ferenciación entre grupos. interacciones debidas a dominancia y epista-
El análisis multivariado de la varianza es un sis, el cálculo de la estabilidad de los genotipos
procedimiento de inferencia estadística usado mediante la descomposición de la interacción
para evaluar la significancia de la diferencia en- genotipo ambiente, el parecido entre parientes,
tre los grupos, que se hallan delimitados sobre la ubicación y la utilización de QTL mediante
la base de las distintas variables independientes marcadores moleculares.
discretas o tratamientos. Es una extensión del La ecuación de regresión es una combina-
ANOVA, sólo que las diferencias se establecen ción lineal de las variables independientes que
teniendo en cuenta varias variables dependien- mejor predicen la variable dependiente. La se-
tes cuantitativas de distribución normal. Por ello lección de las variables con mayor poder de
este análisis es particularmente útil cuando los predicción se realiza mediante aproximacio-
datos provienen de diseños experimentales. nes secuenciales, llamadas estimaciones “ste-
También puede ser considerado como una ex- pwise” (pasos inteligentes). Mediante los coefi-
tensión del análisis de funciones discriminantes, cientes de regresión estandarizados es posible
aunque en éste la única variable dependiente es determinar la importancia relativa de cada va-
categórica y las variables independientes son riable predictora. Las variables independiente
cuantitativas, mientras que el análisis multiva- y dependiente deben ser cuantitativas si bien,
riado de la varianza involucra un grupo de varia- mediante transformaciones previas, es posible

incluir variables independientes no métricas. la selección artificial y a la sustitución alélica
La aplicación del análisis regresión logísti- ocurrida en diferentes loci. El análisis de los
ca permite predecir una variable dependiente patrones de interacción QTL-ambiente, permite
binaria (0,1) empleando tanto variables cate- visualizar los efectos principales de los QTLs
góricas como cuantitativas. Es importante te- (Q) dentro y a través de los ambientes o mega-
ner en cuenta que para asignar causalidad en ambientes, e identificar aquellos que aumentan
forma justificada es necesario disponer de una la efectividad de la selección y la retrocruza
cantidad adecuada de datos biológicos experi- asistida por marcadores. Frecuentemente, los
mentales. modelos que se aplican para estudiar la inte-
Si se cumplen los supuestos básicos, en es- racción QTL-ambiente son los mismos o simila-
pecial la normalidad de las variables, no hay res a los utilizados para estudios de interacción
mayores diferencias entre la regresión logística genotipo-ambiente, tales como el modelo AMMI
y el análisis de funciones discriminantes, sólo (Additive Main Effects and Multiplicative Interac-
que en el caso que sea posible formar más de tion) o el modelo SREG (Sites Regression). El
dos grupos, este último resulta el más apropia- análisis SREG combina la técnica del ANOVA y
do. Los modelos logarítmicos lineales com- del ACP en un sólo modelo. El ANOVA permite
prenden a otros análisis que permiten mostrar estudiar el efecto principal de ambiente, mien-
las relaciones que existen entre variables ca- tras que la interacción genotipo-ambiente más
tegóricas. el efecto principal de genotipo (G) es tratado de
forma multivariada mediante el ACP.
6 Estudio de la interacción QTL-ambiente De manera análoga con el método GGE bi-
con ANOVA y ACP plot (evaluación simultánea del G + GE), se
La selección asistida por marcadores es describe el QQE biplot (Q + QE) que reduce
una inmediata aplicación de la biotecnología la dimensionalidad de la información obtenida
que puede ser usada por los mejoradores para sobre múltiples QTLs en múltiples ambien-
localizar un gen específico o un segmento de tes. En este método se representan los pa-
cromosoma que regula el fenotipo estudiado y trones de interacción QTL-ambiente a partir
que está presente en un individuo o en la po- de una tabla de dos vías (QTLs y ambientes)
blación de interés. y por lo tanto es posible visualizar los efectos
En algunas poblaciones de mapeo (poblacio- de los QTLs dentro y a través de ambientes
nes segregantes con desequilibrio de ligamien- o mega-ambientes. Esta tabla se descompone
to entre los marcadores genéticos y los QTLs) en componentes principales y los dos prime-
tales como las RIL (líneas endocriadas recom- ros componentes principales se grafican para
binantes) y en especial las DH (doblehaploides) QTLs y ambientes en la forma de un biplot. El
es posible multiplicar genotipos prácticamente resultado del QQE biplot contiene información
sin variabilidad genética y probarlos en ensa- sobre los efectos principales de los QTLs o
yos multiambientales. Los ensayos multiam- efecto aditivo, resumido como el efecto medio
bientales en general brindan la posibilidad de a través de ambientes e información sobre la
explorar las interacciones genotipo-ambiente interacción QTL-ambiente relacionada con la
(GE) y QTL-ambiente (QE). Si bien el efecto de estabilidad de los QTLs. El primer análisis de
algunos QTLs explica una alta proporción de la los QQE biplot consiste en determinar si exis-
varianza fenotípica estimada en los diferentes ten diferentes mega-ambientes. Si es así, se
ambientes, el efecto de otros QTLs es detecta- podrán generar múltiples QQE biplots y los pa-
do de manera poco consistente debido a la aso- trones de interacción se investigarán en cada
ciación con ambientes específicos, generando mega-ambiente.
una fuerte interacción QTL-ambiente. Para interpretar la metodología del QQE bi-
Se ha encontrado que en el maíz tropical las plot se utilizó una tabla QTL-ambiente (Yan y
temperaturas de los diferentes sitios afectan la Tinker, 2005), con ocho QTL (Q1 a Q8) y ocho
expresión de distintos QTLs, adaptación espe- ambientes (E1 a E8) (Tabla 2). El biplot fue rea-
cífica debida, al menos en parte, al efecto de lizado con el programa Infogen (Balzarini y Di

Rienzo, 2004) en base al efecto aditivo de los Q4 pueden ser considerados QTLs con efectos
QTLs. mayores. Los restantes no son necesariamen-
te menores porque sus efectos podrían apare-
Tabla 2. Efectos aditivos de ocho QTLs (Q1 a Q8) cer en la CP3 o CP4.
en ocho ambientes (E1 a E8). Similitud entre QTLs: La distancia y el án-
gulo entre dos QTLs es un indicador de la si-
E1 E2 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 militud en sus respuestas a los ambientes. Así
Q1 1 2 2 2 2 1 1 0 1 por ejemplo, Q6 es muy diferente de Q2, Q4 y
Q2 -2 -2 -2 -3 -4 2 3 4 6 Q7. Los QTLs con patrones similares pueden
Q3 2 -2 -2 -1 -2 -3 -2 -1 -2 ser tratados de la misma forma en la selección
Q4 2 4 4 3 1 1 4 2 1 asistida por marcadores.
-4 -3 Similitud entre ambientes y clasificación
Q5 3 -2 -2 -2 -3 -3 -3
de mega-ambientes: La distancia y el ángu-
Q6 0 0 0 0 0 -3 -4 -5 -6
lo entre dos ambientes miden la similitud en la
Q7 -6 -5 -5 -4 -3 0 0 0 0 expresión de los QTLs. En la Figura 1 se ob-
Q8 3 -3 -3 4 4 3 -3 4 -4 servan dos grupos de ambientes, E1 a E4 vs
E5 a E8. Los ambientes dentro de cada grupo
son similares (ángulos pequeños) pero los dos
El efecto principal de Q, de E, y de la QE ex- grupos son independientes (ángulo recto). Por
plicaron 40, 3 y 57% de la variación total, res- lo tanto, se identifican dos mega-ambientes.
pectivamente. El biplot de las CP1 y CP2 expli- Esto implica, que la selección de genotipos en
caron el 79% de la variación total (Figura 1). El un mega-ambiente es independiente del otro, y
QQE biplot permite visualizar distintos temas que las estrategias de selección requeridas en
relacionados con la evaluación y utilización de cada mega-ambiente deben ser distintas.
los QTL. Efecto principal y estabilidad de los QTL a
QTLs mayores vs menores: La distan- través de ambientes: El punto que representa
cia de los QTLs al origen permite visualizar la el ambiente promedio (AP) se obtiene con la
magnitud de sus efectos. Así, Q2, Q6, Q7, Q5 y media de los coeficientes CP1 y CP2 a través
de los ambientes. La línea que pasa a través
del ambiente promedio y el origen del biplot es
llamada eje x del ambiente promedio y las pro-
yecciones sobre este eje cuantifican el efecto
de los QTLs. Así, los efectos principales de los
QTLs a través de ambientes son: Q4 > Q1 > …
> Q7 > Q5. La línea perpendicular al AP que
pasa por el origen se llama eje y del ambien-
te promedio. Las mayores proyecciones de los
QTLs sobre el eje y indican poca estabilidad
de los mismos. Así Q2, Q7 y Q6 son poco es-
tables y Q1, Q3, Q4 y Q5 son relativamente
estables a través de los ambientes. Para una
mejor interpretación de Q8 que toma valores
intermedios, se podría realizar un gráfico com-
plementario con las CP3 vs CP4.
Uso de los QTLs en la selección asistida
por marcadores en diferentes mega-am-
bientes: El biplot QQE también indica la mejor
combinación de los alelos de los QTLs para la
Figura 1. QQE biplot obtenido con los efectos aditi- máxima expresión de los caracteres en cada
vos de la Tabla 2. mega-ambiente. Por ejemplo, la Figura 1 su-

giere que para la máxima expresión del carác- Lecturas recomendadas
ter en el mega-ambiente que contiene de E1
a E4 deben ser seleccionados los alelos Q1 y Balzarini, M.; Di Rienzo, J. 2004. Info-Gen: Software
Q4 del parental 1, ya que presentan los valo- para análisis estadístico de datos genéticos. Uni-
res más altos y positivos. Los mega-ambientes versidad Nacional de Córdoba. Córdoba. Argen-
pueden ser examinados en biplots separados tina.
Everitt, B.S.; Dunn, G. 1991. Applied Multivariate
para una mejor interpretación.
Data Analysis. E. Arnold, London.
Utilidades del biplot QQE: Los caracte- Hair, J.F.; Anderson, R.E.; Tatham, R.L.; Black, W.C.
res cuantitativos y aquellos regidos por pocos 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Pren-
genes están sujetos a interacciones QE. Las tice Hall - Upper Saddle River, New Jersey.
plantas portadoras de genes para resistencia a James, F.C.; McCulloch, C.E. 1990. Multivariate
enfermedades o para enanismo son ejemplos analysis in ecology and systematic: Panacea or
clásicos de genotipos adaptados para respon- Pandora's box?. Annual review of ecology and
der a ambientes específicos, por ejemplo la systematics, 21: 129-166.
presencia de patógenos o altas tasas de ferti- Manly, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A
lizante. Por lo tanto, es necesario entender los Primer. Chapman and Hall, London.
Rencher, A.C. 1995. Methods of Multivariate Analy-
patrones de los QTL-ambiente antes de usar
sis. J. Wiley and Sons, Inc. New York.
los QTL en la selección asistida por marcado- Yan, W.; Tinker, N.A. 2005. A biplot approach for
res. investigating QTL-by-environment patterns. Mo-
lecular Breeding 15: 31-43.

II. Capítulo 9 una corrida electroforética de isoenzimas o
marcadores moleculares.
b) Datos doble estado excluyentes. El carác-
Métodos multivariados para
ter tiene sólo dos estados posibles y la asigna-
estimar variabilidad genética ción del "0" ó el "1" es indistinta.
Ejemplos: Carácter: Sexo. Codificación:
Nélida Winzer, Miguel Di Renzo, Sofía Olmos, Hembra = 0, Macho = 1, ó
Mercedes Ibañez. Hembra = 1, Macho = 0
Tipo de Fruto: dehiscente ó indehiscente.
Clasificación de hojas: paripinadas ó impa-
1 Introducción
ripinadas.
La información procesada a partir de las téc-
nicas que se desarrollan en este libro puede
La distinción entre uno u otro tipo de dato bi-
ser de diversos tipos y puede tratarse por otro
nario es importante al momento de seleccionar
lado, del análisis de una sola variable o de va-
la medida de asociación.
rias variables evaluadas en cada individuo o
muestra.
Datos Multiestado Cualitativos: El carácter
Los análisis estadísticos a utilizar dependen
puede tomar un conjunto finito de estados.
de estos dos aspectos, tipo de datos y núme-
Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado, lobu-
ro de variables, y, además, de qué objetivo se
lado, entero.
haya planteado el investigador.
Color de la flor: blanca, roja o rosada.
Si se trata de una sola variable se podrán
Disposición de folíolos en el raquis: alternos,
aplicar las técnicas aprendidas en un curso
subopuestos, opuestos.
básico de estadística (comparación de dos
Identificación de los nucleótidos presentes
medias, Análisis de la Varianza, Análisis de
en una determinada secuencia de ADN: A, C,
Regresión, pruebas chi-cuadrado, etc.), o bien
T, G.
alguna de sus generalizaciones.
Identificación de los aminoácidos esenciales
En este capítulo se desarrollarán en más de-
presentes en una proteína: Gly, Ala, Ser, Thr,
talle algunas metodologías multivariadas. Se
Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp, Asn,
han seleccionado aquellas que se utilizan con
Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg.
mucha frecuencia y que no requieren demasia-
Clases de embriones somáticos: globular,
dos conocimientos previos.
acorazonado, torpedo, cotiledonar.
Los datos multivariados se ordenan en una
matriz. A efectos de unificar el lenguaje se con-
Datos Multiestado Cuantitativos Discretos:
siderará que cada fila de la matriz representará
Están asociados a valores de conteo.
un individuo, una muestra, una especie; en de-
Ejemplos: Número de hileras por espiga, nú-
finitiva, una OTU (Operational Taxonomic Unit).
mero de macollos por planta, número de inflo-
Las columnas representarán los caracteres o
rescencias.
variables que se observan en cada OTU.
Datos Multiestado Cuantitativos Continuos:
2 Tipo de datos
Representan propiedades que se pueden ex-
Datos Doble Estado: Son los también llama-
presar en una escala continua.
dos datos binarios o dicotómicos. Estos datos
Ejemplos: Biomasa de plantas, peso de se-
se presentan cuando el carácter puede tomar
millas, longitud de partes verdes, concentra-
sólo dos estados posibles. Habitualmente se
ción de proteína del grano, frecuencia relativa
codifican como "0" ó "1".
de un alelo.
Hay que reconocer dos tipos de situaciones
donde pueden aparecer datos binarios.
3 Medidas de asociación y distancia
a) Datos de presencia o ausencia. Sólo se
Un objetivo frecuente suele ser la descrip-
registra la presencia ó ausencia del carácter.
ción del grado de parecido que hay entre las
Ejemplo: Presencia o no de una banda en

OTUs. Para ello será necesario medir ese gra- Es la proporción de caracteres presentes
do de similitud. que comparten, respecto al total de caracteres
Se describirán a continuación algunas de las presentes en las dos OTUs.
medidas que aparecen con mayor frecuencia
en la literatura. Dice
Hay dos tipos de medidas: los índices de aso- 2a a
D12 = =
ciación y las distancias. Los primeros miden el 2a + b + c (a + b) + (a + c)
grado de similitud: cuanto más parecidas sean 2
dos muestras mayor será su asociación. Las
segundas miden el grado de disimilitud: cuanto Es la proporción de caracteres copresentes
más parecidas son dos muestras menor será respecto al promedio de los caracteres presen-
su distancia. tes en cada OTU.
Para datos binarios es usual trabajar con Se puede probar que Jaccard siempre dará
medidas de asociación. Entonces, para carac- un valor de asociación menor que Dice, salvo
terizar a dos OTUs existen cuatro valores a cuando toman el valor 0 ó 1, caso en que siem-
considerar: pre coinciden. Más aun, ambos están relacio-
a = Nº de caracteres donde ambas OTUs co- nados mediante la ecuación J = D/(2-D) ó D =
inciden en el "1"; 2J/(1+J). Esta relación tiene como consecuen-
b = Nº de caracteres donde la primera OTU cia, entre otras, que en un Análisis de Agrupa-
tiene un "1" y la otra un "0"; mientos, cuando se usa ligamiento Simple o
c = Nº de caracteres donde la primera OTU Completo, den los mismos grupos sólo que con
tiene un "0" y la otra un "1"; distintos valores de asociación.
d = Nº de caracteres donde ambas OTUs co- Ejemplo: Como resultado de la aplicación de
inciden en el "0" la técnica RAPD sobre seis muestras se regis-
. tró la información de la Tabla 1 sobre la pre-
La suma de estos cuatro valores dará el total sencia o ausencia de ocho bandas generadas
de caracteres medidos. por un cebador.
Este es un proceso típico en el análisis de la
OTU 1 información a partir de bandas. Primero se co-
1 0 difica la información, se construye la matriz de
OTU 2
1 a b datos y, en este caso, se calcularon las matri-
0 c d ces de asociación de Jaccard y Dice a efectos
de observar las características mencionadas
Si los datos son de presencia/ausencia, un más arriba.
criterio válido es considerar que dos OTUs son Entre las muestras A y C no se observaron
más parecidas cuantos más "unos" compartan. bandas en común, por lo tanto a = 0 y tanto
La coincidencia de "ceros" no aporta a la simi- Jaccard como Dice dan 0.
litud porque puede estar generado por falta de Por otro lado, A y E comparten la presencia
información (la no amplificación de un fragmen- de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto
to RAPD puede ser debida a la carencia del Jaccard como Dice dan 1.
sitio de hibridación del cebador por ausencia Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tan-
completa de la secuencia complementaria o to, de las 6 bandas presentes en una u otra
como consecuencia de una mutación de punto muestra comparten 3. Así Jaccard vale 0.5. El
en dicho sitio o bien, a una falla en la amplifica- total de bandas de B es 4 y el total de bandas
ción por ejemplo). detectadas en E es 5. El promedio de estos to-
tales da 4.5 por lo que la asociación de Dice da
Dos de los índices que comparten este crite- (3/4.5) = 2/3 = 0.667.
rio son Jaccard y Dice. Se observa también que, salvo los 0 y los 1,
JACCARD a todos los valores de Jaccard son menores que
J12 = los de Dice.
a+b+c

Tabla 1: Matriz de datos construida en base a 8 cebadores RAPDs.
A B C D E F A B C D E F
1 1 1 0 0 1 1 0
2 2 1 1 0 1 1 1
3 3 0 1 1 1 0 1
4 4 1 1 0 0 1 1
5 5 1 1 0 0 1 1
6 6 0 0 1 0 0 1
7 7 1 0 0 0 1 1
8 8 0 0 1 0 0 1
Bandas
1 2 3 4 5 6 7 8
A 1 1 0 1 1 0 1 0
B 0 1 1 1 1 0 0 0
C 0 0 1 0 0 1 0 1
D 1 1 1 0 0 0 0 0
E 1 1 0 1 1 0 1 0
F 0 1 1 1 1 1 1 1
A B C D E F A B C D E F
A 1 0.5 0 0.333 1 0.5 A 1 0.667 0 0.5 1 0.667
B 0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571 B 0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727
C 0 0.167 1 0.2 0 0.429 C 0 0.286 1 0.333 0 0.6
D 0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25 D 0.5 0.571 0.333 1 0.5 0.4
E 1 0.5 0 0.333 1 0.5 E 1 0.667 0 0.5 1 0.667
F 0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1 F 0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1
Además, ambas matrices son simétricas: la muestra comparten 3. Así Jaccard vale 0.5. El
asociación entre A y E es la misma que la que total de bandas de B es 4 y el total de bandas
se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la detectadas en E es 5. El promedio de estos to-
mitad de la matriz de asociación. Esta obser- tales da 4.5 por lo que la asociación de Dice da
vación será válida para todas las medidas que (3/4.5) = 2/3 = 0.667.
se presenten en este capítulo. Se observa también que, salvo los 0 y los 1,
Si los datos son binarios pero de estados todos los valores de Jaccard son menores que
equivalentes, dos muestras deberán conside- los de Dice.
rarse más asociadas tanto cuando comparten Además, ambas matrices son simétricas: la
"unos" como "ceros", ya que la codificación que asociación entre A y E es la misma que la que
se les asigna es indistinta. se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la
Este es un proceso típico en el análisis de la mitad de la matriz de asociación.
información a partir de bandas. Primero se co- Esta observación será válida para todas las
difica la información, se construye la matriz de medidas que se presenten en este capítulo.
datos y, en este caso, se calcularon las matri- Si los datos son binarios pero de estados
ces de asociación de Jaccard y Dice a efectos equivalentes, dos muestras deberán conside-
de observar las características mencionadas rarse más asociadas tanto cuando comparten
más arriba. "unos" como "ceros", ya que la codificación que
Entre las muestras A y C no se observaron se les asigna es indistinta.
bandas en común, por lo tanto a = 0 y tanto
Jaccard como Dice dan 0. Un índice recomendable por su simplicidad
Por otro lado, A y E comparten la presencia es el de Simple Matching o de Concordancia
de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Simple:
Jaccard como Dice dan 1.
Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tan- SIMPLE MATCHING a+d
SM12 =
to, de las 6 bandas presentes en una u otra a+b+c+d

Simplemente es la proporción de caracteres
que comparten las dos muestras. Los puntos P* = ( p1 , p 2 ,..., p m )
Si se piensa que la matriz de datos anterior
corresponde a ocho caracteres binarios de es- y Q* = ( q1 , q 2 ,..., q m ) están sobre una
tados equivalentes la matriz de asociación con
el índice de Simple Matching dará: esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, pre-
A B C D E F cisamente, la longitud de la cuerda que une
A 1 0.625 0 0.5 1 0.5 esos dos puntos.
B 1 0.375 0.625 0.625 0.625
C 1 0.5 0 0.5 Para el caso m = 2, se ve en el gráfico la
D 1 0.5 0.250 distancia cuerda entre los puntos P = (0.3, 0.7)
E 1 0.5 y Q = (0.8, 0.2). Los puntos originales son lle-
F 1
vados a la esfera (círculo) de radio 1 y luego
se calcula la distancia habitual entre esos dos
puntos: d = 0.5324.
Se observa que A y E comparten todos los ca-
racteres, por lo tanto tienen la máxima asocia- 1
ción. En cambio C y E no coinciden en ninguno, 0.8

P*
su asociación es 0. La asociación entre C y D y P
entre D y E es 0.5, lo que significa que coinciden 0.6
en la mitad de los caracteres evaluados. Q*

0.4
Además de las que se han definido has-
ta ahora existen muchas otras medidas para 0.2
Q
datos binarios. También se pueden definir me-

didas de distancia o asociación para distintos
0 1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
tipos de datos multiestado. Para no extender Si se consideran simultáneamente varios

en demasía esta sección se presentarán algu- loci la distancia Cuerda se calcula así:
nas distancias definidas específicamente para
frecuencias alélicas.
 r mi

4 Distancias Genéticas
d12 = 2 1 − ∑ ∑ pijq ij ) 
Se pueden clasificar en dos grupos: las ba-
 i =1 j=1 
sadas en un modelo geométrico (Cavalli-Sfor-
za y Rogers) y las basadas en modelos bioló- Distancia de ROGERS (1972):
gicos (Nei).
Si se tienen dos poblaciones de las que se
mi
cuenta con la información sobre los loci para m 1 r
alelos y las frecuencias correspondientes, és-
R12 = ∑
r i =1
∑ (p
j=1
ij − q ij ) 2
tas pueden expresarse de la siguiente manera:
Pob. 1: p1, p2, ... , pm En el gráfico, ésta es la distancia habitual en-

Pob. 2: q1, q2, ... , qm tre los puntos P y Q.
Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y Distancia de Estándar de NEI (1972):

EDWARDS (1967): Esta distancia tiene una base biológica. Ex-
presa la probabilidad de que dos alelos toma-
dos al azar de dos poblaciones diferentes sean
 m
 idénticos, con respecto a la probabilidad de que
d12 = 2 1 − ∑ pi q i ) 
 i =1  lo sean dos alelos tomados al azar de la misma
población. Sean, como antes, las poblaciones
1 y 2 y las frecuencias alélicas de un locus:

∑p q se puede interpretar como la proba-
i i
En las poblaciones naturales una de las for-
mas de realizar el agrupamiento jerárquico de
bilidad que dos alelos sean iguales si uno ha
sido elegido al azar de la población 1 y el otro las mismas en grupos (variedades, líneas, ge-
de la población 2. notipos), es mediante el empleo de medidas
de divergencia genética. Es en este campo
∑ p 2
es la probabilidad que dos alelos elegi-
i donde las llamadas distancias genéticas tienen
dos al azar de la población 1 sean iguales; su mayor aplicación. Las distancias genéticas
basadas en modelos biológicos son las más
∑q 2
es la probabilidad que dos alelos ele-
i empleadas en estudio de genética poblacional
gidos al azar de la población dos sean iguales. debido a que resumen los conocimientos obte-
Los dos últimos términos equivalen a un es- nidos de las fuerzas evolutivas que conllevan a
tado de homocigosis en la población 1 y 2, res- los cambios genéticos es decir, mediante mu-
pectivamente. taciones y deriva genética.
La medida de distancia genética estándar de
Nei define primero la Identidad normalizada Nei es más confiable cuando se utilizan datos
(varía entre 0 y 1): provenientes de muchos alelos. La distancia
de Nei está formulada para un modelo donde
m
se asume que las mutaciones ocurren en for-
ma infinita, con la misma probabilidad para to-
∑p q i i
dos los alelos a una tasa de mutación neutral,
I= i =1
y que la variabilidad genética inicial en la po-
m m
∑p ∑q 2
i
2
i
blación está en equilibrio entre la variabilidad
i =1 i =1 producida por mutaciones y por deriva genéti-
ca, siendo el tamaño efectivo de la población,
y luego la Distancia Estándar: D12 = - ln I. en cada una, constante. Basándose en estos
supuestos, y en que todos los loci sean equiva-
Si se usan varios loci se trabaja con el pro- lentes entre sí, se espera que la Distancia de
medio aritmético de las probabilidades defini- Nei se incremente linealmente con el tiempo. Si
das anteriormente resultando: las frecuencias alélicas en cada población han
sido estimadas con pocas muestras se pueden
r mi utilizar, en cambio, algunas modificaciones a la
∑∑ p q
i =1 j=1
ij ij Distancia Estándar de Nei como las propuestas
D12 = − ln por Nei (1978) y Hillis (1984). La distancia de
r mi r mi
Cavalli-Sforza y Edwards, por el contrario, asu-
∑∑ p ∑∑ q
i =1 j=1
2
ij
i =1 j=1
2
ij me que las diferencias entre las poblaciones
no provienen de mutaciones sino que son sólo
consecuencia de la deriva genética. Además,
Ejemplo: Para la información de la Tabla 2, no asume que el tamaño poblacional ha per-
en el caso de las frecuencias de cinco alelos manecido constante en todas las poblaciones.
provenientes de dos loci, se tiene: I = 0.857986 Considera que el tamaño de la población cam-
y, por lo tanto, D = 0.15317. bia en forma lineal pero no con el tiempo sino
con 1/N, donde N es el tamaño efectivo de la
población. Así, en estos casos, los conocimien-
tos básicos de genética poblacional brindarán
las herramientas necesarias en el momento de
la elección del método más apropiado para el
análisis de nuestros datos.
5 Análisis de coordenadas principales

Tabla 2: Datos de frecuencias alélicas de dos loci Si se tiene una matriz de distancias entre
para el cálculo de la Distancia Estándar de Nei. N muestras ¿será posible representar cada

muestra mediante un punto de manera tal que Si se calcula la distancia euclídea entre los
las distancias resultantes reproduzcan las de puntos en uno cualquiera de estos gráficos se
la matriz?. ve que se han reproducido exactamente los va-
Veamos dos ejemplos: lores de la matriz D. Por ejemplo:
(i) Si se tiene la siguiente matriz D de distan-
cias entre las muestras A, B y C: d E (A, B) = (1.444 − 0.445)2 + (0.881 − 0.94)2 = 1
 0 1 .447 
  en el gráfico I.
D= 1 0 .707 
 .447 .707 0 
 (ii) Si se tuviera la matriz de distancias entre
las muestras P1, P2 y P3:
se podrían hacer algunos de los siguientes
gráficos: Es fácil ver que es imposible repre-
 0 0.9 0.5 
 
D# =  0.9 0 0.3 

sentar en un plano puntos separa-
 0.5 0.3 0 

1.4 dos por estas distancias porque si
1.2 C
I P1 y P2 se ubican como extremos de un segmento
1.0
de longitud 0.9, no hay manera de ubicar un pun-
B
A to P3 que esté a 0.5 de P1 y a 0.3 de P2.
0.8
0.6
P1------------------------------------P2
0.4
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
P1---------------P3? P3?---------P2
Se van a considerar, por ahora, distancias

como las del ejemplo (i). Esto es, distancias
0.5
II
0.3
para las que se puedan encontrar puntos que
C
0.1 reproduzcan esas distancias.
-0.1 B
A
Otro aspecto a considerar es el número de
-0.3
coordenadas necesarias para representar
esos puntos. Es intuitivo que si sólo hay dos
-0.5
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 muestras a una distancia dada se pueden gra-
ficar en una recta (dimensión =1); si hay tres
muestras ya se vio que se pueden graficar en
0.5 un plano (dimensión = 2); si se tuvieran cuatro
III muestras serían necesarias tres coordenadas
0.3
(dimensión = 3); ... y si se tienen N muestras
0.1
B
A
se necesitarán, en general, N-1 coordenadas.
-0.1 Con lo cual si se quieren graficar 40 muestras
C
serán necesarias 39 coordenadas!!!
-0.3
Es evidente que esto no es cómodo si el ob-
-0.5 jetivo es obtener una representación gráfica de
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
los puntos o muestras. Lo ideal sería obtener
dos coordenadas pues se podrían graficar en
Coordenadas de A, B y C: un plano, o bien tres para graficar en tres di-
mensiones.
I: (1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179) El problema, entonces, es encontrar las dos
II: (0.444, -0.119); (-0.555, -0.06); (0.111, mejores coordenadas (ó las tres mejores) para
0.179) obtener esta representación. Ese es el objeti-
III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,- vo del Análisis de Coordenadas Principales
0.179). (ACOOP): encontrar las k mejores coorde-

nadas para las muestras de manera tal que si
se calculan las distancias euclídeas entre ellas donde Si• es el promedio de la fila i de S, S• j
reproduzcan lo mejor posible una matriz de dis-
tancias dada. Habitualmente k = 2 ó 3, a éstas es el promedio de la columna j y S•• es el
se las llama Coordenadas Principales. Natural- promedio de todos los elementos de S.
mente se perderá la información de las restan-
tes coordenadas. En el Paso 2 se encuentran:
Como se mostró en el ejemplo (i) hay muchas a) una matriz N×N donde cada columna es
representaciones posibles. Ahí se han dado un vector de longitud uno. Son los autovectores.
tres pero se podrían haber dado muchas más. b) N números ordenados en forma decre-
Una manera de reducir las opciones es obtener ciente: los autovalores.
coordenadas de manera tal que los puntos es- Estos elementos son característicos de cada
tén centrados en el origen, como en II ó III. matriz S0. Por eso también se los conoce como
Se explicará el método de obtención de las vectores y valores característicos. Cada auto-
Coordenadas Principales partiendo de una ma- vector está asociado a un autovalor.
triz de Asociación S. En este caso las distancias Si la matriz de distancias es “representable”
que se van a reproducir son las definidas por: (como la del ejemplo (i) los autovalores serán
positivos o ceros (el más chico es siempre cero
d2(i, j) = Sii+ Sjj- 2 Sij (1) para estas matrices “representables”).
donde Sij es la asociación entre la muestra i En el Paso 3, si se desean k coordenadas,

y la j. Si la asociación de una muestra consigo se toman los k primeros autovectores y se mul-
misma es 1, es decir Sii = 1, como ocurre con la tiplican por la raíz del autovalor respectivo. El
mayoría de los índices, la ecuación se reduce primer autovector da la primera coordenada de
a: todas las muestras, el segundo la segunda co-
ordenada y así siguiendo hasta la k-ésima. Si
d2(i, j) = 2(1- Sij ). (2) sólo se desean dos coordenadas para graficar
los puntos en un plano se toman los dos prime-
Se detallarán los pasos que se deberían rea- ros autovectores (k=2).
lizar para hacer este análisis al simple efecto
de poder manejar con idoneidad los programas En la Tabla 3 se presenta un ejemplo sen-
estadísticos de que se dispongan. Los pasos 1) cillo.
a 3) son responsabilidad de esos programas. El gráfico correspondiente es el Gráfico II
El usuario deberá, fundamentalmente, indicar- que se mostró más arriba donde A es la mues-
le qué asociación o distancia desea calcular y tra 1, B la 2 y C la muestra 3.
cuántas coordenadas quiere. Las distancias (2) calculadas a partir de la
Paso 1) Centrar doblemente la matriz S → S0. matriz de asociación S dan la matriz de Distan-
Paso 2) Calcular los autovalores y autovec- cias D. Por esa razón ambas matrices tienen la
tores de S0. misma representación.
Paso 3) Calcular las coordenadas de los
puntos representativos de las muestras.
2
d12 = 2(1 − S12 ) = 2(1 − 0.5) = 1 ⇒ d12 = 1
Paso 4) Graficarlos.
d132 = 2(1 − S13 ) = 2(1 − 0.9) = 0.2 ⇒ d13 = 0.447
El Paso 1 tiene como fin hacer que los pun-
tos resultantes estén centrados. Cada elemen- d 223 = 2(1 − S23 ) = 2(1 − 0.75) = 0.5 ⇒ d 23 = 0.707
to de la matriz de asociación S se centra por
filas y por columnas:
OBSERVACIÓN 1: Como en el ejemplo sólo
hay tres muestras los autovectores tienen tres
(3) componentes. Si se trabajara con una matriz
Sij0 = Sij − Si• − S• j + S•• de asociación entre 40 muestras, los autovec-

tores tendrían 40 componentes, una por cada En este algoritmo se ve que lo que se está
muestra. comparando son las asociaciones originales,
sij0 , con las reconstruidas, sij0* , una a una. Para
OBSERVACIÓN 2: Para la matriz S se han el cálculo de α2 se usa la primera fórmula por
reconstruido totalmente las distancias porque lo que el lector no debe traumatizarse con la
sólo son tres muestras. Si hubiera más (N=40, segunda.
por ejemplo) sólo se reconstruirían totalmente
las distancias si se usan 39 coordenadas. Si  0.2111 −0.239 0.028 
sólo se usan las dos primeras se reconstruye,  1

S =  0.5

0.5 0.9 
1

0.75 
1  Doble ⇒ S0 =  −0.239 0.3111 −0.072 
en general, sólo un porcentaje de las distan-  
 0.9 0.75
centrado  0.028 −0.072 0.0444 

cias. Hay dos tipos de porcentajes que se pue-  
den calcular:
Porcentaje de Dispersión: Autovalores de S0:

λ1 + λ 2 λ1 = 0.5167 λ2 = 0.05 λ3 = 0
α1 = ×100%
λ1 + L + λ N
↓ ↓ ↓

si sólo se usan dos coordenadas. v1 v v3
Este porcentaje se interpreta teniendo en
cuenta que:
Autovectores de S0 : Columnas de
2N (λ1 + ... + λN ) = ∑∑ d 2
ij
 0.6173 − 0.5344 0.57735 

, sumando sobre todos los pares de mues-  
tras. En cambio, la suma del cuadrado de las V =  −0.7716 − 0.2674 0.57735 
distancias reconstruidas con las dos coordena-  0.1543 0.8019 0.57735 

das es igual a 2N (λ1 + λ2). Por lo tanto, este
porcentaje mide cuánto se reconstruye del
cuadrado de todas las distancias. Primeras 2 Coordenadas:
Si se usan más de dos coordenadas se van
sumando los autovalores correspondientes en λ1 v1 λ 2 v2
el numerador.
En nuestro ejemplo: α1 = 100% Muestra 1⇒ 0.4437 -0.1195
Muestra 2⇒ -0.5546 -0.0598
Porcentaje de Distorsión: Muestra 3⇒ 0.1109 0.1793
λ12 + λ 22 Tabla 3. Cálculo de autovalores y autovectores para

α2 = × 100% el gráfico de coordenadas principales.
λ12 + L + λ 2N
Este valor mide cuánto se acercan los va-

lores de la matriz de asociación reconstruida OBSERVACIÓN 3: Si se hubieran obtenido
respecto de la matriz de asociación original S0. autovalores negativos la primera medida no
Más exactamente: es recomendable. Hasta podría darse el caso
que α1 fuera mayor al 100%. La segunda, en
cambio, sigue teniendo sentido. Por otro lado,
 2
 no se podrían calcular coordenadas asociadas
 ×100% = 1 − ∑ (sij − sij )  ×100%
S0 − S0*  0 0* 2

α 2 = 1 −
 S0
2
  ∑ ij 
(s 0
) 2  a ese autovalor porque no se puede calcular
  
λi

La aparición de autovalores negativos no es Por otro lado, también es lícito cambiar, por
necesariamente un problema grave para la re- alguna razón, el signo de una coordenada. Por
presentación siempre que los autovalores ne- ejemplo, esto puede ser útil cuando se quieren
gativos sean pocos y pequeños. Por ejemplo, comparar Análisis de Coordenadas Principales
si se trabaja con 50 muestras, en el Paso 2 se realizados con distintas asociaciones o distan-
obtendrán 50 autovalores, de los cuales uno, cias sobre el mismo conjuntos de muestras.
seguramente, es cero. Para la representación Ejemplo:
en el plano se usan sólo los dos primeros. Si
los últimos 10 son negativos no se verán afec- Presentamos la caracterización de 8 cultiva-
tados los cálculos de las coordenadas. res comerciales y 35 cultivares en experimen-
Hay asociaciones y distancias que nunca tación mediante análisis izoenzimático de se-
dan autovalores negativos, entre ellos se en- millas de Amaranthus. Estas accesiones perte-
cuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Sim- necen a siete especies: A. caudatus, A. cruen-
ple Matching y la distancia euclídea. tus, A. hypochondriacus, A. mantegazzianus,
Si en lugar de tener una matriz de asocia- A. dubius, A. tricolor, y A. hybridus (Di Renzo
ciones se tiene una matriz de distancias el pro- et al., 2001). Del total de 43 cultivares, 31 fue-
cedimiento consiste en calcular una matriz S ron polimórficos con 7 sistemas isoenzimáticos
cuyos elementos son: (Tabla 4). Se aplicó análisis de coordenadas
principales a los datos de presencia/ausencia
d ij2 , (4) de las 23 bandas polimórficas. En la figura pue-
sij = − de observarse el nivel de diversidad genética
2
dentro de este germoplasma representado por
y luego seguir los Pasos 1, 2, 3 y 4 anteriores. las coordenadas 1 y 2. Este análisis agrupó
la mayoría de los cultivares de acuerdo a su
OBSERVACIÓN 4: Cada autovector de S0 es clasificación taxonómica y mostró que exis-
un vector de longitud 1 en una cierta dirección. ten relaciones entre diferentes accesiones. Se
Pero por cada dirección podemos tener dos concluye que el análisis isoenzimático de semi-
vectores: v y -v. Por ejemplo: llas fue efectivo para caracterizar los cultivares
destinados a los programas de mejoramiento
de Amaranthus.
 −0.5344   0.5344 
   
v 2 =  −0.2674  y − v 2 =  0.2674 
 0.8019   −0.8019  A.cruen. A.hypoch A.caudat. A.manteg. A.dubius A.tricolor A.hybrid.
    0.6
38-39
40-43
0.4
Cualquiera de estos dos vectores pueden

6-9-10-11
41 37
2 34
42
usarse como segundo autovector y, más aun, 0.2
14 3
27
4
algunos programas pueden dar como resulta-

5 13
28 17
1 36
do el primero y otros el segundo. Como conse-
0.0
12 35
cuencia de esta selección se obtendrá el gráfi- -0.2

15
7
16
20
19
co II ó el III. Se ve que el único efecto de usar

8
18-22 25
26
uno u otro vector es una reflexión del gráfico -0.4

29-30
31
32-33
21
23
respecto del primer eje. Si se cambia el signo 24
de v1 se obtendrá una reflexión respecto del -0.6

-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6
segundo eje. Ninguno de estos cambios modi-
fica la distancia entre los puntos. Al sólo efecto de que el lector pueda repa-
No debe causar sorpresa, entonces, que con sar algunos cálculos en la Tabla 5 se dan los
un programa se obtenga un gráfico y con otro primeros diez elementos de los dos primeros
el mismo gráfico pero con una reflexión sobre autovectores y las dos primeras coordenadas
uno u otro eje, o sobre los dos. principales.

6 Análisis de agrupamientos (cluster) el elemento elemento C y cada elemento del
Esta técnica tiene como objetivo formar gru- grupo formado AB. En cambio, el ligamiento
pos de muestras, poblaciones, individuos u completo la nueva distancia se define tomando
OTUs que sean similares entre sí y diferentes la máxima distancia entre C y cada elemento
a los elementos de los otros grupos. del nuevo grupo. Si A, B y C fueran grupos for-
El primer problema es fijar el criterio para de- mados en pasos anteriores, se usan los mis-
cidir cuándo dos elementos son similares. Si se
tuviera un mazo de cartas, ¿cómo formar gru- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
pos? ¿por el valor de la carta?, ¿porque com- 5
6
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1
parten el palo?. Según el criterio que se apli- 9 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1
10 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1
que los grupos que se formen serán distintos. 11 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1
En la sección anterior hemos visto distintas 12

13
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1
1
maneras de definir la similitud o disimilitud en- 14 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1
15 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0
tre OTUs. Cada una de ellas, u otras que no 19 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1
se han presentado aquí, plantean distintos for- 16

20
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1
1
mas de medir la similitud entre los elementos 21 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
28 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
a agrupar. 27 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0
Existen, además, muchos métodos para for- 1

2
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1
mar los grupos. Uno de los más usados son 3 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0
23 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
los agrupamientos jerárquicos que pueden, a 24 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
su vez, ser divisivos o aglomerativos. Los pri- 25

26
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meros comienzan con todos los elementos en 29 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0
30 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0
un solo grupo y en sucesivas divisiones se van 31 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0
formando grupos cada vez más pequeños. Los 32

33
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0
aglomerativos, por el contrario, empiezan con- 18 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1
22 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1
siderando tantos grupos como elementos se 7 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1
tienen y se van agrupando según su grado de 17

34
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1
parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro 35 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1
36 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1
método se pueden representar en un gráfico 37 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
denominado dendrograma. 38
39
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1
En esta sección se tratarán solamente los 40 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
41 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1
métodos jerárquicos aglomerativos. 42 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1
Aquí se plantea un segundo problema: ¿Qué 43

4
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
0
0
0
0
1
0
tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto es, una 8 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0
vez realizado el primer agrupamiento, cómo se Tabla 4. Matriz de datos de análisis isoenzimático
define la distancia entre ese grupo y los restan- de 8 cultivares de Amaranthus.
tes elementos?.
Supongamos que en un primer paso se han
agrupado los elementos A y B porque son los V1 V2 CP1 CP2
que presentan la menor distancia entre sí. La 1 -0.127 0.031 -0.279 0.055
distancia entre el nuevo grupo AB y otro ele- 2 -0.107 0.137 -0.235 0.246 Autovalo-
mento C se puede definir según distintos cri- 3 -0.123 0.091 -0.270 0.163
res:
4 -0.005 0.074 -0.010 0.134
terios:
5 -0.220 0.070 -0.483 0.126
6 -0.232 0.162 -0.509 0.291 4.81258
Ligamiento simple: d(AB,C) = mín {d(A, C), d(B, C)}, 7 -0.125 -0.112 -0.273 -0.202 3.22431
Ligamiento completo: d(AB,C) = máx {d(A, C), d(B, C)}, 8 -0.125 -0.097 -0.274 -0.174
9 -0.232 0.162 -0.509 0.291 α1 = 46.85
10 -0.232 0.162 -0.509 0.291 α2 = 78.2
d(A, C) + d(B, C) ... ... ... ...
Ligamiento promedio: d({A,B},C) =
2
En el caso del ligamiento simple, la nueva Tabla 5. Resultados de autovectores y coordena-
das principales del análisis isoenzimático de 8 culti-
distancia se define es la mínima distancia entre
vares de Amaranthus.

AE B C D F
AE 0 1 1.41 1.15 1.1
B 1 0 1.29 1.10 0.93
C 1.41 1.29 0 1.26 1.07
D 1.15 1.10 1.26 0 1.22
F 1.1 0.93 1.07 1.22 0
AE BF C D
AE 0 1 1.41 1.15
BF 1 0 1.07 1.10
C 1.41 1.07 0 1.26
D 1.15 1.10 1.26 0
AEBF C D
AEBF 0 1.07 1.10
C 1.07 0 1.26
D 1.10 1.26 0
AEBFC D
AEBFC 0 1.10
D 1.10 0
AE BF C D
AE 0 1.1 1.41 1.15
BF 1.1 0 1.29 1.22
C 1.41 1.29 0 1.26
D 1.15 1.22 1.26 0
AEBF C D
AEBF 0 1.41 1.22
C 1.41 0 1.26
D 1.22 1.26 0
AEBFD C
AEBFD 0 1.41
C 1.41 0
AE BF C D
AE 0 1.05 1.41 1.15
BF 1.05 0 1.18 1.16
C 1.41 1.18 0 1.26
D 1.15 1.16 1.26 0
AEBF C D
AEBF 0 1.295 1.155
C 1.295 0 1.26
D 1.155 1.26 0
AEBFD C
AEBFD 0 1.277
C 1.277 0
Tabla 6. Diferentes clases de agrupamiento en base a la matriz de distancias.
mos algoritmos en el caso del ligamiento sim- Este ligamiento promedio se conoce tam-
ple o completo. Para el ligamiento promedio bién por las siglas UPGMA (Unweighted Pair
hay que promediar todas las distancias entre Groups Method with Arithmetic Averages).
elementos de AB y de C: donde dij es la distan- Consideremos el ejemplo de la Tabla 6. Pri-
mero se realizará un agrupamiento aplicando
ligamiento simple.
∑d ij En primer lugar se agrupan los elementos A
d(AB, C) =
i, j
y E porque están a menor distancia (son igua-
n AB n C les). Formado ese primer grupo habría que
calcular las nuevas distancias del grupo AE a
cia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; los restantes elementos pero como d(A, U) =
nAB y nC son los números de elementos en el d(E, U) para todos los restantes elementos U
grupo AB y C, respectivamente. se mantienen esas distancias.

En el segundo paso se observa que la menor 7 Lecturas recomendadas
distancia es la de B a F; se forma ese grupo y
se recalculan las distancias del nuevo grupo a Cavalli-Sforza, L.L.; Edwards, A.W.F. 1967. Phylo-
los restantes. Y así hasta que se han agrupado genetic analysis: models and estimation proce-
todos. También se puede detener el proceso fi- dures. Am J Hum. Gen 19: 233-257.
jando algún otro criterio para ello. Di Renzo, M.; Bonamico, N.; Gesumaria, J. 2001.
Characterisation of amaranth accessions by iso-
Por ejemplo, cuando se ha alcanzado una
zymic patterns. Seed Sci Technol 29 (1): 227-238.
distancia máxima fijada previamente. Everitt, B.S.; Dunn, G. 1991. Applied Multivariate
A continuación se aplica el ligamiento com- Data Analysis. E. Arnold, London.
pleto. Los dos primeros agrupamientos coinci- Hair, J.F.; Anderson, R.E.; Tatham, R.L.; Black, W.C.
den en este ejemplo, por lo que sólo se mues- 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Pren-
tran los tres últimos pasos. Por último se ven tice Hall - Upper Saddle River, New Jersey.
los pasos cuando se aplica un ligamiento pro- Hillis, D. 1984. Misuse and modification of Nei's ge-
medio. Los mismos métodos se pueden aplicar netic distance. Syst Zool 33: 238-240.
sobre matrices de asociación cambiando los Manly, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A
conceptos de "menor distancia" por el de "ma- Primer. Chapman and Hall, London.
Nei, M. 1972. Genetic distances between popula-
yor asociación".
tions. Am Nat 106: 283-292.
En general, el ligamiento simple produce Nei, M. 1978. Estimation of average heterozygosity
agrupamientos en cadena: a los grupos forma- and genetic distance from small number of indi-
dos inicialmente se van acoplando los restan- viduals. Genetics 76: 379-390.
tes elementos. En cambio, el ligamiento com- Rencher, A.C. 1995. Methods of Multivariate Analy-
pleto tiende a generar muchos grupos chicos sis. J. Wiley & Sons, Inc. New York.
que se reunirán en los últimos pasos.
El análisis de Agrupamientos sólo debe to-
marse como un método exploratorio. Si ori-
ginalmente los datos forman grupos bien sepa-
rados cualquier método de agrupamiento dará,
aproximadamente, los mismos resultados.
Pero si las muestras forman un continuo, cada
método y cada medida de distancia pueden
conducir a resultados muy dispares. En este
caso las conclusiones deben realizarse con
cautela.
A veces es conveniente realizar un Análisis
de Coordenadas Principales para determinar si
existen grupos claramente definidos o no.

PARTE III
Métodos para acelerar
programas de mejoramiento
e identificación varietal

III. CAPÍTULO 1 Identificación de Haploides
Varios procedimientos facilitan la búsqueda
de haploides en muestras grandes en número
Obtención de Plantas de individuos. Algunos de ellos son:
Doblehaploides • Morfología: las plantas haploides son,
en general, más pequeñas que las di-
Polci, Pablo; Conti, Verónica; Miranda, Rubén; ploides, tanto en sus partes vegetativas
Gear, Nicolás como florales. Esto se debe principal-
mente a la disminución en el tamaño de
sus células. Es lógico pensar que el fe-
1 Introducción notipo más pequeño de las plantas pue-
Comentarios generales sobre los de ser una primera aproximación en la
haploides búsqueda de haploides. Si esta disminu-
ción de tamaño fuera notable en las se-
Para referirnos al término haploide es nece-
millas, sería muy fácil realizar una selec-
sario conocer previamente el origen de dicha
ción mecánica, aunque esto sucede en
denominación, y definir algunos conceptos bá- pocas especies.
sicos sobre el tema. Si consideramos haploide • Poliembrionía: la presencia de poliem-
al individuo que posee un solo juego de cromo- brionía facilita la detección de embriones
somas de la especie, no estaríamos incluyen- haploides. No obstante, debe realizarse
do en esta clasificación a aquellos individuos el control citológico correspondiente. El
derivados de especies poliploides, cuya consti- porcentaje de embriones gemelos obser-
tución genética es igual a la de los gametos vados varía con la especie y el genotipo.
normales de dicha especie. Por ejemplo, un • Genes marcadores: con este fin puede
autopoliploide AAAA (2n = 4x) daría lugar a in- utilizarse cualquier par de alelos cuyos
fenotipos dominante y recesivo sean
dividuos “haploides” AA (n = 2x), que por tener
fácilmente distinguibles. En la práctica,
dos juegos cromosómicos (AA) no podrían ser conviene utilizar marcadores que posean
incluidos en la definición. Por lo tanto, una so- manifestaciones fenotípicas claras en
lución sería denominar como haploides a los semilla o en plántula y de esta manera
individuos originados a partir de especies di- hacer una selección más económica en
ploides, que posean un solo juego de cromoso- tiempo y esfuerzo. Para identificar ha-
mas (n = x), llamando polihaploides a aquellos ploides en una variedad que se supone
individuos con una composición cromosómica homocigota, se realizan cruzamientos
igual que la gamética normal de la especie, con otra variedad que sea homocigota
que tengan dos o más juegos cromosómicos para el alelo alternativo. La mayor par-
te de la descendencia será heterocigota
(n > x). Otra posibilidad sería considerar el tér-
(diploide), con fenotipo dominante. Los
mino haploide en un sentido más amplio, com- individuos que aparezcan con el fenotipo
prendiendo en éste a todos los individuos que recesivo serían haploides, obtenidos por
posean una constitución cromosómica igual a partenogénesis o androgénesis, según
la de los gametos normales de la especie (n = sea el fenotipo recesivo materno o pater-
2n/2). Llamaríamos de esta manera monoploi- no, respectivamente.
des y polihaploides a los individuos provenien-
tes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides Antecedentes
(2n> 2x) respectivamente. De aquí en adelan- El valor de los haploides se conoce desde
te, a los fines prácticos y en concordancia con 1922, cuando se descubrió la producción es-
pontánea de los mismos, siendo superior a
la segunda definición, nos referiremos al térmi-
cien el número de especies vegetales capaces
no haploide indistintamente del nivel de ploidía de producirlos in-vivo. Sin embargo, la frecuen-
de la especie en cuestión, como a aquellos cia con la cual se producen es muy baja, con
individuos que poseen la mitad del número valores que van de 0,001 a 0,01%.
cromosómico normal contenido en las células Entre los casos de haploidía espontánea es
somáticas de la especie. común la poliembrionía, que, con una gran va-

riación entre los distintos genotipos, ocurre en para hacer frente a las demandas mundiales de
una amplia gama de especies, géneros y fami- producción. A pesar de que cada año se liberan
lias. En estos casos es frecuente la aparición al mercado numerosas variedades, estas no
de haploides procedentes de una sinérgida del persisten demasiado. Los objetivos de mejora-
saco embrionario, puesto que se ha comproba- miento a largo plazo no podrán ser alcanzados
do en muchas especies que las células antípo- a menos que se genere mucha variabilidad ge-
das degeneran antes de la fecundación. nética que pueda ser utilizada con estos fines
En 1966, Guha y Maheshwari descubrieron y que existan métodos que acorten el tiempo
necesario para la obtención de variedades.
que las anteras de Datura innoxia Mill. genera-
El advenimiento de las técnicas biotecnoló-
ban plantas haploides al ser cultivadas in-vitro.
gicas y los avances en biología molecular han
Este proceso, confirmado posteriormente por permitido el desarrollo de nuevas herramientas
Nitsch y Nitsch (1969) en tabaco, se ha utili- de gran utilidad en el mejoramiento vegetal.
zado para producir haploides en numerosas Entre éstas, la producción de haploides y do-
especies. En el caso de Datura innoxia, las fre- blehaploides son herramientas interesantes ya
cuencias de inducción son casi del 100% y el que permiten acortar el tiempo requerido para
rendimiento es de más de mil plántulas o callos la obtención de nuevas variedades, siendo un
por antera en condiciones óptimas (figura 1). buen complemento para los programas de me-
En estudios de androgénesis in-vitro se ha jora tradicionales. Al carecer de genotipos hete-
detectado especial facilidad para regenerar ha- rocigotas, las poblaciones doblehaploides (DH)
ploides a partir de anteras aisladas o de granos necesarias para encontrar genotipos raros pue-
de polen en miembros de la familia de las sola- den ser mucho menos numerosas, especial-
náceas También se han encontrado resultados mente en el caso de caracteres recesivos, ya
sorprendentes en numerosos géneros de las que éstos no quedan enmascarados por los ale-
crucíferas, gramíneas y ranunculáceas, aun- los dominantes. Las poblaciones DH, si se las
que resulta común observar diferencias signi- compara con poblaciones segregantes, presen-
ficativas, incluso dentro de un mismo género. tan mayor variación genética aditiva y ausencia
de varianza genética debida a la dominancia.
No se ha logrado, sin embargo, el mismo éxito
Es decir que cuando se utilizan poblaciones do-
en especies arbóreas y arbustivas.
blehaploides se eliminan las complejidades del
estado heterocigota y se facilita enormemente
el análisis genético. De esta manera pueden
distinguirse las mutaciones recesivas de forma
inmediata, haciendo que el proceso de selec-
ción sobre una población de haploides resulte
más eficiente (figura 2).
La producción de haploides es una alterna-
tiva biotecnológica de gran importancia y ha
resultado exitosa en varios cultivos, entre ellos
cebada, arroz, maíz y trigo.
Un sistema de producción de DH debe cum-
plir con tres requisitos básicos para su utiliza-
ción en programas de mejoramiento:
Figura 1. Obtención de plantas haploides por culti- 1. Debe producir líneas DH eficientemente a
vo de anteras. partir de todos los genotipos.
2. Los DH obtenidos deben ser normales y
estables.
Importancia de los haploides y 3. Éstos deberían representar una muestra al
aplicaciones en el mejoramiento vegetal azar del conjunto de gametos parentales.
Los métodos tradicionales para el mejora-
miento vegetal han sido practicados por cientos Entre las aplicaciones más importantes de
de años. Actualmente se ha llegado a una eta- los doblehaploides en el mejoramiento vegetal
pa en donde estos métodos son insuficientes podemos citar:

• En las plantas autógamas, con los
métodos convencionales de mejo-
ramiento, la homocigosis práctica
se logra recién luego de seis a ocho
generaciones de autofecundación.
Mientras que con una técnica de
producción de haploides seguida
de duplicación cromosómica, es
posible llegar a homocigosis com-
pleta en solo una generación.
• En las plantas alógamas, la pro-
ducción de homocigotas resulta de
gran importancia. Al trabajar con
especies de polinización cruzada
se favorece naturalmente la he-
terocigosidad, y, de ser posible la
autofecundación, la obtención de
Figura 2. Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento homocigotas se ve dificultada por la
cuando los cultivares parentales difieren, teóricamente, en endogamia.
dos pares de genes. Si el genotipo buscado es, por ejemplo
• En plantas bulbosas, árboles fru-
el doble recesivo aabb, por autofecundación convencional
tales y forestales la homocigosis
se tiene una probabilidad de 1/16 de encontrarlo. Si se in-
duce haploidía, el mismo genotipo tendrá una probabilidad juega un rol muy importante en el
de ocurrencia de 1/4 porque no se producirán los genotipos aceleramiento de los programas de
heterocigotas. mejora. Debido al prolongado tiem-
po requerido para alcanzar la fase
adulta, el proceso de mejora resulta
1. Acortamiento de los programas de me- extremadamente largo, aún siendo
jora: el desarrollo de nuevos cultivares por los posible la autopolinización.
métodos tradicionales actuales comprende tres
etapas fundamentales: a) generación de va- 2. Generación de poblaciones de mapeo:
riabilidad genética, ya sea por medio de hibri- para el mapeo genético de plantas, diversos ti-
daciones sexuales intra e interespecífica, por pos de poblaciones pueden ser utilizadas. La
inducción de mutaciones, o por transformación selección del tipo de población a usar se rea-
genética; b) recuperación de progenies homo- liza en función de los objetivos de la investiga-
cigotas a través de generaciones repetidas de ción y del tiempo y recursos disponibles. Las
autofecundación o retrocruzamiento, seleccio- poblaciones de mapeo con el mayor contenido
nando a favor de los caracteres de interés; c) de información son aquellas obtenidas a partir
evaluación del comportamiento de los nuevos del cruzamiento entre dos individuos homocigo-
materiales en ensayos comparativos a campo. tos contrastantes. En las plantas F1 obtenidas,
Estos pasos son básicos en un programa de el desequilibrio de ligamiento es máximo, y las
mejora, pudiendo existir otras etapas en fun- poblaciones derivadas a partir de estas plantas
ción del modo reproductivo de la especie. Así F1 procuran explorar este desequilibrio. Para
por ejemplo, el tiempo requerido para la ob- especies de autofecundación o que toleran la
tención de un nuevo cultivar de trigo de ciclo autofecundación pueden utilizarse poblaciones
invernal es de aproximadamente diez años, a F2, Fn, RILs (Recombinant Imbred Lines), de-
través del mejoramiento tradicional (figura 3). rivadas de retrocruzas y doblehaploides. Las
La biotecnología se presenta como una alter- poblaciones de doblehaploides representan
nativa atractiva, no sólo para reducir el tiempo la variabilidad genética entre los progenitores
de obtención de los genotipos deseados, sino luego de ocurrida una sola meiosis (F1), y son
también para lograr una economía de mano de especialmente indicadas cuando se realizan
obra y espacio en el campo experimental. estudios con QTL (Quantitative Trait Locus), ya

a bajas temperaturas.
• Plantas de Brassica napus con mayor
contenido de aceite del ácido erúcico en
las hojas. Este aceite se usa como lubri-
cante en la industria.
6. Mutagenesis: si se aplica mutagénesis
a un sistema de haploides, se obtienen mu-
tantes sólidos, lográndose la homocigosis del
mutado rápidamente luego de la duplicación
con colchicina. Entre los agentes mutagénicos
más frecuentemente utilizados se encuentra la
N-metil-N-nitrosurea (20 mM), los rayos γ (0,5
Figura 3. Representación esquemática de los pa- krad) y el etil metil sulfonato.
sos requeridos para la obtención de líneas puras en 7. Transformación genética: rige el mismo
un programa de mejoramiento tradicional. principio que para mutagénesis. La transfor-
mación de haploides permite la obtención del
transgén en homocigosis luego de la duplica-
que al obtenerse genotipos 100% homocigotas ción con colchicina. Puede realizarse con PEG
se dispone de poblaciones estables o “inmor- (polietilenglicol), microinyección o utilizando
tales” de mapeo, permitiendo analizar la mis- Agrobacterium tumefaciens.
ma población en diferentes años y localidades, 8. Producción de plantas homogaméti-
debido a la constante disponibilidad de semilla. cas: Asparagus officinalis es una especie cul-
3. Estudio de especies poliploides: la in- tivada, dioica, en la cual las plantas femeninas
ducción de haploides en plantas poliploides son XX y las masculinas son XY. De esta ma-
facilita el trabajo de investigación y mejora, ya nera, para obtener una población de plantas
que permite manejar niveles de ploidía meno- deben cruzarse ambos tipos, lo que dará una
res para los estudios de herencia y la combina- progenie constituida por 50% de plantas XX
ción de caracteres de interés. y 50% de plantas XY. Sin embargo, desde el
4. Fusión de protoplastos: al fusionar dos punto de vista del productor, es deseable la ob-
protoplastos haploides se origina uno diploide tención de una población constituida solamen-
que puede duplicarse y llevar a la obtención de te por plantas XY, que tienen un menor conte-
un híbrido interespecífico o intergenérico, sien- nido de fibra y son, por lo tanto, preferidas por
do esto una ventaja importante cuando se tra- los consumidores. Para solucionar este proble-
baja en hibridación somática. ma y obtener 100% de plantas masculinas se
5. Variación gametoclonal: la androgénesis ideó un sistema que consiste en el cultivo de
in-vitro provee un excelente sistema para ana- anteras y diploidización de plantas YY, llama-
lizar, a nivel esporofítico, la variación debida a das supermachos. La ventaja de estas plantas
recombinación y segregación meiótica. Las va- es que, al ser cruzadas con plantas XX darán
riantes gametoclonales expresan el carácter re- 100% de plantas XY, como se muestra en el
cesivo en la R0, a diferencia de las somaclona- esquema 1.
les, que requieren de autofecundación y análi- Con este sistema, en 1990 fue liberada una
sis de progenie. Algunos logros de esta técnica: variedad llamada Andrea (un híbrido obtenido
• Frutos de tomate con mayor contenido de como se mencionara anteriormente). Andrea
sólidos. es una variedad muy homogénea, de alto ren-
• Plantas enanas de arroz con granos más dimiento y de excelente calidad.
largos y con elevados niveles de proteí-
nas de reserva y más macolladoras. Obtención de Haploides
• Plantas de Datura innoxia con contenidos Como se mencionara anteriormente, las
más elevados de alcaloides en las hojas. plantas haploides aparecen en muy baja fre-
• Plantas de tabaco con mayor resistencia cuencia en la naturaleza, siendo necesaria la

Progenitor masculino
XY
Formación de gametos
X Y
Plantas haploides Cultivo de anteras
X Y
Homocigotos, hembra Duplicación

y supermacho cromosómica
XX YY
Gametos X Y Formación de
gametos
XY
Híbrido
Esquema 1.
posterior ocurrencia de duplicación cromosó- cundar a la especie en cuestión, puede

mica para la obtención de semillas. Por ello, la servir de estímulo para inducir haploidía,
producción artificial de haploides resulta siem- como sucede en el cruzamiento entre
pre más efectiva. Solanum tuberosum x S. phureja (papa
silvestre). El polen de la papa silvestre
- Origen de los haploides contiene sólo un núcleo generativo, pro-
I. Ginogénesis: desarrollo de un gameto fe- ducto de una gametogénesis anormal,
menino no fecundado. Se logra por: por lo cual la fertilización doble no logra
1. Castración y aislamiento de las flores. producirse, pero se forman embriones
Por este tratamiento se han obtenido ha- haploides por partenogénesis; b) utili-
ploides de Triticum monococcum. zando polen previamente irradiado.
2. Polinización retrasada: la castración de 5. Cultivo de ovarios: puede ser eficaz para
las flores y la posterior polinización en el obtener haploides a partir de cruzamien-
límite de la madurez receptiva del estig- tos interespecíficos.
ma permiten obtener hasta un 30% de II. Androgénesis: desarrollo de un gameto
haploides en trigo. masculino. Se logra por:
3. Presencia de dos células espermáticas 1. Cultivo de anteras: se ha inducido ha-
con diferente velocidad de desarrollo: el ploidía en mono y dicotiledóneas, siendo
mecanismo involucrado en la generación más fácil en las últimas. Es una técnica
de haploides estaría basado en la falta simple que, dependiendo del genotipo
de fertilización de la oosfera durante la y de las condiciones de cultivo permite
doble fertilización. obtener elevados números de plantas
4. Polinización con polen inviable: a) uti- en tiempos relativamente cortos. Ha sido
lizando polen extraño (típico de cruza- más difícil en los cereales, no obstante
mientos interespecíficos), incapaz de fe- se obtuvieron haploides de arroz, trigo,

cebada con diferentes grados de dificul- haploidía del 3,1% y del 52,9% respectivamen-
tad. te. Esto se debe a que ciertas interacciones en-
2. Cultivo de microsporas: en 1974 Nitsch tre un citoplasma y un núcleo extraño inducen
indujo la regeneración de plantas haploi- haploidía.
des de Nicotiana terbium y Datura inoxia VI. Semigamia: el núcleo del gameto mas-
a partir de cultivos en suspensión de mi- culino penetra en la ovocélula pero sin fusio-
crosporas, previo choque térmico a baja narse con el núcleo femenino. Ambos núcleos
temperatura de las flores. Este método comienzan a dividirse independientemente,
tiene la ventaja de producir haploides produciendo un individuo haploide con tejidos
masivamente (más de 7000 plantas por de origen materno y paterno.
botón floral en tabaco), y de permitir la
aplicación de diferentes tratamientos a - Métodos más utilizados para la obten-
las microsporas como transformación o ción de plantas haploides
mutagénesis para luego obtener plantas Entre los métodos disponibles actualmente
por embriogénesis partiendo de una úni- para la obtención de doblehaploides, los más
ca célula inicial. Para conseguir diferen- utilizados son la hibridación interespecífica e
ciar plantas a partir de microsporas es intergenérica, la androgénesis, y recientemen-
necesario quebrar el mecanismo respon- te la ginogénesis en maíz.
sable de la asimetría en la primera mito- I. Cultivo de Anteras: consiste en el cultivo de
sis del polen. anteras inmaduras en un medio de inducción
3. Técnica de gametofito indeterminado donde las microsporas competentes originarán
(ig): en 1969 J L Kermicle desarrolló una callos, que serán luego transferidos a un medio
técnica en maíz basada en la ocurrencia apropiado para la regeneración de plantas (fi-
de una mutación espontánea, encontra- gura 1). En algunas especies de dicotiledóneas
da en la línea W23. El gen ig provoca una el número de plantas obtenidas por cada cien
disrupción en el desarrollo del gametofito anteras cultivadas es muy elevado. En cambio,
femenino, generando, luego del proceso en las gramíneas la técnica no ha sido tan exito-
de polinización, que los núcleos esper- sa. Sin embargo, los progresos en los métodos
máticos ocasionalmente se desarrollen de cultivo in-vitro durante las últimas décadas
androgenéticamente. El desarrollo em- han permitido obtener buenos resultados con
brionario de los núcleos espermáticos en gramíneas (figura 4), aún en aquellas conside-
el citoplasma materno resulta en la for- radas recalcitrantes. La capacidad de respues-
mación de haploides androgenéticos, o ta al cultivo de anteras, denominada capacidad
haploides paternos. androgénica, puede ser evaluada a través de
III. A partir de alguna célula haploide del la producción de callos y de plantas verdes, y
saco embrionario distinta del gameto feme- su eficiencia es altamente dependiente de:
nino (sinérgidas o antípodas). 1. El genotipo: es quizás el factor más im-
IV. Cruzamientos interespecíficos o inter- portante que afecta al cultivo de anteras.
genéricos con eliminación cromosómica: En la naturaleza, la haploidía es contro-
se produce la fertilización de manera de que se lada por el gen hap, llamado gen inhibi-
forme un cigoto diploide, que a lo largo de las dor de la haploidía. Existe suficiente evi-
sucesivas divisiones mitóticas, va perdiendo dencia que sugiere que la androgénesis
el genoma del individuo que aportó el gameto in-vitro también está bajo control génico,
masculino, como sucede en los cruzamientos y que este carácter puede ser transferido
entre Hordeum vulgare y H. bulbosum. desde clones con alta respuesta a otros
V. Interacción núcleo-citoplasma: utilizan- no respondedores. Se ha hallado varia-
do líneas de sustitución y restauración nuclear bilidad en la respuesta entre especies y
se encontró que los individuos con citoplasma aún dentro de ellas. En cebada y trigo los
de Aegilops caudata y núcleo de Triticum aes- caracteres inducción de callos y regene-
tivum o Triticale mostraban una frecuencia de ración de plantas son altamente hereda-

material nuclear y el de las organelas,
resultando en un desarrollo retardado o
incompleto de los plástidos, lo cual con-
duciría a la producción de fenotipos albi-
nos. De acuerdo a este autor, el desarro-
llo de un sistema fotosintético funcional
es promovido por el tratamiento con ba-
jas temperaturas, aunque no siempre un
pretratamiento con frío reduce incidencia
de albinismo.
3. Las condiciones de crecimiento de las
plantas donantes: la edad y las condi-
ciones ambientales en que crecen las
plantas afectan considerablemente la
capacidad androgénica de las mismas.
Los factores ambientales más críticos
son el fotoperíodo, la intensidad de luz,
la temperatura, la nutrición y la concen-
tración de CO2. Estos factores incidirían
en la capacidad de producir las divisio-
Figura 4. Producción de callos y plantas a partir del nes celulares morfogénicas que condu-
cultivo de anteras de Triticum aestivum. (A) Callo cen al desarrollo de embrioides y la re-
blanco y compacto sobre una antera (flecha). (B) generación de plantas. Este último paso
Detalle del callo señalado en (A). (C) Callo transfe- es crítico dentro de todo el proceso, es
rido a medio de cultivo para regenerar planta. (D)
altamente dependiente de la calidad del
Plántula de trigo regenerada a partir de callo, con
callo, y está asociado fuertemente a toda
sistema radicular en formación. (E) Planta haploide
completa finalizando la etapa de rusticación, cre- la historia previa del cultivo. En general,
ciendo sobre sustrato inerte (Perlita). se ha informado que la utilización de an-
teras de las primeras floraciones favore-
ce la respuesta androgénica, mientras
que las colectadas al final de la estación
bles, y se ha sugerido que ambos carac- muestran una menor respuesta al culti-
teres estarían controlados por muchos vo, generando una menor cantidad de
genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la embrioides. En Brassica napus, el creci-
capacidad androgénica no parece difícil, miento de las plantas a bajas temperatu-
siendo la identificación de genotipos con ras mejora la producción de embrioides
gran capacidad de respuesta un paso in- obtenidos a partir de anteras.
dispensable para su incorporación en los 4. El estado de desarrollo de las microspo-
bloques de cruzamiento. ras: en la fase gametofítica de las plan-
2. El % de albinismo: la ocurrencia de plantas, que comienza luego de la meiosis,
tas albinas representa un serio problema las microsporas sufren inicialmente una
para la aplicación del cultivo de anteras división mitótica asimétrica que da origen
en programas de mejoramiento de ce- a dos células de distintos tamaños: la ge-
reales. La incidencia depende, no sólo nerativa (más pequeña y con un núcleo
de la especie, sino también de la varie- altamente condensado) y la vegetativa
dad, citándose valores de 50, 70 y 100% (más grande y con un núcleo difuso).
para tres variedades diferentes de arroz. En las gramíneas, el núcleo generativo
Bernard (1980) ha sugerido que las al- se divide nuevamente originando dos
tas temperaturas incrementan la diferen- núcleos espermáticos. Uno generará el
cia entre la velocidad de replicación del endosperma triploide al fusionarse con

los dos núcleos polares del saco embrio- ría a una alteración en la orientación del
nario, mientras que el segundo fertilizará huso que conduciría a una primera mito-
a la oósfera produciendo el cigoto diploi- sis anormal del grano de polen. Por otra
de, que constituirá el primer paso de la parte, se ha mencionado que las bajas
nueva fase esporofítica. Los embrioides temperaturas retardan el envejecimiento
haploides se originan in-vitro a partir de de la pared de la antera, lo cual aumen-
una de las vías que se enuncian a conti- taría la supervivencia y la viabilidad del
nuación. Cuando la primera división mi- polen. En general, las temperaturas cita-
tótica de la micróspora es asimétrica, los das varían entre 2 y 10 ºC y la duración
haploides se originan por repetidas divi- del tratamiento de 2 a 30 días. Es impor-
siones de la célula vegetativa, de la ge- tante determinar la temperatura adecua-
nerativa o de ambas. En cambio, cuando da para cada especie vegetal, aún para
la primera división mitótica es simétrica, variedades dentro de la misma especie.
ambas células resultantes contribuyen al En algunas especies, tales como Capsi-
desarrollo del haploide. Por lo tanto, una cum annun, avena y algunos genotipos
célula gamética masculina puede revertir de trigo se ha logrado éxito con un cho-
su desarrollo gametofítico hacia el grano que con alta temperatura. Temperaturas
de polen y dar origen directamente a un de 30 – 35 ºC durante los primeros 1 a 4
nuevo individuo. En general, las micros- días del cultivo ayudaron a inducir la an-
poras que se encuentran en la primera drogénesis en varias especies de género
división mitótica son las que mejor res- Brassica.
ponden. Esto varía levemente con la es- 6. La composición del medio de cultivo: es
pecie vegetal, pero esta reversión no es otro de los factores importantes para el
posible luego de iniciada la deposición éxito en el cultivo de anteras. No existe
de almidón. El estadío más apropiado una recomendación general y las varia-
para los cereales es el de micróspora ciones dependen de la especie a cultivar.
uninucleada media y tardía. a) Medios de inducción: dos tipos de
5. Los pretratamientos: distintos tipos de estrés, osmótico y nutricional, han sido
estrés aplicados durante el estadío ade- identificados como causas disparadoras
cuado pueden enmascarar el programa de la inducción de embriogénesis en las
gametofítico e inducir la expresión de microsporas de mono y dicotiledóneas.
genes específicos del desarrollo espor- En tabaco, el cultivo de las anteras en un
fítico. Si bien las bajas temperaturas son medio carente de sacarosa durante los
consideradas como el mejor pretrata- primeros 6 días de la etapa de inducción
miento, también otros pueden estimular permitió una máxima respuesta andro-
la androgénesis, como el calor, el cho- génica. Los carbohidratos cumplen dos
que osmótico, la centrifugación de las roles fundamentales en los medios de in-
anteras o hasta una incisión en la parte ducción, ya que actúan como osmolito y
superior de la inflorescencia donante. como nutriente. Los agentes gelificantes
También se citan la poda, la pulverización representan otro aspecto importante en
con etrel, la irradiación, la reducción en la evolución de los medios de inducción.
la presión atmosférica, la anaerobiosis, Tradicionalmente se utilizó agar como
el tratamiento en una atmósfera satura- gelificante de los medios de cultivo debi-
da de agua y la aplicación de gameto- do a su disponibilidad y bajo costo. Pero
cidas. Las bajas temperaturas aplicadas en 1973 se detectó una mejor respuesta
sobre la planta madre, sobre las yemas androgénica en tabaco cuando las ante-
florales jóvenes o sobre las anteras, ge- ras fueron cultivadas en un medio soli-
neralmente estimulan la embriogénesis. dificado con agar y suplementado con
El frío estimula la división mitótica simé- carbón activado. En medios líquidos la
trica de las microsporas. Esto se debe- adición de Ficoll (polímero sintético de

sacarosa, inerte, no iónico y de alto peso II. Cultivo de Microsporas: comprende la
molecular) incrementa la tensión super- obtención de individuos haploides a partir de
ficial y la viscosidad del medio. De esta microsporas aisladas. Las espigas son pretra-
manera, las anteras y callos flotan sobre tadas y las microsporas liberadas son coloca-
el medio líquido y se desarrollan en con- das en un medio de cultivo donde desarrollarán
diciones aeróbicas, permitiendo eleva- embriones haploides que serán luego transfe-
das tasas de embriogénesis y de produc- ridos a un medio de regeneración para originar
ción de plantas verdes. En cuanto a los plántulas (figura 5). Este sistema es conside-
reguladores de crecimiento, la mayoría rado el de mayor potencial para la producción
de los cereales requiere de la presencia de doblehaploides, debido a que induce a las
de auxinas y de citocininas en el medio miles de microsporas que contiene una flor a
de cultivo y las respuestas parecen de- dividirse y producir embriones. La ausencia de
pender de los niveles endógenos de ta- la pared de la antera podría mejorar la nutri-
les reguladores. Por ejemplo, para lograr ción y eliminar las restricciones físicas para la
la inducción en trigo es indispensable el androgénesis. El cultivo de microsporas tiene
uso de 2,4-D en concentraciones de 1,5 la ventaja de originar embriones de similar ta-
a 2 mg/l. Existen otras sustancias que, maño y etapa fisiológica debido a que pueden
adicionadas al medio de cultivo, ayudan separarse las microsporas de tamaños seme-
en la estimulación de la androgénesis, jantes por centrifugación diferencial. La opti-
como la glutamina y el inositol. También mización de los diferentes pasos críticos para
se citan otros compuestos inespecífi- el éxito de esta técnica puede llevar a la ob-
cos como extracto de papa, de batata, tención de una alta cantidad de plantas verdes
de mandioca, de trigo germinado y de con menores costos y esfuerzos. Entre los fac-
endospermas de arroz y de maíz. En
ocasiones, si el medio es suplementado
con leche de coco los granos de polen
desarrollan directamente en embrioides.
b) Medios de regeneración: la variedad
de medios de regeneración citada es
menor cuando se la compara con la de
los medios de inducción. Los más utili-
zados son modificaciones derivadas del
medio MS, con concentraciones de car-
bohidratos similares a las utilizadas en
los medios de cultivo de tejidos tradicio-
nales (30g/l de sacarosa), utilizando agar
(0,6%) como gelificante, auxinas menos
poderosas, y un balance hormonal a fa-
vor de las citocininas Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas
7. Las condiciones de incubación: las ca- del cultivo de anteras y de microsporas aisladas.
racterísticas ideales de cultivo son es- Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a
pecíficas para cada especie, y aún para partir de anteras hasta la obtención de las plantas
cada genotipo dentro de una misma es- haploides pueden describirse como sigue: a) yema
pecie. Estas afectan particularmente la floral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anteras
tasa de absorción final de nutrientes y la en cultivo, 1d) y 1e) proliferación de las anteras, 1f)
callo haploide, 1g) diferenciación de callo, h) planta
regeneración de plantas verdes. La dura-
haploide. Para el cultivo de microsporas aisladas:
ción e intensidad lumínica, la temperatu- a) yema floral previo a la antesis, 3b) microsporas
ra y la orientación de las anteras sobre el aisladas de una antera, 3c) cultivo de microsporas,
medio de cultivo pueden tener un efecto 3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embrión en de-
considerable en algunas especies. sarrollo.

tores determinantes de la eficiencia del método y para cada genotipo en particular.
podemos citar: 7. Medio de inducción: se han estudiado
1. Genotipo: se han citado cultivares de ce- diferentes concentraciones de azúcares,
bada con una alta respuesta al cultivo de distintas fuentes de nitrógeno orgánico,
microsporas, en contraste con otros me- y la adición de diferentes de auxinas al
nos respondedores. medio. En general se sugiere la sustitu-
2. Albinismo: al igual que en el cultivo de ción de sacarosa por maltosa como fuen-
anteras, el número de plantas albinas te de carbohidratos, la disminución de la
depende del genotipo, y también se ve concentración de nitrato de amonio, el
influido por la densidad de cultivo de las agregado de glutamina, y el empleo de
microsporas. APA (ácido fenil acético) como auxina
3. Condiciones de crecimiento de la plan- para favorecer la inducción.
ta donadora: el mantenimiento de las 8. Medio de regeneración: la composición
plantas en condiciones controladas de del medio de regeneración puede afectar
fotoperíodo y temperatura es esencial y el vigor y supervivencia de las plántulas.
debe ser ajustado en función de la espe- Kasha et al. (2001), trabajando con ce-
cie. Se han citado excelentes resultados bada, encontraron en este método una
en cebada cuando las plantas son culti- manera eficiente de producción de DH,
vadas en ambientes libres de patógenos, con una mejor respuesta y una menor
con alta humedad relativa (60-80%), dependencia del genotipo que en el caso
fotoperíodo de 16 hs de luz, y adecuado del cultivo de anteras. A esto se le suma
régimen de fertilización y riego. Cuando la ventaja de contar con una elevada
las plantas crecen estresadas, ya sea cantidad de microsporas haploides en un
por riego excesivo, sequía, enfermeda- estado fisiológico uniforme, que constitu-
des, o la aplicación de algún plaguicida, yen excelentes blancos para la mutagé-
la respuesta al cultivo de microsporas es nesis, la selección y la transformación.
menor. III. Hibridación Interespecífica e Intergené-
4. Estadio de las microsporas: como se ci- rica: en este caso los haploides se originan a
tara anteriormente para el cultivo de an- través de la eliminación del genoma del poli-
teras, es imprescindible el chequeo del nizador. El sistema de hibridación de trigo x
estadio correcto de las microsporas para Hordeum bulbosum, inicialmente descubierto y
que conserven su capacidad androgéni- empleado con éxito en cebada, ha sido consi-
ca. derado superior al cultivo de anteras por tres
5. Pretratamientos: los más utilizados con- razones:
sisten en el uso de frío, estrés osmótico, 1. La producción de haploides es más fácil.
presencia o ausencia de determinados 2. El tiempo requerido para la regeneración
nutrientes, etc. Se ha demostrado que los de plantas es menor.
nutrientes disponibles para las microspo- 3. La eficiencia en la regeneración de plan-
ras durante el pretratamiento constituyen tas parece ser mayor. La gran limitante
un factor decisivo que determina la cali- de este sistema lo constituye el hecho de
dad de los embriones originados. que la mayoría de los cultivares de tri-
6. Densidad de cultivo de las microsporas: go no pueden cruzarse con H. bulbosum
la densidad de las microsporas en cultivo debido a la presencia de los genes de
afecta el desarrollo de las mismas y el incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desco-
número de microsporas que entrarán en nocimiento del estado de estos genes en
división. Existe una concentración míni- los genotipos de trigo y de H. bulbosum
ma para el desarrollo de las microsporas, involucrados en los cruzamientos, debi-
y una densidad óptima para una mayor do a que los genotipos se seleccionan en
regeneración. Las condiciones más favo- base a criterios agronómicos y no a un
rables deben ser ajustadas en cada caso sistema de compatibilidad de cruzamien-

tos con H. bulbosum. Para sortear estos rezagados en el citoplasma, donde fi-
inconvenientes, se ha sugerido como nalmente son degradados. El resultado
alternativa realizar los cruzamientos de de este proceso es un embrión haploide
trigo utilizando maíz como polinizador de trigo. Seguidamente, los embriones
(figura 6). Luego de la fertilización del inmaduros deben ser rescatados en un
óvulo de trigo por el polen de maíz, du- medio de cultivo apropiado. A través de
rante las primeras mitosis del cigoto, los las cruzas con maíz se han obtenido ha-
cromosomas del maíz son eliminados. ploides de trigo de cultivares tanto com-
Esto se debe a una incompatibilidad en- patibles como incompatibles con H. bul-
tre los cinetocoros de estos cromosomas bosum, lo cual sugiere que el sistema de
y las fibras de los husos acromáticos que incompatibilidad no afecta al método de
hace que en las primeras anafases los trigo x maíz, por lo que sería menos de-
cromosomas de maíz vayan quedando pendiente del genotipo.
Figura 6. Producción de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maíz (Zea mayz).
(A) Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. (B) Plantas de maíz (donantes
de polen) crecidas en invernáculo. (C) Desgrane de espigas para realizar la desinfección de los granos y
posterior rescate de embriones. (D) Grano con dos embriones haploides (poliembrionía). (E) Embriones
inmaduros rescatados y creciendo in-vitro. (F) Planta rusticada. (G) y (H) Plantas con 3-5 macollos con
sus raíces sumergidas en solución de colchicina para la duplicación cromosómica. I. Plantas tratadas con
colchicina y llevadas a macetas con tierra en cámara de crecimiento

IV. Ginogénesis in vivo en maíz: el empleo 4. Duplicación de los individuos haploides.
de líneas con elevada frecuencia de haploides 5. Autofecundación de las plantas haploi-
como polinizadores motivó al desarrollo de des duplicadas.
la tecnología para la obtención de haploides La identificación de los granos haploides se
maternos in-vivo. Este hallazgo abrió nuevas realiza mediante el empleo de genes marcado-
posibilidades para el empleo de polinizadores res de color en embrión y endosperma, siendo
seleccionados en función de su capacidad de el alelo rojo navajo ó Navajo crown (R-nj) el
incrementar las frecuencias de haploides. Lí- más frecuente. Aquellos cariopses con un em-
neas inductoras fueron desarrolladas a partir brión haploide (r-nj), resultantes de la falta de
del germoplasma de Stock 6 de “elevada ha- fecundación de la oósfera, pueden distinguirse
ploidía”. El mecanismo involucrado en la gene- claramente debido a la falta de expresión del
ración de haploides estaría basado en la falta marcador antociánico dominante R-nj en el em-
de fertilización de la oosfera durante la doble brión. Es decir que la expresión específica del
fertilización. En relación a este fenómeno se ha gen R-nj en el endosperma (Navajo crown) y
planteado la hipótesis en que se asume que las en el embrión permite de manera rápida y pre-
líneas inductoras de haploidía presentan dos cisa identificar aquellos granos con la potencia-
células espermáticas con diferente velocidad lidad de producir plantas haploides (figura 8).
de desarrollo (figura 7).
El método de generación de haploides mater- Duplicación cromosómica
nos in-vivo involucra los siguientes pasos: Después de la duplicación cromosómica,
1. Generación del cruzamiento del cual se ya sea espontánea o inducida, se logra la ho-
desean obtener líneas homocigotos (Ge- mocigosis y se restaura la fertilidad. La planta
neración parental). haploide, sin duplicar, es estéril por lo que no
2. Fecundación de la F1 con polen prove- podría producir semillas. Entre las técnicas que
niente del inductor de haploidía. han sido utilizadas para la duplicación de ha-
3. Identificación de granos haploides. ploides cabe mencionar:
1. La duplicación espontánea du-
rante la etapa de callo o de res-
cate de embriones.
2. La regeneración de plantas do-
blehaploides a partir de callos
de médula de plantas haploi-
des de tabaco.
3. Sustancias químicas: aunque
se conocen casos utilizando
agentes químicos tales como
acenafteno, hidrato de cloral,
sulfanilamida, etc., la mayor
eficacia se ha logrado con la
colchicina y el óxido nitroso.
La aplicación del óxido nitroso
bajo presión (2-6 atmósferas)
resulta de especial interés por
su fácil penetración en los teji-
dos y la rápida desaparición de
Figura 7. Generación de haploides in-vivo a través de fecunda- los mismos cuando cesa la pre-
ción incompleta. La célula espermática se une a los núcleos po- sión. Puede utilizarse en flores
lares dando como resultado la formación del endosperma (3n). recién polinizadas. La ventaja
La otra célula no logra fecundar a la oósfera produciendo un que presenta este tratamien-
embrión haploide (n) to es que, al poder ser aplica-

ción a través de los tallitos decapitados,
sobre los que se vierte. Otra forma es
tratar los callos con colchicina antes de
trasladarlos al medio de regeneración.
Este último método permite la obtención
de gran número de doblehaploides, pero
presenta la desventaja de que la mayo-
ría de las plantas así obtenidas son mo-
saicos cromosómicos. Otra alternativa,
para microsporas y anteras, es la adición
del agente duplicador directamente en el
medio de inducción, antes de la primer
mitosis. La diploidización en este mo-
mento requiere menos tiempo y esfuerzo
y ha sido utilizada en programas de me-
joramiento de trigo, maíz, Tritordeum y
arroz. El problema de la suplementación
del medio de inducción con colchicina es
Figura 8. Marcadores de color en embrión y endos-
que reduce la embriogénesis en trigo, si
perma que permiten la selección de granos haploi- bien en Oryza sativa y Brassica la puede
des incrementar. La duración del tratamiento
y la concentración de la solución varían
para cada especie.
Cualquiera sea el método con que se dupli-
do durante la primera división mitótica que la planta, un macollo o sólo una yema flo-
del óvulo fecundado, se ve reducida la ral, lo importante es lograr que las semillas que
aparición de quimeras. Por otro lado, los éstas produzcan sean viables.
residuos de este agente resultan menos
tóxicos para la planta que otros que se Consideraciones finales
aplican en forma líquida, aunque la fre- La elección de los progenitores y la selec-
cuencia de aneuploides puede ser muy ción son etapas decisivas en un programa de
elevada. La acción de la colchicina fue mejoramiento que avanzará luego, generación
descubierta en 1937 y desde entonces tras generación, hacia una homocigosis que
ha pasado a ser prácticamente el agente permita entrar en las etapas de evaluación.
diploidizante más importante. Esta droga Ganar tiempo en estos casos puede signifi-
actúa impidiendo el autoensamblaje de car una reducción de costos muy importante y
la tubulina, inhibiendo así la formación una más temprana entrada en el mercado de
de los microtúbulos del huso y, en conse- la nueva variedad. En el caso de una espe-
cuencia, la segregación anafásica de las cie autógama, como el trigo, es posible ganar
cromátides. Afecta por lo tanto sólo a las generaciones haciendo dos cosechas en un
células que se encuentran en división. año, especialmente en aquellos cultivares de
Puede aplicarse a plántulas, plantas corto ciclo vegetativo. Esto, sin embargo, difi-
adultas, semillas, microsporas y anteras. culta la observación de algunas características
El tratamiento puede realizarse utilizan- agronómicas importantes, que no pueden ser
do una solución acuosa donde se su- observadas en los genotipos en esas condicio-
mergen las raíces, dejando fuera la parte nes, atentando contra una selección eficiente.
aérea. También se puede hacer llegar la Para los trigos de tipo invernal y facultativos,
solución al interior de la planta utilizan- con ligeros requerimientos de vernalización,
do una jeringa con la dosis deseada (mi- esta ganancia de generaciones no es posible
croinyección), o por absorción de la solu- o es compleja. La producción de individuos

doblehaploides que puedan participar anticipa- Lecturas Recomendadas
damente en la etapa de evaluación agronómi-
ca se plantea como una solución promisoria a Atanassov, A.; Zagorska, P.; Boyadjiev, P.; Djilianov,
este problema, reduciendo los tiempos y pre- D. 1995. In vitro production of haploid plants.
supuestos. World Journal of Microbiology & Biotechnology,
Muchos interrogantes quedan aún sin resol- vol. 11, 400-408.
ver, limitando la aplicación extensiva de esta Bhojwani, S.S., Razdan, M.K. 1996. Haploid Pro-
tecnología a algunos modernos programas de duction. En: Plant Tissue Culture: Theory and
mejoramiento vegetal. Algunas preguntas a las Practice, Capitulo 7. S.S. Bhojwani y M.K. Ra-
que debemos encontrar respuestas son: zdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp.167-213.
En que generación segregante se aplica el Coe E. H. Jr., Neuffer M. G., Hoisington D. A. 1988.
método de doblehaploides? The Genetics of Corn. En: Corn and corn Impro-
¿Cuál es el número de individuos dobleha- vement 3ra Edición. (Sprague C. F., Dudley J. W.
ploides derivados de un cruzamiento, repre- eds) pg 81-258. A.S.A., C.S.S.A., S.S.S.A, Madi-
sentativo de la variabilidad gamética creada son Winsconsin, pp 81-258.
en la cruza, que permita un aprovechamiento Lacadena, J.R. 1988. Variaciones cromosómicas
integral, comparable al logrado con el método numericas. En: Genética, Capítulo 15. Lacadena,
convencional de selección a campo? J.R. (ed.) A.G.E.S.A., Madrid. pp. 683-719.
¿Cómo superar la escasa cantidad de semi- Snape, J., Simpson, E., Parker, B., Friedt, W., Fo-
lla producida? roughi-Wher, B. 1986. Criteria for the selection
¿Es una técnica alternativa, o complementa- and use of doubled haploid systems in cereal
ria del mejoramiento tradicional? breeding programmes. En: Genetic manipula-
¿La eficiencia en la producción de dobleha- tion in plant breeding. Proc. Int. Symp. Eucarpia
ploides, justifica su alto costo dentro de un plan W. Horn, C. Jensen, W. Odenbach, O. Schieder
de mejora? (eds). W. De Gruyter, Berlin. pp. 217-229.
De acuerdo a Mujeb-Kazi (1998), las gene-
raciones segregantes adecuadas para producir
doblehaploides son la F2 y F3. Si eligiéramos
individuos F3, que ya cuentan con un año de
selección a campo durante la F2 -generación
que ha mostrado la mayor varianza genéti-
ca entre los dos padres- estaríamos evitando
producir un gran número de plantas dobleha-
ploides que no serán agronómicamente promi-
sorias. No obstante, debemos considerar que
serían necesarios varios cientos de individuos
DH para que el proceso tenga posibilidades de
éxito agronómico.
En general, la producción de doblehaploides
resulta en un gasto excesivo en comparación a
los métodos tradicionales de mejoramiento, por
lo cual en la mayoría de los programas sólo ge-
notipos élite son sometidos a este sistema. Si
bien el costo de producción de los DH depende
directamente del método elegido y la eficiencia
lograda, la aplicación de esta metodología al
mejoramiento vegetal se vislumbra más bien
como una herramienta complementaria al me-
joramiento tradicional, y que de ningún modo
intentaría reemplazarlo.

III. CAPÍTULO 2 dades y el otorgamiento de nuevas patentes.
En la actualidad se dispone de patrones mo-
leculares varietales para una extensa lista de
Aplicaciones de los marcadores especies. Frecuentemente, un grupo de loci
moleculares polimórficos de un marcador molecular, tales
como microsatélites o AFLPs (Amplified Frag-
Alicia Carrera; Gabriela Tranquilli; ment Length Polymorphism) es suficiente para
Antonio Garayalde; Marcelo Helguera generar un perfil molecular de identificación, o
“huella dactilar” de ADN, única para cada cul-
Los marcadores moleculares, herramientas tivar. Como ejemplo, podemos mencionar al
básicas de la biotecnología vegetal descriptas trigo pan (Triticum aestivum L.) para el que se
en Parte I Capítulo 5 de este libro, se utilizan desarrolló una Matriz de Identificación Varietal
en la actualidad en numerosas áreas relacio- en base a marcadores microsatélites de ADN,
nadas con el mejoramiento vegetal y el análisis que permite la individualización de las distintas
de la biodiversidad. A continuación se descri- variedades argentinas. Por otro lado, a partir
ben algunas de esas aplicaciones. Cada uno de datos moleculares es posible obtener dis-
de estos campos posee una base teórica en tintos índices de similitud o distancia genética
ocasiones compleja y muchos de ellos requie- y generar dendrogramas que ponen en eviden-
ren del uso de programas de estadística avan- cia las relaciones entre los materiales. Esta in-
zada. De este modo, el presente capítulo debe formación puede ser altamente valiosa en caso
ser considerado como una introducción a los de litigios por derechos de obtención. Para
temas presentados. más detalles sobre identificación de genotipos
se recomienda la lectura de Parte III, Capítulos
Identificación de genotipos – Pureza 4 y 5 de este libro.
varietal La pureza varietal es uno de los principales
El control de la pureza varietal y la discrimi- requisitos de la semilla comercial. En la produc-
nación de variedades protegidas requieren de ción de semilla híbrida la heterogenidad intra-
una adecuada identificación de los materiales. lote puede originarse por falta de uniformidad
Esta identificación se ha basado tradicional- en las líneas parentales, polinización cruzada
mente en el uso de caracteres morfológicos y espontánea o mezcla de semillas durante la
fisiológicos. Desafortunadamente, la utilización siembra, cosecha o embolsado. Los individuos
de recursos genéticos de origen común en di- fuera de tipo pueden identificarse mediante el
patrón molecular. Del mismo modo, pueden
ferentes programas de mejoramiento ha redu-
establecerse las relaciones de descendencia
cido la eficiencia de discriminación por marca-
entre una serie de líneas parentales y sus híbri-
dores fenotípicos (descriptores), que si bien
dos. Asimismo, la caracterización molecular de
son importantes, presentan limitaciones (bajo
líneas puras permite conocer el nivel de varia-
polimorfismo, influencia ambiental, dependen-
bilidad genética presente en la colección, con-
cia del estadio de desarrollo de planta, etc.).
firmar homocigocis, precisar la identificación y
Como alternativa para resolver este problema, asistir en la planificación de los cruzamientos
los marcadores moleculares resultan de gran destinados a producir híbridos de característi-
utilidad por su número virtualmente ilimitado cas superiores.
y por su habilidad para explorar variabilidad
genética a nivel del ADN. ISTA (International Bancos de germoplasma
Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour El proceso de selección para mejora y las
La Protection Des Obtenions Vegétales) son prácticas de la agricultura moderna han gene-
entidades internacionales que han distribuido rado una pérdida notable de diversidad en la
información para estandarizar los análisis de mayoría de las especies cultivadas. El reem-
laboratorio para la identificación de cultivares, plazo paulatino de las variedades primitivas
y para reglamentar la utilización de diferencias por los nuevos cultivares de indudables venta-
moleculares en la evaluación de homogenei- jas económicas ha producido una reducción en
dad intra-varietal, la discriminación de varie- el número de genotipos que se cultivan. La ero-

sión genética puede tener graves consecuen- datos integral que permite describir la variación
cias para el cultivo, principalmente en relación genética en colecciones de germoplasma.
con su vulnerabilidad sanitaria. Este proceso Veamos algunos ejemplos. En casos como
puede ser atenuado mediante la creación de el girasol (Helianthus annuus), originario de
bancos de germoplasma, que constituyen un Estados Unidos, el análisis de diversidad ha
componente vital de los programas de mejo- demostrado que el proceso de domesticación
ra. Las colecciones pueden mantenerse como ha reducido considerablemente la base gené-
bancos de semilla, a campo, in-vitro o criopre- tica de los materiales cultivados en relación a
servadas. Esta actividad se vuelve particular- las poblaciones silvestres. Por el contrario, en
mente relevante para el Continente Americano poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea eu-
y el Caribe, que constituyen los centros de ori- ropea), las formas cultivadas conservan gran
gen de cultivos importantes como maíz, poroto, parte de la variabilidad presente en las pobla-
cacao, papa, maní, pimiento, tomate, zapallo, ciones de los centros de origen en América y
además de numerosas medicinales, aromáti- Europa, respectivamente. La comparación en-
cas, frutales y forestales. tre los materiales silvestres y cultivados de una
Los recursos genéticos de una especie cul- especie permite además identificar los lugares
tivada comprenden: i) cultivares antiguos y de origen del cultivo, conocidos como centros
de reciente obtención; ii) poblaciones locales de domesticación. Una vez que los recursos
mantenidas por los productores, “landraces”; genéticos disponibles han sido caracterizados,
iii) poblaciones silvestres de la misma especie es posible decidir cuáles serían los cruzamien-
o formas maleza; iv) especies relacionadas. tos que más contribuirían a la expansión de la
Los marcadores moleculares permiten carac- base genética.
terizar accesiones cultivadas y silvestres, es- Aunque frecuentemente el proceso de do-
tudiar el proceso de domesticación, establecer mesticación involucra una pérdida importante
relaciones filogenéticas, y contribuir en la toma de diversidad que es revelada por marcadores
de decisiones para la elección de estrategias moleculares dispersos en el genoma, los cam-
de conservación. El procedimiento consiste bá- bios más significativos en el paso de formas sil-
sicamente en analizar los materiales median- vestres a cultivadas pueden ser explicados por
te marcadores proteicos o de ADN, y calcular unos pocos genes. Por ejemplo, Dubcovsky y
medidas de diversidad (nivel de polimorfismo, Dvorak (2007) describen un fenómeno llamado
riqueza alélica, presencia de alelos únicos) y síndrome de domesticación, que es mayorita-
de similitud genética. Esta información luego riamente adjudicado a genes que controlan la
se integra a datos geográficos (procedencia de arquitectura morfológica de la espiga y el me-
las accesiones, distribución), pedigrí, taxono- canismo de dispersión de las semillas. Uno de
mía y variabilidad en caracteres morfológicos, ellos es el gen Br (brittle raquis) que determi-
fenológicos, fisiológicos, etc. na un raquis quebradizo (ancestral) o firme de
Una gran parte de los polimorfismos molecula espiga; otro es el gen Tg (tenacious glume)
lares se encuentra en regiones no codificantes que determina glumas firmemente adheridas al
del genoma, carece de expresión fenotípica y grano (ancestral) o granos desnudos y el terce-
es selectivamente neutra. En contraste, los ge- ro es el gen Q, que gobierna el libre desgrane
nes que codifican los rasgos morfológicos y/o de la semilla madura y la forma cuadrada de la
agronómicos poseen un fuerte efecto fenotí- espiga. El alelo q produce una espiga piramidal
pico y han estado sometidos a intensas prede raquis elongado (espeltoide) cuyas semillas
siones de selección en las distintas etapas del no se desgranan fácilmente al madurar. La es-
mejoramiento. Por lo tanto, estos caracteres piga del trigo moderno es la resultante de la
representan grupos de genes sometidos a dife- combinación de los alelos br (raquis firme), tg
rentes fuerzas de cambio a lo largo del proceso (grano desnudo) y Q, que generan una espiga
de domesticación. Los marcadores molecula- cuadrada, que permite el libre desgrane de la
res combinados con datos morfológicos, agro- semilla madura desnuda, facilitándose enor-
nómicos y de origen, conforman una base de memente la cosecha del grano.

Desde el punto de vista del mejoramiento, mente importantes, en comparación con los
la información generada por los marcadores mapas obtenidos mediante el uso de marca-
resulta de inmediata aplicación en los proce- dores morfológicos o isoenzimáticos. Conse-
sos de acopio (dónde colectar, qué intercam- cuentemente, cuanto mayor sea el número de
bios realizar), conservación (identificación de marcadores incorporados a un mapa genético
duplicados en las colecciones, monitoreo de mayor será su capacidad de resolución y utili-
los cambios en la composición genética que dad como marco de referencia para incorporar
puedan ocurrir durante la multiplicación o con- genes asociados a características de interés
servación de los materiales), caracterización económico.
(diversidad genética de la colección) y distribu- Para incorporar un carácter de interés agro-
ción eficiente de los recursos genéticos hacia nómico en un mapa genético es necesario
los usuarios. cumplir con las siguientes etapas:
1. Desarrollar una población segregante
Mapas Genéticos para el carácter agronómico en cuestión.
Un mapa genético de una especie animal o 2. Caracterizar la población segregante
vegetal muestra la distribución lineal de mar- utilizando marcadores moleculares poli-
cadores en cada uno de los cromosomas que mórficos (con diferencias en la secuen-
constituyen el genoma de un organismo. Este cia de ADN entre los parentales). Para
mapa esta basado en el concepto clásico de construir un mapa mínimo es deseable
ligamiento: si dos o más genes o marcadores disponer de al menos cuatro marcadores
están físicamente cercanos sobre el mismo cro- moleculares por cada cromosoma del
mosoma, sus alelos se transmiten usualmente genoma en estudio.
juntos a través de la meiosis. Las proporciones 3. Evaluar fenotípicamente el carácter agro-
en que estos genes segregan en una pobla- nómico sobre los individuos de la pobla-
ción se apartan de las esperadas bajo la ley de ción segregante. Este punto es crucial,
segregación independiente. La mayor parte de ya que si la evaluación del carácter en
los gametos contendrán las mismas combina- la población de mapeo no es precisa, el
ciones alélicas que los padres; sólo aquellos mapeo del carácter será erróneo o irrea-
meiocitos que experimenten un intercambio lizable.
entre cromátides no hermanas o crossover ge- 4. Identificar marcadores ligados al carácter
nerarán gametos con combinaciones alélicas agronómico en cuestión (co-segregación
diferentes de las parentales (recombinantes). entre fenotipo del carácter y fenotipo del
El fundamento del mapeo genético reside en marcador). Para esta instancia, al igual
la relación entre la frecuencia de recombina- que para la construcción del mapa ge-
ción y la distancia física entre los loci. La fre- nético, se pueden utilizar herramientas
cuencia de recombinación entre dos genes se informáticas específicas tales como los
convierte en una estimación de la distancia de programas Mapmaker, MapmakerQTL,
mapa que los separa. La unidad de medida de Genemap, etc.
los mapas genéticos es el "centimorgan" (cM),
que es una medida de la cantidad de eventos Cuanto mayor sea la distancia genética en-
de recombinación entre marcadores, ocurridos tre los parentales que darán origen a la pobla-
en una población segregante (de mapeo). Para ción de mapeo, mayor será la probabilidad de
más detalles sobre construcción de mapas ge- detectar marcadores polimórficos, que es un
néticos se recomienda la lectura del Capítulo 6, punto crítico para identificar marcadores liga-
Parte I de este libro. dos al carácter en estudio.
El aporte de los marcadores moleculares en En el contexto del mejoramiento vegetal los
la construcción de mapas genéticos es fun- mapas genéticos posibilitan:
damental, ya que han permitido incrementar • La cobertura y análisis de genomas com-
la probabilidad de identificar regiones cromo- pletos.
sómicas que determinan rasgos agronómica- • La localización de regiones genómicas

que controlan caracteres de importancia de individuos con características ventajosas.
agronómica o industrial. La selección asistida por marcadores (MAS)
• La cuantificación del efecto de estas rees un proceso de selección indirecta basado
giones en la característica estudiada. en la existencia de co-segregación entre mar-
• La descomposición de caracteres gené- cadores y un gen determinado. Su eficiencia
ticos complejos (QTLs) en componentes depende de la distancia entre el marcador y el
mendelianos. gen, y de la contribución de ese gen al fenoti-
po. En términos amplios, el marco de aplica-
En los últimos años ha comenzado a usarse ción que brindan los marcadores moleculares
una nueva estrategia de mapeo denominada comprende la introducción y seguimiento de
mapeo por asociación, que utiliza el concep- genes o QTLs (Quantitative Trait Locus) de in-
to de desequilibrio de ligamiento (LD), definido terés, así como la agilización del proceso de
como la asociación no al azar de alelos de dife- recuperación de homocigosis en fondos gené-
rentes loci. La hipótesis de base considera que ticos particulares. En el primer caso, la estra-
en poblaciones grandes, con apareamientos al tegia se basa en focalizar el análisis sobre el
azar (panmixis), con los loci segregando inde- gen de interés en una población segregante
pendientemente y en ausencia de selección, mediante el uso de marcadores previamente
mutación, o migración, los loci polimórficos desarrollados sobre porciones de secuencias
están en equilibrio: la frecuencia de un cierto de dicho gen, o con marcadores localizados en
haplotipo depende del producto de las frecuen- las regiones adyacentes que se encuentren li-
cias alélicas en cada locus. En este caso el LD gados al carácter en cuestión. El segundo caso
será cero. La existencia de ligamiento físico tiene que ver con que la transferencia de genes
aumenta los niveles de LD, aunque procesos de interés se realiza comúnmente mediante
de selección y migración generan igualmente cruzas amplias, que requieren luego del cruza-
valores de LD distinto de cero. Una ventaja im- miento inicial, una serie de retrocruzas hacia el
portante de este método es que puede pres- parental elite o recurrente. El producto final es
cindir de poblaciones de mapeo clásicas, tales un material que posee el fondo genético origi-
como F2 o RILs (Recombinant Inbred Lines) nal con la nueva característica incorporada. En
pudiendo utilizarse la variación en poblaciones este caso, la estrategia se basa en un análisis
naturales de una especie o colecciones de cul- más amplio de la población segregante, ya que
tivares, producto del mejoramiento. Este en- el uso de marcadores no sólo se aplicará para
foque aprovecha la historia de recombinación la identificación del gen asociado a la caracte-
natural de la especie y los procesos ocurridos rística de interés, sino que también se carac-
de selección, lo cual incrementa el grado de terizarán otras regiones del genomas, a fin de
asociación entre los marcadores y el carácter identificar aquéllas que provengan del parental
de interés. elite. Las herramientas moleculares permiten
Si un marcador resulta estar asociado a un acelerar este proceso, dado que poseen alta
gen que controla un carácter de interés agro- densidad y cubren en forma uniforme el geno-
nómico, la selección de este marcador resulta ma.
en la selección indirecta del gen de interés. La Con relación al seguimiento de genes de in-
comparación de mapas genéticos entre espe- terés, un argumento frecuentemente utilizado
cies genera información básica sobre la estruc- en contra de la selección asistida por marca-
tura y evolución de los genomas. Por otro lado dores es que el mejoramiento de caracteres
un mapa genético constituye el punto de parti- de herencia simple no precisa de marcadores
da para proyectos de clonado de genes. para selección si los fenotipos son fácilmente
identificables. Si bien esto es correcto, aún en
Selección asistida por marcadores estos casos, la utilización de marcadores mo-
El desarrollo de múltiples técnicas molecu- leculares en un programa de mejoramiento
lares ha facilitado el análisis genético de ca- puede representar una ventaja importante, y
racteres de interés agronómico y la selección es que la selección se independiza del fenotipo

y el ambiente. Estas características permiten sarrollado para el gen Pinb-D1 de trigo. Este
identificar rápidamente genotipos únicos en gen codifica una de las proteínas relacionadas
poblaciones segregantes e incorporar varios con textura de grano y se ha demostrado que
genes de interés en un fondo genético, pro- el cambio de un aminoácido (glicina a serina)
ceso también denominado "piramidización" o da origen a una variante alélica cuyo fenotipo
"apilamiento" de genes. es un grano con textura dura. Tanquilli y col.
Por lo descripto anteriormente, puede de- (1999) desarrollaron un marcador que detecta
cirse que la utilidad potencial de los marca- dicha mutación en cualquier población segre-
dores moleculares en el proceso de mejora- gante que sea polimórfica para el gen Pinb-D1
miento genético es alta. Sin embargo, factores y es de gran utilidad para el mejoramiento de
de orden técnico y/o económico han limitado trigos blandos (figura 1). Desafortunadamente,
su adopción. Dentro de los primeros, corres- la disponibilidad de marcadores funcionales se
ponde mencionar la disponibilidad de marca- ve restringida por el limitado número de genes
dores moleculares que permitan, por un lado, caracterizados molecularmente que controlan
mejorar la cobertura del genoma en cuestión, caracteres agronómicos. Sin duda, la disponi-
y por otro lado, que resulten factibles de ser bilidad de marcadores funcionales aumentará
implementados bajo procesos automatizados, progresivamente a partir del conocimiento ge-
tales como extracción de ADN o reacciones de nerado de los proyectos de genómica en espe-
amplificación a gran escala. En este sentido, cies modelo (Arabidopsis, arroz) así como del
es importante destacar que cada vez es mayor número creciente de secuencias codificantes
la cantidad y variedad de marcadores molecu- mapeadas y caracterizadas.
lares desarrollados para cultivos de importan- Dentro de los factores de índole económico,
cia económica. Por otro lado, la implementa- la principal limitante en la adopción generali-
ción de un marcador para la selección de un zada de esta tecnología ha sido la relación en-
carácter agronómico en un programa de me- tre el costo del dato molecular (data point) y el
joramiento requiere de una serie de estudios valor comercial de la semilla mejorada. En los
previos relacionados con: (1) material a utilizar programas de mejoramiento de aquellas es-
(variedades, poblaciones F2, retrocuzas, líneas pecies donde el material de cultivo es híbrido,
avanzadas, etc.), (2) condiciones óptimas de la en general se observa mayor uso de selección
reacción de PCR –Polymerase Chain Reac- asistida por marcadores moleculares. Es espe-
tion- (número de ciclos de PCR, temperatura y rable que esta limitante se vaya superando con
extensión de cada ciclo, concentración de los el tiempo por el permanente avance tecnoló-
componentes que conforman la reacción de gico. En este sentido el amplio desarrollo de
PCR, etc.), (3) detección del marcador (geles marcadores basados en amplificiación (SSRs
de agarosa, acrilamida, secuenciado, etc.), (4) –Simple Sequence Repeats-, SNPs –Single
tipo de información a obtener (marcador domi- Nucleotide Polymorphisms-) ha permitido sim-
nante o codominante), (5) posibilidad de even- plificar las metodologías a aplicar, en com-
tos de recombinación entre marcador y carác- paración con aquellos marcadores basados
ter, etc., proceso que se denomina validación. en hibridación (RFLPs –Restriction Fragment
Desde el punto de vista del mejoramiento, Length Polymorphism-, por ejemplo), reducien-
sin dudas el mejor marcador es aquel que de- do costos y también aumentando la eficiencia
tecta sitios polimórficos que estando dentro del en el proceso de selección.
gen son los determinantes de la variación feno- Para mas detalles sobre selección asistida
típica observada. Estos marcadores, también por marcadores se recomienda la lectura de
llamados de diagnóstico o funcionales, pueden Parte III, Capítulo 3 de este libro.
ser usados en forma confiable en poblaciones
en las que no se hayan mapeado previamen- Mapas comparativos
te, sin correr el riesgo de que la información El tamaño del genoma de plantas es muy
de interés se pierda por recombinación. Como variable entre especies, y gran parte de esa
ejemplo podemos mencionar un marcador de- diferencia está dada por secuencias de ADN

A
5'- AAACAACATTGAAAAC ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA GCT CTC CTT GCT CTT
GTA GCG AGC ACA ACC TTC GCG CAA TAC TCA GAA GTT GGC GGC TGG TAC AAT
GAA GTT GGC GGA GGA GGT GGT TCT CAA CAA TGT CCG CAG GAG CGG CCG AAG
CTA AGC TCT TGC AAG GAT TAC GTG ATG GAG CGA TGT TTC ACA ATG AAG GAT
Gly
TTT CCA GTC ACC TGG CCC ACA AAA TGG TGG AA G GGC GGC TGT GAG CAT GAG
AAG AGC GGC
Ser
GTT CGG GAG AAG TGC TGC AAG CAG CTG AGC CAG ATA GCA CCA CAA TGT CGC
TGT GAT TCT ATC CGG CGA GTG ATC CAA GGC AGG CTC GGT GGC TTC TTG GGC
ATT TGG CGA GGT GAG GTA TTC AAA CAA CTT CAG AGG GCC CAG AGC CTC CCC
TCA AAG TGC AAC ATG GGC GCC GAC TGC AAG TTC CCT AGT GGC TAT TAC TGG
TGA TGATATAGCCTC
TATTCGTGCCAATAAAATGTCACATATCATAGCAAGTGGCAAATAAGAGTGCTGAGTGATGATCTATGAA
TAAAATCACCCTTGTATATTGATCTGTGTTCGAGAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3’
B
1 2 3 4 5 6 M
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
Figura 1. (A) Secuencia nucleotídica del gen pinb-D1, mostrando el cambio de aminoácido Glicina → Seri-
na (Gly → Ser) resultante de la mutación de la base guanina (G) a adenosina (A) que diferencia a los alelos
asociados a texturas blandas y duras, respectivamente. Con un recuadro se indican las zonas donde hibri-
dan los primers, y en negritas y subrayado las bases que forman el sitio de restricción de BsrBI (GAGCGG/
CCGCTC) presente en el alelo asociado a textura dura en grano de trigo. (B) Fotografía de electroforesis
en gel de agarosa 2% de productos de PCR amplificados con primers señalados en figura anterior dige-
ridos con la enzima de restricción BsrBI. En calles 1, 4 y 6 patrón del alelo de pinb-D1 asociado a textura
blanda; en calles 2, 3 y 5, patrón del alelo de pinb-D1 asociado a textura dura.

repetitivo, que difiere entre especies (especie- completamente secuenciados, tales como Ara-
específico). Contrastando con esta situación, bidopsis y arroz (Arabidopsis Genome Initiati-
los genes tienden a ser altamente conservados ve, 2000; International Rice Genome Sequen-
a nivel de secuencia de ADN y esta caracte- cing Project, 2005), a especies con genomas
rística permite utilizar los genes como sondas más complejos tales como trigo, cebada, ave-
para identificar secuencias de genes ortólogos na, etc. Este ha sido tal vez el objetivo principal
(genes con funciones similares, presentes en para impulsar el desarrollo de estos mapas.
diferentes especies, que derivan de una se- Las notables similitudes observadas entre ge-
cuencia ancestral). A partir de esta información nomas fue la base sobre la que se postuló el
(presencia/ausencia de genes ortólogos) se uso de especies modelo, a partir de las cua-
construyen los denominados mapas compa- les estudiar y avanzar en el conocimiento de
rativos. En general, al comparar mapas gené- genomas más complejos. Asimismo, partiendo
ticos de dos especies emparentadas, se han del supuesto de que los genes que gobiernan
detectado regiones cromosómicas donde los aspectos fundamentales de la biología vegetal
genes mantienen el orden y las relaciones de muy probablemente están conservados entre
ligamiento, fenómeno conocido como colineari- distintas especies, y el hecho que la variación
dad o sintenia. Esta sintenia se va perdiendo a en el tamaño de los genomas de especies re-
medida que se comparan especies más aleja- lacionadas se debe fundamentalmente a varia-
das filogenéticamente. Ejemplos de genomas ción en la cantidad de ADN no codificante y no
con regiones colineares se han observado en a una variación en el número de genes, la idea
grupos de especies pertenecientes a la fami- de llegar a la identificación, clonado y caracteri-
lia Solanaceae (tomate, papa, pimiento), entre zación de genes en las especies modelo se ha
Arabidopsis sp. y cultivos del género Brassica, visto fortalecida. De este modo la información
y también dentro de las gramíneas entre es- generada podría hacerse extensiva a una am-
pecies pertenecientes a la tribu Triticeae (trigo, plia gama de especies, incluyendo las cultiva-
cebada, centeno) así como entre especies per- das. En este sentido, la información molecular
tenecientes a distintas subfamilias taxonómi- proveniente de los genomas de Arabidopsis y
cas, tal el caso de arroz, maíz y sorgo. arroz ha sido clave para clonar genes de inte-
La utilidad de los mapas comparativos pue- rés agronómico en especies de genomas com-
de apreciarse desde distintos puntos de vista. plejos como el trigo, como por ejemplo, Vrn-1,
Por un lado, aportan información valiosa para Vrn-2, Q, Ph1, Ppd-D1, Lr10, etc.
detectar cambios producidos en la estructura
cromosómica, que ocurrieron durante el pro- Clonado posicional
ceso evolutivo, ya que cuando se comparan la El clonado posicional consiste en el aisla-
posición y el número de loci entre los mapas de miento de un gen responsable de un carác-
dos especies se hace evidente la ocurrencia de ter particular a partir del conocimiento de su
rearreglos como inversiones, translocaciones localización en el genoma. El proceso utiliza
y duplicaciones. En otros casos se ha podido información genética (modo de herencia del
detectar la ocurrencia de eventos de poliploi- carácter y ubicación del gen/es en una región
dización muy antiguos. Por ejemplo, el maíz específica de un mapa), molecular (secuencia
presenta un comportamiento meiótico que co- nucleotídica de aquellos genes presentes en la
rresponde al de una especie diploide típica. Sin región cromosómica asociada con el carácter),
embargo, el mapa molecular muestra que nu- y de función o expresión de los genes.
merosos loci RFLP de arroz están presentes El primer paso para lograr esto es seleccio-
dos veces en el genoma de maíz por lo que nar parentales que sean contrastantes para
actualmente se considera que el maíz descien- el carácter vinculado al gen en cuestión, por
de de un poliploide ancestral. ejemplo, una variedad de trigo susceptible y
Por otro lado, los mapas comparativos posi- otra resistente a la roya de la hoja. Una vez
bilitan la transferencia de información molecu- seleccionados los parentales se desarrolla una
lar de especies modelo con genomas simples, población segregante, la más sencilla es una

F2, a partir de la cual se construye un mapa cleotídica) que se ha iniciado desde cada mar-
genético utilizando marcadores moleculares, cador flanqueante forme un continuo o "contig"
y sobre este marco se identifican las regiones de fragmentos de ADN genómico de trigo. Este
cromosómicas asociadas al control de dicha contig contiene la secuencia del gen en estu-
resistencia. dio. El paso siguiente consiste en la secuen-
Una vez identificada dicha región, para ciación del contig. A partir de esta información,
avanzar hacia el clonado posicional, es nece- y por análisis de secuencia con herramientas
sario mejorar el grado de resolución del mapa bioinformáticas, se determinan los genes pre-
en esa zona. Esto se logra saturando dicha sentes y aquellos posibles candidatos del ca-
región con nuevos marcadores moleculares e rácter en estudio. La prueba definitiva para es-
incrementando el número de individuos de la tablecer el hallazgo del gen en cuestión es la
población, a fin aumentar las posibilidades de prueba de complementación. Esto consiste en
encontrar recombinantes entre marcadores es- transformar una planta que carece del carác-
trechamente ligados. El objetivo es reducir el ter en estudio (siguiendo con el ejemplo, una
intervalo del genoma analizado al fragmento variedad de trigo susceptible) con cada uno de
mínimo posible que contenga al gen de interés. los genes candidatos y determinar cual de ellos
Muchos de estos marcadores pueden obtener- le confiere el carácter (en este caso resistencia
se del mapeo comparativo en regiones cromo- al patógeno).
sómicas ortólogas de especies emparentadas A partir de la secuenciación completa del ge-
con genomas menos complejos. En el caso de noma de arroz es posible obtener una primera
trigo, serían arroz, cebada, sorgo, Triticum mo- estimación de los genes presentes en nuestro
nococcum, Triticum tauschii, etc. contig, con algunas salvedades, como son la
Una vez reducido al mínimo el intervalo de presencia de genes específicos de arroz (que
genoma portador del gen de interés, el paso no estarán en el contig de trigo) y trigo (que
siguiente es obtener la secuencia nucleotídica no estarán en el genoma de arroz), ruptura de
del mismo. Una forma de hacerlo es mediante la colinearidad de genes entre genomas por
una caminata cromosómica, para lo cual es ne- rearreglos cromosómicos, etc. Como ejemplo,
cesario contar con un mapa físico (secuencia en el clonado posicional del gen Vrn-1 en Triti-
nucleotídica) de la región. Para el ejemplo que cum monococcum se utilizó una población de
estamos considerando, la caminata se inicia 3095 individuos F2, para llegar a delimitar un
seleccionando de una "biblioteca" del genoma intervalo de 0,04 cM en el cromosoma 5Am que
de trigo (BAC library) aquellos clones (tomos) contenía dos genes candidatos. Posteriormen-
que hibriden con los marcadores que flan- te, mediante estudios de expresión de estos
quean al intervalo portador del gen. Los clones genes se observó que sólo uno de ellos (Ap-
seleccionados en la hibridación contra la bi- 1) presentaba un patrón de expresión idéntico
blioteca son digeridos con enzimas de restric- al gen Vrn-1. Para llegar a esto se trabajó con
ción para identificar en cada caso fragmentos marcadores provenientes de las bibliotecas de
compartidos y no compartidos. Se estima que los genomas de cebada, sorgo, arroz y Triticum
los clones seleccionados con un mismo mar- monococcum (figura 2).
cador deben tener en común al menos un frag-
mento de digestión (el fragmento que posee la Distribución de la variabilidad genética
secuencia del marcador). Los fragmentos no en poblaciones naturales y conservación
compartidos corresponden a los extremos de Las especies están constituidas por unidades
estos clones parcialmente solapados entre sí. o demos más o menos aislados denominados
Estos extremos se utilizan como nuevos mar- poblaciones. Una especie vegetal raramente
cadores para extender la caminata cromosó- se extiende en forma continua e ininterrumpida.
mica hacia el gen, reiniciando la búsqueda de En general adopta una distribución en parches.
clones en la biblioteca genómica. Este proceso El número de individuos en cada población, el
se hace simultáneamente en ambos sentidos, modo reproductivo (autogamia-alogamia), las
hasta lograr que el mapa físico (secuencia nu- distancias inter-demos, el tipo de polinización

(gravedad-anemófila-entomófila), la acción del estimados: P de la misma manera que para
hombre en la fragmentación del hábitat y el ori- marcadores codominantes; A es dos, por de-
gen (especies nativas-especies introducidas) finición; sólo es posible calcular He a partir de
determinan en conjunto una distribución de la las frecuencias alélicas estimadas, asumien-
variación genética propia de cada especie. do equilibrio. Entonces q = q 2 donde q es
Los programas de conservación utilizan a la frecuencia del alelo a y q2 la frecuencia de
menudo información acerca de la distribución individuos con ausencia de banda; luego p =
de la variación genética para establecer prio- 1 –q siendo p la frecuencia del alelo A. Con
ridades y estrategias de manejo. Las variacio- estos datos, para calcular la He se procede de
nes dentro y entre poblaciones colaboran en la misma manera que para marcadores codo-
la definición de las unidades a conservar y se minantes.
convierten en elementos importantes para la El estudio de variabilidad con marcadores
toma de decisiones relacionadas con la protec- dominantes no permite determinar si una po-
ción de la biodiversidad. Es deseable que las blación está o no en equilibrio de Hardy Wein-
poblaciones seleccionadas para formar parte berg. Las diferencias genéticas entre pobla-
de las áreas protegidas, contengan la mayor ciones pueden igualmente ser estimadas con
diversidad genética posible de modo de asegu- métodos que no utilizan frecuencias alélicas y
rar el mayor potencial evolutivo. que por lo tanto no asumen equilibrio. Uno de
A partir de marcadores codominantes como estos métodos se basa en el cálculo de dis-
tancias binarias entre pares de individuos, que
las isoenzimas y microsatélites, pueden obte-
consideran la proporción de bandas comparti-
nerse parámetros de diversidad: P, número de
das. El paso siguiente comprende un análisis
loci polimórficos/número total de loci analiza-
de la varianza molecular (AMOVA) que permite
dos; A, número promedio de alelos por locus;
particionar esta varianza en sus componentes
Ho, heterocigocidad observada; y He, hetero-
dentro y entre poblaciones a diferentes nive-
cigocidad esperada (1- Σpi2, pi: frecuencia alé-
les. El programa GenAlEx disponible en http://
lica del alelo i). Dado que los genotipos homo
www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/, permite rea-
y heterocigotos pueden ser reconocidos, es
lizar AMOVA y otros análisis de variabilidad,
posible probar si la población se encuentra en
distancia genética y correlaciones a partir de
equilibrio de Hardy Weinberg. Con los datos de
datos moleculares. Posee un sólido soporte
frecuencias alélicas disponibles se calculan ín- teórico, es de acceso libre y de fácil manejo
dices tales como Nei, Rogers, o Prevosti y se dado que se agrega a la barra de herramientas
construyen matrices de distancia genética (D), Office Excel.
a partir de las cuales es posible realizar análi- El siguiente es un ejemplo simplificado de
sis de agrupamientos que permiten visualizar uso de este programa.
las semejanzas o diferencias genéticas entre
poblaciones. Paso 1) Confección de la tabla de datos en
En el caso de marcadores dominantes como formato para GenAlEx conteniendo registro de
los RAPD (Random Amplification of Polymor- marcadores RAPD de dos poblaciones vege-
phic DNA) o AFLP (Amplified Fragment Leng- tales.
th Polymorphism) el genotipo heterocigoto no
puede ser reconocido y se asume para una - Número de loci RAPD: 11 (A1)
especie diploide que cada banda corresponde - Número de individuos totales: 10 (B1)
a un locus con dos alelos, A y a. El homoci- - Número de poblaciones: 2 (C1)
goto dominante (AA) y el heterocigoto (Aa) - Número de individuos de la población A: 5
corresponden a la presencia de la banda y la (D1)
ausencia corresponde al homocigoto recesivo - Número de individuos de la población B: 5
(aa). Los parámetros de diversidad pueden ser ((E1)

A B C D E F G H I J K L M N
1 11 10 2 5 5
2
3 ind pob P2 240 P2 260 P2 330 P2 400 P2 440 P6 520 P6 550 P6 590 P6 650 P6 660 P6 800
4 1 A 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1
5 2 A 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
6 3 A 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1
7 4 A 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1
8 5 A 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1
9 6 B 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0
10 7 B 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1
11 8 B 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0
12 9 B 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1
13 10 B 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1
14
Paso 2) Cálculo de las distancias binarias entre individuos.

GenAlEx ⇒ Distance ⇒ Genetic (binary) ⇒ OK
A B D C E F G H I J K L
1 1 10 2 5 5 1 10
2 Hoja1 Binary D Pop1 Pop2
3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4 0 1
5 3 0 2
6 3 2 0 3
7 2 1 3 0 4
8 3 2 0 3 0 5
9 5 4 6 5 6 0 6
10 5 2 4 3 4 2 0 7
11 4 1 3 2 3 3 3 0 8
12 2 1 3 2 3 3 3 2 0 9
13 5 2 4 3 4 2 0 3 3 0 10
14
Paso 3) A partir de la matriz de distancia se realiza el análisis de varianza molecular

GenAlEx ⇒ AMOVA (tri or square distance matrix; 999 permutations) ⇒ OK
Summary AMOVA Table
---------------------------------------------------
Percentages of Molecular Variance
Source df SS MS Est. Var. %
---------------------------------------------------
Among Pops Among Pops 1 4,00 4,00 0,57 33%
33% Within Pops 8 9,20 1,15 1,15 67%
Total 9 13,20 1,72 100%
---------------------------------------------------
Within Pops Stat Value P (rand >= data)
67% PhiPT 0,331 0,020
Del análisis se concluye que la diferenciación cuáles poblaciones formarán parte del progra-
molecular entre las poblaciones representa un ma de conservación podría basarse en consi-
33 % de la varianza total, y que esa diferencia deraciones exclusivamente prácticas ya que
es significativa (p= 0,02). las poblaciones son genéticamente equivalen-
La diversidad genética cuantificada por tes. Por el contrario, una especie compuesta
marcadores moleculares puede mostrar, por de poblaciones con niveles bajos de variabi-
ejemplo, que en una especie nativa de interés lidad en cada unidad pero con alto grado de
forestal todas las poblaciones presentan altos diferenciación entre poblaciones, requerirá que
niveles de variabilidad genética y son bastante los esfuerzos de protección sean dirigidos ha-
similares entre si. En este caso, la decisión de cia tantas poblaciones como sea posible, ya

que cada una de ellas posee una identidad especies y aún dentro de las poblaciones, con
genética diferente. Poblaciones de especies formas obligadas o facultativas. El estudio de
endémicas, con niveles de diversidad genética marcadores moleculares en diferentes plantas
extremadamente bajos y un reducido número de una población y su progenie ha contribuido
de individuos, son normalmente ingresadas a a determinar el tipo de reproducción de nume-
la categoría de especies en peligro de extin- rosas especies vegetales
ción.
En este punto, es importante recordar que Estimación del flujo génico
los marcadores moleculares representan va- El flujo génico entre poblaciones vegetales
riación genética esencialmente neutra, es decir ocurre mediante el movimiento de polen o de
se encuentran sometidos a la acción de fuer- semillas. La morfología de semilla y polen, los
zas evolutivas no selectivas tales como deriva mecanismos de dispersión, el tipo de poliniza-
o flujo génico. Las decisiones finales de un pro- ción, etc., hacen que la contribución de estas
grama de conservación deberían por lo tanto dos vías al flujo total varíe de acuerdo a la es-
combinar los datos obtenidos a partir de mar- pecie. Los marcadores moleculares permiten
cadores moleculares junto con la evaluación cuantificar cada uno de estos procesos. Si el
de ciertos rasgos morfológicos, fisiológicos o flujo génico se produce básicamente a través
reproductivos, que son críticos en el proceso de polen, los marcadores de ADN de organe-
de adaptación y supervivencia de las poblacio- las, como por ejemplo cloroplastos, no serán
nes en su hábitat. transferidos de una población a otra porque
Las malezas de mayor impacto en la agricul- este tipo de información es sólo heredada vía
tura mundial son en general especies introdu- materna. En contraste, si el flujo génico se rea-
cidas. En el nuevo territorio, libre de presiones liza principalmente a través de semillas, tanto
selectivas tales como especies competidoras los marcadores de herencia materna como los
o patógenos característicos del ecosistema de de herencia biparental o nuclear, serán trans-
origen, la especie introducida es capaz de es- mitidos entre poblaciones. Mediante el uso
tablecerse y colonizar todos los territorios que de marcadores altamente polimórficos como
reúnan determinadas condiciones ambienta- los microsatélites es posible determinar cuál
les. La caracterización genética de las pobla- ha sido la planta donadora del polen de cada
ciones de malezas puede aportar información semilla de una planta madre, por ejemplo en
de utilidad en los programas de control. Me- especies arbóreas. En este caso, por un lado
diante marcadores moleculares puede esta- se obtiene información acerca de la distancia
blecerse si las poblaciones actuales provienen de transporte de polen y además constituye un
de un solo evento de introducción, con unos test de “paternidad”.
pocos individuos iniciales o por el contrario, La estimación del flujo génico ha cobrado
ocurrieron múltiples eventos de introducción. especial relevancia en los estudios tendien-
Además, determinados marcadores informati- tes a evaluar el efecto sobre el ambiente de
vos pueden establecer con bastante precisión los materiales genéticamente modificados. De
cuál es el lugar de origen de las poblaciones inesta manera, es factible analizar la posibilidad
troducidas, y en este caso rastrear “enemigos de que poblaciones silvestres cercanas a las
naturales” que pudieran ser útiles en el control formas cultivadas, adquieran el transgén me-
biológico de la especie invasora. diante fecundación cruzada, generando cam-
El tipo de reproducción de una especie ve- bios en la dinámica poblacional, competitividad
getal determina en gran parte la distribución o relación con otros miembros de la comuni-
de variabilidad genética entre poblaciones. Los dad biótica tales como polinizadores, patóge-
mecanismos reproductivos pueden clasificarse nos, etc. Esta potencial transferencia de genes
en los tres tipos básicos: alogamia, autofecun- se torna preocupante cuando se trata de flu-
dación y apomixis. En realidad, existen combi- jo génico hacia poblaciones silvestres catalo-
naciones de estos tipos básicos, con porcen- gadas como malezas. En este escenario, los
tajes variables de cada uno de ellos según las marcadores moleculares de ADN o isoenzimas

constituyen herramientas muy útiles. Los indi- ser aplicado a diferentes especies pero la in-
viduos de una determinada población pueden terpretación de los datos parte de asumir que
ser analizados y comparados con su progenie, los productos de amplificación de igual tamaño
producto de una polinización libre. Los alelos son homólogos.
que no estaban presentes en la población ma- Uno de los métodos de análisis filogenéti-
terna son atribuidos al ingreso externo de polen co a partir de marcadores, consiste en calcu-
del cultivo. Evaluando poblaciones a distancias lar un índice de distancia genética en base al
crecientes desde una determinada fuente de número de bandas en común, y luego realizar
polen, el flujo génico puede ser cuantificado, y un análisis de agrupamiento (UPGMA) o árbol
cuando esta información se complementa con filogenético (Neighbour Joining), que refleje las
datos de compatibilidad sexual, polinizadores relaciones entre los taxa. Establecer cuál es el
y clima se arriba a una serie de conclusiones árbol correcto entre todos los posibles es una
que pueden aplicarse al cultivo en gran escala tarea difícil que en parte es resuelta median-
de variedades transgénicas. te el uso de métodos estadísticos, como téc-
Se trate de variedades transgénicas o no, los nicas de re-muestreo, que generan índices de
procesos de hibridación de formas cultivadas consistencia o confiabilidad para cada árbol.
y silvestres, alteran los niveles de diversidad Las relaciones establecidas de este modo se
genética de las poblaciones naturales, produ- cotejan luego en relación a las vías filogenéti-
ciendo una erosión de los recursos genéticos cas propuestas a partir de datos citogenéticos,
vegetales, con potencial aplicación en mejora. morfológicos, ecológicos, cruzamientos, etc.
Nuevamente la estimación del flujo génico y la Por otro lado, la comparación de mapas mo-
determinación de la variabilidad genética me- leculares entre especies ha permitido conocer
el tipo de reorganización genómica que ha
diante marcadores pueden contribuir a atenuar
operado durante el proceso de especiación.
los procesos de "homogenización" genética y
Cuando se compara el orden de los marcado-
dar tiempo a la evaluación de las poblaciones
res moleculares del girasol, Helianthus annuus,
naturales en cuanto a rasgos como resistencia
y especies relacionadas como H. petiolaris o H.
a enfermedades o parámetros de calidad.
argophyllus se observa que estas especies po-
seen zonas colineares y zonas no colineares,
Filogenia
originadas estas últimas en cambios estruc-
La filogenia intenta reconstruir las relaciones
turales. Cuando se incluyó en el mapeo com-
jerárquicas de descendencia entre especies o parativo a H. anomalus se pudo inferir que: i)
grupos de especies y utiliza esta información esta especie ha surgido por hibridación entre
como criterio de clasificación biológica. El co- H. annuus y H. petiolaris; ii) conserva el nú-
nocimiento de la filogenia y diversidad genéti- mero cromosómico de las especies parentales
ca de los recursos silvestres permite optimizar (especiación homoploide); iii) cambios en la
los procesos de hibridación con los materiales estructura cromosómica han sido un mecanis-
cultivados. Cultivos importantes como trigo, gi- mo importante en la evolución de las especies
rasol, tomate, poroto, o arroz cuentan con nu- anuales de Helianthus .
merosas especies o géneros silvestres relacio- Mediante marcadores es posible elucidar las
nados, con potencial uso en el mejoramiento especies parentales ancestrales de una espe-
genético mediante cruzamientos. cie alopoliploide, como el tabaco o el algodón.
Los marcadores moleculares han aportado Basta con examinar las variantes moleculares
nuevas formas de análisis para la resolución de las especies candidatas diploides y compa-
de incógnitas filogenéticas o taxonómicas. Los rarlas con las de la especie poliploide derivada.
marcadores RFLP son particularmente útiles El modo en que segrega un marcador codomi-
dado que están basados en reacciones de hi- nante en una progenie interespecífica, permite
bridización, lo que garantiza la homología de inferir el comportamiento disómico o polisómi-
los segmentos que se comparan entre los dico, lo que permite caracterizar una especie en
ferentes taxa. RAPDs no requiere un conoci- cuanto a su origen alo- o autopoliploide, res-
miento previo del genoma en estudio y puede pectivamente.

En la evolución del género Citrus ha operado Lecturas recomendadas
la hibridación natural a través de reproducción
sexual pero también están presentes mecanis- Andersen J. R., Lübberstedt T. 2003. Functional
mos apomícticos que constituyen barreras al markers in plants. Trends in Plant Science, 8,
intercambio de genes. La taxonomía de este 554-560.
grupo resulta particularmente compleja ya que Angiolillo A, Mencuccini M, Baldoni L. 1999. Olive
no puede ser aplicado el concepto biológico genetic diversity assessed using amplified frag-
de especie. Marcadores de ADN han permitido ment polymorphisms. Theor. Appl. Genet., 98,
esclarecer las relaciones de este polimórfico 411-421.
grupo que incluye naranjas, limones, limas y Arabidopsis Genome Initiative 2000. Analysis of the
mandarinas. genome sequence of the flowering plant Arabi-
Los estudios moleculares más recientes han dopsis thaliana. Nature, 408, 796–815.
colocado al tomate, previamente denominado Bagge M., Xia X., Lübberstedt T. 2007. Functional
Lycopersicon esculentum, dentro del género markers in wheat. Current Opinion in Plant Biol-
Solanum, cambiando su denominación por So- ogy, 10, 211-216.
lanum lycopersicon. Los estudios sobre ADN Buerkle C. A, Rieseberg L.H. 2008. The rate of ge-
de cloroplasto y la similitud de los mapas de nome stabilization in homoploid hybrid species.
ligamiento constituyen evidencias de que el to- Evolution, 62, 266-275.
mate y la papa comparten un antecesor común Carrera A, Pizarro G, Poverene M, Feingold S, Ber-
muy reciente. Esta información resulta de gran ry S, León A. 2002. Variability among inbred lines
aplicación en el mejoramiento de estos cultivos and RFLP mapping of sunflower isozymes. Ge-
así como en la comprensión de la evolución de netics and Molecular Biology, 25, 65-72.
los genomas. Devos K.M. and Gale M.D, 2000. Genome relation-
En los últimos años, ha tomado gran im- ships: The grass model in current research. The
portancia la filogenia basada en datos de se- Plant Cell, 12, 637-646.
cuencias de ADN, en la que cada base de un Dubcovsky J. and Dvorak J. 2007. Genome plastic-
grupo de secuencias alineadas, constituye un ity a key factor in the success of polyploid wheat
under domestication. Science, 316, 1862-1866.
carácter a comparar. La velocidad de cambio
Godt M, Hamrick J. 1998. Allozyme diversity in the
del ADN a lo largo del proceso evolutivo difie-
grasses. En: G.P. Cheplick (ed). Population biol-
re en las distintas porciones de un genoma,
ogy of grasses. Cambridge University Press. pp
encontrándose algunas secuencias altamente
1998-399.
conservadas y otras con elevadas tasas de
Huff DR, Peakall R, Smouse PE. 1993. RAPD varia-
sustitución. Si los taxones a comparar han di-
tion within and among natural populations of out-
vergido recientemente, será conveniente utili-
crossing buffalograss Buchloe dactyloides (Nutt)
zar secuencias altamente variables, que hayan
Engelm. Theoretical and Applied Genetics, 86,
experimentado suficientes cambios en cortos
927-934.
períodos de evolución. Por el contrario, si las
International Rice Genome Sequencing Project
especies a comparar llevan mayores tiempos
2005. The map-based sequence of the rice ge-
de divergencia (especies poco relacionadas)
nome. Nature, 436, 793-800.
deben utilizarse secuencias más estables, con Manifesto M.M., Schlatter A.R., Hopp H.E., Suárez
menores tasas de sustitución. Por otro lado, la E.Y., and Dubcovsky J. 2001. Quantitative eva-
existencia de genomas nucleares, mitocondria- luation of genetic diversity in wheat germplasm
les y plastídicos que evolucionan a tasas espe- using molecular markers, Crop Science, 41, 682-
cíficas, representan herramientas adicionales 690.
para estudiar las relaciones filogenéticas entre Moore G. 2001. Oranges and lemons: clues to
especies con distintos grados de parentesco. the taxonomy of Citrus from molecular markers.
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Natl. Acad Sci. USA, 100, 6263-6268.

III. CAPÍTULO 3 un programa que carece de variabilidad (σ2A →
0) no tendrá posibilidad de generar nuevos ge-
notipos por recombinación y selección por lo
Marcadores moleculares y
que su progreso genético se verá severamente
mejoramiento genético de disminuido (Gy → 0). Por otra parte, el progre-
cultivos so por selección es inversamente proporcional
al número de años que se tarda en completar
Carlos Sala; Mariano Bulos; Analia Fresco; un ciclo de selección (y) y al desvío fenotípico
Emiliano Altieri (σP). El desvío fenotípico refleja básicamente
el grado de interacción entre el genotipo y el
Introducción ambiente para expresar un dado fenotipo. En
El mejoramiento genético es un conjunto de otras palabras, es una medida de la correlación
principios científicos, métodos, técnicas y es- existente entre genotipo y fenotipo.
trategias aplicadas a la obtención de genotipos Consideremos un determinado carácter (por
o grupos de genotipos con características de- ejemplo, la resistencia a una enfermedad) el
seables según objetivos previamente defini- cual está gobernado por un solo gen con dos
dos. El proceso fundamental que subyace en alelos, el alelo de resistencia es incompleta-
el mejoramiento es el de cambio adaptativo por mente dominante, el patógeno está siempre
sustitución alélica bajo selección. La mutación, presente y las condiciones ambientales para
la hibridación interespecífica y la transgénesis que se produzca la infección son siempre fa-
pueden aportar nuevos caracteres a la diver- vorables. Por lo tanto, si se observa una planta
sidad de un cultivo, no obstante el proceso sin síntomas puede concluirse que la misma
fundamental, luego que tales caracteres son es homocigota para el alelo de resistencia. En
incorporados al germoplasma, no se modifica. forma similar, si se observa una planta muy
El mejoramiento genético es un proceso cí- afectada por la enfermedad se concluirá que
clico. En cada ciclo, se evalúan todos los in- la planta es homocigota para el alelo que con-
dividuos de una población determinada. Como fiere susceptibilidad, y todas las plantas que
resultado de esta evaluación, se seleccionan muestren fenotipos intermedios podrían consi-
los individuos deseables y los restantes son derarse heterocigotas. En este caso ideal, el
descartados. Finalmente, los individuos selec- fenotipo estaría indicando exactamente cuál
tos se cruzan entre sí (se recombinan) para dar es el genotipo de cada individuo, la correlación
origen a una nueva generación en que se reini- entre fenotipo y genotipo tendería a 1 y el des-
cia un nuevo ciclo. vío fenotípico tendería a cero. Bajo esas condi-
Un excelente medio para organizar una dis- ciones el progreso genético por elección sería
cusión en torno a cómo maximizar el progreso máximo. Lamentablemente, en la práctica este
genético y distribuir eficientemente los recursos tipo de ejemplo jamás ocurre. Los caracteres
dentro de un programa de mejoramiento es la de importancia económica no siempre están
ecuación de ganancia genética por selección: gobernados por un único gen, sino por varios,
y las relaciones de dominancia y de epistasis
Gy = k σ2A (interacción entre genes) suelen ser bastante
y σP complicadas. Asimismo, el patógeno puede o
no estar presente, y el ambiente puede o no
Esencialmente, esta ecuación indica que el ser favorable para el desarrollo de la enferme-
progreso genético de cualquier programa de dad. Por todas esas razones, la asociación en-
mejora (Gy) es directamente proporcional a la tre fenotipo y genotipo es en general escasa,
variabilidad heredable (σ2A) disponible y a la lo que hace que al evaluar individuos a través
intensidad de selección que se aplique (k). La de su fenotipo no se esté seleccionando el ge-
variabilidad genética disponible refleja el grado notipo adecuado y la recombinación incluirá
de diversidad de los materiales genéticos que muchas cruzas entre individuos que no portan
posee el programa de mejora. En el extremo, el/los gen/es deseados. El resultado es que el

incremento de los alelos favorables dentro de 1980 cuando se utilizaron algunos marcadores
la población se hace a tasas más lentas y, por isoenzimáticos para acelerar la introgresión de
ende, el progreso genético es mucho menor. caracteres monogénicos desde el germoplas-
La tecnología de marcadores moleculares se ma exótico hacia trasfondos cultivados. Pocos
puede aplicar para optimizar o hacer más efi- años después, Beckmann & Soller (1986) des-
ciente todos y cada uno de los factores deter- cribieron el uso de marcadores RFLPs (Res-
minantes de la ganancia genética o del progre- triction Fragment Length Polymorphism) en
so genético por selección. Así, los marcadores el mejoramiento de cultivos, incluyendo los
moleculares pueden utilizarse para: aspectos teóricos relacionados con las retro-
Organizar, mantener e incrementar la diver- cruzas asistidas por marcadores para el me-
sidad genética. De este modo se verá incre- joramiento de caracteres cualitativos. Lande &
mentado el numerador de la ecuación y, por Thompson (1990) fueron los primeros en con-
ende, el progreso genético. siderar los aspectos teóricos de la selección
Disminuir la interacción genotipo/ambiente. asistida por marcadores (MAS, por su acróni-
Si en lugar de seleccionar por el fenotipo se mo inglés) para los caracteres cuantitativos, y
seleccionara por el genotipo de cada individuo, catalizaron una serie de publicaciones de estu-
tendería a disminuir drásticamente el denomi- dios de simulación en la década del 90. Más re-
nador de la ecuación de ganancia genética, cientemente, se han publicado resultados de la
con el consiguiente incremento del progreso aplicación de MAS en programas de mejora y
por selección. Este tipo de selección se deno- algunas consideraciones teóricas adicionales,
mina “selección asistida por marcadores mo- incluyendo la optimización de los sistemas de
leculares” o, simplemente, “selección asistida”. retrocruzas asistidas por marcadores (MABC,
Disminuir el tiempo requerido para comple- por su acrónimo inglés); y las estrategias para
tar los ciclos de selección. Si para incorporar la piramidización o apilamiento de alelos favo-
un carácter dentro del germoplasma del cultivo rables en esquemas de selección recurrente.
se tarda usualmente 6 a 7 generaciones, los Todos estos estudios han contribuido a nues-
marcadores moleculares permiten acortar esos tro entendimiento de muchos aspectos básicos
plazos a 3 generaciones, por lo que el progreso a tener en cuenta al implementar MAS, tales
genético se verá incrementado. Adicionalmen- como el tipo de poblaciones, el tamaño de la
te, los marcadores permiten la introgresión de muestra, el tamaño genómico, y el número de
tales caracteres con un mínimo de incorpora- marcadores. Asimismo, hay varias revisiones
ción de genes provenientes del individuo da- que comparan el uso de distintos tipos de mar-
dor, garantizando de ese modo, que no se re- cadores en mejoramiento.
duzcan las medias poblacionales para aquellos La figura1 muestra los pasos para realizar
caracteres que no están relacionados con el selección utilizando marcadores moleculares
gen introducido. Este tipo de método de incor- microsatélites (si bien, cualquier otro tipo de
poración de variabilidad al germoplasma se de- marcador podría ser usado). Básicamente, de
nomina “retrocruzas asistidas por marcadores cada planta a evaluar se extrae su ADN, se
moleculares” o, simplemente, “conversiones”. amplifica el marcador que esté asociado al gen
A lo largo de este capítulo se analizarán con de interés utilizando la técnica de PCR (Poly-
mayor detalle los modos de implementación merase Chain Reaction), y el producto de am-
de los marcadores moleculares en todas estas plificación se somete a una corrida electroforé-
áreas lo que, en última instancia, contribuye a tica en geles para su observación. Se muestra
maximizar el progreso genético. un ejemplo de selección asistida para desarro-
llar resistencia a una enfermedad denominada
Selección asistida por marcadores “Mancha ojo de rana” producida por Cercospo-
moleculares ra sojina en soja. En el gel que se muestra a la
La aplicación de marcadores moleculares derecha del esquema pueden observarse los
en el mejoramiento de cultivos fue inicialmen- fragmentos de ADN obtenidos para un proge-
te propuesta al comienzo de la década de nitor resistente (R), un individuo susceptible (S)

a este fin dado que son técnicamente más la-
boriosos. En general, los marcadores basados
en PCR son los más indicados para este tipo
de aplicación. Por esta razón, en muchas opor-
tunidades se convierten marcadores RFLPs en
marcadores basados en PCR. Dentro de los
marcadores basados en PCR, los marcadores
multipunto (como los AFLPs –Amplified Frag-
ment Length Polymorphism-, RAPDs –Ramdon
Amplification of Polymorphic DNA- o ISSRs
–Inter Simple Sequence Repeats-) presentan
dos dificultades: son en general dominantes y
no es eficiente amplificar y leer múltiples frag-
mentos para detectar sólo el que nos interesa.
Esta última dificultad se resuelve diseñando
marcadores SCAR (Sequence Characterized
Figura 1. Etapas de la selección asistida por mar- Amplified Region) a partir del fragmento po-
cadores moleculares. Los individuos a evaluar son limórfico que está asociado al gen o carácter
muestreados y el material foliar es acondicionado de interés. De este modo, la amplificación del
de acuerdo al método que se utilice para la extrac- ADN con cebadores específicos produce patro-
ción del ADN. El ADN obtenido es utilizado como nes simples y de fácil lectura. Sin embargo, los
molde para realizar el proceso de amplificación por
SCARs son en general dominantes, lo que in-
PCR del marcador elegido. Los fragmentos obte-
volucra una dificultad adicional. Si el marcador
nidos para cada individuo son resueltos mediante
electroforesis. Los resultados son leídos e interpre- es codominante, como el que se muestra en
tados para decidir la selección de los individuos que el ejemplo de la figura1, se puede determinar
presenten el alelo de interés. Actualmente, una o inmediatamente si cada individuo resistente es
más etapas de este proceso pueden ser automa- homocigótico o heterocigótico para el gen en
tizadas. cuestión. Si, en cambio, el marcador fuese do-
minante, únicamente se podrían distinguir los
individuos portadores del gen de resistencia de
y varios descendientes de la primera retrocuza aquellos que no lo presentan. En esos casos,
con el padre resistente. Tales descendientes posteriormente se deberá determinar si cada
muestran el fragmento que indica la presencia individuo es o no homocigótico mediante aná-
del gen de resistencia, o bien, ambos fragmen- lisis de la descendencia de cada planta. Para
tos, lo que indica que son heterocigóticos para solucionar este inconveniente lo que se hace
el gen de resistencia. es diseñar un marcador CAPs (Cleaved Am-
Existen algunos aspectos importantes que plified Polymorphic Sequence) o bien utilizar
deben considerarse para la implementación la técnica de PCR en tiempo real. El segundo
de la selección asistida por un carácter en punto importante se relaciona con la distancia
un programa de mejora. Ellos son: a) el tipo genética existente entre el marcador molecu-
de marcador elegido; b) la distancia genética lar y el gen de interés. Idealmente, se debe-
entre el marcador y el gen de interés; c) la/s rían utilizar marcadores específicos de alelo.
fuente/s posible/s para el carácter o gen de in- No obstante, en general no es posible disponer
terés. Respecto del primer punto, cuando se de tales tipos de marcadores. A medida que la
practica selección asistida por marcadores es distancia entre el marcador y el gen de inte-
necesario evaluar cientos o miles de plantas en rés se acrecienta, mayor será la probabilidad
forma eficiente y ello determina la elección de de cometer errores de evaluación (tomar a un
los mismos. Cierto tipo de marcadores (como individuo como positivo cuando en realidad no
por ejemplo aquellos basados en la hibridación lo es). Esta dificultad puede solucionarse de
del ADN, como los RFLPs) no se adaptan bien dos formas básicas. En primer lugar, se debe

tratar de saturar la región de interés con un ma- gorrosa, o bien depende de ambientes especí-
yor número de marcadores para hallar uno que ficos o estados de desarrollo que influencian la
esté más cercano al gen. Si ello no fuera po- expresión del fenotipo. Asimismo, para el caso
sible o los nuevos marcadores hallados no se de resistencia a enfermedades, cuando el pató-
encuentren suficientemente cercanos al gen de geno está ausente en el lugar donde se realiza
interés, se puede optar por utilizar dos marca- la selección o su frecuencia de aparición (su in-
dores -uno por “encima” y otro por “debajo” del cidencia) varía mucho entre años.
gen en cuestión- para reducir la probabilidad de Cuando se necesita un elevado número de in-
cometer errores de evaluación. Finalmente, la dividuos para evaluar fenotípicamente el carác-
tercera consideración a realizar es acerca de la ter en cuestión (ejemplo: calidad panadera en
fuente del carácter o gen de interés. Cuando en trigo), los marcadores permiten realizar tal eva-
un dado cultivo un carácter o un gen tienen un luación sobre un solo individuo y en las primeras
solo ancestro dador (o sea, hay una sola fuente generaciones de endocría.
original), existirá un solo tamaño de fragmento Cuando es necesario apilar o “piramidizar”
para el alelo de interés y uno o varios fragmen- varios genes o QTLs que determinan un solo
tos de diferente tamaño para los otros alelos. carácter, como por ejemplo la resistencia a roya
En consecuencia, los resultados obtenidos de de la hoja o a la fusariosis de la espiga en trigo,
la población de mapeo del carácter en cuestión lo que puede ser muy engorroso o virtualmente
son inmediatamente utilizables o trasladables a imposible si se utilizan métodos fenotípicos so-
otras poblaciones y líneas. No obstante, lo usual lamente.
es que existan diferentes fuentes. Si esto es Cuando se necesita individualizar eficaz-
así, primero hay que determinar los tamaños de mente las fuentes de resistencia a patógenos
fragmento tanto para las diferentes fuentes de existentes en el germoplasma y buscar nuevas
resistencia como para aquellos individuos que fuentes para complementar las anteriores. Esta
no portan el alelo de interés, ya que en muchas prospección de recursos genéticos mediante el
oportunidades el tamaño de fragmento puede uso de marcadores no está limitada a las resis-
variar entre diferentes fuentes de resistencia. tencias a patógenos sino que puede emplearse
Asimismo, en otras poblaciones o en otro sector para otros caracteres, como por ejemplo la cali-
del germoplasma, un marcador detectado pre- dad del producto.
viamente como polimórfico en la población de Los marcadores moleculares, finalmente, de-
mapeo original puede ser monomórfico entre bido a que permiten determinar la genética sub-
individuos contrastantes para el carácter, lo que yacente detrás de un dado fenotipo garantizan
puede inducir a errores de evaluación. la generación del mismo en forma recurrente.
En otras palabras, los marcadores permiten re-
Justificaciones para el uso de selección obtener las combinaciones de genes o QTLs
asistida por marcadores en mejoramiento cuya interacción gobierna un determinado fe-
genético. notipo, proceso que -si librado al azar- sería de
Las justificaciones para el desarrollo y uso de una ocurrencia altamente improbable.
MAS en mejoramiento genético pueden agru- En la tabla 1 se ejemplifican algunos de los
parse en 6 categorías diferentes las cuales son caracteres en distintos cultivos cuya selección
relevantes para casi todos los cultivos: se realiza por medio de marcadores molecula-
Cuando la heredabilidad del carácter que se res. Como puede apreciarse, estos caracteres
está evaluando es baja (o sea, cuando la expre- van desde resistencias a enfermedades hasta
sión de un carácter se halla altamente influida caracteres que están relacionados con la ca-
por el ambiente) ya sea porque la genética del lidad del producto, incluyendo caracteres de
carácter es compleja, la penetrancia es baja o la herencia simple (por ejemplo, la resistencia a
expresividad es variable. Cercospora sojina en soja) hasta caracteres de
Cuando no hay métodos efectivos, precisos o herencia compleja (por ejemplo, la calidad pa-
rutinarios de selección fenotípica o convencio- nadera en trigo o la resistencia a la virosis cono-
nal, o éstos son caros, su determinación es en- cida como Mal de Río Cuarto en maíz).

Tabla 1. Ejemplos de caracteres para los cuales se realiza selección asistida utilizando marcadores mo-
leculares agrupados por rasgo. Los ejemplos fueron escogidos para representar la diversidad de ámbitos
donde esta metodología encuentra aplicación.
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Tipo de Rasgo Cultivo Ejemplos Marcador Ref

Resistencia a Nematodo del
Soja SSR 1
Quiste
Resistencias a
Trigo Resistencia a Roya de la hoja SCAR 2
enfermedades y
plagas Maíz Resistencia a Mal de Rio IV SSR 3
Girasol Resistencia a Plasmopara CAPS 4
Soja Resistencia a insectos SSR 5
RFLP-
Trigo Tolerancia a heladas 6
AFLP
Resistencias a Soja Tolerancia a salinidad SSR 7
estrés abiótico Sorgo Tolerancia a aluminio RFLP 8
Requerimiento de frío para
Trigo RFLP 9
florecer
Requerimiento fotoperiódico AFLP-
Trigo 10
para florecer SCAR
Adaptación
Maíz Días a floración AFLP 11
Trigo Enanismo SCAR 12
Trigo Calidad panadera SCAR 13
Porcentaje de proteína en el
Trigo SCAR 14
grano
Trigo Dureza del grano CAPS 15
Calidad del
Soja Inhibidor de tripsina (Kunitz) SSR 16
producto
Bajo contenido de ácido
Soja SNP 17
linolénico
Girasol Alto contenido de ácido oleico SCAR 18
Girasol Resistencia a imidazolinonas INDEL 19

Resistencia a
herbicidas Maíz Resistencia a glifosato SCAR 20
Soja Resistencia a glifosato SCAR 21

Conversiones línea pura (el padre recurrente, R) de muy bue-
Se denomina retrocruza asistida por marca- nas características agronómicas, pero deficiente
dores moleculares o conversión al proceso de para un carácter, se cruza con un individuo que
introgresar un carácter controlado por uno o po- exhibe el carácter en cuestión (individuo dador,
cos genes desde un genotipo dador o donante a D), y se obtienen descendientes F1. Estas plan-
un genotipo recurrente, de modo tal de obtener tas F1 se retrocruzan con el progenitor R. La
el trasfondo genético del recurrente con el ca- progenie obtenida se denomina “retrocruza 1”
rácter deseado. (BC1). En esta generación BC1 se seleccionan
Los marcadores se utilizan para realizar la se- las plantas que muestran el carácter de interés
lección por el carácter de interés y, aún más im- y se retrocruzan con “R”, obteniéndose la “retro-
portante, para seleccionar las plantas de modo cruza 2” (BC2). Se repite de nuevo este proceso
tal de recuperar más rápidamente el trasfondo de selección por el carácter y retrocruzamiento
genético del padre recurrente. Para entender con el progenitor “R” hasta llegar a una gene-
mejor la importancia de este método como así ración (usualmente la retrocruza 6, BC6) en la
también su implementación, lo mejor es comen- cuál se han recuperado todas las características
zar por analizar el método convencional o tradi- del progenitor R, se seleccionan los individuos
cional de retrocruzas. que presenten el carácter de interés y se au-
tofecundan. En la próxima generación (BC6F2)
El método de mejoramiento por se seleccionan aquellas plantas homocigóticas
retrocruzas para los genes que gobiernan el carácter en
El método de retrocruzas es un método muy cuestión y se autofecundan de nuevo. De este
antiguo de mejoramiento y consiste en el cruza- modo, se ha obtenido la línea R original con el
miento repetido de la progenie híbrida derivada carácter del dador incorporado. La figura 2.B es
de una cruza con uno de sus parentales. El ob- un esquema en el que se puede apreciar lo des-
jetivo principal es mejorar a una línea, cultivar o crito en forma gráfica. Se simboliza con una ba-
variedad ya existente por
una o más características
para la cual es deficiente.
Por ejemplo, una variedad
de soja tiene buen rendi-
miento y estabilidad del
rendimiento, pero es sus-
ceptible a una enfermedad
importante de herencia
simple, mientras que otra
variedad es resistente a tal
enfermedad pero es de-
ficiente en muchos otros
aspectos. Un objetivo del
mejoramiento podría ser
obtener una nueva varie-
dad con las características
deseables de rendimiento
y estabilidad de la primera Figura 2. Método de retrocruzas. (A) Esquema del método tradicional
y con el/los gen/es de re- de retrocruzas. (B) Comparación de los niveles de recuperación del
trasfondo genético del padre recurrente utilizando el método tradicional
sistencia de la segunda.
de retrocruzas y el asistido por marcadores. (C) Comparación de los
El esquema general de niveles de eliminación del arrastre por ligamiento utilizando retrocruzas
implementación del mé- convencionales y asistidas por marcadores. D progenitor donante del
todo de retrocruzas es el carácter a incorporar, R progenitor recurrente. BC1, BC2, BC6, genera-
siguiente (figura 2.A). Una ciones sucesivas de retrocruzas hacia el progenitor recurrente.

rra vertical el genotipo de cada individuo, negro Retrocruzas asistidas por marcadores
para el dador y blanco para el recurrente. Como Para realizar una retrocruza asistida por
puede observarse, la F1 tiene una contribución marcadores se sigue un esquema de trabajo
de 50% de cada progenitor. En la BC1, la con- similar al presentado en la figura 3, en la cual
tribución del dador ha disminuido a un 25%. O se describen los pasos utilizados para imple-
sea, en promedio, la generación BC1 presenta mentar dicha conversión. Luego de obtener
el 75% de contribución genética del recurrente la BC1 entre una línea recurrente y una línea
(la ecuación que permite calcular la proporción dadora del gen de interés, se extrae el ADN
del genotipo del padre recurrente recuperado de cada segregante. En primer lugar, se selec-
–RPR- luego de un número determinado de n ciona por el carácter de interés. Esta selección
generaciones de retrocruzas es, en ausencia de puede ser fenotípica o, más comúnmente, me-
selección y ligamiento: RPR= (1-0.5 (n+1))*100). diante marcadores ligados al gen/es de interés
La generación BC2 a su vez presentará, en (selección asistida por marcadores). Se des-
promedio, un 87,5% de contribución del recu- cartan todos los individuos que no presentan
rrente. De esta forma, en cada generación de el/los alelos de interés y, a partir del ADN de
retrocruzas la contribución genética del dador los restantes individuos, se procede a amplifi-
va decreciendo a la mitad de la generación pre- car los marcadores para todas las regiones del
via. De esta forma, al llegar a BC6 la población genoma para las cuales difieren los parentales
de plantas tendrá, en promedio, el 99,2% de los D y R (o sea, para todos los marcadores poli-
genes del progenitor recurrente y, en la práctica, mórficos entre las líneas D y R). Luego de leer
se considera que cada individuo es igual al re- los geles, se calculan las similitudes genéticas
currente salvo por el carácter incorporado. Este de cada individuo segregante con respecto al
método de mejora fue originalmente propuesto padre recurrente y se seleccionan aquel/aque-
por Harlan y Pope en 1922, pero hasta hace llos individuos con los mayores porcentajes de
pocos años no fue extensivamente utilizado en similitud. Esos individuos son los que se retro-
los programas de fitomejoramiento. La razón de cruzan con el padre recurrente para obtener la
esta baja adopción es bastante simple: la incor- generación BC2.
poración del carácter (o sea, la recuperación del Como se describió previamente, los porcen-
trasfondo genético del progenitor elite R con el tajes de recuperación del genotipo recurrente
carácter en cuestión suministrado por D) tarda en cada generación de retrocruzas son valo-
más o menos 7 generaciones, lo que para cul- res promedio de toda la población. De hecho,
tivos anuales implica 7 años si no se pueden existe una gran variabilidad entre individuos
cultivar generaciones de contra-estación. Por respecto de este porcentaje. Así, en la figura
lo tanto, al cabo de 7 años se obtendrá el mis- 3 se muestra, para el caso del maíz, el por-
mo material genético, pero que expresa un ca- centaje de similitud de los segregantes en BC1
rácter adicional. Como resulta lógico, durante con respecto al padre recurrente, evaluados
este período el trabajo de mejoramiento en el por medio de un gran número de marcadores
mismo programa en el que se obtuvo a “R” ha- moleculares dispersos a través de todo el ge-
brá producido nuevos materiales que superen noma. Se puede observar, como ejemplo, que
ampliamente a ese genotipo. Más aún, se pue- en la BC1F1 hay individuos que sólo presentan
den haber obtenido genotipos nuevos que ex- un 40% de similitud con el recurrente, mientras
presen el carácter que se deseaba incorporar que hay otros que muestran más del 80%. In-
mediante cruzas simples y posterior selección. dividualizando y cruzando sólo los individuos
En resumidas cuentas: la aplicación del méto- que presentan los mayores niveles de similitud
do convencional de retrocruzas habrá obtenido para obtener la siguiente generación de retro-
un genotipo “viejo” con un carácter nuevo o, en cruzas, se logra disminuir el número de gene-
palabras de muchos mejoradores, se habrá deraciones necesarias para recuperar el trasfon-
tenido el progreso genético por 7 generaciones. do genético del padre recurrente.
Los marcadores moleculares permiten acelerar Obsérvese que si se elige el individuo con
este proceso, como se explica a continuación. 84,3% de similitud para retrocruzar, el mínimo

resto del genoma. De esta for-
ma, se habrá obtenido la línea
recurrente convertida por el
carácter de interés en sólo dos
generaciones de retrocruzas.
La figura 3.C muestra los re-
sultados obtenidos en el labo-
ratorio de los autores para el
caso del cultivo de maíz, luego
de convertir decenas de líneas
endocriadas por mutantes (por
ejemplo, resistencia a herbici-
das), transgenes (resistencia a
insectos) o QTLs (Quantitative
Trait Locus) para resistencia a
enfermedades. Como norma,
la recuperación del trasfondo
genético del padre recurrente
se logra en BC2, 4 generacio-
nes antes de lo que requerido
por el método tradicional. De
hecho, los porcentajes de simi-
litud promedio de las mejores
plantas seleccionadas de la
BC1 fueron del 89,3% y de la
BC2, del 98,5%.
Figura 3. Conversiones asistidas por marcadores moleculares. La descripción anterior del
(A) Etapas del proceso de análisis de la generación BC1 du- método de retrocruzas se ha
rante una conversión asistida por marcadores. (B) Porcentaje realizado considerando que el
de recuperación del trasfondo genético del progenitor recurrente
carácter en cuestión es de he-
a través de las generaciones para el método convencional de
retrocruzas (teórico) y el método asistido por marcadores (obte- rencia monogénica, que el es-
nido). (C) Las conversiones dentro de un programa de mejora. tado favorable del carácter está
Se inician múltiples conversiones para un mismo carácter so- controlado por el alelo domi-
bre distintos trasfondos genéticos, con el objetivo de obtener los nante, y que la selección puede
mismos genotipos con el carácter incorporado. Como estrategia realizarse antes de que florez-
para obtener genotipos nóveles con el carácter incorporado, es can las plantas. En este caso,
posible iniciar la recombinación en etapas intermedias del pro- la implementación del método
ceso de conversión. de retrocruzas (supongamos
que se desea incorporar la re-
porcentaje de similitud que, en promedio, ten- sistencia a una enfermedad a una variedad de
drán los individuos en la BC2 será del 92% (se- trigo) es relativamente simple. En la práctica
gún el número de plantas que se obtengan se real del mejoramiento, los casos son en general
pueden lograr individuos con el 98-99% de si- un poco más complicados. Así, por ejemplo, si
militud). Repitiendo el mismo procedimiento en se desea incorporar un carácter controlado por
la BC2, se autofecundan los individuos con los un alelo dominante que se expresa en la semi-
mayores porcentajes de similitud para obtener lla (ejemplo: alto contenido de ácido oleico en
la BC2F2. En esta generación se terminan de la semilla de girasol), no se pueden seleccionar
seleccionar los segregantes que presentan el las plantas en cada generación de retrocruzas
gen de interés en estado homocigótico e iden- antes de que éstas florezcan. En este caso, se
tidad genética con el padre recurrente para el deben hacer todos los cruzamientos posibles

con el padre recurrente y evaluarlos cuando se generalmente, puede deprimir el rendimiento
obtengan las semillas de cada planta. Recién potencial o la calidad del producto, dependien-
en ese momento se podrán descartar aquellas do de las características del genotipo dador (si
cruzas con las plantas que no presentaban el es una especie silvestre se esperan mayores
carácter de interés. La mayor dificultad en este consecuencias fenotípicas que si el dador es
ejemplo radica en la cantidad de cruzamientos una línea elite). Así, por ejemplo, cuando se
que se deben realizar para asegurar que al transfirió al trigo el gen Lr19 que confiere re-
menos una de las plantas que se retrocruzan sistencia a roya de la hoja desde Thinopyrum
lleve el carácter en cuestión. Ahora bien, si el ponticum, también se incorporó un gen ligado
carácter que se desea incorporar está controla- (Y) que determina el amarillamiento de la hari-
do por un alelo recesivo (por ejemplo, la dureza na, un carácter indeseable para la industria ali-
del grano en trigo), no sólo se debe retrocruzar menticia. Otro ejemplo es el de la transferencia
cada planta con el padre recurrente, sino tam- a trigo de la resistencia a varias enfermedades
bién autofecundarla (o hacerle un cruzamiento conferidas por distintos genes en el cromoso-
de prueba o “testcross”) para determinar cuál ma 1R de centeno (Secale cereale L.), el cual
de las plantas de cada generación de retro- también presenta genes que disminuyen diver-
cruzas lleva el carácter en cuestión. En este sos parámetros de la calidad panadera.
caso, no sólo se deben hacer gran cantidad En el método convencional de retrocruzas la
de cruzas sino también perder una generación eliminación del arrastre por ligamiento se va lo-
adicional entre cada generación de retrocruzas grando por la “erosión” del segmento incorpo-
para evaluar el carácter de interés. Existe, fi- rado a través de recombinación por entrecruza-
nalmente, otro tipo de complicaciones. Todos miento. Se ha estimado a través de experimen-
los casos anteriores se refieren a ejemplos en tos de simulación que este proceso puede tar-
los que el fenotipo de cada planta se puede dar hasta 100 generaciones (figura 2.C). El uso
analizar en forma individual. Existen muchos de marcadores, en cambio, permite eliminar el
ejemplos (uno de ellos es la calidad panadera arrastre por ligamiento en sólo dos generacio-
en trigo) donde se necesitan cientos de semi- nes de retrocruzas siempre que se disponga
llas para evaluar el fenotipo. En estos casos, de un mapa saturado de esa región genómica
para evaluar cada individuo en las generacio- y del suficiente número de plantas en cada ge-
nes de retrocruzas, se deberían obtener dos neración de retrocruzas. En una primera gene-
generaciones de autofecundaciones antes de ración de retocruzas, por ejemplo, se pueden
decidir cuáles son los individuos con los deter- eliminar todos los individuos que presenten
minantes genéticos correctos para continuar alelos del genotipo dador para los marcadores
retrocruzando. situados a más de 1 cM río arriba del gen. En
El empleo de marcadores moleculares redu- la segunda generación de retrocruzas se hace
ce notablemente las complejidades descriptas lo mismo pero río abajo del gen deseado. De
ya que todos los ejemplos mencionados (se- esta manera el arrastre por ligamiento dismi-
leccionar individuos después de la floración, nuye drásticamente hasta niveles aceptables
hacer cruzamientos de prueba, o multiplicar la en tan solo dos generaciones de retrocruzas,
semilla para poder evaluar) se reducen al caso tal como se muestra en la figura 2.C. Una vez
más simple de seleccionar el carácter de inte- incorporado el gen con esta metodología, la lí-
rés por marcadores antes de la floración. nea obtenida se utiliza como fuente para los
sucesivos proyectos de conversión, de modo
El arrastre por ligamiento y su tal que el arrastre por ligamiento alrededor de
eliminación ese gen en particular no constituye un proble-
Cuando se incorpora un carácter desde un ma adicional en los proyectos posteriores.
genotipo dador a una línea recurrente, todos
los genes ligados al gen incorporado pasan Estimaciones de diversidad
con éste de generación en generación. Ese genética
arrastre por ligamiento puede que no tenga Las estimaciones de diversidad genética de
consecuencias fenotípicas o bien, como ocurre un programa de mejoramiento son fundamen-

tales para planificar los cruzamientos entre pa- individuos. Ello permite agrupar a aquellos que
rentales. Así, la diversidad dentro del programa exhiben mayor similitud genética en conjuntos
puede incrementarse si se planifican cruzas coherentes.
entre individuos que exhiban escaso parecido En la figura 4.A se comparan las estimacio-
genético. La genealogía de los individuos o su nes de similitud genética entre individuos ba-
parecido fenotípico son de escaso valor para sadas en el uso marcadores moleculares con
determinar si dos individuos están o no estre- aquellas derivadas de información fenotípica.
chamente relacionados genéticamente. Las La gráfica muestra la relación entre la distancia
estimas de similitudes genéticas basadas en morfológica (abscisas) y la distancia molecular
marcadores, en cambio, proveen un indicador (ordenadas) para 50 líneas de sorgo granífe-
bastante ajustado de las similitudes o distan- ro (Sorghum bicolor). Puede apreciarse que
cias genéticas reales. Se puede cuantificar la se obtiene un diagrama típico de dispersión
diversidad global que presentan los genotipos triangular: si dos individuos están muy relacio-
en estudio a partir de las huellas dactilares nados a nivel de marcadores es muy probable
(“fingerprinting”) de ADN de los individuos a que también lo estén a nivel morfológico. Por
analizar, las cuales incluyen un gran número el contrario, una gran distancia molecular en-
de marcadores. Mediante los algoritmos de Ín- tre dos individuos no permite realizar ninguna
dice de Contenido de Polimorfismo (PIC) (PIC inferencia acerca de su parecido morfológico
= 1- Σ pi²) se puede determinar cuáles son los
marcadores más discriminantes de los indivi-
duos en estudio. Así, un PIC igual a 0 indica
que el marcador en cuestión es monomórfico
y un PIC alto (por ejemplo, mayor a 0,7) indica
que el marcador en cuestión es altamente po-
limórfico y que tal polimorfismo esta distribuido
uniformemente entre los individuos estudiados.
El valor promedio de PIC para todos los mar-
cadores analizados permite realizar estimacio-
nes de Diversidad Genética (D) (D = 1- Σ Σ pi²).
Mediante la comparación de sucesivos valores
de D, es posible determinar si la diversidad ha
cambiado a través del tiempo, o si se ha mo-
dificado por la introducción al cultivo de nuevo
germoplasma. La utilización de un gran núme-
ro de marcadores adecuadamente dispersos
en el genoma permite construir Matrices Bá-
sicas de Datos (MBD). Mediante programas
estadísticos apropiados se calculan a partir
de ellas relaciones tales como la de similitud
genética entre genotipos. Esta relación puede
obtenerse usando el “Simple Matching Coeffi-
cient” (SMC) (SMC = m/(m+n)), el cual se de-
fine como el número de alelos de marcadores
que dos genotipos tienen en común (m) sobre
Figura 4. Estimaciones de diversidad genética me-
el número total de alelos analizados (m+n). De
diante el uso de marcadores moleculares. (A) Rela-
este modo, se pueden generar matrices de si- ción entre las distancias evaluadas sobre la base de
militud genética entre genotipos sobre las que, información morfológica y molecular para 50 líneas
mediante programas de análisis multivariado, de sorgo granífero. (B) Análisis de agrupamiento
se construyen dendrogramas que comparan para 214 variedades argentinas de soja utilizando
gráficamente las relaciones genéticas entre los marcadores microsatélites.

(éste puede ser muy alto o muy bajo). Esta re- germoplasma” a la utilización de todas las he-
lación puede explicarse por el determinismo rramientas previamente descriptas para la ob-
generalmente poligénico de los caracteres que tención de cultivares o germoplasma de alto
se utilizan en la estimación de las distancias potencial de rendimiento (creados por selec-
morfológicas, que puede conducir a fenóme- ción convencional en ambientes agronómicos
nos de convergencia. Por ejemplo, si se con- de alta oferta potencial con respecto a agua,
sidera que un carácter esta controlado por 4 nutrientes, fungicidas e insecticidas) a los que
loci bialélicos con efectos iguales y se denotan se le introducen caracteres por selección asis-
respectivamente + y - los alelos favorables y tida y conversiones que incrementan su esta-
los desfavorables, las líneas portadoras de las bilidad (resistencia a enfermedades o a estrés
combinaciones de alelos ++-- y --++ presenta- ambiental), calidad del producto final y/o rango
rán el mismo fenotipo pero diferirán para los 4 de adaptación (como por ejemplo, obtención
loci considerados. En síntesis, lo anterior indi- de cultivares de ciclo más corto o más largo
ca que el parecido morfológico entre materia- dependiendo de la estación de crecimiento).
les genéticos tiene escaso valor para realizar El diseño de germoplasma comprende el
un manejo eficiente de la diversidad genética uso de genotipos dadores que presentan ca-
de un cultivo. racteres de interés (resistencias o mejor cali-
El análisis de agrupamiento que se muestra dad) pero que, en general, son agronómica-
en la figura 4.B se realizó evaluando 214 geno- mente muy deficientes (representada en color
tipos de soja representativos del germoplasma negro en la figura 3.C). Estos dadores se utili-
disponible en Argentina analizados a través de zan para introgresar tales caracteres en líneas
30 loci de microsatélites seleccionados por su elite de alto potencial de rendimiento que no
capacidad discriminante. Luego de calcularse los poseen (representadas con diferentes to-
la similitud entre los genotipos, se realizó el nos de grises en la gráfica para señalar sus di-
análisis de agrupamiento cuyo dendrograma ferencias genéticas). Por otra parte, las líneas
se muestra en la figura. Pueden definirse tres elite, se eligen de modo tal que exhiban entre
grandes grupos, los cuales están asociados ellas escaso parecido genético. A medida que
a los grupos de madurez al que pertenecen el proceso de conversión de cada línea avan-
los cultivares. De esta forma, los cultivares de za (o sea, se minimiza la contribución genética
los grupos de madurez V y VI están más aso- del dador como se aprecia en la gráfica desde
ciadas entre sí que con los individuos de los F1 hacia BC2), se comienzan a cruzar entre
grupos de madurez III y IV. Esto indica que los sí a las líneas elite en proceso de conversión
diferentes grupos de madurez tienen ancestros de modo de obtener recombinantes entre los
diferentes y refleja una práctica común en el materiales elite y que lleven el gen de interés
mejoramiento de la soja consistente en cruzar (representadas en la gráfica como individuos
cultivares del mismo grupo de madurez al de- que presentan combinaciones de colores de
sarrollar nuevas variedades. La conclusión de diferentes líneas y la región del genoma que
este tipo de análisis es que para incrementar lleva el gen de interés de la línea dadora). De
la diversidad genética y, por ende, el progreso esta forma, si bien las conversiones continúan
genético en soja, se deberían realizar cruzas de modo tal de obtener cultivares aptos para
entre genotipos pertenecientes a distintos gru- el mercado, se genera al mismo tiempo ger-
pos de madurez. moplasma de alto rendimiento con los genes
Estos son sólo algunos ejemplos de los estu- aportados por la línea dadora. Ese germoplas-
dios de variabilidad que se pueden realizar para ma ingresa al programa de mejora convencio-
monitorear la diversidad genética de un cultivo nal para continuar el proceso de mejoramiento
y el impacto que, sobre la misma, pueden tener del rendimiento por selección.
diferentes estrategias de mejoramiento. Por todo lo expuesto anteriormente, el me-
joramiento genético en la actualidad debe ser
Diseño de genotipos y de germoplasma el resultado de la estrecha colaboración y del
Se denomina “diseño de genotipos o de sinergismo entre los programas de mejora

convencional y molecular. Como se ha mos- Lecturas recomendadas
trado previamente, los ciclos de evaluación,
selección y recombinación del mejoramiento Avise JC. 2004. Molecular markers, natural history,
convencional continúan siendo el corazón del and evolution. 2nd ed. Sinauer Associates, Inc.,
proceso, pero ahora cuentan con el aporte de Sunderland, MA.
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III. CAPÍTULO 4 diseñado para el objeto de protección al que se
aplica: las variedades vegetales.
Es sabido que al tratarse de sistemas bioló-
Identificación y registro de gicos, las variedades vegetales presentan ca-
variedades racterísticas particulares (ya sea en cuanto a
fisiología, propagación, etc.) que no podrían ser
Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y equiparadas a las que presentan otros objetos
María Alicia Loray de derecho. De allí la necesidad de contar con
un sistema de propiedad específico y acorde a
El registro de variedades en la República las necesidades de los obtentores y usuarios.
Argentina Este sistema no es nuevo. Deriva de la Con-
vención de París en materia de propiedad in-
telectual y su Acta específica es la de la Unión
Introducción
Internacional para la Protección de las Obten-
En la República Argentina, la legislación en
ciones Vegetales (UPOV) que data del año
materia de semillas y creaciones fitogenéticas
1961/72. La UPOV es la organización interna-
es la establecida por la Ley Nº 20.247 (1973),
cional intergubernamental, de donde emanan
su Decreto Reglamentario Nº 2183 (1991) y la
las directrices tanto técnicas como jurídicas en
Ley Nº 24376, de aprobación del Convenio In-
materia de derecho de obtentor. Los miembros
ternacional para la Protección de las Obtencio-
de esta Unión, son los Estados y/u organizacio-
nes Vegetales (1994). El organismo encargado
nes intergubernamentales (como por ejemplo la
de aplicar esta legislación es el Instituto Nacio-
Unión Europea) y cuenta con una organización
nal de Semillas (INASE). específica que es la Oficina de la UPOV con
En lo referido a variedades vegetales, esta sede en Ginebra, Suiza, integrada por un Se-
legislación, las define como “el conjunto de cretario General, un Vice-Secretario General,
plantas de un solo taxón botánico del rango su cuerpo técnico y su personal administrativo.
más bajo conocido que pueda definirse por la La República Argentina actualizó en el año
expresión de los caracteres resultantes de un 1991 su legislación en materia de derecho de
cierto genotipo o de una cierta combinación obtentor mediante el Decreto Reglamentario
de genotipos y pueda distinguirse de cualquier Nº 2183 (se la conoce como Acta de 1978 de
otro conjunto de plantas por la expresión de la UPOV). De esta forma pudo acceder a ser
uno de esos caracteres por lo menos”. Asi- miembro de la UPOV en el año 1994. Vale ha-
mismo, se define el término obtentor, como “la cer esta aclaración ya que luego, fue adoptada
persona que crea o descubre y desarrolla una y puesta en vigencia una tercera versión del
variedad”. Por otra parte, se define el término Acta de UPOV que es la que se conoce como
creación fitogenética como “toda variedad o Acta de 1991, a la que Argentina aún no adhirió.
cultivar, cualquiera sea su naturaleza genética, Independientemente de esto, de los 64
obtenido por aplicación de conocimientos cien- miembros parte de UPOV a diciembre de 2007,
tíficos al mejoramiento heredable de las plan- 24 son parte del Acta 1978 -incluido Argenti-
tas” (Decreto Nº 2183/1991 – Reglamentario na-; 1 es parte del Acta de 1961/72 y 39 miem-
de la Ley Nº 20.247, de semillas y creaciones bros son parte del Acta de 1991. Todas estas
fitogenéticas). Actas cuentan con principios básicos que son
Estos términos y definiciones, nos permiten comunes y nuevas regulaciones que se han in-
reconocer claramente a dos partes integrantes corporado como consecuencia de los avances
de un sistema de propiedad intelectual que se técnicos y tecnológicos en la obtención de va-
conoce internacionalmente como Derecho de riedades vegetales (Miembros de la Unión In-
obtentor, siendo la variedad vegetal el objeto ternacional para la Protección de las Obtencio-
de ese derecho y el obtentor el sujeto del mis- nes Vegetales – Status al 18 de junio de 2007
mo. Se trata de un sistema de propiedad inte- – UPOV).
lectual independiente, conocido como “sistema Desde su adhesión al Convenio de UPOV –
sui-generis”, ya que ha sido específicamente Acta de 1978, la República Argentina participa

activamente en los diferentes órganos de deci- la historia del mejoramiento de la variedad; el
sión de la UPOV: Consejo; Comité Consultivo; del procedimiento para el mantenimiento de la
Comité Administrativo y Jurídico y Comité Téc- pureza varietal y el que solicita la información
nico, como así también en los diferentes cuer- correspondiente a la expresión OGM (organis-
pos técnicos específicos y grupos de trabajo. mo genéticamente modificado) de la variedad
y su evento incorporado, en el caso en que
Registro de variedades corresponda (INASE – Formularios generales
La Ley Nº 20.247, creó dos Registros Na- para inscripción de cultivares – 2006).
cionales referidos a variedades vegetales, el Vamos a referirnos específicamente al exa-
primero es el Registro Nacional de Cultivares men técnico de la solicitud, ya que tanto para
(RNC) y el segundo es el Registro Nacional de la inscripción en el RNC como para RNPC, es
la Propiedad de Cultivares (RNPC). condición que todo cultivar sea sometido a este
El RNC es de carácter obligatorio para todo examen.
cultivar que se identifica por vez primera y se El examen técnico es conocido internacio-
va a exponer al público o entregar a usuarios nalmente como examen DHE (o DUS por sus
a cualquier título con un rótulo identificatorio. siglas en inglés) y se refiere a determinar las
Este Registro Nacional no da ningún derecho condiciones de Distinción, Homogeneidad y
de propiedad sobre el cultivar en cuestión, pero Estabilidad del cultivar cuya protección se pre-
habilita a la comercialización del mismo. tende.
El RNPC es optativo. Es el Registro Nacional Estas condiciones provienen de los requisi-
por el que se inscribe una variedad concedién- tos internacionales para conceder un derecho
dole un Título de Propiedad a su obtentor. Por de obtentor, que exigen que la variedad cumpla
si sólo no habilita a que una variedad pueda con los siguientes:
comercializarse, pero reconoce el derecho que Novedad: en sentido comercial.
su obtentor posee sobre la misma. Distinción: que permita distinguirla clara-
Consecuentemente, si una persona desea mente por medio de una o más características
poder comercializar su variedad y, a la vez, te- de otra variedad cuya existencia sea materia
nerla protegida mediante el sistema de dere- de conocimiento general al momento de com-
cho de obtentor, en ese caso deberá realizar pletar la solicitud.
el trámite de inscripción en ambos Registros Homogeneidad: que sujeta a las variacio-
Nacionales. Esto no significa un trámite por du- nes previsibles originadas en los mecanismos
plicado, sino que la misma solicitud de inscrip- particulares de su propagación, mantenga sus
ción, prevé la opción de inscripción en ambos características hereditarias más relevantes en
Registros. forma suficientemente uniforme.
Estabilidad: que sus características heredi-
Examen técnico tarias más relevantes permanezcan conforme
Todo cultivar que se registra, es objeto de un a su definición luego de propagaciones sucesi-
examen, tanto de los aspectos formales (exa- vas o, en el caso de un ciclo particular de pro-
men de forma) como de los técnicos específi- pagación, al final de cada uno de dichos ciclos.
camente (examen técnico o DHE). Además, la variedad debe contar con una
La solicitud de inscripción de una variedad denominación genérica que permita su identi-
vegetal, cuenta con diferentes Anexos, entre ficación sin inducir a error o confusión respecto
los que podemos destacar el de la Descripción de la identidad de otras variedades u obtento-
(aspectos morfológicos, fisiológicos, fenológi- res, ni sobre las características que esta po-
cos, de comportamiento sanitario y de carac- see, entre otras condiciones (Convenio Inter-
terísticas industriales) que va a permitir, me- nacional para la Protección de las Obtenciones
diante la combinación de la expresión de los Vegetales UPOV – Actas de 1978 y 1991).
diferentes caracteres que la integran, la iden- En concreto, las diferentes “Oficinas de Pro-
tificación de esa variedad. Otros Anexos técni- tección” se ocupan de determinar los aspectos
cos de importancia son el del origen genético y referidos a la novedad, la denominación y efec-

tuar el examen DHE. Para esto último, existen y está organizada mediante grupos de espe-
diferentes posibilidades y alternativas para los cies con un profesional técnico responsable
Estados a fin de poder llevar adelante el exa- de cada uno: cereales, oleaginosas, forrajeras,
men técnico DHE. industriales, hortícolas, frutales, forestales, or-
Una opción es la que se conoce como exa- namentales.
men oficial, en el que es la misma oficina la 1. Cada técnico evalúa la solicitud en sus
que se encarga de conducir el ensayo a campo aspectos de forma y de fondo, la deno-
(colección de variedades), agrupar a la varie- minación propuesta para el cultivar y, las
dad inédita con las más parecidas en virtud de características diferenciales del mismo
los caracteres de agrupamiento que el obtentor en comparación con las descripciones de
informa, tomar las observaciones y expresio- todos los cultivares de la misma especie,
nes de cada carácter siguiendo la guía técnica ya registrados o en trámite de registro.
correspondiente, determinando su distinción y Esta primera comparación de caracteres
producir la descripción oficial del cultivar. Para se efectúa mediante un programa que
esta opción, es necesario contar con recursos permite la comparación entre las diferen-
económicos y humanos, estaciones de eva- tes expresiones de los caracteres que
luación en diferentes localidades, personal de forman parte de un descriptor.
campo, etc. La mayoría de los países europeos 2. Estos caracteres, pueden ser más o me-
utilizan esta forma de examen técnico. nos influenciables de acuerdo con las
Otra opción es la reconocida como exa- condiciones del medio en el que se está
men realizado por terceras partes, en el que efectuando la descripción. Así, existen
personal acreditado por la oficina o el mismo caracteres de tipo cualitativo que son
obtentor, es el encargado de llevar adelante los menos influenciados por condiciones
los ensayos de campo, tomar los datos, com- externas y, consecuentemente, más de-
parar las variedades similares, presentar una seables para poder efectuar la compara-
descripción completa del cultivar (morfológica, ción. Los otros caracteres, denominados
fisiológica, fenológica, de comportamiento sa- cuantitativos pueden variar o varían en
nitario y de cualidades industriales si corres- virtud del ambiente (por ejemplo, altura
ponde), con las verificaciones efectuadas por de planta; largo de hoja, etc.).
el personal técnico de la oficina para su control. 3. Consecuentemente, luego de efectuada
En este caso la oficina ya no necesita contar la comparación primera, el técnico exa-
con recursos económicos tan elevados como minador debe analizar el resultado y, de
en el caso anterior, ni con sitios de realización ser necesario, verifica a campo los ca-
de ensayo ni personal de campo. Un cuerpo de racteres y sus expresiones diferenciales
técnicos especializados en los diferentes gru- o incluso, está facultado para efectuar
pos de especies, puede efectuar los controles ensayos oficiales.
necesarios a fin de verificar el cumplimiento de 4. Estos últimos, son efectuados por los
las condiciones de protección. Los países la- técnicos de la Dirección de Registro de
tinoamericanos y centroamericanos miembros Variedades en los casos en que poder
de UPOV, utilizamos esta forma de examen establecer la distinción se haya conver-
técnico, al igual que Canadá, Estados Unidos tido en un estudio no del todo sencillo,
de América y Australia, entre otros. como es el caso de la soja, para la que
desde el año 1994, el INASE conduce
Examen técnico en Argentina sus propios ensayos por medio de la Di-
En el caso nacional, el solicitante u obten- rección de Registro de Variedades, cu-
tor, debe presentar debidamente completos yos resultados luego son comparados
los formularios de solicitud de inscripción y sus con los declarados por el obtentor.
Anexos a la Dirección de Registro de Varieda- Estos ensayos y verificaciones a campo,
des del INASE. Esta Dirección es el Área téc- también son efectuados para otras especies
nica responsable de conducir el RNC y RNPC, con el fin de poder corroborar las declaraciones

de los obtentores y realizar el seguimiento del moleculares para determinar la identidad. En
mantenimiento de la pureza varietal a lo largo este sentido se ha recomendado la posibilidad
de los años. de uso de estas metodologías.
En cuanto a los descriptores varietales, exis- En el caso de la República Argentina, el exa-
te uno por especie y todos ellos incluyen los men DHE como vimos anteriormente, se efec-
caracteres utilizados a nivel internacional para túa mediante “marcadores morfológicos” es de-
efectuar los exámenes DHE. Estas directrices cir, caracteres morfológicos, fenológicos, fisio-
técnicas de la UPOV, son efectuadas por los lógicos, etc. Aún no se utilizan técnicas molecu-
expertos de los diferentes miembros que parti- lares a efectos de establecer la diferenciación
cipan de los grupos técnicos específicos. En las entre cultivares. Pero sí, aceptamos que como
mismas, se explica claramente la forma de eje- información complementaria a la descripción,
cución del examen, la toma de observaciones el obtentor presente el patrón molecular de su
y datos y las expresiones de cada carácter en inédito, indicando la metodología técnica y los
base a las observaciones efectuadas. Todos los marcadores utilizados. Así y ante un eventual
descriptores están integrados por caracteres conflicto, el obtentor ya cuenta con esta infor-
que son, como ya dijimos, de tipo morfológico, mación molecular en el INASE y podría utilizar-
fisiológico, fenológico, de comportamiento a en- la a efectos de la identificación de su cultivar
fermedades y que, en determinadas especies, llegado el caso.
incluyen a los referidos a calidad industrial. En sesiones recientes de la UPOV de los
Cada variedad, cuenta con su descriptor, que
Cuerpos de decisión, se ha considerado el
no es ni más ni menos que la combinación de
tema referido a la utilización de las técnicas
las expresiones de cada carácter que lo integra.
moleculares para otros fines, además del de la
Esa combinación de caracteres nos da la ex-
identificación, como por ejemplo en la determi-
presión de la identidad varietal. Hace que esa
nación de variedades esencialmente derivadas.
variedad sea esa y no otra. Nos permite iden-
Por supuesto que las recomendaciones de la
tificarla mediante estos caracteres contenidos
UPOV son guías técnicas que cada miembro
en el descriptor y la combinación de sus expre-
siones. puede tomar e incorporar en su país, no siendo
Cuando el técnico que realiza el examen obligatorias per-se, pero es sumamente impor-
DHE compara la descripción de variedad inédi- tante que en ese ámbito se esté discutiendo en
ta contra todas las anteriormente registradas los cuerpos técnicos correspondientes, la uti-
o en trámite de registro, lo que está haciendo lidad de las técnicas moleculares con miras a
es comparar identidades morfológicas, fisioló- que el sistema de derecho de obtentor cuente
gicas, fenológicas, etc. para poder establecer con otra herramienta que colabore en su imple-
el cumplimiento de una condición previamente mentación y ejercicio.
establecida: la diferenciación (TG/1/3 – Intro- Por último, la Federación Internacional de
ducción General a las Directrices de examen – Semillas (FIS) que nuclea a los obtentores (par-
UPOV 2005/06). ticipan dos organizaciones argentinas), consi-
En este sentido y, hasta la fecha, la UPOV ha dera que hasta tanto no se puedan definir dis-
recomendado que los exámenes DHE se efec- tancias mínimas para la distinción, el impacto
túen mediante la utilización de caracteres de que esas técnicas tendrán en los requisitos de
tipo morfológico, hasta tanto se pueda estable- uniformidad y estabilidad y, la disponibilidad de
cer la técnica y qué tipo de marcadores molecu- marcadores públicos, no es posible que puedan
lares podrían ser utilizados a efectos de la dife- ser utilizados para el examen DHE por sí solos.
renciación. Para ello, y en el seno de la UPOV, Pero la FIS considera que sí pueden ser utili-
se encuentran trabajando el grupo de técnicas zados en la identificación de una variedad pro-
biomoleculares (BMT) y subgrupos de trabajo tegida y/o en la determinación de una variedad
específico para diferentes especies, a fin de esencialmente derivada (Federación Interna-
poder establecer estas premisas. La UPOV sí cional de Semillas – Documentos de posición
se ha manifestado respecto del uso de técnicas sobre propiedad intelectual - 2006).

La noción de variedad esencialmente deriva- Si pensamos, por ejemplo en variedades
da, aparece en el artículo 14.5. del Convenio obtenidas por recombinación de ADN, se po-
Internacional para la Protección de las Obten- dría suscitar una relación de desequilibrio en
ciones Vegetales – UPOV Acta de 1991. cuanto a los derechos de obtentores y titulares
En ese sentido “Se considerará que una de otros derechos. Así, el obtentor de una va-
variedad es esencialmente derivada de otra riedad protegida, queda exceptuado de su de-
variedad – la variedad inicial – si i) se deriva recho ante la utilización de su variedad como
principalmente de la variedad inicial, o de una fuente de variación inicial para otra mejora. En
variedad que a su vez se deriva principalmen- cambio, el titular de un derecho de, por ejem-
te de la variedad inicial, conservando al mismo plo, patente sobre un gen modificado, producto
tiempo las expresiones de los caracteres esen- o procedimiento determinado, podrá ejercer su
ciales que resulten del genotipo o de la combi- derecho ante la utilización de un tercero.
nación de genotipos de la variedad inicial; ii). Sin duda, el desbalance entre derechos y ti-
se distingue claramente de la variedad inicial, tulares es notable. Por esta razón, el Acta de
y iii) salvo por lo que respecta a las diferencias 1991 de la UPOV introduce la noción de varie-
resultantes de la derivación, es conforme a la dad esencialmente derivada por el que: “En la
variedad inicial en la expresión de los carac- práctica, el nuevo sistema ha creado un marco
teres esenciales que resulten del genotipo o dentro del cual, las partes interesadas pueden
de la combinación de genotipos de la variedad negociar:
inicial”. Por otra parte, pero en ese mismo sen- a) aquel que desea emprender una selec-
tido, el Convenio agrega que: “Las variedades ción “mejorante” (con inclusión de un trabajo de
esencialmente derivadas podrán obtenerse, transformación mediante ingeniería genética)
por ejemplo, por selección de un mutante na- sobre una variedad protegida, concertará un
tural o inducido o de un variante somaclonal, acuerdo con el obtentor de esta variedad antes
selección de un individuo variante entre las de comenzar sus trabajos (esos acuerdos ya
plantas de la variedad inicial, retrocruzamien- se han concertado entre empresas de ingenie-
tos o transformaciones por ingeniería genética” ría genética y obtentores “tradicionales”);
(Convenio Internacional para la Protección de b) cuando un trabajo de selección resulte de
forma imprevista en la creación de una varie-
las Obtenciones Vegetales – Acta 1991).
dad esencialmente derivada, los dos obtento-
Esta noción pretende introducir una mejor
res se entenderán sobre la explotación de esta
relación de derechos entre obtentores y titu-
última si constituye un verdadero mejoramien-
lares de derecho. El Convenio, tal como está,
to; el precio que ha de pagar el usuario no será
contiene en todas sus versiones vigentes,
una regalía doble, sino una suma determinada
una excepción al derecho del obtentor, reco-
por las leyes del mercado (por la competencia).
nocida como “excepción del fitomejorador” o
Si no hay mejoramiento, o bien el obtentor de
“breeder's exemption”. Por esta excepción al
la variedad esencialmente derivada decidirá
derecho, un fitomejorador puede tomar como
que no la va a explotar, o bien el obtentor de
fuente de variación inicial el material de pro-
la variedad inicial ejercerá su derecho para ne-
pagación de una variedad que se encuentra gar al segundo obtentor el derecho a explotar
con titularidad vigente (inscripta en el Registro la variedad; c) los obtentores de variedades
Nacional de la Propiedad de Cultivares en el resultantes de una selección “innovante” y los
caso de la República Argentina) y sin solicitar inventores de productos o de procedimientos
autorización al titular de ese derecho vigente que dan lugar a variedades esencialmente de-
(el obtentor) utilizar ese material de propaga- rivadas tienen derechos de valor sensiblemen-
ción de esa variedad protegida como fuente de te equivalente y, por consiguiente, se ven obli-
variación a partir de la que podrá obtener una gados a concertar acuerdos equilibrados” (Ley
nueva variedad, siempre y cuando no deba uti- tipo sobre la protección de las obtenciones ve-
lizar en cada nuevo ciclo de producción de su getales – UPOV – 1996).
nueva variedad, al material de propagación de “La noción de variedad esencialmente de-
la variedad protegida. rivada hace intervenir el grado de semejanza

entre una de las variedades parentales (la va- El BMT es un grupo de expertos en el exa-
riedad inicial) y la variedad derivada. Para que men DHE, especialistas en técnicas bioquími-
exista derivación esencial, este grado de se- cas y moleculares, y obtentores cuya función
mejanza debe ser muy grande y el número de actual consiste en:
caracteres heredados del segundo genitor (si 1. Examinar la evolución general de las téc-
lo hay) debe ser muy pequeño; en última ins- nicas bioquímicas y moleculares.
tancia, se modifica un sólo carácter” (Ley tipo 2. Informar acerca de las aplicaciones perti-
sobre la protección de las obtenciones vegeta- nentes de las técnicas bioquímicas y mo-
les – UPOV – 1996). leculares al fitomejoramiento.
Para las oficinas de protección de varieda- 3. Estudiar la posible aplicación de las téc-
des, la situación es clara: si una variedad es nicas bioquímicas y moleculares al exa-
nueva, diferente, homogénea, estable, cuenta men DHE e informar sobre sus conclu-
con una adecuada denominación y ha cumpli- siones al Comité Técnico.
do con las formalidades administrativas, esa 4. Si procede, elaborar directrices para me-
Oficina no tiene motivo para no otorgar el título todologías bioquímicas y moleculares y
de obtentor o de propiedad de variedades ve- su armonización y, en particular, contri-
getales. buir a la elaboración de un documento
Al momento en que el obtentor de la varie- referido a “nuevos caracteres”. Estas di-
dad esencialmente derivada, pretenda realizar rectrices se elaborarán en colaboración
alguno de los actos a los que se extiende el de- con los Grupos de Trabajo Técnico (o
recho del obtentor de la variedad inicial sobre sus siglas en inglés TWP).
ésta, es en ese caso en que deberá solicitar 5. Examinar las iniciativas de los Grupos de
permiso para ello al obtentor de esa variedad Trabajo Técnico sobre el establecimiento
inicial. de subgrupos sobre cultivo específicos,
“Todas las partes interesadas se han puesto tomando en consideración la información
de acuerdo en que las relaciones de depen- disponible y la necesidad de métodos
dencia deberán ser administradas por los pro- bioquímicos y moleculares.
pios obtentores, sin que intervengan las autori- 6. Elaborar directrices en relación con la
dades encargadas de administrar el sistema de gestión y la armonización de bases de
protección de las obtenciones vegetales. Las datos sobre información bioquímica y
grandes organizaciones nacionales e interna- molecular, en colaboración con el Grupo
cionales de obtentores, están elaborando ya de Trabajo en Computación (TWC).
recomendaciones sobre las condiciones prác- 7. Recibir informes de los Subgrupos so-
ticas en las que una variedad será considerada bre Cultivos y del Grupo de Consulta del
como esencialmente derivada” (Ley tipo sobre BMT.
la protección de las obtenciones vegetales – 8. Constituir un foro para debatir la utiliza-
UPOV – 1996). ción de técnicas bioquímicas y molecu-
lares en el examen de las variedades
Marcadores moleculares y la UPOV esencialmente derivadas y la identifica-
ción de las variedades.
Antecedentes
A la luz de los avances en biología molecular (UPOV TC/38/16, 2002)
y en las técnicas de mejoramiento, la UPOV En la 6ta. Reunión del BMT, llevada a cabo
decidió que era necesario incorporar un nuevo en Angers, Francia en marzo de 2000, el Gru-
grupo que pudiera estudiar la aplicación de los po BMT consideró que existían (y existen aún)
marcadores moleculares en los estudios DHE. una serie de problemas de tipo legal y político
En el año 1993 se llevó a cabo la primera re- referidos al uso de estas técnicas, que debe-
unión del Grupo de Trabajo en Técnicas Bio- rían ser discutidos en el ámbito de un grupo
químicas y Moleculares y de perfiles de ADN específico. En octubre del mismo año el CAJ
en particular, conocido como Grupo BMT. aceptó la formación de dicho grupo, y en 2001

se acordó el mandato de lo que se denominó grupo de especies, facilitando la discusión y
Subgrupo Especial de Expertos Técnicos y Ju- agilizando la toma de decisiones.
rídicos sobre Técnicas Bioquímicas y Molecu-
lares o también conocido como Grupo de Con- Modelos para la posible introducción de
sulta del BMT, y que contiene los puntos que se técnicas moleculares en los estudios DHE
describen a continuación. En el año 2001, durante la 7ma sesión del
1. El Grupo de Consulta del BMT deberá Grupo BMT, éste consideró de importancia que
evaluar los posibles modelos de aplica- el Grupo de Consulta del BMT pudiera tomar
ción propuestos por el Comité Técnico, sus decisiones legales y políticas sobre la base
sobre la base de los trabajos realizados de diversos modelos para el uso de marcado-
por el BMT y los subgrupos sobre cul- res moleculares en los ensayos DHE, y que
tivos, para la utilización de las técnicas además éstos deberían estar definidos por los
bioquímicas y moleculares en el examen expertos de los Subgrupos de Cultivos.
de la distinción, la homogeneidad y la es- Los modelos para el uso de técnicas bio-
tabilidad en relación con: químicas y moleculares en los estudios DHE
a). la conformidad con el Convenio de aceptados son los siguientes:
la UPOV. 1. Las características moleculares como
b). las posibles repercusiones en la predictivas de características tradiciona-
eficacia de la protección, comparada les. Utilización de caracteres molecula-
con la obtenida mediante los métodos res que se vinculan directamente con los
actuales del examen, y pronunciarse caracteres tradicionales (marcadores ge-
sobre la eventual disminución de la néticos específicos): los marcadores mo-
eficacia de la protección ofrecida leculares que se vinculan directamente
mediante el sistema de la UPOV. con los caracteres tradicionales pueden
2. Al realizar su evaluación, el Grupo de resultar útiles para examinar los caracte-
Consulta del BMT podrá remitir cues- res tradicionales que no pueden obser-
tiones concretas al Comité Administrati- varse fácilmente o de manera coherente
vo y Jurídico o al Comité Técnico para en el terreno, o requieren disposiciones
proveer de aclaraciones o información especiales adicionales (por ejemplo, los
complementaria, según se considere caracteres de resistencia a las enferme-
apropiado. dades). Deberá demostrarse que existe
3. El Grupo de Consulta del BMT informará un vínculo fiable entre el marcador y la
al Comité Administrativo y Jurídico so- expresión del carácter. Por ejemplo el
bre su evaluación, tal como consta en el carácter de tolerancia a herbicidas, intro-
párrafo 1, pero esta evaluación no será ducido por modificación genética. Este
vinculante para la postura del Comité Ad- modelo tiene una serie de supuestos:
ministrativo y Jurídico. • el ensayo para el marcador debe reali-
4. zarse sobre el mismo número de plantas
(UPOV TC/38/14 – CAJ/45/5, 2002) individuales, la misma cantidad de años
A lo largo de los 15 años de existencia del y los mismos criterios que para los ensa-
grupo BMT, se han formado diversos subgru- yos a campo.
pos de trabajo específicos por cultivo o grupos • debe verificarse que realmente el marca-
de cultivos, denominados formalmente Subgru- dor está ligado al gen.
pos de Cultivos. Los que existen actualmente • si se tienen distintos marcadores para la
son los siguientes: papa; rosa; caña de azúcar; misma característica, éstos se conside-
trigo y cebada; maíz; colza; raigrás; soja; toma- rarán como distintos métodos para eva-
te y el grupo horizontal de cultivos de propaga- luar esa característica.
ción vegetativa. • si se tienen distintos genes que confieren
Estos grupos analizan el tema según las la misma característica, éstos se consi-
características específicas de cada especie o derarán como distintos métodos para

evaluar la misma característica. fenotípica entre dos variedades. Luego,
• si existen distintos marcadores ligados se establece la diferencia entre varieda-
a diferentes elementos regulatorios para des utilizando una distancia molecular. Si
el mismo gen, estos marcadores serán la correlación entre ambas distancias es
considerados como distintos métodos fuerte, se verá algo similar a la figura 1.
para evaluar la característica. En este caso el umbral de Distinción Plus
Sobre estos dos últimos puntos se deja asen- para marcadores moleculares, puede ser ex-
tado que se podrán hacer consideraciones, en trapolado a partir del umbral basado en carac-
tanto que pueden existir distintos mecanismos terísticas tradicionales. De esta forma, se to-
de acción de los genes (que otorguen ciertas marán las mismas decisiones sin importar cual
diferencias) y que algunos elementos regulato- de los métodos haya sido el utilizado. En los
rios son comunes a varios genes. casos reales, las correlaciones no son tan bue-
2. Comparación de niveles de umbral para nas, observándose una nube de puntos mas
caracteres moleculares con la distancia dispersa (figura 2):
mínima en caracteres tradicionales para Los métodos no coinciden en el grado de
el manejo de colecciones de referencia: distinción para los pares de variedades que
la clave consiste en determinar si pares
de variedades, que no se consideran dis-
tintas utilizando caracteres tradicionales,
pueden juzgarse distintas al utilizarse
caracteres moleculares, y si dichas deci-
siones podrían ser aceptables para con-
servar el valor de la protección. Las pro-
puestas presentadas deberán basarse
en una evaluación de la distancia gené-
tica en lugar de en un enfoque carácter
por carácter y podrán ser utilizadas en
la gestión de las colecciones de referen-
cia. Es decir, lo que busca esta opción
es llevar menor cantidad de variedades
de la colección a campo, de manera de Figura 1. (Adaptado de TC/38/14 – CAJ/45/5,
minimizar costos. Lo importante de este Anexo página 5).
sistema es que se debe establecer
un nivel de distinción, que se de-
nomina Distinción Plus, en el que
la diferencia entre dos variedades
sea altamente evidente. Aquellas
variedades que resulten no dis-
tintas en esta primera evaluación,
serán evaluadas en un examen a
campo, donde se podrá determi-
nar si realmente son distintas o no
a las variedades nuevas que se
requiere ensayar. La propuesta de
esta opción es la obtención de un
umbral de Distinción Plus basado
en características moleculares. En
esta propuesta, el primer paso es
evaluar las características tradicio- Figura 2. (Adaptado de TC/38/14 – CAJ/45/5, Anexo
nales y establecer una diferencia página 5).

caen dentro de los cuadrantes 3 y 4. Para los Nulceotide Polymorphism o polimorfismo
pares de variedades que caen dentro de los de nucléotido simple) en rosa y también
cuadrantes 1 y 2, las decisiones tomadas no existen algunos ejemplos en trigo y vid,
tendrán impacto en la protección. Respecto del ninguno de ellos actualmente aceptado
cuadrante 3, las decisiones tampoco tendrán por la UPOV. Como ejemplo, a continua-
impacto en la protección, ya que esos pares de ción se describe brevemente como sería
variedades deberán pasar por la evaluación a el ensayo en el caso de rosa. Para esta
campo. En el caso del cuadrante 4, los pares especie se han preseleccionado 7 mar-
de variedades están por debajo del umbral de cadores SSR. La prueba se lleva a cabo
distinción tradicional (por lo tanto serían simi- sobre dos plantas individuales de cada
lares), pero resultan distintas utilizando carac- variedad candidata. Si ésta tiene al me-
terísticas moleculares. Para evitar posibles in- nos 3 bandas o picos, diferentes respecto
convenientes al poner en práctica este método, de las otras variedades, se la considera
ambos sistemas deben ser corridos en paralelo distinta, y se podrá luego realizar el en-
y se deberán determinar umbrales lo suficien- sayo a campo para evaluar la estabilidad
temente altos (con marcadores moleculares) y la homogeneidad. En el caso de que
de manera de minimizar estos casos. Este sis- no sea distinta, se la evaluará con otros
tema ha sido calibrado en Francia para el caso 7 marcadores SSR. Si se encuentran al
del maíz utilizando caracteres basados en pro- menos 3 bandas o picos de diferencia,
teínas. Los supuestos de esta opción son los entonces se la considerará distinta y se
siguientes: la evaluará a campo para determinar si
• Se supone que las diferencias calculadas es homogénea y estable. Si no se logra
entre variedades utilizando marcadores la distinción, se considera que es una va-
moleculares, incluyen a las diferencias riedad ya existente o una mutante y se la
encontradas dentro de las variedades. evaluará a campo tanto para determinar
• Esta opción será utilizada para estable- la homogeneidad y la estabilidad como
cer la Distinción Plus para el manejo de para determinar la distinción, siempre
las colecciones de referencia. utilizando características no molecula-
• La metodología utilizada es lo suficiente- res. El riesgo, en cuanto a mantener el
mente robusta y repetible. nivel de protección, de esta opción es
3. Creación de un nuevo sistema: esta op- que puede ocurrir que variedades que
ción se basa en la utilización de caracte- no hayan sido consideradas distintas
res moleculares del mismo modo en que usando las características tradicionales,
se utilizan los caracteres no moleculares sean consideradas distintas basándose
existentes. Este enfoque significa que en esta opción. Si bien la probabilidad de
las diferencias claramente distinguibles que eso ocurra es baja, la UPOV aún no
en los caracteres moleculares se consi- ha aceptado a este nuevo sistema
derarían niveles de umbral para evaluar (UPOV TC/38/14 – CAJ/45/5, 2002).
la Distinción. Para esta opción es funda-
mental analizar las repercusiones que Otros modelos de uso de las técnicas
podría tener el nuevo sistema, en el nivel bioquímicas y moleculares
de la protección, en comparación con el El grupo BMT tiene dentro de su alcance la
sistema actual. Esto se puede llevar a posibilidad de discutir temas de identificación
cabo mediante la revisión de las posibles de variedades y referidos a las variedades
diferencias en las decisiones tomadas esencialmente derivadas. Además de la posi-
utilizando uno u otro sistema. Este nuevo bilidad de usar a los marcadores moleculares
sistema se ha ensayado utilizando fun- para los exámenes DHE, éstos también pue-
damentalmente marcadores SSR (Short den ser utilizados para la identificación de va-
Sequence Repeat o microsatélites) y más riedades a fin de dar respuesta a dos temas de
recientemente marcadores SNP (Single gran interés para la UPOV:

a. Hacer valer el derecho del obtentor. ducidas usando los métodos que pueden llevar
b. Evaluar la derivación esencial. a derivación, y calculando la similitud. Su mag-
Estos posibles usos de los marcadores de nitud dependerá de la especie, de la variabilidad
ADN tienen una definición más reciente en el genética y del proceso de mejoramiento.
ámbito de la UPOV, discutiéndose las diferen- Si al evaluar dos plantas, la similitud de las
tes propuestas técnicas dentro del grupo BMT. mismas está por debajo del umbral, se puede
Hacer valer el derecho del obtentor, técnica- decir que las plantas son distintas. Pero si la si-
mente significa que se deberá establecer un militud supera al umbral, estaremos en una zona
sistema tal que se pueda realizar una identifi- de “posible derivación” y entonces se deberán
cación única de cada variedad de interés (por llevar a cabo los ensayos a campo (figura 3).
ejemplo todas las de la colección de referencia
de un país, o una región o más ambiciosamen-
te, a nivel mundial). Para esto es necesario
contar no sólo con material original (provistos
por las empresas criadero o por los organis-
mos oficiales), sino también de marcadores
técnicamente validados, en lo posible en el
ámbito regional o mundial. Los marcadores a
utilizar deberán ser de uso público, así como
también las metodologías de análisis y se uti- Figura 3. Esquema de umbrales de distinción para
lizarán la menor cantidad de marcadores posi- variedades esencialmente derivadas. (Adaptado de
ble tal que se pueda identificar a las variedades Le Buanec, 2007).
que ya tengan título de propiedad, a la vez que
haya un margen para que se puedan incorporar
nuevas variedades al sistema. Estos sistemas Selección de marcadores moleculares y
requerirán la construcción de bases de datos construcción de bases de datos:
compatibles entre países para poder realizar directrices del BMT
cualquier intercambio de información. Durante la 8va sesión del grupo BMT en
Actualmente, en el ámbito de ISTA (Interna- 2003, se entendió que era necesario comenzar
tional Seed Testing Association), se están lle- a armonizar metodologías para la generación
vando a cabo ensayos de validación de marca- de datos moleculares a fin de asegurar la cali-
dores SSR sobre 4 especies de interés econó- dad de los datos producidos y para que éstos
mico mundial. además sean aceptados universalmente a fin
En el caso de la derivación esencial, se bus- de ser usados en la caracterización de varieda-
ca determinar si una variedad deriva de otra des. También se consideró fundamental poder
que ya tiene título de propiedad. Esto actual- establecer normas o ejemplos de diseños de
mente es posible realizarlo llevando a cabo un bases de datos, específicas para datos mole-
ensayo a campo que puede durar entre 2 y 3 culares de distinto tipo. Estas consideraciones
años. Los marcadores de ADN pueden acortar se plasmaron en los borradores de las Directri-
estos tiempos a unos pocos meses si se cuen- ces del BMT.
ta con un sistema adecuado de evaluación de Este texto, que aún sigue en discusión, con-
la derivación. tiene lo siguiente:
En este caso la propuesta es evaluar gran • definiciones generales.
cantidad de marcadores (no menos de 150 a • criterios básicos para la selección de me-
200 marcadores) de manera tal de “saturar” el todologías adecuadas.
genoma y así determinar el grado en que se dis- • criterios generales para la selección de
tinguen una variedad de la otra. Para eso debe marcadores y criterios específicos por
definirse un umbral de distinción, que se estable- tipo de marcador.
ce usando pares de variedades de genealogía • consideraciones sobre el origen y tipo de
conocida o pares de aquellas que han sido pro- material a analizar y sobre la cantidad de

plantas o semillas requeridas en cada En este sentido la Asociación Internacional
caso (tamaño de muestra según tipo de de Análisis en Semillas (ISTA), comenzó en
propagación del material). 2007 a conducir ensayos inter-laboratorio con
• consejos sobre el uso de materiales de fines de identificación de variedades mediante
referencia y la calidad de ADN requerido. la técnica de microsatélites (SSR) para cuatro
• Consejos sobre la forma de interpreta- especies de interés comercial mundial: trigo,
ción de los datos y de los resultados. soja, maíz y arroz.
A continuación se presenta un resumen de los Consideraciones finales

diversos puntos sobre selección y uso de mar- La postura de la UPOV respecto de los mar-
cadores de ADN para poder generar datos de cadores moleculares es objeto de evaluación
calidad y que sean universalmente aceptados: continua debido a la evolución constante de es-
a. considerar un análisis basado en estudios tas técnicas y a las nuevas posibilidades que
de especie por especie. ofrecen en línea con los criterios del organismo.
b. acordar el tipo de marcador. Conforme a la actual postura de la UPOV,
c. acordar sobre el equipamiento a utilizar y es posible aplicar los planteamientos del punto
la plataforma de detección. 1. (las características moleculares como cua-
d. acordar sobre los laboratorios que se in- lidades predictivas de características tradicio-
cluyan en un posible ensayo entre labora- nales) ya que basándose en las premisas de
torios. la propuesta, ésta está en conformidad con el
e. acordar sobre criterios de calidad. Convenio de la UPOV y no mermaría la efica-
f. verificar la fuente del material vegetal con cia de la protección suministrada en virtud del
el que se trabaja. actual sistema. También es posible aplicar lo
g. acordar qué marcadores se utilizarán en descrito en el punto 2. (comparación de niveles
un primer ensayo colaborativo, cuáles labo- de umbral para caracteres moleculares con la
ratorios y sobre qué plataformas distintas. distancia mínima en caracteres tradicionales),
h. conducir un ensayo colaborativo. ya que cuando se utilizan para la gestión de
i. desarrollar un protocolo para evaluar los colecciones de referencia está en conformidad
datos moleculares.
con las disposiciones del Convenio de la UPOV
j. acordar sobre el material vegetal y el grupo
y no mermaría la eficacia de la protección su-
de materiales de referencia a ser analizado y
ministrada en virtud del sistema actual.
el origen del mismo (por especie).
Sin embargo, la UPOV considera que no se
k. analizar la colección de referencia en dife-
ha alcanzado un acuerdo respecto de los plan-
rentes laboratorios, con diferentes sistemas
teamientos del punto 3. (creación de un nuevo
de detección, realizando análisis por duplica-
sistema basado en marcadores de ADN). Se
do, e intercambiando muestras y extraccio-
ha observado que no existe consenso en rela-
nes de ADN si ocurre algún problema.
ción con la aceptación de dicha opción ya que
l. utilizar variedades, muestras de ADN y/o
alelos de referencia en los análisis. se considera que no hay conformidad con el
m. verificar cada etapa, incluyendo la entra- Convenio de la UPOV. Tampoco hay acuerdo
da de datos. En lo posible automatizar. respecto de si mermaría la eficacia de la protec-
n. llevar adelante un ensayo “ciego” en dife- ción suministrada en virtud del actual sistema.
rentes laboratorios utilizando la base de da- Asimismo se ha expresado la preocupación de
tos. que si se adopta dicho enfoque, podrían utili-
o. adoptar un procedimiento de manera tal zarse un número ilimitado de marcadores para
de poder incluir nuevos datos. encontrar diferencias entre variedades que es-
(UPOV BMT Guidelines-proj-8, 2007) tén en el plano genético que no necesariamen-
te se reflejen en caracteres morfológicos (ca-
En definitiva este texto indica que los ensa- racteres en los que se basa el sistema actual
yos que se realicen utilizando marcadores de de la UPOV).
ADN, deben estar validados a través de un en- Finalmente se han observado una serie de
sayo inter-laboratorio. cuestiones generales, como por ejemplo la ac-

cesibilidad a las técnicas protegidas por paten- UPOV. 1991. Convenio Internacional para la Pro-
tes, la necesidad de tener en cuenta la relación tección de las Obtenciones Vegetales.
costos-beneficios de estos nuevos enfoques, UPOV. 1996. Ley tipo sobre la protección de las ob-
la importancia de la relación que existe entre tenciones vegetales.
los caracteres fenotípicos y las técnicas mole- UPOV. 2002. TC/38/14 – CAJ/45/5. Ad Hoc
culares y, finalmente, la necesidad de exami- subgroup of technical and legal experts on bio-
nar también la Homogeneidad y la Estabilidad chemical and molecular techniques (The BMT
en los mismos caracteres que se utilizan para review group).
examinar la Distinción (UPOV TC/41/7, 2005). UPOV. 2002. TC/38/14 – CAJ/45/5. Ad Hoc
subgroup of technical and legal experts on bio-
Lecturas recomendadas chemical and molecular techniques (The BMT
review group). Anexo página 5.
Decreto Nº 2183/1991. Reglamentario de la Ley Nº UPOV. 2002. TC/38/16. Informe del Comité Técni-
20.247, de Semillas y Creaciones Fitogenéticas. co.
Federación Internacional de Semillas. 2006. Docu- UPOV. 2005. TC/41/7. Técnicas Moleculares.
mentos de posición sobre propiedad intelectual. UPOV. 2007. Miembros de la Unión Internacional
INASE. 2006. Formularios generales para inscrip- para la Protección de las Obtenciones Vegetales.
ción de cultivares. Status al 18 de Junio de 2007.
Inase.gov.ar: www.inase.gov.ar
Le Buanec, M. 2007. Use of Molecular techniques
in relation to essential derived varieties. Pro-
ceedings of the International Symposium on
the application of molecular techniques for plant
breeding and plant variety protection. Seoul, no-
viembre de 2007.
UPOV. 2005/06. TG/1/3. Introducción General a las
Directrices de examen.
UPOV. 1978. Convenio Internacional para la Pro-
tección de las Obtenciones Vegetales.

PARTE IV
Métodos de propagación
y conservación de germoplasma

IV. Capítulo 1 Etapa 0: Preparación del material vegetal
La correcta elección y preparación del ex-
planto incide directamente sobre la calidad del
Micropropagación
mismo y su respuesta frente a los dos principa-
les problemas que afectan al establecimiento
Sofía Olmos, Gabriela Luciani y
del cultivo, que son la contaminación con mi-
Ernestina Galdeano
croorganismos y la oxidación del explanto.
Los factores que influyen sobre la calidad del
1 Introducción explanto son: el tipo de órgano que sirve como
La micropropagación consiste en la propa- explanto, la edad ontogénica y fisiológica del
mismo, la estación en la cual se colecta el ma-
gación de plantas en un ambiente artificial con-
terial vegetal, el tamaño y el estado sanitario
trolado, empleando un medio de cultivo ade-
general de la planta donante.
cuado. El cultivo es así una herramienta muy
La planta donante debe elegirse en base a
útil en los programas de mejoramiento, ya que
una selección masal positiva para las caracte-
tiene el potencial de producir plantas de calidad
rísticas agronómicas deseables. Una vez se-
uniforme a escala comercial, a partir de un ge-
leccionados los individuos, es preciso definir el
notipo selecto y con una tasa de multiplicación
tipo de explanto a establecer en condiciones in
ilimitada. Esto es posible gracias a la propie-
vitro. En general, los órganos jóvenes o bien
dad de totipotencia que tienen las células ve- rejuvenecidos son los que tienen mejor res-
getales; esto es la capacidad de regenerar una puesta en el establecimiento que los obtenidos
planta completa cuando están sujetas a los es- a partir de materiales adultos.
tímulos adecuados. Así, las células somáticas El empleo de explantos que se encuentran
de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces expuestos a bajos niveles de patógenos puede
o embriones somáticos de acuerdo con la com- resolver el problema de la contaminación por
petencia que posea y al estímulo que reciban . hongos y bacterias durante el establecimiento
Dependiendo de las características de la del cultivo in vitro.
planta que se pretenda propagar y del objetivo Se recomienda colectar explantos primarios
perseguido, la micropropagación puede rea- a campo durante la estación primaveral y esti-
lizarse a través de tres vías de regeneración: val, cuando existe una brotación activa de las
brotación de yemas adventicias preexistentes, yemas, ya que el empleo de yemas en esta-
producción de yemas de novo y embriogénesis do de dormición ocasiona serios problemas de
somática. contaminación.
A fin de lograr explantos de óptima calidad
2 Etapas de la micropropagación es conveniente hacer crecer las plantas donan-
La micropropagación presenta cuatro etapas tes por un tiempo mínimo en condiciones de
principales: 1) establecimiento del cultivo, 2) invernáculo. De esta forma es posible incidir
desarrollo y multiplicación de vástagos o em- directamente sobre el estado sanitario y la ca-
briones, 3) enraizamiento y 4) aclimatación lidad de los explantos mediante el control de la
de las plántulas. Generalmente, las etapas de intensidad lumínica, temperatura y reguladores
enraizamiento y aclimatación pueden combi- de crecimiento. Para especies ornamentales
narse en condiciones ex vitro. En el caso de tropicales y subtropicales se recomienda man-
la embriogénesis somática, el enraizamiento tener las plantas donantes en condiciones de
es reemplazado por una etapa de maduración alta temperatura (25ºC) y baja humedad rela-
y germinación de los embriones para la dife- tiva (75%) a fin de reducir la proliferación de
renciación de los ápices caulinar y radicular. patógenos.
En algunos casos tiene importancia considerar Los procesos morfogénicos de floración,
una etapa previa (Etapa 0) que es la etapa de dormición y bulbificación son controlados por el
preparación de los explantos para el estableci- fotoperíodo y la temperatura. Controlando es-
miento. tos factores también es posible obtener plantas

donantes y explantos más homogéneos duran- la carga de patógenos es mayor y por lo tanto
te todo el año. Pueden aplicarse además pre- la precisión del sistema de detección aumen-
tratamientos con reguladores de crecimiento a ta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden
las plantas donantes, así como también a los tratarse con técnicas adecuadas para la elimi-
explantos mismos. En especies leñosas suele nación de patógenos como la termoterapia, la
utilizarse como pretratamiento la inmersión de quimioterapia a través de la aplicación de anti-
los explantos primarios en soluciones con cito- bióticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo
cininas a fin de inducir la brotación de yemas. de meristemas.
La desinfección superficial incluye varios pa-
Etapa 1: Establecimiento del cultivo sos: el lavado de los explantos con agua co-
El objetivo de esta etapa es establecer culti- rriente, el empleo de etanol al 70% por 1 mi-
vos viables y axénicos. El éxito está determina- nuto, seguido de concentraciones variables de
do por la calidad del explanto a utilizar. En esta hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo)
etapa los principales procesos a controlar son con unas gotas de tensoactivos para favorecer
la selección, el aislamiento y la esterilización de su penetración y actividad. Posteriormente, los
los explantos. explantos deben ser enjuagados al menos tres
veces con agua destilada estéril.
Los materiales que demuestran tener mayor Algunos patógenos permanecen latentes y
capacidad regenerativa son los obtenidos de se expresan cuando son transferidos a un me-
tejidos meristemáticos jóvenes, ya sean yemas dio de cultivo nuevo. En general, estos pató-
axilares o adventicias, embriones o semillas en genos incluyen los patógenos superficiales del
plantas herbáceas y aquellos tejidos meriste- material vegetal, los patógenos endógenos y
máticos que determinan el crecimiento en gro- los patógenos propios del manejo en laborato-
sor, como el cambium en las plantas leñosas. rio. En la Etapa 1 también pueden observarse
En este sentido, es importante señalar que el infecciones por bacterias y hongos asociados a
empleo de yemas adventicias (también llama- trips que sobreviven a los tratamientos de este-
das yemas formadas de novo) está asociado rilización y por patógenos endógenos latentes
con una mayor probabilidad de ocurrencia de dentro del sistema vascular, resultado de una
variantes somaclonales respecto de los siste- esterilización inefectiva de los explantos. Estos
mas de propagación basados en la regenera- patógenos latentes podrían manejarse median-
ción a partir de yemas axilares o embriones te el empleo de bacteriostáticos o antibióticos
somáticos. en el medio de cultivo.
La obtención de cultivos axénicos puede lo-
grarse trabajando tanto sobre aspectos preven- Etapa 2: Multiplicación
tivos como curativos. Una acción preventiva la El objetivo de esta etapa es mantener y au-
constituye el empleo de métodos de verifica- mentar la cantidad de brotes para los nuevos
ción de patógenos en los explantos. Esto puede ciclos de multiplicación sucesivos (subcultivos)
realizarse mediante análisis específicos para y poder destinar parte de ellos a la siguiente
las enfermedades del cultivo, tales como DAS- etapa de producción (enraizamiento, bulbifica-
ELISA o PCR, análisis generales para patóge- ción, etc.). Ambas vías de regeneración, orga-
nos cultivables como el empleo de medios de nogénesis y embriogénesis, pueden darse en
cultivo para el crecimiento de bacterias y hon- forma directa o indirecta. Esta última implica la
gos y métodos específicos para la detección e formación de callo. En general, la organogéne-
identificación de patógenos intracelulares como sis conduce a la producción de vástagos unipo-
virus, viroides y bacterias. La realización de lares que enraízan en etapas sucesivas, mien-
estos análisis directamente sobre las plantas tras que por embriogénesis somática se forman
donantes, previo establecimiento, presenta dos embriones bipolares a través de etapas onto-
ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos génicas similares a la embriogénesis cigótica.
maduros permite visualizar los síntomas más Es importante señalar que cualquiera sea la
marcados de la enfermedad, en segundo lugar, vía de regeneración empleada, es convenien-

te evitar la formación de callo para disminuir el La embriogénesis somática es una vía más
riesgo de variación somaclonal. Los medios de conveniente porque permite saltar las etapas
cultivo, los reguladores de crecimiento como de formación de yemas y enraizamiento, rege-
auxinas, citocininas y ácido giberélico y las con- nerando plantas en una forma mucho más rá-
diciones de crecimiento juegan un papel crítico pida y eficiente. A su vez, la disponibilidad de
sobre la multiplicación clonal de los explantos. protocolos para la obtención de embriones so-
La organogénesis puede darse por inducción máticos es clave para la automatización de la
de yemas axilares o adventicias. La inducción micropropagación y la consecuente reducción
de yemas axilares comprende la multiplicación de costos para su implementación a escala
de yemas preformadas, usualmente sin forma- comercial. Los biorreactores son equipos que
ción de callo. La inducción de yemas adventi- contienen aproximadamente 2 litros de medio
cias comprende la inducción de tejido meriste- de cultivo líquido estéril y donde los embriones
mático localizado mediante un tratamiento con somáticos pueden regenerar y madurar a partir
reguladores de crecimiento, conduciendo a la de suspensiones celulares, sustentados por la
diferenciación del primordio y desarrollo del circulación permanente de nutrientes y de aire
vástago, esto último generalmente en ausencia (Fig.1). Hoy en día, el empleo de biorreactores
del regulador de crecimiento que indujo la orga- para la micropropagación a gran escala está
nogénesis. limitado por dos motivos críticos. En primer
La principal desventaja del primer método lugar, el declinamiento de las líneas celulares
es que el número de yemas axilares por ex- (clones) por efecto de la variación somaclonal
planto limita la cantidad de vástagos. Esto se y segundo, por los altos costos asociados con
ve compensado, sin embargo, por un aumento la conversión de estos embriones somáticos en
en la tasa de multiplicación con los sucesivos plántulas.
subcultivos. La formación de yemas adventicias Las condiciones culturales en las cuales cre-
ofrece mayor potencial para la producción de ce el explanto son el resultado de la interacción
vástagos, ya que ocurre en sitios distintos al de de tres factores: el estado del explanto o ma-
los meristemas. terial vegetal, determinado en parte por el me-
dio de cultivo, el recipiente de
cultivo y el ambiente externo
o condiciones de crecimiento
del cuarto de cultivo. La capa-
cidad de respuesta de los ex-
plantos a un mismo medio de
cultivo cambia con el número
de subcultivos, el tipo de ex-
planto subcultivado y el méto-
do del repique. Por esto mis-
mo, el medio de cultivo debe
optimizarse a fin de lograr la
mayor tasa de multiplicación
vegetativa. Comúnmente se
emplea como medio basal el
medio MS completo sugerido
por Murashige & Skoog (1962)
suplementado con 3% de sa-
carosa como fuente de carbo-
no. A este medio se le adicio-
Figura 1: Embriogénesis somática en zanahoria. A partir de cé-
nan además reguladores de
lulas del floema se obtienen los embriones somáticos que son
un excelente sistema de propagación clonal. Los bioreactores crecimiento, tanto del tipo de
permiten el cultivo a gran escala de los mismos. auxinas como de citocininas.

La etapa de multiplicación generalmente al explanto. Para minimizar el daño de estos
comprende dos períodos, la fase de inducción compuestos se emplean agentes adsorbentes
y la fase de multiplicación propiamente dicha. de fenoles en el medio de cultivo, tales como
La primera implica, generalmente, el empleo el carbón activado y la polivinilpirrolidona o an-
de concentraciones elevadas de reguladores tioxidantes como el ácido ascórbico, la modifi-
de crecimiento (generalmente de auxinas más cación del potencial redox con agentes reduc-
que citocininas) para favorecer la desdiferen- tores, la inactivación de las fenoloxidasas con
ciación. La segunda etapa requiere del empleo agentes quelantes o la reducción de su activi-
de un balance hormonal adecuado para fa- dad o afinidad por el sustrato utilizando un bajo
vorecer los procesos de diferenciación y mul- pH, ó bien cultivando in vitro en condiciones de
tiplicación celular. En este caso el sistema es oscuridad.
más dependiente de reguladores del tipo de Es recomendable además lograr que la tasa
las citocininas. En algunos casos, como ocu- de intercambio gaseoso entre los ambientes
rre en la formación de embriones somáticos, del recipiente y externo sea óptima, evitándose
se requiere de una tercera y cuarta etapa, de- la acumulación de CO2 y de etileno. En este
nominadas de maduración y de germinación sentido el sellado del recipiente es importante,
respectivamente, cuya duración varía entre 1 el intercambio gaseoso es más limitado con el
a 2 semanas. Para la etapa de maduración se empleo de una tapa de plástico que con un film
adiciona ABA (ácido abscícico) al medio basal de polietileno extensible. La utilización de una
en rangos de 5 a 20 μM, seguido del subcultivo tapa perforada con tapón de gomaespuma es
a un medio basal conteniendo AG (ácido gibe- altamente recomendable (Fig. 2).
rélico) en concentraciones de 0,1-1 μM, cuyo El principal problema que puede presentarse
fin es lograr la germinación de los embriones durante los sucesivos subcultivos in vitro es la
obtenidos. vitrificación. La cual consiste en un proceso de
Los tipos de auxinas más empleados son morfogénesis anormal con cambios anatómi-
IBA, 2,4-D, AIA, ANA y picloram, y las citoci- cos, morfológicos y fisiológicos que producen
ninas BA, CIN, ZEA, 2ip y TDZ. El rango de
concentración empleado varía con el regulador
del crecimiento, así es que el 2,4-D, por ejem-
plo se utiliza en concentraciones de 4-35 µM
mientras que otra auxina como el IBA, tiene un
rango de 0,1 a 2 µM.
Los tipos de reguladores, sus combinaciones
y rangos de concentraciones deben ser optimi-
zados para cada especie, genotipo y etapa de
multiplicación determinada. Las condiciones
de incubación de los cultivos in vitro dependen
de las especies con que se trabaje. En el caso
de las especies subtropicales, por ejemplo, los
cultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14
horas de fotoperíodo e intensidad lumínica mo-
derada (100 μmol m-2 s-1).
La presencia de compuestos fenólicos oxi-
dados se encuentra asociada con tejidos vege-
tales sometidos a situaciones de estrés, tales
como aquel provocado por el daño mecánico Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en
producido durante el aislamiento del explanto un recipiente de vidrio con tapa metálica perforada
de la planta madre o durante la transformación. y tapón de gomaespuma, que evita la acumulación
Los compuestos fenólicos liberados al medio de CO2, etileno y excesiva humedad en el ambiente
pueden inhibir el crecimiento e incluso matar de cultivo.

hojas de una apariencia vidriosa. Este fenóme- a ¼ de la composición original, y la sacarosa
no está regulado por dos factores clave que se reduce a una concentración final de 1-2%.
son la humedad relativa y el potencial agua, y Medios con baja concentración salina, como el
afecta a dos procesos fisiológicos fundamen- WPM (Lloyd & McCown, 1981) y GD (Gresshoff
tales, la fotosíntesis y la transpiración. Debido & Doy, 1972) incrementan el porcentaje de en-
a la disfunción metabólica asociada, las plan- raizamiento de vástagos axilares en plantas
tas se vuelven completamente heterótrofas latifoliadas. El empleo de agar presenta ven-
y transpiran excesivamente debido a un mal tajas y desventajas sobre la rizogénesis. Por
funcionamiento estomático y a cambios estruc- un lado, el enraizamiento de especies fores-
turales en las paredes celulares. La principal tales en agar se favorecería al producirse una
consecuencia de la vitrificación es la baja su- rizogénesis más sincrónica como resultado del
pervivencia de las plántulas obtenida durante contacto íntimo de las estacas con el medio de
la aclimatización ex vitro. Por ello, es funda- cultivo. Sin embargo, las raíces producidas por
mental conocer el rol de los distintos factores este método son usualmente engrosadas y no
que inciden negativamente sobre el desarrollo poseen pelos radiculares. Adicionalmente, el
morfogénico normal (parcialmente autótrofo) in empleo de agar está asociado con la formación
vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, de callo en la base de las estacas, que condu-
los componentes orgánicos e inorgánicos del ce al establecimiento de conexiones vascula-
medio, los reguladores de crecimiento, la luz res interrumpidas entre raíces y vástagos.
y la temperatura. Una baja humedad relativa, Comúnmente, a fin de proceder a su enrai-
elevada irradiación, la remoción de la fuente de zamiento, los vástagos de buen tamaño prove-
carbohidratos del medio de cultivo y la defo- nientes de la etapa de multiplicación y provis-
liación de las plantas para estimular la formatos de al menos 4-5 yemas, se colocan durante
ción de hojas nuevas estimulan la fotosíntesis periodos cortos en soluciones con concentra-
y otras actividades metabólicas de las hojas ciones elevadas de auxinas. La auxina más
en forma normal. Otras estrategias para lograr utilizada es el IBA, que puede utilizarse a con-
un óptimo crecimiento implican el empleo de centraciones de 1-10 μM durante pocas horas.
retardantes del crecimiento para estimular la Alternativamente se pueden emplear niveles
formación de hojas nuevas después del trans- más bajos de auxinas (0,1 a 1 μM), pero mante-
plante. O bien, el empleo de altos niveles de niendo la inducción por un periodo más prolon-
CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la gado (3 a 7 días). Luego los vástagos se trans-
vía de lignificación y prevenir la vitrificación a fieren a un medio de cultivo basal desprovisto
través de la inhibición de la hiperhidratación, la de reguladores de crecimiento para permitir el
hipolignificación y la formación de aerénquima. desarrollo de las raíces. Aproximadamente 20
días después del tratamiento de inducción, es
Etapa 3: Enraizamiento y aclimatización posible la obtención de una adecuada cantidad
En esta etapa se produce la formación de de raíces funcionales que permitan continuar
raíces adventicias. En las especies herbáceas hacia la etapa de aclimatización.
es relativamente fácil mientras que en muchas Es importante acentuar que el uso de auxi-
especies leñosas resulta más complicada por nas a elevadas concentraciones es contrapro-
su limitada capacidad rizogénica. ducente porque induce la formación de callo
El enraizamiento puede realizarse tanto en en la base de las estacas. Por ello para cada
condiciones in vitro como ex vitro. En el primer cultivo es necesario optimizar un protocolo de
caso pueden emplearse varios tipos de subs- rizogénesis que minimice la formación de callo
tratos y reguladores de crecimiento (principal- y maximice la tasa de rizogénesis y supervi-
mente auxinas) para promover la rizogénesis. vencia de las plantas.
Los substratos incluyen: medio solidificado con El enraizamiento ex vitro permite que el en-
agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con raizamiento y aclimatización se logren simultá-
medio nutritivo o agua. En un medio solidifica- neamente y que raramente se forme callo en
do con agar, los nutrientes se reducen de ½ la base de las estacas, asegurando así una

conexión vascular continua entre el vástago y Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos
la raíz. Sin embargo, el estrés asociado a la cambiales de especies forestales condujeron,
transpiración acelerada de las plantas durante en el año 1940, a la formación de yemas ad-
las etapas iniciales del trasplante puede reducir venticias en Ulmus campestris. Durante la dé-
considerablemente la tasa de supervivencia. cada del 40 se publicaron logros adicionales en
Por ello, es conveniente contar con instalacio- al producción separada de vástagos y raíces
nes de invernadero o cámaras de crecimiento en especies latifoliadas. En 1950 se publicó
adecuadas para brindar temperatura y hume- por primera vez la obtención de organogéne-
dad relativa moderadas que permitan lograr la sis en coníferas, con la formación de vástagos
rusticación de las plantas en forma progresiva. a partir de callos de Sequoia sempervirens. En
Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes la década 1970-80 se obtuvieron las primeras
substratos, mezclas de tierra y arena y/o abo- plantas de álamo (Populus tremuloides) y Pin-
nos, los cuales convienen que estén debida- us palustris. En ambos casos la formación de
mente desinfectados. plántulas se logró vía organogénesis. Luego del
año 1975 la micropropagación de especies la-
3 Propagación de especies leñosas tifoliadas se realizó a través de la regeneración
El empleo de clones en programas de refo- indirecta, pasando por una etapa de callo.
restación de muchas especies genera al menos El principal método utilizado para especies
un 10 % de incremento en ganancia genética latifoliadas es la brotación de yemas adventi-
en relación al empleo de plantas regeneradas cias, empleando ápices de vástagos, yemas
por semillas de árboles selectos. Sin embargo, laterales y microestacas. En las coníferas, la
la máxima ganancia genética puede ser obte- elongación de las yemas axilares a partir de
nida mediante el empleo conjunto de propaga- braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy
ción sexual y agámica. La reproducción sexual exitosa. En latifoliadas de clima templado los
es importante para la introducción de genes mejores explantos los constituyen las yemas y
nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y vástagos en activo crecimiento más que las ye-
el mejoramiento de características controladas mas en estado de dormición. Los vástagos se
por efectos aditivos de genes. La reproducción colectan en primavera y a principios del verano
asexual por otro lado permite la multiplicación a fin de obtener material con reducido nivel de
de individuos o grupos de individuos seleccio- contaminación. Alternativamente las yemas en
nados de una población elite, que exhiben una dormición pueden ser colectadas y brotadas en
significativa ganancia genética debida a efec- condiciones ambientales controladas.
tos no aditivos de genes. Para la inducción de vástagos, tanto en gim-
Tradicionalmente, las especies forestales nospermas como en angiospermas, se requie-
fueron propagadas vegetativamente mediante re el empleo de citocininas. La más usada es
el enraizamiento de estacas, de braquiblastos la N6-benciladenina (BA) o también llamada
en coníferas, así como por injertos. La propa- 6-bencil amino-purina (BAP) y el tidiazurón
gación por estacas de Cryptomeria japonica (TDZ).
(cedro japonés), Populus spp. (álamos) y Salix Los medios basales más usados para an-
spp. (sauces) ha sido llevada a cabo durante giospermas son el MS (Murashige & Skoog,
siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para la 1962) o el WPM (Lloyd & McCown, 1981). Para
mayoría de los árboles propagados por estacas el caso de gimnospermas, el empleo de me-
se observa una rápida pérdida de capacidad dios reducidos en sales minerales y baja can-
de rizogénesis al aumentar la edad de la planta tidad de nitrógeno resulta mucho mejor que el
donante de las estacas. En este sentido, una empleo de un medio altamente salino y nitroge-
de las principales ventajas de la micropropa- nado como el MS.
gación es la capacidad potencial de desarrollar La inducción de yemas adventicias es el
protocolos de multiplicación optimizados para método más empleado para gimnospermas y
multiplicar árboles adultos que han demostra- angiospermas. En este caso, las yemas se in-
do ser fenotípicamente superiores. ducen directamente sobre el explanto en ge-

neral sin previo pasaje por una etapa de ca- traciones mayores a 1 μM si se trata de BA y
llo. En general, cuanto más joven es el tejido, entre 0,1-1 μM en el caso del TDZ.
tanto mayor es la respuesta a los tratamientos Los explantos jóvenes de especies leñosas,
que conducen a la organogénesis de novo. particularmente angiospermas, a menudo se-
Los explantos más frecuentes son embriones cretan al medio de cultivo polifenoles oxidados,
cigóticos maduros, seguido de cotiledones y visibles como pigmentos marrones y/o negros.
epicótilos de plántulas. Generalmente se uti- Se observa también, que en los explantos de
liza BA a concentraciones mayores o iguales árboles adultos el problema se acentúa. Por
a 5 ppm como única fuente de inducción o en ello se recomienda el empleo de explantos pri-
combinación con otras citocininas. La adición marios juveniles.
de auxinas puede ser beneficiosa, aunque en Los tipos de explantos más utilizados para el
coníferas se ha encontrado que promueve la establecimiento in vitro son los segmentos no-
formación de callo y reduce el proceso de or- dales de explantos juveniles, las yemas axila-
ganogénesis. res obtenidas por rejuvenecimiento de plantas
En algunos casos, como en Populus spp., adultas, y los embriones cigóticos y plántulas
la formación de yemas adventicias se logra a obtenidas de semillas de origen sexual.
partir de un callo originado a partir de tejido La desinfección de los mismos se logra me-
cambial. diante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2 mi-
El método llamado multiplicación mediante nutos) seguido de una solución de lavandina
nódulos meristemáticos es un método también comercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de cloro
utilizado para Pinus radiata y álamo. En este activo durante 5-30 minutos. En la mayoría de
caso se obtiene básicamente un tejido meris- los casos se emplean agentes tensoactivos, ta-
temático (no un verdadero callo) usando re- les como Triton ó Tween 20, adicionados en
laciones altas de auxina/citocinina para luego la solución de lavandina. En todos los casos
inducir la producción de vástagos. los explantos son lavados finalmente varias ve-
La disponibilidad de protocolos vía embriogé- ces con agua destilada estéril.
nesis somática para especies forestales es aún Los medios basales más empleados son el
limitada. En la angiospermas los primeros em- MS, formulado por Murashige & Skoog (1962),
briones somáticos se obtuvieron de Santalum diluido a la mitad o a un cuarto de su formula-
album, donde sin embargo no fue posible la ob- ción original o el WPM, formulado por Lloyd &
tención de plantas completas. Recién 20 años McCown (1981). Como medios de multiplica-
después pudieron lograrse plantas completas ción se emplean además el BTM (broadleaved
de abeto (Picea abies), una gimnosperma. En tree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Pé-
las gimnospermas los mayores éxitos se lo- rinet y Lalonde (1983). Los reguladores de cre-
graron empleando como explantos embriones cimiento más utilizados son ANA y BA. Tam-
cigóticos maduros e inmaduros. En la mayoría bién han sido efectivas auxinas como IBA y
de los casos los embriones se originan en for- 2,4-D, y citocininas como 2iP, CIN, ZEA y TDZ.
ma indirecta a partir de callos embriogénicos En la Fig. 3 se muestran las etapas de la mi-
o bien, directamente desde el explanto. En las cropropagación de plantas de paraíso gigante,
coníferas puede ocurrir un proceso de poliem- Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al.,
brionía previa formación de callo que condu- 2002).
ce a una alta tasa de multiplicación inicial. En
general, los medios de cultivo más efectivos 3.1 Problemas asociados a la micropro-
para estos fines contienen elevados niveles de pagación de especies leñosas
sales y suministran nitrógeno tanto como NH4+ Es mucho más difícil propagar material adul-
y NO3-. Las auxinas más comúnmente emplea- to que juvenil ya que los primeros son recalci-
das en el medio de inducción son el 2,4-D y el trantes, es decir, difíciles de regenerar. Sin em-
ANA, en concentraciones mayores de 2 μM. En bargo, aún en estos casos es posible extraer
algunos casos es necesario además el empleo explantos de mayor capacidad regenerativa
de alguna citocinina, generalmente en concen- mediante dos formas: 1) seleccionando los te-

Figura 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L.
(Olmos et al., 2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad, provin-
cia de Misiones, Danzer Forestación S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas
para generar una población de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparación del material ve-
getal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas
como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vástagos desarrollados a partir de
meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962
(MS) suplementado con 2,22 μM 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 μM ácido giberélico (GA3) + 0,25 μM
ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de multi-
plicación (medio MS suplementado con 2,22 μM BAP, estos vástagos fueron empleados como explantos
para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la
etapa de multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callo. En estos casos, el medio de
multiplicación para los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentración de BAP a 0,44
μM. F) Vástago enraizado en medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad, suplementado
con 9,89 μM IBA durante 2 días, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo
para pasar a la etapa de aclimatización.
jidos más juveniles dentro de un árbol o, 2) in- duo está determinado por la posición que ocu-
duciendo el rejuvenecimiento del árbol donante paba en la planta adulta. Esto es ocasionado
antes de aislar los explantos. por efecto del envejecimiento fisiológico e im-
plica que los explantos más reactivos in vitro se
Para seleccionar el material más juvenil en encuentran en las yemas de las áreas basales
una planta adulta hay que considerar el fenó- del tronco y raíces.
meno de topófisis. Este es un proceso por el A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso
cual el tipo de crecimiento de un nuevo indivi- de reversión temporaria de las características

adultas que permite lograr material vegetal en na, arroz), pasturas (pasto bermuda, festuca
estado de juvenilidad. En general, a fin de con- alta, raigrás, pasto llorón) y hortícolas (cebo-
trarrestar los efectos debidos a la topófisis, se lla, ajo, puerro); protocolos generales para di-
recomienda emplear tejidos juveniles, y un ta- cotiledóneas que incluyen especies hortícolas
maño de explanto muy pequeño. (tomate, papa, pimientos y zanahorias) y legu-
La juvenilidad puede lograrse por dos méto- minosas forrajeras (alfalfa, maní, trébol blanco)
dos. En primer lugar, mediante el empleo de ór- y protocolos para especies modelo como Ara-
ganos juveniles separados de plantas adultas, la bidopsis y tabaco.
utilización de estacas enraizadas o bien de bro- En todos los casos, las formas de propaga-
tes epicórmicos. En segundo lugar mediante el ción son las mismas. Se emplean vías de re-
rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciación generación por formación de yemas axilares,
de yemas adventicias y embriones (en este caso yemas adventicias y embriogénesis somática.
se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de En los dos primeros casos, el sistema de pro-
un nuevo ciclo ontogénico), del injerto de yemas pagación a través de la organogénesis directa
adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con asegura la estabilidad genética de las plantas
reguladores de crecimiento (como citocininas regeneradas y se emplean cuando el objeti-
como el BA), por la poda severa (recepado de vo es la propagación clonal a gran escala. La
árboles adultos) y, a través del cultivo in vitro de embriogénesis u organogénesis indirecta, con
meristemas. formación de callo, se emplea en cambio para
Tanto los atributos de supervivencia a campo, generar variabilidad en programas de mejora-
como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y miento.
la susceptibilidad a enfermedades de las plan- En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las
tas, tienen una correlación directa con la cali- etapas de la micropropagación incluyen tanto
dad de los vástagos durante el cultivo in vitro. la multiplicación de yemas axilares por el culti-
Un problema crucial a resolver en cada sistema vo de meristemas, la formación directa de ye-
de propagación es la calidad diferencial de las mas adventicias en explantos obtenidos a par-
raíces de las plantas regeneradas en relación a
tir de placas basales o umbelas inmaduras y la
aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las
formación indirecta de yemas adventicias y/o
plantas regeneradas de Pinus elliottii suelen te-
embriones somáticos obtenidos a partir de ca-
ner una raíz principal no ramificada y gruesa. En
llos que provienen de distintos tipos de explan-
cambio, las plantas obtenidas a través de semi-
tos (meristemas, brotes, placa basal ó raíces).
llas tienen raíces más delgadas y de mayor cre-
En el caso de alfalfa y otras leguminosas como
cimiento lateral que permiten comparativamente
un mejor anclaje y una mayor resistencia a los soja y maní la micropropagación es llevada a
vientos. cabo por la vía de la embriogénesis somática,
donde los embriones se obtienen utilizando te-
4 Propagación de especies herbáceas jidos juveniles (embriones, cotiledones y pecío-
La micropropagación de especies herbáceas los) como explantos. En algunos casos como
está orientada a proveer material libre de pató- pasto llorón (Eragrostis curvula) es posible la
genos, propagar material seleccionado por su regeneración de plantas mediante embriogé-
mayor rendimiento o por su mayor resistencia nesis, organogénesis y regeneración directa a
a enfermedades y estreses ambientales, con- partir de los explantos.
servar la diversidad específica en bancos de
germoplasma, obtener material para estudios 5 Lecturas Recomendadas
fisiológicos y genéticos y sentar las bases para
la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Caso, O. H. 1992. Juvenilidad, rejuvenecimiento y
Existe una gran variedad de protocolos, de- propagación vegetativa de las especies leñosas.
sarrollados en función de la especie y de los Agriscientia 9 (1): 5-16.
objetivos de la propagación. Existen protocolos Chalupa, V. 1983. Micropropagation of conifer
generales para monocotiledóneas como en el and brodleaved forest trees. Communicationes
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IV. Capítulo 2
Semilla Sintética
Hebe Y. Rey y Luis A. Mroginski
Concepto:
Resulta difícil tratar de determinar el origen
de la idea de la producción de semillas sintéti-
cas o artificiales. Es uno de los resultados de
la aplicación en la Agricultura de los embriones
somáticos descriptos por primera vez en 1958,
por Jakob Reinert y por F.C. Steward y co-
laboradores. Sin embargo, un gran propulsor
de su utilización para la propagación en gran
escala de plantas fue Toshio Murashige quien
en un Simposio realizado en 1977 en Ghent
(Bélgica) presentó formalmente la idea de la
producción de las semillas sintéticas, enten-
diendo como tal a un simple embrión somático
encapsulado. Esta semilla se diferencia de la
semilla verdadera en que el embrión es somáti-
co (producido por el fenómeno conocido como
embriogénesis somática) y no cigótico y que si Fig. 1.- a) Partes de una semilla sintética .b,c y d)
tiene endosperma y cubierta, éstos son artifi- Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30)
ciales (Fig.1a y b). Esta semilla, puesta en con- mediante semillas sintéticas (las barras verticales
indican 3 mm)
diciones adecuadas, germina (Fig.1c) y se con-
vierte en una planta (Fig.1d). Muchos grupos
de investigación han contribuido al desarrollo tipo de “semillas sintéticas” - de una utilización
de las semillas sintéticas. Entre ellos se deben muy restringida- no será tratado en este capí-
destacar el grupo liderado por Keith Walker de tulo.
la Compañía Monsanto que a partir de media-
dos de la década del 70 trabajaron especial- Tipos de semillas sintéticas
mente con alfalfa. También hay que mencionar Las semillas sintéticas pueden fabricarse de
la labor de Robert Lawrence de la Union Car- diferentes maneras (Fig.2). Básicamente se
bide quienes comenzaron los trabajos con es- pueden usar embriones hidratados (tal como
pecies forestales, lechuga y apio. Otros inves- resultan de la embriogénesis somática) o bien
tigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron pueden ser desecados. En algunos casos es-
sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupo tos embriones están protegidos por cubiertas
liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Ge- protectoras. De esta manera se pueden distin-
netic Inc. fue muy importante, especialmente guir 5 tipos básicos de semillas sintéticas.
por su descubrimiento de que hidrogeles como 1) Semillas sintéticas con embriones de-
el alginato de sodio podían ser utilizados para secados (Tipo 1 de la Fig. 2) sin cubierta:
producir semillas artificiales que podían germi- Es un sistema muy simple, los embriones son
nar en condiciones de invernadero. desecados hasta alcanzar porcentajes de hu-
Hay que aclarar que además del concepto medad de 8- 20%. En este caso los embriones
de semilla sintética definido más arriba, tam- no están provistos de ningún tipo de cubierta
bién es factible que en lugar de encapsular em- protectora. Embriones de alfalfa sometidos al
briones somáticos, se encapsulen yemas. Este desecamiento mostraron porcentajes de con-

versión en plantas de hasta el 95% (Cuadro 5) Semillas sintéticas con embriones so-
1), además es posible mantenerlos viables por máticos hidratados y provistos de una cu-
cerca de un año en condiciones de laboratorio. bierta protectora (Tipo 5 de la Fig. 2). Es el
sistema más usado.
Cuadro 1: Semillas sintéticas de algunas especies basadas en la desecación Por esta razón, de
de embriones sin cubierta protectora aquí en adelante
cuando se mencione
“semilla sintética” se
referirá a este tipo.
Tiene la ventaja de
que los embriones
no están sujetos a
la desecación que
constituye la princi-
2) Semillas sintéticas con embriones so- pal causa de los bajos valores de conversión
máticos desecados y provistos de cubierta en plantas. Si bien se han ensayado numero-
protectora (Tipo 2 de la Fig. 2). Los embrio- sas sustancias para encapsular a los embrio-
nes de zanahoria y apio fueron recubiertos con nes somáticos (agar, gelrite, gomas), una de
polyoxietileno y luego desecados. Los resulta- la técnicas más usadas consiste en lograr la
dos han mostrado que si bien es factible lograr formación de una cubierta protectora de algi-
que los mismos sobrevivan, la conversión en nato de calcio que es un compuesto que ade-
plantas es realmente baja. más de no ser tóxico para el embrión permite
3) Semillas sintéticas con embriones hi- una rápida formación de la cubierta. El proce-
dratados sin cubierta (Tipo 3 de la Fig. 2). so es muy simple (Fig. 3) y consiste básica-
Es el sistema más simple, consiste en utilizar mente en sumergir los embriones somáticos
los embriones somáticos tal como resultan del en una solución de alginato de sodio (2%) y
proceso de la embriogénesis somática sin nin- luego sumergirlo en un agente acomplejante
gún tipo de cubierta protectora. Este sistema [por ejemplo 100 mM de Ca (NO ) ]. Con esta
ha sido desechado en la práctica por la escasa 3 2
técnica se genera una semilla sintética consis-
conversión de embriones en plantas.
tente de un embrión somático con una cubierta
4) Semillas sintéticas con embriones so-
seminal y un endosperma artificial (Fig.1a y
máticos hidratados suspendidos en un gel
b). Eventualmente estas cápsulas pueden ser
viscoso (¨fluid drilling¨) (Tipo 4 de la Fig. 2).
recubiertas por sustancias tales como el po-
Inicialmente fue desarrollado en zanahoria y
lioxietilenglicol que sirven para mantener una
más recientemente con batata.
adecuada hidratación de las cápsulas y em-
briones. Este procedimiento ha posibilitado la
obtención de semillas sintéticas de numerosas
especies de interés económico entre los que
se pueden mencionar la alfalfa, la zanahoria, el
apio y especies forestales como Picea abies,
Pinus radiata, Santalum album y Pseudotsuga
menziesii.
Producción de semillas sintéticas

En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos que
se deben tener en cuenta para la producción y
manipulación de las semillas sintéticas.
En primera instancia es necesario contar con
un eficiente sistema que asegure la inducción
Fig.2.- Tipos de semillas sintéticas in vitro de la embriogénesis somática que brin-

Fig.3.- Inducción de la embriogénesis somática (a-d); selección de embriones somáticos (e); inmersión
de los embriones en alginato de sodio (f); acomplejamiento con nitrato de calcio (g); lavado (h); semilla
sintética (i)
de la producción de embriones sin la necesi-

dad de la fusión de gametas. Estos embriones
deben ser estructuras bipolares perfectas (con
un polo que genere el vástago y el otro la raíz)
capaces de convertirse (“germinar”) en plantas
enteras. Si bien la existencia de embriogénesis
somática ha sido informada en centenares de
especies de Angiospermas y Gimnospermas,
en muchos casos no es de utilidad para iniciar
la producción de semillas sintéticas debido a
la baja tasa de producción deembriones aptos
para la encapsulación.
En los últimos años se han hecho notables
avances en el conocimiento de los factores que
regulan la embriogénesis somática. Sin embar-
go aún se dista mucho de conocer las bases
genéticas de este fenómeno cuya ocurrencia,
in vitro, si bien ha sido descripta en centenares
de especies de Angiospermas y casi otro tanto
de Gimnospermas, en muchos casos no es de Fig. 4. Etapas en la producción de las semillas
utilidad para iniciar la producción de las semi- sintéticas

llas sintéticas, por su baja tasa de producción el suelo. Este aspecto está afectado por va-
de embriones aptos para ser encapsulados. rios factores entre los que figuran, el tipo de
El segundo paso consiste en lograr una pro- embrión, la calidad del endosperma sintético,
ducción sincronizada y en gran escala de los la dureza de la cápsula y la protección contra
embriones. Es fundamental contar con embrio- agentes patógenos.
nes simples que no se fusionen entre sí y que El tipo de embrión es quizás el factor más im-
en un momento determinado se encuentren en portante que influye en la calidad de la semilla
estado cotiledonar y que no generen embrio- sintética. Deben poder generarse rápidamente,
nes secundarios. Diferentes procedimientos en grandes cantidades, no fusionarse entre sí,
(basados en filtros y equipos clasificadores au- ni formar callos. Deben desarrollarse de mane-
tomáticos) han sido desarrollados para selec- ra sincronizada y convertirse rápidamente en
cionar estos embriones. Para la producción en plantas. Es altamente deseable que conserven
gran escala se han desarrollado varios diseños su viabilidad por largo tiempo en condiciones
de bioreactores y sistemas mecanizados de de laboratorio o mantenidos en refrigeradores
encapsulamiento adaptados a las particulari- comerciales. Generalmente la falta de embrio-
dades de cada especie. nes de calidad es el factor limitante de la pro-
Se trabaja mucho para lograr una adecuada ducción de semillas sintéticas.
maduración de los embriones que es un pro- El endosperma sintético tiene que proteger
ceso esencial para la obtención de altos valo- y nutrir al embrión hasta que germine y pue-
res de conversión en el suelo. Investigaciones da crecer autotróficamente. En este punto es
hechas con alfalfa han mostrado la utilidad del preciso recordar que si bien los embriones so-
empleo de tratamientos con ácido abscísico, máticos son muy similares a los embriones ci-
maltosa y del pretratamiento con temperaturas góticos, carecen de las sustancias de reserva
bajas (4ºC). necesarias para su conversión en plántulas. El
El almacenamiento de las semillas sintéticas endosperma sintético generalmente está com-
es otro aspecto importante a tener en cuenta. puesto de los mismos medios de cultivo que
Lo ideal sería que las semillas sintéticas tuvie- se usan para inducir la germinación in vitro de
ran un comportamiento similar al de la mayo- los embriones. Estos medios contienen macro
ría de las semillas verdaderas y permanecie- y micronutrientes, vitaminas, sacarosa y sus-
ran viables por mucho tiempo. Los resultados tancias reguladoras de crecimiento. La compo-
obtenidos con semillas sintéticas de muchas sición de este endosperma lo hace susceptible
especies muestran que aún hay que trabajar al ataque de patógenos, por lo que también se
arduamente para que ello ocurra. Las técnicas incorporan compuestos de acción fungicida y
de la cryopreservación con nitrógeno líquido bactericida. Es común el agregado de 1-5 mg/L
podrían resolver este punto. de benomyl y de algunos antibióticos como ce-
Por último lo ideal es que la semilla sinté- fatoxina o ampicilina.
tica sea sembrada directamente al suelo con La dureza de la cápsula puede afectar, por
un alto porcentaje de conversión en plantas. acción mecánica o por dificultar la respiración,
Muchos factores inciden negativamente para la conversión de los embriones en plantas. Es
que ello ocurra. Por ahora en la mayoría de los reconocido que la dureza debe ser del orden
casos, las semillas sintéticas son sembradas de 0,2 y 2 Kg/cm2 de presión, la que puede ob-
primeramente en cámaras climatizadas o en tener mediante una adecuada manipulación de
invernaderos para luego ser llevadas al campo. la concentración del alginato y de los tiempos
de la reacción del acomplejamiento.
Calidad de la semilla sintética
Un aspecto de gran importancia tecnológica Ventajas del empleo de semillas
es el contar con semillas sintéticas que, ade- sintéticas
más de no generar variantes somaclonales, La mayoría de las plantas de interés econó-
tengan un alto porcentaje de conversión en mico son propagadas mediante semillas verda-
plantas cuando las mismas son sembradas en deras. Éstas constituyen excelentes propágu-

los que pueden ser producidos a bajo costo, en heterogéneas (té, yerba mate, paraíso) y es re-
forma rápida, y pueden ser sembrados mecáni- comendable su propagación asexual. También
camente. Además la mayoría de ellas pueden es el caso de muchos híbridos y de plantas
ser conservadas fácilmente por mucho tiempo. que no producen semillas verdaderas o bien el
Sin embargo hay muchas plantas que no se caso de ciertas plantas transgénicas. En todas
propagan mediante las semillas verdaderas y estas situaciones el uso de semillas sintéticas
lo hacen a través de partes vegetativas (Es el es ventajosa. Las plantas serán clonadas, es
caso entre otras de la caña de azúcar, mandio- decir cada planta derivada de una semilla sin-
ca, ajo, frutilla, papa, batata, varios árboles y tética será una copia fiel de la planta madre,
plantas ornamentales). Otras especies tienen utilizando sembradoras similares a las que
semillas de poca calidad (Muchas coníferas). hoy se emplean con las semillas verdaderas.
En algunos casos si bien las plantas pueden Adicionalmente las semillas sintéticas podrán
propagarse por semillas, presentan dificulta- actuar como transportadoras de reguladores
des para su germinación (por ej. yerba mate) de crecimiento, microorganismos y pesticidas
o bien debido al alto grado de heterocigosis que se quieran incorporar durante la siembra,
las poblaciones derivadas de semillas son muy los costos de los transplantes se verán redu-
Cuadro 2. Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosas subtropicales de inte-
rés para Argentina y Estado actual de su desarrollo.v

cidos, las poblaciones serán genéticamente Lecturas recomendadas
uniformes y podrán ser comercializadas cier-
tos híbridos de plantas resultantes de costosas Cantliffe, D. J. (2001) Bioreactor technology in plant
manipulaciones manuales. cloning, Proceedings of the Fourth International
En el Cuadro 2 se señalan algunas especies Symposium on In Vitro Culture and Horticultural
para las cuales sería necesario contar con un- Breeding. Acta Horticulturae.560:345-351.
Carlson, W. C. J. E. Hartle. (1995). Manufactured
sistema de semilla sintética.
seeds of woody plants. In S.M. Jain , P KGupta,
La falta de una difusión más masiva de esta
R.J. Newton (eds.) Somatic embryogenesis in
tecnología en la actualidad obedece por un woody plants. London, Kluwe Acad. Press. 1:
lado a razones técnicas (En muchas especies 253-263.
aún no se ha logrado inducir eficientes siste- Gray, D. J. (1991). Somatic embryogenesis and
mas que permitan la generación de grandes development of synthetic seed technology.
cantidades de embriones somáticos de cali- Critical Reviews in Plant Sciences 10: 33-61.
dad) y económicos (Cálculos hechos en alfalfa Guerra, M. P. T., A.C. Teixeira, (1999). Embriogenese
indican que su costo de producción supera en somática e sementes sintéticas. In: A.C.Torres,
casi cien veces el costo de producción de la L.S.Caldas, J.A.Buso (eds.) Cultura de Tecidos
semilla verdadera. Sin embargo, este costo es e Transformacao Genética de Plantas. CBAB.
Embrapa. Brasilia . 2: 533-568.
casi similar o incluso inferior al de la producción
Ibaraki, Y. K., (2001). Automation of somatic embryo
de semillas verdaderas de algunos híbridos de
production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture.
alcaucil, geranio y gerbera. 65: 179-199.
Jiménez González.A., E.Q. Mendoza (1998) In
CONCLUSIONES :Pérez Ponce,J.N. (ed.) Propagación y Mejora
Si bien aún el uso de la semilla sintética en la Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto
Agricultura es insignificante y sólo es utilizada de Biología de Plantas.Santa Clara. Cuba.
en cierto grupos de árboles forestales, hay co- pp.225-240.
incidencia en el mundo en que esta tecnología McKersie,B.D., D.C.W.Brown (1996) Somatic
se va a convertir en un futuro cercano en el embryogenesis and artificial seeds in forage
principal método de propagación de las plan- legumes. Seed Science Research 6: 109-126.
Mroginski, L. A. H.Rey ,S. Olmos, V. Gonzalez
tas. Los progresos logrados en los últimos 20
(1995). Semillas artificiales para la propagacion
años han sido notables. Sin embargo hay que de plantas. Paradigmas 1: 5-9.
incrementar las investigaciones básicas sobre Timmis,R. (1998). Bioprocessing for tree
embriogénesis somática para luego abordar production in the forest industry: Conifer somatic
los aspectos ïndustriales¨ de la producción en embryogenesis. Biotechnol. Progress 14:156-
gran escala de las semillas sintéticas. En la Ar- 166.
gentina, si bien esta tecnología podría ser usa-
da teóricamente en todas las Angiospermas y
Gimnospermas, en la actualidad la mayor de-
manda de su utilización proviene de producto-
res de plantas leñosas, con los cuales un rá-
pido diagnóstico de lo que sucede en el área
subtropical (Cuadro 2) nos ubica a Argentina
en un estado de desarrollo inicial, con capaci-
dad técnica y humana para encarar la produc-
ción de las semillas sintéticas.

IV. Capítulo 3 y en otros casos resulta sumamente costoso
y los riesgos de pérdidas por manipulación o
desastres naturales son muy altos. Por lo tan-
Conservación de Germoplasma to, se buscó implantar nuevas estrategias para
in vitro. conservar los recursos genéticos en forma más
eficiente.
Adriana Scocchi y Hebe Rey Los métodos de conservación de germoplas-
ma se pueden dividir en:
Abreviaturas usadas en este capítulo: Métodos de Conservación in situ;
DMSO (Dimetilsulfóxido); PVP (Polivinilpirro- Métodos de Conservación ex situ.
lidona); PVS2 (30% glicerol, 15% etilenglicol, Los primeros se basan en la conservación
15% DMSO, 0.04M sacarosa), TTC (Cloruro de las plantas en sus habitats naturales e in-
2,3,5–Trifenil-Tetrazolio), PEG (Polietilengli- cluyen la conservación en Parques Nacionales
col). y en Reservas Ecológicas, los cuales requie-
ren un considerable espacio físico, altos cos-
Introducción tos asociados a la necesidad de mano de obra
Desde sus inicios, el hombre ha dependido especializada, control permanente de enferme-
básicamente de los vegetales como fuente de dades y malezas, a la par que las plantas están
energía. Al aumentar rápidamente la población, expuestas a las inclemencias del clima y de los
se ha hecho necesario implantar técnicas de incendios.
explotación, en particular agropecuarias, que Por otra parte, los métodos de conservación
han contribuido a la destrucción de las pobla- ex situ se basan en el mantenimiento del ma-
ciones pioneras vegetales que fueron producto terial biológico en bancos de semillas, bancos
de siglos de evolución. Por otro lado, las téc- de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en
nicas modernas de producción de variedades campo, viveros, jardines botánicos).
mejoradas altamente homogéneas han provo- En general, los bancos de semillas consti-
cado la reducción de la variabilidad genética tuyen uno de los métodos más convenientes
de las especies cultivadas, ocasionando una para la conservación de germoplasma ex situ,
“erosión genética”. porque permiten almacenar una gran variabili-
En este contexto es cuando se recurre a las dad genética en forma económica y práctica.
fuentes genéticas originales de la variabilidad, Para la conservación de semillas la Internatio-
las que se deben preservar adecuadamente. nal Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI)
Cuando se habla de preservación de germo- recomienda su desecación hasta un 3-7% de
plasma hay que subrayar que el objetivo es humedad y su almacenamiento a bajas tem-
conservar, con la mayor integridad posible, la peraturas (-18ºC). Este protocolo de conserva-
variabilidad genética de las poblaciones selec- ción es en general el más recomendado para la
cionadas. mayoría de las especies que se propagan por
semillas y cuyas semillas resisten la deseca-
Métodos empleados para la conservación ción sin que ello implique pérdida de viabilidad.
de germoplasma: A las semillas que presentan estas caracterís-
La estrategia a seguir para la conservación ticas se las denominan “semillas ortodoxas”
de germoplasma, depende de la naturaleza del como por ejemplo las semillas de arroz, trigo,
material vegetal, y está definida por la duración avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo,
de su ciclo de vida, el modo de reproducción y en ciertos casos este método de conservación
el tamaño de sus individuos. De acuerdo con no es aplicado, porque la especie se propaga,
estas características se han intentado diversas en la práctica, vegetativamente (como la man-
alternativas de conservación, que van desde el dioca, papa, caña de azúcar, plátanos y bana-
tradicional banco de semillas hasta el manteni- nos) o bien porque sus semillas pierden rápi-
miento de áreas de reservas. Sin embargo, en damente la viabilidad cuando son sometidas a
muchos casos el mantenimiento no es posible procesos de desecación. A estas semillas se

las denominan “semillas recalcitrantes”. Las tardantes del crecimiento, deshidratadores de
semillas de numerosas especies que viven en tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente
zonas tropicales o subtropicales se incluyen en de cultivo. La modificación de uno o más de es-
esta categoría, como por ejemplo las de coco, tos factores es usada para la conservación de
cacao, frutales tropicales perennes y diversas numerosas especies, como por ejemplo para la
palmeras. conservación de microestacas de Manihot es-
Otro método de conservación de germoplas- culenta; de vástagos de especies de Fragaria,
ma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de te- Ipomoea, Rubus, Musa, Saccharum, Zingiber,
jidos. El descubrimiento de la totipotencialidad Ananas, Coffea, Dioscorea y de microtubércu-
de las células vegetales y la posibilidad de delos de Solanum. Estas técnicas de almacena-
sarrollar plantas normales y completas a partir miento se realizan a mediano plazo, es decir,
de diferentes explantes, ha permitido pensar se basan en reducir el metabolismo celular y
en el establecimiento de bancos de germoplas- con ello reducir el crecimiento y el número de
ma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Al- subcultivos durante meses hasta un año, sin
gunos de los primeros estudios sobre el man- que ello afecte la viabilidad de los cultivos. En
tenimiento in vitro del germoplasma fueron rea- el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de
lizados en mandioca en el Centro Internacional Botánica del Nordeste (IBONE), en la Facultad
de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el de Ciencias Agrarias de la UNNE, desde hace
Centro Internacional de la Papa (CIP). Recién varios años se llevan a cabo experimentos re-
en 1980 se reconoció el potencial de los méto- feridos a la conservación de germoplasma de
dos del cultivo in vitro para la conservación de paraíso (Melia azedarach). Utilizando como
especies de plantas "difíciles". Este término se explantes meristemas de clones selectos de
refiere a las especies propagadas vegetativa- paraíso mantenidos durante 12 meses a tasas
mente en forma obligada o que tienen semillas de crecimiento reducidas (medios de cultivo
recalcitrantes. En estos casos, la conservación subóptimos o empobrecidos y en condiciones
de los genotipos se realiza mediante el mante- de oscuridad se logró mantener con éxito y re-
nimiento de plantas vivas o mediante el cultivo generar plantas de paraíso que actualmente se
in vitro de ápices caulinares o de nudos. encuentran en evaluación a campo (Fig. 1). Asi-
El mantenimiento de los recursos fitogenéti- mismo en el IBONE, se realizan experimentos
cos mediante los métodos del cultivo in vitro se tendientes a optimizar las técnicas de conser-
logra haciendo cambios en el ambiente de cul- vación in vitro a largo plazo que consisten en
tivo para desacelerar el crecimiento de las cé- el almacenamiento a temperatura del nitrógeno
lulas y de los tejidos. El objetivo es aumentar al líquido (-196ºC) –crioconservación- con lo cual
máximo el período de transferencia del cultivo. se consigue la supresión del crecimiento hasta
Es esta necesidad la que estimuló algunos de llegar a un estado de "suspensión animada".
los primeros estudios sobre el mantenimiento En el Laboratorio del IBONE se ha logrado con
in vitro del germoplasma de diversas especies. éxito la crioconservación de meristemas de
Este método cubre un amplio espectro de técni- paraíso aplicando la técnica de encapsulación-
cas que implican el cultivo, bajo condiciones de desidratación (Fig. 1).
asepsia, de órganos o fragmentos de órganos Las técnicas de conservación de germo-
(meristemas, semillas, embriones somáticos, plasma mediante el uso de la crioconservación
embriones cigóticos, hojas, tallos, raíces, ye- ofrecen varias ventajas en relación con las
mas, polen, anteras, callos o protoplastos), en técnicas tradicionales de conservación, pues
un medio de cultivo artificial definido, bajo con- permiten la conservación a largo plazo (años),
diciones ambientales controladas. Esta técnica presenta bajos costos de mantenimiento, una
ha sido usada para mantener colecciones en fácil manipulación de las muestras y no depen-
crecimiento mínimo, para lo cual se requiere: den del suministro eléctrico.
reducir la temperatura, reducir las condiciones Desde que en 1968 se informara acerca de
de luminosidad, modificar el medio de cultivo, la crioconservación de células de lino y luego
adicionar al mismo inhibidores osmóticos o re- de los resultados satisfactorios que se obtuvie-

Figura 1: Estrategias para la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach L.), desarrolla-
das en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE. Facultad de Ciencias Agrarias. UNNE
ron con la crioconservación de meristemas de La crioconservación consta de siete pasos:

frutilla en el Instituto de Biotecnología de Plan-
tas en Sakatoon - Canadá, se iniciaron en 1985 1.- Selección del material a crioconservar:
algunas investigaciones colaborativas entre el Cuando se realiza la selección del material
CIAT y el IPGRI para desarrollar esta técnica a crioconservar, se debe tener la absoluta se-
con el cultivo de meristemas de mandioca. A guridad de que a partir del mismo se obtienen
partir de estos estudios, numerosos trabajos plantas completas. El explante seleccionado
dan muestra de la importancia de esta técnica, depende del objetivo de conservación y está
de sus usos y aplicaciones. estrechamente relacionado con el tipo de pro-

pagación de la especie. Por ejemplo en el caso do la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo
de la mandioca, la cual se propaga principal- la permeabilidad de las células.
mente por vía asexual (mediante estacas), se
conserva su germoplasma in vitro en el CIAT 4.- Almacenamiento:
mediante el cultivo de microestacas y también De acuerdo al material vegetal que se utilice,
de meristemas con lo cual paralelamente a la se presentan dos grandes sistemas:
conservación se consigue el saneamiento de -Sistemas Secos: comprende todos aque-
los cultivares. Además, se están realizando es- llos tejidos vegetales endógenamente resisten-
tudios para la crioconservación de meristemas. tes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la
deshidratación.
2.- Deshidratación:
-Sistemas Hidratados: son todos aquellos
La deshidratación del explante es un paso
tejidos vegetales no tolerantes a las bajas tem-
crucial para el éxito de la crioconservación, ya
peraturas y a la deshidratación por lo que se re-
que es necesario eliminar toda el agua libre
quiere una protección exógena. Esta protección
presente en el tejido vegetal, minimizando así
las posibles pérdidas por congelación. La des- puede estar dada por el uso de crioprotectores
hidratación del tejido puede realizarse en una o bien por la utilización de soluciones de vitrifi-
cámara a 0ºC o en cámaras herméticamente cación.
cerradas utilizando sustancias higroscópicas Los sistemas secos, por ser más resistentes
como por ejemplo: silica gel, glicerol (5 - 20%), necesitan menor preparación para su almace-
o sometiendo al explante a una corriente de namiento y comprende aquellas especies que
aire en un flujo laminar de aire estéril. habitan zonas frías y/o templadas. En cambio,
los sistemas hidratados son más susceptibles
3.- Aclimatación: al frío y están representados por todas aquellas
La aclimatación se puede realizar en forma especies que habitan zonas tropicales y sub-
rápida o lenta. La aclimatación rápida consiste tropicales, las cuales no están adaptadas para
en colocar el explante directamente en el ni- soportar temperaturas inferiores a 0ºC, por este
trógeno líquido, con o sin la adición exógena motivo estos tejidos deben ser protegidos exó-
de crioprotectores; mientras que la aclimata- genamente mediante el uso de crioprotectores.
ción lenta se realiza bajando gradualmente la
temperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe 5.- Descongelamiento y Rehidratación:
ser manejado cuidadosamente pues una des- Cuando se desea recuperar al explante del
hidratación excesiva de las células puede ex- nitrógeno líquido, se puede realizar un descon-
ponerlas a una alta concentración interna de
gelamiento rápido a Baño María (generalmente
los solutos. Por esta razón generalmente el
1-2 min. a 30 ó 40ºC) o en forma lenta some-
material se congela lentamente, a una veloci-
tiendo al explante a temperatura de laboratorio
dad adecuada hasta alcanzar una temperatura
o a una corriente de aire en el flujo laminar de
próxima a los -40ºC y luego se lleva a nitrógeno
líquido (-196ºC). aire estéril.
Para preparar (aclimatar) al explante a las
bajas temperaturas se utilizan sustancias crio- 6.- Test de Viabilidad:
protectoras como azúcares (sacarosa, gluco- Los tests de viabilidad nos permiten com-
sa); alcoholes (glicerol, etilenglicol, manitol y probar las zona/s del tejido que ha/n muerto y
sorbitol), DMSO, PVP, o también pueden uti- cual/es ha/n sobrevivido al frío. La evaluación
lizarse soluciones de vitrificación, que son una de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma
combinación de crioprotectores tal como el visual, realizando el recultivo y determinando
PVS2. Tanto los crioprotectores como las solu- la capacidad de regeneración, utilizando TTC
ciones de vitrificación actúan fundamentalmen- que colorea el tejido que ha sobrevivido a la
te como agentes anti-congelantes, aumentan- crioconservación; o midiendo la conductividad

eléctrica, que permite estimar el daño produci- básicamente pueden resumirse en técnicas de:
do en las membranas celulares. - Encapsulación-Deshidratación
En la última década, han surgido numerosas - Vitrificación
técnicas que combinan el uso de crioprotecto- - Encapsulación-Vitrificación
res y de soluciones de vitrificación con técnicas - Desecación
de deshidratación y encapsulación, las cuales - Precultivo
Cuadro Nº 1: Utilización de técnicas de crioconservación en diferentes explantes de algunas especies de

interés agronómico.

- Precultivo-Desecación debe estar relacionado con el tamaño del ex-
- Gotita Congelada. plante y la misma debe ser removida rápida-
mente luego del descongelado.
En el Cuadro Nº 1 se detallan las especies
y explantes en los cuales cada una de estas Encapsulación-Vitrificación:
técnicas ha sido empleada con resultados sa- La técnica de encapsulación-vitrificación, es
tisfactorios. una combinación de las técnicas de encapsu-
lación-deshidratación y vitrificación. Las mues-
Encapsulación-Deshidratación: tras son encapsuladas en alginato de calcio
La técnica de encapsulación-deshidratación y sometidas a vitrificación durante el enfria-
esta basada en el desarrollo de la metodología miento. Comparada con la técnica de encap-
aplicada a las semillas sintéticas, en la cual un sulación-deshidratación tiene un 30% más de
explante es recubierto por una matriz de algina- supervivencia. Esto puede explicarse debido a
to de sodio y polimerizado en una solución de que las cápsulas de alginato de calcio reducen
cloruro de calcio formando un gel alrededor del la toxicidad de las soluciones de vitrificación.
explante de alginato de calcio. Una vez llevada
a cabo la encapsulación, se realizan pre-tra- Desecación:
tamientos generalmente con sacarosa (desde La técnica de desecación es un proceso muy
0.3 hasta 1.5M), que actúa como crioprotector simple que sólo requiere la deshidratación del
del explante. En especies tolerantes al frío, la material vegetal, la cual es crucial para el éxito
exposición de las plantas madres a bajas tem- de la crioconservación. Esta técnica consiste en
peraturas durante varias semanas previas a la someter al explante a una corriente de aire en
criopreservación, incrementa la supervivencia. un flujo laminar o en cámaras herméticamente
La deshidratación puede llevarse a cabo so- cerradas conteniendo silica gel; luego de lo cual
metiendo las cápsulas de alginato (contenien- se realiza un enfriado rápido, sumergiendo el
do a los explantes) a una corriente de aire en el material directamente en nitrógeno líquido.
flujo laminar o exponiéndolas en cámaras her-
méticamente cerradas con silica gel. Las cáp- Precultivo:
sulas así deshidratadas pueden ser llevadas La técnica del pre-cultivo, involucra la incor-
directamente a inmersión en nitrógeno líquido poración de crioprotectores (durante distintos
o bien a un descenso lento de temperatura. tiempos que dependen del explante) antes del
enfriamiento; como por ejemplo la adición de
Vitrificación: altas dosis de sacarosa para la crioconserva-
Esta técnica, involucra el pre-tratamiento de ción de meristemas de Musa spp.; la utiliza-
las muestras con soluciones de vitrificación. ción de PEG y DMSO en embriones cigóticos
Ejemplos de estas soluciones muy utilizadas de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la
en el mundo son el PVS2 o bien otra compues- utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en
ta por 40% etilenglicol, 15% sorbitol y 6% albú- semillas, embriones cigóticos, polen y anteras
mina sérica bovina. de Oryza spp. y la utilización de ácido abscísico
Luego de la exposición a las soluciones de para la conservación de líneas celulares y de
vitrificación (generalmente a una temperatura callos de Oryza sativa.
de 0ºC para disminuir los riesgos de fitotoxici-
dad), las muestras pueden ser sumergidas di- Precultivo-Desecación:
rectamente en nitrógeno líquido o llevadas a un Esta técnica es una combinación de dos téc-
descenso lento de temperatura. Las soluciones nicas descriptas anteriormente. Las muestras
crioprotectoras usadas en los protocolos de vi- son tratadas con crioprotectores, parcialmente
trificación, son generalmente tóxicas para las desecadas y luego sometidas a enfriamiento
células y el tiempo de exposición a la solución rápido o lento. Generalmente en el precultivo se

emplean azúcares (sacarosa, glucosa) y con un importante resaltar que las técnicas de criocon-
tiempo de duración variable desde horas como servación ofrecen una alternativa muy valiosa
en el caso de la conservación de embriones cuando se piensa en conservar los recursos fi-
maduros de Cocos nucifera, en el cual el pre- togenéticos por tiempo ilimitado (años), si bien
cultivo tuvo una duración de 11-20 hs., hasta 7 hasta el momento solo se aplica como rutina
días como fue aplicado con éxito en embriones para la conservación de líneas celulares en la-
somáticos de Elaeis guineensis. boratorios de investigación y para la conserva-
ción de algunos genotipos pertenecientes a los
Gotita Congelada: géneros Rubus spp., Pyrus spp., Solamun spp.
La técnica de la microgota congelada ha sido y Elaeis guineensis.
aplicada con éxito en ápices de Solanum tube-
rosum, la misma consiste en pretratar (2-3 hs) Lecturas Recomendadas:
con DMSO en medio líquido y formar una mi-
crogota (2.5 µl) la cual se suspende sobre papel Engelmann, F. 1997. Status report on the
de aluminio y se la lleva a inmersión directa en development and application of in vitro techniques
nitrógeno líquido. Este procedimiento es una for the conservation and use of plant genetic
resources. Engelmann, F. (ed.) IPGRI :1-63.
adaptación de la técnica clásica desarrollada
Engelmann, F. and H. Takagi. 2000. Cryopreservation
para meristemas de mandioca. of tropical plant germoplasm. Current research
Esta técnica ha sido satisfactoriamente apli- progress and application. Engelmann, F. and H.
cada en 150 variedades de Solanum tuberosum Takagi (eds.) JIRCAS-IPGRI pp 496.
con un porcentaje de supervivencia del 40%. Mroginski, L.A., W.M. Roca, K.K. Kartha. 1991.
Criopreservación del Germoplasma. En: Cultivo
Conclusiones: de tejidos en la agricultura. Fundamentos y
Los recursos fitogenéticos constituyen un aplicaciones. Roca W. M. y L. A. Mroginski (eds.)
reservorio de información genética imprescin- CIAT (32):715-730.
dible para la solución de muchos de los proble- Roca, W.M., D.I. Arias y R. Chávez. 1991. Métodos
de conservación in vitro de germoplasma. En:
mas a los que se enfrenta la agricultura. Los
Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos
métodos para asegurar su conservación son y aplicaciones. Roca, W.M. y L.A. Mroginski
diversos y cada uno de ellos posee sus ven- (eds.) CIAT (31):697-714.
tajas e inconvenientes. Por ello, se considera
que el conjunto de técnicas de conservación in
situ y ex situ, son métodos complementarios,
no excluyentes, para lograr el objetivo común
de preservar los recursos fitogenéticos, como
parte esencial de una estrategia global para la
conservación de la biodiversidad.
En la última década se han producido avan-
ces significativos en el desarrollo de técnicas in
vitro de conservación. La disponibilidad de ban-
cos de germoplasma in vitro, tanto en condicio-
nes de crecimiento lento como la conservación
a temperaturas ultrabajas (crioconservación),
han contribuido a dicho avance. Algunos ejem-
plos de conservación de germoplasma en cre-
cimiento lento son usados como rutina en Cen-
tros Internacionales, como por ejemplo, para la
conservación de germoplasma de mandioca en
el CIAT Cali, Colombia y para la conservación
de germoplasma de papa en el CIP (Centro In-
ternacional de la Papa) en Perú. Además, es

PARTE V
Ejemplos de aplicaciones
de la biotecnología vegetal

V. CAPÍTULO 1 secuencias y permiten realizar estudios de
mapeo y de distribución física de secuencias,
analizar relaciones evolutivas entre especies y
Aportes de la citogenética al
estudiar la organización del genoma y la arqui-
estudio de genomas vegetales tectura nuclear. Los resultados que se obtienen
mediante la aplicación de estas técnicas faci-
Lidia Poggio, González Graciela, litan estudios de sistemática, filogenia, biodi-
Ferrari María Rosa, García Ana María, versidad, evolución, mejoramiento y biotecno-
Wulff Arturo, Greizerstein Eduardo, logía.
Tómas Pablo y Schrauf Gustavo. Las técnicas de hibridación in situ (ISH) se
refieren al FISH (Fluorescent In Situ Hybridiza-
Dedicado a la memoria del Dr. Carlos Alberto tion) o GISH (Genomic In Situ Hybridization),
Naranjo. según que se utilicen como sonda secuencias
particulares o ADN genómico total, respectiva-
1.- Introducción
mente, y serán explicadas en el apartado 5 de
La Citogenética fue definida como la discipli-
éste capítulo.
na que estudia el comportamiento y la estruc-
Resultados obtenidos por nuestro grupo de
tura de los cromosomas y su relación con la
trabajo, que se expondrán en el presente ca-
transmisión y recombinación de los genes. La
pítulo, ejemplifican como la citogenética permi-
citogenética clásica proporciona diferente nivel
te profundizar en el conocimiento del origen y
de análisis que la citogenética molecular, y am-
evolución de cromosomas y genomas comple-
bas contribuyen a los estudios taxonómicos,
tos, localizar genes o regiones cromosómicas
evolutivos y de genómica estructural y funcio-
de interés agronómico y resolver problemas
nal, aplicables en procesos de mejoramiento
sistemático-evolutivos. Estos aportes contribu-
genético convencionales o biotecnológicos.
Los principales estudios de la citogenética yen al desarrollo de programas de conserva-
clásica se basan en la determinación de las ca- ción de recursos genéticos y biodiversidad.
racterísticas del cariotipo y la identificación cro-
mosómica mediante técnicas de tinción con- 2.- Análisis del cariotipo
vencionales y bandeo cromosómico. También, El complemento cromosómico de una espe-
se evalúa el tamaño del genoma y se analiza el cie, o cariotipo, se refiere a la apariencia feno-
comportamiento meiótico de los cromosomas típica de los cromosomas en metafase mitótica
en razas, especies, híbridos y poliploides. tomando en cuenta las siguientes característi-
Los estudios citogenéticos permiten anali- cas:
zar la presencia de cromatina introgresante en • Número básico (x), número gamético (n)
cultivos y especies naturales, contribuyendo al y número somático (2n).
estudio de la transferencia de genes en progra- • Tamaño absoluto y relativo de los cromo-
mas de mejoramiento. En el área agronómica, somas.
por ejemplo, facilitaron la construcción de va- • Posición de los centrómeros.
liosos stocks de trigo como monosómicos, dite- • Número, tipo y posición de las regiones
losómicos, dobles ditelosómicos, nulisómicos organizadoras del nucleolo.
y líneas con deleciones que fueron útiles para • Cantidad y distribución de heterocromati-
realizar estudios genéticos y mapas físicos. na (detectada por bandeo cromosómico).
En planes de conservación de la biodiversi- • Tamaño del genoma.
dad la citogenética evalúa los daños genéticos • Identificación cromosómica mediante la
que los taxones puedan sufrir por el sistema de localización física de secuencias (FISH).
preservación de las semillas o por el impacto
de la polución ambiental. El número básico (x), es el número menor de
Las técnicas de citogenética molecular (hi- cromosomas necesario para que el organismo
bridación in situ) combinan información citoló- sea viable y representa el mínimo de cromo-
gica clásica con información molecular de las somas de una serie poliploide. El número ga-

mético (n), es el número de cromosomas que como poliploide serían, en muchos casos, la
llevan las gametas y puede coincidir o no con causa del surgimiento de nuevos números bá-
el número básico, de acuerdo con el nivel de sicos. Brassica napus (2n =38) posee un nú-
ploidía de la especie que se trate. El número mero básico derivado (x=19) y se originó por
somático (2n), es el número de cromosomas el cruzamiento entre B. campestris (x=10) y B.
que llevan las células somáticas. oleracea (x=9) y posterior poliploidización.
Las características del cariotipo son general- Es interesante destacar que los rearreglos
mente constantes en un grupo de especies y estructurales mencionados, al modificar la po-
aún de géneros, pero a menudo ocurren varia- sición de los genes, pueden cambiar también la
ciones estructurales y/o numéricas que pueden funcionalidad de éstos aunque no se detecten
cambiar el número, tamaño y posición centro- cambios notorios en la morfología del cariotipo.
mérica de los cromosomas y concomitante- Distintas especies pueden estar aisladas
mente, la simetría del cariotipo. reproductivamente si el híbrido entre ellas po-
Los principales rearreglos cromosómicos see rearreglos en condición heterocigota que
responsables de las diferencias cariotípicas ocasionen disturbios en el apareamiento meió-
entre grupos taxonómicos pueden modificar tico, que determinen esterilidad. Estas espe-
la forma de los cromosomas sin cambiar su cies pueden poseer pocas diferencias a nivel
número como, por ejemplo, translocaciones, bioquímico, molecular o morfológico pero sus
inversiones pericéntricas no simétricas, dupli- diferencias cromosómicas las mantendrían ais-
caciones y deficiencias. También ocurren rea- ladas reproductivamente (especies crípticas).
rreglos que modifican tanto la forma como el Cuando se realizan estudios cromosómi-
número y tamaño de los cromosomas sin alte- cos comparados no hay leyes o principios que
rar la información genética, como las fusiones permitan inferir características ancestrales o
y las fisiones cromosómicas. Estos cambios derivadas del cariotipo, ya que se pueden en-
se denominan disploides, a diferencia de los contrar grandes diferencias cariotípicas entre
aneuploides que producen perdida o ganancia especies relacionadas. Estas variaciones son
de cromosomas enteros. Por ejemplo, en la fa- dinámicas y no están relacionadas con com-
milia Asteraceae el número básico ancestral es plejidad genética u organística.
x = 9, pero hay géneros en la tribu Astereae Un análisis más preciso de la variación cario-
con grupos de especies que tienen x = 8, 6, 5 típica se obtiene empleando técnicas de ban-
y 4, originadas por cambios disploides. Si es- deo cromosómico (C o DAPI, entre otros) que
tos rearreglos, en condición heterocigota, po- revelan secuencias de ADN altamente repeti-
seen menor valor adaptativo que en condición das y regiones organizadoras del nucléolo, las
homocigota, estos últimos se pueden fijar en que pueden utilizarse como marcadores cro-
poblaciones pequeñas con elevada endocría, mosómicos. La heterocromatina constitutiva es
dando lugar a procesos de especiación cromó- un componente aditivo del genoma y presenta,
somica. en muchos grupos, variación intra e interespe-
El número cromosómico también puede va- cífica, la cual puede revelarse por las diversas
riar por poliploidía manteniéndose constante el técnicas de bandeo cromosómico. Aunque las
número básico. El trigo (x=7) ejemplifica una regiones heterocromáticas no contienen genes
serie poliplóide compuesta por especies con activos podrían tener importancia en eventos
2n=14, 28 y 42. regulatorios y en el desarrollo y la disposición
En la familia Fabaceae los procesos de dis- espacial de los cromosomas en el núcleo (Fi-
ploidía creciente y decreciente, tanto a nivel gura 1 A y B).
diploide como poliploide originaron números Las técnicas de bandeo cromosómico ofre-
básicos secundarios y series poliploides modi- cen marcadores que permiten identificar geno-
ficadas. mas y/o cromosomas, sin embargo no es posi-
Las fusiones y fisiones cromosómicas, así ble conocer las secuencias comprendidas en
como hibridación entre taxones con distinto dichos marcadores. Por lo tanto, las bandas C
número cromosómico, tanto a nivel diploide que son similares en tamaño y posición pueden

diferir en la composición de sus secuencias, C” al contenido de ADN del gameto haploide
las cuales pueden ser discriminadas utilizando y “2C” a la cantidad de ADN genómico que se
técnicas de hibridación in situ (Figura 2 E y F). encuentra en el núcleo de células somáticas no
replicadas.
Dado que la poliploidia es un importante
modo de especiación y muchas plantas con-
sideradas diploides (maíz, Arabidopsis) han
mostrado ser poliploides antiguos, los terminos
“valor C” y tamaño del genoma pueden resul-
tar ambiguos en estos casos. En un diploide
ambos términos serían sinónimos. Sin em-
bargo, en un poliploide el “valor C” represen-
ta el contenido de ADN de todos los genomas
ancestrales que lleva el núcleo gamético. En
estos casos es necesario conocer el conteni-
do de ADN del genoma básico “Cx” ya que la
poliploidía sólo aumenta el “valor C” pero no el
“Cx”. Lo esperado en un poliploide es que el
“valor C” aumente en forma directa con el nivel
de ploidía y que el “Cx” permanezca constan-
te. Sin embargo, en muchos poliploides se ob-
servó que el “Cx” tiende a disminuir a medida
que aumenta el nivel de ploidía. Esto sugiere
que ocurre disminución del tamaño del geno-
ma luego de la formación del poliploide y que
este fenómeno podría estar relacionado con el
proceso de diploidización cromosómica y ge-
Figura 1: A: Bandeo C en Metafase mitótica de Z. nómica.
m. ssp. mexicana. La flecha indica una banda C. B: Las principales causas de variación (intra o
Bandeo DAPI en centeno. La flecha muestra una interespecífica) del contenido de ADN, descar-
banda de heterocromatina telomérica. C: Dos gru- tando la variación en el nivel de ploidía, son:
pos de 5 bivalentes Diacinesis de maíz. B: Cromo-
aneuploidía, polimorfismo numérico para cro-
soma B. N: nucleolo. D: Configuración meiótica en
Diacinesis de maíz x Z. perennis (F1), se observan
mosomas accesorios (cromosomas B), rees-
5 I + 5 II + 5 III y agrupación espacial de los II. I: uni- tructuraciones cromosómicas con pérdida o
valentes, II: bivalentes y III: trivalentes. E: Dos gru- duplicación de material genético y variación en
pos asincrónicos de 5 II cada en Anafase I de maíz. el número de copias de secuencias no codifi-
F: Puentes y fragmentos en Anafase I de tricepiro. cantes.
Las flechas muestran los fragmentos y las cabezas El tamaño del genoma es muy variable en-
de flecha indican los puentes. G: Asociación secun- tre grupos de plantas. En Angiospermas oscila
daria de bivalentes en Metafase I de Senecio mada- entre 0,05 pg en Cardamine amara y 127,4 pg
gascariensis. La flecha muestra dos II agrupados. en Fritillaria assyriaca, variación que no se en-
H: Desinapsis en Profase I de Z. luxurians x Z. m.
cuentra necesariamente relacionada con nivel
ssp. mexicana (F1). N: nucleolo. Barra: 10 um en
Fig. A-F y H. Barra: 3 um en Fig. G.
de ploidía. La variación del tamaño del geno-
ma se encuentra, a grandes rasgos, relaciona-
da con diferencias en la complejidad organís-
3.- Contenido de ADN. Variación intra e mica, los virus, por ejemplo, tienen genomas
interespecífica en el tamaño del genoma más pequeños que las bacterias y éstas a su
El contenido de ADN se evalúa en general vez menores que los eucariotas. Sin embargo,
por microdensitometría con tinción de Feulgen en organismos superiores se encontró que el
o por citometría de flujo. Se denomina “valor- aumento en el valor C no es explicable por la

existencia de mayor número de genes funcio- existen mecanismos moleculares que generan
nales, ya que el contenido de ADN de un alga ADN repetido no codificante que actúa como
unicelular puede ser igual al de una angiosper- mutágeno y/o agente regulador.
ma leñosa. Esta “paradoja del valor-C” fue re- La variación intraespecífica en el conteni-
suelta cuando estudios moleculares mostraron do de ADN es aún un tópico discutido aunque
que gran parte del genoma consiste en ADN re- existen casos, como el del género Zea, donde
petido que tiene el potencial de cambiar rápida- ha sido demostrada inequivocamente. En maíz
mente en número de copias y alterar el tamaño (Zea mays ssp. mays) las diferencias en el ta-
del genoma en respuesta a eventos bióticos maño del genoma radican, principalmente, en
y abióticos. Actualmente, está demostrado que el número de cromosomas accesorios (cromo-
cambios en el tamaño del genoma involucran somas B) y en el contenido de heterocromatina
pérdida o ganancia de secuencias repetidas de los cromosomas del complemento regular,
(elementos transponibles, retroelementos, mi- que está representada en gran parte por blo-
crosatélites, macrosatélites, etc). Estas se lo- ques heterocromáticos denominados “knobs”.
calizan en regiones intergénicas y pueden es- Estudios citogenéticos clásicos realizados, por
tar dispersas en el genoma o en arreglos en nuestro grupo de investigación en razas nati-
tandem. Aunque los elementos transponibles vas del Noroeste argentino (NOA), revelaron
son transcripcionalmente inactivos pueden ac- la existencia de una correlación positiva entre
tivarse en condiciones de variación o estrés cromosomas B y altitud de cultivo, sugiriendo
ambiental. El estrés genómico producido por
un significado adaptativo para estos cromoso-
la hibridación interespecífica y la poliploidiza-
mas accesorios. Además, el análisis de la va-
ción, en la naturaleza o como consecuencia de
riabilidad microsatélite en estas razas de maíz
prácticas de mejoramiento, puede, en algunos
confirmó la participación de fuerzas selectivas
casos, producir la amplificación de elementos
en el mantenimiento de la correlación descripta.
transponibles.
La presencia de cromosomas accesorios,
En general, la relación “ADN génico, no gé-
que son heterocromáticos, no codificantes y
nico” disminuye con el aumento del tamaño del
genoma y en algunas Angiospermas con eleva- sin funciones vitales para el organismo, son
do contenido de ADN las secuencias repetidas frecuentes en razas nativas de plantas cul-
pueden representar hasta el 90% del ADN total. tivadas tales como maíz y centeno. El modo
Esta relación plantea interrogantes acerca del particular de herencia de estos cromosomas,
origen y función del ADN repetido no codifican- con mecanismos de impulso que hacen que se
te. Se han analizado las relaciones que existen hereden con mayor frecuencia que la esperada
entre el contenido de ADN y algunas caracte- por herencia mendeliana, abre un nuevo cam-
rísticas celulares y organísmicas, denominán- po de investigación en lo que se refiere a su
dose parámetros nucleotípicos a aquellos as- utilización como portadores de genes útiles en
pectos del ADN nuclear que afectan al fenotipo programas de mejora.
independientemente del ADN codificante. En Es interesante señalar que no hay relación
varios grupos de plantas se ha observado que entre especiación y contenido de ADN. Por
las variaciones en el contenido de ADN nuclear ese motivo se postuló que la especiación de-
están correlacionadas positivamente con: vo- pendía fundamentalmente de cambios en los
lumen y/o longitud cromosómica, área y/o vo- genes codificantes. Sin embargo la genómica
lumen celular, porcentaje de heterocromatina, comparativa ha revelado constancia en es-
longitud del complejo sinaptonémico, duración tos genes informacionales. En las gramíneas,
del ciclo mitótico y meiótico, latitud y altitud de por ejemplo, el contenido de genes y el orden
crecimiento. Se han encontrado datos que per- de los mismos están altamente conservados,
miten suponer que diferencias en el tamaño del mientras que la cantidad de ADN repetido ha
genoma poseen significado adaptativo en la cambiado considerablemente. Estos hallazgos
evolución, diversificación y adaptación a distin- llevan a investigar el rol de las secuencias de
tos ambientes. Algunos autores postulan que ADN repetido en los procesos de especiación.

4.- Análisis meiótico en híbridos y etc.; los cuales se observarían también en el
poliploides poliploide derivado. En estos casos la meiosis
Una especie diploide con reproducción irregular y la esterilidad no estarían reflejando
sexual es fértil si posee un comportamiento necesariamente falta de homología entre ge-
meiótico normal, o sea buen apareamiento nomas parentales. Por lo antes mencionado se
entre cromosomas homólogos, el cual se ve deduce que el grado de irregularidades meióti-
reflejado en la formación de bivalentes (II) en cas observadas en el híbrido sería una estima-
meiosis (Profase I). Ello determina que exista ción de diferencias génicas y/o estructurales
buena segregación y formación de gametos que poseen las entidades progenitoras.
balanceados y fértiles. El grado de aparea- Un fenómeno frecuente en híbridos diploi-
miento meiótico es una medida de la homo- des entre distintas especies es que, aunque
logía que existe entre los cromosomas. Por presenten formación regular de bivalentes y
lo cual la homología genómica entre dos en- desarrollo normal de los estados II de la meio-
tidades puede evaluarse estudiando el com- sis, posean elevada esterilidad. Podemos en-
portamiento meiótico de sus híbridos F1. Si el contrar ejemplos de este fenómeno en híbri-
híbrido analizado posee formación de II y es dos entre distintas especies de los géneros
fértil se puede concluir que hay afinidad (homo- Amaranthus, Prosopis, Hypochaeris y Bromus,
logía) entre sus genomas parentales. Sin em- entre otros. Stebbins (1971) ha denominado a
bargo, podría ocurrir que aunque las especies este fenómeno "hibridez estructural críptica"
parentales tuvieran una elevada homología en que puede ocurrir cuando las especies proge-
cuanto a las secuencias de ADN, los híbridos nitoras se diferencian en pequeños rearreglos
fueran estériles, con formación de univalentes estructurales. En estos casos si bien se forman
(I) en su meiosis. Esta esterilidad podría de- bivalentes, se segregan combinaciones géni-
berse a la acción de genes que interfieren con cas inviables a los gametos. Esto indica que
el proceso normal de apareamiento (formación la formación de bivalentes no se debe nece-
del complejo sinaptonémico, ocurrencia y/o sariamente a que los genomas parentales que
posición de sobrecruzamientos) o que alteran conforman un híbrido interespecífico sean ho-
la disposición espacial de los genomas en el mólogos.
núcleo provocando, de esta manera, asinapsis El estudio meiótico de híbridos entre taxo-
o desinapsis (Figura 1F). La esterilidad podría nes con distinto nivel de ploidía aporta mayor
deberse también al comportamiento meiótico información que el realizado en híbridos diploi-
irregular causado por diferencias en rearreglos des. En la naturaleza podemos encontrar auto
estructurales entre las especies progenitoras y alopoliploides. En los autopoliploides recien-
de un híbrido. Por lo tanto, si el híbrido entre tes se espera una elevada frecuencia de mul-
dos taxones es estéril habrá que analizar si el tivalentes mientras que en los alopoliploides
aislamiento reproductivo postcigótico obedece ésta depende de si se trata de alopoliploides
a causas génicas o cromosómicas. Si las cau- típicos (formados por hibridación entre espe-
sas fueran cromosómicas se observaría forma- cies con genomas muy diferentes y posterior
ción de I y el poliploide derivado tendría meiosis autoduplicación) o alopoliploides segmentarios
regular con formación de II. Configuraciones (originados por hibridación entre especies muy
meióticas anormales como I, II heteromórficos afines y posterior autoduplicación). Las confi-
o multivalentes en Profase-Metafase I (Figuras guraciones meióticas (frecuencia de I, II y mul-
1D y 2G) y, en estadios posteriores (puentes, tivalentes) permite estudiar la relación entre los
fragmentos, cromosomas con cromátidas des- genomas parentales de un alopoliplóide. Sin
iguales, micronúcleos, etc.), pueden deberse a embargo, el apareamiento cromosómico en
heterocigosis para distintos tipos de rearreglos poliploides puede estar afectado por factores
estructurales (Figura 2F). Si la esterilidad fuese que aumentan o disminuyan la frecuencia de
de origen génico podrían observarse disturbios multivalentes, independientemente de la afini-
meióticos de distinto tipo como asinapsis, desi- dad de los genomas, como por ejemplo, genes
napsis, alteración en la formación del huso, similares al gen Ph de trigo, que inhiben el apa-

reamiento homeólogo, o genes que afectan la poliplóide de Zea (Figura 1E). En Zea y otros
sinapsis y la frecuencia y/o localización de so- poliploides como Senecio se observó asocia-
brecruzamientos. ción secundaria de II, sugiriendo la existencia
En el género Zea el análisis de las asocia- de homeología entre los genomas ancestrales.
ciones meióticas en especies e híbridos ha En el presente apartado se ha ejemplificado
revelado la naturaleza alotetraploide del maíz cómo el análisis meiótico permite dilucidar el ori-
(2n=20) y de sus especies silvestres relacio- gen y postular los modos de especiación de al-
nadas (teosintes), con un número básico x=5. gunas especies. Además de la utilidad en estu-
Las especies con 2n=20 presentan 10 II en dios taxonómicos y evolutivos, el conocimiento
Profase-Metafase I, mientras que Zea peren- de la meiosis es de importancia fundamental en
nis (2n=40) muestra, con frecuencia elevada, estudios aplicados, ya que en la producción de
5 IV + 10 II. En híbridos con 2n=30 cromoso- híbridos o poliploides de importancia agronómi-
mas (Z. diploperennis (2n=20) x Z. perennis, ca se debe lograr un máximo de fertilidad y esto
Z. luxurians (2n=20) x Z. perennis (2n=40) y está relacionado con el comportamiento cromo-
Z. mays ssp mays x Z. perennis), realizados sómico durante la formación de sus gametos.
artificialmente por nuestro grupo de investi-
gación, la configuración meiótica observada 5.- Citogenética molecular
mas frecuentemente fue 5 III + 5 II + 5I. Estas La Citogenética Molecular (ISH: Hibridación
configuraciones meióticas indicaron la presen- In Situ) combina información acerca de la mor-
cia de dos genomas ancestrales (A y B), de 5 fología nuclear o cromosómica con la informa-
cromosomas cada uno, y permitieron postular ción molecular de las secuencias, y permite
las fórmulas genómicas para los taxones de realizar estudios de mapeo y de distribución
Zea con 2n=20 (AxAx BxBx), para Zea peren- física de las mismas, analizar relaciones evo-
nis (ApApAp’Ap’ Bp1Bp1 Bp2Bp2) y para los lutivas entre especies y estudiar la organiza-
híbridos 2n=30 (ApA´pAx BpB´p Bx). Nuestro ción del genoma y la arquitectura nuclear. Por
grupo de investigación ha encontrado además, lo tanto la citogenética molecular aporta impor-
en teosintes, razas nativas de maíz e híbridos tantes resultados a los estudios de sistemáti-
con 2n=20, formación frecuente de dos grupos ca, filogenia, biodiversidad, evolución, mejora-
de 5 II cada uno, muchas veces asociados a miento y biotecnología.
husos acromáticos distintos. Este doble huso Las técnicas de ISH consisten en hibridar
sería una evidencia de la existencia de geno- cromosomas con secuencias de ADN marca-
mas ancestrales con 10 cromosomas cada das con fluorocromos. Estas técnicas, aplica-
uno. Este fenómeno está asociado a una leve das desde 1969, utilizaban métodos de mar-
asincronía de los dos grupos de 5 II durante cación y detección radioactivos. En plantas,
el desarrollo meiótico (Figura 1E). Este fenó- se comenzaron a aplicar a fines de la década
meno ha sido observado con alta frecuencia del 80 debido a la gran disponibilidad de se-
en líneas aloplásmicas obtenidas por nuestro cuencias clonadas para ser utilizadas como
grupo de trabajo cruzando maíz como proge- sonda, y a los nuevos sistemas no radioacti-
nitor masculino y teosinte (Z. mays ssp. mexi- vos de marcación y detección. Esta metodo-
cana) como progenitor femenino. Estas líneas logía es útil en estudios de la estructura, fun-
aloplásmicas presentaron comportamiento ción, organización y evolución de los genomas
meiótico regular con formación de 10 II que se y permite conocer su composición, a nivel de
distribuyeron en dos grupos de cinco II cada secuencias. Para realizar esta técnica se pue-
uno. Esto sugiere que la interacción "citoplas- den utilizar una gran variedad de sondas: des-
ma de teosinte-núcleo de maíz" influencia la de ADN genómico total (GISH: Hibridación In
distribución espacial de los cromosomas en el Situ Genómica), hasta secuencias específicas
núcleo promoviendo la separación de los dos FISH (Hibridación In Situ Fluorescente), tales
genomas ancestrales de 10 cromosomas cada como sondas de cromosomas individuales o
uno. La presencia de dos grupos asincrónicos fragmentos cromosómicos (obtenidas por mi-
de 5 II cada uno permitió inferir la naturaleza crodisección), secuencias de ADN repetido en

tandem, retrotransposones, secuencias de ge- y posición de copias insertas y su correlación
nes únicos o de bajo número de copias. con la expresión y la regulación.
Una de las aplicaciones del FISH es la ob- Para los casos en que las secuencias a de-
tención de mapas físicos, funcionales y estruc- tectar son muy cortas (menores a 300pb) se
turales de los genomas, mediante la localiza- han desarrollado distintas modificaciones de
ción cromosómica de secuencias de distinto la técnica de FISH que consisten en sistemas
origen. El análisis de la localización de secuen- de amplificación de las señales de hibridación,
cias diversas permite identificar cromosomas, FISH sobre fibras de ADN, FISH sobre cromo-
analizar la arquitectura nuclear del genoma y somas paquiténicos o descondensados. Ade-
verificar hipótesis acerca de la relación entre más, se han utilizado variantes como PRINS
posición y función de determinadas secuen- (Primed In Situ Hybridization) y C-PRINS (Cy-
cias. Aplicando esta metodología se pueden cling PRINS), entre otras. La técnica de PRINS
obtener cariotipos FISH para determinadas se basa en el apareamiento de oligonucleótidos
especies y detectar los rearreglos intergenómi- iniciadores a secuencias complementarias en
cos que ocurrieron en su evolución. Por otra cromosomas desnaturalizados in situ, segui-
parte, los experimentos de FISH permiten de- do de la elongación debida a la incorporación,
terminar la distribución y posición de material mediante una ADN polimerasa, de nucleótidos
cromosómico extraespecífico, la existencia de marcados. En el C-PRINS intervienen una se-
apareamiento y recombinación intergenómico, rie de ciclos termales análogos a la reacción en
y la segregación preferencial de determinados cadena de la polimerasa.
cromosomas o segmentos cromosómicos. En estudios realizados en nuestro labora-
Por su parte, el GISH, en el que se utiliza torio, la hibridación in situ permitió revelar la
ADN genómico total como sonda, revela homo- composición genómica del trihíbrido tricepiro,
logías específicas del ADN, principalmente en que es un cereal sintético de origen trigenérico:
lo que respecta a secuencias repetidas. Esta trigo, centeno y agropiro, y cuya composición
técnica facilita, por ejemplo, el reconocimiento genómica y cromosómica, luego de varios años
de especies parentales y el análisis de la or- de selección, era desconocida. El tricepiro se
ganización nuclear en híbridos y poliploides, y originó por el cruzamiento de triticale (2n=42) x
la determinación de la naturaleza de su apa- trigopiro (2n=56) cuya F1 poseía 2n=49; luego
reamiento meiótico (auto o alosindético). Ade- de varias generaciones de selección este hí-
más permite detectar cromosomas o segmen- brido se estabilizó en 2n=42. Los estudios de
tos cromosómicos introgresantes en híbridos y GISH realizados sobre los cromosomas de tri-
generaciones segregantes, lo cual es de gran cepiro Don René INTA empleando sondas de
utilidad en planes de mejoramiento, pues es ADN genómico de centeno (Figura 2A) y de
posible realizar el seguimiento de los segmen- Thinopyrum mostraron 14 cromosomas perte-
tos o cromosomas introgresados a lo largo de necientes al genoma R de centeno y pequeñas
generaciones segregantes, retrocruzadas y en zonas de introgresión de Thynopyrum. Con la
líneas recombinantes. Por otra parte, es útil en finalidad de identificar la totalidad de los cro-
el análisis de afinidades genómicas interespe- mosomas del tricepiro se emplearon las son-
cíficas, en estudios evolutivos y taxonómicos. das pSc119.2 (aislada de centeno y que hibri-
Es importante señalar que las relaciones ob- da con patrones característicos sobre todos los
tenidas mediante GISH no son afectadas por cromosomas de los genomas R y B de trigo y
genes que producen disturbios en el aparea- sobre algunos cromosomas de los genomas A
miento meiótico (asinapsis, desinapsis, apa- y D de trigo), pAs1 (aislada de Aegilops squa-
reamiento homeólogo o heterólogo), siendo de rrosa y que hibrida sobre los cromosomas del
gran utilidad para analizar homologías de híbri- genoma D de trigo), y pTa71 (aislada de trigo
dos o poliploides que presentan esterilidad gé- y que revela zonas organizadoras del nucléo-
nica. Además, el FISH y el GISH proporcionan lo porque contiene genes ribosomales). Estos
información acerca de la localización cromosó- experimentos mostraron la presencia de 6 zo-
mica y genómica de loci transgénicos, número nas de ADN ribosomal, 2 en cromosomas de

centeno y 4 en cromosomas trigo (Figura 2B), (180pb y/o TR-1). En nuestro laboratorio rea-
mientras que la coloración con plata (Ag-NOR) lizamos experimentos de FISH para dilucidar
indicó que sólo 4 de ellas eran activas forma- la composición de secuencias de las distintas
doras de nucléolos. Se comprobó entonces un bandas heterocromáticas o knobs (DAPI+). Es-
fenómeno de supresión intergenómica que lle- tos nos permitieron observar que existe gran
vó al silenciamiento de los genes ribosomales variabilidad en la composición de secuencia
de centeno en presencia del genoma de trigo, de los distintos “knobs” lo cual resultó de gran
(anfiplastía). Por lo expuesto se puede dedu- utilidad para caracterizar las líneas y razas de
cir que el uso conjunto de las técnicas clásicas maíz y teosintes estudiadas hasta el momento
y de ISH permitió establecer que la composi- (Figuras 2G y 2H).
ción genómica y cromosómica de tricepiro Don En maíz y teosintes los métodos de GISH y
René INTA es AABBRR, con introgresión de FISH nos permitieron analizar las afinidades
Thinopyrum en el cromosoma 6A (Figura 2A). genómicas existentes entre los distintos xones
Por otra parte, experimentos de FISH utili- de Zea. Un ejemplo de esto es el estudio de
zando las mismas sondas nos permitieron ca- las afinidades, a nivel de secuencias repetidas,
racterizar distintas líneas de Triticale obtenidas entre el maíz y su supuesto progenitor silvestre
en nuestro país. Zea mays ssp. parviglumis. Además, se anali-
En la gramínea patagónica Bromus pictus zaron las homologías entre los taxones de Zea
(2n=70) hemos realizado experimentos de con 2n=20 y Zea perennis con 2n=40. Median-
GISH que han demostrado que Bromus setifo- te hibridación in situ utilizando secuencias mar-
lius (2n=28) es uno de sus progenitores (Figu- cadoras específicas hemos podido resolver la
ra 2C). Esta información evolutiva es relevante constitución cromosómica de las complejas
para el mejoramiento y la domesticación de configuraciones meióticas que se observan en
esta potencial especies forrajera. los híbridos de Zea con 2n=30 cromosomas
Elymus scabrifolius (agropiro criollo) es una (Figuras 2E y 2F). Estos resultados permitieron
gramínea perenne sudamericana de alto valor corroborar las fórmulas genómicas planteadas
forrajero que posee un origen híbrido alotetra- para las distintas especies de Zea, avalando
ploide (2n=28, x=7). Se ha postulado una fór- el origen poliploide del maíz y de sus especies
mula genómica SSHH cuyo genoma parental S silvestres relacionadas.
pertenece a Pseudoroegneria y H a Hordeum. Otro aspecto que se ha desarrollado última-
Para determinar el origen de los genomas mente dentro de la citogenética molecular es
componentes del agropiro criollo se realizaron el de la microdisección y clonado de cromo-
experimentos de ISH asociados a estudios ci- somas o secciones cromosómicas. En plan-
togenéticos clásicos que permitieron confirmar tas, es muy útil como fuente de sondas y se
que una especie de Hordeum es uno de sus aplica para analizar genomas, para establecer
parentales, detectar reorganizaciones interge- relaciones entre cromosomas y grupos de liga-
nómicas y obtener mapeos físicos de secuen- miento específicos, localizar genes de interés,
cias repetidas (Figura 2D). En esta especie, la y relacionar las distancias físicas y genéticas
combinación del análisis clásico del cariotipo, en mapas de ligamiento.
GISH y FISH permitió identificar a cada uno de Por todo lo expuesto podemos concluir que
los cromosomas y su pertenencia a cada ge- la citogenética molecular es de gran utilidad en
noma parental, lo cual será de gran utilidad en estudios evolutivos, sistemático-taxonómicos
los planes de mejora en ejecución. y aplicados, ya que en el estudio de las rela-
Las distintas razas de maíz y de teosintes ciones genómicas entre especies muestra las
presentan variación en el tamaño, número y similitudes entre sus genomas y la distribución
composición de sus regiones heterocromáti- física de las secuencias repetidas que com-
cas, denominadas “knobs”, que son citológi- parten. En el análisis de híbridos y poliploides
camente observables mediante bandeo C y naturales o artificiales, permite conocer del ori-
DAPI. Estos pueden estar constituidos por dos gen de híbridos interespecíficos, determinar el
familias de ADN altamente repetido en tandem origen genómico de los cromosomas involu-

crados en distintas configuraciones meióticas, Libros
establecer las relaciones genómicas entre las
especies parentales, analizar los dominios cro- Bennett M. D. and Leitch I.J. 2005. Genome size
mosómicos de cada genoma parental (su ar- evolution in plants. In: The evolution of the
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V. CAPÍTULO 2 nerar variación genética cuando esta es inexis-
tente o tiene una heredabilidad muy baja. En
la actualidad se dispone de metodologías efi-
Mejoramiento de Plantas
cientes para la transformación de forrajeras, ya
Forrajeras en la Era Genómica sean gramíneas o leguminosas (Figura 1).
La utilización de la biolística o la transfor-
German Spangenberg, Mauro Meier y mación mediada por Agrobacterium permite
Viviana Echenique la regulación de nuevos genes, o de genes
preexistentes, que codifican para las enzimas
1 Introducción que intervienen en las distintas vías metabó-
Si bien el mejoramiento genético convencio- licas, para que estos se expresen en mayor o
nal ha tenido un gran impacto en el incremen- menor grado. En la actualidad se encuentran
to del rendimiento, la calidad y la resistencia a en etapa de evaluación a campo distintas es-
plagas y enfermedades en cereales y oleagi- pecies forrajeras transgénicas con caracteres
nosas, en las especies forrajeras los progresos
han sido significativamente menores, especial-
mente en lo referido al rendimiento. Esto obe-
dece a varios factores como un proceso más
reciente de domesticación, la complejidad de
objetivos, problemas reproductivos, de merca-
do y las menores inversiones realizadas en el
área. Las herramientas biotecnológicas desa-
rrolladas en los últimos 20 años ofrecen inte-
resantes alternativas que pueden contribuir a
mejorar esta situación.
En los últimos años la biotecnología ha apor-
tado varias metodologías para complemen-
tar los programas de mejoramiento, como el
cultivo de tejidos, la hibridación somática, la
variación somaclonal y la transgénesis. Esta
última resulta muy promisoria, especialmente
para incrementar la calidad del forraje, persis-
tencia, resistencia a plagas y enfermedades,
tolerancia a estreses abióticos y para manipu-
lar el crecimiento y desarrollo. Los marcadores
moleculares brindan su utilidad para la identifi- Figura 1. Transformación de trébol blanco para
cación y selección de caracteres agronómicos resistencia virus. A-H) Sistema prolífico de rege-
complejos. Más recientemente, la genómica neración de plantas resistentes al virus del mosaico
permite identificar a gran escala genes de inte- de la alfalfa (AMV) y al virus del mosaico del tré-
bol blanco (WCMV) a partir de explantos cotiledo-
rés para su introducción en los forrajes. Todas
nales. La transformación se llevó a cabo utilizando
estas tecnologías confluyen en el mejoramien-
Agrobacterium tumefaciens, utilizando npt2 como
to molecular, que permitirá obtener nuevos cul- marcador de selección. I) T-ADN del vector binario
tivares para satisfacer las demandas actuales conteniendo el gen quimérico npt2 y el gen de la
de producción. En este capítulo se describen proteína de la cápside del AMV (AMV4). J) Análi-
las aplicaciones actuales y futuras y el impacto sis por PCR para la identificación preliminar de las
de la biotecnología en el mejoramiento de es- plantas transformadas utilizando iniciadores para
pecies forrajeras. el gen npt2. K) Idem anterior pero utilizando inicia-
dores para el gen AMV4. L) Análisis de Southern
2 Transgénesis blot utilizando una sonda dirigida al gen AMV4. M)
Análisis de Northern blot de plantas transgénicas de
La tecnología génica y la obtención de plan-
trébol blanco expresando el gen quimérico AMV4.
tas transgénicas brindan la posibilidad de ge-

simples modificados. Si bien algunos aspec- 2.1.1 Manipulación de la biosíntesis de
tos de la genética, fisiología y bioquímica de lignina
muchos procesos vegetales complejos no han El principal objetivo tendiente mejorar el va-
sido aún completamente dilucidados, lo cual lor nutritivo de las gramíneas forrajeras para
podría demorar algunas de las aplicaciones de la industria lechera es el incremento de la di-
la transgénesis en el mejoramiento vegetal, la gestibilidad de la materia seca, la cual declina
tecnología génica es una poderosa herramien- marcadamente (> 10%) a medida que estas
ta para ampliar los conocimientos en genética crecen y maduran, reduciendo el valor nutritivo
molecular. del forraje. Dado que la heredabilidad de este
El número de genes disponibles para los carácter es baja y el mismo está controlado por
mejoradores de plantas ha aumentado rápida- un gran número de genes, el potencial para un
mente con el advenimiento de los grandes pro- rápido mejoramiento por métodos tradicionales
gramas de secuenciación de especies como es reducido.
Lolium perenne y el trébol blanco; o en la se- Se estima que pequeños incrementos en la
cuenciación completa del genoma de especies digestibilidad tendrán un efecto significativo en
modelo como Medicago trunculata L., Lotus la calidad del forraje y concomitantemente en
japonicus L. y arroz (Oryza sativa L.).En con- la producción animal. Así, incrementos del 1%
secuencia, las aplicaciones de la transgénesis en la digestibilidad de la materia seca in vitro
en el mejoramiento de especies forrajeras es- conducen a incrementos promedio del 3,2% en
ganancia media de peso vivo.
tán orientadas hacia el desarrollo de eventos
La lignina es un componente importante de
de transformación con variación genética única
la pared celular de plantas vasculares y du-
y a la disección genética de vías metabólicas y
rante mucho tiempo ha sido reconocida por su
procesos de desarrollo relevantes para la pro-
impacto negativo sobre la calidad del forraje,
ducción de forrajes.
en la fabricación de papel y más recientemen-
Los mejores candidatos en cuanto a carac-
te en la obtención de biocombustibles a partir
teres para la aplicación de transgénesis en
de celulosa. Durante las últimas dos décadas,
plantas forrajeras son: calidad del forraje, re- genetistas y bioquímicos han avanzado en el
sistencia a plagas y enfermedades, tolerancia conocimiento de la relación entre lignificación y
a estreses abióticos y la manipulación del cre- digestibilidad de los forrajes.
cimiento y desarrollo. Los efectos negativos de la lignina sobre la
digestibilidad dependen de su contenido, com-
2.1 Modificación genética de la posición de monómeros y grupos funcionales
calidad del forraje y del grado de entrecruzamiento con los poli-
El mejoramiento molecular basado en trans- sacáridos de la pared celular. La lignificación
génesis para mejorar la calidad del forraje está es un proceso altamente coordinado y regu-
dirigido al tratamiento de los subcaracteres in- lado por un conjunto de eventos metabólicos
volucrados, a saber: digestibilidad de la mate- que resultan en la biosíntesis de precursores
ria seca, contenido de carbohidratos solubles, de la lignina (monolignoles). Existen tres nive-
contenido de proteínas, metabolitos secunda- les de control para la manipulación genética de
rios, alcaloides, etc. La modificación de la ma- ligninas, a saber: la síntesis de monolignoles,
yoría de los parámetros de calidad se asocia el transporte de los mismos desde el sitio de
a ciertas vías metabólicas, o a la producción síntesis al de polimerización, y el de polimeri-
de proteínas específicas. La tecnología génica zación de monolignoles para dar los productos
permite identificar las proteínas involucradas y finales. Una de las estrategias más exploradas
las enzimas clave a ser manipuladas, el ais- para mejorar la digestibilidad de la lignina es la
lamiento de los genes correspondientes y la regulación negativa de las enzimas involucra-
manipulación de su expresión en plantas trans- das en la biosíntesis de monolignoles.
génicas. A continuación desarrollaremos ejem- En función de los resultados de varios estu-
plos de distintas aplicaciones. dios relacionados con la manipulación de lig-

nina se ha encontrado que los genes pal, c4h, más fácil de extraer químicamente, en otros
c3h y 4cl no son buenos blancos para la mani- esta tecnología trajo aparejadas alteraciones
pulación especifica de biosíntesis de monolig- en el desarrollo de la planta, como reduccio-
noles ya que producen efectos adversos sobre nes en el tamaño y colapso de las células del
otras funciones biológicas (Figura 2 A). Estos xilema, pero, en general estos resultados indi-
genes codifican las enzimas fenilalanina ami- can que la introducción de genes de esta vía
no ligasa (PAL), cinamato-4-hidroxilasa (C4H), metabólica en construcciones de ARN sentido
p-cumarato 3-hidroxilasa (C3H) y 4-cumarato o antisentido permiten mejorar la digestibilidad
CoA ligasa (4CL). de la materia seca, sin alterar el desarrollo nor-
mal de la planta.
Los efectos observados en plantas con re-
gulación negativa de alguna de estas enzimas
son similares a aquellos encontrados en la na-
turaleza en un tipo de mutantes de maíz llama-
dos «brown midrib» (bmr), cuyos genes codifi-
can para enzimas menos activas. El enfoque
transgénico brinda la posibilidad de obtener
plantas con ligninas diferentes, logrando una
mayor variedad de fenotipos que la existente
en la naturaleza, a través de la regulación ne-
gativa de varias enzimas y a la utilización de
promotores específicos.
En raigrás perenne se ha logrado clonar y
caracterizar tres genes clave en la vía de bio-
Figura 2. A) Via biosintética de la lignina. PAL: fe- síntesis de monolignoles: cad, 4cl y ccr (cina-
nilalanina amonio liasa; TAL: tirosina amonio liasa;
moil CoA reductasa, CCR). Estos genes han
C4H: cinamato-4-hidroxilasa; C3H: p-cumarato 3-hi-
droxilasa; COMT: cafeato-O-metiltransferasa; F5H:
sido mapeados en los cromosomas de raigras
ferulato-5-hidroxilasa; 4CL: 4-cumarato CoA ligasa; (Figura 2 B) y se encuentran en evaluación
CC3H: cumaroil CoA hidroxilasa; CCOMT: cafeoil- plantas transgénicas de esta especie con estos
CoA-O-metiltransferasa; CCR: cinamoil-CoA-reduc- genes regulados en sentido y antisentido. La
tasa; CAD: cinamoil alcohol deshidrogenasa. Las regulación negativa de OMT en Festuca incre-
flechas punteadas indican reacciones que no han mentó en un 10% la digestibilidad, lo cual es un
sido verificadas experimentalmente. resultado muy importante de esta tecnología.
Por otro lado, comt, ccoaomt y cad son bue-

nos blancos para alterar el contenido y com-
posición de ligninas, y codifican las enzimas
O-metil transferasa del ácido cafeico (COMT),
cafeoil CoA-3-O-metiltransferasa (CCoAOMT)
y cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD). Las
investigaciones realizadas utilizando plantas
modelo como tabaco y álamo demostraron
que la regulación negativa de la expresión de
COMT, CAD y 4CL conduce a una alteración
en la composición de la lignina, o a una dismi-
nución de su contenido, con incrementos signi- Figura 2. B) Mapeo de los genes correspondientes
ficativos en la digestibilidad de la materia seca. a la vía de biosíntesis de lignina, en los grupos de
En algunos de estos casos la lignina resultó ligamento LG2 y LG7 de raigrás perenne.

En esta especie también se regularon negati- mas: sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa
vamente las enzimas CAD y COMT. (1-SST), fructano:fructano 1- fructosiltransfe-
Dado que los genes estructurales involucra- rasa (1-FFT) y sacarosa:fructano 6-fructosil-
dos en la biosíntesis de lignina se encuentran transferasa (6-SFT), que sintetizan la mezcla
regulados a nivel de transcripción, otra estra- más compleja de fructanos ligados que se en-
tegia para la manipulación genética involucra cuentra en pastos y cereales. Varios de los ge-
la manipulación de factores de transcripción de nes involucrados en esta vía metabólica han
tipo MYB. sido aislados y caracterizados, como el 6-SFT
El reciente interés en la producción de bio- de cebada, el 6G-FFT de cebolla y el 1-SST de
combustibles a partir de celulosa ha impulsa- alcaucil. Su introducción en plantas desprovis-
do la ingeniería genética de ligninas, utilizando tas de fructanos nativos conduce a la acumu-
como sistemas modelo cultivos energéticos lación de oligofructanos y, en plantas que los
como Populus trichocarpa y Brachypodium producen provocan la acumulación de nuevas
distachyon. La gran cantidad de biomasa que variedades de los mismos.
proporcionan los forrajes es una alternativa La introducción de un gen microbiano para la
atractiva para este fin. En Estados Unidos se fructosiltransferasa (gen SacB) de Bacilus sub-
busca utilizar el pasto varilla o switchgrass (Pa- tilis en plantas de tabaco y papa, que carecen
nicum virgatum) como una alternativa. Se trata de fructanos y acumulan almidón, condujo a la
de producir modificaciones genéticas que re- acumulación de cantidades considerables de
dunden en baja cantidad de lignina o diferente fructanos de elevado peso molecular, que les
calidad de la misma. De esta manera se faci- confirieron un mejor rendimiento en situaciones
litaría la liberación de celulosa y hemicelulosa de estrés. Esto demuestra que la sacarosa, el
de la matriz de la pared celular y quedarían sustrato para la fructosiltransferasa, puede ser
más accesibles para el tratamiento enzimático redireccionada en especies que no acumulan
posterior. fructanos.
La manipulación de la biosíntesis de fructa-
2.1.2 Manipulación del metabolismo nos en plantas transgénicas para mejorar la
de fructanos calidad del forraje y la tolerancia a estreses
Los fructanos son moléculas de polifructosa abióticos, está siendo explorada en legumino-
producidas por varias especies de gramíneas sas como Trifolium repens y Medicago sativa, y
para las cuales constituyen la principal forma en gramíneas como Lolium perenne y Festuca
de almacenamiento de carbohidratos solubles. arundinacea.
Observaciones realizadas en líneas de raigrás Se ha reportado la obtención de plantas de L.
que almacenan concentraciones elevadas de multiflorum con alteraciones en el metabolismo
carbohidratos solubles indicaron que éstas no de fructanos por la introducción de genes qui-
sufren disminuciones en la digestibilidad du- méricos de levansacarasa bacteriana. También
rante el verano, ya que estos carbohidratos se dispone de ADNc de genes homólogos de la
parecen contrarrestar las disminuciones en fructosiltransferasa de raigrás perenne. Estos
digestibilidad debidas a lignificación, favore- han sido aislados, caracterizados y utilizados
ciendo además la asimilación del forraje y de para la disección genética de la biosíntesis de
proteínas en el rumen y, concomitantemente, fructanos en gramíneas transgénicas. También
generando incrementos en el peso vivo. se han aislado y caracterizado otros genes de
Un alto contenido de fructanos en los forra- la vía que han sido introducidos y expresados
jes es de gran valor ya que pueden ser mo- en leguminosas y gramíneas.
vilizados fácilmente para mantener el rebrote Por medio del análisis de secuencias, utili-
inmediatamente después de la defoliación, así zando la técnica de microarreglos y Northern
como por añadir valor nutritivo para la alimen- blot se determinaron los perfiles de expresión
tación del ganado. de los genes involucrados en la vía de fruc-
La síntesis de fructosa en gramíneas involu- tanos en raigrás perenne. La organización de
cra la acción concertada de al menos tres enzi- los genes, el número de copias y su ubicación

en el mapa genético se determinaron utilizan- ADNc de la albúmina de girasol (SFA8) con la
do marcadores moleculares. También se cons- señal KDEL del retículo endoplásmico, bajo el
truyeron vectores para la regulación mediante control de diferentes promotores. Estas plantas
ARN sentido y antisentido de los genes men- expresan el transcripto esperado y acumulan la
cionados. Las correspondientes plantas trans- proteína SFA8 a niveles superiores al 0,2% del
génicas se utilizan para la disección molecular total de proteína soluble. Sin embargo, desde
del metabolismo del fructanos y para compren- el punto de vista nutricional los valores obteni-
der su rol fisiológico en las plantas, y también dos aún están lejos del óptimo, que deberá ser
para mejorar el valor nutritivo, persistencia y del 2 al 5 % del total de proteína soluble. Es
calidad utilizando genes de la misma especie. crucial, por lo tanto, desarrollar estrategias que
Estos estudios también aportarán información permitan alcanzar estos niveles a fin de explo-
acerca de su rol funcional en la tolerancia al frío tar el máximo potencial de la técnica.
y la sequía. Este conocimiento es clave para el
diseño de experimentos tendientes a la obten- 2.1.4 Manipulación de la biosíntesis
ción de plantas transgénicas con mejor calidad de taninos condensados
de forraje y tolerancia a estreses abióticos. Los taninos condensados (proantocianas)
son compuestos poliméricos derivados del
2.1.3 Expresión transgénica de metabolismo fenilpropanoide, sintetizados por
proteínas «rumen by-pass» la vía metabólica de los flavonoides. Desde
Los aminoácidos azufrados metionina y el punto de vista agronómico son importantes
cisteína son limitantes en la nutrición animal. en las leguminosas forrajeras, donde pueden
Estos influyen en el crecimiento de la lana en considerarse beneficiosos o perjudiciales de
las ovejas y su aporte es reducido en condicio- acuerdo a los niveles encontrados en la planta.
nes naturales de pastoreo y por la fermenta- Niveles de taninos condensados superiores al
ción en el rumen, ya que la microflora degra- 4 - 5% del peso seco son perjudiciales, actuan-
da las proteínas y en algunas circunstancias do como factores antinutritivos y generando re-
resintetiza proteínas de menor valor nutritivo. chazo por parte del animal. En cantidades mo-
Los suplementos postruminales de metioni- deradas (1 - 3%) mejoran la calidad del forraje,
na y cisteína resultan en incrementos del 16 ya que reducen el meteorismo («empaste») por
al 130% en la tasa de crecimiento de la lana. disrupción de la espuma causada por las pro-
Estos efectos positivos también se han obser- teínas en el rumen, disminuyen la pérdida de
vado en bovinos, donde han redundado en una proteínas debidas a desaminación microbiana
mayor producción de leche y una mayor tasa y reducen la carga de parásitos en el animal.
de crecimiento en animales para carne. Por lo Las estrategias moleculares utilizadas para
tanto la ingestión de forrajeras que contengan la manipulación de la biosíntesis de taninos se
proteínas ricas en aminoácidos azufrados, re- han orientado hacia la introducción de taninos
lativamente estables en el rumen (rumen by- condensados en alfalfa y trébol blanco, y a su
pass), incrementaría el aporte de aminoácidos reducción en leguminosas que tienen altos
esenciales para la nutrición de los rumiantes, contenidos. Estas estrategias se basan en la
conduciendo a una mayor producción animal, disponibilidad de genes involucrados en la bio-
particularmente en lo que a lana se refiere. síntesis de antocianas, que afectan las etapas
Genes que codifican proteínas de este tipo comunes en la biosíntesis de flavonoides y la
fueron aislados, caracterizados e introducidos suposición de que éstos funcionarán en la bio-
en plantas de festuca alta, alfalfa, trébol blanco síntesis de taninos.
y trébol subterráneo. Estas proteínas serían la El estudio de mutantes de la vía metabólica
ovoalbúmina de pollo, la albúmina de arveja y de los flavonoides en Arabidopsis proporcionó
de semilla de girasol. Como ejemplo puede ci- abundante información acerca de la identidad
tarse el caso de plantas transgénicas de Festu- de las enzimas involucradas en la síntesis de
ca arundinacea (festuca alta) que expresan ge- taninos en esta especie. Esto permitió el clo-
nes quiméricos constituidos por secuencias de nado, entre otros, de los genes CHS, CHI, F3H

y DFR, y de la identificación y clonado del gen Hongos como Phytophthora clandestina, Ka-
BAN (BANYULS), que parece ser específico batiella caulivora, Rhizoctonia solani y Fusa-
de la vía de biosíntesis de taninos. Por otro rium spp., que atacan a varias especies de tré-
lado se ha intentado la regulación negativa o boles, donde no existen fuentes de resistencia
positiva de enzimas clave que regulan esta vía natural, provocan cuantiosas pérdidas econó-
chalcona sintetasa (CHS) y leucoantocianina-4 micas en Australia. Se han identificado cuatro
reductasa (LAR), o la expresión de genes re- proteínas antifúngicas diferentes que, en ensa-
guladores que tienen un accionar pleiotrópico yos in vitro, demostraron ser efectivas contra
(con efectos a varios niveles fenotípicos). Un estos patógenos. Los genes codificantes se
ejemplo de esto lo constituye la transformación utilizaron, individualmente o combinados, para
de plantas de Lotus corniculatus con el gen re- obtener plantas transgénicas de trébol subte-
gulatorio Sn de maíz, que resultó en una dis- rráneo. Esto brindaría una mayor protección
minución del contenido de taninos en hojas, sustancial contra un amplio espectro de hon-
conjuntamente con un aumento del nivel de los gos patógenos.
mismos en raíz. Recientemente se obtuvieron plantas de fes-
La alfalfa carece de taninos condensados tuca alta con elevados niveles de resistencia
en hojas y tallos, por ello puede causar meteo- a R. solani y a P. grisea, mediante la transfor-
rismo en los rumiantes que la consumen. La mación genética simultanea con cuatro genes:
presencia de estos flavonoides en las semillas alfalfa β-1, 3 glucanasa AGLU1, fago T4 lisozi-
ma, dermaseptin rana, y arroz Pi9.
demuestra que esta especie contiene todos los
genes necesarios para la síntesis de los mis-
2.2.2 Transgénesis para incrementar la
mos. La identificación y el clonado de los ge-
resistencia a enfermedades virales
nes involucrados en la biosíntesis de taninos
La mayoría de los métodos clásicos utiliza-
en semillas de alfalfa permitirán manipular su
dos para prevenir las infecciones virales son la-
expresión en hojas.
boriosos y económicamente inviables. Se han
identificado fuentes potenciales de tolerancia o
2.2 Resistencia a plagas y resistencia en alfalfa y en unas pocas especies
enfermedades de Trifolium, pero no existe una resistencia na-
Los patógenos y las plagas pueden disminuir tural a estos virus que sea transferible, efectiva
considerablemente la producción, la persisten- y durable, y que pueda ser incorporada a culti-
cia, el valor nutritivo y la palatabilidad de las vares de leguminosas forrajeras. La tecnología
plantas forrajeras. En los últimos diez años se génica es una opción atractiva para lograr este
han desarrollado varias estrategias para mani- objetivo, ya que permite sortear barreras inte-
pular la resistencia. A continuación hablaremos respecíficas, desarrollar resistencias multigéni-
de algunos ejemplos. cas, y manipular niveles y sitios de expresión.
La transgénesis se ha utilizado para desarrollar
2.2.1 Transgénesis para incrementar la resistencia efectiva y durable en un amplio ran-
resistencia a enfermedades fúngicas go de especies vegetales.
El ataque de hongos a las hojas y siste- Virus como el del mosaico de la alfalfa (alfa-
mas radicales provocan daños que afectan el movirus, AMV), el del mosaico del trébol blan-
establecimiento, disminuyen el rendimiento, co (potexvirus, WCMV) y el del amarillamiento
la calidad y la persistencia de las plantas. La de las nervaduras (potyvirus, CYVV) afectan
expresión constitutiva de genes que codifican negativamente el crecimiento y desarrollo de
proteínas antifúngicas (AFPs) en plantas trans- las leguminosas. Se estima que combinados
génicas, bajo promotores específicos de órga- causan pérdidas a la industria rural australiana
no o inducibles por el patógeno, se ha logrado por más de 800 millones de dólares por año.
en leguminosas, como alfalfa y trébol blanco. Cada uno de ellos infecta individualmente a un
Específicamente se obtuvieron plantas de al- gran número de especies distribuidas por todo
falfa que expresan una quitinasa de arroz, que el mundo. Una interesante aplicación del mejo-
podría hacerlas resistentes al ataque de Rhi- ramiento molecular fue el desarrollo de trébol
zoctonia solani y Sclerotium rolfsii. blanco inmune al virus AMV.

Los virus que se encuentran con frecuencia nismo que vive y se desarrolla dentro de los
en gramíneas forrajeras son el de enanismo, tejidos de la planta) modificado, como podría
de amarillamiento de la cebada (BIDV) y el mo- ser Neotyphodium. Las cepas modificadas re-
saico del raigrás (RMV). La infección de BIDV sultarían seguras para los rumiantes que las
provoca disminuciones en el rendimiento de consuman, pero serían capaces de expresar y
hasta un 24%, mientras que el rango de RMV secretar proteínas insecticidas tales como toxi-
va del 5 al 50%. La infección con RMV también nas Bt o inhibidores de proteasas, que protejan
reduce la competitividad del raigrás perenne a las gramíneas forrajeras de las plagas.
como resultado de un mal establecimiento y
una reducida persistencia. 2.3 Crecimiento y desarrollo
2.3.1 Manipulación de alergenos del polen
2.2.3 Transgénesis para La fiebre del heno y el asma alérgico esta-
incrementar la resistencia a plagas cional, debido al polen de las gramíneas, son
Las plagas pueden dañar a las plantas direc- enfermedades ambientales que afectan al 25%
tamente al alimentarse del follaje o las raíces, de la población en climas templado- fríos. El
o indirectamente por transmisión de patógenos polen de raigrás es uno de los más abundantes
mientras accionan sobre la planta. En pasturas en estas regiones, siendo el principal alerge-
infectadas por densas poblaciones de insectos no para más del 50% de los pacientes alérgi-
plaga se producen disminuciones en la produc- cos. Este polen contiene por lo menos 4 cla-
ción de materia seca que van del 20 al 40%. ses principales de proteínas alergénicas, cada
Varios insectos como Wiseana spp, Cos- una de las cuales está constituida por múltiples
telytra zealandica, Teleogryllus commodus, isoformas inmunológicamente indistinguibles
Sminthurus viridis, Sitona spp, Coleophora spp, que involucran 17 alergenos de tamaño varia-
Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp pueden ble. Al menos una proteína de cada una de es-
causar daños significativos a leguminosas y tas clases ha sido aislada y caracterizada en
gramíneas. A fin de incrementar la resistencia a detalle. Se han aislado clones de ADNc para
los mismos se han utilizado distintos enfoques el principal alergeno del raigrás Lolp1, Lolp2
transgénicos. Uno de ellos es la utilización de y Lolp5. En 1997 se obtuvieron las primeras
la proteína cristalina e inhibidores de proteasas plantas transgénicas de raigrás, transformadas
de Bacillus thuringiensis (Bt). Por ejemplo se con versiones antisentido de los genes Lolp1 y
obtuvieron plantas de trébol blanco que expre- Lolp2 bajo el control de un promotor específico
san un gen quimérico Bt cry 1Ba modificado y del polen, a fin de obtener una regulación ne-
acumulan en las hojas la delta endotoxina solu- gativamente los alergenos del mismo. Estudios
ble. La alimentación de larvas de Wiseana con realizados con las plantas transgénicas Lolp1 y
hojas de estas plantas promovió la inhibición Lolp2 revelaron una disminución en los niveles
en la ingesta, redujo el crecimiento de las lar- de expresión de los alergenos en el polen. Las
vas y ocasionó mayor mortalidad al comparar- plantas de raigrás transformadas con Lolp1
las con larvas alimentadas con plantas control. evidenciaron un desarrollo reproductivo nor-
En alfalfa (Medicago sativa L.) también se mal y polen viable. Estos estudios permitirán
ha logrado obtener planta transgénicas que ex- comprender aún mas el rol funcional de estos
presan en gen cryIA con el fin de reducir el ata- alergenos en la planta y explorar el potencial
que de la isoca de la alfalfa (Colias lesbis F.). para la obtención de cultivares de raigrás hi-
Otro ejemplo lo constituye la utilización de poalergénico.
inhibidores de proteasas, como el inhibidor
de tripsina pancreática bovina o aprotinina en 2.3.2 Manipulación de cambio de fase y
trébol blanco, donde la expresión en hoja a ni- floración
veles de 0,07% de proteína soluble reduce el La disminución del valor nutritivo en algunas
ataque por las larvas de Wiseana. forrajeras perennes se encuentra asociada con
Otra estrategia para proteger contra insec- el comienzo del crecimiento de las cañas flora-
tos plaga sería la transformación indirecta en les, la floración y la senescencia. Por lo tanto la
gramíneas, utilizando un endófito (microorga- calidad del forraje podría mejorarse inhibiendo

la producción de cañas florales, que son poco Se han utilizado diferentes enfoques para la
digeribles, o retardando la senescencia. manipulación del desarrollo reproductivo que
Se han informado modificaciones en el tiem- podrían conducir a un bloqueo de la floración,
po de floración en plantas transgénicas a tra- al desarrollo de la apomixis (tipo de reproduc-
vés de la regulación de la expresión de genes ción agámica común en ciertas especies de
involucrados en la iniciación del meristema flo- gramíneas) y androesterilidad (esterilidad de
ral. La expresión constitutiva de genes de Ara- la parte masculina de la planta), que además
bidopsis thaliana como LEAFY o APETALA1 posibilitarían el mantenimiento de los trans-
conducen a un desarrollo precoz como se ha genes. Esto es de particular importancia para
observado en plantas transgénicas de álamo. forrajeras transgénicas de polinización abierta,
En A. thaliana, mutaciones en uno o más de mediada por el viento, ya que la dispersión del
los genes involucrados en la determinación polen es un factor importante en la evaluación
de identidad del meristema floral conducen a de riesgo de las gramíneas genéticamente mo-
un desarrollo floral incompleto o nulo. Esto ha dificadas.
llevado a pensar en la posibilidad de controlar
o inhibir la floración en forrajeras transgénicas 2.3.3 Manipulación de la senescencia
regulando negativamente la expresión de los Se ha observado en plantas transgénicas
ortólogos (genes que tienen la misma estruc- que la producción autorregulada de citocini-
tura y función, y un origen común) de LEAFY o nas inhibe la senescencia foliar (envejecimien-
APETALA1. to de la hoja que culmina en la muerte de la
Un ejemplo en forrajeras fue la identificación misma). Este sistema se basa en la utilización
de el gen terminal de la floración 1 en L. peren- de un promotor específico de senescencia de
ne (LpTFL1), de expresión especifica de cier- A. thaliana, el SAG12, que controla la expre-
tos tejidos en Arabidopsis. Otro blanco para sión transgénica de un gen para la isopente-
la manipulación del desarrollo reproductivo en nil transferasa (ipt) de Agrobacterium tumefa-
forrajeras es el gen indeterminate 1 (ID1). Este ciens. El producto de este gen cataliza un paso
gen desempeña un rol importante en el con- en la biosíntesis de citocininas. Las plantas que
trol de la iniciación floral y en el mantenimiento expresan este gen presentan un retraso en la
de un estado floral determinado en maíz. Su
senescencia foliar y no exhiben anomalías de
mutación es la única conocida en monocotile-
ningún tipo. En trébol blanco, genes análogos
dóneas que bloquea específica y severamente
de ipt quiméricos bajo el control de promotores
la transición hacia un crecimiento reproductivo.
regulados por desarrollos asociados a senes-
Recientemente se aisló y caracterizó un ADNc
cencia, retardan significativamente la senes-
de plantas de raigrás perenne homólogo de
cencia. Las plantas transformadas presentaron
este gen. Sería esperable que la inhibición de
un aumento relativo en número de hojas, en
la transición del estado vegetativo a la forma-
la longitud de los estolones y en el área foliar
ción de cañas florales e inflorescencias en gra-
total, en comparación con plantas control. Otro
míneas incremente la calidad del forraje y, en
caso es la transformación de plantas de Fes-
consecuencia también disminuya la cantidad
de alergenos del polen. tuca arundinacea con el mismo gen ipt Estas
La inhibición o el control de la floración en plantas mostraron un aumento considerable en
forrajeras transgénicas a través de supresión el número de macollos, en los niveles de clo-
antisentido de ortólogos de ID1 o LEAFY y rofila a y b y en la tolerancia al frío, lo cual se
APETALA1 podría incrementar la calidad y me- tradujo en plantas más vigorosas y que a ba-
jorar los patrones de crecimiento estacional. jas temperaturas permanecen verdes por más
Por otro lado, representarían una vía para la tiempo.
contención de transgenes. Para la producción
de semilla, este bloqueo de la floración debería 2.4 Agricultura molecular
ser revertido. Una posibilidad para lograr este Las plantas transgénicas pueden ser utili-
fin sería la utilización de un promotor inducible zadas para expresar proteínas recombinantes
para controlar la supresión. heterólogas y biomoléculas, siendo ésta una

alternativa interesante en reemplazo de los se sabe que no se cruzan con el trébol blan-
sistemas microbianos. La perennidad, la pro- co. El uso de leguminosas forrajeras como el
ducción potencial de biomasa, la capacidad de trébol rojo, trébol de Persia y alfalfa en esta
fijar el nitrógeno biológico y la habilidad para zona «buffer», sembradas en bandas alterna-
crecer en áreas marginales que poseen las das, asegura que haya un elevado número de
forrajeras, en particular las leguminosas, las leguminosas no transgénicas floreciendo en
hace atractivas para este fin. La disponibilidad el ensayo en el período crítico en que están
de tecnologías que permitan alcanzar niveles floreciendo las plantas transgénicas motivo del
de expresión elevados y contener los trans- experimento. Las dimensiones de esta zona
genes, permitiría utilizar a las forrajeras como «buffer» fueron diseñadas teniendo en cuen-
biorreactores para la obtención de enzimas inta consideraciones tales como la conducta de
dustriales, productos farmacéuticos, vacunas, las abejas como polinizadoras del trébol blan-
anticuerpos y plásticos biodegradables entre co, la dispersión del polen, y determinaciones
otros. La alfalfa tiene ciertas características de flujo génico utilizando un gen marcador de
que la convierten en un interesante bioreactor. fácil trazabilidad (denominado Feathermark). A
Entre ellas se destacan la perennidad y la ca- fin de determinar el flujo génico, dos hileras de
pacidad de producir dos ó tres cosechas en el trébol blanco no transgénico se incluyeron en
año, existiendo además la tecnología adecua- el diseño rodeando el perímetro del ensayo y
da para extraer las proteínas de interés dejan- las parcelas centrales con las plantas transgé-
do un residuo utilizable para la alimentación del nicas. Las semillas cosechadas de las plantas
ganado. Se han desarrollado y evaluado plan- de trébol blanco no transgénico de estas dos
tas de alfalfa transgénicas productoras de en- hileras se analizaron utilizando una combina-
zimas microbianas involucradas en la degrada- ción de resistencia a antibiótico (resistencia a
ción industrial de lignina y celulosa, entre otros. G418 mediada por un gen npt2 ubicado en el
Este cultivo también ha sido utilizado para la T-ADN integrado en el genoma de las plantas
producción de polímeros biodegradables como transgénicas) y PCR para detectar la presencia
el polihidroxibutirato (PHB) mediante la intro- del gen marcador de selección. Los resultados
ducción de tres genes de Ralstonia eutropha. de este análisis confirmaron que este diseño
de campo es adecuado para la evaluación de
2.5 Evaluación a campo de plantas plantas transgénicas (Figura 3).
forrajeras transgénicas
A fin de determinar la estabilidad en la ex- 2.6 Integración de plantas forrajeras
presión de los transgenes, evaluar los nuevos transgénicas en programas de
fenotipos e identificar los eventos de transfor- mejoramiento y desarrollo de cultivares
mación adecuados para el desarrollo de ger- transgénicos
moplasma y cultivares transgénicos es nece- Los ejemplos citados más arriba acerca del
sario realizar ensayos de campo planificados, desarrollo de una serie de eventos de transfor-
en principio en pequeña escala. mación en leguminosas y gramíneas forrajeras
Solo después de haber realizado estas eva- constituyen una prueba fehaciente de la fun-
luaciones se pueden integrar estos materia- cionalidad de esta tecnología. El desafío actual
les en programas de mejoramiento molecular es utilizar esta tecnología y las herramientas
para el desarrollo de cultivares transgénicos. moleculares actuales para transferir genes va-
Un ejemplo ilustrativo de un diseño para en- liosos de manera múltiple o individual. Se trata
sayos de campo en escala reducida es el de de generar variabilidad genética y obtener ger-
plantas transgénicas de trébol blanco inmunes moplasma transgénico elite e incorporar estos
al virus del mosaico de la alfalfa. En este en- factores en programas de mejoramiento para
sayo se tuvieron en cuenta importantes carac- obtener cultivares. Hoy existen estrategias efi-
terísticas de bioseguridad, como por ejemplo cientes para la introgresión de transgenes elite
la presencia de una zona de dos hectáreas para la obtención de cultivares sintéticos (Figu-
sembradas con leguminosas forrajeras que ra 3B). En la Figura 3B se muestra la estrategia

entre la progenie T1 (Etapa 2); identificación
por PCR cuantitativa o cruza de prueba de las
plantas T2 que son homocigotas para los trans-
genes (Etapa 3). Por último, las plantas elite
homocigóticas para los transgenes son sem-
bradas para su selección en un criadero junto
con líneas parentales elite no transgénicas. De
esta manera se identificarán los nuevos pa-
rentales de los cultivares sintéticos transgéni-
cos experimentales, que posteriormente serán
evaluados en distintos ambientes.
3 Genómica
El mejoramiento de la plantas forrajeras ha
entrado en la era genómica, lo cual significa
que se cuenta con gran cantidad de nuevas
herramientas y tecnologías para el descubri-
Figura 3. A) Esquema de la liberación a campo, a miento de genes y para el análisis global de
pequeña escala, de plantas transgénicas de trébol los genomas. Todo esto aportará información
blanco inmunes a AMV. acerca de todos los aspectos del crecimiento
vegetal, desarrollo, diferenciación y respuestas
a estreses bióticos y abióticos, revolucionando
el mejoramiento vegetal y la producción. Miles
de etiquetas de secuencias expresadas (ESTs,
Expressed Sequence Tag) han sido el punto
de partida para dilucidar la función de miles
de genes vegetales, permitiendo la creación
de bases de datos de los principales cultivos;
posibilitando la identificación, caracterización
funcional y uso de genes valiosos para los sis-
temas de producción de forraje.
3.1 Descubrimiento de genes y

microarreglos para el análisis de la
Figura. B) Estrategia para el desarrollo de germo- expresión de genes en plantas forrajeras
plasma elite transgénico de trébol blanco inmune Las especies modelo para las cuales se han
a AMV, basada en la utilización de PCR cuantita- encarado proyectos de genómica basados en
tiva para detectar las plantas homocigotas para los ESTs son Lotus japonicus y Medicago trunca-
transgenes (npt2 y AMV4).
tula. Se han generaron mas 220.000 ESTs de
M. truncatula por consorcios internacionales
financiados por el múltiples entedidas de di-
utilizada para la obtención de plantas de tré- versos países. Otro programa entre Agriculture
bol blanco elites inmunes a AMV, homocigotos Victoria-DNRE (Australia) y AgResearch Limi-
para los transgenes. Involucra cruzas iniciales ted (Nueva Zelanda) generó mas de 100.000
de los eventos de transformación elegidos lue- ESTs de cultivos forrajeros clave para la agri-
go de su evaluación a campo con plantas elite cultura de clima templado, como son el raigrás
no transgénicas (Etapa 1); selección por resis- perenne (L. perenne) y el trébol blanco (T. re-
tencia a antibiótico de la progenie que lleva el pens). Para ello se secuenciaron a gran escala
transgén y está ligado al gen marcador npt2, o clones seleccionados al azar de genotecas de
análisis por PCR, seguido por cruzas dialélicas ADNc que representaban un amplio rango de

órganos, estados de desarrollo y tratamientos
experimentales. Más de 50.000 secuencias de
ADN de raigrás perenne fueron categorizadas
funcionalmente.
Dentro de este programa se realizaron mi-
croarreglosde ADNc de alta densidad (con
4.000-5.000 gotas/arreglo) para su utilización
en la identificación de secuencias de tréboles y
raigrases (Figura 4).
Una de las aplicaciones de estos microarre-
glos basados en ESTs de plantas forrajeras es
la fenotipificación molecular. Esto comprende
el análisis de patrones de expresión global o
patrones de expresión específicos utilizando Figura 4. B) Análisis de la imágen de los microarre-
hibridación con sondas complejas de genoti- glos de etiquetas expresadas de ADN (ESTs) (Ima-
pos contrastantes o poblaciones y ambientes Gene Software).
contrastantes. Todo esto puede utilizarse para
integrar los datos de microarreglos con aque-
llos de selección fenotípica convencional.
El análisis comparativo de secuencias y
datos de microarreglos de raigrás y tréboles
con aquellos de Arabidopsis y arroz, conjun-
tamente con los programas de descubrimiento
Figura 4. C) Microarreglos de ADNc de trébol blan-

co utilizando RNA de hojas y raíz. Confirmación por
Northern de la expresión de los genes para la di-
gidroflavonol reductasa y una proteína embriónica.
Figura 4. A) Perfiles de expresión a través de mi-

croarreglos de ADN utilizando dos colorantes fluo-
rescentes (Cy5 y Cy3) para marcar dos muestras
de RNA total provenientes de distintas situaciones
de crecimiento o desarrollo, por ejemplo plantas
creciendo en luz (Cy3) y plantas creciendo en os-
curidad (Cy5). Luego de la hibridación, los puntos
marcados en verde indican los genes que se en-
cuentran regulados positivamente cuando las plan-
tas se encuentran en condiciones de luz, aquellos
marcados en rojo corresponden a los regulados
positivamente cuando se hallan en oscuridad y los
que están en amarillo corresponderían a aquellos Figura 4. D) Perfiles de expresión de genes de rai-
genes que están regulados positivamente en am- grás, comparando genes que se expresan en tallo
bas situaciones. y raíz.

de ESTs en M. Truncatula, han aportado infor- Agriculture Victioria-DNRE también ha en-
mación acerca de los aspectos conservados carado un programa de genómica de endófitos
y divergentes en la organización y función del de gramíneas, focalizado en el descubrimiento
genoma de gramíneas y leguminosas. de genes gramínea-endófito en la asociación
Festuca arundinacea/Neotyphodium coeno-
3.2 Simbio y patogenómica phialum. A través de este programa se han
Las leguminosas y gramíneas ofrecen la generado aproximadamente 8.000 secuencias
posibilidad de estudiar, a nivel genómico, inte- del hongo que se analizaron a través de soft-
racciones de distintos tipos como por ejemplo: ware de búsquedas por homología, y se carac-
planta/patógeno, simbiosis leguminosa/bac- terizaron funcionalmente. El principal interés
teria fijadora de nitrógeno, asociaciones legu- está dirigido al descubrimiento de genes invo-
minosa/microrriza y endosimbiosis gramínea/ lucrados en la colonización del huésped, en el
endófito. La información obtenida en estos es- aporte de nutrientes para el hongo endofítico
tudios será de gran valor para desarrollar resis- y en la biosíntesis de metabolitos secundarios
tencia a patógenos y mejorar las asociaciones activos y su regulación. Este proyecto también
beneficiosas en las forrajeras. aportará información acerca de la interacción
El trabajo de descubrimiento de genes en
endófito-huésped, así como de los mecanis-
M. truncatula está orientado a estudiar la res-
mos fisiológicos conducentes a un incremento
puesta de la planta ante los patógenos y a ca-
en el vigor de la planta y a una mayor toleran-
racterizar diferentes sistemas patogénicos que
cia a estreses. Estas herramientas genómicas
incluyen hongos como Colletotrichum trifolii y
y el conocimiento generado posibilitarán el de-
Phytophthora medicaginis, y bacterias como
sarrollo de tecnologías para manipular la aso-
Xylella fastidiosa y Xanthomonas alfalfae.
Para mediados del 2000 el US M. truncatu- ciación gramínea-endófito y así incrementar el
la Functional Genomics Project generó 27.000 rendimiento de la planta, mejorar la tolerancia
secuencias de ADN que incluían 2.828 ESTs a estreses bióticos y abióticos y alterar la espe-
de hojas infectadas con Colletotrichum, 2.462 cificidad endófito huésped a fin de beneficiar a
ESTs de hojas infectadas con Phytophthora, la industria del césped y del forraje.
3.259 ESTs de micorrizas de raíz y aproxima- En otro proyecto similar se han tratado de
damente 9.500 secuencias de raíz de diferen- aislar y caracterizar genes involucrados en la
tes estadios luego de la inoculación con Si- biosíntesis de indol-diterpenos y ergopeptinas,
norhizobium meliloti, y de nódulos maduros y en la asociación Lolium perenne-N. lolii. Estos
senescentes. compuestos son tóxicos para los mamíferos.
Por otro lado existe un proyecto de genó- Actualmente se conoce la base genética de la
mica funcional integrado tendiente a dilucidar variación fenotípica de cinco cepas de N. lolii
los eventos conducentes a la nodulación en con diferentes perfiles de expresión de la toxi-
las leguminosas utilizando L. japonicus como na. La protección de los meristemas de Lolium
modelo. Este proceso de nodulación involucra de un exceso de herbivoría es vital para el éxito
la interacción compleja entre genes bacteria- reproductivo y la distribución de esta y otras es-
nos y sus productos, con procesos de desa- pecies de gramíneas. El desarrollo de asocia-
rrollo en la planta que involucran percepción y ciones simbióticas entre gramíneas y endófitos
transmisión de señales y morfogénesis. El ob- del grupo Epichloë/ Neotyphodium representa
jetivo es comprender la contribución genética una forma única de protección donde el hués-
de la planta a esta simbiosis a fin de mejorar ped y el simbionte han co-evolucionado para
las asociaciones naturales beneficiosas para la beneficio mutuo. El hongo le aporta protección
agricultura y el ambiente. Este y otros recursos al huésped a través de la producción de me-
genéticos de M. truncatula y L. japonicus con- tabolitos bioprotectores en retribución por los
tribuirán significativamente a conocer y com- nutrientes para su crecimiento.
prender las respuestas a patógenos y estrés y El clonado de los genes de estas vías me-
las interacciones de la rizósfera con las legumi- tabólicas es un objetivo importante ya que se
nosas forrajeras. conoce poco acerca de la enzimología, de la

biosíntesis de toxinas y de las condiciones En este marco se han aislando y caracteriza-
para la síntesis endofítica de estos metabolitos do genes que permiten a estas especies tole-
ex planta. rar estreses abióticos como sequía, salinidad y
suelos de baja fertilidad.
3.3 Xeno-genómica Entre las especies estudiadas se incluyen
La genómica comparativa basada en el gramíneas australianas nativas, tales como las
análisis de ESTs de varias plantas tolerantes halotolerantes Agrostis adamsonii y A. robus-
a estreses abióticos permitirá la identificación ta y la especie tolerante a aluminio Microlaena
de redes de genes asociados con estreses stipoides (Tabla 1). También incluye especies
ambientales tales como alta salinidad, sequía y exóticas como Deschampsia artanctica, una de
bajas temperaturas, así como la determinación las dos únicas plantas vasculares nativas de la
de vías bioquímicas conservadas involucradas Antártida. Estos descubrimientos facilitarán el
en las respuestas. desarrollo de estrategias efectivas de mejora-
La investigación genómica utilizando espe- miento molecular que permitirán incrementar la
cies vegetales exóticas, conocida como xeno- tolerancia a estreses abióticos en forrajeras y
genómica, incluye el descubrimiento de genes otros cultivos.
a través del secuenciado de ESTs a gran es-
cala y el análisis de la expresión global de ge- 4 Resumen y conclusiones
nes con microarreglos basados en las mismas. En los últimos años se ha realizado un
Esto posibilitará la obtención de genes clave considerable progreso en el establecimiento
y variantes de genes de plantas exóticas, mu- de las metodologías requeridas para
chos de ellos nuevos y la determinación de sus el mejoramiento molecular de plantas
patrones de expresión en respuesta a estreses forrajeras. Numerosas estrategias
abióticos específicos. biotecnológicas están siendo consideradas
Un programa de xeno-genómica llevado en relación al mejoramiento de la calidad
a cabo por Agriculture Victioria-DNRE se en- nutritiva a través de la alteración en la
cuentra abocado a seleccionar gramíneas y biosíntesis de lignina, carbohidratos
leguminosas australianas nativas y exóticas, solubles y protoantocianas, y de la
adaptadas a estreses ambientales extremos. expresión regulada de proteínas ricas en

aminoácidos esenciales, resistentes al In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding
rumen. También se pretende incrementar of forage crops. Kluwer Academic Publishers,
la resistencia a patógenos y plagas, Dordrecht, 2000. Capitulo 10.
manipular el crecimiento y desarrollo a fin Forster JW.; Jones ES.; Koelliker R.; Drayton
de incrementar la persistencia y demorar MC.; Dumsday JL.; Dupal MP.; Guthridge KM.;
Mohoney NL.; Van Zijll de Jong E. and Smith
senescencia, impedir la floración, regular
K. 2000. Development and implementation of
negativamente los alergenos del polen. molecular markers for forage crop improvement.
Más recientemente el creciente interés en In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding
la producción de biocombustibles a partir of forage crops. Kluwer Academic Publishers,
de celulosa ha impulsado a la ingeniería Dordrecht, 2000. Capitulo 6.
genética de ligninas para facilitar la Gresshoff PM.; Men AE.; Maguire T.; Grimmond
liberación de celulosa y hemicelulosa. Las S.; Lohar D.; Ayanru S.; Meksem K.; Lightfoot
primeras plantas forrajeras transgénicas D. and Stiller J. 2000. An integrated functional
están siendo evaluadas a campo y se han genomics and genetics approach for the plant’s
seleccionado eventos de transformación function in symbiotic nodulation. In: Spangenberg
para el desarrollo de nuevos cultivares. G. (ed.) Molecular breeding of forage crops.
Las herramientas genómicas permiten com- Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2000.
Capitulo 17.
prender mejor la genética, fisiología y bioquí-
Humphreys M. O. 2005. Molecular breeding for the
mica de varios procesos vegetales complejos y genetic improvement of forage crops and turf.
acelerar la aplicación de estrategias de tecno- Wageningen Academic Publishers, Netherlands.
logía génica para el mejoramiento de plantas Humphreys MW., Yadav R S., Cairns AJ., Turner
forrajeras. LB., Humphreys J. y Skot L. 2005. Review: A
La aplicación de herramientas y metodolo- changing climate for grassland research. New
gías moleculares para el mejoramiento de es- Phytologist, 169, 9–26.
tas especies complementa, en gran medida, Kalla R.; Chu P. y Spangenberg G. 2000. Molecular
a la selección empírica basada en el fenotipo. breeding of forage legumes for virus resistance.
Estas estrategias son promisorias solamente In: Spangenberg G. (ed.) Molecular breeding
cuando se las considera dentro de un progra- of forage crops. Kluwer Academic Publishers,
ma de mejoramiento. Los programas más exi- Dordrecht, 2000. Capitulo 13.
Li X., Weng J., and Chapple C. 2008. Improvement
tosos son aquellos que incluyen equipos mul-
of biomass through lignin modification. The Plant
tidisciplinario, cuyo esfuerzo resultará crítico Journal, 54, 569–581.
para el desarrollo de cultivares destinados al
mercado y para de plantas forrajeras destina-
das a otros usos.
La investigación genómica en las plantas
forrajeras permite el desarrollo de tecnologías
que van más allá de los sistemas de produc-
ción de forrajes, incrementando significativa-
mente el valor de las semillas y de los produc-
tos agrícolas. La infinidad de genes vegetales
que se descubren continuamente representan
un recurso invalorable.
5 Lecturas Recomendadas
Austin-Phillips S. and Ziegelhoffer, T. 2000. The

production of value-added proteins in transgenic
alfalfa. In: Spangenberg G. (ed.) Molecular
breeding of forage crops. Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, 2000. Capitulo 18.
Casler MD. y Kaeppler HF. 2000. Molecular
breeding for herbage quality in forage crops.

V. CAPÍTULO 3 porogénesis se generan cuatro células haploi-
des a partir de una “célula madre de la megás-
pora” que se diferencia en la nucela del óvulo.
Caracterización molecular de la En la mayor parte de las angiospermas, tres de
apomixis y su aplicación en la estas células haploides degeneran, mientras
agricultura que la restante constituye la megáspora fun-
cional. Por el proceso de megagametogénesis,
Silvina C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz (una serie acotada de mitosis ordenadas), esta
célula desarrolla un megagametófito conocido
Qué es la apomixis como “saco embrionario”. El saco embrionario
Algunas plantas con flores presentan un más común es el de tipo Polygonum, formado
modo asexual de reproducción llamado apo- por 8 núcleos haploides (n) contenidos en siete
mixis. Consiste en la formación de semillas células, a saber: la ovocélula, dos sinérgidas,
que contienen embriones genéticamente idén- una célula central binucleada, y tres antípodas.
ticos a la planta madre, sin que intervengan los Por otra parte, en las anteras las micrósporas
procesos de meiosis y fecundación. La apo- desarrollan los granos de polen mediante un
mixis fue descripta por primera vez en 1841 en proceso de microgametogénesis. El polen ma-
la planta australiana Alchornea ilicifolia por J. duro está típicamente integrado por tres célu-
Smith. Cuando un ejemplar femenino de esta las haploides (n), dos de las cuales constitu-
especie dioica fue llevado a los Kew Gardens yen los gametos masculinos. La otra tiene una
de Londres desde Asia, la planta aislada flo- función relacionada con el crecimiento del tubo
reció y produjo semillas en abundancia en au- polínico.
sencia de un progenitor masculino, poniendo La formación de la semilla requiere del pro-
al carácter en evidencia. Paradójicamente, los ceso de doble fecundación: un gameto mas-
primeros experimentos con plantas apomícti- culino (n) se fusiona con la ovocélula (n) para
cas fueron realizados en forma involuntaria por originar al cigoto (2n). A partir de este cigoto
Gregor Mendel, quien utilizó cruzas interespe- se desarrolla el embrión. La célula central del
cíficas de Hieracium para intentar confirmar saco embrionario con sus dos núcleos (n + n)
los resultados obtenidos en sus famosos estu- se fusiona con el otro gameto masculino para
dios sobre la herencia en las arvejas de jardín. originar el endospermo. Así, la fusión de dos
Mendel atribuyó erróneamente a una supuesta gametos haploides únicos derivados de la dis-
“frecuente autopolinización” la falta de segre- tribución al azar del material genético durante
gación observada en varios cruzamientos. Hoy las meiosis masculina y femenina resulta en la
sabemos que muchas especies del género generación de progenies genéticamente diver-
Hieracium son apomícticas. sas. En resumen, en la reproducción sexual la
Se considera que la apomixis ha evoluciona- meiosis produce la recombinación genética de
do como un sistema de reproducción alternati- los caracteres de ambos progenitores y game-
vo a la sexualidad a través de la reformulación tos haploides. La fecundación fusiona de ma-
de sus programas de desarrollo. Por eso, para nera aleatoria un gameto masculino con uno
comprender mejor su funcionamiento, es nece- femenino para originar un nuevo individuo con
sario compararla con la reproducción sexual. una constitución genética única.
La sexualidad en las angiospermas compren- La apomixis elude la ruta sexual evitando la
de la alternancia cíclica entre los estados de reducción meiótica y la fecundación. El óvulo
esporófito (la planta misma, 2n) y gametófito desarrolla una semilla cuyo embrión contiene
(el grano de polen y el saco embrionario, n). exactamente el mismo genotipo que la planta
La meiosis que ocurre en las flores posibilita que lo origina. Por lo tanto este carácter (tam-
la recombinación y reducción del contenido ge- bién llamado agamospermia) ha sido definido
nético y da lugar a la formación de las esporas como reproducción asexual a través de semi-
femeninas (megásporas) en el óvulo y masculi- llas. La apomixis fue descripta en más de 400
nas (micrósporas) en las anteras. En la megas- especies de plantas pertenecientes a 35 fami-

lias diferentes, entre las que se destacan las más profundamente que la apomixis esporo-
Gramíneas, las Compuestas, las Rosáceas y fítica, principalmente por ser el tipo presente
las Rutáceas. Presenta formas diversas y pa- en las gramíneas, donde muchas especies
rece haber surgido varias veces independien- con valor agronómico presentan este modo
temente durante la evolución. Brevemente, los de reproducción. En la Figura 1 se muestra
embriones apomícticos pueden formarse a tra- un esquema comparativo simplificado de las
vés de una ruta esporofítica o gametofítica. vías de reproducción sexual y apomíctica en
En la apomixis esporofítica, también llamada angiospermas. Los diferentes mecanismos de
embrionía adventicia, los embriones surgen di- apomixis observados en distintos géneros en
rectamente de una célula somática de la nuce- comparación con el proceso sexual de mega-
la o de los tegumentos del óvulo. Comúnmente gametogénesis, fueron esquematizados en la
se forman embriones múltiples a partir de cé- Figura 2.
lulas nucelares (esporofíticas) que comparten Recordemos que en las angiospermas
el óvulo junto con el embrión de origen sexual existe una doble fecundación. En la apomixis
y utilizan su endospermo para desarrollarse. gametofítica la partenogénesis excluye inva-
Esta forma de apomixis aparece comúnmente riablemente una de las etapas de esta doble
en los cítricos, los cuales se convirtieron en un fecundación: la unión de los gametos mascu-
sistema modelo para estudiar el proceso. En linos con los femeninos. Sin embargo, no ne-
la apomixis gametofítica se forman siempre cesariamente se anula la fecundación de los
sacos embrionarios que difieren en algunos núcleos polares. Aunque en algunos casos el
aspectos del gametófito femenino haploide (n) endospermo puede desarrollarse en forma au-
generado a partir de la megáspora funcional. tónoma (sin la unión de un gameto masculino
Su principal diferencia es precisamente el he- con los núcleos polares del saco embrionario
cho de ser diploides (2n) ya que los núcleos apospórico o diplospórico) en muchas espe-
que los conforman no han pasado por el pro- cies apomícticas, como en la mayoría de las
ceso meiótico y por lo tanto no han reducido su gramíneas tropicales, es necesario que un ga-
contenido de ADN. Por eso se dice que estos meto masculino se fusione con el o los núcleos
sacos embrionarios o megagametófitos sur- polares de la célula central del saco embriona-
gen por un proceso de apomeiosis (apo: prefijo rio para formar el endospermo. A este proceso
griego de significación negativa). De acuerdo se lo llama pseudogamia.
con el origen de la célula que genera al saco Casi todos los sacos embrionarios diplos-
embrionario y al embrión, la apomixis gameto- póricos (con excepción de los de Eragrostis)
fítica puede ser clasificada como: diplosporía, conservan la típica estructura de los sacos em-
cuando el saco embrionario se origina a partir brionarios de origen meiótico, generalmente
de la célula madre de la megáspora misma ya con siete células y ocho núcleos. Sin embargo,
sea por mitosis o luego de una falla en la meio- en la aposporía los sacos muestran por lo ge-
sis o aposporía, cuando el saco embrionario neral una constitución muy variable, tanto en
se origina directamente por mitosis a partir de taxones diferentes como dentro de un mismo
una célula somática cercana, usualmente una taxón (Figura 2). Por ejemplo, en gramíneas
célula de la nucela. Los sacos embrionarios, tropicales o subtropicales, el saco apospórico
sean éstos apospóricos o diplospóricos, conse forma por dos mitosis consecutivas, con
tienen un gameto femenino 2n, la ovocélula, a permanencia de los cuatro núcleos en un solo
partir de la cual se desarrolla directamente el polo celular. Así se organiza un megagametófi-
embrión por partenogénesis sin que exista fe- to con una ovocélula flanqueada por dos sinér-
cundación. Así, mientras en el proceso sexual gidas y una célula central uninucleada y exten-
la reducción meiótica se complementa con la samente vacuolizada. Esta estructura de saco
fecundación que restaura el nivel de ploidía apospórico fue descripta por primera vez para
2n, en la apomixis gametofítica la ausencia de Panicum maximum y por esa razón a los me-
reducción se complementa con la partenogé- gagametófitos con esta morfología se los cono-
nesis. La apomixis gametofítica fue estudiada ce como sacos apospóricos de tipo Panicum.

Figura 1: Rutas biológicas de reproducción sexual y apomíctica. Durante la sexualidad una célula de
la nucela del óvulo se diferencia como célula madre de la megáspora y luego de sufrir un proceso de meio-
sis da origen a cuatro megásporas haploides. Tres de estas megásporas degeneran y la cuarta da origen a
la formación de un saco embrionario luego de una serie de mitosis, donde todos los núcleos celulares es-
tán reducidos (n). La ovocélula y los núcleos polares del saco son fecundados por los núcleos generativos
del polen para generar el cigoto y el núcleo primario del endosperma, respectivamente. El cigoto da origen
al embrión a través de sucesivas mitosis. La apomixis consiste en la formación de un embrión a partir de
una célula no reducida (que no ha sufrido meiosis). En la apomixis gametofítica se observa la formación de
un megagametofito con células no reducidas, cuya ovocélula (2n) genera un embrión por partenogénesis.
En la embrionía adventicia el embrión es generado directamente a partir de una célula de la nucela en un
proceso similar a la embriogénesis somática.
Sin embargo, en las especies apospóricas de Otros aspectos sustanciales del carácter
Paspalum, un género también perteneciente apomixis
a la tribu Paníceas igual que Panicum, existe Hay varias características particulares de
una característica en la constitución de los sa- este modo de reproducción que merecen ser
cos apospóricos que los diferencia netamente remarcadas. Por una parte la apomixis usual-
del tipo Panicum: en Paspalum los sacos ge- mente no altera la formación del microgame-
neralmente tienen una célula central con dos tófito y la meiosis ocurre en las anteras gene-
núcleos polares y a veces tres (Figura 3). Esta rando polen reducido, aunque a veces se ob-
característica es importante porque debido a servan tasas inferiores de viabilidad. Además,
la pseudogamia, la relación genómica mater- apomixis y sexualidad no son procesos mutua-
na/paterna del endospermo es distinta en las mente excluyentes ya que pueden aparecer
plantas sexuales y en las apospóricas. En las simultáneamente sacos reducidos (meióticos)
sexuales, hay una relación 2/1 materno/pater- y no reducidos (provenientes de apomixis) en
no (madre n + n; padre n), mientras que en las una misma planta, en una misma inflorescen-
apospóricas esa relación es generalmente 4/1 cia y aún en un mismo óvulo. Una planta apo-
(madre 2n + 2n; padre n). En Panicum la rela- míctica que es capaz de generar al menos una
ción es 2/1 tanto en las sexuales como en las parte de su progenie por medios sexuales se
apospóricas (n + n/n en las sexuales y 2n/n en conoce como “facultativa”. Por lo tanto, en los
las apospóricas). genotipos apomícticos facultativos las proge-

Figura 2: Distintos tipos de sacos embrionarios formados durante el proceso de apomixis. En la
mayoría de las plantas angiospermas sexuales, la célula madre de la megáspora realiza un proceso de
meiosis y genera cuatro megásporas haploides, tres de las cuales degeneran. La cuarta megáspora lleva
a cabo una serie de tres divisiones mitóticas para formar un saco embrionario reducido y octanucleado. En
el proceso de embrionía adventicia la formación del saco sexual es normal, pero las células nucelares ad-
yacentes desarrollan embriones somáticos que coexisten con el embrión de origen sexual. En la apomixis
diplospórica la célula madre de la megáspora realiza una serie de mitosis para generar un saco embriona-
rio no reducido o inicia un proceso de meiosis que falla y se genera un saco embrionario no reducido. En
la apomixis apospórica células de la nucela cercanas a la célula madre de la megáspora realizan varias
mitosis consecutivas para generar un saco embrionario no reducido cuya característica más notable es la
ausencia de antípodas.
nies segregan como clases maternas (2n + 0) cundación de una ovocélula reducida y 3) ha-
y no-maternas o aberrantes. Hay tres tipos diploides (n + 0) generados por partenogénesis
ferentes de individuos aberrantes que pueden a partir de una ovocélula reducida.
encontrarse en la progenie de una planta apo- Por otra parte, la apomixis gametofítica se
míctica: 1) híbridos BIII (2n + n) que resultan de relaciona fuertemente con la poliploidía. En
la fecundación de una ovocélula no reducida, general las especies apomícticas presentan
2) híbridos BII (n + n) que resultan de la fe- razas de bajos niveles de ploidía (usualmente

Figura 3: Microfotografías de secciones de óvulos de razas tetraploides de Paspalum notatum.
A: óvulo conteniendo un saco embrionario meiótico (las dos sinérgidas y algunas de las antípodas no se
observan porque están en una sección adyacente al corte del óvulo). B: óvulo conteniendo dos sacos
embrionarios apospóricos con dos núcleos polares. Referencias: a, antípodas; e, ovocélula, p, núcleos
polares; barra = 30 micras
diploides) que se reproducen por sexualidad ducción apomíctica. Existen varias teorías que
y otras de mayor nivel de ploidía (por ejemplo explican la baja frecuencia de apomixis a ni-
tri, tetra o pentaploides) que se reproducen vel diploide. Una fue propuesta por Nogler y
por apomixis. Estos complejos integrados por sostiene que un alelo dominante A, responsa-
individuos sexuales y apomícticos de distinto ble de la aposporía, no puede ser transmitido
nivel de ploidía se conocen como “complejos a través de gametas haploides, con lo cual la
agámicos” y se consideran estructuras repro- apomixis no puede ser encontrada en diploides
ductivas complejas y evolucionadas donde la naturales. Otra fue planteada por Mogie y sos-
sexualidad permite la generación de nuevos tiene la existencia de un fenómeno de dosaje
genotipos y la apomixis la propagación clonal génico para un alelo mutante a-, en presencia
muy eficiente de las combinaciones genéticas del alelo salvaje a+, para que el carácter se
superiores. Al menos para algunas especies exprese. De acuerdo a esta teoría la ausencia
(por ejemplo P. notatum y P. rufum) existen evi- de apomixis en los diploides naturales se debe
dencias que sugieren que la diversidad gene- más bien a una falta de expresión, en lugar de
rada a niveles menores de ploidía puede ser la no-transmisión propuesta por Nogler. Mogie
impulsada hacia los niveles poliploides por me- sugiere que se necesitan dos copias del alelo
dio de eventos sucesivos de hibridización 2n + a- (frecuencia mayor a 0,5) para la expresión
n. La relación de la apomixis con la poliploidía de la apomixis. En contraste con esta teoría,
es estrecha ya que existen muy pocos casos Noirot propone que el alelo a+ no debería es-
reportados de diploides que muestran repro- tar presente en una frecuencia mayor de 0,25.

La demostración del carácter dominante del (apomícticos facultativos), del mismo nivel de
alelo determinante de la apomixis en muchas ploidía en el cual se expresa la apomixis es un
especies apospóricas contradice estas últimas requisito fundamental para el mejoramiento de
hipótesis. Sin embargo, en el género Paspalum estas especies. Estos individuos presentan un
se demostró que debe existir cierto efecto de cierto grado de variabilidad como para aumen-
dosaje relacionado con la poliploidía, ya que la tar las posibilidades de supervivencia frente a
sola duplicación cromosómica con colchicina cambios ambientales y aportan asimismo ger-
de diploides sexuales indujo, al menos en algu- moplasma útil para el mejoramiento.
nos casos, la obtención de tetraploides apomíc- Uno de los principales requisitos para lle-
ticos. En base a esas observaciones, Quarin y var adelante un programa de mejoramiento
colaboradores postularon que el determinante de una especie apomíctica es la colección de
genético responsable de la apomixis existiría germoplasma diverso desde las fuentes de
a nivel diploide, pero que su expresión estaría origen. Una buena colección posibilita ampliar
condicionada por uno o varios genes adiciona- la base genética disponible y eventualmente
les sujetos a efectos de dosaje. Una hipótesis identificar introducciones sexuales o altamen-
alternativa podría ser que una condición epige- te sexuales (apomícticas facultativas con alta
nética asociada con la poliploidía posibilitara la expresión de sexualidad). La evaluación de es-
expresión del alelo determinante del carácter. pecies relacionadas es también una alternativa
Así, a nivel diploide el alelo determinante de la importante cuando no se dispone de plantas
apomixis estaría eventualmente presente, pero sexuales de la especie de interés. Ejemplos
sólo sería capaz de expresarse en forma apre- de cruzamientos interespecíficos e incluso in-
ciable en entornos poliploides que provean un tergenéricos empleados como punto de partida
paisaje epigenético propicio. en programas de mejoramiento se encuentran
en Brachiaria, Zea x Tripsacum y Pennisetum,
Mejoramiento genético de especies entre otros.
naturalmente apomícticas El adecuado conocimiento de la biología flo-
Algunas especies apomícticas tienen un ral, citogenética y modo de reproducción de
valor agronómico muy importante, como es los materiales disponibles es un requisito fun-
el caso de varias gramíneas forrajeras, los ci- damental para cualquier estrategia de mejora-
trus, el mango y las fresas. Hasta el presente, miento. Como se verá mas adelante, los estu-
sólo se dispone de programas de mejoramien- dios realizados para determinar la base gené-
to avanzados en algunas gramíneas forraje- tica de la apomixis en varias especies de gra-
ras entre las que se encuentran especies de míneas indican que el carácter presenta un tipo
los géneros Brachiaria, Cenchrus, Eragrostis, de herencia relativamente simple, haciendo po-
Panicum, Paspalum, Pennisetum y Poa. En sible entonces su utilización en programas de
principio, las plantas apomícticas facultativas mejoramiento una vez que son detectados indi-
pueden ser mejoradas por metodologías de viduos sexuales o apomícticos facultativos. En
cruzamiento convencionales, ya que producen estos casos los genotipos apomícticos obliga-
al menos algunos sacos embrionarios meióti- dos con características deseables pueden ser
cos que posibilitan la hibridación y selección. usados como dadores de polen. Debido a que
En cambio en los apomícticos obligados (que los gametos masculinos son reducidos y que
se reproducen completamente o casi comple- la mayoría de las especies apomícticas son al-
tamente en forma clonal), la hibridación y el tamente heterocigotas, los cruzamientos entre
análisis de segregación son impracticables. individuos sexuales (utilizados como progeni-
Las progenies de tales plantas exhiben siem- tores femeninos) y apomícticos (empleados
pre el fenotipo materno o pueden ocasional- como dadores de polen) pueden conducir a la
mente aparecer variantes que probablemente generación de progenies F1 variables donde es
surjan de mutaciones más que de segregación posible seleccionar. Hay que tener en cuenta
sexual. Por ello, la disponibilidad de individuos que si bien son necesarios individuos sexua-
sexuales o con algún grado de sexualidad les o con adecuada expresión de sexualidad

para realizar las cruzas, en el momento de la pecies como P. notatum (apomíctico, 4X), P.
selección habrá que usar el criterio contrario, dilatatum (apomíctico, 5X), P. plicatulum, P.
es decir, seleccionar los mejores fenotipos atratum, y luego se eligieron algunos ecotipos
que contengan un alto grado de expresión de por sus cualidades agronómicas y su adaptabi-
la apomixis. Esto conducirá a la obtención de lidad al cultivo. En el sur de los Estados Unidos
nuevas variedades genéticamente estables. El se han popularizado algunas variedades tetra-
objetivo final de un programa de mejoramiento ploides apomícticas de P. notatum (Argentine,
de una especie apomíctica en el cual ha sido Paraguay, Paraguay 22, Wilmington, Tifton 7 y
posible obtener recombinación genética es la otras). También se cultivan algunas variedades
identificación en la población segregante de los apomícticas de Dallisgrass (P. dilatatum) selec-
genotipos superiores, con reproducción com- cionadas de la misma manera. En nuestro país
pletamente (o casi completamente) apomíctica se cultivaron durante mucho tiempo dos varie-
que puedan ser transformados en cultivares dades apomícticas de P. guenoarum: el Pasto
mediante su multiplicación por semillas. El ca- Rojas y el Pasto Ramírez, seleccionadas por
mino no es sencillo porque en cada generación este método en Paraguay. Recientemente se
es necesario distinguir en la progenie, cuáles han inscripto otras dos variedades que han sido
son los individuos generados por sexualidad y seleccionadas en la Facultad de Ciencias Agra-
cuáles por apomixis. Dentro de los generados rias de la Universidad Nacional del Nordeste: el
por sexualidad, habrá que seleccionar los que Pasto Cambá (P. atratum) y el Pasto Chané (P.
al mismo tiempo posean las mejores caracte- guenoarum). Otro ejemplo es el de Eragrostis
rísticas agronómicas y presenten un alto grado curvula (pasto llorón), cuyos cultivares provie-
de expresión de la apomixis. Otro aspecto a te- nen de selecciones practicadas sobre materia-
ner en cuenta es el nivel de ploidía de los pro- les nativos de Tanzania y Sudáfrica. El pasto
genitores que serán empleados en los cruza- llorón fue introducido en Argentina aproxima-
mientos. Los primeros estudios de hibridación damente en 1930 en una estancia de la provin-
indicaron la necesidad de realizar cruzas entre cia de San Luis. De ahí, en 1947, semillas del
especies sexuales y apomícticas con el mismo cultivar Tanganyika (primer cultivar adaptado)
nivel de ploidía ya que varios intentos realiza- fueron remitidas a la Estación Experimental
dos entre diploides sexuales y poliploides (en INTA Anguil, donde fueron multiplicadas consti-
general tetraploides) apomícticos condujeron a tuyendo la base de la intensificación del cultivo
la generación de progenies estériles. en nuestro país; 2) la segunda posibilidad de
En las gramíneas tropicales y subtropicales mejoramiento, en la que aún se ha avanzado
se ha hecho un buen uso del carácter en el me- poco, consiste en realizar cruzamientos con
joramiento, especialmente en la domesticación genotipos sexuales poliploides naturales, que
de algunas especies. Tres líneas de trabajo han son muy raros. Un buen ejemplo de esto son
sido llevadas adelante en estos programas: 1) las variedades Nueces y Llano de Buffelgrass
la selección de los mejores genotipos naturales (Pennisetum ciliaris) desarrolladas en EEUU en
partiendo de una amplia colección de germo- la década del 70 a partir de cruzamientos entre
plasma y estudiando características como la una rara planta 4x sexual (natural) por plantas
productividad de biomasa, calidad de forraje, apomícticas 4x (que son las comunes en esta
adaptabilidad al cultivo y a distintas condicio- especie). También se pueden conseguir plan-
nes ambientales, capacidad de producción de tas 4X sexuales por duplicación cromosómica
semilla, persistencia al pastoreo, y otras. Hay de una planta diploide sexual. Mediante este
numerosos ejemplos de cultivares de pastos tipo de tratamientos se han obtenido plantas
forrajeros apomícticos que se mejoraron usan- tetraploides sexuales en B. ruziziensis, E. cur-
do este tipo de selección. Así se obtuvieron va- vula, P simplex, P. notatum y P. hexastachium.
riedades apomícticas de Paspalum, Brachia- La disponibilidad de estas plantas, además de
ria, Panicum, Themeda, Eragrostis y Melinis. facilitar los planes de cruzamientos, permitió la
Tomando como ejemplo al género Paspalum, realización de estudios detallados de la heren-
en primer lugar se seleccionaron algunas es- cia del carácter apomixis en algunas de estas

especies. Actualmente, poblaciones segregan- combinación genética que lleve los factores de-
tes de P. notatum obtenidas a partir del cruza- terminantes de la apomixis podría ser manteni-
miento entre individuos tetraploides sexuales da y multiplicada como una réplica exacta por
(generados experimentalmente) y apomícticos innumerables generaciones vía semillas. Esto
naturales están siendo evaluadas en pruebas a posibilitaría el uso del carácter para propagar
campo en Florida, EEUU. 3) Una tercer estra- especies que actualmente se clonan vegetati-
tegia de mejoramiento consiste en la obtención vamente o in vitro. La perspectiva de reproducir
de variantes somaclonales a partir del cultivo híbridos superiores vía semillas podría repre-
in vitro de tejidos. Esta metodología se basa sentar una ayuda importante para los produc-
en la aparición de variaciones heredables en tores agropecuarios de los países en desarro-
las plantas regeneradas in vitro (conocidas llo, permitiéndoles sostener altos rendimientos
como variantes somaclonales) que pueden uti- año tras año usando parte de la cosecha sin
lizarse en el mejoramiento. Por ejemplo, en el pérdidas en la producción debidas a la segre-
laboratorio de Genética del Departamento de gación o endogamia. Entre otras ventajas, la
Agronomía de la Universidad Nacional del Sur, expresión de la apomixis reduciría al mínimo
Bahía Blanca, Argentina, se obtuvieron varios el aislamiento físico requerido para preservar
somaclones de pasto llorón (Eragrostis curvu- líneas genéticas homocigotas. Asimismo faci-
la), entre ellos una línea tetraploide apomíctica litaría el uso de transformantes considerando
registrada como cultivar Don Luis (RC9191, que una planta transgénica apomíctica fijaría
2006-2026) en honor al Ing. Luis A. Mroginski, inmediatamente el nuevo carácter y se conver-
uno de los pioneros en el desarrollo del culti- tiría en un cultivar luego de su multiplicación.
vo in vitro de tejidos vegetales en nuestro país. En un planeta con una demanda creciente de
Don Luis se distingue de los otros materiales alimentos, que deberá duplicar su producción
de Eragrostis curvula por su número cromosó- en los próximos 50 años utilizando una super-
mico (2n = 64), el ancho de sus hojas, el co- ficie de siembra igual o menor a la actual, esa
lor azul de las mismas y su resistencia a bajas opción resulta de crucial importancia. Se calcu-
temperaturas. En estado reproductivo se dife- la que solamente para la producción de arroz
rencia por el mayor tamaño de las panojas en híbrido y con una tasa moderada de acepta-
relación a otros cultivares. ción por parte de los agricultores, esta tecno-
logía brindaría beneficios globales por unos 2
Usos potenciales de la apomixis en el a 4 billones de dólares anuales. Las ventajas
mejoramiento de plantas naturalmente enumeradas y muchas otras no mencionadas
sexuales aquí hacen que este carácter represente un
La ausencia de recombinación durante la beneficio potencial enorme para la agricultura
megagametogénesis y de fecundación de la y que se hayan comparado los incrementos po-
ovocélula por un gameto masculino posibilita tenciales en la producción a través del uso de
la generación de embriones que presentan una esta tecnología con aquellos derivados de la
constitución genética idéntica a la de la plan- revolución verde a partir de los años 60.
ta madre. La apomixis es un carácter utilizable
en el mejoramiento de plantas y la producción El control genético de la apomixis
de alimentos, ya que puede constituir una he- La apomixis es un carácter heredable, pero
rramienta ventajosa para la estabilización de su control genético no fue aún completamen-
genotipos superiores y la fijación de combina- te esclarecido. Tradicionalmente se consideró
ciones híbridas. La perspectiva más atractiva que sus determinantes básicos podrían haber-
que representa la apomixis para la agricultura se originado por mutación y que la mayoría de
es la posibilidad de obtener y propagar, por se- los otros genes involucrados en su expresión
millas, nuevos híbridos interespecíficos e inter- son similares a los de la sexualidad. A pesar de
genéricos, permitiendo el desarrollo de genoti- su amplia distribución en las angiospermas, el
pos mejor adaptados a los distintos ambientes carácter no es muy común en los cultivos ma-
y con altos rendimientos. En teoría cualquier yores o en sistemas modelos. Esta condición

forzó a que los estudios en este campo deban región que controla la apomixis, presentan di-
ser realizados en especies silvestres que son ferente expresividad, lo que refuerza la idea de
poliploides, altamente heterocigotas y con una que deben existir modificadores o alteraciones
pobre caracterización genética. La disección epigenéticas afectando al carácter. En ningún
de las bases genéticas del carácter es por lo caso el efecto de esos modificadores o la natu-
tanto dificultosa y compleja. Los estudios de raleza del posible control epigenético han sido
herencia sólo son posibles si pueden cruzarse estudiados en detalle. Como veremos, en los
progenitores completamente sexuales y apo- últimos años se impuso mayoritariamente el
mícticos y la progenie F1 segregante puede ser modelo cualitativo de clasificación, ya que casi
examinada por métodos citoembriológicos o todos los estudios de mapeo han considerado
por análisis de progenies en busca de variacio- una planta como apomíctica si se observa en
nes con respecto al fenotipo materno. El aná- ella al menos un saco embrionario no reducido,
lisis de progenies usando marcadores molecu- independientemente del grado de expresividad
lares puede ser usado como un indicador de del carácter. El hecho de que en casi todas las
la proporción de progenies apomícticas de un especies apomícticas los marcadores ligados
determinado individuo. En las cruzas de este a la apomeiosis mapean en una única región
tipo (que pueden ser intra o interespecíficas) genómica hace pensar que aplicar el modelo
se utiliza un poliploide sexual natural o genera- cualitativo es esencialmente correcto, aunque
do artificialmente como planta madre, mientras permanece pendiente el estudio de cuáles son
que un genotipo apomíctico contribuye como los factores que afectan la expresividad del ca-
dador de polen. rácter.
El modo de clasificación de las progenies en La apomixis esporofitica se hereda en for-
apomícticas y sexuales fue motivo de contro- ma simple como un carácter dominante. En el
versia durante varias décadas entre los inves- único estudio de mapeo reportado hasta ahora
tigadores dedicados al estudio de la apomixis. en Citrus el carácter presentó una segregación
Mientras algunos proponían tener en cuen- simple con una relación de segregación de 3:1.
ta su grado de expresividad, considerándolo Sin embargo la aplicación del mapeo de QTLs
como un carácter cuantitativo, otros conside- resultó en la identificación de 6 loci mayores
raban que era más conveniente tratarlo como con efectos positivos o negativos, un patrón
un carácter cualitativo, y proponían clasificar a más complejo que el anticipado. Actualmente
una planta como apomíctica siempre y cuando se están llevando a cabo estudios genéticos
llevase al menos un saco embrionario no re- y moleculares adicionales en Citrus y géneros
ducido. El primer modo de clasificación resul- relacionados así como también en otras espe-
taría adecuado si la diferente expresividad de cies que se reproducen por embrionía adven-
la apomixis se originase en la necesidad de la ticia.
acción conjunta de varios genes mayores que La aposporía parece estar controlada por un
determinaran el carácter o estuviese influida único locus en donde un gen mayor dominan-
por la presencia de modificadores, mientras te o un grupo de genes ligados y coadaptados
que la segunda aproximación sería más apro- (que funcionan como una sola unidad genética
piada si el carácter estuviese controlado por un a causa de una fuerte supresión de la recom-
gen simple cuya expresividad dependiese de binación) son los responsables de la expresión
factores epigenéticos asociados. Se sabe que del carácter. En la mayoría de las gramíneas
el ambiente puede afectar el grado de apo- forrajeras estudiadas el “apo locus” aparece
mixis en algunas especies, lo que sugiere que como una región genómica compleja, que con-
efectivamente puede haber tanto genes modi- tiene numerosos genes que son transmitidos a
ficadores como factores epigenéticos jugando la progenie como un bloque. Es importante no-
un rol en la expresividad del carácter. Por otra tar que la palabra “locus” es utilizada aquí para
parte, se demostró que en híbridos de Pen- denotar una región del genoma que puede in-
nisetum, plantas pertenecientes a diferentes cluir uno o varios genes. Este único “locus” en
progenies todas ellas portadoras de la misma algunas especies segrega en forma Mendelia-

na y en otras, muestra una fuerte distorsión de apomícticas son uniplexas (Aaaa) hasta ahora
la segregación. El modelo del locus único se no se han encontrado en la naturaleza plantas
aplica a casi todas las especies apospóricas completamente sexuales (aaaa). Esta situación
estudiadas (Pennisetum squamulatum, Pen- se repite en otras especies apomícticas. Tam-
nisetum ciliare, Panicum maximum, Brachiaria poco se puede explicar el hecho de que siem-
sp., Paspalum notatum, Ranunculus sp y Hiera- pre que se utilizó como polinizador a una planta
cium sp), Supone que la constitución genética apomíctica, ésta resultó ser un genotipo Aaaa.
de las plantas sexuales sería del tipo nuliplexo ¿Cómo es posible que el genotipo uniplexo sea
(aaaa) mientras que los individuos apomícti- el único existente en las poblaciones apomícti-
cos serían uniplexos (Aaaa), siendo A el alelo cas facultativas? Estas cuestiones plantean la
dominante determinante de la aposporía. Los posibilidad de que la herencia de la apomixis
cruzamientos de individuos de este tipo gene- no pueda ser explicada únicamente en base
rarían progenies F1 que segregan en sexuales a la constitución genética, sino que también
y apomícticos con relaciones de segregación deba tenerse en cuenta el entorno epigenéti-
aproximadas al 1:1, aunque en algunos casos co asociado y la estrecha relación de ambas
se observan fuertes desviaciones en esta rela- condiciones con la poliploidía. La demostración
ción. Las distorsiones en la segregación en P. reciente de que ocurren modificaciones gené-
notatum han sido atribuidas a un efecto pleio- ticas y epigenéticas específicas, recurrentes y
trópico letal del gen/es determinantes de la reproducibles durante los eventos de alo y auto
apomixis, o a un ligamiento parcial con un gen poliploidización plantea posibilidades novedo-
letal. Por otro lado en Poa pratensis está clara- sas respecto al origen de la región que contie-
mente documentado que existe recombinación ne a locus apo y su funcionamiento en relación
entre la aposporía y la partenogénesis, lo cual con la poliploidía.
indica un control independiente para cada uno La diplosporía, a diferencia de la aposporía,
de estos componentes. Además no se observa parece estar controlada por dos o más genes
supresión de la recombinación en la región. En que segregan en forma independiente, res-
esta especie la partenogénesis puede evaluar- ponsables de la apomeiosis, la partenogéne-
se fácilmente en ausencia de fertilización por el sis y la formación autónoma del endospermo,
desarrollo de embriones luego del tratamiento cuando esta última existe. El ligamiento entre
con auxina. Cuando este carácter se analizó el desarrollo del saco embrionario diplospórico
en forma cualitativa se demostró que involucra y la partenogénesis puede ser eliminado en al
a un único gen. Posteriormente se postuló para menos dos taxones de Asteraceae: Erigeron y
Poa un modelo genético más complejo que in- Taraxacum. En cruzas de diploides sexuales y
cluye genes simples, no ligados para la inicia- triploides apomícticos de Taraxacum muchos
ción de la aposporía, la prevención de la apos- híbridos 3x y 4x forman semillas en ausencia
poría, la iniciación de la partenogénesis, la prede polinización, mientras que el endospermo
vención de la partenogénesis y el desarrollo de se desarrolla autónomamente, tal como se
la megáspora. Este último modelo es sostenido esperaría en Taraxacum apomícticos. Sin em-
por la observación de clases discretas con di- bargo, varios híbridos 3x no forman semillas si
ferente expresividad del carácter apomixis, que no se los poliniza, aunque uno de ellos produjo
podrían ser explicadas mejor con un modelo de embriones 2n+n (derivados de la fecundación
5 genes. de sacos embrionarios no reducidos) cuando
El modelo del gen único, aplicado a nume- fue polinizado con un diploide. Este genotipo
rosas especies apospóricas, deja sin solucio- realiza apomeiosis (ausencia de reducción de
nar varias cuestiones, además de la ya men- la gameta) pero es incapaz de hacer parteno-
cionada respecto a la diferente expresividad. génesis. La independencia entre la diplosporía
Por ejemplo en el caso de Panicum maximum y la partenogénesis fue luego confirmada en
(que es una especie apomíctica facultativa, o otras cruzas. El desarrollo autónomo del en-
sea forma algunos de sus descendientes por dospermo también segregó en forma separada
sexualidad) si bien se postula que las plantas de la partenogénesis. Curiosamente, la región

que determina la diplosporía en Taraxacum generales de procedimientos para transferir la
no presenta reducción de la recombinación, apomixis a especies sexuales: i) hibridación
constituyéndose (junto al caso de la apospóri- clásica entre una planta sexual y un pariente
ca Poa pratensis) en uno de los pocos ejem- apomíctico natural; ii) iniciación de la expresión
plos de recombinación en la región genómica de la apomixis por experimentos de bloqueo de
que determina la formación apomeiótica de un genes (mutantes T, etiquetado transposicional,
saco embrionario. Similarmente, las progenies mutagénesis) y iii) transformación de cultivares
originadas a partir de cruzas entre diploides sexuales con genes que controlan la expresión
sexuales y poliploides apomícticos de Erigeron del carácter. Las dos primeras aproximaciones
annuus mostraron que varias plantas diplos- ya fueron intentadas, aunque hasta el momen-
póricas no formaban embriones, sugiriendo to los proyectos no han sido del todo exitosos.
que se había eliminado el componente de la La tercera opción todavía continúa siendo hi-
partenogénesis. Se demostró claramente que potética.
las dos características segregaban en forma Los primeros experimentos dirigidos a in-
independiente. La región que lleva el locus DIP troducir la apomixis a través de cruzamientos
(que determina la diplosporía) también presen- fueron realizados hace unos 40 años por D.
ta restricción de la recombinación (como en el F. Petrov, quien realizó hibridizaciones entre
caso de la región APO en la mayoría de las es- maíz y razas tetraploides de Tripsacum dacti-
pecies apospóricas estudiadas), pero no así la loydes (una especie diplospórica también per-
región responsable de la partenogénesis. Otra teneciente a la tribu de la Andropogóneas igual
especie diplospórica extensamente estudiada que el maíz). Posteriormente otros grupos de
es Tripsacum dactyloides, debido a que es un investigación produjeron híbridos interespecífi-
pariente lejano del maíz y presenta potencial cos de maíz-Tripsacum que se reproducen por
para la transferencia del carácter a esta espe- apomixis. Sin embargo, como los genotipos
cie por mejoramiento convencional. En esta obtenidos luego de una serie de retrocruzas
especie la diplosporía se hereda de manera con maíz son completamente macho-estériles,
simple. Varios marcadores del cromosoma 6 el progreso en la recuperación del genoma de
de maíz cosegregan estrictamente con el ca- esta especie está fuertemente asociado con
rácter. Aunque la región presenta una fuerte la capacidad de generar híbridos con algún
supresión de la recombinación en las razas grado de reproducción sexual (apomícticos
apomícticas, en las cruzas de diploides sexua- facultativos). La imposibilidad de generar este
les se detecta una recombinación considerable tipo de individuos es la principal dificultad que
entre los mismos marcadores. La localización enfrenta este sistema. Una dificultad adicional
de la apomixis en una translocación cromoso- es el fuerte requerimiento de una relación 2:1
mal en híbridos de maíz –Tripsacum también en el número de genomas haploides maternos
reforzó la conclusión de que un único cromoso- y paternos que contribuyen a la formación del
ma de Tripsacum transmite la apomixis. endospermo en maíz. Estos problemas han
demorado el progreso en la introducción de la
Transferencia del carácter apomixis a apomixis en maíz en los últimos años. La trans-
especies de interés agronómico ferencia de la apomixis al mijo perla (Pennise-
Aunque desde el punto de vista del mejora- tum glaucum) desde P. squamulatum por un
miento genético la apomixis puede conside- programa de mejoramiento iniciado al final de
rarse como un sistema que restringe la varia- los 70 es considerado el más avanzado de su
bilidad genética, esta forma de reproducción tipo. En este esquema las retrocruzas con Pen-
constituye una herramienta única para desa- nisetum glaucum han avanzado hasta la gene-
rrollar cultivares superiores y preservar combi- ración BC7, mediante la selección de grandes
naciones híbridas indefinidamente. Por ello la progenies para identificar individuos apomícti-
transferencia del carácter a las especies cul- cos parcialmente macho fértiles. Estas plantas
tivadas ha sido perseguida desde hace tiem- son morfológicamente muy parecidas al mijo
po. Básicamente se consideran tres grupos perla, aunque producen un bajo número de

semillas viables. Este hecho estaría vinculado es un sector no recombinante de tamaño cal-
a la formación del endospermo y es un incon- culado en unos 50 Mpb. Se aislaron 99 clones
veniente que aún resta resolver. En resumen, de BAC conteniendo marcadores moleculares
la factibilidad de la transferencia está aún por que mapean en esta región. Algunos de estos
demostrarse. Los principales obstáculos son: clones fueron utilizados para realizar estudios
equilibrar el balance endospérmico y lograr la de FISH (hibridización fluorescente in situ; del
expresión de la apomixis a nivel diploide. Aquí inglés fluorescent in situ hybridization) sobre
se debería lograr, seguramente a través de un cromosomas de estas especies. En P. squamu-
esfuerzo multidisciplinario internacional, un latum los experimentos de FISH confirmaron
conocimiento profundo de la relación entre la que la región asociada a la aposporía (ASGR)
expresión de la apomixis y la poliploidía, espe- es físicamente muy grande (más de 50 Mpb) y
cialmente de la autoploidía. En gramíneas de la que está localizada cerca del telómero sobre
subfamilia Panicoideas (Paspalum, Panicum, el brazo corto del cromosoma portador. Tam-
Tripsacum, Brachiaria, Melinis y otras) es po- bién demostró que la ASGR es hemicigota y de
sible que el sistema apomíctico difiera del que naturaleza heterocromática. Se encontró una
existe en Pooideas (Poa, Elymus y otras). Son señal proveniente de una repetición centromé-
necesarios conocimientos básicos más profun- rica en el extremo distal de la ASGR, lo que
dos de la embriología de especies silvestres sugiere que el cromosoma portador sufrió una
con sistemas apomícticos, para determinar qué inversión. En Pennisetum ciliaris el cromosoma
género o qué especie son los más adecuados portador es 20 Mpb más largo que sus presun-
para obtener los genes que podrían utilizarse tos homeólogos, y la ASGR se localiza cerca
en futuras transformaciones genéticas que per- del centrómero, en una región hemicigota y
mitan usar la apomixis en los cereales. heterocromática. En ambas especies (P. squa-
Los intentos para generar mutantes apo- mulatum y P. ciliaris) la ASGR contiene una re-
mícticas inactivando genes de la sexualidad gión de alrededor de 13 Mpb de bajo número
por etiquetado transposicional o mutagénesis de copias. La región de baja copia es flanquea-
no han tenido éxito aún en recrear el carácter da a ambos lados por regiones de alto núme-
pero permitieron la identificación de varios ge- ro de copias o repetitivas. En P. squamulatum
nes involucrados en el control de etapas parti- la señal de alta copia se localiza únicamente
culares de su desarrollo, como la proliferación en la ASGR, mientras que en P. ciliare puede
del endospermo en ausencia de fertilización o ser identificada en todos los demás cromoso-
la generación de sacos no reducidos que por mas también. Se encontró que un retrotrans-
fecundación produjeron híbridos BIII. La trans- posón Opie-2-like puede mimetizar la señal de
formación genética de cultivares sexuales con alta copia generada por los clones de BAC.
genes que controlan el inicio del carácter es Una comparación del orden de los genes en
aún hipotética. los BACs correspondientes a la región de baja
copia entre las dos especies de Pennisetum
Caracterización molecular de la región demostró que aunque la región está invertida,
genómica que gobierna la apomixis mantiene el orden relativo en la posición de
En los últimos años la tecnología de mar- genes en un fragmento relativamente grande
cadores moleculares y los procedimientos de del cromosoma (es macrosinténica) en ambas
biología molecular han generado una cantidad especies. La macrosintenia aparentemente no
considerable de conocimientos nuevos sobre se mantiene fuera de la ASGR. En una esca-
las bases moleculares de la apomixis. Los gé- la menor, segmentos con un orden de genes
neros de gramíneas para los cuales se dispone similar existen entre las dos especies apomíc-
de más datos acerca de la estructura molecular ticas, y estos segmentos pueden ser hallados
de la región genómica asociada a la apomixis múltiples veces dentro de la ASGR en ambas
son hasta el momento Pennisetum y Paspa- especies. Inicialmente se identificaron regio-
lum. En Pennisetum ciliare y Pennisetum squa- nes sinténicas con el cromosoma 11 de arroz,
mulatum la región que determina la apomixis pero luego se demostró que dentro de la región

existen múltiples sectores más pequeños que embrionarios apospóricos en Poa.
comparten sintenia con distintos cromosomas En P. notatum (como en Pennisetum squa-
de arroz (cromosomas 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10 y 11). mulatum) también se postuló la existencia de
Un sector que representa 2.5 Mpb (~2 % de una inversión genética en la región del APO lo-
la región) fue secuenciado, y los genes inclui- cus, en base a observaciones citogenéticas y a
dos se conocen. Entre ellos están 4 copias de evidencias provenientes del mapeo. Los datos
genes homólogos a baby-boom, que fueron derivados de mapeo genético indican que la
estudiados detalladamente como posibles can- región asociada a la apomixis en P. notatum
didatos a controlar alguna etapa de la apomixis es un sector extenso de 36 Mpb, que presen-
en la especie. Baby-boom había sido identifi- ta una fuerte supresión de la recombinación y
cado inicialmente en Brassica napus, inducido apareamiento preferencial de cromosomas (ver
en cultivos de micrósporas que realizaban em- Figura 4). Experimentos de MSAP (polimorfis-
briogénesis somática. La sola sobreexpresión mo de amplificación sensible a metilación; del
de baby-boom en Arabidopsis thaliana induce inglés Methylation Sensitive Amplification Po-
la formación de embriones somáticos ectópi- lymorphisms) y RFLP (polimorfismo de longitud
cos en hojas y es suficiente para provocar em- de fragmentos de restricción, del inglés Res-
briogénesis somática espontánea. También se triction Fragment Length Polymorphisms) con
determinó la presencia de retrotransposones enzimas sensibles a metilación y la secuencia-
Opie-2-like, CACTA y helitrones en la región ción de clones provenientes de la ASGR per-
ASGR de Pennisetum. mitieron determinar que se trata de una región
La caracterización por mapeo genético del metilada extensivamente y que contiene abun-
locus apo en especies de Paspalum determi- dantes transposones y retrotransposones. En
nó una alta conservación de la región entre P. resumen, los estudios realizados en Paspalum
notatum, P. simplex y P. mallacophylum. En P. indican que, en forma similar al caso de Pen-
notatum se observa homología (sintenia) con nisetum squamulatum, la ASGR es una región
segmentos de los cromosomas 12 y 2 de arroz, extensa, que podría haber sufrido una inver-
mientras que en Paspalum simplex y Paspa- sión y que presenta todas las características
lum malacophyllum sólo con el cromosoma 12 de la heterocromatina: supresión de la recom-
de arroz. Dado que también en Brachiaria bri- binación, metilación extensiva, abundancia de
zantha, varias sondas que mapean en el cro- elementos transponibles y apareamiento pre-
mosoma 2 de arroz fueron asociadas al locus ferencial de cromosomas. Además se detectó
apo, es posible entrever una cierta conserva- que varios genes de esta región están silen-
ción del mecanismo de control de la apospo- ciados en las razas apomícticas respecto a las
ría para algunas especies de gramíneas. Por sexuales (ver siguiente sección).
otro lado, a partir de una genoteca en BAC de
P. simplex se aisló un clon (346H10) que con- Expresión de genes durante el desarrollo
tiene secuencias 100% ligadas a la aposporía apomíctico
en P. simplex y P. notatum. Experimentos de Una serie de trabajos recientes enfocados
FISH con el clon 346H10 determinaron que en estudiar la expresión de genes en plantas
el locus apo se encuentra en regiones no pe- apomícticas y sexuales, han informado el ais-
ricentroméricas del genoma de P. simplex. La lamiento de transcriptos de ARNm específicos
secuenciación de 346H10 reveló 2 regiones del desarrollo apomíctico. En el año 1996 se
que mostraron homología con los genes EXS publicó un trabajo pionero en la realización
(un receptor del tipo proteína quinasa rico en de estos perfilados del transcriptoma, allí los
leucinas) y PKD (dominio de proteína quinasa). autores informaron que un gen (Pcs-2) se ex-
Estos genes resultaron similares a SERK (re- presa sólo en ovarios sexuales mientras otros
ceptor tipo proteina quinasa de la embriogéne- dos (Pca-2 y Pca-3) lo hacen exclusivamente
sis somática) el cual fue asociado con la inducen ovarios apomícticos de buffelgrass (Penni-
ción de la formación de embriones somáticos setum ciliare). Estos transcriptos no presen-
en zanahoria y con la formación de los sacos taron homologías con genes incluidos en los

Figura 4: Localización de la región que controla la aposporía en Paspalum notatum por medio de mar-
cadores moleculares. Panel A: grupo de ligamiento M17a del mapa genético de Paspalum notatum, que
contiene a la región apo. El cuadro de abajo muestra un grupo de marcadores que están ligados 100% a la
apomixis. Nótese la supresión de la recombinación en el locus. El grupo M17a está ligado en repulsión al gru-
po M17b. Panel B: gel de AFLP obtenido durante la construcción de un mapa genético de Paspalum notatum.
bancos de datos. Más adelante otros autores aposporía. También se comparó la expresión
informaron la expresión de asg1 (gen especí- de genes en flores de genotipos sexuales y
fico de la apomixis 1) en primordios florales de apomícticos de P. notatum y se identificó al gen
una accesión apomíctica de guineagrass (Pa- arp1, que es homólogo a la cinesina katD de A.
nicum maximum) asociada temporalmente con thaliana. Se identificaron 6 genes de expresión
la aparición de las células iniciales de la apos- diferencial en ovarios de plantas apomícticas
poría. La secuencia de asg1 es similar a varios y sexuales de Brachiaria brizantha, entre ellos
genes específicos de la semilla o el embrión de un gen homólogo a una proteína quinasa (fami-
diferentes especies vegetales, entre ellos rd22 lia MAP quinasas, del inglés mitogen-activated
(un gen expresado en semillas e inducido por protein).
sequía en A. thaliana), grp (un gen que codifica Recientemente una caracterización más ex-
una proteína rica en glicina de la pared celu- tensa del transcriptoma fue completada para
lar de ovarios de Phaseolus vulgaris), usp (un las especies apospóricas Poa pratensis y Pas-
gen que codifica a una proteína de semilla de palum notatum. La misma permitió el aisla-
Vicia fava), plyg1 (un gen que codifica a un pre- miento de centenares de genes de expresión
cursor de la cadena beta de poligalacturonasa diferencial en flores de genotipos sexuales y
de Lycopersicum esculentum) y adr6p (un gen apospóricos (Figura 5). Varios genes comunes
regulado negativamente por auxina de Glycine fueron identificados en ambas especies, y mu-
max). La homología de secuencia con todos chos de los restantes pertenecen a las mismas
estos genes es altamente significativa por lo vías funcionales. Los genes identificados se
que los autores interpretaron que asg1 podría inscriben dentro de unas pocas clases onto-
cumplir una función nueva dentro del comple- lógicas: transducción de señales, proteólisis,
jo de formación del embrión y la semilla, rela- control del ciclo celular, control de la transcrip-
cionada con la aparición de las iniciales de la ción, estructura de la cromatina y actividad de

Figura 5: Análisis de expresión diferencial de genes en inflorescencias de plantas apomícticas y
sexuales. Panel A. Imagen de los órganos reproductivos de Paspalum notatum captada por microscopía
electrónica de barrido y coloreada artificialmente. En el centro se observa el ovario rodeado por las anteras
que han liberado algunos granos de polen (gentileza de la Dra. Ana María González, IBONE, CONICET).
Panel B. Geles de display diferencial mostrando la expresión de transcriptos en los órganos reproductivos
de una planta apomíctica (Q4117) y otra sexual (Q4188) de Paspalum notatum. Las flechas indican los
transcriptos que presentan expresión diferencial. Paneles C y D: a partir de los geles se aislaron frag-
mentos de genes que fueron utilizados como sondas en experimentos de hibridización in situ de tejidos
reproductivos de Paspalum notatum. En el panel C se muestra la hibridización del transcripto N22 con los
órganos reproductivos de la planta sexual Q4188. En el panel D se muestra la hibridización del mismo
transcripto N22 con los órganos reproductivos de la planta apomíctica Q4117. En el óvulo se observa la
clara expresión diferencial del gen blanco (gentileza del Dr. Guillermo Seijo, IBONE, CONICET).
transposones. Muchos de los genes aislados liploidización. Asimismo, los genes afectados
son idénticos a otros cuya expresión es afecta- durante los cambios de ploidía pertenecen cla-
da en inflorescencias por un cambio en el nivel ramente a las mismas clases funcionales que
de ploidía, lo que evidencia a nivel molecular el los controlados durante la apomixis.
alto grado de relación entre la apomixis y la po- Entre los genes activados o silenciados du-

rante el desarrollo apospórico se encuentran apomixis? ¿Cuál o cuáles genes de la región
numerosos representantes de una cascada de serían responsables de disparar el carácter?
transducción de señales de tipo ERK (quinasa La diferente expresividad de la apomixis que
regulada por señales extracelulares, del inglés observamos en numerosas especies, ¿es con-
extracellular receptor kinase). Por ejemplo re- secuencia directa del grado de modulación epi-
ceptores LRR (regiones ricas en repeticiones genética que afecta a la región? Aunque se ha
de leucinas), Ras, proteínas de unión a activa- avanzado mucho en la caracterización de las
dores de Ras, proteínas ancladas a GPI (glico- bases moleculares del carácter, estas y otras
silfosfatidil inositol), MAP quinasas, fosfolipasa preguntas permanecen sin respuesta.
C, fosfatidilinositol quinasas, serin-treonin fos- También se realizaron estudios de expre-
fatasas, serin-treonin quinasas, proteínas de sión de transcriptos en inflorescencias inma-
interacción con PRIP y otros genes asociados. duras en genotipos apomícticos y sexuales de
Asimismo numerosos genes relacionados con diferentes ploidías de la especie diplospórica
el recambio de proteínas (proteínas ribosoma- Eragrostis curvula. Los estudios realizados
les, serin proteinasas, ubiquitina, factores de demostraron que para un grupo numeroso de
elongación). También se detectó la expresión genes los perfiles de expresión de un genotipo
diferencial de elementos transponibles entre tetraploide apomíctico (4x apo) y un diploide
plantas apomícticas y sexuales, pero restaría sexual (2x sex) resultaron casi idénticos entre
comprobar si ésta se mantiene en otros genoti- sí y a la vez diferentes en comparación con un
pos y si realmente podría estar cumpliendo un genotipo tetraploide sexual (4x sex). La casi to-
rol relacionado con el carácter. talidad de los genes implicados se hallan silen-
En el caso de P. notatum, se observa un fe- ciados en los genotipos 2x sex y 4x apo. Estos
nómeno interesante. Muchos de los genes si- resultados son inesperados, ya que estos indi-
lenciados en las plantas apomícticas respecto viduos (2x sex y 4x apo) presentan diferencias
a las sexuales cuentan con secuencias homó- tanto en su ploidía como en su modo de re-
logas en la porción distal del cromosoma 2 de producción. Para explicar estos resultados los
arroz, una región que fue asociada con el locus autores formularon la hipótesis de que una falla
apo en esta especie. Más aún, cuando algunos parcial en el reacomodamiento de la expresión
de estos genes silenciados fueron localizados de algunos genes durante la poliploidización
en la propia especie, resultaron asociados al en esta especie culminaría en el disparo mole-
locus apo. Este grupo de genes comprende: cular de la diplosporía. O sea, ante un cambio
la proteína LunaPark B, un homólogo de la de ploidía un grupo numeroso de genes debe-
proteína checkpoint CHK1, una proteína an- ría activar su expresión para lograr mantener la
clada a GPI, una proteína similar a extensina, sexualidad. Una falla en esta activación daría
una MAP3K, poliubiquitina, un receptor LRR, como resultado un fenotipo apomíctico. Este
una proteína hipotética y un retrotransposón. modelo coincide con la evidencia experimental
La ubicación de estos genes en cercanías del de Paspalum en el hecho de que la apomixis
apo locus, junto con su expresión diferencial en podría estar causada por un silenciamiento de
plantas apomícticas y sexuales, los convierten la expresión génica. Genéticamente la apospo-
en candidatos interesantes para el control de la ría y la diplosporía no parecen tener el mismo
apomixis. Los genes incluidos en la región apo origen, ya que los disparadores de ambos pro-
parecen estar silenciados en plantas apomícti- cesos han sido asociados a regiones sinténicas
cas respecto a las sexuales. Se ha postulado de arroz con diferente localización. Sin embar-
que en P. notatum podría haber ocurrido una go, varios de los genes expresados durante el
inversión de un sector sinténico con los cromo- desarrollo diplospórico son los mismos o tienen
somas 2 y 12 de arroz, seguida de una inva- relación con los de la aposporía (de hecho las
sión de heterocromatina en la región, la pro- mismas clases funcionales parecen afectadas)
liferación de retrotransposones y la modifica- por lo que parece haber una relación molecu-
ción local de la expresión génica. ¿Podría esta lar evidente entre ambos tipos de apomixis. La
modificación de la expresión ser la causa de la expresión diferencial de genes fue estudiada

también en especies diplospóricas de Boeche- nes, la función y la regulación de la apomixis,
ra (Brasicaceae). En Boechera microphylla y se vislumbra para el futuro un escenario pro-
B. lignifera (apomícticas) y B. formosa (sexual) misorio. Nuestro entendimiento de las bases
se detectaron 4500 genes diferencialmente moleculares de la apomixis se ha incremen-
expresados utilizando microarreglos. Entre los tado notablemente a causa del desarrollo de
genes identificados se encuentran algunos re- técnicas poderosas de biología molecular y al
lacionados con la organización de la estructura creciente interés en el tema despertado en las
del genoma como genes del grupo polycomb instituciones científicas e investigadores. Por
(PcG) y factores de transcripción de tipo MADS otra parte, con el advenimiento del análisis ge-
box. Los autores postularon que los genes del nómico a gran escala se dispone de nuevas
grupo PcG, sobreexpresados en plantas apo- herramientas para el descubrimiento de genes
mícticas, podrían estar produciendo la altera- y los análisis de expresión. Es de esperar que
ción en la expresión de los genes de tipo MADS en los próximos años este aumento del cono-
box, concluyendo en el desarrollo de apomixis, cimiento de las bases genéticas y moleculares
aunque se ignora si éste es el factor causal del del carácter permita controlar su expresión con
disparo del carácter a nivel de control genético fines de mejoramiento. Solamente a través
en estas especies. de una comprensión profunda del mecanismo
Otros estudios de mucha importancia para biológico responsable de la apomixis y de las
la elucidación de las bases moleculares de implicancias evolutivas derivadas de su utili-
la apomixis informaron la caracterización de zación podrá concretarse su transferencia exi-
mutantes en las especies modelo, que sin ser tosa a las especies de gran cultivo. Para esto
apomícticas, presentaron fenotipos similares a se requerirá un fuerte apoyo financiero a los
algunas etapas particulares de su desarrollo. estudios básicos sobre el tema. Por otra parte,
Entre ellas debemos citar: 1) las mutantes par- dado que la problemática del carácter es muy
tenogenéticas fie, fis, fis2, medea y medicis de compleja será indispensable fortalecer la co-
Arabidopsis thaliana ; 2) la mutante apomeióti- operación internacional ya existente para man-
ca dyad de Arabidopsis thaliana; 3) una mutan- tener un espacio de discusión y de intercambio
te LRR de arroz que da origen a células análo- de materiales e información.
gas a las iniciales de aposporía y 4) la mutante
embriogénica somática SERK de zanahoria
Lecturas recomendadas
(SERK es un receptor de tipo LRR). Particu-
larmente en el caso de la interesante mutante Albertini E, Marconi G, Barcaccia G, Raggi L,
apomeiótica dyad de A. thaliana, se ha confir- Falcinelli M . 2004. Isolation of candidate genes
mado que la inactivación de un gen responsa- for apomixis in Poa pratensis. Plant Mol Biol, 56,
ble de la cohesión de las cromátides hermanas 879-894.
y organización del centrómero durante la meio- Asker SE and Jerling L . 1992. Apomixis in plants.
sis de células germinales (DYAD/SWITCH1) CRC Press, London.
es capaz de generar un fenómeno similar a la Bicknell R and Koltunow A . 2004. Understanding
apomeiosis en dichas células, llevando luego Apomixis: Recent Advances and Remaining
de la fertilización por polen y a la producción de Conundrums. The Plant Cell,16, S228-S245.
híbridos BIII. La baja tasa de producción de sa- Calderini O, Chang SB, De Jong H, Busti A, Paolocci
F, Arcioni S, de Vries S, Abma- Henkens MHC,
cos no reducidos y la ausencia de partenogé-
Klein Lankhorst RM, Donnison IS, Pupilli F .2006.
nesis en esta mutante es un indicador más de
Molecular cytogenetics and DNA sequence
que aunque la región genómica que controla el analysis of an apomixis-linked BAC in Paspalum
carácter es única, hay más de un gen o quizás simplex reveal a non pericentromere location
una condición epigenética compleja involucra- and partial microcolinearity with rice. Theor Appl
das en la regulación de la apomixis. Genet, 112, 1179-1191.
. Cervigni GDL, Paniego N, Pessino S, Selva JP,
Perspectivas Díaz M, Spangenberg G and Echenique V . 2008.
A pesar de que aún es necesario responder Gene expression in diplosporous and sexual
numerosas cuestiones sobre la acción de ge- Eragrostis curvula genotypes with differing ploidy

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V. CAPÍTULO 4 tas a gran escala, debido que permite no solo
la producción masiva, sino la conservación de
material selecto y la multiplicación de clones de
Avances de la biotecnología en sanidad controlada.
cultivos ornamentales En la actualidad se utilizan principalmente
tres estrategias para la multiplicación in vitro:
Alejandro S. Escandón, Pablo A. Marinangeli y 1) organogénesis, 2) embriogénesis somática,
Mariana Pérez de la Torre y 3) tecnología de cultivo de células en capa
fina (TLC, thin cell layer) para la multiplicación
1. Introducción de plantas entre otras aplicaciones.
En la segunda mitad del siglo XX la floricultu-
ra comenzó a transformarse en una verdadera Organogénesis
industria que debía abastecer a un mercado La micropropagación por organogénesis es
muy exigente, altamente competitivo y ávido una alternativa de gran aplicación para la pro-
de novedades. En el desarrollo de este proce- ducción masiva de plantas en un corto lapso.
so la incidencia de la biotecnología resultó de Se trata de una herramienta muy utilizada para
una relevancia insoslayable. la multiplicación tanto de ornamentales como de
Como toda industria, la actividad florícola gira otros cultivos hortícolas, frutales, industriales y
alrededor de un producto y de los factores que forestales.
lo afectan. Entre ellos, los referidos a la pro- Un requisito indispensable es el ajuste preciso
ducción propiamente dicha (volumen, calidad, de las condiciones de cultivo tanto físicas como
homogeneidad, sanidad y plazo de entrega), y químicas. Se deben establecer las condiciones
aquellos que hacen a su mejoramiento (en el óptimas de fotoperíodo, intensidad de luz, ba-
caso de la floricultura, factores que modifican lance de nutrientes (orgánicos e inorgánicos),
la arquitectura de las plantas y las flores, colo- y reguladores del crecimiento (RC) adecuados.
res, fragancias, tiempo de postcosecha, etc.). Cada especie, y cada cultivar en particular, pre-
De las herramientas biotecnológicas dispo- sentan requerimientos nutricionales y hormona-
nibles, el cultivo de tejidos ha sido de las que les sumamente específicos. Así por ejemplo, en
más impacto tuvo en la floricultura aunque, en el cultivo de segmentos nodales de Bougainvi-
forma reciente, la genómica y la transgénesis llea en medio libre de RC se induce el desarrollo
han adquirido gran relevancia, sobre todo en de un callo que progresa en la medida que se lo
cultivos como la rosa, el clavel y el crisantemo. mantenga unido al explanto original, inhibiendo
En este capítulo comentaremos los avances el desarrollo de la yema axilar. Mientras que el
producidos a partir de estas tecnologías en los agregado de BAP (6-bencilaminopurina) pro-
cultivos mencionados y en plantas en maceta. mueve la formación y el desarrollo de yemas.
Otro caso interesante es el de algunas es-
2. Cultivo de tejidos pecies del género Begonia que requieren del
En los últimos años se ha verificado un incre- agregado de carbón activado al medio de cultivo
mento relevante en la producción de plantas para inducir el desarrollo de brotes. Se sabe que
ornamentales, este hecho posiblemente haya el carbón activado adsorbe a los RC reducien-
sido una consecuencia del aumento registrado su disponibilidad para los tejidos, de modo
do en su valor comercial durante los últimos 20 que se ha propuesto que el híbrido de begonia
años. Hoy en día alrededor de 150 especies en cuestión produce una alta concentración de
diferentes de plantas ornamentales son propa- auxinas y citocininas, y que el agregado de car-
gadas a escala comercial a través del cultivo bón activado adecua el nivel de RC permitiendo
de tejidos en laboratorios privados, que pro- un desarrollo mejorado y controlado. Siguiendo
veen a los mayores consumidores del mercado en la misma línea del ejemplo, otro requerimien-
florícola: Holanda, Japón y EEUU entre otros. to especial para la multiplicación en masa del
El cultivo in vitro de tejidos resulta una he- híbrido Begonia x elatior es la utilización de las
rramienta clave para la propagación de plan- citocininas cinetina y zeatina, que a diferencia

de BAP, no afectan las características básicas otro lado, los experimentos realizados con rosa
de la planta como el color de las flores, un de- y ciclamen, han contribuido en gran medida a
talle no menor al diseñar una estrategia para la incrementar nuestro conocimiento sobre las
producción de un cultivo ornamental. bases de la herencia de la capacidad de em-
Con respecto a la influencia de la luz, el cul- briogénesis somática de un genotipo dado. Pa-
tivo de Ficus benjamina permitió estudiar el recería ser que este rasgo estaría controlado
efecto de la calidad de la luz sobre la inducción por más de un gen, cuya naturaleza, recesiva o
de yemas de novo. Se observó que al utilizar dominante, sería especie dependiente.
ápices como explanto, la taza de yemas forma-
das de novo resultaba mayor bajo luz roja. En el Células en capa fina
mismo estudio se advirtió que la calidad de luz La tecnología de células en capa fina (TCL)
no afectaba el enraizamiento de esta especie. es una estrategia de cultivo de tejidos desarro-
Los requerimientos de la etapa de enraiza- llada en la década del 70. Consiste en utilizar
miento también suelen ser muy específicos. como explanto una fina capa de células (en-
Por ejemplo, en Ficus carica el agregado de tre 0,5 y 1,0 mm de espesor), el corte puede
PVP (polivinil pirrolidona) que adsorbe los poli- ser longitudinal (lTCL) o transversal (tTCL). El
fenoles oxidantes facilita el enraizamiento. En corte longitudinal generalmente involucra cé-
gerbera, por ejemplo, para reducir el estrés lulas epidérmicas, subepidérmicas, corticales,
provocado por el pasaje del cultivo in vitro a cambiales o medulares; que pueden realizar-
invernáculos, se trabajó con atmósfera enri- se a partir de tallos, hojas, pedicelos, bulbillos,
quecida en CO2, y el uso de soluciones de alta nervaduras, etc. Para los cortes transversales
conductividad eléctrica, provocando el cierre se parte de tallos, raíces, rizomas, pedúnculos,
de estomas para evitar la transpiración extre- pétalos u otros órganos florales, etc.
ma del material y su desecación. En la Tabla se En la actualidad algunos investigadores la
presentan algunos de los resultados obtenidos han redescubierto como una poderosa herra-
a través de estas técnicas y de las que se de- mienta para el cultivo de tejidos, de órganos y
sarrollaran en los párrafos siguientes. para la transformación genética.
Se trata de un sistema simple que sólo re-
Embriogénesis somática quiere una pequeña cantidad de células como
La embriogénesis somática tiene un gran po- explanto inicial y una mínima cantidad de me-
tencial para la propagación clonal de individuos dio de cultivo. Puede ser utilizada como herra-
selectos y, desde el punto de vista comercial, mienta para la propagación comercial, en algu-
para la producción en biorreactores y la pro- nos casos se observó que aumenta la eficien-
ducción de semilla artificial. Pese a esto, pre- cia respecto del uso de explantos “convencio-
senta limitaciones importantes como la depen- nales”, e incluso acorta de manera significativa
dencia del genotipo, que afecta la producción los tiempos de cultivo.
de embriones somáticos tanto como el poder Además de regenerar plantas, a través del
germinativo de los mismos. ajuste fino de las condiciones de cultivo, exis-
La puesta a punto de un sistema de pro- tiría la posibilidad de regenerar y cultivar órga-
ducción comercial a partir de embriogénesis nos aislados.
somática requiere de una serie de ajustes fi- En la Tabla 1 se presentas algunos ejemplos
nos, sobre todo en la etapa de formación de de los resultados obtenidos a través de TCL,
los embriones, o fase 0. Lograr una respuesta de los cuáles describiremos algunos en deta-
embriogénica homogénea, en la forma, calidad lle. Por ejemplo, a partir de trozos de 1 x 10
y tiempo de maduración de los embriones, es mm2 de capas epidérmicas y subepidérmicas
esencial para alcanzar la producción industrial. (lTCL) de los entrenudos de una rama floral de
Varias especies ornamentales como crisan- Petunia hybrida, se regeneraron yemas y flo-
temo, ciclamen, rosa, begonia, violeta africana res dentro de los primeros 15 días de iniciado
y estrella federal han sido propagadas con éxi- el cultivo. En otro experimento, partiendo de
to por medio de esta estrategia (ver Tabla). Por láminas transversales de pecíolos de violeta

Tabla 1. Micropropagación de cultivos ornamentales aplicando diferentes estrategias de cultivo
in vitro y las respuestas obtenidas. ya: yemas adventicias; mb: multibrotación; pt: plántulas; r: raíces;
dy: desarrollo de yemas preexistentes; ce: callo embriogénico; sce: suspensión celular embrigénica; ge:
germinación de embriones; dp: desarrollo de plántula, bu: bulbillo; pr: protocormos. *: Sólo se regeneraron
plantas completas en algunos cultivares.

africana (Saintpaulia ionantha) se recuperaron cuyos productos finales tienen una alta cotiza-
70.000 plantas al cabo de 3-4 meses de cultivo. ción en el mercado. A pesar de que muchas
La técnica también se utilizó para la obten- empresas propagan in vitro diferentes espe-
ción de embriones somáticos de geranio (Pe- cies de esta monocotiledónea, son escasos
largonium x hortorum), donde se verificó que los reportes publicados sobre protocolos de
con el uso de segmentos transversales de hi- multiplicación a gran escala. Con el método
pocótilo se lograba una eficiencia 8 veces ma- de micropropagación convencional de yemas
yor en la producción de embriones, respecto de apicales, es posible producir cerca de 11.000
los producidos cuando se utilizaba el hipocótilo plantas anuales. Sin embargo, se ha reportado
entero como explanto. que el uso de tTCL de yemas apicales se po-
La orquídea es uno de los cultivos ornamen- dría alcanzar una producción de alrededor de
tales más apreciados, tanto para flor de cor- 80.000 plantines por año.
te como para planta en maceta. Son especies En la Figura 1 se describen las alternativas
de TCL según los tratamiento
in vitro a los que se someten
distintos explantos de crisan-
temo (Dendranthema grandi-
flora). Así, variando las con-
diciones de cultivo podemos
seguir diferentes vías para la
multiplicación, es ésta flexibili-
dad la que lo convierte la tec-
nología en una poderosa he-
rramienta para el estudio de la
diferenciación vegetal.
Otro cultivo ornamental al
que se ha aplicado esta tecno-
logía es la gentiana (Gentiana
spp.), valorada tanto como flor
de corte y planta en maceta.
Gentiana puede ser propa-
gada por medio de secciones
transversales del receptáculo
floral que regenera yemas por
organogénesis directa luego
de 2 a 4 semanas de cultivo.
Gladiolus spp, Heliconia
spp, Iris spp y Helianthus spp,
son otros de los géneros orna-
mentales que han sido exito-
samente propagados por esta
tecnología.
Automatización de la pro-
pagación in vitro
El proceso de escalado
para la optimización de la pro-
ductividad de un proceso de
Figura 1. El diagrama indica el origen de las tTCLs y las diferentes micropropagación, indepen-
condiciones de cultivo aplicadas para la obtención de plantines de dientemente de la estrategia
crisantemo. (Gentileza de Jaime Teixeira da Silva, traducido) que se utilice, requiere de la

implementación de los cultivos en medio líqui-
do y el uso de biorreactores. En efecto, en un
contexto comercial, esta tecnología tiene una
serie de ventajas sobre las técnicas convencio-
nales (entre ellas la posibilidad de automatizar
la producción, disminuyendo costos y simplifi-
cando tareas).
En términos generales un biorreactor es un
recipiente o sistema que mantiene un ambiente
biológicamente activo y de condiciones propi-
cias (pH, temperatura, concentración de oxíge-
no, nutrientes, etc.) para el elemento que se
cultiva. En plantas, tradicionalmente se los ha
utilizado para el cultivo de raíces y en la pro-
ducción de metabolitos secundarios. Como sis- Figura 3. El principio de funcionamiento de los sis-
tema de propagación, no son muchas las espe- temas de inmersión temporaria se basa en que, por
cies en los que se los ha utilizado exitosamen- medio del trabajo de un compresor que insufla aire
te. Algunos de estos casos son: hippeastrum estéril al recipiente inferior, se produce el desplaza-
(Hippeastrum spp.), ciclamen (Cyclamen per- miento del medio líquido, que se encuentra deposi-
sicum), clavel (Dianthus caryophyllus), gladiolo tado en su interior, al recipiente superior (las flechas
(Gladiolus grandiflorum) y jacinto (Hyacinthus azules indican el circuito del aire insuflado), donde
se encuentra el material en cultivo que es cubierto
orientalis). Comercialmente, se han multiplica-
totalmente por el líquido (las flechas rojas describen
do con éxito: helechos, espatifilum, filodendro,
el recorrido del medio). Mientras la válvula se man-
estrella federal y liliaceas. tiene abierta, se insufla aire al interior del recipiente
En el año 1994, la firma francesa IN VITRO inferior y, en consecuencia, el medio se mantiene
PIC, presentó un sistema de inmersión tempo- en contacto con los explantos. Una vez cerrada la
raria al que denominó RITA (del francés: Ré- válvula, por simple gravedad el medio vuelve al re-
cipient d’Inmersion Temporaire Automatique) cipiente inferior
(ver Figuras 2 y 3). El sistema permite sumergir
los explantos en el medio de cultivo en forma
sucesiva, y por tiempo e intervalos determina-
dos para cada situación.
Figura 2. Sistema original RITA, de origen francés

desarrollado por Vitropic S.A. Figura 3. Vías metabólicas de las antocianinas.

Este sistema de inmersión temporaria pre- 3. Transformación genética
senta ciertas ventajas no sólo sobre el sistema Modificando colores
de multiplicación tradicional, sino también so- En la edición anterior de este texto se co-
bre los reactores de inmersión completa. Entre mentó sobre el desarrollo de claveles azules y la
ellas se destacan: extensión de la vida postcosecha de la empresa
Con respecto al cultivo en fase sólida: la dis- Florigene R&D (Australia). Posteriormente, Flo-
minución del costo de mano de obra debido a rigene R&D se asoció con Suntory Research
(Japón) para concretar la obtención por ingeni-
la facilidad de manipulación de los explantos y
ería genética de una rosa de color azul.
del cambio de medio; la economía de espacio,
Las antocianinas son la clase de pigmentos
y la optimización de la nutrición de los explan- mayoritarios en las flores, son moléculas rela-
tos debido a que absorben los nutrientes del tivamente simples, solubles en agua, que se
medio a través de toda su superficie, favore- encuentran en grandes vacuolas de las células
ciendo el crecimiento en general. epidérmicas de los pétalos. Un punto clave de
Con respecto a los sistemas de inmersión la ruta de biosíntesis de estos compuestos es
permanente: debido a la naturaleza del sistema el intermediario DHK (dihidrokaempferol). Las
temporario se favorece la renovación completa enzimas FLS (flavonol sintasa), F3’H (flavo-
del aire dentro del recipiente, evitando la con- noide 3’- hidroxilasa), F3’5’H (flavonoide- 3’,5-’
centración de gases perjudiciales al desarrollo hydroxilasa) y DFR (dihidroflavonol reductasa)
de los explantos, y reduciendo los problemas utilizan este sustrato, sugiriendo que este punto
de asfixia o vitrificación de los tejidos. Por otro es crítico en la biosíntesis de antocianinas y en
lado, cada recipiente se encuentra protegido la determinación del color floral (Figura 3).
Para la obtención de rosas azules, se incorpo-
por filtros contra contaminación; y además se
raron los genes de la vía de la delfidina, pigmen-
elimina el riesgo de contaminación cruzada.
to responsable del color azul. Además, fue nec-
Pese a esto, presentan ciertas desventajas:
esario a través de la tecnología de ARN de inter-
es difícil controlar la sanidad dentro del reci- ferencia bloquear la ruta de síntesis de cianidina,
piente, requiere de equipamiento especial, y no para disminuir la concentración de este pigmento
sirve para el establecimiento del cultivo (sólo y de esta forma evitar la contaminación del color
para las fases de multiplicación, crecimiento y bordó en los pétalos. Los cultivos de las nuevas
enraizamiento). variedades azules habrían alcanzado la etapa
Entre las especies florales que se han mul- de ensayos a campo y podrían ser lanzadas al
tiplicado por medio de esta tecnología encon- mercado en 2009.
tramos la piña ornamental (Ananas lucidus), En otros géneros como Torenia, con el obje-
aunque comercialmente sólo se puede men- tivo de incrementar la variabilidad en los colores,
cionar al bananero ornamental (Musa basjoo se han desarrollado materiales transgénicos por
cv. 'Variegata') y varias especies de orquídeas medio de la técnica de cosupresión de los genes
(Orchydea sp). que codifican la DFR (dihidroflavonol reductasa)
y la CHS (chalcona sintetasa). En lobelia (Lo-
Estos sistemas son especialmente intere-
belia erimus), se obtuvieron plantas con flores
santes para la propagación de plantas sin ne-
azules incorporando el gen de la F3’5’H de lisi-
cesidad de luz, pues permiten un aumento de antus.
la eficiencia por disminución de costos al inde- En crisantemo, utilizando la tecnología de ARN
pendizarse de la iluminación. Por ejemplo, en antisentido, se ha logrado la obtener flores de
el caso de Lilium spp. se diseñó un protocolo diferentes tonalidades. Recientemente un grupo
de micropropagación independiente de la luz de origen japonés, ha dado un paso importante
basado en ciclos de bulbificación directa segui- en la elucidación de la vía metabólica para la ob-
da de una fase de crecimiento in vitro de los tención de crisantemos de color blanco, al iden-
bulbillos. Como resultado se obtienen micro- tificar la enzima CmCCD4 (del inglés carotenoid
bulbos aptos para el cultivo a campo. cleavage dioxygenase), como la responsable de

la degradación de los carotenoides que ocasio- con el patógeno, las plantas transformantes
na la pérdida de la coloración amarilla. presentaron un retraso significativo en el de-
sarrollo de sintomatología, y de la etapa aguda
Incrementando fragancias de la enfermedad.
Uno de los parámetros de gran valor agrega- Otro caso es el ataque del hongo Botrytis,
do en el mercado de ornamentales es la capa- un problema importante para el cultivo del cri-
cidad de los cultivos de producir perfume, las santemo. Hasta el momento no se ha logrado
fragancias sirven para atraer tanto a poliniza- detectar resistencia en el germoplasma del gé-
dores como a potenciales clientes. nero Chrisantemum. Al día de hoy el control del
Se conocen cerca de 700 productos vo- patógeno se realiza por métodos químicos y de
látiles involucrados con el aroma de las plantas manejo del cultivo, sin embargo estas medidas
y flores, desde el punto de vista químico son son sólo paliativas. Se han obtenido plantas
ácidos grasos derivados del benceno, fenilpro- transgénicas de crisantemo portadoras del gen
panoles y terpenoides. Si bien se han clonado para la quitinasa de arroz (rcc2) que mostraron
una interesante cantidad de genes involucra- en lo ensayos de desafío una resistencia leve
dos en estas vías de síntesis, los avances en a Botrytis.
la bioquímica y la biología molecular de estos Cuando se trata de obtener resistencia a in-
compuestos son aún muy limitados y, a la fe- secto, la estrategia común es la utilización de
cha, son muy pocos los reportes de avances toxinas. Así, en crisantemos se logró obtener
en esta especialidad. resistencia a Helicoverpa armiguera utilizan-
Por el momento se obtuvieron resultados do la toxina modificada del gen Bt, CryIAB; y
promisorios en petunia, conejito y clavel. En el resistencia a Spodoptera exigua, con CryIC.
caso de éste último se reportó el incremento Además, se realizaron importantes progresos
en la fragancia al regular negativamente la ex- en la obtención de plantas con resistencia a
presión del gen de la enzima F3’H (como se trips (Frankiniella occidentalis, vector de to-
mencionó antes, involucrada en la biosíntesis spovirus). En este caso se obtuvieron plantas
de antocianinas). De modo que las flores re- transgénicas de crisantemo que expresan un
sultaron más pálidas por una disminución de la conjunto de inhibidores de proteasas. Los en-
concentración de antocianinas, pero con mayor sayos con larvas F. occidentalis alimentadas
fragancia debido a un incremento en la síntesis con plantas transgénicas mostraron un 80%
de metil benzoato. de reducción en la viabilidad, comparadas con
aquellas larvas alimentadas con las plantas
Resistencia a hongos, insectos y virus control (no transgénicas).
Dado que otros capítulos profundizan sobre Los géneros virales Tospovirus y Potyvirus
las estrategias utilizadas para desarrollar resis- afectan a cultivos florícolas y hortícolas, y se
tencia a patógenos en plantas, nos limitaremos encuentran ampliamente distribuidos en todo el
en este apartado a comentar algunos casos mundo. Entre las estrategias planteadas para
ilustrativos en el área de plantas ornamentales. generar resistencia en plantas, se llevó a cabo
Los mecanismos de defensa de plantas son la transformación de crisantemo con el gen de
bastante complejos, por lo general el ataque de la nucleocápside viral de Tomato spotted wilt
un patógeno activa cascadas de señales que tospovirus (TSWT). Se utilizaron construccio-
desencadenan múltiples respuestas. En los nes que presentaban la secuencia en sentido
cultivos florícolas, la mayoría de las estrategias y antisentido, que lograron conferir resistencia
para obtener resistencia a hongos se basan en a las plantas transgénicas (ante el desafío viral
la utilización de enzimas hidrolíticas. Por ejem- se mostraron asintomáticas y con bajos niveles
plo, el hongo Fusarium es responsable de un de acumulación de viral). Con una estrategia
20% de las pérdidas anuales producidas en similar se lograron plantas resistentes al virus
el cultivo de clavel. Se desarrollaron plantas de la clorosis del tomate (TCSV), al virus del
transgénicas que expresan un gen de quitinasa anillado de tomate y pimiento (GRSV) y el de la
aislado de Serratia marcecens. Ante el desafío necrosis del tallo del crisantemo (CSNV).

Una estrategia alternativa se basó en la de los parámetros más codiciados en el mejo-
utilización del gen PACI, del hongo Schizo- ramiento de plantas ornamentales, tanto para
saccharommyces pombe, que codifica una ri- flores de corte como plantas de maceta. La
bonucleasa que reconoce y degrada ARN de modificación de la forma de las plantas adqui-
doble cadena. En este caso se observó que los ere relevancia a la hora de obtener un cultivo
niveles de resistencia alcanzados por las trans- homogéneo en altura, o bien de incrementar la
formantes dependían del grado de expresión cantidad de brotes laterales. Por otro lado, una
del transgén, aproximadamente el 20% de es- planta con forma diferente significa un gran im-
tas plantas presentaban niveles altos de expre- pacto en el mercado.
sión que correlacionaban con la ausencia de A pesar de que se conoce un número impor-
desarrollo de los síntomas de infección. tante de genes involucrados en la determina-
ción de la arquitectura de las plantas, sólo unos
Prolongando la vida en postcosecha pocos han sido utilizados en cultivos florícolas.
El período de vida postcosecha de las flores En petunia se sobreexpresó el factor LIF
depende del grado de nutrición, la carga mi- (del inglés lateral shoot inducing factor) bajo
crobiana y, fundamentalmente de la produc- el promotor 35S de CaMV. Se observó que al
ción de etileno (hormona asociada al proceso alteraba el metabolismo de las citocininas pro-
de senescencia). Existen sustancias como las vocando la aparición de fenotipos con mayor
sales de plata que retardan el proceso (actúan cantidad de ramas con ramificaciones secun-
bloqueando el receptor de etileno, ETR1), sin darias, poco usuales en esta especie.
embargo son muy tóxicas y su uso debería La misma planta, petunia, se transformó con
dejarse de lado. La ingeniería genética ofrece el gen ipt (isopentenil transferasa de A. tume-
una serie de alternativas para lograr retrasar faciens), bajo el control de un promotor de Ara-
este proceso. bidopsis de la senescencia de las hojas. Las
Por ejemplo, se transformaron claveles con plantas transformantes presentaron mayor
el gen etr1 bajo regulación del promotor 35S cantidad de flores y retraso de la senescencia,
del virus del mosaico del coliflor (CaMV). Las con una marcada disminución de sensibilidad
plantas transformantes mostraron una vida al etileno.
postcosecha de tiempo comparable al de las
Asimismo, se han obtenido resultados inte-
plantas control (no transgénicas) tratadas
resantes modificando las vías de biosíntesis
químicamente. En una estrategia mejorada,
o respuesta a giberelinas. Esto se debe a que
se transformaron plantas de Campanula car-
para solucionar la falta de uniformidad en la
patica (una ornamental de maceta) con una
morfología de las plantas de crisantemo (plan-
construcción del mismo gen (etr1) bajo el pro-
tas en maceta) se aplican productos como pac-
motor FBP1 de petunia, específico de flores.
lobutrazol, phosphonD, Amo1618, etc. Se trata
Las flores mostraron una marcada disminución
de inhibidores de giberelinas, compuestos cos-
de su sensibilidad al etileno, y fueron capaces
tosos, difíciles de manejar y, en algunos casos,
de mantenerse abiertas durante 14 días, cu-
de uso restringido. Dado que las giberelinas
ando el período habitual es de 3 días. Se pu-
ede observar que la utilización de promotores incrementan la división y elongación celular, la
específicos de órgano genera el mismo nivel inhibición de esta vía resultaba una alternativa
de protección frente a etileno, y presenta ven- válida. Un equipo de investigadores transformó
tajas significativas frente a la expresión consti- crisantemo con el gen gai de A. thaliana bajo el
tutiva (no modifica la sensibilidad al etileno en promotor constitutivo 35S. Obtuvieron un am-
el resto de la planta, por lo que otras acciones plio rango de fenotipos de enanismo que atri-
del etileno como la activación de respuestas buyeron no sólo al diferente número de copias
defensivas, no resultarían afectadas. insertadas, sino también al sitio de inserción en
el genoma de la planta. Al medir los niveles de
Plantas con nuevas formas expresión del gen se observó que correlacio-
Desde el punto de vista de estético, la modi- naban con el grado de intensidad del fenotipo
ficación de la arquitectura de la plantas es uno observado, esto es, a mayor nivel de expresión

mayor grado de enanismo detectado (Figura
4). Usando esta estrategia lograron obtener
una reducción en la altura comparable a la al-
canzada por la utilización de los inhibidores de
giberelinas, evitando los efectos colaterales
que estos productos provocan.
Una interesante alternativa para incrementar
la variabilidad genética es el uso de A. rhizo-
genes. Se trata de una bacteria del suelo que
posee un megaplásmido denominado Ri (Figu-
ra 5), donde se encuentran los genes rol A, rol Figura 4. Efecto del gen gai en plantas de crisante-
B, rol C, y rol D, responsables de provocar al- mo. A la izquierda el control sin transformar, el resto
teraciones fenotípicas denominadas raíces en son plantas transgénicas expresando diferentes ni-
cabellera (hairy roots). En la infección, la bac- veles del transgen que se correlacionaron con los
teria transfiere a la planta estos genes que co- síntomas de enanismo observado. Cortesía del Dr.
Setephen D. Jackson.
difican proteínas que intervienen en la síntesis
de auxinas y opinas. Además de acrecentar el
desarrollo de las raíces en el sitio de infección,
otros de los síntomas asociados son: enanis-
mo, mayor compacidad, menor dominancia
apical, variabilidad en hojas y flores. Estas alte-
raciones varían de evento a evento, y la inten-
sidad de los síntomas es especie dependiente.
Pese a esto constituyen una herramienta inte-
resante para programas de mejoramiento de
plantas ornamentales.
En el año 2005, la empresa Sakata presentó
una variedad de conejito (A. majus) con carac-
terísticas diferentes a las variedades comercia-
les conocidas hasta ese entonces. La planta
se caracterizó por ser significativamente más
compacta, tener entrenudos cortos, una mar-
cada disminución de la dominancia apical,
muy ramificada, hojas y flores más pequeñas,
y gran capacidad de enraizamiento. Esta va- Figura 5. Plásmido Ri del tipo agropina, que se ca-
riedad se obtuvo aplicando la tecnología de A. racteriza por poseer el ADN-T dividido en dos Tl y
rhizogenes. Una estrategia similar se utilizó a Tr. En la porción Tl se encuentran las secuencias
principios de los ‘90 con Nierembergia scopa- que codifican para los genes rol y en Tr los oncoge-
nes aux1 y aux2 y de la síntesis de opinas. Ambas
ria, donde se trabajó con las cepas hiperviru-
porciones de ADN T son transferidas en el proceso
lentas de A. rhizogenes (Figura 6). En la misma
de transformación.
época se presentaron resultados similares ob-
tenidos con geranio (Pelargonium sp.) donde
las plantas mostraron fenotipo enano, incre-
mento en el número de entrenudos y de ramas (Eustoma grandiflorum), rudbekia (Rudbeckia
laterales, mayor número de hojas, de color hirta), datura (Datura arborea y D. sanguinea),
más oscuro, mayor capacidad de enraizamien- angelonia (Angelonia salicariifolia) y catarantus
to y un incremento en la concentración de acei- (Catharanthus roseus).
tes esenciales, pero una marcada inhibición Los genes rol también fueron utilizados en
en la floración. Utilizando la misma tecnología forma independiente del sistema de A. rhizoge-
se informaron resultados similares en lisiantus nes para la transformación genética de platas.

La caracterización de genes por medio de
marcadores moleculares clásicos como las
etiquetas de secuencias expresadas (EST, Ex-
pressed Sequence Tags) o los polimorfismos
de un sólo nucleótidos (SNP, Single Nucleotide
Polymorphism), conjuntamente con la estima-
ción de la diversidad genética, pueden ser uti-
lizados para establecer los marcadores que se
corresponden con rasgos fenotípicos de inte-
Figura 6. A la izquierda los controles sin transfor- rés. Y una vez obtenidos éstos utilizarlos para
mar de Nierembergia scoparia, a la derecha las la selección asistida, la construcción de ma-
plantas transgénicas expresando la sintomatología
pas genéticos y locus de carácter cuantitativo
de la enfermedad de las raíces en cabellera. Genti-
(QTLs, Quantitative Trait Loci).
leza del Dr. Masahiro Mii de la Universidad de Chi-
ba, Japón. En rosa, por ejemplo, se ha creado un mapa
genético de alta densidad para ser usado como
herramienta de análisis de la variación genética
y la detección genes de interés. Los mapas de
ligamiento fueron construidos con marcadores
Utilizando el rol C bajo el control del promotor
moleculares (incluyendo AFLP, Amplified Frag-
35S de CaMV se obtuvieron petunias con me-
ment Length Polymorphism, ISSR, Inter-Simple
nor dominancia apical y tanto la planta, como
Sequence Repeat; RFLP, Restriction Fragment
sus hojas y flores, mostraron un tamaño signifi-
Length Polymorphism; RAPD, Random Ampli-
cativamente más reducido que la planta control
fied Polymorphic DNA, entre otros) y marcado-
(no transgénica). En crisantemo y clavel, con
res morfológicos. El resultado fue un mapa de
una construcción similar, se obtuvieron plantas
de fenotipo enano, entrenudos cortos, muy ra- gran cobertura y con marcadores robustos, con
mificadas, hojas de diferentes formas y tonos lo cual se abrió una muy promisoria perspec-
de verde, mayor cantidad de flores por tallo, tiva para la confección de mapas de QTLs y
aunque más pequeñas y compactas. para el mejoramiento asistido por marcadores.
En begonia (B. tuberhybrida) se utilizó para Con el desarrollo del mapa de ligamiento se
la transformación una construcción que porta- pudieron identificar, funcionalmente, diversas
ba los tres genes rolA, rolB y rolC. Las plantas regiones del genoma, por ejemplo, se ha iden-
transformantes resultaron enanas, con mayor tificado un gen que controla el tipo de flor, dos
cantidad de hojas arrugadas y de intenso color QTLs para resistencia a powdery mildew, otros
verde, pero con problemas en la floración (des- dos que controlan el tiempo de floración y otros
de retrasos a inhibición en comparación con el asociados a el tamaño de la flor, el número de
genotipo salvaje). entrenudos, al grosor del tallo, la longitud de
La estrategia de transformación con tres ge- la raíz, el contenido de clorofila y el área foliar,
nes también se aplicó, con distintos grados de entre otros caracteres.
éxito, en lilium, limonium y rosa. El avance de la genómica también ha hecho
posible generar librerías de ADNc de pétalos
4. Genómica en ornamentales de rosa para desarrollar ESTs y microarreglos,
Existen cada vez más proyectos de investi- que combinados con los resultados de proteó-
gación abocados al desarrollo de proyectos de mica, han permitido identificar varios genes y
bioinformática y genómica, que se estructuran estimar sus posibles funciones, entre ellos al-
como consorcios mundiales con el fin de aunar gunos incluidos en la producción de fragancia.
esfuerzos y recursos: En ornamentales están Algunos grupos de investigación trabajan ac-
activos los consorcios de Rosáceas GDR (Ge- tivamente en el estudio del desarrollo floral de
nome Database for Rosaceae) y Begonia; y el Lilium para elucidar el proceso a nivel genéti-
de Petunia hybrida y A. majus incluidas en la co y transcripcional. Estudios genómicos como
SGN (Sol Genomic Network). éstos pueden ser de suma utilidad al combi-

a) Etapas del ensayo de transformación, inoculación (1). Raíces emergentes en una etapa temprana del
cultivo (2). Crecimiento en placa y medio líquido, a la izquierda se observa el grado de desarrollo de un
control en medio sólido (3). Primeras etapas de la organogénesis (4). Plántulas in vitro (5). Eventos recu-
perados luego de la etapa de aclimatación (6).
7 8
b) Las flechas indican los eventos 7 y 8 (izquierda y derecha, respectivamente) y su comparación respec-
to de la planta silvestre. Se puede apreciar diferencias, entre otras, en el tamaño de las flores y la forma
y tamaño de las hojas.
Figura 7. Desarrollo de los productos obtenidos en los ensayos de transformación de Calibrachoa exce-
llens con Agrobacterium rhizogenes.
narse con técnicas de transformación genética las relaciones genéticas como la diversidad
que permitan introducir variaciones en el pa- entre distintas especies. Por ejemplo, en cala-
trón de floración y explotarlos comercialmente. tea (Calathea Mey.), el uso de AFLPs permitió
El conocimiento de la diversidad genética es diferenciar distintas especies, generando perfi-
de gran ayuda para un correcto manejo del ger- les y clusters que podrán ser utilizados para la
moplasma por parte de los mejoradores. Con comparación con otras especies.
este fin se crearon BEGOBIO y BEGOMOL, Por otro lado, estudios basados en RAPDs,
dos bancos de germoplasma ex situ e in situ de ISSRs y microsatélites de cloroplasto (ADNcp)
Begonia. El proyecto cuenta con un programa han permitido estudiar la diversidad genética
de preservación de la biodiversidad por medio de dos especies de prímula, Primula sikkimen-
de criopreservación y de almacenamiento de sis y P. farinosa. En el último caso, el releva-
ADN en chips y en librerías de ADNc. miento de plantas de distintas altitudes permitió
Distintos trabajos con marcadores molecula- establecer la diferenciación de las poblaciones
res clásicos que han permitido analizar tanto a través del gradiente de altitudes. En came-

lia amarilla (Camellia nitidissima) se utilizaron En conejito (A. majus) se aislaron secuen-
RAPDs y AFLPs para estudiar la variabilidad cias repetidas en tandem de las regiones cen-
y la estructura de distintas poblaciones, estos troméricas de los cromosomas. Por medio de
datos son de vital importancia en la conserva- la técnica de hibridación fluorescente in situ
ción de la diversidad genética de esta especie. (FISH) se estableció un cariotipo estándar uti-
En la variedad “Blue Parrot” de tulipán (Tulipa lizando estas secuencias repetitivas. Para in-
spp) se logró establecer una correlación entre tegrar los mapas genéticos y cromosómicos,
la detección de cambios fenotípicos relevantes se seleccionaron marcadores moleculares de
en plantas micropropagadas y la modificación cada grupo de ligamiento de una colección de
de los perfiles moleculares de RAPDs e ISSR. cromosomas artificiales de Antirrhinum para la
En junquillo (Narcissus tazetta var. chinensis) transformación de plantas. Los clones se hibrid-
se utilizaron RAPDs y AFLPs para caracterizar aron por FISH en los cromosomas de conejito,
mutantes generadas por radiación gamma. La el resultado permitió establecer la relación en-
alta frecuencia de mutantes detectadas permi- tre los cromosomas y los grupos de ligamiento.
tió determinar la efectividad del tratamiento.
En violeta de los Alpes (Cyclamen persicum) 6. Perspectivas
se inició un proyecto de ESTs para entender Si bien se han obtenido resultados intere-
el proceso de embriogénesis somática. Aproxi- santes, por el momento las técnicas de inge-
madamente un tercio de los genes involucra- niería genética han tenido poco impacto en el
dos en este proceso se cubrió con los ESTs ámbito de los cultivos ornamentales.
analizados. En la colección generada de Cicla- Teniendo en cuenta que la fuerza impulsora
men se halló una alta proporción de genes ho- que mueve esta clase de industria es la perma-
mólogos con los involucrados en el proceso de nente renovación y la aparición de novedades,
embriogénesis somática en el sistema modelo las perspectivas son propicias para el desar-
de Daucus carota (zanahoria). rollo de nuevas variedades ornamentales utili-
En Gerbera hybrida se logró obtener una co- zando técnicas biotecnológicas. En este marco
lección de ADNc a partir de 8 tejidos diferentes. es importante destacar que a la hora de selec-
A partir de la secuenciación y el ensamblado con cionar los cultivos sobre lo cuales trabajar, de-
las bases de datos existentes, se generó una berían contemplarse no sólo cuestiones técni-
base de ESTs que dio origen a un microarre- cas sino también comerciales y legales.
glo denominado ‘9K cDNA’. Este microarreglo Por otro lado, los avances en las técnicas
permitió la identificación de genes específicos biotecnológicas y el desarrollo de nuevos y me-
de flores, varios de los cuales tendrían posibles jorados programas de computación, han dado
funciones en el desarrollo órgano-floral. Luego, a la genómica el impulso necesario para ser
el mismo microarreglo se utilizó para analizar una herramienta fundamental en los programas
los cambios transcripcionales producidos du- de mejoramiento. A pesar de que se han pro-
rante la organogénesis en 6 estadios diferentes ducido avances en el número de especies es-
del desarrollo floral de gerbera. Se logró identi- tudiadas y la comprensión de sus respectivos
ficar una serie de genes que participarían en el genomas (cada día hay nueva información de
desarrollo y la apertura de los pétalos, abriendo mapas de ligamiento y, éstos a la vez, más sat-
un camino interesante al manejo de la regula- urados), aún hay mucho por hacer, sobre todo
ción de la floración. frente a las perspectivas del cambio climático
En Petunia las librerías de ADNc de flores y los problemas asociados a la contaminación
permitieron desarrollar ESTs y microarreglos, ambiental.
a partir de los cuales se describieron proteínas
involucradas en las vías dependientes del cal-
cio y en el metabolismo de la pared celular; y
genes relacionados a la apertura de las flores,
la biosíntesis de antocianinas y la degradación
de proteínas.

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V. CAPÍTULO 5
Aplicación de la biotecnología en
la mejora y conservación de
especies forestales
Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo,
Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry
En el presente texto se abordan dos grandes

aspectos de investigación en biotecnología fo-
Figura A: Proporción de las actividades en biotec-
restal, uno de los cuales involucra la explora- nología forestal agrupadas en grandes categorías,
ción de la variabilidad natural y su aprovecha- según el dominio público (Chaix and Monteuuis,
miento para distintos fines, incluyendo avances Apendice 2.1) FAO, 2004.
mundiales y principales proyectos en el campo
de la genómica, aplicaciones en Argentina en
la genética ecológica de los bosques y en el genómicos que comenzaron en el año 2000
mejoramiento y domesticación de especies de con la secuenciación de Arabidopsis thaliana,
interés. El otro aspecto se refiere a los orga- siguiendo en el año 2004 con la de Populus
nismos genéticamente modificados, objetivos trichocarpa (http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/
y ejemplos de investigación en América Latina. Poptr1.home; Tuskan et al., ,2006), y que con-
tinúa con la de secuenciación completa del ge-
1) Avances de las estrategias y noma de Eucalyptus grandis (esperada para el
herramientas genómicas en el año 2010), permitieron el desarrollo de nuevas
mejoramiento molecular forestal estrategias para la identificación de genes in-
volucrados en características de interés.
Introducción Existen varios proyectos genómicos fores-
El desarrollo biotecnológico y sus aplicacio- tales públicos y privados. Con la información
nes al sector forestal se están expandiendo genómica disponible, se ha utilizado la estrate-
rápidamente (Figura A). Las técnicas de mar- gia del “análisis del gen candidato” (candidate
cadores moleculares para la localización de gene approach) para la identificación de genes
genes simples y QTLs (loci involucrados en ca- subyacentes en QTLs, por ejemplo, en pino,
racterísticas cuantitativas o Quantitative Trait para genes involucrados en la síntesis de lig-
loci) han permitido identificar intervalos genó- nina y estructura de la pared celular (*Brown et
micos “relativamente amplios” típicamente in- al, 2003). Mediante la estrategia de “genética
volucrando decenas de centiMorgans (cM), y genómica” (genetical genomics), que es una
por lo tanto decenas o centenas de genes, y combinación del análisis de QTLs y análisis del
no los genes efectivamente involucrados en el transcriptoma en las poblaciones segregantes,
control de la característica. Estos marcadores se vio que QTLs para crecimiento co-localiza-
se aplican dentro de tácticas de selección fami- ron con eQTLs (expressed QTLs) para genes
liar, y sólo una estrategia de mapeo de polimor- relacionados a contenido de lignina, sugiriendo
fismos de secuencia que estén suficientemen- que crecimiento y lignina estarían controlados
te próximos a una mutación funcional revelará por los mismos loci en el pedigrí de eucalipto
asociaciones entre marcadores moleculares y ensayado (Kirst et al, 2004). En álamo, se estu-
caracteres de interés más precisas (Neale y diaron combinadamente QTLs, microarreglos y
Savolainen, 2004; *Gonzalez-Martinez et al. genes candidatos para identificar genes invo-
2006). lucrados en tolerancia a sequía (Street et al.,
La información de los mapas, conjuntamen- 2006). Por último, y para determinar loci y alelos
te con la generada por los diversos proyectos responsables de las diferencias fenotípicas, se

emplea el “mapeo de asociación” (association
mapping) a partir de la búsqueda de variantes
de genes candidatos. En contraste con el ma-
peo de QTLs, los marcadores que muestran
asociación con un carácter fenotípico, están
muy cerca o directamente en el gen que influye
en el carácter (Figura B). Esta táctica, toma
ventaja de la gran variabilidad y bajo valor de
desequilibrio de ligamiento que generalmente
presentan las poblaciones naturales y puede
aplicarse cuando existe gran variabilidad aléli-
ca (SNPs o single nucleotide polymorphisms).
En el caso de Eucalyptus, una primera asocia-
ción entre polimorfismo en genes candidatos y
el ángulo de la microfibrilla fue publicado por
Thumma et al., 2005. En coníferas los estudios Figura B: Ilustración simplificada de un ensayo
de asociación fueron pioneros y se realizaron de asociación genética para la identificación de la
en pino taeda (*Gonzalez-Martinez et al., 2006; variación alélica que influye un carácter fenotípico
“altura”, en un escenario de bajo o alto desequili-
2007), pino radiata, pino Oregón (abeto blanco)
brio de ligamiento. A) El carácter de interés se mide
y falso abeto (abeto rojo). en árboles no relacionados tomados de una pobla-
Hasta aquí, se ha hablado del estudio de la ción. Como ejemplo se midió la altura de cada ár-
variabilidad de los fenotipos naturales para la bol a una edad definida B) se determinan SNP en
búsqueda de las variantes genéticas que los cada genotipo, generalmente tomando una muestra
causan, cuyo esquema general simplificado se pequeña y luego extendiendo al total de la pobla-
muestra en la Figura C. La otra alternativa es ción estudiada para los SNPs seleccionados. Los
SNPs se han elegido para dos loci en un mismo
la modificación de un fenotipo, a través de los
cromosoma bajo el escenario de “bajo desequilibrio
análisis de anulación o supresión (knock out) de ligamiento”. Para el SNP superior (“A” vs. “C”),
o sobreexpresión de un gen mediante plantas los árboles qeu poseen SNP “A”, tienen una altura
transgénicas. promedio de 92, mientras qeu los que tienen “C”,
Independientemente de las estrategias utili- su altura promedio es sólo 56, consistente con una
zadas, una vez identificados los fenotipos be- asociación significativa entre el genotipo SNP y el
neficiosos, pueden seguirse dos caminos: 1) fenotipo altura. Para el segundo SNP (“G” vs “T”),
los árboles que poseen “G” tienen un promedio de
identificar genotipos que contengan estos ale- altura de 74, y los árboles que tienen “T”, también
los de interés e introducirlos en los programas tienen un promedio de altura de 74, indicando que
de mejoramiento/conservación y 2) modificar este SNP no tiene asociación con el fenotipo altura.
genéticamente clones elite con estas variantes, El bajo desequilibrio de ligamiento resutaría tipica-
que si bien en especies forestales es dificultosa, mente en una pequeña región cromosómica (pocos
en los casos posibles, han sido exitosas, como cientos de bases, señalado por cajas coloreadas).
C: los mismos genotipos de SNP pero en escenario
se explicará posteriormente (*Boerjan 2005).
de alto desequilibrio de ligamiento. En este caso, la
región cromosómica que rodea al SNP es grande,
Situación en Argentina algunos cientos de kilobases, y es común entre los
La biotecnología en estudios de Genética individuos, también señalada como caja coloreada.
Ecológica Forestal El resultado es que un SNP con significativa asocia-
El bosque constituye el ecosistema terrestre ción a un carácter, es probable que esté muy cerca
de mayor complejidad donde ocurren infinidad o directamente sobre el gen, y esto permite el co-
nocimiento de la función, regulación etc., siendo los
de interacciones entre los elementos estructu-
SNPs predictivos no sólo en el pedigre y pueden
rales del sistema (los árboles) y los numerosos usarse en poblaciones naturales.
organismos que viven dentro de él. En las últi- Tomado de Will genomics guide a greener forest
mas décadas, el acelerado avance de la fron- biotech? Andrew T. Groover Current Opinion in Bio-
tera agrícola y ganadera ha reducido sensible- technology 2005, 16:159–166.

Figura C: Esquema de trabajo simplificado para detección y análisis de ESTs mediante genética directa.
A partir del tejido donde se expresa el carácter o del tejido del árbol sometido a distintos estímulos (A) (ej,
madera o tejidos sometidos a diversos factores de estrés), se extraen diferencialmente los ARNm que se
transcriben frente a esa respuesta. Luego de un paso de síntesis de cADN “in vitro”, estos fragmentos o
ESTs son clonados (B) en librerías de expresión y secuenciados (C). Esta información se compara con las
secuencias depositadas en las bases de datos públicas existentes (D) y se observa el grado de similitud
entre ellas. A partir de aquellas que presentan alta identidad de secuencia con los genes publicados (ahora
genes candidatos), se diseñan marcadores específicos de fragmentos (E), o bien se buscan variantes de
SNPs entre los individuos muestreados. Estas diferencias de secuencias permitirán posicionar al gen en el
cromosoma y detectar su co-localización con QTLs en una población segregante de cruzamientos contras-
tantes para el carácter en cuestión (G). La otra estrategia, (H) es utilizar poblaciones de individuos de gran
variabilidad fenotípica y genotípica, en donde estos SNPs tratan de asociarse con los fenotipos, realizando
mapeo de asociación (ver también Figura B). Se observarán diferencias significativas del carácter entre
los grupos que poseen uno u otro haplotipo, si éste está directamente influyendo el carácter. En este es-
quema general, el cambio de la base “A” del gen de por una “C”, genera una modificación del aminoácido
en la proteina, que influye directamente en la expresión del carácter, y puede visualizarse en los fenotipos
de los individuos segregantes de la población de mapeo y en la población de asociación.
mente la superficie boscosa a una tasa anual forestales. La mayoría ya han sido presenta-
de deforestación mundial de unos 13 millones dos y descriptos en este volumen y pueden ser
de has, a la cual nuestro país, contribuye con encontrados en diferentes publicaciones (eg.
un promedio de 300.000 has de bosque nativo *Ziegenhagen and Fladung 2008).
por año (FAO 2007) urge por lo tanto actuar Una de las formas de agrupar a los diferen-
rápidamente en la conservación del bien co- tes tipos de marcadores genéticos utilizados
mún genético forestal ya que de él depende la en estudios de genética ecológica forestal es
conservación de la diversidad genética y el uso en función de su utilidad para reflejar el ver-
adecuado de la misma en procesos producti- dadero nivel de variación genética a diferentes
vos de importancia socio-económica. escalas espacio-temporales.
Numerosos son los marcadores que se utili- En base a ello podemos definir tres grupos
zan en estudios de genética ecológica con fines de marcadores genéticos que se han utilizado
de conservación y domesticación de especies y se utilizan actualmente:

1.- los que permiten monitorear procesos de cloroplasto en Rauli (Nothofagus nervosa) y
evolutivos de larga data y en grandes escalas confirmado luego en Roble Pellin (N. obliqua),
espaciales especie emparentada, se propuso una clara di-
2.- los que permiten monitorear procesos ferenciación entre el norte y el sur del área de
evolutivos recientes y procesos genéticos de distribución natural de estas especies en base
importancia actual en escala de paisaje a los haplotipos encontrados (*Marchelli & Ga-
3.- los que permiten la identificación de ge- llo 2006, *Azpilicueta et al.2009) y la existencia
nomas y el monitoreo del impacto actual de di- de varios refugios glaciarios sobre la vertiente
ferentes tipos de disturbios sobre la diversidad oriental de los Andes e incluso en el ecotono
genética en escala local con la estepa patagónica. La diferencia del
Los límites entre los grupos no son exclu- efecto sobre los bosques patagónicos de dos
yentes por lo que podemos contar en algunos patrones diferentes de distribución e intensidad
casos con un mismo marcador que sirva para de la última glaciación se puso de manifiesto
más de un propósito. también con estos marcadores en un estudio
preliminar realizado con Nothofagus antarctica
• Entre los del primer grupo, se destacan (*Pastorino et al. 2009) Estos resultados per-
los marcadores genéticos de ADN de miten comprender mejor la historia evolutiva
organelas, de mitocondrias y particular- que dio origen a la distribución espacial actual
mente de cloroplastos La organización de la variación genética en las especies arbó-
molecular del genoma de cloroplasto es reas de nuestros bosques. En el caso de una
extremadamente conservada por lo que gimnosperma emblemática como la Araucaria
diferentes taxones vegetales mantienen araucana se determinaron los sitios de mayor
un mismo arreglo lineal de sus genes. Su diversidad y se verificó nuevamente el patrón
evolución es lenta con una tasa mutacio- general de diferenciación norte-sur hallado en
nal del orden de 1-3 x 10-9 motivo por el otras especies, mediante la distribución de los
cual mutaciones ocurridas en tiempos haplotipos analizados (*Marchelli et al. 2009)
geológicos son mantenidas hasta la ac- • Para los objetivos del segundo grupo de
tualidad. Con el monitoreo de la distribu- marcadores, que comprende esencial-
ción espacial de su variación y en gran- mente estudios de variación genética
des escalas, como las de distribución entre y dentro de poblaciones (diferen-
natural de una especie pueden ser uti- ciación y diversidad genéticas), se utiliza
lizadas, junto con estudios palinológicos principalmente la información del ADN
y registros de microfósiles, para ayudar nuclear, sujeta a una mayor tasa de mu-
a reconstruir la historia glaciaria y post- tación, a herencia biparental y a recombi-
glaciaria de los bosques. De esta forma nación de la información genética.
se ubican sitios de probables refugios Estudios realizados con marcadores géni-
glaciarios y rutas migratorias a partir de cos isoenzimáticos en Ciprés de la Cordillera
ellos durante la retracción de los hielos. (Austrocedrus chilensis) permitieron encontrar
La correcta interpretación de la distribu- que las poblaciones orientales esteparias de
ción espacial de líneas genealógicas da- esta especie patagónica, fuera de los parques
das por las secuencias génicas o sitios nacionales, son las que contienen la mayor
de restricción permiten realizar estudios diversidad genética (Pastorino y Gallo 2002).
filogeográficos dentro de géneros y es- Información obtenida con marcadores SSRs
pecies (Avise 2000). (Arana et al. 2008) confirmó el carácter relic-
Las angiospermas poseen herencia materna tual y de alta diversidad genética en este tipo
en el ADN de cloroplasto por lo que el monito- de poblaciones (*Arana et al. 2010, en prensa).
reo espacio-temporal de su variación permite Con ambos marcadores se determinó además
definir el movimiento histórico de la semilla y la estructuración espacial del sistema de apa-
por lo tanto el flujo génico materno. Mediante reamiento en poblaciones de esta especie y
estudios realizados con marcadores de ADN un proceso de deriva genética.

La estructuración genética y sus patrones SSR nucleares, cpSSR o SSR de clo-
de distribución espacial han sido sugeridos en roplastos, RAPD, AFLP). Entre estos
estudios de regeneración natural post-incendio procesos figuran estimaciones de flujo
a escala de rodal en una especie del genéro polínico actual, estructuración genética
Nothofagus utilizando marcadores genéticos en diferentes estratos generacionales,
isoenzimáticos (Premoli y Kitzberger 2005) impacto del uso silvícola en la diversidad
En Roble Pellín (Nothofagus obliqua), pudo genética, impacto de la fragmentación
ser detectado otro proceso genético pocas del habitat, análisis de paternidad, identi-
veces evidenciado en especies forestales: un ficación de regeneración natural vegeta-
efecto de cuello de botella en una población tiva, entre otros.
esteparia y aislada a unos 30 km al este de Aplicando SSRs junto con marcadores gé-
las poblaciones continuas de la especie (Ga- nicos isoenzimáticos y PCR-RFLP en ADN de
llo et al. 2008, Azpilicueta y Gallo, 2010). Ade- cloroplasto se analizó el flujo génico entre dos
más, marcadores génicos isoenzimáticos per- poblaciones de Nothofagus nervosa, separa-
mitieron confirmar la hibridación natural entre das por una colada de lava de una erupción
especies del género Nothofagus por medio de geológicamente reciente del volcán Lanín. Se
alelos específicos de especie en dos loci de se- comprobó que no existe conexión por flujo se-
gregación independiente o por diferenciación
de frecuencias alélicas en el género Prosopis
(Verga 1995). Estos resultados contribuyeron
en el primero de los casos a formular un mode-
lo de dinámica de hibridación natural y propo-
ner pautas de manejo silvícola para la conser-
vación de ambas especies (Gallo 2004). Las
etapas avanzadas del proceso de hibridación
e introgresión (retrocruzas) pudieron ser con-
firmadas con marcadores microsatélites en un
estudio comparativo de su calidad de madera.
Un estudio morfológico detallado junto con in-
formación sobre variación genética isoenzi-
mática permitió detectar la hibridación natural
interespecífica poco común entre una especie
decidua (Nothofagus antarctica) y una siem-
preverde (N. dombeyi) (Steconni et al. 2004).
Un estudio que derivó en una medida concreta
de protección fue realizado a través del análisis
combinado con marcadores de ADN de cloro-
plasto e isoenzimáticos. Con ellos fue detecta-
do el centro de mayor diversidad genética de Figura D: Ejemplo del patrón electroforético de
poblaciones argentinas de Nothofagus nervosa ADN de cloroplasto de poblaciones argentinas de
(*Marchelli & Gallo 2006; *Gallo et al. 2009), Nothofagus nervosa (Raulí), que conjuntamente
(Figura D), resultando en una decisión políti- con isoenzimas fue utilizado para detectar el centro
ca sobre la conservación y manejo de masas de mayor diversidad genética al oeste de la cuen-
boscosas ca Lago Lacar (señalado en el mapa por el círculo
• El tercer grupo de marcadores es utili- lleno), derivando luego en una medida política que
permitió modificar el estatus de protección de ese
zado en estudios de procesos de impor-
bosque.1: Mapa con haplotipos (de Marchelli y Ga-
tancia evolutiva y de genética espacial a llo 2006),2: Migración de fragmentos de restricción
escala local, los cuales requieren esen- de ADN de cloropasto en geles de agarosa (de Mar-
cialmente marcadores hipervariables, chelli et.al. 1998), 3: Bosque Hua-Hum incluido en
co-dominantes o dominantes (nSSR o la nueva área protegida).

minal pero que ambas poblaciones se man- nante. En el ámbito local estos marcadores se
tienen conectadas genéticamente por flujo de utilizaron como descriptores complementarios
polen (*Milleron et al. 2008). Con el uso de para la inscripción en el Registro Nacional de
microsatélites se obtuvieron resultados prelimi- la Propiedad de Cultivares de los primeros 10
nares sobre el flujo polínico en Araucaria arau- clones de Eucayptus grandis, mediante la uti-
cana destacándose la importancia de los árbo- lización de 6 SSRs desarrollados por EMBRA-
les aislados como “puentes genéticos” entre PA, Brasil (*Torales et al. 2005) .
fragmentos. Por otro lado se comprobó que el La cuantificación de la diversidad genética
vecindario genético de un bosque de Nothofa- dentro del stand, es uno de los criterios claves
gus tiene un radio de solo 15 m con un número que definen la calidad de la semilla forestal.
efectivo de 8 árboles polinizadores (Marchelli La producción de semilla genéticamente me-
et al. 2007) lo cual ya ha servido para fijar pau- jorada, a través de Huertos Semilleros, integra
tas aplicables de cosecha de semilla y de malas actividades priorizadas en los programas
nejo silvícola. de mejoramiento del INTA, donde idealmente
Como se ve a través de todos estos ejem- el material de propagación debe presentar alto
plos de estudios realizados en Argentina, las valor genético y mantener alta diversidad.
técnicas biotecnológicas de genética molecular El huerto semillero constituye una plantación
realizan un contundente aporte en el monitoreo de clones (HSC) o progenies (HSP) seleccio-
de procesos ecológicos de importancia evoluti- nados intensivamente sobre la base de carac-
va Esto permite en tiempos relativamente cor- terísticas de importancia económica, el cual
tos obtener resultados que posibilitan la toma ha sido sometido a los aclareos genéticos ne-
de decisiones relacionadas a la conservación cesarios para conservar únicamente aquellos
y al manejo de la diversidad genética de nues- clones o individuos que han demostrado su su-
tros bosques nativos. perioridad. Esto puede originar el decrecimien-
to del nivel de variabilidad genética presente
Aplicación de marcadores moleculares en las semillas producidas en el huerto y, por
neutros en Poblaciones de mejora y extensión, en las plántulas utilizadas en las ex-
producción de especies forestales de plotaciones comerciales, con posibles pérdidas
rápido crecimiento de productividad. A modo de ejemplo se citan
La caracterización, evaluación y manejo de las especies del género Eucalyptus, las cuales
la variabilidad genética en poblaciones de me- si bien presentan un sistema de fecundación
jora y producción integran áreas de aplicación predominantemente alógamo y mediado por
donde los marcadores de ADN neutros ofrecen polinización entomófila, pueden estar sugetas
mayor utilidad. a efectos de depresión por endogamia. Estos
Tanto en los programas de mejora genética efectos se manifiestan en la reducción de los
como en los programas de propagación ma- niveles de producción de semillas, reducción
siva, la correcta identificación de clones elite, de altura de fuste, área basal y volumen, y de-
así como la identificación de los progenitores formación de hojas y tallos en algunas espe-
involucrados en cruzamientos controlados, cies. En consecuencia, el diseño de los huertos
constituyen factores críticos en la producción debe considerar restricciones de distancias mí-
de especies comerciales, ya que errores de nimas entre individuos emparentados. En plan-
identificación genética pueden afectar severa- taciones clonales la asistencia por marcadores
mente los niveles de ganancia esperados en moleculares permite evitar la implantación de
sistemas a gran escala. Dichos aspectos, así clones genéticamente relacionados en bloques
como la estimación del nivel de contaminación contiguos, disminuyendo además, el riesgo fren-
con polen procedente de fuentes externas en te al ataque de plagas y patógenos en toda la
huertos semilleros, pueden ser asistidos me- plantación.
diante "fingerprint" o huella dactilar del ADN En el ámbito local, se aplicaron AFLP y SSR
mediante el empleo de los SSRs, gracias a en poblaciones de mejora de Eucalyptus dun-
su naturaleza multialélica y herencia codomi- nii, seleccionadas por caracteres morfomé-

tricos de interés, con la finalidad de diseñar nética y estructura poblacional, diagnosticaron
HSCs que maximicen el progreso en la mejora una marcada asociación entre las razas locales
genética y minimicen los riesgos de depresión entre sí, así como una clara afinidad entre és-
por endogamia. Su aplicación permitó el análi- tas y las razas australianas del Sur y Sudeste
sis genómico de 46 clones selectos por forma de Tasmania, sugiriendo que dichas regiones
de fuste y tasa de crecimiento y la identifica- fueron las primeras fuentes proveedoras de se-
ción de nueve pares de clones más divergen- millas de la especie (Acuña et.al. 2004).
tes, manteniendo el 95.2% del número total
de alelos detectados (*Marcucci Poltri et al. Evaluación de variabilidad funcional en
2003). Así mismo, estos marcadores han sido programas de mejoramiento y
utilizados,para la estimación de la amplitud de domesticación
la base genética retenida en huertos semilleros La exploración de la variabilidad alélica de
diseñados a partir de poblaciones de mejora- genes candidatos mediante diversas técnicas
miento, en E. grandis, E. globulus y E. dunnii de detección de SNPs, constituye un desafío
(*Marcucci Poltri et al. 2005). Actualmente se para el estudio de la diversidad funcional en
aplican en Pinus taeda, con el objeto de esta- especies forestales.
blecer las relaciones de parentesco entre indi- En los programas de mejoramiento y do-
viduos pertenecientes a HSCs, instalados en mesticación de Argentina se han comenzado
la provincia de Misiones (Villalba-Acosta et al, a incorporar y desarrollar nuevas estrategias,
2009) y en el NOA (*Fornes, 2003), pudiendo dirigidas a optimizar la calidad de madera (con-
ser sujetos al raleo de individuos. tenido de lignina y densidad) en especies del
La incorporación de técnicas moleculares en género Eucalyptus, como así también a ana-
los programas de mejora, procura optimizar la lizar características adaptativas en especies
estructura de las poblaciones de mejora/pro- nativas. En ambos estudios, la finalidad es
ducción, incrementar la información necesaria detectar variantes alélicas responsables de la
para decidir sobre la infusión de nuevos ma- expresión del carácter y a continuación se de-
teriales y mejorar las estrategias de selección. tallan los dos ejemplos.
Con la finalidad de establecer una estrategia 1) El contenido y composición de lignina es
alternativa de selección para el diseño de un de gran importancia en la producción de pulpa
HSP local de E. dunnii, basado en el análisis para la industria del papel, fundamentalmente
conjunto de un índice de selección morfométri- por las consecuencias que su eliminación tie-
co y criterios de diversidad genética molecular, ne en la conservación del medio ambiente. Por
se realizó el estudio genómico de 37 familias otro lado, el bajo contenido de este polímero es
de medio hermanos, selectas por forma de fus- una característica importante para la utilización
te, DAP y densidad de la madera, provenientes de los residuos forestales en la generación de
de 5 orígenes australianos y una procedencia biocombustibles (bioetanol) ya que reduce los
local. La diversidad genética y su distribución componentes inhibitorios y enriquece la con-
así como las relaciones genéticas entre los in- centración relativa de los hidratos de carbono
dividuos, evidenciaron con claridad baja dife- fermentables. En una primera etapa se carac-
renciación genética entre procedencias y alta terizó un Huerto Semillero Clonal de primera
diferenciación entre familias, donde el 80% de generación (27 árboles) de E. grandis, tanto en
la variación total fue explicada dentro de ellas, la variabilidad de los genes candidatos involu-
sugiriendo por lo tanto que el diseño del HSP crados en la via metabólica como en el con-
debía basarse en la selección individual y fami- tenido y composición de lignina (Torales et al,
liar (*Zelener et. al. 2005). 2006),. Se encontraron escasas diferencias fe-
La determinación de los posibles orígenes notípicas entre individuos y algunas variantes
de las razas locales de E. globulus provenien- alélicas diferenciales. En cuanto a la búsqueda
tes de Argentina, Portugal, España y Chile, de QTLs asociados a densidad de madera, se
fue también abordada mediante el análisis de trabajó en poblaciones segregantes locales de
SSRs y AFLPs. Los estudios de diversidad ge- E. grandis (García et al, 2007) y en el desa-

rrollo de marcadores funcionales de tipo EST- ces logrados mundialmente a nivel genómico
SSR a partir de secuencias publicadas de E. en especies modelo podrán ser utilizados con
globulus (Acuña et al, 2007), información útil mayor intensidad en otras especies, habiendo
en el mapeo genético y estudios de variabilidad iniciado el camino en alguna de ellas, con el
funcional. fin de explotar la variación genética de pobla-
2) La segunda aplicación del programa se ciones de mejora o nativas. No obstante, para
refiere al estudio de variabilidad a nivel de nu- el descubrimiento de nuevos genes, será tam-
cleótidos de genes involucrados en tolerancia bién necesario generar e incorporar en bases
a estrés abiótico tales como sequía y salini- de datos públicas, secuencias de ESTs, logra-
dad. Los genes seleccionados se estudiaron das a través de diversos experimentos y en-
en las poblaciones de Austrocedrus chilensis sayos biológicos en géneros y especies en las
y Prosopis spp, en sus gradientes naturales de que la disponibilidad actual de proyectos de se-
distribución geográfica, abarcando las zonas cuenciación no esté prevista o sea difícil por la
marginales, sometidas a estrés hídrico y sali- complejidad del genoma, como el caso de las
no. Ambas especies constituyen sistemas mo- coníferas. A partir de estas bases de datos y
delo para este tipo de análisis, siendo especies de las metodologías de alto desempeño, como
forestales nativas de importancia económica, métodos de pirosecuenciación o microarreglos
de relativo rápido crecimiento y con un alto de oligonucleótidos en cuentas (beadarrays),
potencial adaptativo. Tienen posibilidades de basadas en la extensión de iniciadores alelo
adecuarse a cambios climáticos futuros, que específica como tecnología de Golden Gate
les permitirían ocupar nichos que no se super- (Fan et al. 2006), se podrán detectar gran can-
ponen con la producción forestal de especies tidad de SNPs en forma paralela, a un costo
exóticas de alto rendimiento, permitiendo la razonable y finalmente podrán utilizarse en es-
restauración de ecosistemas degradados por tudios de asociación genética. Por lo tanto, la
la explotación forestal extractiva. Constituyen genética de asociación promete ser la estrate-
una alternativa productiva y en algunos casos gia elegida en todos los géneros y en donde
puede ser combinada con la actividad agrícola el objetivo es correlacionar la distribución de
o ganadera. A partir de ESTs de Pinus pinas- los genotipos de los genes candidatos como
ter, P. taeda, Prosopis juliflora y genes de Ara- secuencias de ADN, y los fenotipos relevantes
bidopsis y Criptomeria japónica, se diseñaron (tal como se aplica en humanos y otros orga-
cebadores, se amplificaron y analizaron frag- nismos de fecundación cruzada).
mentos con alto porcentaje de similitud a los Por esta razón, seguirán siendo clave la se-
depositados en la base de datos. En Austroce- lección de los genes candidatos, la capacidad
drus chilensis se analizaron porciones de los de caracterizar apropiadamente los fenotipos
genes Pal 3, LP3-1 y Aquaporina en genotipos y la habilidad de utilizarlos para manipular vía
contrastantes sin detectar aún asociación. En mejoramiento molecular o transgénesis.
Prosopis se evaluaron 5 genes en genotipos Todas estas metodologías, además de mejo-
de las especies Prosopis flexuosa, P.chilensis rar el conocimiento del control genético de ca-
y P.alba con comportamientos contrastantes racterísticas de interés (alelos de importancia
frente al estrés hídrico. En los genes HAK3P, económica y ecológica), reducirían los costos
ERD 15, PHD Finger y Rab7 se detectaron y tiempos de mejoramiento y ayudarán en la
SNPs diferenciales entre especies que habitan conservación.
las distintas regiones (Torales et al, 2009).
2 )Modificación genética de especies
Conclusiones y perspectivas forestales
La utilización de marcadores moleculares
neutros y genéticos para manejo asistido de Introducción
poblaciones de mejora y en genética ecológi- La transformación genética de árboles es to-
ca, principalmente con fines de conservación, davía un instrumento relativamente nuevo en
han sido aplicados en Argentina. Los avan- el sector forestal y se realiza a menudo usando

sistemas de transformación basados en Agro- del volumen del tronco, y el acortamiento de
bacterium tumefaciens (ver Capitulo XX) en an- los turnos de corta, son objetivos importantes
giospermas y por bombardeo con micropartícu- de muchos programas de mejoramiento de ár-
las en gimnospermas (ver Cap XX)). Los éxitos boles, así como la rectitud del fuste, el período
en especies forestales son hasta el momento de reposo y los hábitos de crecimiento (rami-
limitados debido a los problemas asociados a ficación). Para ello se ha modificado la expre-
la regeneración de las plantas, especialmente sión de una serie de genes que participan en la
si se considera que muchas especies son aún síntesis de hormonas vegetales. Por ejemplo,
consideradas recalcitrantes al cultivo in vitro y el gen ipt de Agrobacterium tumefasciens, que
que la transformación de una nueva especie codifica una enzima para la producción de cito-
depende de su capacidad de regeneración de cininas, la sobreexpresión de los genes rol de
plantas. Agrobacterium rhizogenes que producen modi-
Una de las aplicaciones de la tecnología de ficaciones en la anatomía y composición quími-
modificación genética que a menudo se pasa ca de la pared celular en árboles transgénicos,
por alto, pero que es tal vez la más importante, la expresión en dirección sentido y antisentido
es la que se refiere a la investigación de la bio- de la enzima GA 20-oxidasa que participa en la
logía de los árboles, es decir, estudios sobre el síntesis de giberelinas y por ende en el creci-
funcionamiento de los genes y sobre los carac- miento, el gen de la glutamina sintasa (GS) de
teres que éstos controlan. pino, que interviene en el metabolismo del ni-
Por otro lado, la utilización comercial de ár- trógeno y una xiloglucanasa de Aspergillus que
boles transgénicos se limita a las plantaciones promueve la expansión celular.
comerciales, para lo cual es esencial disponer Respecto a la estructura de la madera, la in-
de marcos reglamentarios para el ensayo, se- vestigación se concentra en modificar el conte-
guimiento y gestión de los árboles OGM, uti- nido y la composición de lignina. Muchos de los
lizando materiales con reproducción controla- genes involucrados en la síntesis de la lignina
da (estériles, de propagación vegetativa o con han sido sobreexpresados o inhibidos en árbo-
producción reducida de polen). La modificación les como álamo, pino y eucaliptos. Utilizando
genética a través del ensayo clonal es la estra- la estrategia de antisentido para reducir la ex-
tegia más lógica para integrarla a los progra- presión del gen 4CL (Hu et al. 1999; *Sederoff
mas tradicionales de mejoramiento de árboles. et al, 1999) o aumentando la expresión de F5H
Por esta razón, es preferible utilizar ingeniería se obtuvo una reduccion del 45% del contenido
genética en especies forestales que cuentan de lignina y un aumento del 15% de celulosa
con programas avanzados de mejoramiento y en álamos.
en las que pueda considerarse de modo realis- Otros objetivos han sido la introducción de
ta la utilización de técnicas de clonación. resistencia a insectos y hongos, tolerancia a
herbicidas y las mejoras relacionadas con la
Objetivos de la transformación genética capacidad de crecer en suelos marginales, ex-
de árboles hibiendo resistencia o tolerancia a los estreses
Uno de los objetivos más importantes, cons- bióticos y abióticos (como sequías, heladas,
tituye el estudio de la funcionalidad de los ge- inundaciones, alta salinidad, etc.). El primer
nes que se van descubriendo y que mediante árbol transgénico fue un álamo con resisten-
esta herramienta, ya sea por sobreexpresión o cia a insectos (*Filatti et al, 1987), utilizando
supresión, es posible atribuir. Los dos objeti- los genes Cry de Bacillus thuringiensis, que se
vos más estudiados en la investigación en in- emplean para cultivos agrícolas, útiles para va-
geniería genética forestal son el aumento en rias plagas forestales. Se han introducido en
la producción de biomasa y los cambios en álamos, pinos, abeto, nogal, alerce y otras es-
la estructura de la madera, con un papel fun- pecies forestales. La resistencia a hongos fue
damental en los estudios de los mecanismos obtenida en álamos que expresan genes de
reguladores de formación de la misma. El au- quitinasas como e Ac-AMP 1.2 y ESF 12 (Liang
mento de la tasa de crecimiento, el incremento et al. 2002). La resistencia a herbicidas (glifo-

sato) se obtuvo en álamo, Picea y Pinus. En a la mariposa del brote. Investigadores brasi-
el caso de la resistencia o tolerancia a estrés leños han participado en el desarrollo de ála-
abiotico, se han logrado transformar árboles mos y eucaliptos transgénicos en conjunto con
tolerantes a salinidad (gen codA de la enzima Francia y USA. Por otro lado, en ese país, em-
colina oxidasa de Arthrobacter globiformis en presas del sector privado de la industria del pa-
Eucalyptus camaldulensis), tolerantes a suelos pel están desarrollando eucaliptos con la canti-
ácidos y sequía (gen DREB1A de Arabidopsis dad de lignina modificada. En México se están
thaliana en híbridos de Eucalyptus grandis x E. ensayando nuevos genes involucrados en la
urophylla). modificación de la madera para incrementar
La modificación de la floración ha sido tam- el crecimiento en Pawlonia sp. En Argentina,
bién blanco de la modificación genética. Al con- tanto el INTA como la UNLP han iniciado pro-
trario de las especies herbáceas y anuales, los yectos de modificación genética de clones de
árboles no han sido totalmente domesticados álamos para modificar la lignina, para toleran-
y, por consiguiente, tienen parientes silvestres cia a herbicidas y resistencia a insectos.
con los que pueden ser interfértiles; además,
son especies longevas, producen cantidades Conclusiones
copiosas de polen y semillas que se diseminan La modificación genética en el sector fores-
a menudo por el viento a distancias considera- tal es mucho más que una cuestión técnica; se
bles. Por lo tanto, para liberar en forma segu- han de tener en cuenta los valores sociocultu-
ra árboles transgénicos, es necesario evitar el rales y los múltiples usos de los bosques y es
riesgo de dispersión del transgén en el ambien- necesaria la aceptación de la opinión pública.
te. Se ha logrado la esterilidad reproductiva en Se necesitan protocolos fiables, experimen-
forma genética, utilizando el gen PTD, aislado tados y convenidos para evaluar los riesgos
de Populus tricocharpa, que genera ablación relacionados con los árboles forestales modi-
citotóxica de estructuras florales únicamente ficados genéticamente, pero la evaluación del
(Shepard 1997). riesgo en cultivos de tan larga duración plantea
En cuanto a la utilización de plantaciones algunos problemas. En consecuencia, el desa-
forestales fitorremediar, se han ensayado dife- rrollo, ensayo y aprobación de los árboles fo-
rentes estrategias para aumentar la capacidad restales modificados genéticamente para una
de absorción de las raíces. Se han transfor- utilización más generalizada puede sufrir un
mado híbridos de Populus usando un gen de costo elevado y exigir plazos muy largos.
mamíferos del citocromo P450, para detoxificar En conjunto, la manipulación genética en el
tricloroetileno (TCE) y otros compuestos halo- sector forestal se realiza en al menos 35 paí-
genados, se han transformado callos embrio- ses, aunque según la *FAO (2004) en la ma-
génicos de Liriodendron tulipifera con un gen yoría de los casos se trata de experimentos
modificado de la enzima bacteriana mercúrico de laboratorio, con tan solo algunas pruebas
reductasa (gen merA) (Che et al., 2003) y se sobre el terreno y se limitan esencialmente a
han modificado híbridos de álamo (Populus las especies Populus, Pinus, Liquidambar y
alba x P. glandulosa) sobreexpresando un gen Eucalyptus. El último informe de China ante
de fitoquelatinas (péptidos que unen metales la Comisión Internacional del Álamo reportó
en hongos y plantas), para la eliminación de el establecimiento de plantaciones de árboles
cadmio. genéticamente modificados, habiendo sido au-
torizada la comercialización de Populus nigra
Árboles transgénicos en America latina y de 741 líneas híbridas transformadas con
En algunos países de América Latina se es- los genes de resistencia a insectos. Es impor-
tán desarrollando proyectos de transformación tante tener en cuenta que si se decide liberar
genética de árboles para su comercialización. comercialmente árboles forestales modificados
En Chile, a través de un proyecto conjunto del genéticamente, es condición el empleo de ma-
sector privado en acuerdo con la Universidad, teriales con reproducción controlada (estériles,
se está tratando de obtener pinos resistentes de propagación vegetativa o con producción

reducida de polen). La madera es vital para la Nucleotide Polymorphisms at Candidate Genes
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V. Capítulo 6 En sentido amplio existen dos formas de
modificar plantas por ingeniería genética de
manera de conferirles resistencia a virus: des-
Técnicas de Ingeniería Genética encadenar resistencia mediante la expresión
para conferir resistencia a virus de secuencias genómicas derivadas del pro-
en plantas pio virus al que se desea combatir (llamada
resistencia derivada del patógeno o PDR) o,
M del Vas; AJ Distéfano; desencadenar resistencia mediante la expre-
C Rovere Vázquez; HE Hopp sión de genes no-virales que poseen actividad
antiviral. Ambas estrategias se describirán a
Las enfermedades de las plantas causan continuación. (Recientemente se ha publicado
la pérdida de aproximadamente el 15% de la una interesante recopilación sobre el tema, ver
producción agrícola mundial. En particular, las Prins, et al. 2008 en Lecturas Recomendadas).
infecciones virales producen perjuicios econó-
micos significativos de manera directa, a tra- Resistencia a virus conferida por
vés de una disminución del rendimiento por secuencias virales
efecto de la enfermedad e indirecta, y a través La prevención del desarrollo de enfermeda-
de un incremento en los costos debido a la uti- des virales utilizando genes derivados del pató-
lización de semilla libre de virus (por ejemplo geno fue propuesta por primera vez a comien-
en plantas de propagación clonal como papa, zos del siglo XX, cuando se demostró que las
ajo y batata). Por otro lado, la exportación de plantas de tabaco podían ser protegidas frente
ciertos productos se ve restringida debido a las a la infección con una cepa severa del virus
limitaciones internacionales impuestas a la ex- del mosaico del tabaco (TMV, Tobacco mosaic
portación de materiales fuera de las tolerancias virus) si, previamente, se las había inoculado
fitosanitarias y de calidad permitidas. con una cepa menos virulenta del mismo virus.
Clásicamente las enfermedades virales en Este tipo de estrategia, comúnmente denomi-
plantas se controlan mediante distintas estra- nada “protección cruzada”, ha sido empleada
tegias como el mejoramiento genético, el uso para varios cultivos de importancia económica,
de semillas libres de virus, la rotación de culti- incluyendo tomate, papaya, cítricos, etc. En
vos y la técnica de protección cruzada (que se 1985, dos investigadores propusieron que la
describe brevemente más adelante). expresión de ciertos genes del patógeno en un
Desde 1983, con las primeras obtenciones hospedante alteraría el balance normal de los
de plantas de tabaco y petunia transgénicas, componentes virales y predijeron que esto con-
se publicaron un gran número de trabajos de- duciría al impedimento de la replicación o del
tallando la transferencia de genes foráneos a movimiento del virus dentro de la planta más
una cantidad creciente de especies de plantas. allá de la primera célula infectada.
La ingeniería genética permite incorporar en
las plantas nuevos caracteres de interés agrí-
Protección debida a la expresión de la
cola en forma horizontal, evitando así el traspa-
proteína de cápside viral (CP)
so de caracteres indeseables. De esta forma,
Las primeras plantas transgénicas con resis-
la variedad transgénica adquiere un carácter
tencia a virus se obtuvieron en 1986 mediante
nuevo al tiempo que mantiene intactos el fon-
la expresión del gen que codifica la cápside de
do genético y el potencial productivo original,
TMV. Utilizando esta estrategia se lograron ob-
lo que permite encarar el mejoramiento rápido
de cultivares ya utilizados por el agricultor. Los tener plantas resistentes a virus pertenecientes
transgenes introducidos pueden provenir de a casi todos los géneros de virus de plantas,
otras variedades de la misma especie vege- principalmente en tobamo-, potex- y alfamovi-
tal, de plantas de otras especies sexualmente rus (Tabla 1).
incompatibles e incluso de organismos perte- En general, las plantas protegidas muestran
necientes a otros reinos incluyendo animales y un retardo temporal del desarrollo de síntomas,
microorganismos. una atenuación en la sintomatología caracte-

Tabla 1: Ejemplos de resistencia a virus mediante la expresión de la proteína de cápside (CP) o nucleocáp-
side (Gen N) viral en plantas transgénicas.
Géneros de virus transgén Virus Especies vegetales
Tobamovirus CP TMV; ToMV; AIMV tabaco; tomate

Potexvirus CP PVX; CyMV; WCIMV tabaco
Potyvirus CP PVY; TEV; PRV; PPV PPV; tabaco; papa; papaya; maíz
MDMV; SMV; WMV II;
ZYMV
Carlavirus CP PVS tabaco; papa
Luteovirus CP PLRV papa

Comovirus CP SLRSV tabaco
Nepovirus CP ArMV tabaco
Tobravirus CP TRV tabaco
Ilavirus CP TSV tabaco
Geminivirus CP TYLCV tomate
Tospovirus Gen N TSWV; INSV; TCSV; GRSV tabaco
Los acrónimos utilizados (en orden alfabético) son: AIMV: Alfalfa mosaic virus; ArMV: Arabis mosaic virus;
CMV: Cucumber mosaic virus; CyMV: Cymbidium mosaic virus; GRSV: Groundnut ringspot virus; INSV:
Impatiens necrotic spot virus; MDMV: Maize dwarf mosaic virus; PLRV: Potato leaf roll virus; PPV: Plum
pox virus; PRV: Papaya ringspot virus; PVS: Potato virus; PVX: Potato virus X; PVY: Potato virus Y; SMV:
Soybean mosaic virus; SSLRSV: Strawberry latent ringspot virus; TCSV: Tomato chlorotic spot virus; TEV:
Tobacco etch virus; TMV: Tobacco mosaic virus; ToMV: Tomato mosaic virus; TRV: Tobacco rattle virus;
TSV: Tobacco streak virus; TSWV: Tomato spotted wilt virus; TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus; WClMV:
White clover mosaic virus; WMV II: Watermelon mosaic virus II; ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus.
rística de cada virus, una menor cantidad de Las plantas transgénicas que expresaban el
sitios de infección y un menor título viral. Se gen de cápside del virus TMV resultaron resis-
demostró que hay una correlación entre la re- tentes a la inoculación con partículas virales
sistencia y el nivel de expresión de la proteína de TMV pero la resistencia era sobrepasada
de la cápside, que la protección actúa a nivel si se las inoculaba con ARN viral infectivo. Se
celular y es superada por altas dosis de inó- postuló entonces que la protección se debía a
culo (viriones). En algunos casos es superada la inhibición del desnudamiento viral en las cé-
por inoculación con ARN viral. La protección lulas infectadas inicialmente. Varias líneas de
es más efectiva para el virus homólogo al que evidencia apoyan esta hipótesis. Por ejemplo
dio origen al transgén. Sin embargo, abarca si se inoculan protoplastos derivados de plan-
también a virus y cepas relacionadas aunque tas transgénicas que expresan la CP de TMV
la eficiencia se va reduciendo a medida que la o plantas no transformadas con pseudovirio-
relación filogenética se hace más lejana y dis- nes de TMV que contienen ARNm que codifica
minuye la identidad entre la secuencia expre- para la proteína indicadora beta-glucuronidasa
sada en la planta transgénica y la secuencia (GUS), se observa que hay una marcada dis-
del virus desafiante. minución de la actividad GUS en los proto-

plastos derivados de las plantas transgénicas tula que la proteína de cápside se une al ori-
probablemente debida a la falla en el desnu- gen de ensamblado localizado en el extremo 5´
damiento de los viriones. Más adelante se de- del ARN viral, suprimiendo de esta manera la
mostró que las proteínas de cápside mutage- traducción de la replicasa viral (cuyo gen está
nizadas de forma que carecen de la habilidad localizado en el mismo extremo). También es
de auto-agregarse no son capaces de conferir posible que inhiba el movimiento de PVX de
protección frente a TMV, y que las proteínas célula a célula ya que la proteína de cápside
mutadas capaces de interactuar con sí mismas es un cofactor esencial de la traslocación sis-
con afinidad más alta conferían mayor protec- témica.
ción que la proteína de cápside salvaje. Es de- Como se desprende de los dos ejemplos
cir se estableció una relación directa entre el descriptos, el mecanismo de protección media-
nivel de agregación de la proteína de cápside y do por la proteína de cápside no es único, y es
el nivel de protección frente a TMV. Posterior- particular para cada sistema virus-planta.
mente se demostró que el estado de agrega- Además de obtenerse resistencia a virus
ción de las proteínas de cápside de TMV en las mediante la expresión de proteínas de cápsi-
plantas transgénicas correlaciona con el nivel de (CP) virales, se logró obtener resistencia a
de resistencia observado. Estos resultados su- virus mediante la expresión en plantas trans-
gieren que la resistencia por expresión de la génicas de otras proteínas virales tales como
cápside viral (CP) estaría mediada por deter- la replicasa viral (REP) o de la proteína de mo-
minadas configuraciones de la estructura cua- vimiento viral (MP).Ambas estrategias se des-
ternaria de la cápside mas que por la expresión criben a continuación.
de la subunidad de cápside en la transgénica
per se. Se propuso que el grado de regulación Protección debida a la expresión de la
de la replicación viral por las agregados de la replicasa viral (REP) o de la proteína de
cápside en la planta transgénica determina el movimiento viral (MP)
grado de resistencia mediada por la CP. Si bien La resistencia mediada por la replicasa viral
estos trabajos apoyan la hipótesis de que en es la segunda aplicación más avanzada en el
las plantas transgénicas para CP hay una inhi- uso de genes derivados del patógeno para la
bición en una etapa temprana de la infección, obtención de plantas resistentes a virus. Esta
no se puede descartar que además, la expre- resistencia fue primero demostrada en plantas
sión de proteína de cápside, impida o modifi- de tabaco que expresaban el gen de la replica-
que etapas más tardías de la infección. Si se sa de TMV (género tobamovirus) y luego ob-
injerta una porción de planta transgénica que servada para diferentes familias de virus que
muestra protección mediada por cápside entre incluyen los tobravirus, potex-, poty-, alfamo-,
una base y un ápice no transgénicos y se ino- cucumo- y luteovirus entre otros. Los genes de
cula la planta injertada en la base no transgéni- replicasa viral confieren resistencia tanto a in-
ca, se observa que el virus no puede moverse fecciones producidas por el ARN viral o por el
hacia el ápice, es decir que no puede atravesar virión y se ha demostrado que dan lugar a una
la zona transgénica protegida. Sin embargo, la resistencia muy efectiva y estable. Entre los
supresión del movimiento vascular involucra ejemplos de resistencia mediada por replicasa
también el empaquetamiento y desnudamiento viral se encuentra el uso de genes que poseen
viral, y cabe la posibilidad de que la supresión deleciones, modificaciones de secuencia, ge-
del movimiento vascular sea una consecuencia nes truncados y genes completos sin modificar.
secundaria de la inhibición del desnudamien- Existen ejemplos en los cuales la expresión de
to viral en las plantas expresando proteína de la proteína de replicasa es fundamental en el
cápside. fenotipo resistente y ejemplos en los cuales la
Otro caso muy estudiado es el del virus PVX resistencia podría ser mediada por el ARN de
de la papa. Las plantas transgénicas para la la replicasa viral por lo que se ha sugerido que
cápside de PVX resultan protegidas ante la no hay un único mecanismo involucrado en
inoculación con virus o con ARN viral. Se pos- la resistencia inducida por replicasa. Los me-

canismos de resistencia mediada por ARN se En el año 1993 se correlacionó por primera
describen más adelante en éste capítulo. vez la resistencia mediada por ARN con el fe-
Por último, la expresión de proteínas de mo- nómeno de cosupresión y se propuso que el
vimiento disfuncionales o mutantes fue reporta- ARN viral (o el endógeno en la cosupresión)
da como capaz de conferir una resistencia más era degradado en forma inducible y específi-
amplia comparada con la resistencia mediada ca por un mecanismo desencadenado por la
por CP o REP. Por el contrario, la expresión expresión del ARN del transgén. Este proceso
de proteínas MP sin modificar, por lo general, que se llamó silenciamiento post transcripcio-
aumentan la infección viral. El mecanismo pos- nal de genes (PTGS) se describió por primera
tulado en este caso implica la existencia de do- vez en plantas, pero se ha encontrado también
minios funcionales compartidos por MPs de di- en hongos (donde se denomina “quelling”) y
ferentes virus. Estos dominios podrían compe- animales como nematodos, moscas o mamí-
tir por factores celulares comunes requeridos feros (donde se denomina interferencia media-
para el movimiento y en consecuencia impedir da por ARN). Brevemente, el PTGS puede ser
el progreso de la infección de estos virus. desencadenado eficientemente por transgenes
nucleares que dan lugar a transcriptos con es-
Mecanismo de protección debida al tructura de ARN de doble cadena (ARNdc) o
desencadenamiento de resistencia que expresan altos niveles o niveles aberrantes
mediada por ARN de transcriptos. En plantas también puede ser
En 1992 se demostró, por primera vez, que desencadenado por la replicación de virus que
se podía obtener resistencia a virus mediante generalmente produce intermediarios replicati-
la expresión de un ARNm de cápside viral no vos de ARNdc por lo que se concluyó que esta
traducible, es decir no era necesaria la expre- estrategia de resistencia mediada por ARN pro-
sión de la proteína codificada por el transgén. grama un mecanismo de resistencia antiviral
A partir de entonces se publicaron numero- preexistente. Una vez desencadenado el pro-
sos trabajos profundizando la caracterización ceso, los intermediarios que contienen ARNdc
de este tipo de resistencia a virus, llamada en son reconocidos por una nucleasa específica
sentido amplio “resistencia mediada por ARN”. de ARNdc que los procesa en fragmentos de
Las plantas que muestran este tipo de resisten-
ARNs pequeños (llamados pequeños interfe-
cia presentan un fenotipo de inmunidad que se
rentes -“small interfering”- siARN) de ambas
caracteriza porque no hay replicación viral de-
polaridades y de 21 y 24 nt de longitud. A su
tectable, no hay diseminación viral dentro de la
vez, se postula que los siARN actúan como
planta y no hay síntomas debidos a la enferme-
guías para dirigir la maquinaria de degradación
dad o un fenotipo de recuperación que se ca-
de ARN contra todo aquél ARN con homología
racteriza, éste último, por una infección inicial
a la secuencia desencadenante. Un aspecto
(con producción de síntomas) seguida por un
a destacar es que el silenciamiento mediado
crecimiento posterior resistente a la infección y
por ARN es desencadenado localmente y lue-
asintomático. En cualquiera de los dos casos,
go transmitido a toda la planta vía una señal
y a diferencia de lo que ocurre en la protec-
ción mediada por la expresión de proteínas de de silenciamiento móvil. Si bien se desconoce
cápsides virales, las plantas son solamente re- por el momento la naturaleza de la señal, se
sistentes a la infección producida por virus es- postula que ésta contiene un componente de
trechamente relacionados con el virus que dio ácido nucleico que explicaría la especificidad
origen al transgén. El análisis de estas plan- de secuencia del mecanismo de degradación y
tas a nivel molecular demostró que en general un componente proteico.
contienen copias múltiples del transgén y que Utilizando los conocimientos que se fueron
si bien presentan un alto nivel de transcripción acumulando sobre el mecanismo de la protec-
en el núcleo, los niveles estables del ARNm ción mediada por ARN, se han diseñado y uti-
del transgén en el citoplasma son muy bajos. lizado construcciones genéticas que contienen
Usualmente se observa además metilación de secuencias repetidas invertidas (IR) de trans-
la región codificante del transgén. genes virales. La transcripción da lugar a lar-

gos ARNdc que son muy eficientes precurso- tas. Es interesante destacar que varios de los
res de siARNs. De esta manera se ha logrado supresores de silenciamiento virales descrip-
aumentar el porcentaje de plantas silenciadas tos habían sido previamente caracterizados
y por lo tanto la efectividad de la estrategia de como proteínas responsables de la sintomato-
resistencia mediada por ARN. Mientras que logía, del movimiento viral y/o del fenómeno de
las estrategias clásicas que utilizan construc- sinergismo en la virulencia combinada de dos
ciones con transgenes simples en orientación o más virus.
sentido o antisentido dan lugar a un 5 al 20% La posibilidad de la supresión del silencia-
de plantas transgénicas resistentes, utilizando miento por parte de un virus que coexista con
construcciones de transgenes IR se obtienen las plantas transgénicas protegidas por el me-
más del 90% de las plantas transgénicas resis- canismo de silenciamiento génico debe ser
tentes. Utilizando IRs fue posible desencade- tomada en cuenta ya que la infección de una
nar resistencia mediada por ARN en diferentes planta silenciada con un virus heterólogo que
familias de virus. Se ha demostrado previa- lleva un supresor de silenciamiento puede dar
mente que este mecanismo de resistencia no lugar a la reversión del silenciamiento tornán-
es efectivo ante virus cuya secuencia difiera en dola susceptible a la infección viral. Resulta im-
más de un 10% respecto de la secuencia del portante entonces estudiar qué virus coinfectan
transgén. Con el objetivo de obtener una resis- un mismo hospedador en condiciones natura-
tencia más amplia, se fusionaron fragmentos les y en lo posible utilizar plantas transgénicas
de 150 pb de secuencias virales pertenecien- con resistencia a ambos virus. En forma aná-
tes a cuatro tospovirus en una simple construc- loga a la estrategia descripta anteriormente es
ción IR quimérica obteniendo con esta estrate- posible diseñar construcciones incorporando
gia una alta frecuencia de plantas transgénicas distintas secuencias virales pequeñas y con-
con resistencia múltiple. servadas correspondientes a los distintos virus
Dado que el PTGS es un mecanismo de contra los que se quiere obtener resistencia.
defensa antiviral en plantas, resulta espera- Recientemente, ha surgido una variante al-
ble que se haya seleccionado en los virus de ternativa para la obtención de resistencia a
plantas la capacidad de contrarrestar a este virus mediada por ARN: el uso de microARNs
mecanismo. Congruentemente con esta espe- (miARNs). Los miARNs son ARNs endógenos
culación, se encontró que varios virus de plan- pequeños que regulan la expresión de ge-
tas codifican proteínas supresoras del PTGS. nes en plantas y animales. En plantas, estos
Luego de una búsqueda exhaustiva de supre- miARNs de 21 nucléotidos se procesan a par-
sores de silenciamiento en una gran cantidad tir de regiones de “stem loops” de transcriptos
de virus de plantas, se concluyó que práctica- primarios largos que luego se acoplan a com-
mente todos los virus llevan supresores de si- plejos de silenciamiento donde en general diri-
lenciamiento, que los genes que los codifican gen la degradación específica de ARNs men-
tienen secuencias y origen evolutivo diverso, y sajeros complementarios a una de las cadenas
que los distintos supresores actúan inhibiendo del miARN. Se ha demostrado que se pueden
el silenciamiento a distintos niveles. Algunos realizar cambios en la secuencia de 21 nt del
como la proteína HC-Pro codificada por los po- miARN sin alterar la biogénesis o la madura-
tyvirus previenen la acumulación de los siARN, ción del pre-miARN. Esto condujo a la idea de
pero no eliminan la señal móvil que propaga rediseñar miARNs de manera que tengan como
el silenciamiento. Otros supresores, como la blanco genes imprescindibles para la replica-
proteína p25 del virus PVX interfieren con la ción del virus que se desea controlar. De esta
señal de propagación sistémica, y finalmente manera se han obtenido plantas transgénicas
otros, como el codificado por el virus del acha- resistentes a virus por expresión de miARNs
parramiento del tomate (TBSV), suprimen el si- artificiales (amiARNs) en plantas. Un grupo de
lenciamiento sólo en las nervaduras. Incluso se investigadores modificó un miARN de Arabi-
han encontrado en virus animales supresores dopsis (el miR159) de manera de dirigirlo hacia
de silenciamiento que son funcionales en plan- los supresores de silenciamiento virales P69

del Turnip yellow mosaic virus y HC-Pro del sión de genes que interfieran con el ciclo de
Turnip mosaic virus y demostraron que plantas multiplicación viral (como es el caso de la cáp-
de Arabidopsis que expresan estos amiARNs side u otras proteínas virales). Esto se debe a
son respectivamente resistentes a estos vi- que la baja acumulación de ARN transgénico
rus. De manera similar, otro grupo de trabajo minimiza las posibilidades de una potencial
diseñó un amiARN basado en el miR171 de ta- recombinación homóloga con ARN de origen
baco dirigido al supresor de silenciamiento 2b viral infectante. Por otro lado, la ausencia de
del CMV y observó una correlación entre los la proteína codificada por el transgén minimiza
niveles de expresión del miARN artificial y el drásticamente el análisis de riesgo alimentario
nivel de resistencia al virus obtenido. Asimis- del OGM y evita el riesgo de transcapsidación
mo los autores compararon esta estrategia con de otros virus en el caso en que el transgén
la estrategia clásica de expresión de un “hair- codifique para la proteína de cápside viral fun-
pin” de dcARN dirigida a esta misma secuen- cional.
cia y demostraron que la estrategia basada en
el miARN artificial fue más efectiva, tanto en Resistencia a virus conferida por genes
plantas transgénicas como en ensayos de ex- no virales
presión transiente. Además de la resistencia derivada del pató-
Las ventajas de usar amiARNs con respecto geno (PDR), en los últimos años se han explo-
a usar las construcciones de dcARN que des- rado estrategias alternativas para lo obtención
encadenen silenciamiento son 1) el mecanismo de plantas transgénicas con resistencia a en-
de resistencia mediado por miRNA en general fermedades virales. Entre ellas, las más promi-
no es sensible a la temperatura (hay excepcio- sorias son la expresión de anticuerpos antivi-
nes). Se ha demostrado en cambio, que el si- rales en plantas o “plantibodies” y la expresión
lenciamiento mediado por dcARN es inhibido de proteínas que interfieren con la transmisión
a temperaturas menores a 15 ºC en Nicotiana del virus por insectos vectores. Ambas estrate-
benthamiana. 2) en el caso de los amiARNs gias se discutirán por separado más adelante.
las secuencias virales que se expresan en las Otras alternativas involucran la expresión de
plantas transgénicas son de menor tamaño que genes de resistencia contra virus en especies
en las estrategias clásicas de silenciamiento. diferentes de las cuales fueron aislados origi-
Esto es relevante dado que en las estrategias nalmente. Por ejemplo, la incorporación del
de resistencia mediada por dcARN se genera gen N de tabaco en plantas de tomate confiere
una población de siARNs con una gran can- resistencia al Tabacco mosaic virus (TMV) y la
tidad de blancos potenciales endógenos. En incorporación del gen Sw5 de tomate en plan-
cambio, en el caso de los amiRNAs los blancos tas de tabaco confiere resistencia a tospovirus.
potenciales son menores y pueden ser elegi- Otro enfoque promisorio es generar resisten-
dos a priori con precisión. Sin embargo, esta cia mediante el silenciamiento de genes de la
última característica puede al mismo tiempo planta esenciales para el ciclo de vida viral.
ser una desventaja, ya que se esperaría una En una reciente publicación, el silenciamiento
durabilidad menor ya que un cambio en unos por ARN interferente de los genes NtTOM1 y
pocos nucleótidos del virus desafiante podría NtTOM3 (esenciales para la multiplicación de
sobrepasar la resistencia desencadenada por los tobamovirus) en Nicotiana tabaccum dio
un amiARN. como resultado la inhibición de la multiplicación
Un aspecto interesante a recalcar es que del Tomato mosaic virus y otros tobamovirus,
debido a que el mecanismo de silenciamiento pero no afectó el crecimiento de las plantas.
implica una muy baja acumulación del ARN de- Otras estrategias incluyen el uso de la enzima
rivado del transgén y una nula acumulación de 2’-5’- oligoadenilasa sintetasa de mamíferos
proteínas, este tipo de estrategia resulta atrac- en plantas, y de inhibidores naturales y espe-
tiva desde el punto de vista de la evaluación de cíficos de la replicación viral como la expresión
riesgos en cuanto a la bioseguridad de estos de la proteína inactivadora de ribosomas (PAP)
OGMs, en contraposición de la sobre-expre- de Phytolacca americana (“pokeweed” en in-

glés). La expresión de PAP en plantas de papa necrotic yellow vein virus en Nicotiana bentha-
y tabaco transgénicas las protege frente a una miana y en el 2000, se mostró que la expresión
variedad de virus, ya sea que éstos fueran ino- de la cadena Fv contra la proteína de cápside
culados mecánicamente o por áfidos vectores. del virus TMV en la membrana plasmática de
En los últimos años se encontraron o redise- plantas de tabaco transgénicas, confería resis-
ñaron varios tipos menos tóxicos y formas no tencia al virus.
tóxicas de estas proteínas las que, expresadas Otra variante de la misma estrategia consis-
en plantas transgénicas, confieren resistencia te en el uso de scFvs dirigidos contra proteínas
a virus sin producir el efecto de la inactivación que no forman parte de la cápside viral y jue-
de los ribosomas. Por otro lado, se estudió la gan un rol importante en la replicación, como
actividad antiviral de la proteína IRIP (proteína la replicasa viral. Usando scFvs obtenidos con-
RIP obtenida de bulbos de iris), una ARN-N-gli- tra la RNA polimerasa dependiente de ARN
cosidasa, en plantas transgénicas de tabaco, (RdRp) del Tomato bushy stunt virus (TBSV),
observándose una reducción significativa de se obtuvieron plantas de N. benthamiana con
las lesiones producidas por el virus TMV con altos niveles de resistencia no solo contra el
respecto a las plantas control. TBSV, sino también contra otros miembros de
la familia Tombusviridae como el Red clover
Expresión de anticuerpos en plantas necrotic mosaic virus, el Cucumber necrotic
transgénicas virus y el Turnip crincle virus. Recientemente
A pesar de que las plantas no sintetizan anti- se demostró que altos niveles de expresión en
cuerpos, la expresión de anticuerpos en plantas plantas de papa de un scFv dirigido contra la
transgénicas es una estrategia prometedora proteasa NIa de PVY daba protección comple-
para obtener resistencia a virus. La conserva- ta contra PVY.
ción de la estructura y afinidad de los mismos Por lo tanto, la expresión de anticuerpos di-
hacia una determinada proteína viral sería su- rigidos contra proteínas virales esenciales ha
ficiente para interrumpir funciones esenciales e demostrado ser una alternativa interesante
impedir, en consecuencia, la replicación viral. para obtener resistencia a virus.
Para que la estrategia sea efectiva es indis-
pensable lograr altos niveles de expresión de Expresión de proteínas que interfieren
los anticuerpos en el compartimiento celular con la transmisión viral por parte de
donde ocurre la replicación viral. En los últimos insectos vectores en plantas
años se han desarrollado protocolos sencillos transgénicas
para la selección de buenos anticuerpos, que La toxina BT de Bacillus thuringiensis ha
incluyen la selección de anticuerpos monoclo- sido muy efectiva para el control de insectos
nales usando las tecnologías de hibridoma y coleópteros y lepidópteros pero hasta el mo-
genotecas utilizando la técnica de exhibición mento, no ha sido efectiva para controlar a
de epitopes en bacteriófagos o “phage display”. los insectos que se alimentan del floema que
En este sentido la obtención de bibliotecas de pertenecen al grupo de los hemípteros. Este
anticuerpos de cadena única (scFv) sintéticos, grupo de insectos, entre los que se encuentran
han impulsado la aplicación de esta estrategia. los saltamontes (“leafhoppers”) y las chicha-
En 1993 se demostró por primera vez que rritas (“planthoppers”), causan grandes daños
la expresión constitutiva de un anticuerpo de de manera directa durante su alimentación y
cadena única (scFv) dirigido contra la proteína principalmente porque son transmisores de
de cápside del Artichoke mottled crinkle virus virus. Se ha demostrado que la expresión de
causaba una reducción en la susceptibilidad al lectinas en plantas confiere resistencia a este
virus, que se ponía de manifiesto por una baja tipo de insectos. En particular, la expresión de
en la incidencia de la infección y un retraso en la lectina GNA en floema de arroz en plantas
la aparición de los síntomas. En 1996 se expre- transgénicas les confiere resistencia a la chi-
só un anticuerpo monoclonal de cadena única charrita Nilaparvata lugens que transmite entre
(scFv) contra la proteína de cápside del Beet otros a los virus Rice black streaked dwarf vi-

rus, Rice tungrovirus y Rice ragged stunt virus. teína del insecto GroEL. Se ha demostrado que
Una estrategia similar se utilizó exitosamente plantas de tomate que expresan la proteína
para controlar otro tipo de insectos como los GroEL en el floema son resistentes al virus. Se
áfidos: la expresión de ciertas lectinas de ajo espera que esta estrategia cobre mayor impor-
en el floema de Arabidopsis disminuye la capa- tancia a medida que se vayan identificando las
cidad reproductiva del áfido Myzus nicotianae. funciones de las distintas proteínas de insectos
Una estrategia alternativa para obtener plan- en su relación con la transmisión de virus.
tas resistentes a virus de manera indirecta se
basa en la utilización de proteínas insecticidas Plantas transgénicas con resistencia a
del tipo de la PAD4. Esta proteína se expresa virus cultivadas comercialmente, o en
naturalmente en altos niveles durante la infec- etapas avanzadas de experimentación
ción de Arabidopsis por el áfido Myzus persicae En los últimos años se ha autorizado el cul-
tivo comercial y consumo de una variedad de
y modula un mecanismo endógeno de defen-
plantas transgénicas con resistencia a virus
sa. La expresión de esta proteína en el floema
basada en alguno de los mecanismos descrip-
de plantas transgénicas causa la disminución
tos (Tabla 2).
del tiempo de alimentación y en el tamaño de Existe otro grupo muy importante de plan-
las poblaciones del áfido. tas transgénicas con resistencia a virus que
Una tercera estrategia se basa en la exprese encuentran en etapas avanzadas de expe-
sión de proteínas de insectos en el floema de rimentación o de pruebas piloto a campo. Es
plantas transgénicas. Por ejemplo se ha de- interesante constatar que los países en vías
mostrado que el Tomato yellow leaf curl virus de desarrollo han adoptado esta tecnología y
(TYLCV) evita su destrucción dentro de la he- trabajan activamente en la obtención de plan-
molinfa de la mosca blanca que lo transmite tas de cultivos de interés local con resistencia
mediante una interacción estrecha con la pro- a virus (Tabla 3).
Tabla 2: Plantas transgénicas con resistencia a virus autorizadas para su comercialización. (fuente AG-
Bios: http://www.agbios.com/dbase.php)
Cultivo Evento Virus Transgén Países
Ciruela C5 PPV Cápside EEUU
Papaya 55-L63-1 PRSV Cápside Canadá y EEUU
Papa RBTM21-129 PLRV Replicasa Australia, Canadá

21-350 Japón, Corea,
22-082 Filipinas, México
,
y EEUU
RBMT15-1001 PVY Cápside Australia, Canadá

SEMT15-02 Japón, Corea,
SEMT15-15 Filipinas, México
y EEUU
Zapallo ZW20 WMV, ZYMV Cápside Canadá y EEUU

CZW-3 CMV, WM
V, ZYMV Cápside Canadá y EEUU
Los acrónimos utilizados fueron: CMV: Cucumber mosaic cucumoviru s; PRSV: Papaya
ringspot potyvirus ; PLRV: Potato leafroll luteovirus ; PPV: Plum pox virus ; PVY: Potato
virus Y; WMV-2: Watermelon mosaic virus 2; ZYMV: Zuchini yellow mosaic potyvirus.

Tabla 3: Plantas transgénicas con resistencia a virus en etapas avanzadas de experimentación en labora-
torio (e), pruebas piloto a campo (c) o comercialización (co) en países en vías de desarrollo (fuente: FAO.
Bio.Dec www.fao.org/biotech/inventory_admin/dep/default.asp).
Cultivo Virus País
Ají CMV y TMV China (c)

CVbMV Tailandia (e)
Ají pimiento PVY Indonesia (e)
CMV y TMV Korea (e)
Algodón CLCV Pakistán (e)
CYDV China (e)
Vigna mungo virus India (e)
Tungro virus Malasia (e)
Arroz RRSV Tailandia (e)
RDV China (c)
RTV China (c), Malasia e Indonesia (e)
Arveja BGMV Brazil (c)
Banana BTV Filipinas (c) y Egipto (e)
Batata SPFMV Kenia (c), India y Filipinas (e)
Caña de azúcar SCMV y Yellow virus Brasil (c)
SCMV Egipto (c)
Chaucha ABMV Taila ndia (e)
AMV Ucrania (e)
FBNYV Egipto (e)
Cítricos Trist eza virus India y Cuba (e)
CPsV Argentina (e)
CVpD Indonesia (e)
Garbanzo CABMV Zimbaw e (c)
VMYMV India (e)
Maíz MSV Sudáfrica (e)
MRCV Argentina (e)
Maní PStV Indonesia (e)
IPCV India (e)
Melón CMV México y China (c)
ZYMV Egipto (c)
Nuez mocada Stri pped virus China (c)
Papa PVY Argentina , Tunez y Vietnam (e) y China (c)
PLRV Argentina (c) , Vietnam, Filipinas y Cuba (e)
PVY, PLRV Brasil y Egipto(c) , Chile , India y Colombia (e)
PVX, PVY Perú, Sudáfrica e Indonesia (e) y México (c)
Papaya PMV Bangladesh e Indonesia (e)
PRSV Malasia, Vietman, India, Indonesia y Malasia (e)
China, Brasil y México (c)
RV Filipinas (e)
RSV Cuba (c)
PRV Tailandia (e)
Pepino ZYMV Egipto (c)
CMV -CGMMV india (e)
Pimienta CMV Malasia (e)
CVBMV , pepLCV Tailandia (e)
Pimienta picante CMV y TMV República de Corea (c)
Pimienta dulce CMV China (c)
Virus R China (co)
Poroto BGMV Brasil (c)
Repollo TuMV China (c)
Ta baco TSWV y PVY Brasil (c)
PVY India (e), Republica de Corea (e)
TMV Indonesia y Rep. de Corea (e), China y México (c)
Trigo BYDV China (e)
YMV China (e)
WYDRV China (e)
Tomate Geminivirus y Tospovirus Brasil (c)
Gemi nivirus Cuba (e)
CMV Indonesia (e), México (c) y China (co)
TYLCV Tailandia, China y Egipto (e)
ToLCV India e Indonesia (e)
Uva GLRaV, GFLV, GVA, GVB Tunez (e)
Zapallo PMV, PAMV y SMV2 México (c)
ZYMN Egipto (c)
Zuchini PMV, PAMV, SMV2 y ZAMV México (c)

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V. CAPÍTULO 7 aminoácidos, azúcares y otros compuestos
químicos, que pueden ser reconocidos como
señales por los microorganismos del suelo e
Obtención de plantas resistentes
inducen en ellos una respuesta recíproca. La
a enfermedades bacterianas respuesta bacteriana puede ser muy distinta
teniendo en cuenta el tipo de interacción que
Adrián Vojnov, M. Mercedes Rivero, establece con las plantas. Así las bacterias
Diego Zappacosta. fitopatógenas pueden establecer interacciones
compatibles o incompatibles. En una relación
Introducción compatible el patógeno infecta y enferma a la
A pesar de que las plantas son en general planta; esto ocurre sólo si las condiciones am-
resistentes a las infecciones producidas por la bientales son favorables, si las defensas pre-
mayoría de los patógenos (bacterias, hongos formadas de la planta son inadecuadas, si la
y virus), cada una de ellas posee cierto grado planta falla en detectar al patógeno, e incluso
de susceptibilidad a alguno de éstos fitopatóge- si las respuestas de defensa activadas son in-
nos. El conocimiento de la interacción patóge- eficientes. En una interacción incompatible las
no-hospedador, las herramientas utilizadas por plantas resisten al ataque del patógeno. Esta
unos para atacar y los mecanismos de defensa resistencia puede ser inespecífica, a través de
para evitar las consecuencias de este ataque la denominada resistencia no hospedadora,
por los otros, son tema de estudio de diversos basal o innata, en la cual el patógeno no en-
grupos de investigación alrededor del mundo. cuentra condiciones favorables para infectar, o
Conocer los factores de virulencia utilizados bien porque la planta presenta barreras estruc-
por las bacterias fitopatógenas y su mecanismo turales adecuadas o sintetiza compuestos tóxi-
de acción, es importante para el desarrollo de cos que impiden la proliferación y colonización
plantas resistentes a enfermedades. Por otro de la bacteria. La relación incompatible, y por
lado, profundizar los conocimientos sobre los lo tanto la resistencia, puede ser debida tam-
mecanismos de defensa vegetal, permite pla- bién a un reconocimiento específico. En este
near estrategias en el diseño de cultivos mejor caso existe una base genética definida. Se
adaptados al medio, ya sea incrementando la trata de la presencia de genes de resistencia
resistencia innata o a través de la introducción dominantes en el hospedador que le permiten
de genes de resistencia heterólogos. reconocer genes de avirulencia del patógeno.
Este capítulo es una breve reseña sobre las En los años 40 del siglo pasado, Harold H. Flor
principales bacterias responsables de enferme- propuso el modelo “gen a gen” (ver Figura 1).
dad en plantas, sus herramientas o factores de Dicho modelo establece que la resistencia se
virulencia, su regulación, y otras estrategias im- produce cuando la planta expresa un gen de
portantes que utilizan durante el proceso infec- resistencia dominante (R, proteína R) y el pa-
tivo. Las distintas estrategias biotecnológicas tógeno un gen de avirulencia dominante com-
para la producción de plantas resistentes, ya plementario (Avr, proteína Avr). Esta respues-
sea aquellas que ya se encuentran en el cam- ta defensiva está frecuentemente asociada a
po, como otras en desarrollo o de potencial utili- una Respuesta Hipersensible (HR; del inglés
zación, también son presentadas en el capítulo. Hypersensitive Response), que se caracteriza
por una necrosis rápida y localizada en res-
Tipos de interacción planta-bacteria puesta al ataque del patógeno. Es decir, frente
Las plantas, como todos los organismos vi- a la invasión de tejidos vegetales por un mi-
vientes, interactúan con el medio ambiente y croorganismo foráneo, la respuesta defensiva
en él con otros organismos, entre ellos se en- inducible más temprana es la muerte celular
cuentran las bacterias. Ambos organismos, controlada. Esta reacción HR ocurre aproxi-
bacterias y plantas, intercambian señales, es- madamente 24 horas después de que la planta
tableciendo una especie de diálogo. Las célu- percibe un patógeno potencial. Se trata de un
las vegetales emiten secreciones conteniendo fenómeno conocido desde hace varios dece-

aspectos genético-moleculares son Agrobacte-
rium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas.
Estos organismos pueden ser cultivados en
el laboratorio, y pueden inocularse fácilmente
en plantas para realizar estudios de fitopato-
genicidad. Por otro lado, las bacterias Gram-
positivas, como Clavibacter, Curtobacterium y
Rhodococcus, son más difíciles de manejar en
condiciones controladas.
Erwinia chrysanthemi, E. carotovora, E.
amylovora y otras 15 especies, son las cau-
santes de pudriciones blandas debido a su
capacidad para producir grandes cantidades
de enzimas pectolíticas, capaces de macerar
tejido parenquimatoso de un amplio rango de
especies.
Pseudomonas syringae se clasifica en alre-
Figura 1. Modelo gen por gen. La figura muestra dedor de 45 patovariedades y puede infectar
las combinaciones de genes involucradas en distin- un amplio rango de especies. Entre ellas: P.
tas interacciones de resistencia/enfermedad entre syringae pv. phaseolicola infecta el fríjol cau-
un patógeno y su hospedador. En los años 40 del sando la enfermedad conocida como “tizón de
siglo pasado, Harold H. Flor propuso este modelo halo”;y, P. syringae pv. tomato produce la “man-
que establece que la resistencia se produce cuando cha negra” del tomate.
la planta expresa un gen de resistencia dominante Ralstonia (formalmente Pseudomonas) sola-
(R) y el patógeno un gen de avirulencia dominante nacearum es una bacteria de suelo que colo-
complementario (Avr). Este modelo explica los ca-
niza el floema de una amplia gama de plantas
sos de compatibilidad de incompatibilidad planta-
patógeno
huésped, causando entre otras la podredum-
bre parda de la papa.
El género Xanthomonas esta constituído por
20 especies que atacan a más de 350 vegeta-
nios, que comparte características generales les. En particular Xanthomonas axonopodis pv
con la apoptosis o muerte celular programada. citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis
El objetivo final es aislar al invasor en la zona de los cítricos, enfermedad que por los daños
donde se ha detectado la penetración del mi- que produce, ha adquirido una importante so-
croorganismo patogénico. cioeconómica trascendente en los países pro-
Luego de una HR, la planta adquiere resis- ductores de cítricos. Por otra parte, Xanthomo-
tencia en tejidos distales al sitio primario de in- nas campestris pv campestris, es el patógeno
fección. Esta resistencia, que protege a toda la causante de la pudrición negra en crucíferas,
planta, es conocida como Resistencia Sistémi- entre ellas Arabidopsis, y constituye un modelo
ca Adquirida (SAR; Systemic Acquired Resis- de interacción planta-patógeno muy estudiado.
tance). Otros géneros de bacterias fitopatógenas
son Agrobacterium, Rhodococcus, Spiroplas-
Principales bacterias fitopatógenas: ma, Xylella y Streptomyces. Xylella fastidiosa,
Las bacterias fitopatógenas capaces de ines la causante de la clorosis variegada de los
fectar y desarrollar enfermedades en un gran cítricos, y fue la primera bacteria fitopatógena
número de especies vegetales de importancia cuyo genoma fue secuenciado totalmente.
económica, pertenecen a un reducido grupo Las bacterias del género Streptomyces son
de géneros. Los géneros de bacterias Gram- procariontes filamentosos Gram-positivos que
negativas más estudiados desde el punto de producen esporas como principal mecanismo
vista de su biología, impacto fitopatológico y de dispersión. Sólo unas pocas especies entre

las 400 descriptas son patógenas de plantas. estos incluyen proteínas efectoras secretadas
Las especies de Streptomyces fitopatógenas por el SST-III, pero también exopolisacáridos y
causan enfermedades a nivel de órganos y fitotoxinas, han sido reseñadas en la literatura.
estructuras subterráneas de diversas especies Entre los efectores descriptos, el AvrPtoB es
vegetales. Por ejemplo, Streptomyces scabies uno de los mejores caracterizados. La proteí-
causa la sarna de la papa (escaras a nivel de na R Pto es una serina/treonina quinasa de to-
los tubérculos). mate que confiere resistencia a Pseudomonas
La adecuada identificación de las especies, syringae, que expresen la proteína AvrPto. Pto
subespecies y patovariedades de bacterias es y AvrPto interactúan físicamente, y esta inte-
fundamental, y de gran interés en el marco de racción es necesaria para la activación de la re-
estudios epidemiológicos y de impacto am- sistencia. Se ha demostrado que la deposición
biental o ecológico. En la actualidad, existen de calosa constituye un mecanismo defensivo
herramientas genéticas y moleculares que se en plantas. En ausencia de Pto, AvrPto actúa
suman a la tradicional caracterización fenotípi- suprimiendo dicho mecanismo, permitiéndole a
ca de las diferentes bacterias. Entre ellas, se la bacteria una sustancial multiplicación en el
encuentran la secuenciación de ADN, la hibri- tejido vegetal. Por otro lado, AvrPtoB suprime
dación ADN-ADN, el análisis de isoenzimas y la muerte celular programada iniciada por Pto
los marcadores moleculares. pero también aquella iniciada por otras proteí-
nas R, alterando la respuesta inmune vegetal.
Factores de virulencia bacterianos Otro ejemplo similar a los mencionados ante-
Las bacterias fitopatógenas han desarrolla- riormente, esta dado por HopM1. La proteína
do una serie de compuestos que contribuyen a HopM1 es un efector producido por Pseudo-
los fines de invadir y colonizar los respectivos monas syringae, Erwinia amylovora y Pantoea
hospedadores. Estos compuestos o factores stewartii subsp. stewartii y que también modifi-
de virulencia, determinan la patogenicidad y el ca la respuesta de defensa.
grado de virulencia del patógeno. Dependiendo Otros efectores producidos por Pseudo-
de la interacción planta-bacteria, las bacterias monas syringae pv. phaseolicola, VirPphA,
producen factores, algunos de los cuales son AvrPphC y AvrPphF, previenen la detección del
comunes y otros específicos para cada interac- patógeno por parte del hospedador, mediante
ción patógeno-hospedador. distintos mecanismos, entre ellos: inhibición de
Muchos de estos factores son proteínas que la expresión del gen avr, bloqueo de la secre-
inyectan directamente en la célula hospedado- ción de la proteína Avr, interferencia entre el
ra (proteínas efectoras) a través del sistema de Avr y la proteína R, o supresión en el camino
secreción tipo III (SST-III), un sistema común de señalización de la respuesta de defensa río
entre las bacterias patógenas tanto de plan- abajo al reconocimiento del Avr.
tas como animales, y que se induce cuando la Las cepas virulentas de Pseudomonas syrin-
bacteria toma contacto con el hospedador. La- gae producen diversas toxinas como: corona-
mentablemente para el agente patógeno, estas tina, faseolotoxina, tagetitoxina, tabtoxina, si-
proteínas son moléculas ideales para ser reco- ringomicina, siringotoxina, etc. La toxina coro-
nocidas por el sistema de defensa de la planta natina, promueve la virulencia de P. syringae
(modelo gen a gen): a través de las proteínas actuando como un análogo del jasmonato y
de resistencia (proteína R) la planta puede "re- posee la capacidad de inducir susceptibilidad
conocer" la presencia de determinada proteí- en Arabidopsis thaliana.
na efectora (proteína Avr), desencadenando la Diversas enzimas extracelulares son im-
respuesta hipersensible (HR). portantes factores de virulencia, ya que en
Algunos de los factores de virulencia han su ausencia, la virulencia del patógeno dismi-
sido caracterizados recientemente como supre- nuye considerablemente. La secreción de un
sores de la respuesta de defensa vegetal y le amplio rango de enzimas capaces de degra-
permiten a la bacteria promover su crecimiento dar componentes de la pared celular de plan-
y difusión dentro del tejido vegetal. Varios de tas vasculares y otros componentes celulares,

tienen un papel importante en enfermedades y funcional que se denomina comúnmente bio-
bacterianas como las podredumbres blandas película o biofilm.
y también en bacterias que causan necrosis o Se ha podido observar una relación directa
marchitamiento vascular. Entre éstas podemos en la capacidad de producir biofilms y la viru-
mencionar enzimas pectolíticas, celulasas, lencia de estas bacterias. Los biofilms son es-
proteasas, glicanasas, poligalacturonasas y tructuras importantes en el desarrollo bacteria-
esterasas. La posesión de dichas enzimas ga- no y podrían ser un blanco muy apropiado para
rantiza una puerta de entrada a la planta o una contrarrestar las enfermedades producidas por
vez adentro, la provisión de nutrientes para su éstas en los respectivos hospedadores.
multiplicación. Entre las ventajas que le proporciona a la
Las bacterias producen una enorme varie- bacteria poseer la capacidad de desarrollar
dad de polisacáridos constituidos por diversos un biofilm, podemos mencionar: protección
azúcares. Los exopolisacáridos (EPS) pueden del medio ambiente; mayor disponibilidad de
estar asociados a la membrana externa for- nutrientes; cooperación entre especies (micro-
mando capsulas o ser liberados en el medio consorcio; sintrofismo), y adquisición de nue-
extracelular. Estos EPS han sido involucrados vas características genéticas
en patogenicidad conjuntamente con otros La formación de biofilms requiere de la ca-
(glucanos cíclicos) y como ocurre también con pacidad de las bacterias de unirse a distintas
las enzimas antes mencionadas están someti- superficies, en particular el tejido vegetal. Para
dos a una compleja red de regulación. lograr esta asociación, las bacterias utilizan
Los EPS que han sido implicados en la inte- diversas moléculas, entre ellas los EPS y las
racción con el hospedador, facilitarían la dise- proteínas de superficie, siendo las funciones
minación del patógeno mediante mecanismos de motilidad importantes para el desarrollo de
que en algunos casos ya se han dilucidado. El estas estructuras tridimensionales. La expre-
xantano, que es el polisacárido más importante sión de los genes involucrados en la síntesis
producido por todas las Xanthomonas, actúa de estas moléculas de adhesión, así como
suprimiendo la defensa local siendo esta ac- otros factores de virulencia, están regulados
tividad dependiente de estructura del mismo. por mecanismos dependientes de la densidad
El xantano suprime el engrosamiento de la pa- celular.
red celular de la célula vegetal inducido por el
ataque del patógeno (deposición de calosa), Regulación de factores de virulencia y
mediante el secuestro de iones calcio e interfi- biofilm en bacterias fitopatógenas
riendo con el camino de señalización que lleva La formación de biopelículas bacterianas es
a la activación de la calosa sintetasa. un proceso muy regulado. Cada especie res-
En el caso de Agrobacterium, un patógeno ponde a sus propias señales ambientales a
que desarrolla tumores en la planta hospeda- través de un conjunto de mecanismos mole-
dora, las hormonas vegetales son importantes culares. A pesar de esta gran diversidad, hay
factores de virulencia que el microorganismo un sistema conservado de regulación que res-
produce: auxinas y citoquininas. La auxina ponde a varios estímulos que son importantes
principal producida es el ácido indolacético que para la asociación entre bacterias y plantas. El
modula el tiempo de incubación de la enferme- sistema de regulación de la formación de bio-
dad. Las citoquininas que se producen son va- film, al igual que algunos factores de virulencia,
rias (derivados de la zeatina) y determinan el en particular las enzimas extracelulares y los
tamaño del tumor. EPS, son dependientes del número de bacte-
rias presentes, o del mecanismo comúnmente
Organización en comunidades (biofilm), denominado quórum sensing.
una estrategia bacteriana durante la El fenómeno de quorum sensing fue recono-
interacción con la planta hospedadora cido en la decada de los 60 en estudios reali-
Las bacterias no viven aisladas sino que for- zados con la bacteria Vibrio fischeri. Esta bac-
man una comunidad estructurada, coordinada teria marina bioluminiscente, produce luz sólo

cuando hay una gran cantidad de bacterias quorum sensing, las proteínas I y R juegan un
presentes. Se observó que la luminiscencia rol central. La célula bacteriana (en gris) con-
se producía por acumulación de un activador tiene una proteína I que es responsable de la
o molecula “autoinductora”. Esta molécula es síntesis de moléculas difusibles (en verde) de
producida por la bacteria y activa la luminiscen- acil homoserin lactonas (A-HSLs), que actúan
cia cuando alcanza una determinada concen- como señalizadoras. A una alta concentración
tración crítica. Las bacterias son capaces de celular, las moléculas señalizadoras interac-
censar su densidad de población a través de túan con la proteína R. La interacción con la
la detección de esta molécula autoinductora. Al misma induce un cambio conformacional que
mecanismo del censado de la densidad celular aumenta su afinidad por determinadas secuen-
se lo llamó quorum sensing y la molécula ac- cias de ADN (secuencias lux) presentes en las
tivadora producida por V. fischeri fue aislada regiones promotoras de los genes regulados
en el año 1981, siendo identificada como una por acil homoserin lactonas.
N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lactona. Uno de los sistemas de quórum sensing me-
El quorum sensing es un proceso relativa- jor estudiados es el de Ralstonia solanacea-
mente simple. Las acil-homoserin lactonas rum. Esta bacteria produce el exopolisacarido I
(HSL) son sintetizadas a un nivel basal por (EPS I) y otros factores de virulencia que están
las acil-HSL sintasas (generalemente homólo- regulados a través de una red sensorial. Para
gas a las proteínas tipo LuxI de V. fisheri). Las lograr la expresión diferencial de sus genes,
moléculas de acil-HSLs sintetizadas son rápi- R. solanacearum utiliza esta compleja red de
damente liberadas por las células bacterianas cascadas regulatorias que censan los cambios
por difusión. El incremento en el tamaño de la ambientales y gatillan cambios en la expresión
población bacteriana eleva la concentración de génica. Los componentes de la red son, en
las acil-HSLs. A niveles elevados de concen- su mayoría, reguladores del tipo de dos com-
tración, las acil-HSLs interactúan con un factor ponentes (sensor-regulador). Estos sistemas
de transcripción (homólogo a la proteína LuxR presentan un dominio sensor en el extremo
de V. fisheri) que modula la expresión de los N-terminal que puede unir señales específicas
genes regulados por quorum sensing. del medio extracelular y un dominio quinasa
Como se muestra en la Figura 2, en la re- citoplasmático que dispara la fosforilación del
gulación de factores de virulencia a través de componente regulador. La fosforilación acti-
Figura 2. Quórum sensing. Modelo simplificado de la transducción de señales en quórum sensing, QS.
Los microorganismos censan sus poblaciones a través de un sofisticado mecanismo de comunicación ce-
lular. Cuando la densidad celular alcanza un determinado umbral se dispara la expresión de determinados
genes. Este tipo de regulación que controla diversas funciones biológicas, entre ellas las de virulencia, es
conocido como autoinducción o quorum sensing. Las moleculas señallizadoras esenciales de este sistema
son la acil-homoserin lactonas (acil-HSL).

va el dominio de unión a ADN presente en la la planta de manera inespecífica dirigiendo una
región C-terminal de esta proteína, convirtién- respuesta general, o bien pueden ser detec-
dola en un activador transcripcional de los ge- tadas específicamente por el producto de los
nes blancos. En R. solanacearum la densidad genes de resistencia (R). Las primeras son mo-
celular es censada mediante el éster metílico léculas presentes en la superficies de la ma-
del ácido 3-hidroxi palmítico (3-OH.PAME). Un yoría de las bacterias fitopatógenas, como el
nivel elevado de 3-OH.PAME induce la produc- lipopolisacárido (LPS) en la membrana externa
ción de EPS I y de algunas exoenzimas. Estos de las bacterias Gram-negativas, o la flagelina,
factores de virulencia promueven el ataque de componente estructural del flagelo. El conjunto
la bacteria. de estas moléculas se conoce como patrones
En Xanthomonas camprestris pv campestris moleculares asociados a patógenos (PAMPs).
(Xcc), un patógeno que afecta crucíferas, la El reconocimiento específico, como se mencio-
producción de las enzimas extracelulares y de nó en secciones anteriores, involucra la inte-
EPS está regulada por el grupo de genes rpf racción del producto de un gen de Avr del pató-
(regulación de los factores de patogenicidad), geno y el producto de un gen de R de la planta.
compuesto por 9 genes (rpfA-I). Los genes En cualquiera de los casos (reconocimiento es-
rpfB y rpfF están implicados en la regulación pecífico o inespecífico), la respuesta de la plan-
mediada por pequeñas moléculas difusibles ta está constituida por una serie de eventos. En
denominadas DSF (del inglés diffusible signal primer lugar, a través de la membrana plasmá-
factor), las cuales actuarían como comunica- tica se produce un rápido intercambio de iones
doras intercelulares. con el medio extracelular. De esta forma, se
incrementa la concentración intracelular de H+
Genómica y bacterias fitopatógenas y Ca2+, mientras disminuye la de Cl- y K+. Este
Para las bacterias fitopatógenas la era genó- intercambio de iones es un prerrequisito para
mica comenzó oficialmente con la publicación la activación de las proteín quinasas activadas
de la secuencia del genoma de Xylella fastidio- por mitógenos (MAPK; mitogen-activating pro-
sa, el agente causal de la clorosis variegada de tein kinase) y de la generación de especies de
los cítricos. Utilizando programas de predicción oxígeno reactivas (ROS; reactive oxygen spe-
de secuencias se han encontrado en el geno- cies) a través de una NAD(P)H oxidasa asocia-
ma de esta bacteria (de más de 2,5 millones de da a membrana. Una vez activadas las MAPK,
pares de bases) unos 2.900 genes. Además de algunas son traslocadas al núcleo y otras son
X. fastidiosa, ya se han secuenciado los geno- rápidamente fosforiladas y desfosforiladas. Fi-
mas de cepas representativas de la mayoría de nalmente, se produce la inducción transcripcio-
los grupos taxonómicos que contienen bacte- nal de un considerable número de genes en la
rias fitopatógenas de importancia. Entre ellos, célula vegetal, entre ellos los de las proteínas
varias especies del género de Xanthomonas y relacionadas a la patogenicidad (PR; pathoge-
Pseudomonas Para conocer el estado actual nicity related proteins) y los genes involucrados
de la secuenciación de genomas en bacterias en la biosíntesis de fitoalexinas (metabolitos
fitopatógenas se puede consultar la base de secundarios lipofílicos de bajo peso molecular
datos GOLD (ver Lecturas Recomendadas) y con actividad antimicrobiana).
donde se encuentra una lista actualizada de
los proyectos de secuenciación. Estrategias biotecnológicas para la
obtención de plantas resistentes a
La planta y su sistema defensivo bacterias fitopatógenas
Los mecanismos moleculares implicados en - Interferencia con los factores de virulencia
el desencadenamiento de una respuesta de- Uno de los caminos empleados para neutra-
fensiva en plantas, involucran el reconocimien- lizar patógenos bacterianos es la alteración de
to por parte de éstas de señales derivadas del la expresión de sus factores de virulencia, con-
patógeno. Estas señales o moléculas presen- trolados a través del mecanismo de quórum
tes en el patógeno pueden ser reconocidas por sensing (estrategia de quórum quenching, QQ,

Figura 3). Consiste en interferir en la comuni- bacterianos. Así, algunas cepas de B. subtilis
cación entre bacterias a nivel de la generación producen enzimas que degradan el xantano,
de la señal: por ejemplo la inhibición de la sín- polisacárido producido por todas las bacterias
tesis, la transferencia de estas moléculas señal del género Xanthomonas.
o de sus precursores. Otros niveles de interfe- Además, se han identificado otras especies
rencia son el transporte y la recepción de la se- del género Bacillus que producen acilhomose-
ñal. Estrategias alternativas se relacionan con rina lactonasas (acil-HSLasa). Estas enzimas
la degradación de las acil-HSL o con la utiliza- inactivan las HSLs mediante la hidrólisis de su
ción de moléculas que las imitan (provenientes enlace lactona. Diversas cepas de Bacillus,
de microorganismos o plantas). Algunos de es- mediante el gen aiiA, sintetizan acil-HSLasa.
tos compuestos han sido recientemente carac- Este gen se expresó en plantas de Nicotiana
terizados, por ejemplo las furanonas que son tabacum y Solanum tuberosum y se evaluó su
metabolitos secundarios producidos por el alga efecto en ensayos de infección con Erwinia ca-
roja Delinea pulcra, y que presentan una alta rotovora. A partir de inoculaciones de hojas de
homología estructural con las HSLs. tabaco y tubérculos de papa con esta bacteria,
Por otra parte, se han identificado distintas se observó que la expresión de la enzima in-
especies del género Bacillus como fuente im- terfería con la patogenicidad incrementando la
portante de genes que codifican enzimas ca- resistencia vegetal a la infección.
paces de degradar factores de virulencia o mo- Otra estrategia, enfocada a la alteración
léculas que actúan en su regulación, por ejem- de la expresión de los factores de virulencia,
plo, enzimas capaces de degradar polímeros consistió en la introducción del gen expI de E.
Figura 3. Quorum quenching. Diferentes estrategias pueden utilizarse para interferir la comunicación
entre células bacterianas. Existen diferentes mecanismos que afectan la regulación por acil-HSL. Existen
mecanismos bioquímicos que interfieren en la comunicación entre bacterias a nivel de la generación de
la señal: por ejemplo la inhibición de la síntesis o de la transferencia de estas moléculas señal o de sus
precursores. Existen además posibles interferencias en el transporte y en la recepción de la señal. Otras
estrategias de interferencia a la comunicación entre células bacterianas se relacionan con la degradación
de las acil-HSL. Algunos microorganismos son capaces de sintetizar compuestos que imitan a las acil-HSL
con el objeto de interferir la comunicación entre otras especies y competir con ellas por nichos ecológicos.

carotovora. Este gen que codifica la enzima lares con dominios de unión de nucleótidos y
responsable de la síntesis de oxoacil-homo- secuencias repetidas ricas en leucinas (NB-
serina lactona (OHLs) se introdujo en plantas LRR; nucleotide-binding/leucine-rich repeat) y
de Nicotiana tabacum. La presencia de OHLs con un dominio N-terminal variable, donde se
en la planta al inicio del curso de la infección observan motivos TIR (Toll-like receptor) o CC
bacteriana indujo la expresión temprana de ge- (coiled coil).
nes de virulencia del patógeno. Esta expresión Un ejemplo de expresión heteróloga de un
temprana desencadeno una respuesta rápida gen R es la introducción del gen Bs2 de pi-
de defensa que le permitió contrarrestar la in- miento en plantas de tomate. Dicho gen con-
fección. fiere resistencia a cepas de Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria (Xcv) que contienen
- Introducción de genes de resistencia el gen de avirulencia avrBS2. Dado que diver-
Uno de los casos mas exitosos en el control sas patovariedades de X. campestris poseen
de enfermedades bacterianas es el del tizón el gen avrBS2, se estima que el gen Bs2 de
bacteriano del arroz causado por Xanthomo- pimiento podría conferir resistencia estable a
nas oryzae pv. oryzae. En este patosistema el campo a otras especies de plantas. Se obtu-
estudio de la interacción patógeno-hospedador vieron plantas transgénicas de tomate que ex-
permitió desarrollar una estrategia para com- presaban el gen de resistencia BS2. Para de-
binar genes específicos de manera de obtener terminar el efecto de la expresión del gen, se
una resistencia duradera. El Xa21 es el primer midió el crecimiento de cepas isogénicas de X.
gen de resistencia de arroz caracterizado. La campestris pv vesicatoria conteniendo o no el
proteína codificada por este gen posee un do- gen de avirulencia avrBS2. Se inocularon plan-
minio de serina/treonina quinasa y es capaz tas de tomate transgénicas y no transgénicas
de autofosforilarse en varios sitios en el curso con ambas cepas. Sólo se observó resistencia
de una interacción incompatible. Xa21 confiere en aquella planta transgénica BS2 inoculada
resistencia a la mayoría de las razas de Xan- con las bacterias que portaban el gen avrBS2.
thomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Otro de los
genes de resistencia, aislados de arroz y que - Expresión de genes antimicrobianos de
confiere resistencia a Xanthomonas oryzae pv. diverso origen
oryzae, es el gen Xa26. Si bien ambos genes
codifican proteínas muy similares, el Xa26 con- Péptidos antimicrobianos:
fiere resistencia tanto en plantas jóvenes como Entre los compuestos antibacterianos más
adultas; mientras que Xa21 sólo tiene efecto difundidos y de mayor espectro de acción se
en plantas adultas, lo que sugiere que estaría encuentran los péptidos antimicrobianos. La
regulado por genes involucrados durante el de- amplia distribución de este tipo de moléculas
sarrollo de la planta. Esta táctica de manipula- en los reinos animal y vegetal sugiere que han
ción y expresión de genes R es la más utilizada cumplido un rol fundamental en la evolución
tanto en mejoramiento clásico como con trans- de estos organismos multicelulares complejos.
génicos. La mayoría de los péptidos antimicrobianos
El descubrimiento de genes R en diferentes presentan una estructura antipática en forma
cultivos como cebada, maíz y tomate se ha de α-hélice, en la que diferentes aminoácidos
acelerado notablemente debido al desarrollo catiónicos e hidrofóbicos se organizan espa-
de las técnicas de mapeo, aislamiento y se- cialmente en sectores discretos de la molécu-
cuenciación. Son interesantes las similitudes la. Los péptidos lineales como la cecropina y
halladas en la estructura de las proteínas R la magainina sólo adoptan esta conformación
en especies de plantas mono y dicotiledóneas, una vez que se insertan en la membrana.
lo que evidencia que los sistemas defensivos Los péptidos antimicrobianos actúan frente
han sido conservados durante la evolución a los microorganismos en forma específica. La
y diversificación de las plantas. Los genes R base de esta especificidad está determinada
más comunes, codifican proteínas intracelu- por la naturaleza diferencial de la membrana

de las células bacterianas y las células anima- Sarcophaga peregrina por un grupo de cientí-
les o vegetales. En las bacterias, la membrana ficos de la Universidad de Tokio (Japón). Este
se organiza de forma tal que la gran mayoría péptido posee 39 aminoácidos y pertenece al
de fosfolípidos con carga negativa permanece grupo de las cecropinas, con actividad lítica y
expuesta al medio externo. En el caso de las antibacteriana contra muchas bacterias Gram-
células de mamíferos y de plantas, la membra- positivas y negativas. En estudios in vitro, la
na presenta sólo lípidos sin carga neta hacia el sarcotoxina ha resultado altamente eficiente en
exterior, mientras que os lípidos con carga ne- la inhibición del crecimiento de algunas bacte-
gativa se disponen hacia el interior de la célula, rias fitopatógenas tales como Xanthomonas
es decir, hacia el citoplasma. Por esta razón, axonopodis pv. citri. Se ha comprobado que la
los péptidos con carga positiva se unen elec- expresión de sarcotoxina en plantas de taba-
trostáticamente con los lípidos de carga nega- co, bajo el control de un promotor constitutivo,
tiva presentes en la cara externa de la mem- aumenta la resistencia de estas plantas a dos
brana bacteriana, pero no interactúan con los bacterias fitopatógenas: Pseudomonas syrin-
lípidos que constituyen las membranas de las gae pv. tabaci y Erwinia carotovora subsp. ca-
células superiores. El modelo Shai-Matsuzaki- rotovora.
Huang (Figura 4) grafica el mecanismo de ac-
ción de los péptidos antimicrobianos. Expresión de enzimas líticas del tipo
Se han expresado en plantas diferentes ti- lisozimas:
pos de péptidos antimicrobianos. Entre ellos Estas enzimas catalizan la hidrólisis de la
la sarcotoxina que es un péptido aislado origi- mureína, un constituyente de la pared celular
nalmente a partir de la hemolinfa de larvas de bacteriana. Las lisozimas se localizan en las
Figura 4. Modelo de Shai-Matsuzaki-Huang. Se representa un péptido con su estructura en α-hélice. A:

reconocimiento de la membrana bacteriana por parte de los péptidos. B: inserción del péptido a la membra-
na mediada por la atracción electrostática de cargas; adelgazamiento de la capa externa de la membrana;
se generan tensiones en la bicapa (flechas). C: formación de poros en la membrana. D: transporte de pép-
tidos y lípidos a la capa interna de la membrana. E: acción de los péptidos sobre “blancos” intracelulares
(en algunos casos). F: colapso de la membrana bacteriana y ruptura de la célula. Los lípidos representados
en amarillo poseen carga negativa. Los lípidos representados en negro no poseen carga neta.

vacuolas de numerosas especies vegetales primera fitoalexina aislada y caracterizada fue
por lo que entran en contacto con las bacterias la pisantina (se aisló en 1960 a partir de las vai-
fitopatógenas una vez que éstas han produci- nas de Pisum sativum). Se trataba de un isofla-
do la lisis o ruptura de la célula vegetal. Pocas vonoide pterocarpano. La naturaleza química
lisozimas vegetales han sido caracterizadas y de las fitoalexinas cubre prácticamente todo el
clonadas, por lo que se han buscado lisozimas espectro químico de los productos naturales.
de otros orígenes para ser expresadas en plan- Recientemente se ha logrado la síntesis cons-
tas transgénicas, como las del bacteriófago T4 titutiva de glucósidos del isoflavonoide daid-
(los bacteriófagos son virus que infectan a las zeína, un miembro de las fitoalexinas del tipo
bacterias) y la del huevo de gallina. El gen de la pterocarpano, en células de maiz, a través de
lisozima del bacteriófago T4, uno de los miem- la introducción de la enzima isoflavona sintasa
bros más activos de esta familia de enzimas de Glycine max.
bacteriolíticas, ha sido expresado en plantas
de Solanum tuberosum. Las plantas transgéni- Lecturas recomendadas:
cas obtenidas fueron infectadas con la bacteria
fitopatógena Erwinia carotovora susp. atrosep- Agrios GN. 2004. Plant Pathology. Elsevier
tica bajo condiciones de laboratorio e inverná- Inc.,Oxford, UK
culo. Usando una alta presión de infección, se Collinge DB., Lund OS. and Thordal-Christensen
H. 2008. What are the prospects for genetically
observó una reducción significativa en la ma-
engineered, disease resistant plants?. European
ceración de los tejidos infectados. También se Journal of Plant Pathology, 121, 217-231.
comprobó que la capacidad de brotación de los Gurr SJ. and Rushton PJ. 2005. Engineering plants
tubérculos transgénicos desafiados con el pa- with increased disease resistance: what are we
tógeno resultó sumamente disminuída. going to express?. Trends in Biotechnology, 23,
275-282.
Expresión de tioninas: Loh J., Pierson EA., Pierson LS., Stacey G. and
Las tioninas son polipéptidos ricos en cisteí- Chatterjee A. 2002. Quorum sensing in plant-
nas, presentes en el endosperma y en las ho- associated bacteria. Current Opinion in Plant
jas de los cereales, cuya acción no específica Biology, 5:1369-1375.
Vojnov AA., Dow JM. and Bouarab K. 2007.
se basa en la permeabilización de las membra-
Recent progress in understanding the roles of
nas celulares. DSF-regulated virulence factors in Xanthomonas
Como ejemplo, las secuencias codificantes campestris pathogenicity. Pest Technology, 1,
de α-tioninas de cebada y trigo se transforma- 117-126.
ron en plantas de tabaco. Se seleccionaron las Genomes OnLine Database (GOLD): www.
líneas transformadas y se las desafió en en- genomesonline.org
sayos de inoculación con bacterias fitopatóge-
nas (Pseudomonas syringae pv. tabaci 153 y
P. syringae pv. syringae). Se comprobó que las
plantas transgénicas que expresaban el gen de
la α-tionina presentaban menor proporción de
lesiones necróticas, en comparación con las
plantas no transgénicas.
Síntesis de fitoalexinas:
Entre las estrategias tendientes a incre-
mentar el sistema defensivo de las plantas
se incluye la síntesis de fitolexinas, lo que ge-
neralmente involucra la modificación de vías
biosintéticas complejas. Las fitoalexinas son
compuestos químicos sintetizados por la plan-
ta en respuesta a una invasión microbiana. La

V. CAPÍTULO 8 completos (por ejemplo, la pirosecuenciación),
la posibilidad de evaluar los cambios en la ex-
presión génica a gran escala y el desarrollo de
Aproximaciones biotecnológicas la bioinformática, ha tenido un gran impacto en
para un manejo sustentable del la generación de estos conocimientos. Otras
estrés fúngico en la agricultura fuentes que aportan también al desarrollo de
la biotecnología asociada al mejoramiento ge-
Juan Carlos Díaz Ricci; Ursula Tonello; nético vegetal son los marcadores moleculares
Gustavo Martínez-Zamora; Sergio Salazar; de interés agronómico que se tratan en otros
Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; capítulos de este libro.
Carlos Grellet; Paula Filippone; En este capítulo, nuestro objetivo es dar una
Alicia Mamani; Marta Ontivero; y breve introducción de los principales hongos
Atilio Pedro Castagnaro causantes de enfermedades de plantas culti-
vadas, describir los mecanismos por los cua-
les los patógenos fúngicos pueden acceder a
INTRODUCCIÓN los tejidos vegetales y una vez establecidos en
La relación entre las plantas y los hongos se ellos, las tácticas que usan para su nutrición.
remonta a hace alrededor de 400 millones de Además se analizan brevemente las reacciones
años, ya que hay evidencias de que el estable- de defensa que pueden desarrollar las plantas
cimiento de las primeras plantas sobre la su- frente a este ataque, y finalmente, comentar el
perficie de la tierra fue facilitado por la interac- aprovechamiento de este conocimiento para
ción con hongos simbióticos. Esta asociación generar algunas estrategias biotecnológicas
mejoró la capacidad de la planta para la adqui- que permitan mejorar la agronomía de los cul-
sición de nutrientes y le permitió su adaptación tivos respecto del control sustentable o mejor
a los cambios del medioambiente. A lo largo de dicho, del manejo eficiente y eco-sistémico (se
la evolución, la habilidad de los hongos para refiere a un sistema que involucra a la ecología
infectar a las plantas surgió en forma repetida en un sentido amplio) de enfermedades provo-
e independiente, lo que determinó el desarrollo cadas por hongos fitopatógenos.
de una diversidad de estrategias en los hongos
fitopatógenos para evadir las defensas vegeta- PRINCIPALES HONGOS CAUSANTES DE
les y completar su ciclo de vida en las plantas. ENFERMEDADES DE INTERÉS
Durante el desarrollo de la enfermedad se alte- AGRONÓMICO
ran en la planta procesos relacionados a la fo- De las innumerables especies fúngicas co-
tosíntesis, a la absorción de agua y minerales nocidas sólo un pequeño número son capaces
del suelo y su transporte al resto de la planta, al de producir enfermedades en plantas. En la
crecimiento y desarrollo, todo lo cual repercute actualidad, Magnaporthe oryzae es considera-
negativamente en la agricultura. do el hongo que más daño produce a la agri-
El desarrollo de estrategias biotecnológicas cultura mundial, porque afecta al arroz que es
para el manejo sostenible tanto en lo produc- el cultivo vegetal más importante del planeta.
tivo como para la salud humana y ambiental, Este fitopatógeno fúngico conjuntamente con
consiste en complementar el mejoramiento ge- Ustilago maydis, causante del carbón de la es-
nético convencional de cultivos vegetales con piga del maíz, fueron seleccionados por con-
el conocimiento generado por la investigación sorcios internacionales para la secuenciación y
de las interacciones entre hongos y plantas, el estudio en profundidad de su genoma, con lo
en particular de los factores relacionados a la que se han conseguido grandes avances en el
patogenicidad en hongos y de los mecanis- conocimiento de sus mecanismos de infección.
mos de defensa en plantas. La aplicación de Las diferentes especies de Colletotrichum
que producen enfermedades en varios cultivos
herramientas desarrolladas recientemente en
de interés con una incidencia severa en la eco-
el campo de la Biología Molecular como las
nomía, le siguen en importancia. Los hongos
técnicas que permiten secuenciar genomas
de este género provocan antracnosis en cerea-

les, legumbres y frutas. Aunque los hongos de que se nutren de los tejidos vivos del hospe-
estas especies atacan diferentes tejidos de la dero, mientras que los necrotrofos lo hacen a
planta durante su desarrollo, en muchos casos partir de tejidos muertos. Otros denominados
el daño se produce después de la cosecha del hemibiotrofos se comportan como biotrofos y
fruto o del tejido u órgano de consumo, al igual necrotrofos según el estadio de su ciclo vital
que sucede con hongos del género Penicillium. considerado.
Otros patógenos fúngicos importantes per- Las paredes de las células vegetales, for-
tenecen al género Botrytis, causantes de la madas principalmente por polisacáridos com-
podredumbre gris, los cuales tienen un amplio plejos como celulosa, hemicelulosa, pectinas,
rango de hospederos, al igual que los de los compuestos fenólicos resistentes a hidrólisis
géneros Alternaria y Septoria. Estos hongos como lignina, y en menor grado por proteínas,
causan daños en diferentes cultivos por la pro- desempeñan un importante rol en la defen-
ducción de toxinas que finalmente matan a la sa contra patógenos. Esta barrera puede ser
planta y pueden afectar también a los consu- superada por algunos hongos gracias a que
midores. secretan enzimas capaces de hidrolizar sus
Lograr un manejo sostenible de las enfer- componentes, permitiéndoles acceder a los
medades conocidas con el nombre común de tejidos y espacios intracelulares. Sin embargo,
roya, cuyo agente etiológico pueden ser distin- algunos eventos previos a la penetración han
tas especies de hongos fitopatógenos, es clave demostrado ser de gran importancia en el pro-
también para mejorar la agricultura mundial. ceso infectivo, entre los que se encuentra: la
Para profundizar en el conocimiento de los adhesión de los conidios a la superficie de la
hongos fitopatógenos se recomienda consultar planta, el reconocimiento del hospedero y la li-
la extensa bibliografía que está disponible en beración de las señales apropiadas que permi-
Agrios (2004), ya que esta breve enumeración tan los procesos de morfogénesis relacionados
sólo persigue un objetivo introductorio de lo al desarrollo del hongo, como se muestra en la
que se tratará a continuación en este capítulo. Figura 1.
En general, el proceso de infección de plan-
PROCESO DE INFECCION DE PLANTAS
tas por parte de hongos fitopatógenos incluye
POR HONGOS PATOGENOS
una serie de etapas comunes a diferentes es-
Para producir la enfermedad, los hongos
pecies que pueden resumirse en los siguientes
deben acceder al interior de los tejidos vege-
pasos, algunos de los cuales pueden verse en
tales, penetrando en hojas, tallos y raíces di-
el esquema mostrado en la Figura 1 para hon-
rectamente, o a través de heridas o aperturas
gos biotrofos (Fig. 1A) y hemibiotrofos en su
naturales como estomas. Las partes aéreas de
etapa biotrófica (Fig. 1B):
las plantas están cubiertas por una capa con-
1- Unión de las estructuras infectivas fúngi-
tinua formada por un material de naturaleza li-
cas a la superficie de la planta.
pídica denominada cutícula. La estructura y la
composición de esta cubierta varían según la 2- Germinación de conidios y formación de
planta, órgano o estadio del crecimiento, pero estructuras de infección en las partes aéreas
básicamente está formada por una matriz de del hospedero.
cutina y ceras. Los hongos fitopatógenos son 3- Penetración al hospedero.
los únicos que pueden acceder a los nutrientes 4- Colonización de los tejidos vegetales.
vegetales a través de la cutícula por acción de
enzimas denominadas cutinasas, que degra- 1- Unión de las estructuras infectivas
dan la cutina. fúngicas a la superficie de la planta.
Es importante tener en cuenta que de acuer- La adhesión de los conidios a la superficie
do al tipo de nutrientes que necesitan para del hospedero es el primer paso del proceso de
completar su desarrollo, los hongos patógenos infección y es indispensable para llevar a cabo
se pueden clasificarse en biotrofos y necrotro- las etapas posteriores del desarrollo. La natu-
fos y el hecho que pertenezcan a un tipo u otro raleza química del material usado por las distin-
determina las características de sus mecanis- tas especies fúngicas para la unión es variable,
mos de infección. Los biotrofos son aquellos como lo son también las condiciones del medio

Figura 1: Esquema simplificado de las estructuras infectivas típicas de un hongo patógeno biotrófico obli-
gado (A), hemibiotrófico en la fase biotrófica (B) y algunas de las vías de señalización activadas. Después
de la adhesión del conidio a la supercifie del tejido vegetal, este emite un tubo germinativo (TG) que crece
hasta encontrar una zona de la superficie de la hoja (u otro tejido) donde se fija y desarrolla el apresorio. A
partir de allí se produce la penetración de la papila infectiva que termina en otra estructura destinada a la
nutrición del hongo, el haustorio. Nomenclatura: MC, membrana celular; MH, membrana haustorial; MeEH,
membrana extrahaustorial; MaEH, matriz extrahaustorial; Avr, factor de avirulencia; Gen R, gen de resis-
tencia (i.e. tipo TIR-NBS-LRR, CC-NBS-LRR), PRR (pattern recognition effector) o ETI (effector-triggered
immunity); MAPK, (Map quinasas); FT, factores transcripcionales.
ambiente que inducen la adhesión. En el caso go que se encuentra en el extremo de la conidia

del hongo causante del tizón del arroz Magna- que se unirá a la superficie de su hospedero, en
porthe oryzae, la humedad del ambiente o el ro- tanto que Blumeria graminis f. sp. hordei que
cío es necesaria para la hidratación del mucíla- produce la enfermedad llamada “oídio” en ce-

reales, no requiere un medio hidratado en esta un área especializada en intercambio de nu-
fase inicial porque las esporas liberan cutinasas trientes en la zona de contacto con la mem-
que modifican la superficie del hospedero y de brana, en la cual se ha detectado la presencia
la conidia, tornándolas más hidrofóbicas, favo- de transportadores de hexosas, aminoácidos
reciendo la unión entre ambas y el desarrollo y otras moléculas. Este tipo de interacción es
posterior del tubo germinativo. posible debido a que, como ha sido demostra-
do en Colletotrichum y otras especies, en las
2- Germinación de los conidios y áreas de contacto los patógenos enmascaran
formación de estructuras de infección en los componentes específicos de su pared celu-
las partes aéreas del hospedero. lar como quitina, modificándolos químicamen-
Los estímulos que determinan la germina- te, y así evitan ser reconocidos por los siste-
ción de los conidios son diversos, entre ellos mas de defensa celulares.
la estimulación por contacto, condiciones del En el caso de los biotrofos obligados como
medioambiente (temperatura y humedad) y la Blumeria graminis f.sp. hordei, patógeno de la
disponibilidad de nutrientes. Durante este pro-
cebada, cuando la hifa de infección se pone
ceso se produce movilización de compuestos
en contacto con la membrana plasmática de
de reserva, polarización y biosíntesis de mem-
la célula del hospedero se inicia la formación
branas y pared celular, hasta que finalmente
del haustorio, que es una estructura de nutri-
emerge el tubo germinativo, hifa especializada
ción del hongo que se desarrolla en el interior
que avanza por una corta distancia (ver Fig.1A
y 1B). El tubo germinativo censa la superficie de una célula epidermal por invaginación de la
del hospedero y si se perciben las señales fí- membrana plasmática. El haustorio tiene una
sicas y químicas apropiadas, se inducen una estructura compleja en la que algunos de los
serie de eventos que finalmente llevarán a la componentes se forman a partir de la mem-
formación del apresorio (Fig. 1A y 1B). De este brana celular de la planta llamada membrana
reconocimiento participan diversas proteínas extrahaustorial (MeEH, Fig. 1A) y otros son
fúngicas, como las integrinas, proteínas trans- producidos por el hongo, como los componen-
membrana que conectan eventos del medio tes de la membrana haustorial (MH, Fig. 1A),
externo con el citoesqueleto, o las hidrofobi- matríz extrahaustorial (MaEH, Fig. 1A), etc. A
nas, que intervienen en el desarrollo de estruc- través de este conjunto de estructuras, el hon-
turas aéreas y en las interacciones de las hifas go absorbe agua, minerales y otros nutrientes
con superficies hidrofóbicas. (Catanzariti et al., 2007).
En el caso de los hongos hemibiotrofos, esta
3- Penetración en el hospedero. estructura haustorial no llega a desarrollarse
Para acceder a los nutrientes intracelulares tanto, aunque cumple con las mismas funcio-
del hospedero, los microorganismos patóge- nes nutricionales para el hongo (Fig. 1B). En la
nos deben llegar al apoplasto. Para conseguir- segunda fase de desarrollo en los tejidos del
lo pueden penetrar directamente a través de hospedero, los microorganismos hemibiotro-
aperturas preexistentes como heridas o esto- fos modifican su metabolismo, dando lugar al
mas; o usar una estrategia fisicoquímica com- crecimiento de un nuevo tipo de hifa, una “hifa
binada ejerciendo presión sobre las estructuras necrotrófica secundaria”, de menor diámetro
vegetales y secretando enzimas hidrolíticas que puede atravesar la membrana plasmática,
durante 13permite el anclaje de la hifa infectiva ramificarse dentro de la célula y destruir poste-
y posibilita a su vez el crecimiento y fijación de riormente al hospedero.
otro órgano llamado haustorio (ver Fig. 1A). Patógenos necrotrofos como Botrytis cine-
rea, después de degradar por medio de en-
4- Colonización del tejido del hospedero zimas las paredes celulares del hospedero,
Después de la penetración, los hongos se producen una amplia variedad de compuestos
diseminan a partir del sitio de infección. En el fitotóxicos que afectan importantes procesos
caso de hongos biotrofos o hemibiotrofos en celulares, los que conducen a la degradación
la primera fase de la infección, se establece de componentes estructurales y funcionales de

la célula del hospedero, los que luego son usa- observa un reordenamiento de los componen-
dos por el hongo para su propia nutrición. tes del citoplasma y migración del núcleo, en
los que participan componentes del citoesque-
RESPUESTAS DE DEFENSA leto como la actina (Fig. 1B). El espacio entre
DE LA PLANTA. pared celular y membrana plasmática en el si-
En la naturaleza, las plantas están expues- tio de penetración comienza a engrosarse por
tas al ataque de organismos patógenos diver- el depósito de calosa, compuestos fenólicos,
sos como virus, bacterias, hongos, insectos lignina, celulosa, pectina, proteínas como las
y herbívoros, entre otros. Para hacer frente a glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y peroxi-
ellos han desarrollado varios mecanismos de dasas, formado la papila que rodea a la hifa de
defensa que se desencadenan específicamen- infección. La síntesis, deposición y ensamble
te luego del reconocimiento del atacante, y que de todos estos materiales está acompañada
deben ser regulados para minimizar los efectos por la liberación de especies reactivas de oxí-
negativos de esta respuesta sobre otros proce- geno (ERO) entre las cuales se encuentra el
sos de la célula, como el crecimiento. peróxido de hidrógeno. Las ERO desempeña-
Como se dijo, a medida que invaden los te- rían al menos tres funciones en la defensa de
jidos del hospedero, las estructuras infectivas la planta: (i) crean el ambiente apropiado que
del hongo se ponen en contacto con la pared promueve el proceso de lignificación y la for-
celular de las células vegetales y secretan una mación de puentes cruzados entre residuos de
serie de enzimas conocidas como enzimas de aminoácidos de las proteínas de la pared celu-
degradación de la pared celular que incluyen, lar (lo que las torna más resistentes al ataque
como se mencionó anteriormente, celulasas, de enzimas fúngicas), (ii) poseen también una
poligalacturonasas, xilanasas y proteinasas acción tóxica directa sobre el patógeno frenan-
(Fig. 1B). Los fragmentos de pared celular deri- do su crecimiento, y (iii) sirven como moléculas
vados de estas actividades enzimáticas pueden señales para inducir la expresión de algunos
actuar también como elicitores de la respues- genes relacionados a la defensa.
ta de defensa vegetal, aunque en otros casos A lo largo de la evolución y como modo de su-
la suprimen. En los sitios donde se produce la perar las respuestas inducidas en la planta, los
degradación de la pared celular el hongo acce- hongos fitopatógenos han evolucionado hacia
de al apoplasto y su presencia es percibida por la producción de una serie de moléculas deno-
una serie de receptores que se encuentran en minadas efectores fúngicos, las cuales pueden
la membrana plasmática, denominados recep- actuar a distintos niveles. La naturaleza quími-
ca de estos efectores es diversa, lo que ha difi-
tores de reconocimiento de patrones o RRPs,
cultado su identificación. Las plantas resisten-
capaces de reconocer epítopes conservados
tes expresan proteínas productos de genes de
dentro de moléculas que son imprescindibles
resistencia o R (Fig. 1A), capaces de detectar
para la supervivencia del patógeno, las cuales
la presencia de efectores (factores de avirulen-
en conjunto reciben el nombre de MAMPs, por
cia) y desencadenar eventos relacionados a la
las siglas en inglés de “Microbial Associated
transducción de señales e.g. cascada de MAP
Molecular Patterns” (Glazebrook, 2005). Entre
quinasas (Fig. 1B) que finalmente activan una
estas moléculas se encuentra la quitina, cons-
defensa efectiva en estos hospederos.
tituyente específico de la pared celular de los
Como consecuencia de esta interacción, en
hongos que es reconocida por receptores RRP la célula en contacto con el agente invasor y
que poseen un dominio denominado Lys-M. La en aquellas que la rodean puede desencade-
unión del ligando a estos receptores desenca- narse la respuesta de hipersensibilidad o HR,
dena una serie de eventos subcelulares que que consiste en un complejo pero organizado
inducen finalmente la expresión de genes rela- mecanismo de suicidio llamado también muer-
cionados a la defensa de la planta. te celular programada (PCD), acompañado de
Como señal de la respuesta de defensa des- la inducción de respuestas defensivas locales
encadenada en el hospedero, inmediatamente (LAR: resistenca local adquirida) y sistémicas
debajo del sitio de formación del apresorio, se (SAR: resistencia sistémica adquirida), siendo

estas últimas efectivas en sitios distantes del mejores herramientas bioinformáticas, la con-
de infección. La respuesta de hipersensibili- formación de grupos de investigación interdis-
dad es considerada como uno de los factores ciplinarios para dilucidar la función de los nue-
más importantes que frena el desarrollo de los vos genes, y como desafío en el futuro, para
patógenos biotrofos o en la etapa biotrófica de integrar los conocimientos y aplicarlos en la
los hemibiotrofos, impidiendo su acceso a los agricultura a gran escala (Xu et al., 2006).
nutrientes y confinándolo al sitio inicial de la
infección. Sin embargo, en el caso de patóge- ESTRATEGIAS BIOTECNOLÓGICAS
nos necrotrofos, capaces de producir toxinas Después de haber presentado los aspectos
que inducen la muerte celular, tiene un efecto más sobresalientes de los procesos de inte-
opuesto ya que facilita la colonización de las racción entre plantas y patógenos fúngicos, en
plantas. esta sección se pretende dar algunas ideas y
Después del reconocimiento del patógeno ejemplos de investigación que tienda a imple-
se activan dos vías de transducción de señales mentar estrategias agrícolas para un manejo
principales, una dependiente de ácido salicílico sustentable y eficiente del estrés biótico en ge-
y la otra que depende de etileno y ácido jasmó- neral y fúngico en particular, minimizando el im-
nico. En muchos puntos estas vías se interco- pacto sobre el medio ambiente y la salud, tanto
nectan y modulan, fenómeno conocido como de consumidores como de operadores de toda
“cross-talk” (Dangl y Jones, 2001; Glazenbrook la cadena agroindustrial. Se aborda la búsque-
et al., 2003). En general y a modo muy simplifi-
da y utilización de biocontroladores (bioinduc-
cado hasta tanto se diluciden los mecanismos
tores y biopesticidas propiamente dichos) de
involucrados en la llamada resistencia horizon-
origen vegetal y microbiano, la caracterización
tal o poligénica, se puede aceptar que la re-
de genes que pudieran estar involucrados en la
sistencia a organismos biotrofos se establece
defensa vegetal y la transferencia de los mis-
a través de la vía de transducción de señales
mos por ingeniería genética.
dependiente de ácido salicílico, en tanto que la
resistencia a necrotrofos depende de la vía de
etileno/ácido jasmónico. 1 - Inductores de la Respuesta de Defensa
de Origen Microbiano y Vegetal
GENOMICA DE HONGOS PATOGENOS Uno de los procesos naturales que se intenta
La secuenciación de los genomas completos aprovechar para el desarrollo de estrategias de
de muchas especies fúngicas permitió algunos control de enfermedades, es la capacidad que
avances en el conocimiento de los procesos tienen las plantas de defenderse del ataque de
biológicos relacionados a los mecanismos de patógenos. Como se ha visto, se sabe que las
proliferación de los hongos fitopatógenos en plantas reaccionan ante un estrés biótico utili-
los tejidos del hospedero, e influyó en el diseño zando diversos mecanismos que se manifies-
de las estrategias de investigación para tratar tan cuando se ponen en contacto con un pató-
de responder sobre aspectos de este proceso geno o con sustancias químicas derivadas de
que aún se desconocen. éstos. Esta interacción puede conducir a que la
En la actualidad se ha completado la se- planta no contraiga la enfermedad o lo haga en
cuenciación del genoma completo de algunos forma muy débil si percibe a tiempo las seña-
hongos causantes de importantes daños en les del patógeno (inductores o elicitores) y lo-
cultivos como Magnaporthe oryzae (Dean et gra inducir una respuesta de defensa, pero se
al., 2005) causante del tizón del arroz, Ustilago enfermará si no logra detectarlas o si lo hace
maydis, y Fusarium, entre otros; el estado de muy tardíamente (Dangl y Jones, 2001). En el
los proyectos de secuenciación de otros geno- primer caso se dice que la interacción es del
mas fúngicos puede ser consultado en www. “tipo incompatible” y el patógeno es “avirulen-
ncbi.nlm.nih.gov. to” y en el segundo, se trata de una “interacción
Sin embargo, el análisis de la gran cantidad compatible” y el patógeno es “virulento”.
de datos generados puede transformarse en Un hecho interesante que es la base de una
un factor limitante, que requiere la creación de de las estrategias de protección posibles, es

que algunos patógenos pueden comportarse una interacción del tipo incompatible, no se
como avirulentos con algunos genotipos de enferman (o lo hacen en menor grado) porque
plantas y como virulentos con otros genotipos. que estos aislados inducen una serie de reac-
Dicho en otras palabras, esto significa que “por ciones fisiológicas que conducen al desarrollo
alguna razón” ese patógeno puede desencade una respuesta de defensa. Estudios poste-
denar una respuesta de defensa en aquellos riores confirmaron esta hipótesis, demostrando
genotipos de planta donde establece una in- que el efecto observado se debe efectivamen-
teracción del tipo “incompatible”. La Figura 2 te a la inducción de una verdadera respuesta
muestra a modo de ejemplo como aislados de de defensa de la planta (Salazar et al., 2007).
hongos patógenos del genero Colletotrichum Este fenómeno nos permite imaginar que sería
pueden presentar diversos Índices de Severi- posible utilizar este tipo de interacciones entre
dad (IS) de la enfermedad (“antracnosis”) en plantas y microorganismos para desarrollar
frutilla, lo que pone en evidencia la existencia estrategias alternativas a las convencionales,
de patotipos (tipos o genotipos patogénicos). para controlar la incidencia de enfermedades
Hay cultivares de frutilla que se muestran muy fúngicas. Sin embargo, si bien lo antedicho es
resistentes para algunos patotipos (1<IS<2) cierto, para intentar una aplicación directa tie-
mientras que son muy susceptibles para otros nen que ser superado algunos inconvenientes
aislados del patógeno (4<IS<5); ver como que se discuten a continuación.
ejemplo al cultivar Pájaro que presenta gran La debilidad de esta aproximación radica en
resistencia al aislado SS71 mientras que es al- que en los campos donde se realiza el cultivo,
tamente susceptible al aislado M11. muchas veces los agricultores no utilizan una
Este resultado sugiere que cuando las plan- única línea genética del cultivo (cultivar o va-
tas son expuestas a un patógeno que se com- riedad), ni el cultivar específico para el cual el
porta como avirulento, es decir que establece biocontrolador (patógeno avirulento) es efecti-
5
IS frente a Colletotrichum
4
LFC1-05
F7
3
LFC3-05
TPS1-05
2
SS71
L9
1
M11
MP3
0
1 2 3 4 5
Cultivares de frutilla
Figura 2: Susceptibilidad de cinco cultivares de frutilla a ocho aislados diferentes de Colletotrichum sp. La
susceptibilidad es evaluada por el Indice de Severidad (IS) utilizando una escala de 1 a 5, siendo 1 muy
resistente y 5 muy susceptible.

vo. Esta condición hace que la utilización de defensa en plantas susceptibles de frutilla. Se
ese factor biótico para inducir la respuesta de pudo probar que la fracción particulada (EC)
defensa, aunque sea avirulento y efectivo para y soluble (sobrenadante, SN) de extractos de
una variedad en particular, puede ser capaz de conidios obtenidos del aislado avirulento (M23)
producir enfermedad en otro cultivar, provo- del hongo Colletotrichum fragariae, mostra-
cando efectos no deseados en el cultivo. ron capacidad de inducir la respuesta de de-
Para solucionar este inconveniente se propu- fensa en plantas sanas de frutilla cuando son
so la utilización de patógenos muertos o inacti- aplicados en forma previa a la infección con
vados que conserven la capacidad de inducir la un patógeno virulento de C. acutatum, y que
respuesta defensiva en el vegetal, o extractos la protección adquirida podría perdurar en el
provenientes de estos microorganismos inacti- tiempo (ver Fig. 3, EC9, EC30, SN9 y SN30).
vados, de otros no patógenos que contengan Los Resultados mostraron que plantas trata-
elicitores de la defensa (mantengan el poder das de este modo, no manifiestan síntomas de
inductor), o la utilización directa de compues- la enfermedad aún hasta 50 días posterior a
tos vegetales capaces de intermediar o de ac- la infección (ver Fig. 3, EC50 y SN50; DSR =
tuar como inductores naturales de la defensa 1) y que ese efecto, del mismo modo que el
innata de las plantas. producido por el hongo activo, se debía a la
Como se muestra en la Figura 3, se investigó inducción de una respuesta de defensa de la
la capacidad de extractos estériles de un pató- planta (Chalfoun et al., 2007).
geno de frutilla para inducir una respuesta de Desde el punto de vista tecnológico se po-
4
Figura 3 9 dpi
3
30 dpi
2 50 dpi
0
EC
EC 3 SN 2 C1 Cruz. Ctr.(+)
Ctr. Prot. C2 C.acut.
Tratamientos
Figura 3: Evolución de la enfermedad evaluada como IS (índice de severidad) a los 9, 30 y 50 dpi (días
posteriores a la infección con un aislado virulento de C. acutatum) de plantas de frutilla del cultivar Pájaro
pretratadas con: EC, extracto estéril de conidios del aislado avirulento M23 de Colletotrichum sp.; SN, so-
brenadante estéril de un cultivo del aislado avirulento M23 de Colletotrichum sp.; C1, conidios activos del
aislado avirulento M23 de Colletotrichum sp.; C2, agua destilada estéril. La susceptibilidad es evaluada
por el Indice de Severidad (IS) utilizando una escala de 1 a 5, siendo 1 muy resistente y 5 muy susceptible.

dría esperar que la utilización de estos extrac- una proteína derivada de la bacteria Erwinia
tos fúngicos solucione el problema menciona- amylovora con actividad elicitora de la defen-
do arriba referido a la inconveniencia de usar sa, o metabolitos secundarios (no proteicos)
patógenos vivos para el desarrollo de biocon- de plantas (Filippone et al., 2001). Se debería
troladores. Sin embargo, esta nueva estrate- esperar que el mecanismo de inducción de la
gia también puede conllevar aspectos no tan respuesta de defensa utilizado por estos pro-
ventajosos que deben tenerse en cuenta antes ductos o compuestos sea menos restringido al
de intentar su utilización directa como agente estar más conservado en el reino vegetal, lo
de biocontrol. Los inconvenientes previsibles que permitiría prever un rango de acción ex-
se refieren al grado de especificidad que pue- tendido no sólo a otras variedades comerciales
den tener estos inductores con el cultivar utili- de frutilla sino a otras especies cultivadas. Re-
zado, es decir, del espectro varietal de acción. sultados preliminares obtenidos nos permiten
Lo ideal sería que, por una simple cuestión de abrigar esperanzas en esta dirección.
amortizaciones y costos, el efecto inductor fue- Todos estos resultados, nos hacen entrever
ra efectivo en muchas variedades de frutilla y un futuro muy promisorio en las investigacio-
aún mejor, en otros cultivos vegetales. Dicho de nes orientadas a la extracción, purificación y
otra manera, que estos extractos pueden servir caracterización de moléculas con capacidad
para proteger otras variedades u otras espe- de inducir la respuesta defensiva de las plan-
cies agrícolas de sus patógenos más agresi- tas, ya sean de origen vegetal o microbiano,
vos. En este sentido, es recomendable realizar para la formulación de bioinductores de amplio
ensayos con otros cultivares y especies vege- espectro, capaces de tener actividad sobre di-
tales para comprobar el grado de especificidad ferentes variedades de distintos cultivos.
que pueda manifestar este tipo de elicitores, ya
que si se analiza el origen de ese “inductor” se 2 Utilización de Genes Potencialmente
podría pensar que se trata de una proteína del Involucrados en la Respuesta Defensiva
tipo Avr (proteínas del patógeno que interaccio- Otra estrategia posible consiste en utilizar
nan específicamente con productos de genes genes involucrados en la defensa vegetal,
de resistencia R), y por lo tanto tener efecto que pudieran conferir resistencia total o al me-
únicamente si son reconocidas por las proteí- nos un incremento parcial de la resistencia en
nas codificadas por un gen R específico de la plantas de interés. Esto debería lograrse por
planta (Datta y Muthukrishnan, 1999). Esta úl- expresión homóloga (e.g. cuando el gen que
tima aseveración se sustenta en la teoría del se introduce por vía no sexual proviene de la
reconocimiento “gen-a-gen” propuesta por de misma especie) o heteróloga (e.g. cuando el
Flor ya en 1956, por lo que deberíamos espe- gen proviene de una especie distinta a la que
rar una respuesta muy específica, es decir, res- se está transformando), utilizando herramien-
tringida a una especie e inclusive un cultivar tas de ingeniería genética. En estos casos,
determinado de la misma. En caso de ser cier- para incrementar las expectativas de éxito de
ta esta hipótesis, deberíamos esperar un rango esta estrategia, se suelen elegir variedades de
de acción muy reducido de estos extractos, por alto potencial productivo pero susceptibles a
lo que la aplicación de esta estrategia, queda- las principales enfermedades. La pregunta que
ría reducida a un número pequeño de genoti- surge es qué tipo de genes convendría consi-
pos de una especie vegetal. derar y esa pregunta no tiene una respuesta
En estos casos habría que pensar en otra trivial y es muy dependiente de la especie de
aproximación tecnológica que permita un uso interés y la información disponible sobre los
más amplio de los elicitores de defensa. En genes que muestren algún valor potencial.
ese sentido, se están investigando otros com- A grandes rasgos y hasta tanto se diluciden
puestos de origen natural con resultados inte- los mecanismos involucrados en la resistencia
resantes, algunos de los cuales son extractos poligénica u horizontal, o se disponga de mé-
inactivos o proteínas purificadas de micro- todos para clonar (aislar) e introducir grandes
organismos como el “harpin” que es una es porciones cromosómica por una vía no sexual,

A Construcción utilizada: pHCHI
CMv35s ch5B tnos Pnos nptII toct
B Líneas transgénicas obtenida: ChiA y ChiB
C1 pBI ChiA ChiB C2
C Actividad quitinasa en líneas transgénicas
a 30 kDa
b IS
NT pBI 39A 39B 35 ChiA ChiB ChiC
kDa
30
c 14
Figura 4: Aumento de la resistencia inducida por la expresión heteróloga de un gen de quitinasa (ch5B)
proveniente de Phaseolus vulgaris. A) pHCHI, constructo utilizado para la expresión del gen de quitinasa
en plantas de frutillaFigura
(cultivar 4
Pájaro). CMv35s, promotor constitutivo proveniente del virus de mosaico del
coliflor; tnos, terminador proveniente del gen de nopalino sintasa (nos) del plásmico Ti de Agrobacterium
tumefanciens; Pnos, promotor proveniente del gen de la nopalino sintasa del plásmico Ti de A. tumefan-
ciens; toct, terminador proveniente del gen de octopina sintasa (oct) del plásmico Ti de A. tumefanciens;
nptII, gen de la neomicina fosfotransferasa que otorga resistencia a neomicina a los tejidos transformados
de plantas. B) Resultados de ensayos de susceptibilidad al hongo patógeno Botrytis cinerea de hojas de
plantas de frutilla (cv. Pájaro). C1, control de planta no transformada y no inoculada; pBI, control de planta
transformada con el vector de expresión sin el inserto de la quitinasa y no inoculado; ChiA y ChiB, hojas
de dos líneas plantas transformadas obtenidas en forma independiente e inoculadas con el patógeno; C2,
control de planta no transformada e inoculada con el patógeno. La inoculación se realizó con 10 µl de una
suspención de 106 conidios/ml. Las hojas fueron colocadas bajo condiciones controladas de temperatura,
luz y humedad, evaluándose el desarrollo de la enfermedad a los 5 dpi. C) Evaluación de la expresión
(a), indice de susceptibilidad (b) y actividad de la quitinasa en hojas de frutilla (c) no transformada (NT),
transformada con el vector sin inserto (pBI), de lineas transgénicas que expresan (ChiA y ChiB) y que no
expresan (39A, 39B, 35, ChiC) el gen de la quitinasa ch5B; Lizo, proteína utilizada como marcador de peso
molecular correspondiente a Lysozima (figura extraída de Vellicce et al., 2006)v

se puede decir que los genes involucrados en En los últimos años se ha incrementado el in-
la defensa vegetal y por tanto utilizables, pue- terés por la búsqueda de genes de resistencia,
den ser de dos tipos: (i) aquellos asociados a no sólo por la posibilidad de utilización para la
la respuesta de defensa y (ii) los denominados obtención de variedades resistentes, sino para
genes de resistencia de tipo R, los que pueden dilucidar mecanismos de control y regulación
ser a su vez de varios tipos diferentes. Para de la respuesta de defensa, y de factores que
que esta estrategia pueda tener alguna posi- determinen la susceptibilidad o resistencia de
bilidad de éxito, es necesario además que se la planta hacia un patógeno.
cumplan algunas condiciones. Si se trata de un Este planteo permite visualizar al menos,
gen asociado a la respuesta defensiva, el pro- tres estrategias posibles (no excluyentes) que
ducto de ese gen debe tener una actividad co- pueden contribuir significativamente al mejo-
nocida que permita prever una acción deleté- ramiento fitopatológico de cultivares. Por un
rea sobre el patógeno (por ejemplo antibiótica) lado, se podría intentar por ingeniería genética
y consecuentemente de protección a la planta aumentar la frecuencia de alelos (variantes gé-
(Datta and Muthukrishnan, 1999). En cambio, si nicas) de genes tipo R que contribuyan a incre-
se trata de un gen de resistencia tipo R no hace mentar la resistencia a enfermedades. Por otra
falta conocer su actividad específica, pero si parte, se podría bloquear o anular la expresión
debe tener la capacidad de reconocer al pató- de genes de la planta que permiten el progreso
geno en forma directa o indirecta por medio del de la enfermedad, o intentar sobre-expresar en
producto de un gen avr del mismo (Axtell and variedades susceptibles, genes cuya actividad
Staskawicz, 2003; Mackey et al., 2002, 2003). nos permita incrementar la resistencia. De esto
Entre los genes más promisorios, se pueden se trata la siguiente sección.
mencionar aquellos que codifica para alguna
proteína relacionada con la defensa vegetal 3 Transferencia de Genes Involucrados
como ser: quitinasas, glucanases, entre las en la Respuesta Defensiva por Ingeniería
que tienen actividad enzimática hidrolíticas de Genética
componentes de la pared celular de hongos. La estrategia consiste en utilizar recursos
Pero también pueden ser de genes que codi- genéticos disponibles con alto potencial de
fican para enzimas que no están relacionadas rendimiento, e incorporar por ingeniería gené-
directamente con actividades hidrolíticas, pero tica unos pocos genes ausentes en los genoti-
están sin embargo relacionadas a la regula- pos de partida (variedades o cultivares), que le
ción del metabolismo de especies reactivas del confieran un incremento de resistencia a enfer-
oxígeno (i.e. glutation S tranferasas o GSTs, medades fúngicas. La literatura en ese senti-
superóxido dismutasas o SODs, peroxidasas, do es tan extensa que para lo que se pretende
etc), al transporte de lípidos (i.e. lipooxigena- en este capítulo sería imposible resumirla. Sin
sas, LTPs, etc.), o simplemente que no tengan embargo, quisiéramos resaltar dos aspectos
actividad conocida, pero cuya participación en y detenernos sólo en uno de ellos: el primero
la respuesta de defensa haya sido probada se refiere al impacto socio-cultural que puede
(i.e. proteínas de transporte de calcio, recepto- implicar la introducción de OGMs (organismos
res de etileno, MAMPs, etc.). Particularmente genéticamente modificados por ingeniería ge-
interesante son aquellos genes que aún cuan- nética) en el mercado y el otro, a la factibilidad
do sus productos no poseen una actividad an- de lograr los mismos objetivos por otra metodo-
tibiótica directa, codifican para proteínas que logía. Con respecto al primer aspecto mencio-
participan en la señalización de la respuesta nado, sólo diremos que desde el punto de vista
defensiva, ya sea por que regulan etapas de científico hay que tener en cuenta por un lado,
la cascada de señalización (i.e. NPR1, GSTs), que el nuevo genotipo portador de los genes
o la expresión de genes asociados a la defen- introducidos mantenga o mejore sus propieda-
sa (i.e. genes R) (Tang et al., 1999; Kim et al., des en relación a la salud de consumidores y
2002; Tonello et al., 2006; Martinez Zamora et operarios, y por otra parte, que los nuevos ge-
al., 2008). nes no puedan transferirse sin control a otras

especies vegetales emparentadas. Respecto cruzamientos y selección) y la obtención de un
de la posibilidad de alcanzar el mismo objetivo OGM que exprese un gen heterólogo que con-
con otra aproximación tecnológica, como por fiera resistencia, podría ser un alternativa muy
ejemplo la mejora genética convencional o clá- adecuada. Este el caso de la interacción entre
sica, en este caso habría que evaluar el costo frutilla y Botrytis: no se encontró ninguna va-
real, es decir, por ejemplo contraponer el tiem- riedad de frutilla con resistencia hacia Botrytis,
po necesario para introducir la característica por lo que se decidió incorporar la resisten-
por la vía convencional, con el requerido para cia por ingeniería genética. En la Figura 4 se
lograr la desregulación y la autorización de uso muestran resultados obtenidos para una varie-
del cultivar transgénico. También habría que dad de frutilla (Pájaro) susceptible a la enfer-
conocer previamente, si la característica gené- medad de moho gris. La estrategia consistió en
tica a transferir está o no en un germoplasma la expresión de un gen heterólogo (ch5B) que
que pueda cruzarse y dar descendencia fértil codifica para una proteína (Ch5B) del tipo PR
con la especie cultivada o variedad que se de- asociada a la respuesta de defensa en poroto
sea mejorar. o Phaseolus vulgaris. En la Figura 4A se mues-
Como ejemplo vamos a mencionar la inte- tra la construcción utilizada para transformar el
racción entre frutilla y dos patógenos fúngicos: cultivar Pájaro de frutilla, con la cual se obtu-
Colletotrichum acutatum y Botrytis cinerea. El vieron dos líneas transgénicas que expresaban
primero causante de la enfermedad llamada la quitinasa en forma correcta y activa: ChiA y
antracnosis y el segundo de la podredumbre o ChiB. También (Figura 4B) se muestran los
moho gris. Como puede verse en la Fig. 2, estu- resultados de un ensayo de infección con Bo-
dios fitopatológicos realizados de la interacción trytis en hoja desprendida, en el que se puede
entre genotipos de Colletotrichum con distin- apreciar el grado de protección conferida por la
tos cultivares de frutilla (Fragaria x ananassa), expresión del transgen (o gen introducido por
muestran que un aislado particular de hongo ingeniería genética) en plantas transformadas
puede atacar con distintos grados de severi- (ChiA y ChiB), en comparación con controles no
dad a diferentes cultivares de frutilla y también, transformados (C1, C2) o transformados con el
que un cultivar de frutilla puede ser afectado plásmido sin el inserto del gen ch5B (pBI) (Ve-
de manera diferente por distintos aislados de llicce et al., 2006, Qin et al, 2008). Esta enfer-
hongos patógenos. Este resultado claramente medad es de gran incidencia en casi todos los
muestra que no sólo hay variabilidad genética agro-ecosistemas donde se cultiva frutilla en el
en los hongos patógenos para el carácter de mundo. El gen ch5B utilizado codifica para una
patogenicidad\virulencia, sino que en la fru- proteína con actividad quitinasa, cuya actividad
tilla hay también variabilidad genética para el antifúngica ya había sido previamente probada
carácter de resistencia. Este dato es de gran (Benhamou et al., 1993). Estos resultados per-
importancia para analizar distintas estrategias miten comprobar que la expresión de ese gen
alternativas para otorgar a cultivares de fruti- de quitinasa es capaz de disminuir la suscepti-
lla resistencia a la antracnosis o al moho gris. bilidad (IS) de este cultivar hacia Botrytis (Fig.
Esto significa que habrá que analizar bien, cuál 4Ca y 4Cb) y que ese carácter estaba asociado
metodología, si la clásica o la de transgénesis, a la actividad de esta quitinasa (Fig. 4Cc).
conviene utilizar para transferir la característica Otra estrategia interesante para el manejo
desde el material genético poco domesticado de Botrytis en frutilla es aquella reportada por
a otro más domesticado. Concretamente todos Hanhineva (2008). Su propuesta consistió en
los programas de mejoramiento genético del utilizar las propiedades antifúngicas de las iso-
mundo intentan contestar esta pregunta. flavonas, sobre-expresando uno de los genes
Sin embargo, puede ocurrir que un cultivo responsables de su síntesis, la estilbeno sinta-
determinado no muestre variabilidad genética sa, en genotipos sensibles de frutilla. Así pudo
para el carácter de resistencia hacia un pató- demostrar que esta aproximación transgénica
geno, por lo que no sería posible mejorar el cul- también permite obtener cultivares de frutilla
tivo por una aproximación convencional (e.g. con tolerancia al moho gris incrementada.

Estos resultados muestran claramente que Benhamou N, Broglie K, Chet I and Broglie R
la vía de la modificación genética por transgé- (1993) Cytology of infection of 35s-bean chitinase
nesis, es una estrategia posible y puede contri- transgenic canola plants by Rhizoctonia solani:
buir efectivamente al manejo de enfermedades cytochemical aspects of chitin breakdown in vivo.
producidas por patógenos fúngicos, disminu- Plant J, 4, 295-305.
yendo los riesgos de efectos nocivos para el Catanzariti,A-M, Dodds, P.N. and Ellis, J.G. (2007).
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Chalfoun NR, Muñóz Blanco J, Caballero Repullo
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En este capítulo se mostró como el conoci- secreted by an avirulent strain of Colletotrichum
miento básico de los mecanismos de defensa spp. induce resitance in strawberry. Biocell 31
y los factores involucrados en la respuesta (suppl): 124. Abstract PL-
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V . Capítulo 9 riabilidad. Esto último no es deseable para la
producción de plantas libres de virus, donde
el objetivo que se persigue es mejorar la sani-
Utilización de cultivos de tejidos dad de la planta sin modificar sus cualidades
para la obtención y conservación agronómicas. Es importante aclarar que han
de plantas libres de sido reportadas ciertas mutaciones en plantas
provenientes de cultivo de meristema, pero con
enfermedades. mucha menos frecuencia y menos importantes
que las detectadas con otros sistemas de ob-
Vilma C. Conci. tención de plantas in vitro.
Cultivo de meristema Eliminación de virus
El cultivo de meristema ha sido utilizado con Los virus de plantas son responsables de
éxito para distintos objetivos, entre ellos la rá- importantes pérdidas en los rendimientos, lle-
pida clonación de material deseable (micropro- gando en algunos casos a ser limitantes para
pagación), la conservación de germoplasma a el cultivo. La mayoría de ellos no se transmiten
bajas temperatura (criopreservación), y la ob- por semilla, por lo tanto, las especies que se
tención de plantas libres de patógenos sistémi- multiplican por esta vía, tienen la posibilidad de
cos, entre ellos los virus. liberarse de estos patógenos en forma natural.
Esta técnica consiste en aislar el meristema Por otra parte, las especies que se propa-
(explanto) y sembrarlo en un medio de cultivo gan exclusivamente en forma agámica no tie-
adecuado que posibilite el desarrollo de una nen esta ventaja. Cuando son infectadas sis-
planta completa. El término cultivo de meris- témicamente por virus, estos son transmitidos
tema por lo general, no es correctamente em- desde la planta madre a la descendencia con
pleado, ya que en la mayoría de los casos, se alta eficiencia. Esta situación permite que la in-
siembra el domo meristemático acompañado fección continúe de generación en generación
por uno o dos primordios foliares. El domo es y se disemine a diferentes regiones a través del
una estructura generalmente menor a 0,1 mm comercio de estos propágulos (bulbos, tubér-
muy difícil de extraer en forma aislada, y de la culos, esquejes, etc.). Ejemplo de ello son ajo,
cual resulta con frecuencia complicado obtener frutilla, frutales de carozo o pepita, yuca, papa,
una planta completa. Para ello, es necesario batata y numerosas especies ornamentales.
un medio de cultivo con concentraciones de En estos casos, la obtención y multiplicación
hormonas y sales equilibradas y condiciones de plantas libres de virus por medios artificiales
juega un papel importante para mejorar la pro-
ambientales estrictas, por consiguiente, esto
ducción y calidad.
ha llevado a que los resultados en ese sentido
Una larga lista de especies han sido liberadas
sean muy pobres. Por esta razón, en la mayo-
de virus a través de la regeneración de plantas
ría de los casos, se utiliza el domo meristemá-
in vitro. El sistema más frecuentemente utiliza-
tico acompañado de 1 ó 2 primordios foliares.
do y con mayores éxitos, es el cultivo de me-
Quizás lo aconsejable sería utilizar el término ristema suplementado, en algunos casos, por
cultivo de “yema”, “brote” o “tallo”. A pesar de tratamientos de termoterapia o quimioterapia.
ello, utilizaremos la denominación cultivo de
meristema por ser esta la terminología más di- Distribución de los virus en las plantas
fundida, aunque no estrictamente correcta. Los virus en las plantas no están uniforme-
En general se considera que las plantas mente distribuidos. En las infecciones sistémi-
provenientes del cultivo de meristema son cas, algunos están limitados al floema o a po-
idénticas, u homólogas, a la planta madre de cas células parenquimáticas adyacentes, otros
donde se extrajo el explanto. Por el contrario, involucran a todas, o casi todas las células de
las plantas derivadas de otros tejidos como cala planta. Algunos virus, dejan sectores sin in-
llos, nucela, primordios florales o protoplastos, fectar y sólo unos pocos invaden los nuevos
usualmente presentan distintos grados de va- tejidos meristemáticos.

Los meristemas suelen tener pocos o ningún miento inducido por ARN); este complejo sepa-
virus. Las razones para ello no están esclareci- ra la doble hebra del siARN y une sólo una de
das completamente pero se mencionan como ellas. La hebra de siARN actuará como guía en
posibles las siguientes: la identificación de los ARNs mensajeros blanco
1.-Sistema vascular poco diferenciado. Los de degradación a través del apareamiento de
virus son rápidamente transportados a lo largo secuencias complementarias.
de toda la planta por el floema, y así se dis-
tribuyen sistémicamente. Los meristemas no En algunos organismos como plantas e in-
tienen tejido vascular formado por lo tanto el sectos, este proceso sirve como defensa fren-
avance es solamente a través del movimiento te a virus, ya que la mayoría de ellos producen
célula a célula. Se comprobó que el Tobacco ARN de doble cadena en algún momento del
mosaic virus (TMV) y el Potato virus X (PVX) ciclo infectivo. El mecanismo de silenciamiento
avanzan 1 a 8 cm/h por el tejido vascular y 5 puede inhibir la acumulación de virus en una cé-
a 15 µm/h célula a célula. Por esta razón se lula e impedir que se difunda, dado que existe
supone que las células meristemáticas no es- un proceso de diseminación sistémica del silen-
tán completamente invadidas por virus cuando ciamiento. Es decir, que la inducción del silen-
están en activo crecimiento. ciamiento en la zona de infección genera una
2.- Alta actividad metabólica. Presumible- señal móvil que inicia el silenciamiento en zonas
mente es más difícil para un virus invadir cé- distantes del organismo. Esta señal podría mo-
lulas con alta actividad metabólica, como las verse a través del floema, o de una célula a otra
células meristemáticas donde está ocurriendo por plasmodesmos.
activa mitosis. Existe además un mecanismo basado en un
3.-Altas concentraciones de auxinas. Se ha principio similar que regula la expresión de ge-
observado que altas concentraciones de 2,4-D nes endóngenos.
en el medio de cultivo inhibe la multiplicación Algunos trabajos proponen un modelo de de-
de los virus. Por lo tanto se puede suponer que fensa en el cual ciertas proteínas involucradas
las altas concentraciones de auxinas endóge- en el silenciamiento suministran una señal que
nas existentes en los ápices meristemáticos gatilla una inmediata respuesta de silenciamien-
pueden producir un efecto similar. to contra el virus en las zonas de crecimiento y
4.- Algunos experimentos sostienen la hi- en las nuevas hojas emergentes. De este modo
pótesis de que la habilidad de los meristemas el mecanismo de señal de silenciamiento podría
para escapar de las infecciones virales se explicar, al menos en parte, porque algunos vi-
debe a un mecanismo de silenciamiento ge- rus, no invaden los meristemas de plantas in-
nético viral ocurrido en células meristemáticas, fectadas.
cuyo objetivo es la degradación del ARN viral.
El silenciamiento génico es un mecanismo de Factores que pueden afectar la
regulación mediante el cual la célula impide la producción de plantas libres de
expresión de un gen. El silenciamiento génico patógenos sistémicos
postranscripcional implica la degradación de Varios factores pueden afectar el desarrollo
un ARN mensajero, impidiendo su traducción in vitro de una planta a partir de un meristema:
y de esta forma evitando la síntesis de la pro- el medio de cultivo empleado, el estado fisioló-
teína correspondiente. Este proceso comienza gico del explanto, la concentración de hormo-
en la célula a partir de ARN de doble cadena nas endógenas, las contaminaciones internas
(ARNdc), el cual es procesado por una ARNa- o externas producidas durante el desarrollo del
sa tipo III denominada Dicer (o Dicer-like en cultivo, el tamaño y localización del explanto,
plantas). El procesamiento genera fragmentos etc. Mencionaremos aquí algunas consideracio-
de 21-26 nucleótidos denominados pequeños nes haciendo especial referencia a aquellas que
ARNs de interferencia (siARN). El siARN se afectan la obtención de plantas libres de virus.
une al complejo de enzimas que degradarán Localización del explanto. Frecuentemen-
el ácido nucleico (RISC, complejo de silencia- te se utilizan meristemas apicales y axilares

con buenos resultados para la producción de especie vegetal que se trate y el, o los, virus
plantas libres de virus. Sin embargo es aconse- involucrados. En términos generales, cuanto
jable el uso de yemas terminales ya que tienen más grande resulte el explanto mayor será la
un mayor crecimiento potencial que las yemas posibilidad de regenerar plantas, pero menor
laterales. En general los meristemas más jó- la posibilidad de obtener plantas libres de vi-
venes se desarrollan mejor que los viejos y rus. Si por el contrario se parte de plantas ya
producen más plantas libres de virus que las saneadas, o lo que se desea es sólo la multi-
yemas laterales, probablemente porque tienen plicación del material in vitro, se podrán usar
un crecimiento más activo que las axilares. Sin yemas o brotes de mayor tamaño y asegurar
embargo también es posible la obtención de así el desarrollo de una planta sin mayores re-
plantas sanas a partir de yemas axilares. querimientos nutricionales.
Estación o momento de la extracción: Existe un gradiente de incremento de con-
los meristemas en activo crecimiento son los centración de virus desde el domo meristemá-
más recomendados por su alto potencial de tico hacia los sucesivos primordios, que coinci-
desarrollo. Esto también favorece las posibili- de con la diferenciación. Esto significa que la
dades de obtener plantas libres de virus. Para probabilidad de obtener plantas libres de virus
especies vegetales con períodos de dormancia es inversamente proporcional al tamaño del
definidos los mejores resultados se obtienen explanto utilizado. Explantos entre 0,2 y 0,5
cuando los meristemas están despiertos y co- mm son los que más frecuentemente producen
mienzan a brotar. En el caso de ser necesario plantas libres de virus. Sin embargo, también
inducir la brotación, los tratamientos más usa- se han reportado buenos resultados con el em-
dos consisten en someterlo a períodos de frío pleo de meristemas más grandes. El tamaño
(variable según la especie), y/o el uso de ácido recomendado es variable y depende del hos-
giberélico. pedante, de los tratamientos previos (termote-
Tamaño del explanto utilizado. El meriste- rapia, quimioterapia, etc.) y el, o los, virus invo-
ma necesita una serie de requerimientos nutri- lucrados. En algunos casos, no sólo es impor-
cionales para cumplir sus funciones de auto- tante considerar la especie de hospedante sino
perpetuación y de generar células para formar también el cultivar, ya que se han detectado
tejidos definidos. Por lo tanto al ser retirado de notables diferencias entre ellos.
la planta debe ser sembrado en un medio de Por otra parte, es probable que el tamaño del
cultivo apropiado, así rápidamente desarrolla meristema por si solo no sea el que determina
una planta completa. Cuanto más pequeño el éxito en la obtención de plantas libres de vi-
sea el meristema más difícil será encontrar rus. Se han detectado numerosos virus en me-
el medio de cultivo adecuado que permita un ristemas apicales de 0,1-0,5 mm en diferentes
buen desarrollo. Se ha observado que sembrar especies (clavel, Nicotiana rustica, N. cleve-
sólo el domo meristemático, en general, no da landii, Chenopodium amaranticolor, poroto, ta-
buenos resultados. En la mayoría de los casos baco, tomate, petunia, papa). Sin embargo se
sólo produce callo que luego puede regenerar ha logrado la obtención de plantas sanas con
plantas. Como se mencionó anteriormente, la explantos de esos tamaños, o mayores, por lo
diferenciación a partir de callo implica un in- que se podría suponer que la eliminación de
cremento en la posibilidad de mutaciones y virus ocurre también durante el proceso de cul-
variabilidad no deseada cuando se intenta ob- tivo in vitro o por alguna otra razón no aclarada
tener plantas genéticamente iguales a la planta todavía.
donante del explanto. Por esta razón general-
mente se cultiva el domo, con uno o dos pri- Desarrollo del cultivo
mordios foliares, a partir del cual se obtiene El primer paso es la extracción del meriste-
con frecuencia una planta completa. ma o explanto. Para ello se corta una porción
El tamaño del explanto así como el núme- de tejido de aproximadamente 1 cm que in-
ro de primordios que deba poseer, dependerá cluye el meristema y se desinfecta. Frecuen-
en cada caso del objetivo que se persiga, la temente se realiza mediante una inmersión en

alcohol seguido de hipoclorito de sodio o cal- y la capa de cera epicuticular es muy reducida.
cio. Luego este trozo es llevado a una cámara La formación de raíces adventicias es rela-
de flujo laminar y con la ayuda de instrumental tivamente fácil de conseguir en plantas her-
estéril y una lupa estereoscópica se procede a báceas, y difícil en leñosas. Existe una etapa
la escisión del explanto. Una vez extraído se de inducción de raíces, de iniciación del creci-
coloca en un medio de cultivo adecuado y es miento y de elongación de las mismas. En esta
mantenido bajo condiciones apropiadas de luz, fase del crecimiento se suele incrementar la
temperatura y humedad para el desarrollo. intensidad de luz para favorecer la rusticación
Fase I. Etapa de iniciación. El objetivo de de las plantas, pero hay que cuidar que ésta
esta etapa es el desarrollo del explanto en no afecte a las raíces. Se puede mejorar esto
forma aséptica. En general ocurre primero un cubriendo con aluminio la base de los tubos o
aumento del tamaño y luego el tejido puede ir usando 0,3% de carbón activado en el medio
tornándose lentamente verde. Posteriormente de cultivo para proporcionar sombra a las raí-
irán desarrollándose brotes o plantas comple- ces.
tas y a partir de estas se pueden obtener ye- En las plantas que se propagan por bulbos,
mas axilares. tubérculos, rizomas, etc., se puede inducir la
Fase II. Etapa de multiplicación. En esta formación de los mismos in vitro para mejorar
etapa el objetivo es la multiplicación activa del la eficiencia en el transplante, ya que éstos
explanto para la producción de numerosas pueden ser cosechados del tubo de ensayo y
plantas a partir de una, constituyendo así un sembrados directamente en tierra sin mayores
clon proveniente de un solo meristema, al que dificultades.
se conoce como mericlon. La multiplicación o Transplante. En el momento del transplan-
micropropagación puede efectuarse por proli- te, es importante no dañar las raíces. Es nece-
feración de brotes axilares, brotes adventicios, sario lavarlas cuidadosamente para retirar los
formación de embriones somáticos, etc., tra- restos de agar, debido a que los medio de cul-
tando siempre de evitar la formación de callo tivo ofrecen un buen sustrato para el desarrollo
como paso previo a la diferenciación. La etapa de hongos y bacterias que pueden afectar el
de multiplicación puede involucrar varios repi- desarrollo de la planta en el suelo.
ques del material a medio de cultivo fresco. Se El mayor problema en esta etapa, es la des-
ha visto con frecuencia que la tasa de multipli- hidratación debido a algunas características
cación varía con el tiempo de permanencia del de las plantas cultivadas in vitro: reducida cera
explanto en el medio de cultivo. Es frecuente epicuticular, lentitud de movimiento estomático,
que después de 2 ó más subcultivos aumente abundantes espacios intercelulares, dificulta-
el número de yemas que se producen a partir des en las conexiones del tallo y la raíz. Por lo
de un explanto. No es aconsejable mantener el cual conviene transferir las plantas a macetas y
material indefinidamente en esta etapa ya que mantenerlas con alta humedad relativa por los
se ha observado un aumento de la variabilidad primeros 15 días. También se han observado
cuando las plantas son mantenidas por largos buenos resultados con el uso de rocío artificial
períodos en estas condiciones. En general se o neblina. Otra práctica frecuente es cubrir las
considera que 10-12 subcultivos es lo máximo plantas con polietileno o recipientes de vidrio
que debería mantenerse el material en esta transparente, a modo de cámara húmeda, y
etapa. descubrirlas progresivamente hasta destapar-
Fase III. Etapa de acondicionamiento para las completamente al cabo de 3 ó 4 semanas.
el transplante a tierra. Frecuentemente las
plantas desarrolladas in vitro no poseen raíces Multiplicación del material ex vitro
o si las tienen muchas veces no son funciona- Las plantas libres de patógenos deben ser
les; y en general, tiene malas conexiones vas- multiplicadas bajo condiciones controladas
culares con el tallo. A nivel foliar puede estar al- para evitar su recontaminación. Una vez rus-
terada la producción de clorofila. Los estomas ticadas y adaptadas nuevamente a las condi-
suelen no funciona o hacerlo muy lentamente, ciones ex vitro pueden ser multiplicadas bajo

jaulas anti-vectores todo el tiempo que se Una práctica muy usada es la combinación
considere necesario. En esta etapa es impor- de la termoterapia y el cultivo de meristemas.
tante evitar que las plantas se reinfecten. Es Esto implica mantener las plantas en termote-
recomendable la esterilización del suelo para rapia por un período variable de tiempo y tem-
evitar la contaminación con nematodes y hon- peratura (entre 34 y 38°C desde una a varias
gos que en algunos casos son transmisores semanas), luego se realiza la extracción del
de virus. Las jaulas deben estar revestidas de meristema, se siembra en el medio de cultivo y
malla muy fina para evitar la entrada los vec- se continua con los pasos convencionales para
tores. Por la misma razón, es recomendable su desarrollo.
una doble puerta de acceso. Periódicamente Esta práctica no es efectiva para todos los
la malla debe ser controlada para detectar ro- virus por igual, depende del virus y del hospe-
turas. Es recomendable aplicar insecticidas y dante. Se ha visto que un mismo virus en dis-
mantener libre de malezas, que puedan actuar tintas especies se inactiva en forma diferente.
como reservorio de vectores tanto dentro como Generalmente esta práctica ha resultado más
fuera de la jaula. Si bien el material introducido efectiva en virus de partículas alargadas, y me-
a las jaulas debe ser previamente controlado nos eficiente para virus poliédricos.
respecto a su sanidad, es conveniente, en esta Podría suponerse que cuanto más largo es
etapa, repetir los análisis para detectar rápida- el tratamiento con calor sería más efectivo, sin
mente si se evidencia una infección y eliminar- embargo no resulta siempre así. En crisantemo
la antes de que se propague. En estas condi- y ajo, por ejemplo, se ha observado que tra-
ciones es posible mantener “plantas madres” tamientos de 10-30 días pueden ser efectivos
por mucho tiempo, como un stock de material para la liberación de algunos virus, en cambio
libre de virus a partir del cual realizar sucesivas tratamientos mas prolongados no siempre pro-
multiplicaciones. ducen mayor porcentaje de plantas sanas. Ade-
La etapa de multiplicación masiva, o a gran más dificultan la implantación del tejido acon-
escala, se realiza a campo en áreas aisladas diciones in vitro, traduciéndose en un número
de focos de contaminación. Esta etapa se ex- menor de plantas obtenidas.
tiende todo el tiempo necesario hasta obtener En algunos casos la combinación de bajas
el número requerido de individuos como para temperaturas (5°C) seguido del cultivo de me-
realizar una producción comercial. Si el área ristema fue utilizada con éxito para la limpieza
protegida está lo suficientemente alejada de de virus. Esta práctica se aplicó sobretodo en
plantas infectadas y se evita el acceso de los el caso de viroides, que se desarrollan bien con
vectores, es posible mantener estas plantas altas temperaturas.
por muchos ciclos de cultivo. Son fundamen- Quimioterapia. El uso de antivirales sería la
tales en esta etapa los análisis periódicos que solución definitiva para estas enfermedades,
permitan llevar un registro del estado sanitario sin embargo hasta ahora no se ha encontrado
del material. un compuesto así. Algunas sustancias químicas
ocasionan una disminución en la concentración
Alternativas para mejorar la eficiencia en de virus, y atenúan o suprimen los síntomas
la producción de plantas libres de virus que produce la infección, pero suspendido el
Termoterapia. Es la técnica más antigua tratamiento se recupera la concentración viral.
utilizada para la liberación de patógenos en Se han evaluado diferentes sustancias, la más
plantas. Pero sólo con el empleo de altas tem- utilizada es la Ribavirina (1-b-D-ribofuranosyl-1,
peraturas, difícilmente se consigan plantas li- 2, 4–triazole–3-carboxamide, Virazole™ es el
bres de virus. Mantener las plantas enfermas nombre comercial). Sin embargo un problema
por períodos prolongados a altas temperaturas importante con este compuesto es su fitotoxici-
disminuye la concentración de virus en la plan- dad, que depende de la dosis empleada y de la
ta, pero al llevarlas nuevamente a condiciones especie tratada. El éxito del proceso en muchos
normales, en poco tiempo recuperan el nivel casos requiere de varios meses de tratamiento
original. y la fitotoxicidad puede constituir una dificultad.

Un modo adecuado de empleo de los antivi- ma de la variedad a injertar, y luego sembrarlo
rales es la combinación con el cultivo de me- sobre la superficie decapitada del epicótilo de
ristema. En algunos casos han sido aplicados una plántula proveniente de semilla crecida in
directamente a los meristemas in vitro, colo- vitro. Se trabaja con plántulas crecidas in vitro,
cando el antiviral en el medio de cultivo. Las de aproximadamente 2 semanas de edad. Se
plantas son mantenidas bajo la acción del an- las extrae del tubo y se corta el epicótilo y el
tiviral por largos períodos que incluyen varios ápice de la raíz (dejando un trozo de 4-6 cm).
subcultivos. Los cotiledones y yemas axilares también se
También se han obtenido plantas libres de eliminan. En la base del tallo cortado se practi-
virus a partir de callos a los que previamente se ca una incisión en forma de "T" invertida, don-
aplicó Ribavirina, aunque la práctica no ha sido de se coloca el meristema (domo con 1, o 2
eficiente en todos los casos. primordios foliares) proveniente de la planta
Electroterapia. El método consiste en apli- de campo que se desea injertar. Las plantas
car corriente eléctrica a yemas por un período microinjertadas se colocan en medio de cultivo
variable de tiempo para obtener plantas libres adecuado para su desarrollo, y cuando tienen
de patógenos. Se supone que la aplicación de 2-3 hojitas, se injertan en plantas normales de
electricidad produce la degradación de las par- vivero.
tículas y pérdida de infectividad. Esta técnica
ha sido implementada para liberar de mosaico Análisis de las plantas obtenidas
al almendro cv Caetanuccia. En este caso, bro- Como hemos visto existen varias alternati-
tes de 9,6 mm se sometieron a 500 V por tiem- vas para obtener plantas libres de virus a partir
pos variables y luego se injertaron sobre pies del cultivo de meristemas, y si bien contamos
sanos (obtenidos por semilla). Con 5 minutos con lineamientos o consideraciones generales
de tratamiento los resultados fueron buenos, y para aumentar las posibilidades de éxito, no
con 20 minutos se obtuvo completa inactiva- hay proceso que ofrezca total seguridad. La
ción viral. El método también ha sido emplea- etapa decisiva en este sistema es el análisis de
do para eliminar bacterias de caña de azúcar, las plantas obtenidas, cuando comprobamos si
Potato leaf roll virus de papa, Dasheen mosaic realmente se alcanzó el objetivo. Empleando el
virus de araceas y Banana streak virus de ba- mismo protocolo, en el mismo momento, con el
nana, entre otras. La eficiencia de la técnica mismo material, es posible obtener plantas sa-
puede depender del cultivar, el patógeno y el nas y plantas que aún permanecen infectadas.
genotipo. Por lo tanto, la única forma de diferenciarlas
Cultivo de domo proveniente del disco ba- será mediante pruebas o tests que establezcan
sal (del inglés, stem-disc dome culture). El pro- su estado sanitario. El éxito de un programa
cedimiento consiste en la obtención de plantas de producción de plantas libres de virus no de-
libres de virus a partir del cultivo de estructuras pende de la obtención de un alto porcentaje de
con forma de domo, diferenciadas a partir del plantas sanas en al primera etapa, sino de al
cultivo del disco basal de dientes de ajo. Se menos unas pocas plantas madres realmente
ha informado la diferenciación de 20-30 brotes libres de patógenos, que luego podremos mul-
a partir del cultivo del disco basal de dientes tiplicar por diferentes sistemas. Es recomenda-
de ajo en 1 mes de cultivo. Originalmente, el ble analizar las plantas madres más de una vez
método se llamó cultivo del disco basal (stem- para asegurar su sanidad, es preferible que
disc culture). Una modificación posterior de sea en etapas diferentes a lo largo del proceso,
esta técnica que consiste en la extracción de y en lo posible por técnicas distintas.
las estructuras con forma de domo y su cultivo Para realizar un análisis confiable hay que
en medio adecuado, permite obtener plantas tener en cuenta varios factores que son espe-
libres de virus. cíficos para cada combinación planta-patóge-
Microinjerto de ápices caulinares in vitro no. La elección de la técnica de análisis depen-
para obtención de plantas de naranjo libres de derá del patógeno y de las posibilidades para
virus. La técnica consiste en extraer el meriste- realizarla. Es importante el empleo de sistemas

de alta sensibilidad que nos permitan detectar satisfactorios, sin embargo cuando se las utili-
los virus aún en bajas cantidades. Sin embargo za solas fallan en la detección de muchas plan-
no existe una prueba que sea infalible, siempre tas infectadas (falsos negativos).
hay un límite de concentración del patógeno por Mejores resultados se han obtenido con el
debajo del cual no puede ser detectado. Para empleo de técnicas que combinan la serología
evitar errores en este sentido es recomenda- con la microscopía electrónica como son la in-
ble tener en cuenta algunas consideraciones. munoelectromicroscopía con o sin decoración
Como ya se ha mencionado, la concentración (ISEM ó ISEM-D). Estas técnicas son altamen-
de virus no es igual en todas las partes de una te sensibles y permiten la observación directa
planta, por lo tanto, es recomendable estable- del virus por lo cual no hay falsos positivos y no
cer en que tipo de tejidos u órganos se conse requiere un antisuero de alta calidad para su
centra el patógeno, y realizar la prueba a partir desarrollo. El inconveniente es que no son de
de ellos. Del mismo modo, se ha comprobado uso masivo debido a que es engorroso analizar
que existen fluctuaciones en la concentración gran cantidad de muestras, y a que el equipa-
viral a lo largo del ciclo de cultivo, por lo tanto miento que se requiere (microscopio electróni-
es conveniente realizar las pruebas en varias co) es altamente costoso.
ocasiones o bien, si se conoce, en aquel punto Las técnicas basadas en la detección de
en que virus alcanza su mayor título. Esto es los ácidos nucleicos han mostrado un gran
sobretodo importante cuando se prueba el ma- desarrollo y evolución en la última década, y
terial transferido a campo. son utilizadas con frecuencia debido a su alta
Cuanto más temprano descartemos las sensibilidad y especificidad. El uso de sondas
plantas contaminadas más seguro será el sis- moleculares ha dado buenos resultados. La
tema. Una planta infectada siempre es un foco reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
de contaminación, y por más cuidados que se sus variantes son las técnicas de mayor sensi-
tengan siempre se corren riesgos. Cuando las bilidad que se cuenta hasta el presente. Entre
plantas están in vitro, en general, la concen- ellas se mencionan: PCR anidado, transcripta-
tración de virus es muy baja, probablemente sa reversa (RT)-PCR, inmuno captura (IC) RT-
debido a las condiciones de cultivo, la concen- PCR, entre otras. Esto posibilita detectar los vi-
tración de hormonas en el medio, u otros facto- rus, aún en bajísimas concentraciones. Si bien
res no muy claros. Sin embargo las plantas no estas pruebas son altamente sensibles, aún no
deben dejar de analizarse en esta etapa. son de uso masivo.
Frecuentemente se menciona el empleo de Para obtener resultados confiables es reco-
la técnica inmunoenzimática de doble sánd- mendable la combinación de varias pruebas,
wich de anticuerpos (DAS-ELISA). Esta téc- es decir aprovechar la practicidad del ELISA y
nica tiene varias ventajas: permite el análisis la sensibilidad de las técnicas moleculares, de
simultáneo de muchas muestras (96 celdas por ISEM, u otras. En este caso las plantas que
placa, varias placas por ensayo), es relativa- resultan negativas a ELISA pueden ser luego
mente fácil y de bajo costo. Sin embargo, no es analizadas por una técnica más sensible y dis-
lo suficientemente sensible como por ejemplo minuir así el número de pruebas complicadas
para detectar virus en muestras de plantas in o costosas.
vitro. En estos casos, muchas de las plantas Como se mencionó anteriormente, la con-
in vitro que dan resultados negativos median- centración de virus en las plantas in vitro en
te DAS-ELISA resultan positivas cuando se general es baja, por lo tanto se corre el grave
prueban por otra técnica más sensible. Algu- riesgo de considerar como sanas, plantas que
nas variantes como ELISA en membrana de ni- en realidad están infectadas. Por esta razón se
trocelulosa, o dot blot (las proteínas se aplican hace casi obligatorio repetir los análisis en las
directamente en las membranas, sin pasar por plantas ex vitro. Es necesario dejar pasar cier-
los procesos de electroforesis y transferencia; to tiempo antes de hacer el análisis para que
el revelado es similar al de un western blot), el virus, si está presente, tenga la posibilidad
también han sido empleadas con resultados de incrementar su concentración y resulte más

fácil detectarlo. En esta etapa es frecuente la Consideraciones respecto a los análisis
utilización de ELISA en cualquiera de sus va- de virus
riantes, con buenos resultados. En general, cuando se habla de las plantas
En algunos casos el sistema que resulta liberadas de virus se emplean términos como
más eficiente para analizar las plantas obteni- "plantas libres de virus" "planta sana", "sanea-
das, es el empleo de plantas indicadoras. El da", sin que se defina que virus fueron elimi-
injerto es la forma más segura de transmitir un nados ni que pruebas se emplearon para com-
virus y esto es lo que se emplea como sistema probar su eliminación. El concepto de plantas
de diagnóstico. Se realiza un injerto desde la libres de virus debería estar acotado a los vi-
planta que se desea probar a plantas suscep- rus analizados. En el caso de plantas que son
tibles (indicadoras) y que desarrollan síntomas afectadas por un conjunto de virus diferentes
evidentes de la presencia del patógeno. El in- sería necesario realizar un análisis indepen-
conveniente en este tipo de análisis, es que diente para cada uno de ellos y señalar el, o
hay que esperar que la planta obtenida in vitro los, virus de los cuales ha sido liberada o pro-
sea transferida a suelo y que desarrolle lo sufi- bada. Por otra parte debe definirse la técnica
ciente como para extraer una porción de tejido de análisis empleada, ya que no todas tienen la
(hoja, yema, brote, etc., según el tipo de injer- misma sensibilidad. Todas las técnicas tienen
to). Además necesitamos un operador con ha- un límite de sensibilidad por debajo del cual no
bilidad para realizar el injerto con éxito, y luego, son capaces de detectar la presencia del pa-
mantener las plantas injertadas en condiciones tógeno. Por consiguiente, dependiendo de la
adecuadas hasta que aparezcan los síntomas. sensibilidad de la técnica que se use, el por-
En algunos casos este tiempo puede ser muy centaje de plantas supuestamente "libres de
prolongado. A pesar de los inconvenientes que virus " puede variar. Lo correcto sería entonces
se mencionan, para algunas especies, este si- hablar de plantas negativas a los virus proba-
gue siendo el método más seguro. Por ejem- dos y mencionar las técnica usada.
plo en frutilla, una especie afectada por más
de 20 enfermedades diferentes de las que en Ejemplos de sistemas de producción de
muchos casos ni siquiera se ha caracterizado plantas libres de patógenos sistémicos
el agente causal, la transmisión a plantas in-
dicadoras resulta la prueba más efectiva. En Producción de plantas de ajo libres de
este caso se injerta el folíolo medio de la planta virus.
que se desea probar a plantas indicadoras en Conci V.C., Cafrune E., Perotto C. y
las cuales los patógenos van a dar síntomas Quevedo V. INTA-IFFIVE. Córdoba.
notables. Algunos virus se van a manifestar Argentina.
después de 2 ó 3 semanas de realizado el in- Entre los patógenos que afectan al cultivo de
jerto, en otros casos la bibliografía menciona ajo los virus son los responsables de las mayo-
que los síntomas aparecen recién después de res pérdidas en los rendimientos, ocasionando
6 meses, ó incluso 1 año. Con frecuencia no es entre un 20 y 80% de disminución en el peso
posible identificar que virus es el que está prede los bulbos. Las infecciones causadas por
sente, pero es posible determinar si la planta numerosos virus, si bien no causan la muerte
está infectada. de la planta, producen enfermedades crónicas.
En vid parte de los virus son analizados me- Debido a que el ajo se propaga exclusivamente
diante ELISA, sin embargo para otros se utili- de forma agámica, las plantas infectadas por
za el injerto a plantas indicadoras. Algunos de diferentes combinaciones de estos virus los
los virus pueden ser detectados en pocas se- transmiten a las sucesivas generaciones y a
manas, pero para síndromes como el del tallo las distintas regiones de producción. La utiliza-
estriado o agujereado (stem pitting/grooving) ción de materiales libre de virus, obtenido por
por ejemplo, es necesario esperar entre 8 y 12 cultivo de meristemas, es por el momento la
meses. única forma de control utilizada.

En trabajos realizados en Argentina se ensa- establecen una serie de categorías de semi-
yaron tratamientos de termoterapia con agua lla (Básica, subcategoría Preinicial, Inicial y
y con aire caliente, previos a la extracción de Fundación; Registrada, subcategoría A y B; y
los meristemas. Los mejores resultados se ob- Certificada), cada una de las cuales contempla
tuvieron con aire caliente, con un 30-100% de un valor máximo tolerado para la presencia del
plantas "libres de virus". En algunos cultivares virus Onion yellow dwarf virus, responsable en
no se consiguieron plantas "libres de virus" sin nuestra región de las mayores pérdidas en los
el empleo de termoterapia; mientras que algu- rendimientos. Sin embargo, dado el avance de
nos genotipos fueron liberados sólo con el em- los conocimientos respecto al daño que produ-
pleo del cultivo de meristema. cen otros virus, seguramente algunos otros se-
En la Figura 1 se describe el procedimiento rán considerados en el futuro.
utilizado para la obtención de las plantas de ajo
libres de virus. Se inició con la extracción del Plantas cítricas libres de enfermedades.
meristema incluyendo el disco basal. Se des- Costa N., Plata M.I. y Anderson C.
infectó y se extrajo el explanto constituido, en INTA EEA. Entre Ríos, Argentina.
este caso, por el domo más un primordio foliar. Las enfermedades producidas por virus, vi-
Se sembró en medio de iniciación para desa- roides y otros organismos similares producen
rrollar una planta completa (Fig. 1A). Las plan- importantes pérdidas económicas en los cí-
tas obtenidas se analizaron mediante ISEM-D, tricos de todo el mundo. Algunas provocan la
con antisueros específicos para los virus de muerte de las plantas y otras disminuyen la
interés. Las plantas que resultaron negativas producción y la calidad de la fruta, causando
a todas las pruebas se transfirieron a medio de pérdida de vigor y de longevidad de la planta.
micropropagación (Fig. 1B). Luego de varios Las principales enfermedades causadas por
ciclos in vitro muchas plantas bulbifican espon- este tipo de microorganismos son psorosis,
táneamente y otras deben ser inducidas (Fig. tristeza, exocortis y cachexia. Estas enferme-
1C). Los minibulbillos obtenidos in vitro se co- dades se han extendido, debido a la propa-
secharon y se sembraron en suelo estéril. Las gación vegetativa de material infectado. Es
plantas que no formaron bulbos se transfirieron normal encontrar varias virosis en una misma
a maceta y se mantuvieron en cámara húmeda planta y en muchos países como Argentina,
por un período de tiempo variable luego, se las casi la totalidad de las plantas adultas están
adaptó de manera paulatina a las condiciones afectadas por alguna virosis.
naturales de humedad y temperatura (Fig. 1D- La psorosis y otras enfermedades se trans-
E). Las plantas ex vitro se probaron mediante miten mediante el injerto de yemas. Una vez
DAS-ELISA para constatar su estado sanitario, hecho el injerto, la planta puede permanecer
y se mantuvieron bajo jaulas anti-vectores. Los con la enfermedad latente durante muchos
bulbos cosechados se conservan en lugar fres- años. Las yemas que se extraigan de una plan-
co y seco hasta la época de siembra. Las su- ta con enfermedad latente originarán plantas
cesivas multiplicaciones se realizaron en jaulas enfermas.
donde se continuó analizando las plantas, me- Los países con citricultura de avanzada han
diante pruebas de DAS-ELISA (Fig. 1F-G). Los basado su éxito en el empleo de Programas de
bulbos producidos se entregaron a semilleros Certificación utilizado plantas libres de enfer-
que realizan la multiplicación en áreas aisladas medades.
de otros cultivos de Alliaceae, hasta obtener el La termoterapia y la obtención de plantas nu-
número de bulbo-semilla suficiente como para cleares han sido técnicas muy utilizadas para
iniciar una producción comercial. este objetivo. Actualmente en gran parte de los
La implementación de programas tendientes países citrícolas, que tienen programas de eli-
a la producción de plantas de ajo libre de vi- minación de virus y viroides, se utiliza la técni-
rus y el control de enfermedades es importante ca de microinjerto de ápices caulinares in vitro.
ya que en Argentina rigen normativas para la La combinación de las técnicas de termote-
fiscalización de semilla de ajo. Estas normas rapia y de microinjerto de ápices caulinares in

Figura 1.- Producción de plantas de ajo libres de virus. A: planta en medio de iniciación. B: micropropa-
gación. C: bulbillos obtenidos in vitro (microbulbillos). D: planta transferida a tierra y mantenida en cámara
húmeda. E: planta adaptada a las condiciones ex vitro. F: plantas en suelo bajo jaula antiáfidos. G: mul-
tiplicación a gran escala bajo jaula antiáfidos. H: bulbos de ajo libre de virus (arriba) e infectados (abajo).

vitro logra obtener un alto porcentaje de plan- seleccionada la planta, se la somete a termo-
tas cítricas libres de virus. terapia y cultivo de tejido, empleado la técnica
En la Figura 2 se describe el procedimiento de microinjerto de ápices caulinares in vitro.
para la obtención de plantas cítricas libres de Esta técnica comprende las siguientes etapas:
virus. En primer lugar se selecciona una plan- preparación del portainjerto, preparación del
ápice, injerto, cultivo de plantas injertadas e
ta candidata en base a las introducciones de
injerto sobre un plantín vigoroso. Las plantas
variedades cítricas de copa y portainjerto que obtenidas por microinjerto no presentan carac-
se realizan a los Bancos de Germoplasma, de teres juveniles y en las plantas obtenidas no se
selecciones locales y de variedades obtenidas han observado anormalidades con respecto a
en los programas de mejoramiento. Una vez la planta madre (Fig. 2).
Figura 2. Obtención de plantas cítricas libres de enfermedades. A: planta obtenida por microinjerto de
ápices caulinares in vitro. B: injerto sobre un plantín vigoroso. C: membrana de inmunoinmpresión-ELISA
con huellas de tallos de plantas infectadas con tristeza. D: moteado causado por psorosis. E: epinastia
causada por exocortis. F: acanaladuras causadas por cachexia-xiloporosis. G: invernáculo con plantas
madres libres de enfermedades.

El éxito de la técnica depende en gran medi- Monte Fundación. Plantas de reserva y donan-
da del tamaño del tejido extraído y del patóge- te de materiales de propagación, generalmente
no a eliminar. En el caso de exocortis, tristeza constituido por tres plantas de cada cultivar o
y cachexia, el porcentaje de plantas libres es portainjerto obtenidas por propagación agámi-
superior al 90%. E virus de la psorosis de los ca de la Planta Inicial.; 3) Un monte de Plantas
cítricos es bastante más difícil de eliminar. de Base con al menos diez plantas por cultivar
Una vez obtenida la planta de microinjerto y/o portainjerto, derivadas propagación agámi-
y cuando tiene tamaño suficiente se realizan ca del Monte Fundación. Son las Plantas Ma-
las pruebas de diagnóstico para comprobar dres de Propagación, sometidas a rigurosos
que estén libres de patógenos. Las técnicas controles sanitarios y varietales, anuales; 4)
de diagnósticos para cada enfermedad pueden Producción de Plantas Certificadas para vive-
ser varias pero, en caso se existir organismo ros expendedores derivadas propagación agá-
nacionales o internacionales de referencia, es mica de Plantas de Base.
conveniente emplear aquellas reconocidas o Obtención de la Planta Inicial. 1) Selec-
recomendadas por ellos. Por ejemplo en este cionar plantas por su pureza varietal y condi-
caso podría tratarse de PROCITRUS (proyecto ciones agronómicas candidata a Planta Inicial.
INTA para la obtención, producción, manteni- 2) Determinar su estado sanitarios mediante
miento y distribución de portainjertos y cultiva- transmisión a plantas indicadoras, pruebas se-
res de especies cítricas con identidad varietal rológicas, moleculares y/o microscopia electró-
y estado sanitario controlado), o el Programa nica. 3) Si ninguna de las plantas resulta libre
Nacional de Certificación de Cítricos. En este de patógenos sistémicos, aplicar termoterapia
caso existe una normativa específica para el seguida de cultivo de meristemas. Los contro-
funcionamiento de los laboratorios de diagnós- les sanitarios de las plantas regeneradas per-
tico de enfermedad en cítricos, aprobado por mitirán seleccionar la Planta inicial.
INASE y SENASA, ambos dependientes de la Termoterapia y cultivo de meristemas. 1)
SAGPyA (Secretaría de Agricultura, Ganade- Enraizar en suelo estéril estacas de las plantas
ría, Pesca y Alimentación). seleccionadas, y/o de portainjertos de Sanidad
Certificada para injertar yemas de las candi-
Producción de Prunus libres de virus. datas a Planta Inicial. 2) Colocar las plantas
Docampo DM. INTA-IFFIVE. enraizadas y con brotes (en actividad) en cá-
Córdoba, Argentina. maras donde reciban terapia con aire caliente.
Monitoreos realizados en especies frutales 3) Temperatura: varía con la relación cultivar-
del género Prunus del área frutícola templada patógeno. En general se usa 34-38 ºC. 4). Fo-
Argentina evidenciaron el deterioro sanitario de toperíodo: 16 h de luz (tubos fluorescentes de
plantaciones en producción y de propagación. luz blanca, 3,5-4,0 Klux). Riego diário. Hume-
Una de cada cuatro plantas analizadas se en- dad relativa: 60 y 80%. 5) Tiempo: varía con
contró infectada por uno o más virus. Varios la relación planta-patógeno. Oscila entre 3 y 7
factores facilitaron esta situación: carencia de semanas. 6) Retirar las plantas de la termote-
controles sanitarios, ineficacia de los métodos rapia. A continuación extraer los meristemas de
empleados en los análisis, dispersión por vec- las yemas desarrolladas durante el tratamiento
tores, diseminación de materiales infectados y sembrar en medio de cultivo in vitro.
por la comercialización. Micropropagación. 1) Sembrar meristemas
Un Sistema de Certificación Sanitaria de de 0,3-0,5 mm (con uno o dos primordios folia-
Plantas Perennes se fundamenta en producir el res), e identificar el material. 2) Repicar e iden-
número de plantas requeridas por el mercado tificar individualmente cada yema del yemario
a partir de una Planta Inicial. Básicamente re- originado. Cada una originará un clon. 3) Repi-
quiere:1) Obtener la Planta Inicial de cultivares car las yemas manteniendo la individualización
y/o portainjertos seleccionada por sus caracte- del clon. No superar diez ciclos de micropro-
res agronómicos, pureza varietal y su estado pagación. 4) Control Sanitario. Antes de la ter-
sanitario. Constituye el material fundacional del cera multiplicación, tomar al menos 3 plantas
cual derivará todo el material certificado; 2) Un de cada clon y analizar la presencia de los pa-

tógenos que se estableció eliminar. Mantener (eds). Plant virus deasease control. The American
estas plantas al menos una semana fuera de Phythopathology Society. St. Paul, Minnesota,
la cámara de cultivo, bajo luz, temperatura y USA. pp 346-380.
Gella Fañanas R. 1993. Obtención de planta
humedad adecuada para que los patógenos,
certificada. Servicio de Investigación Agraria.
si los hubiera, incrementen su población para Diputación General de Aragón. España. pp 33.
facilitará su detección. El control sanitario de- Hernandez R. et al, 2001. “Electrotheraphy”
berá incluir transmisión a plantas indicadoras, Technique eliminates viral and bacterial infection
pruebas serológicas, microscopía electrónica y from plant shoot-tip cultures. INIVIT, Santo
técnicas moleculares. Eliminar los clones que Domingo, Cuba.
no superen el control. Hu C.Y. and Wang P.J. 1983. Meristem shoot tip,
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del agar. 2) Plantar en terrinas plásticas desin- London. pp 177-227.
fectadas con NaOCl al 15 %, en una mezcla de Kartha K.K. 1981. Meristem culture and
turba, mantillo y perlita 1:1:1 estéril. 3) Colocar cryopreservation-methods and applications. In:
las terrinas en cámaras del 90-100% de hume- Thorpe A.T. (ed). Plant tissue culture methods
dad relativa, luz continua (tubos fluorescentes and applications in agriculture. Department of
de luz blanca 3,5-4,0 Klux), Temperatura entre Biology, University of Calgary, Calgary, Alberta,
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15-35 ºC. 4) A los 30 días transplantar a cesti- Kartha K.K. 1984. Elimination of virus. In Vasil I.K.
llos. Mantenerlos bajo túneles de polietileno en (ed). Cell culture and somatic cell genetics of
invernadero. 5) Retirar el plástico lentamente, plants. Academic Press, Inc. pp 577-585.
una parte cada 2-3 días hasta su retiro defi- Navarro L. 1979. Microinjerto de ápices caulinares
nitivo. 6) Control Sanitario. Como se describió in vitro para la obtención de plantas de agrios
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V. CAPÍTULO 10 son rutina en muchos laboratorios de desarro-
llo tecnológico e investigación. No obstante, al-
gunos aspectos como el aislamiento de genes
candidatos y su efectiva expresión en plantas
Obtención de plantas resistentes aún son estudiados y ajustados.
a insectos Las estrategias exploradas en la búsqueda
de genes que pueden generar resistencia a in-
Dalia Lewi; Clara Rubinstein sectos en vegetales son diversas. El espectro
de genes candidatos a aportar resistencia a
Breve introducción sobre manejo de distintas plagas para la agricultura puede pro-
plagas en agricultura y sistemas de venir de diversas fuentes, tanto vegetales como
control bacterianas. También se está investigando la
posibilidad de conferir resistencia mediante el
Aplicaciones de la biotecnología en el uso de técnicas que involucran interferencia de
control de insectos plaga ARN (RNAi). Los genes que producen endo-
La preocupación pública por los riesgos in- toxinas, como los Bt, derivados de la bacteria
herentes al uso de pesticidas para el control del suelo Bacillus thuringiensis, son los más
de insectos estimuló la búsqueda y el desa- explorados y los únicos que hasta el momento
rrollo de alternativas menos riesgosas para el tienen aplicación comercial.
ambiente. La adición de genes mediante la in- Dada la numerosa cantidad de genes rele-
geniería genética para desarrollar variedades vados e identificados como posibles fuentes
vegetales con resistencia a insectos es una he- de resistencia a insectos, se podrían agrupar
rramienta muy útil para complementar el mejo- según el origen de las secuencias candidatas
ramiento genético vegetal. Mediante diversos en: i) genes de origen bacteriano (Bt); ii) genes
métodos, ya se han transferido a varias espe- de origen vegetal (inhibidores de proteasas,
quitinasas, avidina, lectina); iii) secuencias de
cies vegetales numerosos genes provenientes
insectos (estrategia de RNAi)
de un amplio rango de plantas y bacterias, que
confieren resistencia a insectos, enfermedades
i) Bacillus thuringiensis (Bt)
y tolerancia a herbicidas. En la experiencia su-
El microorganismo Bacillus thuringiensis, co-
mada hasta el momento, los genes transferi-
múnmente conocido como Bt, es una bacteria
dos son heredados normalmente a las proge-
aeróbica, gram positiva que se encuentra na-
nies sin efectos adversos en las plantas que
turalmente en el suelo y ha sido utilizada como
los contienen, y las plantas transgénicas han insecticida biológico desde hace más de medio
mantenido los niveles de resistencia a campo. siglo. Descubierta en Japón en 1902, esta bac-
En todos los casos, la transgénesis debe estar teria produce proteínas de inclusión en forma
integrada a un sistema de manejo de plagas de cristales, llamadas δ-endotoxinas o proteí-
ecológicamente sustentable. nas Cry, durante la esporulación. Estos crista-
En el año 2007, de las 114 millones de les son específicamente tóxicos para insectos,
hectáreas que se cultivaron globalmente con especialmente los lepidópteros. Luego de la
OVGMs (Organismos Vegetales Genéticamen- ingestión de los cristales, las toxinas actúan a
te Modificados), un tercio (42 millones) fueron nivel del intestino de la larva. Los cristales son
de eventos con resistencia a insectos. Ya se disueltos por los jugos alcalinos del intestino
han obtenido transformaciones estables en que convierten a las protoxinas en fragmen-
unas 100 especies vegetales, entre las cuales tos tóxicos -toxinas- que dañan las células del
se incluyen maíz, trigo, soja, tomate, algodón, epitelio intestinal de las larvas. En mamíferos
papa y arroz. También se han obtenido eventos superiores no existen sitios de reconocimiento
que combinan la resistencia a insectos con la de estas toxinas, razón por la cual no resultan
resistencia a herbicidas en maíz y algodón. tóxicas para humanos.
Tanto las técnicas de transformación genéti- Las preparaciones de cristales son usadas
ca vegetal como las de ingeniería genética ya como insecticida desde hace más de 60 años

en numerosos cultivos, especialmente en huer- nes de proteínas Cry mediante transgénesis
tas orgánicas. Los cristales individuales suelen en numerosas especies vegetales: forestales
ser una mezcla de toxinas, cada una de las (álamo, eucalipto, alerce), cereales (maíz, tri-
cuales posee especificidad sobre un tipo de in- go), leguminosas (garbanzo, soja, maní), hor-
sectos. Respecto a su utilización en biotecnolo- tícolas (papa, tomate, repollo, brócoli, batata),
gía, una de las ventajas que poseen las toxinas y frutales (manzano, frutilla). Todos los cultivos
derivadas de Bt en el contexto de los eventos comerciales aprobados con resistencia a in-
transgénicos, es la especificidad con la que ac- sectos poseen genes derivados de Bt (tabla 1).
túan. Por tratarse de eventos que contienen un Manejo del cultivo Bt: refugios
gen codificante para un tipo de toxina, se ob- Para que el uso y la aplicación exitosa de
serva que la actividad insecticida es específica la tecnología de resistencia mediante la expre-
hacia los insectos plaga que se quiere contro- sión de genes derivados de Bt pueda perpe-
lar en cultivos que expresan estas proteínas. tuarse en el tiempo se debe considerar el uso
Esto constituye una ventaja sobre otros siste- de refugios. La posibilidad potencial de desa-
mas de control, ya que los insectos que no son rrollo de resistencia a las plantas insecticidas
plaga, así como los insectos benéficos, no son es considerado uno de los temas principales
afectados. Además, esta especificidad permite de preocupación sobre esta tecnología, debido
implementar sistemas de manejo integrado de a que ya han aparecido casos de resistencia a
plagas para combatir otros insectos que no son productos para espolvorear, derivados de Bt.
Por esta razón, el desarrollo de planes de ma-
controlados por estas toxinas.
nejo de la resistencia de insectos es de suma
Hasta el momento existen alrededor de 400
importancia. De las estrategias consideradas,
genes aislados que codifican para toxinas di-
la más efectiva es la alta expresión de las pro-
ferentes (para mayor detalle: http://www.lifesci.
teínas entomotóxicas en las plantas junto a la
sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Ini-
siembra de refugios de plantas no Bt. Por otro
cialmente se las clasificó según la especifici-
lado, la segunda generación de plantas de al-
dad biológica (cryI para Lepidópteros, cry II
godón Bt, combina dos tipos de proteínas in-
para Lepidópteros y Dípteros, cry III para Co- secticidas para un mismo insecto blanco. Este
leópteros, y cry IV para Dípteros). En cambio, apilamiento de genes Bt, en combinación con
la nomenclatura actual se basa en la identidad una buena estrategia de manejo de refugios,
aminoacídica de la proteína. También se optó conferirá la máxima capacidad de protección a
por cambiar los números romanos por arábigos la tecnología Bt contra la resistencia de insec-
(Por ejemplo, la CryIIIA actualmente se deno- tos.
mina Cry3A).
Los primeros intentos para expresar las ii) Genes de origen vegetal
toxinas Bt en plantas fueron algo infructuosos Inhibidores de proteasas: el desarrollo po-
debido al origen bacteriano de los genes, es- tencial de resistencia a las toxinas derivadas
pecialmente por el alto contenido en nucleóti- de genes Bt en lepidópteros ha disparado di-
dos AT (adenina y timina), que produce bajos versas investigaciones para generar nuevas
niveles de expresión. Para solucionar estos in- estrategias de control de insectos que puedan
convenientes se han mejorado las secuencias a su vez preservar esta biotecnología amigable
eliminando algunos sitios de poliadenilación, para el ambiente. Los inhibidores de proteasas
mejorando la codificación para los codones e (IP) son candidatos posibles para mejorar la
incrementando el contenido de GC. Estos cam- toxicidad de Bt contra lepidópteros, agregando
bios mejoraron la expresión hasta alcanzar el la posibilidad de control de coleópteros, dípte-
0.2% - 0.3% del total de proteína soluble en ros y otros insectos.
plantas transgénicas. Los IP son parte del sistema de defensa de
La primera especie vegetal transformada la planta contra el ataque de los insectos y se
con estos genes fue el tabaco, en 1986. Ac- pueden encontrar en hojas, frutos, tubérculos
tualmente ya se han podido expresar los ge- o semillas. Para poder digerir sus alimentos,

Tabla 1. Cultivos resistentes a insectos aprobados por país. Fuente: www.isaaa.org; www.agbios.com
Cultivo con genes de reistencia a Año de la primera liberación

País insectos a campo
Australia algodón 2003

algodón 2005
Brasil
maíz 2008
Burkina Faso algodón 2008
algodón 2003
papa 1995
Canada
maíz 1996
batata 1995
algodón 1997
China
alamos 2005
Honduras maíz 2002 (precomercial)
India algodón 2002
Indonesia algodón 2001
Irán arroz 2004
algodón 1997
Japón
maíz 1996
Mejico algodón 1997
Filipinas maíz 2002
algodón 1997
Sudáfrica
maíz 1997
algodón 1995
maíz 1995
EE UU
tomate 1998
papa 1995
Unión Europea (España, Francia,
Alemania, Rep. Checa, Polonia, maíz 1997
Portugal, Eslovaquia y Rumania)
Uruguay
maíz 2003
muchos insectos producen proteinasas, como pecies. Se ha observado que no siempre estos
la tripsina, o enzimas semejantes a la quimo- genes actúan como antimetabolitos efectivos,
tripsina. Las proteínas antimetabólicas, como sino que hay un gradiente de efectividad frente
las IP, interfieren en el proceso digestivo de los a diferentes insectos y que, además, muchas
insectos susceptibles y, de esta manera, afec- veces no son tan efectivos como los genes Bt.
tan su crecimiento y desarrollo. Tomando este En base a estas observaciones se debe opti-
concepto, se han transformado plantas con mizar la interacción entre el IP introducida y la
secuencias de genes IP que, escoltados por proteasa blanco del insecto para incrementar
promotores adecuados, pueden expresar altos la acción del gen expresado en la planta trans-
niveles de estas proteínas. Los IP se encuen- génica.
tran comúnmente en los alimentos derivados Otra estrategia para mejorar los niveles de
de vegetales y son fácilmente inactivados con control puede ser utilizar más de un gen IP
la cocción. Teniendo en cuenta esta precau- para interferir en diferentes proteasas del in-
ción, la expresión de genes que codifican para secto. En este sentido, la combinación exito-
IP en plantas se puede considerar como una sa de diferentes secuencias de IPs formando
estrategia segura. multidominios para el control de trips (Thysa-
El primer ejemplo exitoso de resistencia a noptera: Thripidae) abre un abanico de nuevas
insectos expresando IPs fue la expresión de posibilidades.
genes inhibidores de tripsina de caupí (CpTi) También se ha propuesto el uso de IPs en
en 1987. A partir de ese momento, se han intro- combinación con los genes Bt, debido a que
ducido numerosos genes IP en diferentes es- las entomotoxinas Bt activadas pueden estar

sujetas a proteólisis o degradación por las pro- se amplía notablemente. Numerosos tra-
teinasas, derivando en fragmentos no tóxicos. bajos informan que ya se han introducido
Estos casos de resistencia o estados menos genes de lectinas (como la GNA, de Ga-
sensibles podrían evitarse si se combinan lanthus nivalis L. aglutinina) en cultivos
estos genes con los inhibidores de tripsina o para el control de insectos lepidópteros,
quimotripsina del insecto. La combinación de dípteros, coleópteros y homópteros. Un
genes de endotoxinas con genes derivados de mecanismo de acción propuesto con la
plantas, como los IP, ofrece nuevas oportuni- GNA es que al ser succionado por los in-
dades y estrategias para el control de insectos. sectos, se une al epitelio del intestino y
Otros ejemplos de aplicación de IP son la pasa a la hemolinfa, actuando como en-
expresión del gen de esporamina (inhibidor de tomotóxico. Expresando las GNA se han
tripsina) de batata, en B. oleracea, la sobreex- podido obtener plantas transgénicas de
presión de hidroxiprolina en tabaco para con- papaya resistentes a ácaros. Expresan-
trol de lepidópteros, o la introducción de inhibido lectinas de cebolla (llamadas ASAL)
dores de tripsina de garbanzo en algodón para se han controlado áfidos en plantas de
control del coleóptero picudo del algodonero mostaza. Como en otros casos de genes
Anthonomus grandis. provenientes de plantas, las lectinas pue-
• Genes inhibidores de alfa amilasa: así den combinarse con otros genes, como
como los IP, los inhibidores de α-amilasa por ejemplo, con distintos tipos de Bts,
son producidos por las plantas como un para combatir plagas de lepidópteros y
mecanismo natural de defensa contra de homópteros a la vez. Por ejemplo, la
insectos. La toxicidad de los inhibidores lectina PTA (de la planta medicinal china
de α-amilasa se produce mediante la in- Pinellia ternata) ha mostrado efectos so-
terferencia en la digestión de los carbo- bre áfidos en combinación con genes Bt
hidratos. Recientemente se ha aislado en trigo.
el gen inhibidor de α-amilasa de caupí y Algunas lectinas tienen limitaciones en su
se ha demostrado el efecto tóxico sobre aplicación en alimentación de mamíferos supe-
gorgojos de papaya. riores debido a su toxicidad, como en el caso
• Lectinas: son proteínas con unión espe- de las contenidas en el germen de trigo, que
cífica a carbohidratos. El rol principal que poseen fuertes propiedades insecticidas. Otras
se les atribuye es el fenómeno de recono- lectinas como la GNA se consideran no tóxicas
cimiento biológico que involucra células para este grupo debido a su baja capacidad de
y proteínas. Para ser clasificadas como unión en el intestino.
lectinas, las proteínas de unión a carbo- • Quitinasas: son enzimas digestivas que
hidratos deben poseer por lo menos dos rompen las uniones glucosídicas de la
sitios de unión. Esta característica les quitina, sustancia que compone las pa-
permite aglutinar o precipitar estructuras redes celulares de hongos, el exoesque-
que contienen residuos de azúcares. Se leto de algunos gusanos, y cutículas de
ha determinado que algunas lectinas ve- insectos, nematodes y artrópodos. Se
getales poseen un mayor o menor efecto encuentran en organismos que deben
entomotóxico o actividad insecticida. La digerir su propia quitina o la de otros indi-
toxicidad sería consecuencia de la inte- viduos como hongos o animales. Pueden
racción con las glicoproteínas intestina- funcionar como tóxicas para insectos si
les. Las diferencias en el nivel de toxi- son capaces de degradar la capa de qui-
cidad se pueden deber a que evolutiva- tina de las membranas que protegen el
mente las plantas desarrollaron propie- epitelio intestinal. En plantas superiores
dades bioquímicas y fisicoquímicas dife- la expresión génica de las quitinasas se
rentes, como la especificidad en la unión activa por la invasión de patógenos, por
a carbohidratos. El espectro de plagas lo que se cree que cumplen un rol impor-
que se pueden controlar con estos genes tante de defensa. Ya se ha comprobado

la acción inhibitoria sobre el crecimiento tear sistemas de apilamiento de distintos
de hongos, pero la aplicación en el con- genes en la misma planta. Asimismo, se-
trol de insectos aún no está fehaciente- ría más efectivo combinar sistemas de
mente descripta. genes que participen en sistemas me-
• Avidina: es una glicoprorteína que se tabólicos diferentes. Para efectuar una
encuentra en la clara del huevo de ga- sinergia efectiva entre la biotecnología
llina y tiene la propiedad de secuestrar y el mejoramiento genético, las distintas
la vitamina biotina. Al ser ingerida por el estrategias planteadas de expresión de
insecto en una concentración mayor a genes en plantas, a su vez, deben ser
100 ppm, la avidina puede ocasionar una incluidas dentro del sistema de manejo
deficiencia letal de esta vitamina y evitar integrado de plagas.
el desarrollo de insectos durante el alma-
cenamiento de granos. Por lo tanto, la iii) Estrategias de ARN de interferencia
avidina expresada en los granos puede (ARNi)
ser efectiva como biopesticida para un Los organismos eucarióticos poseen una
amplio espectro de especies de insec- maquinaria común se silenciamiento génico de
tos. Los datos sobre la efectividad y es- secuencias específicas que es disparado por la
pecificidad de acción de las avidinas no presencia de ARNs de doble cadena (dsRNA).
están tan completos como en el caso de Este proceso se conoce como “interferencia
las entomotoxinas Bts, pero se conside- del RNA” (RNAi) en animales y “silenciamiento
ra que podrían usarse como alternativa o génico post transcripcional” en plantas (PTGS).
complemento de esta tecnología. Se ha El silenciamiento de algunos genes esen-
expresado en maíz para producir biomo- ciales en insectos, mediado por los dsRNA,
léculas, pero podría utilizarse en un futu- puede inducir el cese de la ingestión y, even-
ro también para biocontrol. tualmente la muerte. La utilización de la estra-
• Polifenol oxidasas: las enzimas llamadas tegia el ARN de interferencia para control de
polifenol oxidasas (PPOs) catalizan la insectos requiere de una llegada eficiente al
oxidación de compuestos fenólicos a qui- sitio de acción (tanto vía ingestión o por apli-
nonas. Frecuentemente su inducción se cación tópica) de las moléculas de dsRNA. Los
asocia con la respuesta de las plantas a genes candidatos blanco ideales para silenciar
señales o daños producidos por patóge- de esta manera podrían ser los que codifican
nos o insectos. Por estas observaciones para proteínas con funciones esenciales para
se sugiere que tendrían la capacidad de el insecto. Se ha estudiado la transcripción de
conferir resistencia tanto a enfermeda- algunas secuencias de genes provenientes
des provocadas por bacterias como por de insectos lepidópteros en plantas de maíz
insectos. Como ejemplos de aplicación transgénicas (como por ejemplo, una porción
se han publicado trabajos de resistencia del gen de la ATPasa de Diabrotica virgifera
a lepidópteros en álamo y en tomate. La virgifera), bajo promotores constitutivos, ve-
manipulación de la actividad de PPOs rificándose una merma en el daño a nivel de
para generar resistencia también podría las raíces. Asimismo, se ha estudiado la posi-
ser un componente del manejo integrado bilidad de control combinando mediante el uso
de plagas. de ARN de interferencia, de más de un gen en
• Combinación de genes: muchos de los termitas Reticulitermes flavipes.
genes candidatos para resistencia a in- Este enfoque alternativo al control de plagas
sectos plaga que pueden ser usados en puede ser efectivo también en combinación
transformación genética son muy espe- con genes Bt, tanto para control de lepidópte-
cíficos o a veces medianamente efecti- ros como de coleópteros, según la secuencia
vos. Para cubrir más posibilidades de que se introduzca en la planta. Por ejemplo,
control y evitar las posibles apariciones para el control del lepidóptero (Helicoverpa
de resistencia, es recomendable plan- armigera) del algodón, del cual se han encon-

trado algunos individuos resistentes en China Reducción de micotoxinas
a los genes Bt, se demostró que la expresión Uno de los beneficios indirectos de los culti-
de la secuencia de la enzima que degrada el vos Bt es la reducción del nivel de contamina-
gossipol en la oruga (que le permite tolerar la ción por micotoxinas en maíz. Las micotoxinas
presencia de esa sustancia) es efectiva para el son metabolitos secundarios de los hongos que
control de la plaga. colonizan los cultivos. Se consideran contami-
Esta nueva estrategia para el control de in- nantes inevitables en los alimentos y aún las
sectos plaga en plantas parece ser muy pro- mejores tecnologías no pueden eliminar com-
metedora, ya que las secuencias génicas de pletamente su presencia. El daño por insectos
los insectos para usar como blanco pueden ser es uno de los factores que predisponen a la
muy específicas y relativamente fáciles de ob- contaminación por micotoxinas en maíz debido
tener. a que abren la puerta de entrada a los hongos a
través de los canales que realizan en los tallos.
Cultivos Bt comercializados- beneficios de la Por esta razón, cualquier método que reduce
tecnología el daño de orugas, también reduce el riesgo de
contaminación por hongos, y se ha observado
Control biológico que los maíces Bt muestran una reducción sig-
Los enemigos naturales, como los preda- nificativa del nivel de las micotoxinas más co-
dores y parasitoides, cumplen una función munes. En Argentina, en los años favorables a
ecológica y económica importante en cuanto la acumulación de fumonisinas (por presencia
al mantenimiento de la población de insectos de Fusarium verticillioides y F. proliferatum), las
herbívoros por debajo de los umbrales de daño concentraciones de esta micotoxina son en un
económico. De esta manera contribuyen a los 40% menores en los híbridos Bt que en las res-
sistemas sustentables de manejo integrado de pectivas isolíneas de maíz.
plagas (MIP).
También se conocen algunos factores que Reducción de plaguicidas
afectan a los insectos plaga que interactúan Durante el año 2006 los cultivos GM han re-
con los enemigos naturales y, consecuen- ducido la aplicación de pesticidas en 286 mi-
temente, con la función de control que éstos
llones de kg (equivalente a un 40% del volu-
aportan. De manera similar, la resistencia de-
men de pesticidas anual aplicado en la Unión
rivada de la ingeniería genética en plantas po-
Europea), disminuyendo así el impacto del uso
dría tener impacto sobre el control biológico,
de pesticidas sobre el ambiente en un 15,4%.
pero se ha comprobado que los cultivos trans-
Según una investigación de la IUPAC (Unión in-
génicos disponibles a la fecha que expresan
ternacional de Química Pura y Aplicada) entre
proteínas Cry derivadas de Bacillus thurin-
los años 2002 y 2007, la adopción de cultivos
giensis, no tienen efectos sobre los enemigos
resistentes a insectos redujo el uso de insec-
naturales debido a su restringido espectro de
ticidas, especialmente en el algodón Bt en Es-
actividad. Sin embargo, el hecho que los insec-
tados Unidos, así como también en Australia,
tos plaga son eficientemente controlados por
los cultivos Bt tiene inevitables consecuencias India, China y Sudáfrica. El algodón Bt se ha
sobre los enemigos naturales que se especia- incorporado a las prácticas de manejo integra-
lizan en esas especies tanto como hospedan- do de plagas para evitar que los insecticidas
tes como predadores. Pero, por otra parte, se afecten los insectos benéficos. Además, la re-
ha demostrado una disminución en el uso de ducción del uso de insecticidas debido al uso
insecticidas en los cultivos Bt, lo que ha be- de algodón y maíz Bt benefician directamente a
neficiado significativamente a los organismos los productores, aumentando el margen bruto.
de control biológico. Como consecuencia, esta
tecnología puede contribuir a la conservación Aumento del rendimiento
de los enemigos naturales, deviniendo en una Todos los reportes acerca de los beneficios
herramienta muy útil para el manejo integrado de la adopción de cultivos Bt mencionan como
de plagas. un punto de gran relevancia el aumento de los

rindes en comparación con las tecnologías 50.000 hectáreas de algodón Bt. Cinco años
convencionales. En países como Argentina, después, en 2007, el área de algodón Bt llegó
China, Méjico, India y Sudáfrica se verifican a 6,2 millones de hectáreas, cultivadas por 3,8
incrementos de rendimiento entre 11% y 65%, millones de pequeños productores y de esca-
mientras que los costos por el menor uso de sos recursos. Cabe destacar que más de 9 de
disminuyen entre 40 a 77%. cada 10 productores que sembraron algodón
Bt en 2005, también lo hicieron en 2006 y en
Menor uso de agua 2007. El algodón Bt ha aumentado los rendi-
Al disminuir el número de pulverizaciones mientos hasta en un 50%, ha reducido el uso
con insecticidas, la tecnología Bt contribuye al de insecticidas a la mitad, con las correspon-
uso racional del agua. dientes consecuencias para el ambiente y la
salud, y ha incrementado los ingresos de los
Beneficios e impactos de la tecnología productores en US$ 250 o más por hectárea. A
según el país adoptante nivel nacional, el incremento en los ingresos de
los productores derivados del uso del algodón
Los beneficios de estas tecnologías pueden Bt fue estimado para 2006 entre US$ 840 millo-
observarse en diferentes contextos y desde di- nes y US$ 1,7 mil millones. Además, la produc-
versos aspectos. Cada país adoptante de los ción del algodón se duplicó, e India, que tenía
eventos transgénicos con resistencia a insec- uno de los rendimientos más bajos en el cultivo
tos ha transitado por experiencias exitosas por de algodón, pasó a ser un exportador, en lugar
razones tanto económicas, ecológicas y/o so- de un importador de algodón.
ciales. Cabe mencionar que en India hay nuevos
La adopción de la tecnología muchas veces productos de la biotecnología en desarrollo,
se mide en términos de beneficio económico. como la berenjena Bt, un importante cultivo
Pero se ha determinado que hay factores ins- alimenticio y comercial que puede beneficiar a
titucionales que influyen indirectamente en el unos 2 millones de productores pequeños y de
nivel y la distribución de las ganancias, como bajos recursos. La berenjena Bt se encuentra
la capacidad de investigación en institutos na- en estado avanzado de ensayos a campo, y se
cionales, las políticas en derecho de propiedad espera su aprobación en un futuro cercano.
intelectual, la capacidad de regulación en se-
guridad ambiental y alimenticia, y la existencia China
de mercados permeables a estas tecnologías. La historia del algodón en China está bien
documentada y es un importante caso de es-
Estados Unidos tudio sobre la adopción de cultivos transgéni-
El primer país adoptante de algodón y maíz cos por parte de productores pequeños y de
Bt fue Estados Unidos. El beneficio por el uso bajos recursos. Aunque India inició la siembra
de estos dos eventos fue de $19 millones en de algodón Bt en 2002, seis años después que
1996 y de $190 millones en 1997. En el primer China, ya en 2006 India había plantado 0,3 mi-
ciclo de cultivo de algodón Bt se redujeron en llones de hectáreas de algodón Bt más que Chi-
un 70% las aplicaciones de insecticidas y hubo na, y 2,4 millones de hectáreas más que China
un incremento de 7% en el rendimiento. Actual- en 2007. Sin embargo, como las plantaciones
mente el 50% de los cultivos OGM tienen lugar de algodón son mucho más pequeñas en Chi-
en EE UU, ocupando más de 50 millones de na (tienen en promedio 0,59 hectáreas) que en
hectáreas. India (1,63 hectáreas), el número de pequeños
productores que cultivaron algodón Bt en China
India en 2007 (7,1 millones) fue casi el doble que en
India es el país que siembra la mayor su- India (3,8 millones), lo que equivale al 69% de
perficie de algodón, y donde 60 millones de las 5,5 millones de hectáreas del algodón culti-
personas están relacionadas con este cultivo. vadas en China. Según los estudios realizados
En el 2002, unos 54.000 agricultores cultivaron por el Centro para la Política Agrícola China

CCAP, el algodón Bt en China, en promedio, Unión Europea
aumenta el rendimiento en un 9,6%, reduce el El maíz Bt se sembró por primera vez en Es-
uso de insecticidas en un 60%, con consecuen- paña en el 1998. Entre 1998 y 2002, mediante
cias positivas tanto para el ambiente como para un convenio entre productores y compañías
la salud de los productores, y genera un incre- semilleras, se sembraron pequeñas superficies
mento en los ingresos de US$ 220 por hectá- (5% del total del maíz), llegando a 58000 has
rea. Además, China ya ha sembrado casi un en 2006. En Francia se sembraron pequeñas
cuarto de millón de álamos Bt. En un estudio superficies, así como en Portugal y Alemania
realizado entre 2002 y 2007, se ha encontrado entre 1998 y 2000. Hasta el año 2005 hubo pe-
que además de controlar el principal lepidópte- queños incrementos en el área sembrada, y en
ro en el algodón (Helicoverpa armigera), reduce el año 2006, se sembraron aproximadamente
la presencia de esta plaga en otros cultivos no 65000 has de maíz Bt en siete Estados Miem-
OGM, disminuyendo la necesidad de pulverizar bros de la UE. El primer impacto de la adop-
con insecticidas. Entre los desarrollos actuales ción del maíz Bt se tradujo en mayores rindes
se encuentra el arroz transgénico resistente a (10% o más) debido al control de los lepidópte-
plagas (larvas de lepidópteros) que una vez ros plaga más importantes de esas zonas, en
que se cultive comercialmente, aumentaría el comparación con los maíces convencionales.
rendimiento un 2-6% y reduciría el uso de in- Las ganancias generadas por el uso de los
secticidas en casi un 80%. maíces Bt fueron entre 65 y 141 €/ha más que
en los cultivos convencionales. En algunas re-
Irán giones además, se mejoró la calidad de grano
En el año 2004, Irán aprobó la siembra co- mediante una reducción significativa del nivel
mercial de arroz resistente a insectos. Fue el de micotoxinas.
primer país en aprobar arroz GM para cultivo
y consumo. El evento contiene el gen Cry1Ab, Argentina
introducido en la variedad popular aromática En el año 1998 se han aprobado por pri-
�llamada Tarom molaii, confiriéndole resisten- mera vez en Argentina los eventos de maíz
cia a la oruga del tallo, plaga que afecta el 25% y algodón con resistencia a insectos para su
de la cosecha cada año. Durante 2005-2006 producción y comercialización. A partir de allí
Irán sembró unas 4000 hectáreas de arroz Bt. se aprobaron otros eventos Bt en maíz. La su-
Se observó que esta variedad rinde 200 kg perficie sembrada fue incrementándose desde
más que su contraparte no OGM. Actualmen- 13 mil y 5 mil has hasta 2,5 millones y 162 mil
te todavía no se produce arroz GM en forma has en la campaña 07/08 para maíz y algodón
comercial. respectivamente. En 2007, el incremento anual
comparado con 2006, fue de 1,1 millones de
Filipinas hectáreas, equivalentes a una tasa anual de
Un ejemplo muy interesante de cultivos GM crecimiento del 6%. En el caso de maíz ya se
es el de la berenjena en Filipinas. Este cultivo han aprobado, para su cultivo en la campaña
de gran importancia económica (U$S 32 millo- 07/08, eventos apilados de tolerancia a her-
nes) es atacado por muchas plagas de insec- bicidas con resistencia a insectos. La tasa de
tos, entre ellos el más destructivo es el lepidóp- adopción de estos eventos para la producción
tero L. orbonalis, Guenee. Para combatir esta se puede observar en la figura 1. En la tabla 2
plaga algunos productores pulverizan insecti- se detallan los eventos aprobados en la Argen-
cidas hasta dos o tres veces por semana. Se tina hasta agosto de 2008.
están desarrollando eventos con incorporación • Maíz Bt: el beneficio de la adopción de la
de genes Bt, y pronostican que su adopción tecnología Bt consiste en la prevención
significará un aumento en el rendimiento, re- de las pérdidas de rendimiento causadas
ducción de costos y de las labores, y un incre- por el ataque de Diatraea Saccharalis
mento del beneficio de U$S 909/ha comparado (barrenador del tallo) en su estado larval.
con las variedades de cultivo actual. Se estima que las pérdidas en la región

Figura 1. Superficie con cultivos Bt en Argentina. Fuente: Argenbio 2008.
pampeana por esta plaga alcanzan los de las pérdidas causadas por ataques de
170 millones de dólares y que además, lepidópteros.
la adopción de híbridos Bt incrementó en
un 10% el rendimiento del cultivo (es de- Lecturas recomendadas
cir, que evitó pérdidads de producción de
esa magnitud). Baum J A, Bogaert T, Clinton W, Heck G R,
• Algodón Bt: el algodón Bt provee resis- Feldmann P, Ilagan O, Johnson S, Plaetinck G,
tencia al complejo principal de pestes Munyikwa T, Pleau M, Vaughn T & Roberts J.
(Helicoverpa gelotopoeon y H. Zea co- 2007. Control of coleopteran insect pests through
RNA interference. Nature Biotechnology 25,
múnmente asociadas con Heliotis vires-
1322-1326.
cens) y también al gusano de la hoja Brookes G. 2007. The benefits of adopting
(Alabama argillacea), la lagarta rosada genetically modified insect resistant (Bt) maize in
(Pectinophora gossipiella) y otros le- the European Union (EU): first results from 1998-
pidópteros (Spodoptera spp). Pero no 2006; PG Economics Ltd www.pgeconomics.
provee resistencia contra insectos coco.uk.
leópteros o succionadores (chinches y Christeller J T, Malone L A, Todd J H, Marshall R
homópteros). Se ha determinado que la M, Burgess E P J, Philip B A. 2005. Distribution
reducción en la cantidad de insecticidas and residual activity of two insecticidal proteins,
pulverizados durante el período de culti- avidinand aprotinin, expressed in transgenic
tobacco plants, in the bodies and frass of
vo Bt oscila entre 43% y 55%. La mayo-
Spodoptera litura larvae following feeding.
ría de las reducciones son en insectici- Journal of Insect Physiology 51, 1117–1126.
das muy tóxicos (de clases I y II), como Farias L R, Costa F T, Souza L A, Pelegrini P B,
organofosforados, carbamatos y piretroi- Grossi-de-Sá MF, Neto S M, Bloch C Jr, Laumann
des sintéticos, que causan problemas de R A, Noronha E F, Franco O L. 2007. Isolation
residuos y son tóxicos para los insectos of a novel Carica papaya α-amylase inhibitor
benéficos. Se ha estimado el impacto de with deleterious activity toward Callosobruchus
la adopción de algodón Bt como el equi- maculates. Pesticide Biochemistry and
valente a un 30% de aumento neta de Physiology, 87, 255–260.
producción por hectárea. El aumento de Integration of Insect-Resistant Genetically Modified
Crops within IPM Programs Series: Progress
producción corresponde a la reducción
in Biological Control, Vol. 5 Ed: Romeis, Jörg;

Tabla 2. Eventos con resistencia a insectos aprobados en Argentina (hasta junio de 2008).
Nombre del Otros países con

Fecha
Evento de Solicitante Gen Resolución el mismo evento
aprobación
Transformación aprobado
Australia, Brasil,
cry1Ac de Bacillus Canadá, China,
Monsanto thuringiensis subsp. SAGPyA UE, India, Japón,
MON 531 16/07/1998
Argentina kurstaki HD-73 N°428 Corea, Méjico,
(B.t.k) Filipinas,
Sudáfrica, EEUU
Australia, Brasil,
Canadá, China,
UE, India, Japón,
cry1Ab de Bacillus
Monsanto SAGPyA N° Corea, Méjico,
MON 810 16/07/1998 thuringiensis subsp.
Argentina 429 Filipinas,
kurstaki HD-1.
Sudáfrica, Suiza,
Taiwán, Uruguay,
EEUU
Australia, Brasil,
Canadá, China,
cry1A(b) de Bacillus UE, Japón, Corea,
Novartis thuringiensis subsp. SAGPyA N° Méjico, Filipinas,
Bt 11 27/07/2001
Agrosem kurstaki cepa HD-1; 392 Rusia, Sudáfrica,
pat Suiza, Taiwán,
Reino Unido,
Uruguay, EEUU
Australia Canadá
cry1F de Bacillus
Dow China UE
thuringiensis var.
AgroSciences y SAGPyA N° Japón Corea
TC 1507 15/03/2005 aizawai ; gen pat de
Pioneer 143 Méjico Filipinas
Streptomyces
Argentina Sudáfrica Suiza
viridochromogenes
Taiwán EEUU
Híbrido derivado del

UE, Japón,
cruzamiento entre SAGPyA Nº
NK603 x 810 Monsanto 28/08/2007 Corea, Méjico,
las líneas parentales 78
Filipina, Sudáfrica
NK603 y MON810
Evento apilado
derivado del
Dow cruzamiento de las
UE, Japón,
AgroSciences y líneas 1507 y NK603 SAGPyA Nº
1507 x NK603 28/05/2008 Corea, Méjico,
Pioneer con tolerancia a 434
Filipinas
Argentina herbicida y
resistencia a
lepidópteros.

Shelton, Anthony M.; Kennedy, George. 2008. Raney T. 2006. Economic impact of transgenic
XVIII, 446 p. Springer Netherlands. crops in developing countries. Current Opinion in
Mao Y B, Cai1 W J, Wang J W, Hong G J, Tao X Y, Biotechnology, 17:1–5.
Wang L J, Huang Y P & Chen X Y (2007) Silencing Trigo E J y Cap E J. 2006. Diez Años de Cultivos
a cotton bollworm P450 monooxygenase gene Genéticamente Modificados en la Agricultura
by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance Argentina. www.argnebio.org.
of gossypol. Nature Biotechnology 25:11, 1307- Wang J and Constabel C P. 2004. Polyphenol
1313. oxidase overexpression in transgenic Populus
Mayer A M. 2006. Polyphenol oxidases in plants and enhances resistance to herbivory by forest tent
fungi: Going places? A review Phytochemistry 67, caterpillar (Malacosoma disstria). Planta 220,
2318–2331. 87–96.
McCafferty H, Moore P H, Zhu Y J. 2008. Papaya Wu F. 2008. Field Evidence: Bt Corn and Mycotoxin
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produces a biologically active lectin with spider Wu M. 2008. Suppression of Cotton Bollworm in
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Ralph, S G. 2008. Analysis of 4,664 high-quality Containing Cotton. Science Vol. 321, 1676-1678.
sequence-finished poplar full-length cDNA
clones and their utility for the discovery of genes
responding to insect feeding. BMC Genomics,
9:57.

V. CAPÍTULO 11 no y al año 2009 hay reportados casos en el
norte de Buenos Aires, Córdoba y el noreste
argentino, comprometiendo el cultivo de soja y
Aplicaciones biotecnológicas al
maíz, cuya estrategia de manejo de malezas,
manejo de malezas: Eventos de está basada en el uso de glifosato. Existe un
resistencia a herbicidas en proyecto que plantea el uso de marcadores
cultivos. moleculares y secuenciación nucleotídica para
caracterizar la dinámica de la dispersión y ca-
Germán Ferrari racterización molecular del mecanismo de re-
Julio E. Delucchi sistencia de dicha maleza.
Marcadores moleculares Instrumentos genómicos y de la

Es muy importante destacar que la incum- proteómica
bencia de la biotecnología aplicada al manejo La proteómica es el estudio de la estructu-
de malezas no se limitan solamente a la obten- ra y función de las proteínas, incluida su forma
ción de plantas transgénicas con resistencia de actuar e interactuar dentro de las células. A
herbicidas. Así, el uso de marcadores molecu- partir del conocimiento profundo del metabolis-
lares tiene gran importancia para la correcta mo celular en las malezas es posible la identifi-
identificación taxonómica de malezas y para cación de blancos, tanto para sitio de acción de
el conocimiento de las relaciones genéticas los herbicidas como para fuente de resistencia
entre poblaciones, el estudio del modo de re- aplicables a cultivos. Por medio de esta tecno-
producción y del flujo de genes con las plantas logía fue detectada en el maíz la enzima Glu-
cultivadas. Los recientes avances en la carac- tatión S-transferaza (GST) (Frear y Swanson,
terización funcional de los genomas vegetales 1970), que tiene la capacidad de detoxificar,
están encontrando creciente aplicación en este por medio de conjugación a herbicidas electro-
campo. La genómica funcional permite identifi- fílicos como la atrazina, acetoclor y metolaclor.
car genes cuyas formas mutantes son letales, Posteriormente ocurrió el descubrimiento y
constituyendo éstos blancos ideales para su aislamiento del gen psbA, proveniente de los
inhibición por un herbicida. Por otra parte, la cloroplastos de varias especies de malezas,
utilización de micro arreglos permite estudiar a que confiere resistencia conspicua a herbicidas
nivel genómico los efectos de “herbicidas can- con acción sobre el fotosistema II como la atra-
didato” sobre la expresión génica. Estos datos zina. A partir de este descubrimiento pudieron
deben ser luego confirmados en estudios pro- obtenerse plantas de tabaco con el gen psbA
teómicos. mutado para otorgarle resistencia a atrazina
Las aplicaciones de los marcadores mole- por selección fotomixotrófica* (*sistema de cul-
culares son muy diversas y es de esperar que tivo de in-vitro).
se les encuentren nuevos usos. Por ahora se
están utilizando en la diferenciación de indivi- Cultivo de tejidos, selección in vitro y
duos, discriminación entre clones, análisis filo- mutagénesis para el desarrollo de
genéticos y taxonómicos, mapeo de genomas, cultivos con resistencia a herbicidas.
cuantificación de variabilidad génica intra e in- Las técnicas de mutagénesis y selección in
ter específica, mejoras genéticas, detección de vitro o a campo, han permitido el aislamiento
infecciones o propensión a sufrirlas, localiza- de individuos con resistencia a herbicidas, que
ción de resistencia a enfermedades y disper- en muchos casos, han alcanzado el nivel de
sión de especies entre otras. utilización comercial. La obtención de cultivos
Un ejemplo de aplicación del uso de marca- Clearfield® (maíz, girasol, colza, trigo, arroz,
dores moleculares en malezas es la epidemio- entre otros), resistentes a diferentes principios
logía molecular de sorgo de Alepo (Sorghum activos de la familia de las imidazolinonas o la
halepensis) resistente a glifosato. Los primeros soja STS®, resistente a sufonilureas, ambos
casos se manifestaron en el noroeste argenti- grupos inhibidores de la enzima acetolactato

sintetasa (de ahora en más en este texto, ace- respectivamente. La superficie total de cultivos
tohidroxiácido sintetasa, o AHAS), son ejemplo GM en Argentina ascendió a 19,85 millones de
de ello. Estos cultivos fueron obtenidos a tra- hectáreas en la campaña 2007/08, un 8% más
vés de la inducción de mutaciones y posterior que en la campaña anterior.
selección, por la acción de los mencionados El proceso de inserción de genes implica la
herbicidas, de los individuos resistentes. obtención de organismos genéticamente mo-
dificados, en este caso particular, de cultivos
Cultivos resistentes a herbicidas transgénicos. El primer cultivo transgénico
obtenidos por ingeniería genética obtenido por este método fue la denominada
La ingeniería genética permite la introduc- soja RR (soja Roundup Ready®) resistente a la
ción de variabilidad genética, útil para el mejo- acción herbicida del glifosato, por medio de la
ramiento de los cultivos por métodos no sexua- transferencia de un gen, desde una especie de
les. La resistencia a herbicidas fue una de las Agrobacterium al genoma de la soja. Dicho gen
primeras aplicaciones de la ingeniería genética también fue introducido en el maíz, generando
de plantas, dichos mecanismos de resistencia el híbrido de maíz RR (maíz Roundup Ready®).
ya se conocían a partir de estudios con ais- Por otra parte, también se obtuvo el maíz Li-
lamientos bacterianos resistentes, selección berty Link®, resistente a glufosinato de amonio,
in vitro de células vegetales y de resistencia herbicida no selectivo conocido comercialmen-
a campo en cultivos y malezas. Por lo tanto, te como Liberty®. En este último caso, el gen
resultaba claro que el fenotipo de resistencia
incorporado codifica para una enzima (fosfi-
podía obtenerse a partir de la introducción de
notricin-N-acetil transferasa), responsable de
genes individuales.
convertir al glufosinato en un metabolito inocuo
A partir del conocimiento de las secuencias
para el cultivo.
codificantes que pudieran conferir resistencia
a ciertos herbicidas en plantas y disponer de
Objetivos buscados en el desarrollo de
las herramientas para su correcta expresión,
cultivos resistentes a herbicidas
fue factible la obtención de cultivos resistentes.
Sumado a esto, un grupo de empresas con • Resolver un problema de malezas para
marcado interés por diversificarse hacia el ne- el que no haya herbicidas disponibles.
gocio de semillas, para desarrollar cultivos re- • Reemplazar las combinaciones de her-
sistentes a sus moléculas herbicidas, hicieron bicidas actualmente en uso por nuevos
posible la obtención de plantas transgénicas herbicidas.
con resistencia exclusiva a dichos herbicidas • Reemplazar un herbicida de altas dosis
o bien, combinada con resistencia a insectos. por uno de bajas dosis.
Según un informe del ISAAA (Servicio para • Reemplazar a un herbicida pre-emer-
la Adquisición de Aplicaciones Agro-biotecno- gente por uno post-emergente.
lógicas), en 2007, 114.3 millones de hectáreas • Reemplazar herbicidas con propiedades
en todo el mundo, un 12% más que en 2006, ecológicas y/o toxicológicas inferiores.
fueron sembradas con cultivos genéticamente Estos objetivos dan un marco de referencia
modificados (GM). El 57% de estas hectáreas para encarar el desarrollo de cultivos con resis-
correspondieron a soja, el 25% a maíz, el 13% tencia a un herbicida, teniendo en cuenta que,
a algodón y el 5% restante a canola. Estas su- el desarrollo de cultivos tolerantes debe priori-
perficies significaron el 64%, 24%, 43% y 20% zar la utilización de herbicidas con los menores
de las áreas totales de cada uno de esos culti- efectos nocivos para el medio ambiente. Es
vos, respectivamente. En Argentina, en la cam- importante comprender que existen diferentes
paña 2007/08, prácticamente el 100% de la su- problemas de malezas en cultivos particulares
perficie de soja fue sembrada con soja toleran- no resueltos aún y que se trata de una situa-
te al herbicida glifosato, mientras que el maíz ción dinámica donde las malezas evolucionan
y el algodón transgénicos ocuparon el 74% permanentemente como respuesta a las prác-
y el 90% del área destinada a esos cultivos, ticas de control empleadas por los agricultores.

Estrategias para obtener cultivos de vista ambiental (baja toxicidad para orga-
resistentes a herbicidas mediante nismos no blanco, bajo movimiento en el agua
ingeniería genética subterránea y persistencia limitada).
• Incrementar la expresión de la proteína El glifosato inhibe en plantas, bacterias,
blanco del herbicida. algas, hongos y parásitos apicomplejos, la
• Alterar el sitio de acción del herbicida. 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintetasa
• Introducir genes que permitan la detoxifi- (EPSPS), enzima clave para la síntesis de
cación del herbicida. aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina
y triptofano). La EPSPS es codificada en plan-
Cabe mencionar que, de las estrategias tas por un gen nuclear cuyo producto activo se
mencionadas sólo las dos últimas han produ- localiza en los plástidos. En las plantas, esta
cido aplicaciones comerciales. En la tabla infe- ruta biosintética (ruta del shikimato) tiene lugar
rior son enumerados los principales eventos de en el cloroplasto. El glifosato actúa como un in-
resistencia a herbicidas aplicados en cultivos y hibidor competitivo ocupando el lugar del PEP
su modo de acción. (fosfoenolpiruvato) en el complejo enzimático.
La unión de este herbicida a la enzima nativa
Resistencia a Glifosato bloquea su actividad e impide el transporte del
En el año 1974 se introdujo al mercado el complejo EPSPS-shikimato 3-fosfato al cloro-
herbicida Roundup® cuyo ingrediente activo es plasto. La enzima producida por el gen mutado
el ácido glifosato (n-fosfonometil glicina). Este (epsps*) tiene una menor afinidad por el glifo-
es un herbicida pos emergente de amplio es- sato y es catalíticamente activa en presencia
pectro, no selectivo y seguro desde el punto del herbicida (Figura 1).
Figura 1. Esquema de la inhibición por el ácido n-fosfonometil glicina (glifosato) sobre la enzima EPSPS
susceptible y la incompatibilidad del sitio de acción al mismo herbicida en la enzima EPSPS* mutante.
Fuente: Mentaberry, A. 2007

da. A partir de estos descubrimientos, se aisló
el gen que codifica una EPSPS resistente a gli-
fosato proveniente de la cepa CP4 de la bac-
teria Agrobacterium tumefaciens (cp4 epsps).
Asimismo, se demostró en varias especies
vegetales (zanahoria, petunia, tabaco, alfalfa y
soja) que la selección gradual con glifosato en
cultivos celulares permite obtener líneas celu-
lares con resistencia al herbicida mediada por
un proceso de amplificación génica.
Gen gox, que codifica la enzima glifosato

oxidoreductasa
Esta es la enzima responsable del proceso
de degradación del glifosato por la ruta del áci-
do aminometilfosfónico (AMPA). Se observó
Figura 2. Estructura de la EPSP sintetasa de E. que el glifosato es rápidamente degradado por
coli. Los residuos del sitio activo están marcados bacterias del suelo, el catabolismo de este her-
en azul. La región en rojo es una región altamente bicida puede producirse por la ruta de la C-P
conservada. La conversión de la Gly 96 a Ala trans- liasa (observada en Pseudomonas sp.) o por
forma a la enzima en resistente a glifosato. Menta-
la del AMPA a partir Achromobacter sp. El gen
berry, A. 2007
gox, codificador de la enzima glifosato oxidore-
ductasa, es obtenido a partir de la cepa LBAA
de Achromobacter sp y puede ser incorporado
al genoma vegetal para sintetizar dicha enzima
y así conferir resistencia por degradación del
Desarrollo de plantas transgénicas principio activo.
resistentes a glifosato La utilización del gen cp4 epsps para obten-
ción de plantas transgénicas tolerantes a glifo-
EPSPS resistente a glifosato de la cepa sato, ha resultado más eficiente que la del gen
CP4 de Agrobacterium tumefaciens gox. Se han observado en varios casos que la
(cp4 epsps). expresión de este último, en presencia del her-
El gen que codifica la EPSPS se clonó ini- bicida, está asociada a síntomas que sugieren
cialmente en bacterias y se demostró que el fitotoxicidad de los productos de degradación.
incremento de su expresión, logrado median-
te la localización del mismo en un plásmido Desarrollo de productos comerciales resis-
multicopia, confiere resistencia al herbicida. tentes a glifosato
Se obtuvieron así plantas transgénicas de • Soja: promotor 2x35S / secuencia codifi-
petunia que expresaban un ADNc codificante cante cp4 epsps (1996).
para la pre-proteína completa EPSPS de esa • Canola: Promotor FMV (Figwort mosaic
misma especie bajo control del promotor 35S virus) / secuencia codificante cp4 epsps
del virus del mosaico del coliflor. Estas plan- y promotor FMV / secuencia codificante
tas resultaron altemente tolerantes al herbici- gox (1996).
da. Otra estrategia explorada fue la búsqueda • Algodón: promotor FMV / secuencia co-
de formas variantes de la EPSPS que tuvieran dificante cp4 epsps (versión sintética con
simultáneamente baja afinidad por el glifosato optimización de uso de codones; 1997).
y buena actividad catalítica. Se demostró que • Maíz: promotor de actina 1 de arroz /
las plantas transgénicas que expresaban una secuencia codificante cp4 epsps y pro-
EPSPS heteróloga con estas características, motor 2x35S / secuencia codificante cp4
tenían muy buena respuesta frente al herbici- epsps (2001).

Resistencia a glufosinato de amonio cia a herbicidas suficiente para su uso agrícola
El glufosinato de amonio es un herbicida se obtuvieron expresando constitutivamente el
de contacto de amplio espectro que se utiliza gen bar (tabaco, tomate y papa). Actualmente,
para controlar malezas en post-emergencia, ambos genes se encuentran en varios cultiva-
como defoliante para acelerar el secado de res transgénicos que tienen status comercial
granos previo a la cosecha, o para el control así, Aventis comercializa en Canadá, la canola
total de la vegetación en suelos no cultivados.
Liberty Link® desde 1995 y en el año 1997 se
Fue desarrollado por Hoechst en los años 70 y
aprobó en EEUU la soja y el maíz Liberty Link®.
es comercializado en más de 40 países bajo
distintos nombres comerciales, Basta®, Rely®,
Herbicidas que inhiben la
Finale® y Challenge®. El L-glufosinato (L-fosfi-
acetohidroxiácido sintetasa
notricina) es un inhibidor competitivo reversible
La acetohidroxiácido sintetasa (AHAS), más
del lugar del L-glutamato en el complejo enzi-
conocida por su antigua denominación de ace-
mático de la glutamino sintetasa, que desem-
tolactato sintetasa (ALS), es una enzima clave
peña un papel crucial en la via de asimilación
en la biosíntesis de los aminoácidos ramifica-
primaria y secundaria del amonio en las plan-
dos leucina, valina e isoleucina (Fig. 3).
tas. La asimilación primaria comprende el amo-
Los herbicidas inhibidores de la AHAS se
nio originado a partir del nitrato absorbido del
han difundido debido a que presentan varias
suelo por las raíces y la secundaria comprende
ventajas:
la reasimilación del amonio libre que se forma
• Se utilizan en dosis muy bajas que pue-
en la planta como consecuencia de la deami-
den llegar a 2 g. ia/ha.
nación de aminoácidos y la fotorespiración. En
• Son de amplio espectro.
las plantas tratadas con glufosinato, la inhibi-
• Poseen actividad residual en el suelo.
ción de la reacción que produce glutamina a
• Permiten una amplia ventana de aplica-
partir del glutamato conduce a una rápida acu-
ción y buen margen de seguridad para el
mulación de amonio, la fotosíntesis y la sínte-
cultivo.
sis de proteínas decrecen. El conjunto de estos
• Presentan baja toxicidad para mamífe-
procesos producen la muerte de la planta unos
ros.
pocos días luego del tratamiento.
La AHAS es un blanco muy particular, ya
Obtención de plantas transgénicas que es inhibida por herbicidas que pertene-
resistentes a glufosinato cen a varios grupos químicos, entre ellos, las
El bialafos, un producto de fermentación de sulfonilureas y las imidazolinonas. Ambos son
Streptomyces hygroscopicus, se comercia- relativamente recientes y el primero de ellos
liza en Japón desde 1984 bajo el nombre de fue comercializado en 1982 (clorsulfuron, una
Herbiace®. Este es un pro herbicida natural sulfonilurea). Las sulfonilureas actúan como
que consiste en L-glufosinato y dos residuos inhibidor competitivo del piruvato sobre el sitio
L-alanina. En las células vegetales, el bialafos catalítico de la enzima y las imidazolinonas ac-
se convierte en L-glufosinato por acción de en- tuan como inhibidor no competitivo con respec-
dopeptidasas. to al piruvato (Fig. 4). La expresión de AHAS
A partir de la cepa Tu494 de Streptomyces es necesaria siempre que haya síntesis de
proteínas, por ello esta enzima se expresa a lo
hygroscopicus, se clonaron los genes bar y pat,
largo del ciclo de vida de la planta, catalizando
ambos codifican para la síntesis de la enzima
el primer paso de las dos ramas de la biosín-
fosfinotricin-acetil transferasa (proteína PAT), tesis de aminoácidos ramificados, proceso que
que convierte al L-glufosinato en una forma en las plantas se localiza en los cloroplastos.
acetilada sin actividad herbicida y que permite Los inhibidores de la AHAS se unen a dominios
a estas bacterias defenderse de la acción tóxi- de la misma que no corresponden al sitio ca-
ca del glufosinato que ellas mismas producen. talítico, esto provoca que las mutaciones pun-
Las primeras plantas con niveles de resisten- tuales que afectan la unión de un herbicida a

Figura 3. Representación de la enzima AHAS de Arabidopsis thaliana mostrando sus 4 sub-unidades
idénticas. Fuente: Dr. Ronald G. Duggleby
Figura 4. Sub-unidad de AHAS mostrando sus tres sectores junto con la Tiamina piro fosfato (TPP) en
color rojo y los cofactores Mg2+, y flavin dinucleotido (FAD). En amarillo puede verse el sitio de acción ocu-
pado por el herbicida imazaquin. Fuente: Dr. Ronald G. Duggleby
la AHAS, no modifiquen su actividad catalítica. convierten a la AHAS sensible en una forma de

Como consecuencia, se han descrito en male- la enzima resistente a por lo menos un herbici-
zas, varias sustituciones de aminoácidos que da sin perder su funcionalidad.

Surgimiento de malezas resistentes a las patrones de resistencia a los inhibidores de las
AHAS AHAS sugieren que los sitios de unión de cada
El extenso y reiterado uso de los inhibidores familia no sean idénticos (Fig. 5). El gran nú-
de la AHAS hizo que, a pesar de su reciente di- mero de biotipos resistentes se debe en parte
fusión, la resistencia a los mismos haya evolu- a que existen muchos aminoácidos que al ser
cionado rápidamente en las malezas. Así, hay sustituidos transforman a la AHAS en resisten-
actualmente más especies o biotipos de male- te. La resistencia a las AHAS puede dividirse
zas resistentes a este grupo de herbicidas que en 3 categorías:
a cualquier otro. En la mayoría de los casos la • Biotipos resistentes a todos los inhibi-
resistencia que surge en las malezas se debe dores de las AHAS: sulfonil-ureas (SU),
a alteraciones en el sitio blanco del herbicida imidazolinonas (IMI), triazolopyrimidinas
como origen de una mutación puntual. Existen (TP), y pyrimidinylthiobenzoatos (PTB)
una gran cantidad de mutaciones responsables • Biotipos resistentes a IMI y PTB sola-
de la resistencia a los inhibidores de la AHAS, mente.
por ejemplo las mutaciones en los genes que • Biotipos resistentes a SU y TP solamen-
codifican dicha enzima, resultando en algún te.
cambio de cualquiera de los cinco aminoácidos
que la forman. Por ejemplo, un cambio en Pro Obtención de cultivos resistentes a
197 provee alta resistencia a las sulfonil ureas inhibidores de la AHAS
pero no a las imidazolinonas, mientras que la A mediados de la década del 80 se obtuvie-
sustitución de Ala122 resulta en resistencia so- ron importantes avances en el desarrollo de
lamente a IMI. Una mutación en Trp591 provee líneas de arroz tolerante o resistente a herbici-
resistencia a las dos familias de herbicidas y das IMI, principalmente por una selección masi-
es muy posible que ocurran mutaciones múl- va en cultivos de tejidos. En 2001 y 2002 las va-
tiples que generen resistencia múltiple al con- riedades resistentes a IMI fueron introducidas
junto de inhibidores de la AHAS. Los diferentes en el sur de EEUU bajo el nombre comercial de
Figura 5. A) Clorimuron-etil posicionado en el sitio activo de la AHAS de Arabidopsis. La molécula es

inclinada en torno al grupo sulfonil los anillos aromáticos obstruyen el canal de acceso al sitio activo de la
enzima mientras que el resto de la molécula se mete en éste. B) Imazaquin bloqueando el acceso al sitio
activo de la AHAS, su posición es mucho más superficial en comparación al clorimurón Fuente: Dr. Ronald
Duggleby

Clearfield®. Estas variedades no fueron modifi- mecanismo de acción consiste en unirse a la
cadas por la inserción de genes extraños sino proteína D1, ubicada en la membrana tilacoi-
que son mutantes seleccionados y desarrolla- de del cloroplasto, impidiendo así su unión a la
dos con variedades siguiendo el método clásico plastoquinona y bloqueando el transporte de
de fitomejoramiento. La tecnología Clearfield®, electrones hacia el Fotosistema I. La atrazina
proveniente de una mutación natural en plantas se usa en cultivos como maíz y sorgo, que pre-
de girasol silvestre (Helianthus annuus), ha sido sentan resistencia a la misma por tener capa-
incorporada en el cultivo comercial de girasol. cidad metabólica de detoxificarlo por medio de
El trigo de primavera resistente a las imidazoli- la glutation-s-transferasa, que fija un tripéptido
nonas fue liberado comercialmente en Canadá de glutation a compuestos hidrofóbicos como la
en 2004 (IR Trait). En remolacha azucarera fue atrazina. Este mecanismo, esta involucrado en
desarrollada la resistencia a IMI y sulfonilureas el metabolismo de las triazinas y las clorace-
por selección de células somáticas Sir-13 y tanilidas. Una vez que el glutatión es unido al
93R30B. Las sojas STS® (sulfonylurea-tolerant herbicida, este se transforma en un compuesto
soybeans) fueron obtenidas en 1993 por mé- no tóxico y es removido hacia la vacuola. Este
todos de selección tradicional y poseen el gen es uno de los mecanismos enzimáticos de pro-
Als1 que otorga resistencia natural a este tipo tección frente a compuestos xenobióticos, una
de herbicida. de las estrategias de la resistencia a herbicidas.
Mediante tratamientos mutagénicos de mi-
crosporas y posterior cultivo y selección in vitro, Selectividad por alteraciones en el sitio
se han obtenido plantas resistentes a imidazoli- blanco del herbicida
nonas (colza), de esta misma manera, se obtu- En el contexto de reiterado uso de triazinas
vieron plantas resistentes a imidazolinonas por en monocultivo de maíz, se han identificado
mutagénesis química de semillas y posterior biotipos de malezas con resistencia a las mis-
selección a campo en arroz, trigo y maíz. Res- mas. Esta resistencia se basa en la alteración
pecto de la obtención de plantas transgénicas, del sitio blanco de estos herbicidas. La proteí-
fueron obtenidas plantas de algodón resisten- na D1 está codificada por el gen psb A, que
tes debido a la expresión de una AHAS de taba- está ubicado en el genoma del cloroplasto.
co mutagenizada in vitro y lino con la expresión En varias especies vegetales se ha reportado
de una AHAS de Arabidopsis spp. como base molecular de la resistencia a triazi-
nas una mutación de puntual en el codón 264
Resistencia a las triazinas del mencionado gen, que produce una sus-
La aparición de la resistencia a las triazinas titución de serina por glicina (Figura 6) en la
en algunas especies de malezas, aportó una forma resistente. Un reemplazo de isoleucina
buena oportunidad para desarrollar cultivos re- por Val219 en Poa annua es la responsable de
sistentes por técnicas de selección clásica. La la resistencia de este biotipo al diuron y metri-
fuente de genes utilizada por los criadores esta- buzin. En Portulaca oleacea una sustitución de
ba normalmente limitada por las barreras repro- Ser264 a treonina provee resistencia a linuron.
ductivas que existen entre las especies, pero la La resistencia de los inhibidores del fotosiste-
aparición de un biotipo de Brassica campestris ma II basada en cambios del sitio de acción
resistente permitió el desarrollo de la canola es de herencia materna, por ser origen de una
resistente a las triazinas. El citoplasma de B. mutación del ADN del cloroplasto. Este tipo de
Campestris resistente fue transferida a Brassi- herencia es de bajo potencial de expansión ya
ca napus var. Oleífera por retrocruzas combina- que no se diseminan por medio del polen.
da con selección citogenética. Así OAC Triton® La proteína 32 kDa (proteína de unión a Qb o
fue la primera canola resistente a triazinas que D1) fue identificada como sitio de unión de las
apareció comercialmente en Canadá. triazinas en Amaranthus hybridus. Esta proteí-
Dentro de este grupo, la atrazina es uno de na integra el núcleo del centro de reacción del
los herbicidas más usados en el mundo, estos Fotosistema II. En líneas resistentes de Ama-
herbicidas son inhibidores fotosintéticos. Su ranthus, se vio que las triazinas no se unían a

Figura 6. Fragmento de la proteína D1 que es punto de unión de la plastoquinona y sitio de acción de la
s triazinas, mostrando la sustitución de serina de la forma susceptible por glicina en la forma resistente a
atrazina, en el codón 264. Fuente: Mallory-Smith, 2006.
la proteína y se encontró una mutación puntual obtenida de Klebsiella pneumoniae sub. sp.
de Ser a Gly en la posición 228. Se observaron ozanae. Estas plantas son resistentes a campo
mutaciones similares de la Ser 264 a Gly en la a los herbicidas ioxynil y bromoxynil y han sido
proteína de 32 kDa de Chlamydomonas rein- liberadas comercialmente en algunos países.
hardtii, Chenopodium album y Solanum nigrum. Al ser el glifosato menos costoso y de mayor
La búsqueda de resistencia por ingeniería espectro de control que los hidroxibenzonitri-
genética se ha orientado a la introducción de los, en 2004 fue el último año de comercializa-
proteínas de 32 kDa mutadas en plantas trans- ción de algodón BXN1 y colza BXN.
génicas y a la detoxificación de atrazinas me-
diante la introducción de un gen que codifica Resistencia a Dicamba
Es un herbicida auxínico que se utiliza como
glutation-S-transferasa (GTS). El segundo en-
pre y post emergente en el control de malezas
foque ha dado mejores resultados.
latifoliadas anuales y perennes. Recientemen-
te se logró aislar el gen de la dicamba mono-
Resistencia a hidroxibenzonitrilos
oxigenasa (DMO) de Pseudomona maltophi-
Los hidroxibenzonitrilos son también inhibi- lia, la cual confiere tolerancia a dicamba. Esta
dores del fotosistema II en especies dicotiledó- enzima está involucrada en la conversión del
neas. Por esta razón, cuando se aplican sobre dicamba en un compuesto no tóxico como el
dicotiledóneas resistentes a los mismos, se ácido 3,6 dicloro-salicílico. La inserción de este
suele incluir un herbicida de acción graminici- gen provee a las plantas latifoliadas resisten-
da, de modo de ampliar el espectro de control cia al herbicida. Actualmente se encuentra en
de malezas. Se obtuvieron plantas transgéni- desarrollo y proceso de inscripción en USA la
cas de algodón, colza y tabaco que expresan soja y el algodón resistentes a dicamba por la
una secuencia codificante para una nitrilasa, inserción de este gen.

Otras resistencias metabólicas a los herbicidas no selectivos ya existentes, es
una opción interesante para ser explorada por
Genes de bacterias la industria agroquímica respecto al desarrollo
Se obtuvieron plantas transgénicas de va- de nuevos herbicidas. Debe remarcarse que
rias especies, resistentes al ácido 2,4-dicloro esto implica un cambio de paradigmas tecnoló-
fenóxiacético (2,4-D; regulador de crecimiento gicos: antes, se desarrollaban herbicidas para
de tipo auxínico) por expresión de una mono- su uso en cultivos particulares; ahora, se modi-
oxigenasa con gran especificidad de sustra- fican genéticamente los cultivos para favorecer
to, obtenida de Alcaligenes eutrophus (gen el uso de herbicidas particulares. La capacidad
JMP134 tfdA), una bacteria de suelo capaz de de los científicos para desarrollar nuevos even-
utilizar el 2,4-D como sustrato fuente de car- tos transgénicos útiles en cultivos y la expecta-
bono. A partir de esta bacteria, también, se lo- tiva de utilización de los mismos es actualmen-
graron plantas transgénicas que expresan una te muy alta. Sin embargo, surgen cuestiones
secuencia codificante para una dehalogenasa, que podrían afectar el futuro desarrollo de este
que confiere resistencia al herbicida dalapon tipo de tecnología. ¿Cómo afectará la opinión
(inhibidor de la síntesis de lípidos), asi como pública y los actuales sistemas regulatorios a
una secuencia codificante para una carbamato los nuevos eventos transgénicos? ¿Habrá su-
hidroxilasa, obtenida tambien de Alcaligenes ficientes mercados globales que justifiquen la
sp. que confiere resistencia al herbicida meto- inversión que implica su desarrollo? ¿Acepta-
laclor (perteneciente al grupo de las cloroace- rán los consumidores la proliferación de nue-
tamidas que inhiben la síntesis de lípidos). vos organismos genéticamente modificados
(OGM) en Europa? La demanda de los produc-
Genes eucarióticos tores por los OGM puede ser muy alta, pero
Fueron obtenidas plantas de tabaco que ex- globalmente el comprador debe también nego-
presan una glutation S-transferasa de maíz, re- ciar respecto de la situación de los gobiernos y
sistentes a cloroacetamidas, plantas transgé- la sociedad para determinar la viabilidad de los
nicas de papa con expresión constitutiva de 3 nuevos eventos transgénicos. La expansión fu-
secuencias codificantes para citocromo-P450 tura en esta área dependerá de cómo se res-
monooxigenasas humanas. Se expresó en ponda a estas cuestiones.
papa, bajo control de un promotor inducible por
benzotiadiazol, una secuencia que codifica la Bibliografía de consulta
citocromo-P450 monooxigenasa de rata, sola
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V, CAPITULO 12 La primera respuesta observada en plantas
sometidas a un estrés hídrico severo es el cierre
de los estomas para prevenir la pérdida de agua
Obtención de plantas tolerantes a
por transpiración, lo que provoca una disminu-
distintos tipos de estreses ción de la tasa fotosintética y de la actividad
abióticos ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa
(RubisCO). La disminución en el CO2 intrace-
Florencia del Viso, Andrea F. Puebla, lular provoca un aumento en el transporte de
Néstor Carrillo y Raquel L. Chan electrones con una concomitante producción de
EROS, incluyendo anión superóxido, peróxido
Factores abióticos que causan de hidrógeno (H2O2) y oxígeno singlete.
estrés en plantas. Efectos sobre Los cambios bioquímicos y fisiológicos aso-
los cultivos de interés agronómico ciados a la adaptación al estrés hídrico incluyen
Los cambios desfavorables en el ambiente, variaciones en la fluidez y en la composición de
provocados por factores climáticos y edáficos, las membranas, acumulación de osmolitos, y
generan estrés de tipo abiótico en las plantas cambios en las interacciones proteína-proteína
afectando severamente su productividad. Los y proteínas-lípidos.
estreses abióticos constituyen la principal causa
de pérdidas en los cultivos. Estas pérdidas de Salinidad
productividad superan a veces, según cálculos Las altas concentraciones salinas en los
estimativos, el 50%. Las estrategias de mejora- suelos afectan a las plantas en al menos dos
miento clásico indicaron que los caracteres de formas. En primer lugar dificultan a las raíces
tolerancia a estreses ambientales son caracteres la extracción de agua del suelo y en segundo
cuantitativos y difíciles de seleccionar. lugar resultan tóxicas para toda la estructura
Existen numerosos factores abióticos natura- vegetal. Las diferentes especies varían en su
les causantes de estreses para las plantas. Las tolerancia al estrés salino. Existen especies
actividades antropogénicas han agravado esta sensibles como el arroz, el maíz y la soja,
problemática. Como resultado global, el 22 % de mientras que otras como la alfalfa o la cebada
los suelos cultivados es salino y las áreas someti- presentan una mayor tolerancia.
das a déficit hídrico se expanden continuamente. Los efectos causados por el estrés salino
En este capítulo nos enfocaremos en la des- son esencialmente la disrupción del equilibrio
cripción de los estreses abióticos que más afec- osmótico e iónico por exceso de sodio (Na+),
tan el crecimiento, desarrollo y productividad de y la producción de EROS. Niveles tóxicos de
los cultivos; así como en las estrategias que se Na+ afectan la actividad de diversas enzimas y
han implementado con el objetivo de obtener las causan la desorganización de las membranas,
variedades de especies agronómicamente im- la reducción del crecimiento, y la inhibición de
portantes mejor adaptadas a situaciones de es- la expansión y la división celular.
trés. La reducción del crecimiento como conse-
cuencia del estrés salino presenta dos fases.
El déficit hídrico La primera (fase osmótica) es una respuesta
La disponibilidad de agua es el factor más im- rápida, que causa una pronunciada detención
portante que afecta los cultivos. La sequía cau- del crecimiento de la planta y el cierre de los
sa deshidratación celular por remoción de agua estomas. La segunda (fase iónica) se caracte-
hacia los espacios extracelulares resultando riza por una necrosis de las hojas causada por
en la reducción del volumen vacuolar y citosó- la acumulación de Na+. En algunas especies,
lico, en la reducción del crecimiento vegetativo las raíces de las plantas exhiben la capacidad
por disminución de la tasa fotosintética, y en la de excluir al Na+. En otras, existe una toleran-
producción de especies reactivas de oxígeno cia específica de tejido al Na+ y al anión cloruro
(EROS) que afectan negativamente las estruc- (Cl-), que involucra la compartimentalización de
turas celulares y el metabolismo. estos iones intracelularmente, así como tam-

bién la excreción de sales por medio de glán- Vías de señalización de las respuestas.
dulas especializadas. Regulación de la expresión génica.
Las plantas han adquirido durante su evolu-
Las temperaturas extremas ción la capacidad de modificar eventos especí-
El estrés por temperatura que experimen- ficos del desarrollo como respuesta a los cam-
tan las plantas puede clasificarse en tres tipos: bios en las condiciones ambientales, y de este
bajas temperaturas sobre cero (del inglés chi- modo optimizar la utilización de los nutrientes
lling), temperaturas de congelamiento (del in- disponibles. Esta plasticidad representa una
glés freezing) y altas temperaturas. ventaja significativa ya que el programa de
expresión de genes que gobierna el desarro-
Altas temperaturas llo puede variar de acuerdo a las condiciones
En la actualidad, el calentamiento global externas.
acentúa los efectos adversos de las altas tem- Las plantas perciben las señales del medio
peraturas sobre los cultivos, incrementando las ambiente y las transmiten a la maquinaria celu-
pérdidas de productividad en tasas de hasta el lar. De esta forma activan procesos utilizando
17% por cada grado Celsius de aumento de la mecanismos complejos que les permiten acli-
temperatura ambiente durante la estación de matarse. La respuesta consiste, en general, en
crecimiento vegetativo. cambios en el tipo, cantidad o actividad de de-
El estrés por altas temperaturas está deter- terminadas proteínas de la planta, generando
componentes útiles para las nuevas condicio-
minado tanto por el aumento de la temperatura
nes y eliminando los superfluos. Esto implica la
ambiental por sobre la óptima inherente a cada
activación o inactivación de los genes a partir
especie, como por la radiación solar. Las hojas
de los cuales estas proteínas son sintetizadas.
son los órganos que más sufren este tipo de
Los procesos de activación e inactivación sue-
estrés.
len estar gobernados por un lado, por factores
Las altas temperaturas, al igual que las ba- de transcripción y por otro por la presencia de
jas, afectan la fluidez y la permeabilidad de las elementos presentes en las regiones promoto-
membranas celulares y conducen a la apertura ras de los genes regulados. Además de este ni-
estomática para refrigerar la hoja. vel de regulación de la expresión génica (trans-
cripcional), existen otros puntos de regulación
Bajas temperaturas que incluyen las vías de procesamiento de los
El frío es un factor relevante que causa se- ARN mensajeros, el transporte de los mismos
rias consecuencias en la productividad de las una vez maduros, su traducibilidad, y por últi-
especies vegetales. Las especies adaptadas mo el procesamiento y transporte de las proteí-
a climas templado-fríos, como los cereales de nas sintetizadas. Recientemente se han des-
invierno, toleran bajas temperaturas sobre cero cripto mecanismos de silenciamiento de genes
(0 – 15 ºC), y aún temperaturas de congela- mediados por micro-ARNs, como un punto im-
miento si son expuestas a un proceso conocido portante de regulación de la expresión génica
como aclimatación. En contraste, las especies (para una revisión ver Sunkar y col., 2007).
de climas tropicales y subtropicales, como el
maíz, el arroz o el tomate, son sensibles a las Obtención de plantas transgénicas con
bajas temperaturas y en su mayoría carecen tolerancia mejorada a distintos tipos de
de mecanismos de aclimatación. estrés de origen abiótico
La consecuencia más importante del conge- Como se ha comentando, los mecanismos
lamiento es el daño a las membranas celulares. de adaptación a condiciones ambientales ad-
Éstas son afectadas por la disminución de la versas son controlados por redes moleculares
fluidez y la deshidratación que sufren durante involucradas en la percepción del estrés, la
el congelamiento. La fluidez de las membranas transducción de las señales, y la regulación de
depende de la temperatura y de la proporción la expresión de genes efectores. Estas casca-
de ácidos grasos insaturados presentes. das activan mecanismos protectores para res-

tablecer la homeostasis, y proteger y reparar años se realizaron numerosos estudios detalla-
biomoléculas y membranas dañadas (Figura dos sobre el desarrollo de tolerancia a estrés
1). En consecuencia, la manipulación de genes abiótico, muchos de ellos basados en la deter-
que ayuden a mantener las funciones de célu- minación de perfiles de transcriptos y amplitud
las y componentes podría, en principio, incre- genómica, que proporcionaron el conocimiento
mentar la tolerancia a estrés. La mayor parte de indispensable para el desarrollo racional de to-
las estrategias empleadas para mejorar el ren- lerancia a estrés.
dimiento de plantas bajo condiciones adversas Diferentes fuentes de estrés (sequía, hela-
se han basado en el fortalecimiento de estos das, salinidad) disparan una respuesta en cier-
sistemas endógenos (Figura 1). En los últimos to modo única, que posee a la vez elementos

comunes e idiosincrásicos respecto a otras res- Sin embargo, esta estrategia no está exenta
puestas y a vías metabólicas y morfogenéticas de problemas ya que la expresión constitutiva
del organismo. Existe una significativa super- de este tipo de genes suele afectar rutas no
posición y entrecruzamiento (del inglés crossta- vinculadas al estrés y, muy a menudo, se aso-
lk) entre tales redes de decisiones, que puede cia con retardos de crecimiento y alteraciones
resultar sinérgica o antagónica. Aunque esta en el metabolismo basal. Tales inconvenientes
observación abre posibilidades de obtener to- podrían evitarse mediante el uso de promoto-
lerancia cruzada a diferentes fuentes de estrés res inducibles por estrés en lugar de constituti-
mediante una única intervención transgénica, vos; la situación refleja la dificultad de manipu-
también limita el número de intervenciones úti- lar reguladores clave sin contar con reglas ge-
les, y a menudo requiere una regulación sofisti- nerales para identificar puntos de intervención
cada del transgén para prevenir impactos inde- adecuados.
seables en el crecimiento y desarrollo vegetal.
Las estrategias de ingeniería genética em- Los factores de transcripción
pleadas para incrementar la supervivencia bajo Los factores de transcripción (FTs) juegan
condiciones de estrés han intentado fortalecer un rol central en la elaboración de la respues-
la expresión de cuatro grandes grupos de ge- ta ambiental y el programa morfogenético de
nes: i) genes involucrados en la transmisión de la planta. Se trata de proteínas que actúan en
señales; ii) reguladores transcripcionales; iii) trans, capaces de reconocer blancos de se-
genes que codifican proteínas involucradas en cuencias específicas de ADN (elementos cis)
la tolerancia, como proteínas del shock térmico localizadas en las regiones promotoras de de-
(HSP) y enzimas antioxidantes; y iv) genes que terminados genes. La regulación de la expre-
codifican enzimas involucradas en la síntesis sión génica está gobernada en gran medida
de metabolitos protectores. Discutiremos bre- por la interacción de los FTs con esta clase de
vemente cada una de las estrategias. En las elementos cis, induciendo o reprimiendo distin-
Tablas 1 a 3 se describen algunos casos. tas vías de transducción de señales a través de
un efecto dominó.
Genes involucrados en la cascada de En plantas, se han identificado y caracteri-
señales zado numerosos genes que codifican FTs. De
Varios genes inducibles por estrés cuyos hecho, en Arabidopsis thaliana y Oryza sativa,
productos intervienen en la transmisión de se- cuyos genomas fueron completamente se-
ñales de la respuesta han sido identificados y cuenciados, se identificaron unos 1500 genes
caracterizados exhaustivamente, incluyendo que codificarían FTs. Esta identificación se rea-
fosfolipasas y quinasas de proteínas pertene- lizó en base a la presencia de dominios o mo-
cientes a las familias MAP (del inglés mitogen- tivos conservados, y caracterizados funcional-
activated protein), y SOS (del inglés salt-overly- mente en FTs de otros reinos. Sin embargo, en
sensitive). Puesto que operan en un nivel alto plantas, no más de un 10 % de estas secuen-
de la cascada de decisiones de la respuesta, cias han sido aisladas y estudiadas fehacien-
constituyen por definición excelentes puntos temente, asignándoles la función de FT a las
de intervención para obtener tolerancia gene- proteínas codificadas. Además se debe tener
ralizada. Varios de estos genes han sido intro- en cuenta que la similitud entre proteínas de
ducidos en plantas resultando en líneas con fe- organismos que pertenecen a distintos reinos,
notipos tolerantes a diversas fuentes de estrés. no necesariamente implica que se encuentren
A título de ejemplo, la expresión constitutiva involucradas en la regulación de los mismos
de la MAP quinasa quinasa quinasa 1 de ta- eventos.
baco en maíz, activa una cascada de señales Los FTs vegetales se clasifican en familias y
oxidativas que confiere tolerancia aumentada subfamilias de acuerdo al grado de conserva-
a heladas, calor y salinidad en las transforman- ción de la secuencia de aminoácidos, al tama-
tes; protegiendo la fotosíntesis y otros metabo- ño, y a la composición estructural de los genes
lismos bajo condiciones adversas. codificantes.

Algunos FTs fueron caracterizados funcio- codificaban proteínas de tipo WRKY, provocó
nalmente y, en casi todos los casos, se observó la falta de respuesta en mutantes silenciadas.
que intervienen en varias vías se señalización. En otros, se obtuvieron plantas con respuestas
Así por ejemplo, las proteínas de las familias mejoradas a distintos tipos de estrés al mismo
MYB, MYC, b-Zip y HD-Zip participan en las tiempo, corroborando la hipótesis de que los
respuestas a distintos tipos de estrés abiótico; factores de transcripción actúan simultánea-
mientras que las proteínas de la familia WRKY mente en diferentes vías de señalización.
se relacionan tanto con la respuesta al ataque Dentro de los FTs específicamente vincula-
por organismos patógenos, como a la respues- dos a respuestas ambientales, existe un grupo
ta frente a estrés abiótico. de genes bien caracterizados cuya acción se
En las estrategias donde los FTs vegetales ubica en el inicio de la cascada de señalización
han sido sobreexpresados, expresados de ma- en respuesta a estrés abiótico. Este grupo se
nera ectópica, o silenciados, se observó que encuentra representado por Rd29A de A. tha-
las plantas transformantes presentaban res- liana. En los promotores de los genes de este
puestas alteradas a las condiciones medioam- grupo se identificaron las secuencias denomi-
bientales, tanto por la acción de factores bióti- nadas ABRE (del inglés ABA-responsive ele-
cos como abióticos (ver Tabla 2). En algunos ment, elemento de respuesta a ABA) y DRE/
casos la duplicación o triplicación de genes que CRT (dehydration-responsive element/C-re-
Tabla 2. Obtención de plantas tolerantes a déficit hídrico utilizando factores de transcripción de origen
vegetal (Adaptada de Umezawa y col., 2007)
Planta de la
Planta Sistema de
Clasificación Nombre del gen cual proviene Experimentos realizados Parámetros medidos Año
transformada expresión
el gen
Familia AP2/ERF
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 1998
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Arabidopsis Ara bidopsis Arabidopsis Retención de agua Supervivencia 1999
RD29AP
DREB1/CBF DREB1B/CBF1 Tomat e Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Crecimiento y desarrollo 2002
DREB1/CBF CBF4 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2002
DREB1/CBF ZmDREB1A Arabidopsis Maíz CaMV35SP Disecación Electrolitos 2004
DREB1/CBF DREB1C/CBF2 Arabidopsis Arabidopsis Knock out Disecación Supervivencia 2004
AP2/ERF SHN1/WIN1 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Desarrollo 2004
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Trigo Arabidopsis Arabidopsis Retención de agua Supervivencia 2004
RD29AP
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Tabaco Arabidopsis Arabidopsis Retenció n de agua Superviven cia y 2004
RD29AP fototsíntesis
DREB1/CBF DREB1A/CBF3 Arroz Arabidopsis MaízUbi -1P Retención de agua 2005
AP2/ERF WXP1 Alfalfa M. truncatula CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2005
DREB2 DREB2A (forma Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP, Retención de agua Supervivencia 2005
active con Arabidopsis Supervivencia
deleción interna) RD29AP
Proteínas con
dominio básico
asociado a
cierre de
leucinas (bZIP) ABF3, AREB2/ABF4 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua 2002
AREB1/ABF2 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Crecimiento y supervivencia 2004
bZIP
ABF3 Arroz Arabidopsis Maíz Ubi -1P Retención de agua Supervivencia 2005
bZIP
AREB1/ABF2 (forma Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua, Fotosíntesis y supervivencia 2005
bZIP
active con una deshidratación Supervivencia
bZIP
deleción interna)
AREB1/ABF2 (forma Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP deshidratación 2005
active fosforilada) Supervivencia
bZIP)
AtMYC2, AtMYB2 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Tratamiento con manitol 2002

MYB/MYC
CpMYB10 Arabidopsis C. CaMV35SP Retención de agua Electrolyte leakage 2004
MYB, MYC
AtMYB60 Arabidopsis plantagineum ARN de Retención de agua Supervivencia, crecimiento 2005
MYB
Arabidopsis interferencia y retención de agua
R2R3 -MYB
Proteínas con
ZPT2-3 Petunia CaMV35SP Deshidratac ión 2003
dedos de zinc
CAZFP1 Arabidopsis Petunia CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2004
Cys2His2-type STZ Arabidopsis Pimie nto CaMV35SP Retención de agua Supervivencia, contenido 2004
Cys2His2-type Arabidopsis de clorofila
Cys2His2-type HAHB4 Arabidopsis y CaMV35SP y Deshidratación, ataque Supervivencia,
maíz girasol promotor con insectos, retención de conductancia
HD- Zip HAHB4 agua Supervivencia, área foliar,
(homeodominio turgencia, desarrollo
asociado a
cierre de ANAC019/055/ 072 Arabidopsis 2004
leucinas) Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua
Supervivencia
Otros
NAC

peat, elemento de respuesta a deshidratación). tópica de HAHB4 en plantas de Arabidopsis y
Los FTs de la familia EREBE/AP2 unen las se- maíz confiere tolerancia al ataque de insectos,
cuencias de tipo DRE/CRT y los de la familia e incluso al daño mecánico; aunque también
b-ZIP los elementos ABRE. La expresión de resulta en hipersensibilidad al ataque de bacte-
los genes de la familia EREBE/AP2 se induce rias patógenas, al menos en Arabidopsis.
a bajas temperaturas mientras que los de tipo Nuevamente, la utilización de promotores in-
DREB lo hacen por estrés osmótico. Los FTs ducibles en reemplazo de los constitutivos pre-
de tipo b-Zip AREB1 y AREB2 son regulados senta una alternativa viable. Cuando se modi-
positivamente por ácido abscícico (ABA). fican los factores adecuados, la morfología y el
La sobreexpresión de este tipo de genes pro- proceso de desarrollo se tornan indistinguibles
dujo plantas con tolerancia aumentada a facto- de las plantas controles sin transformar, alcan-
res abióticos. En los casos de de DREB1 y 2 en zando buenos niveles de tolerancia.
A. thaliana las plantas transgénicas resultaron
tolerantes a déficit hídrico. Por otra parte, la Proteínas que confieren tolerancia a
expresión heteróloga de DREB1B/CBF1 de A. estrés
thaliana en tomate, además de conferir una ele- Muchas situaciones adversas como la se-
vada tolerancia a sequía, también lo hizo frente quía, el calor extremo y la salinidad, pueden
a estrés oxidativo y al generado por frío. Apa- causar desnaturalización e inactivación de
rentemente el mecanismo de tolerancia ocurre biomoléculas. Las HSP, las proteínas LEA (lla-
vía el cierre estomático rápido, el incremento madas así por su abundancia en la embriogé-
en la concentración de prolina y el aumento de nesis tardía, del inglés late-embryogenesis-
la actividad catalasa, que provoca la reducción abundant) y las chaperonas moleculares, son
en la acumulación de H2O2. Es interesante des- capaces de suministrar protección contra estos
tacar que la transformación cruzada con genes efectos favoreciendo el adecuado plegamiento
homólogos de arroz dio como resultado el mis- y ensamblado de enzimas y otras proteínas.
mo efecto protector. Los resultados de algunos ensayos señalan
Un FT que actúa por un mecanismo diferen- una correlación positiva entre los niveles de va-
te es WXP1 perteneciente a la familia AP2 de rias chaperonas y la tolerancia a estrés. Se ob-
Medicago truncatula. Cuando se expresó de servó también que la expresión de estos genes
manera ectópica en alfalfa, las plantas trans- es inducida durante episodios de adversidad
formadas presentaron tolerancia a déficit hídri- ambiental, y varios de ellos han sido utilizados
co vía la sobreproducción de cera en las hojas, para diseñar y generar plantas transgénicas
y evitando de esta forma la evaporación por tolerantes (ver Tabla 1). Por ejemplo, la intro-
transpiración. ducción de HSP101 de Arabidopsis en arroz
Otro ejemplo de genes que intervienen en condujo a un aumento de la termotolerancia,
distintas vías es el del FT HAHB4 de girasol. mientras que la sobreexpresión de proteínas
La expresión de este gen es regulada positiva- LEA resultó en mayor resistencia a la sequía.
mente por estrés hídrico, salino y la presencia Por otro lado, la producción aumentada
de las hormonas ABA, etileno y ácido jasmó- EROS también resulta frecuente frente a mu-
nico. La expresión ectópica de este gen bajo chas situaciones de estrés. Las EROS cum-
el control de un promotor constitutivo fuerte en plen un doble rol: participan en la transducción
plantas de Arabidopsis, generó líneas notoria- de señales, pero al mismo tiempo contribuyen
mente más tolerantes a condiciones de sequía al daño por oxidación de membranas y biomo-
y/o salinidad. Sin embargo, y tal como se refirió léculas, el cual es responsable de gran parte
en ejemplos anteriores, la expresión constitu- del deterioro que sufre la planta. Por lo tanto, la
tiva del gen provocó cambios morfológicos y manipulación de enzimas antioxidantes como
retraso en el desarrollo, eventos indeseables peroxidasas y dismutasas ofrece otra oportuni-
desde el punto de vista agronómico. La com- dad para prevenir los daños oxidativos ocasio-
plejidad de la acción de los FTs se ve reflejada nados por el desafío ambiental. Por desgracia,
también en el hecho de que la expresión ec- la aplicación de esta estrategia está lejos de

Tabla 1. Obtención de plantas tolerantes a déficit hídrico usando como herramientas genes que codifican
proteínas protectoras (adaptada de Umezawa y col., 2007)
Organismo del
Nombre del Planta Sistema de Experimentos
Clasificación cual se obtuvo el Parámetros medidos Año
gen transformada expresión realizados
gen
Metabolismo de
osmoprotectores
Fructan o s SacB Tabaco B. subtilis b CaMV35SP 5–10% PEG (tierra ) Desarrollo 1995
Trehalos a TPS1 Tabaco S. cerevisiae b CaMV35SP Disecación Supervivencia 1996
myo -Inositol IMT1 Tabaco Iceplant CaMV35SP Retención de agua Fotosíntesis 1997
Prolina P5CS Arroz Mothbean AIPC-ABA- Retención de agua Crecimiento del tallo 1998
inducible
Trehalos a OtsA, OtsB Tabaco E. coli b CaMV35SP Regado limitado Peso seco de hojas 1998
Fructan o s SacB Remolacha B. subtilis b CaMV35SP Regado limitado (productividad) 1999
Glicina -betaína COX Arabidopsis/ canola/ A. pascens b CaMV35SP Regado limitado Producci ón de biomasa 2000
Tabaco Crecimiento del tallo
Galactinol AtGolS2 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2002

Trehalosa TPSP Rice E. coli b ABA-inducible/ Retención de agua Fotosínte sis, crecimiento 2002
(OtsA+OtsB) rbcS P del tallo
Trehalosa TPSP Arroz E. coli b Ubi -1P de maíz Retención de agua Fotosínte sis, crecimiento 2003
(OtsA+OtsB) del tallo
Manitol mtlD Trigo E. coli b Maíz Ubi -1P Regado limitado Crecimiento del tallo, 2003
Poliaminas ADC Arroz D. stramonium b Maíz Ubi -1P 20% PEG (soil) biomasa 2004
Poliaminas SPDS Arabidopsis C. ficifolia CaMV35SP Retención de agua Crecimiento del tallo 2004
Prolina P5CS Petunia Arabidopsis , CaMV35SP Retención de agua Crecimiento del tallo 2005
Trehalosa TPS1 Tomat e arroz CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2005
Glicina -betaína GSMT+DMT Arabidopsis S. cerevisiae b CaMV35SP Retención de agua Crecimiento del tallo 2005
A. halophytica b Regado lim itado Fotosíntesis y crecimiento
Proteínas de del tallo
protección HVA1 Arroz Arroz Act -1P Retención de agua 1996
LEA (del inglés late Cebada Desarrollo
embryogenesis HVA1 Trigo Maíz Ubi -1P Retención de agua 2000
abundant ) BiP Tabaco Cebada CaMV35SP Retención de agua Desarrollo y biomasa 2001
LEA Soja Crecimiento del tallo y
Chaperone AyHsp17.6A Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua fotos íntesis 2001
HVA1 Arroz Arabidopsis Arroz Act -1P Supervivencia
Heat shock protein Ceba da
LEA LEA Col china CaMV35SP Retención de agua , 2004
Canola ensayos a campo Crecimiento y potencial
LEA de agua 2005
Crecimient o del tallo y
Proteínas retención de agua
MnSOD Alfalfa CaMV35SP Retención de agua
capt adoras de
N.
especies reactivas
MsALR Tabaco plumbaginifolia CaMV35SP Retención de agua 1996
de oxígeno (EROS)
PARP Canola CaMV35SP(RNAi) Callo s Fotosíntesi s,
Detoxific ació n Alfalfa conductancia ,
– Agrobacterium productividad
Lípido per óxido CDT1 C. plantagenium pg5 Retención de agua 2000
NAD+ ruptura CaMV35SP Retención de agua 2005
AVP1 Arabidopsis C. plantagenium CaMV35SP Cultivo en hidroponía y Fotosintesis 1997
Others AtNCED3 Arabidopsis Agrobacterium tierra Desarrollo 2001
desconocido Chl-NADP-ME Tabaco Arabidopsis MAS Supervivencia de los callos 2001
Arabidopsis Knockout 2002
transporte de iones CYP707A3 Arabidopsis Maíz Retención de agua Desarrollo 2005
biosíntesis de ABA Crecimiento del tallo
estomas Arabidopsis Conductancia estomática ,
desarrollo
catabolismo de ABA Supervivencia y
transpiración
ser sencilla, ya que diferentes miembros de la ambientales hostiles (Figura 1). Se trata de
red antioxidante en plantas responden de ma- amino ácidos (como prolina), aminas (glicina-
nera diferente a distintos tratamientos hostiles. betaína, poliaminas), azúcares y azúcares al-
Se han obtenido en consecuencia niveles va- coholes (trehalosa, manitol), y antioxidantes
riables de tolerancia mediante la expresión de (glutatión, ascorbato, tocoferoles). Otros solu-
enzimas antioxidantes. Por ejemplo, la sobre- tos compatibles son los fructanos, polímeros
expresión de superóxido dismutasas fue capaz de fructosa, cuyo incremento está relacionado
de incrementar la supervivencia y tolerancia a al proceso de aclimatación a las bajas tempe-
estrés en arveja y tabaco, pero no en alfalfa. raturas en especies tolerantes de gramíneas.
Así por ejemplo, plantas transgénicas de arroz
Síntesis de metabolitos protectores y tabaco que producen fructanos mostraron un
Se ha identificado una amplia gama de me- incremento en la tolerancia a las bajas tem-
tabolitos capaces de mitigar los efectos de- peraturas. No obstante, la modulación de una
letéreos del estrés osmótico y del estrés oxi- única reacción enzimática, aún cuando se trate
dativo que acompañan a muchas situaciones de la etapa limitante, está generalmente regu-

lada por la tendencia de la célula a restituir la proviene de estudios realizados en microorga-
homeostasis metabólica, limitando el potencial nismos fotosintéticos, cianobacterias y algas.
de este enfoque. Estos organismos, al igual que las plantas,
Los intentos de sobreexpresar trehalosa y están sometidos a estrés ambiental especial-
manitol en arroz y maíz, respectivamente, con- mente en los océanos donde las condiciones
dujeron a aumentos moderados en los niveles suelen ser extremas, y sufren disminuciones
de estos compuestos cuando se manipuló una del mismo tipo en los niveles de Fd.
única enzima. La modificación de varias eta- En tales condiciones, algas y cianobacterias
pas dentro de una misma vía puede ayudar al responden al desafío ambiental mediante es-
control de los flujos metabólicos de una mane- trategias sustitutivas. Se trata del reemplazo
ra más predecible. Por ejemplo, la ingeniería de las proteínas lábiles al estrés por otras re-
de varias reacciones en las correspondientes sistentes, mediante la inducción de la expre-
rutas permitió obtener altos niveles de glicina- sión de los genes que las codifican. El reem-
betaína y de trehalosa en plantas. La deter- plazo más conspicuo es precisamente el de
minación de perfiles metabólicos globales en Fd por flavodoxina (Fld), una flavoproteína so-
plantas se ha convertido en una herramienta luble que contiene mononucleótido de flavina
imprescindible para comprender cambios indu- y cuyas propiedades como transportadora de
cidos por estrés en metabolitos protectores. electrones son prácticamente idénticas a las
de Fd. Sin embargo, a diferencia de Fd que se
Estrategias sustitutivas encuentra ampliamente distribuida en plantas,
Un elemento común a muchas situaciones de animales y bacterias, Fld ha desaparecido del
estrés que ha surgido de los análisis de ampli- genoma de los eucariotes superiores, incluyen-
tud genómica en Arabidopsis es la declinación do plantas, y sus considerables ventajas adap-
universal de la proteína de hierro-azufre ferre- tativas se perdieron irreversiblemente mucho
doxina (Fd), resultado que además se ha con- antes de la colonización de la tierra firme.
firmado por ensayos bioquímicos. Fd juega un Es interesante hacer notar que a pesar de
rol central en la distribución de electrones des- los eones de divergencia evolutiva entre plan-
de la cadena de transporte electrónico a nume- tas y cianobacterias, la proteína Fld aislada de
rosas vías cloroplásticas, incluyendo la fijación estas últimas es capaz de interactuar producti-
de CO2, la asimilación de nitrógeno y azufre, el vamente con las enzimas homólogas, sugirien-
metabolismo de aminoácidos y la desaturación do que podrían actuar corrigiendo las conse-
de ácidos grasos. Además participa en varios cuencias negativas de la disminución de Fd en
procesos regulatorios (vía tiorredoxina), disipa- plantas estresadas.
tivos y morfogenéticos (síntesis de fitocromos y Efectivamente, líneas transgénicas de taba-
de ácido jasmónico). La regulación negativa de co que acumulan una Fld de cianobacteriana
la expresión mediante un ARN antisentido ha en cloroplastos desarrollaron tolerancia au-
permitido observar los efectos negativos de la mentada a diversas fuentes de estrés abiótico
caída de Fd: las plantas presentaron fenotipos (incluyendo sequía, radiaciones, heladas, altas
cloróticos y enanos, indicando que su disminu- temperaturas y alta luz), así como también a
ción puede ser extremadamente dañina para los efectos tóxicos del herbicida de contacto
un organismo sometido a estrés. Por lo tanto, paraquat y a nitroderivados. La tolerancia de-
Fd constituye un excelente candidato para in- sarrollada fue dependiente de la dosis, y de
tervenciones transgénicas. la capacidad de la Fld transgénica de interac-
Desafortunadamente, la posibilidad de incre- tuar con los sistemas endógenos de transporte
mentar el contenido de Fd mediante ingeniería electrónico, reemplazando a Fd a medida que
genética está limitada por la fuerte regulación esta declina como consecuencia del estrés.
postranscripcional de la expresión, que depen- Resultados preliminares indican que los mis-
de de secuencias ubicadas dentro de la región mos niveles de tolerancia pueden obtenerse
codogénica, lo que hace virtualmente imposi- en cultivos de interés agronómico como maíz,
ble la mutagénesis. Una alternativa atractiva cebada, colza, tomate y papa (Tabla 3).

Tabla 3. Obtención de plantas tolerantes a déficit hídrico usando como herramientas genes involucrados
en las vías de señalización (adaptada de Umezawa y col., 2007)
Clasificación Nombre Planta Planta de la Sistema de Experimentos Parámetros medidos Año

del gen transformada cual fue expresión realizados
aislado el
gen
Proteinas-
quinasas
CDPK OsCDPK7 Arroz Arroz CaMV35SP Retención de agua Crecimiento del tallo, expresión génica, 2000
marchitez,
GSK3/Shaggy AtGSK1 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia 2001
MAPKKK NPK1 Maíz Tabaco CaMV35SP Estrés hídrico Número de hojas, tamaño de fruto 2004
SnRK2 SRK2C Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia, expression génica 2004
Otros
Medidor de calcio CBL1 Arabidopsis Arabidopsis Agrobacterium Retención de agua Supervivencia, expression génica 2003
MAS
14-3-3 Proteina GF14l Algodón Algodón CaMV35SP Retención de agua Senescencia, contenido de clorofila, 2004
fotosíntesis
CC-NBS-LRR ADR1 Arabidopsis Arabidopsis CaMV35SP Retención de agua Supervivencia, expression génica 2004
Farnesyl- ERA1 Arabidopsis, Arabidopsis CaMV35SP/ Retención de agua, Supervivencia, pérdida de agua, 2005
transferasa canola RD29AP ensayos a campot productividad de semilla, contenido de aceite
(antisentido)
Del laboratorio al campo tolerancia aumentada a distintos tipos de es-

En la obtención de tolerancia a campo, el trés, sobre todo a aquellos que se dan en forma
pronóstico se complica aún más dado que las simultánea en determinadas regiones. Lograr
plantas en su ambiente natural están sometidas esto implica conocer las complejas relaciones
a varias adversidades en forma simultánea, en entre distintas vías de transducción de señales
lugar de una sola condición (tal como se estudia que participan en cada una de las respuestas.
en el laboratorio). Esto puede agravar el daño ¿Cuál sería la estrategia entonces? Obtener
que sufre por el organismo y al mismo tiempo, un mapa de todos los genes esenciales para
desencadenar rutas protectoras diferentes e in- el desarrollo de tolerancia a una combinación
cluso opuestas. Por ejemplo, la sequía es nor- de estreses abióticos puede ser, además de
malmente acompañada por cierre estomático costoso, un trabajo faraónico. Por otra parte, la
para prevenir la pérdida de agua, mientras que resistencia a múltiples estreses pareciera estar
las altas temperaturas conducen a aperturas ligada genéticamente a la penalidad de retar-
de los estomas para bajar la temperatura fo- dos en el desarrollo así como a disminuciones
liar mediante evaporación. Sin embargo, calor en los rendimientos. Sin embargo, desde el
y deficiencia de agua normalmente van juntas punto de vista opuesto, una reducción del ren-
en el campo. Algunos investigadores han suge- dimiento ocasionada por la estrategia utilizada
rido que el desarrollo de tolerancia contra una es mucho más alentadora que el rendimiento
combinación de estreses podría requerir una cero causado por la combinación letal de va-
respuesta única que no puede preverse por la rios tipos de estrés.
mera adición de genes inducidos durante cada Una estrategia posible sería la de analizar la
episodio individual de estrés. El conocimiento expresión génica en plantas que al ser some-
existente sobre este tipo de tolerancia es vir- tidas a una combinación de estreses severos,
tualmente nulo, lo cual podría explicar en parte sobrevivan o los toleren mejor que sus pares.
por qué algunas plantas transgénicas con tole- Este tipo de resistencia sugiere la presencia de
rancia aumentada desarrolladas en el labora- mutaciones detectables en los análisis de ex-
torio, no muestran mejoras en el rendimiento presión.
cuando son ensayadas a campo. También es fundamental la experiencia de
mejoradores y productores. Son ellos quie-
Perspectivas nes saben qué tipo de estrés o combinación
En consecuencia, uno de los mayores desa- de ellos, afecta más a cada cultivo y en cada
fíos es el desarrollar plantas transgénicas con región. Las combinaciones pueden ser muy di-

ferentes y por consiguiente los estudios y solu- broad-range stress tolerance. Plant Cell, 18,
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V. Capítulo 13 funcionales. De esta manera podemos encon-
trar metabolitos secundarios con estructuras
químicas similares a metabolitos primarios,
Manipulación genética del
pero que cumplen funciones muy diferentes.
metabolismo secundario en Según sus características biosintéticas po-
plantas demos clasificar a los metabolitos secundarios
en tres grupos principales (Figura 1):
Alicia Zelada, María Binaghi • terpenos, compuestos lipídicos deriva-
dos del isopentenil difosfato (IPP)
Metabolitos primarios y secundarios. • fenilpropanoides, compuestos fenólicos
Los metabolitos presentes en las plantas derivados de la vía del shikimato o del
pueden ser divididos en dos grupos fundamen- malonato.
tales: los metabolitos primarios y los metabo- • alcaloides, compuestos nitrogenados de-
litos secundarios. Se denomina metabolismo rivados de aminoácidos.
primario de las plantas a los procesos quími- La importancia económica de los metaboli-
cos que intervienen en forma directa en la su- tos secundarios se ha acrecentado en los úl-
pervivencia, crecimiento y reproducción de las timos años, y ello ha estimulado el interés en
plantas. Por ejemplo, son procesos químicos el estudio de su metabolismo y, en particular,
pertenecientes al metabolismo primario: la fo- en la modificación de ciertas rutas biosintéti-
tosíntesis, la respiración, la síntesis de proteí- cas mediante técnicas de ingeniería genética.
nas, la diferenciación de tejidos, y en general la Por otra parte, un mayor conocimiento de las
formación de carbohidratos, lípidos y proteínas propiedades biológicas de muchos metabolitos
que intervienen en estos procesos o son par- secundarios ha llevado a la revalorización de
te estructural de las plantas. En consecuencia estos compuestos como fuente de nuevas dro-
los aminoácidos destinados a la formación de gas y compuestos de utilidad para las indus-
proteínas, los carbohidratos y los ácidos gra- trias farmacéutica (antibióticos, anticanceríge-
sos que intervienen en estos procesos son de-
nos), agropecuaria (insecticidas, herbicidas),
nominados metabolitos primarios. En contra-
alimenticia (pigmentos, saborizantes, conser-
posición a este concepto podemos definir los
vantes) y cosmética (esencias colorantes), en-
metabolitos secundarios como todos aquellos
tre otras.
compuestos que no son esenciales per se para
las funciones vitales de las plantas, pero que
Ingeniería genética del metabolismo
juegan un rol importante para su supervivencia
secundario en plantas.
en los ecosistemas. La principal función de los
La ingeniería metabólica se puede definir
metabolitos secundarios es actuar como me-
diadores en las interacciones entre las plantas como el redireccionamiento de una o más re-
y su medio ambiente. Muchos de estos com- acciones enzimáticas en una vía biosintética
puestos cumplen funciones de defensa contra para producir nuevos compuestos, aumentar
predadores y patógenos, actúan como agentes la producción de compuestos preexistentes, o
alelopáticos (compuestos que son liberados disminuir la producción de compuestos no de-
para ejercer efectos sobre otras plantas), o sir- seados. Se trata de un campo de aplicación re-
ven para atraer a los polinizadores o a los dis- lativamente nuevo que es muy dependiente del
persores de las semillas. Se caracterizan por conocimiento bioquímico y fisiológico. Debido
ser especie-específicos, es decir que su pro- al uso de trazadores radioactivos, ya hacia
ducción está limitada a una especie o a un gru- 1975 se disponía de nociones generales ade-
po de especies dentro de un grupo filogenético, cuadas sobre la relación producto-sustrato en
y suelen producirse en estructuras especializa- muchas vías metabólicas. El desarrollo rápido
das y de forma tejido específica. de este campo ocurrió a partir de la disponi-
Los metabolitos primarios y secundarios no bilidad de herramientas de biología molecular,
se diferencian por su estructura química o su como el clonado de genes, el uso de promoto-
origen biosintético, sino sólo por diferencias res y las técnicas de transformación, las cuales

Figura 1. Vías generales del metabolismo secundario de las plantas. Se presentan las tres
principales vías biosintéticas de los metabolitos secundarios: terpenos, compuestos fenólicos o
fenilpropanoides y productos nitrogenados o alcaloides.
permitieron explorar los mecanismos molecu- cadamente procesos esenciales para la planta.
lares que regulan la producción de metabolitos Sin embargo, para lograr esto de una manera
secundarios. De esta forma, a partir de la déca- relativamente controlada, no basta con cono-
da de los 80, se logró un progreso significativo cer los componentes (enzimas y metabolitos)
en la disección de muchas vías biosintéticas y que participan de una determinada vía meta-
en la sobreexpresión de genes heterólogos, lo bólica. También se debe conocer la regulación
que permitió los primeros avances. Desde ende esta vía (pasos limitantes, mecanismos de
tonces se han logrado numerosos resultados retroalimentación) y su relación con otras vías
exitosos y un número aún mayor de resultados biosintéticas (vías competitivas). También es
no esperados. El conocimiento ganado ha con- importante conocer la compartimentalización
ducido a concebir el funcionamiento del meta- celular de la ruta en estudio y la participación
bolismo como el de una gran red de reacciones de tejidos o de órganos especializados en la
químicas interrelacionadas, en que la modifica- producción de determinados metabolitos.
ción de un sólo componente puede producir
un impacto considerable en el metabolismo Manipulación genética del metabolismo
de todo el organismo. Aún así, el metabolis- secundario por sobreexpresión o
mo secundario es un blanco particularmente inhibición de la producción de enzimas
atractivo para mejorar el rendimiento de un La manipulación genética del metabolismo
producto determinado sin que ello afecte mar- secundario tiene como objetivo el aumento o

disminución de la producción de un compues- vías metabólicas, la sobreexpresión de genes
to que se encuentra normalmente presente en estructurales sólo ha permitido obtener aumen-
una planta, o bien la producción de un nuevo tos del flujo metabólico de moderados a muy
compuesto que no es naturalmente producido pequeños. Conocer los factores de transcrip-
por la misma. ción que regulan una determinada vía metabó-
Para aumentar la producción de un com- lica nos permite inducir la expresión de toda la
puesto es necesario aumentar su biosíntesis o vía metabólica en su conjunto por sobreexpre-
disminuir su catabolismo. El aumento de la bio- sión del o los genes que codifican dichos fac-
síntesis puede realizarse por sobreproducción tores. Esta estrategia ha permitido obtener au-
de las enzimas implicadas en la vía biosintética mentos del flujo metabólico significativamente
o bien por inhibición de una vía competitiva que mayores que los obtenidos por sobreexpresión
aumenta indirectamente la síntesis del com- o inhibición de genes estructurales. Este efec-
puesto por redireccionamiento de metabolitos. to se debe a que los factores de transcripción
La disminución del catabolismo se logra por al controlar en forma simultánea la expresión
disminución de la producción de enzimas que de la mayoría de los genes comprendidos en
utilizan el compuesto deseado para la obten- una vía determinada, permiten eludir las res-
ción de otros compuestos. tricciones generadas por la existencia de pa-
Para disminuir la producción de un compues- sos limitantes. Además, la modulación del flujo
to no deseado se debe aumentar su catabolis- metabólico utilizando factores de transcripción
mo o disminuir su biosíntesis. Esto se puede no requiere de la identificación, aislamiento y
lograr por sobreproducción de enzimas de la caracterización molecular de los genes que
vía catabólica o por inhibición de la producción componen la vía en cuestión. Sin embargo, la
de enzimas de la vía biosintética.
modificación del metabolismo a través de la ex-
El conocimiento de los genes involucrados
presión de factores de transcripción no es una
en una vía metabólica permite aumentar las
panacea para resolver todos los problemas de
actividades de dichas enzimas por sobreexpre-
la ingeniería metabólica de plantas. Como es
sión de sus respectivos genes a partir de pro-
obvio, los factores de transcripción no pueden
motores inducibles o constitutivos. Por otra par-
inducir vías metabólicas que no están presen-
te, la utilización de técnicas de ARN antisentido
tes en la planta, por lo que, en estos casos, es
y, más recientemente, de ARN de interferencia
necesario introducir todos los genes necesa-
(ARNi), nos permite disminuir específicamente
la expresión de determinadas enzimas a través rios para recrear las mismas en las plantas de
del silenciamiento postranscripcional de los ge- interés. Por esta razón, la ingeniería genética
nes que las codifican. de genes estructurales continuará aún siendo
necesaria para resolver muchos problemas de
Uso de los factores de transcripción la ingeniería metabólica.
en la manipulación del metabolismo Entre los primeros factores de transcrip-
secundario. ción descriptos en plantas se encuentran los
Se acepta actualmente que el control del flujo factores R y C1, involucrados en el control de
metabólico a través de una vía biosintética se la biosíntesis de antocianinas de la aleurona
encuentra en más de un paso de esta vía. Estos de maíz. La inducción de la vía de la síntesis
“puntos” de control (pasos limitantes) pueden de antocianinas en células indiferenciadas de
ser modificados por condiciones ambientales, maíz pudo inducirse por sobreexpresión de es-
metabólicas o del desarrollo y son, en última tos dos factores de transcripción. Asimismo, la
instancia, responsables de la productividad de sobreexpresión de estos factores en arroz pro-
la planta. La distribución del control regulatorio dujo la activación de la vía de síntesis de las
hace que la modificación del metabolismo por antocianinas, lo que se tradujo en un aumento
sobreexpresión o inhibición de unos pocos ge- de la resistencia del arroz a la infección por un
nes estructurales sea difícil de alcanzar. patógeno fúngico. Este ejemplo muestra que la
A pesar de los esfuerzos realizados para acumulación de un producto natural puede mo-
identificar los pasos limitantes de diferentes dificarse por la sobreexpresión de zterpenos.

Monoterpenos: los aceites esenciales con- en un remedio casero (té hecho con hojas de
tienen monoterpenos volátiles que son almace- la planta guante de zorro púrpura) y se usaba
nados en los pelos glandulares de la epidermis. para tratar la angina de pecho.
Estos aceites esenciales se obtienen de flores, Tetraterpenos: Entre los tetraterpenos se
de frutos, de hierbas y especias y son usados encuentran los carotenoides, compuestos que
en perfumes y saborizantes. Algunas de las son de gran importancia como suplementos
plantas más utilizadas para la obtención de dietarios. Los carotenoides son sintetizados
este tipo de compuestos son: la menta (men- de novo a partir de geranil-geranil difosfato por
tol) y el limón (limoneno). Algunas plantas emi- todos los organismos fotosintéticos. Participan
ten terpenos volátiles después que los insectos en la captación de la luz y en la protección por
se han alimentado de ellas. Estos atraen a los el exceso de luz blanca. Muchas bacterias
enemigos naturales del insecto predador y ac- no fotosintéticas (Erwinia herbicola, Thermus
túan como un mecanismo de defensa contra el aquaticus, Deinococcus radiodurans) y hon-
mismo. gos (Neurospora crassa, Phycomyces blakes-
Sesquiterpenos: los aceites esenciales de leeanus) sintetizan también carotenoides. En
hierbas y especias también contienen sesqui- las plantas, los carotenoides se acumulan en
terpenos. Algunos sesquiterpenos actúan en cloroplastos y en cromoplastos. Se puede en-
los mecanismos de defensa de la planta pro- contrar un amplio rango de carotenoides en los
duciendo fitolaexinas como la rosina y otras cromoplastos (por ejemplo, licopeno en fruto
sustancias repelentes de herbívoros. de tomate, β-caroteno en raíces de zanahoria,
Diterpenos: Las resinas contienen diterpe- luteína y zeaxantina en endosperma de maíz).
nos. Cuando los canales que transportan la La investigación, el desarrollo y el uso de
resina son dañados, la descarga de la resi- productos naturales como agentes terapéu-
na sirve como una barrera química y física a ticos y nutricionales, especialmente aquellos
la alimentación de los insectos. Por otro lado, derivados de plantas, ha crecido mucho a lo
los diterpenos se polimerizan cuando la re- largo de estos años. Uno de los desarrollos
sina es expuesta al aire y contribuye a sellar con mayor éxito y publicidad fue la obtención
las heridas. Ciertos escarabajos de la corte- del arroz transgénico rico en β-carotenos. La
za han adquirido la capacidad de metabolizar vitamina A es un nutriente esencial cuya caren-
los monoterpenos contenidos en la resina de cia en humanos puede afectar severamente la
las coníferas, convirtiéndose en depredado- visión, la reproducción y la función inmune. Se
res especializados. Algunos diterpenos son estima que en el mundo existen 124 millones
muy importantes en aplicaciones medicinales de niños deficientes en vitamina A y que una
ya que poseen propiedades antiinflamatorias, provisión adecuada podría evitar de 1 a 2 mi-
antimicrobianas y antiespasmódicas. Una de llones de muertes anuales. El arroz es uno de
las drogas más potentes contra ciertos tipos los principales alimentos para millones de per-
de cáncer es un diterpeno, el paclitaxel (Taxol), sonas. La parte comestible del arroz consiste
obtenido originalmente de la corteza del tejo básicamente en el endosperma, compuesto
del Pacífico (Taxus brevifolia). por gránulos de almidón y cuerpos proteicos,
Triterpenos: El algodoncillo de Siria (Ascle- pero carece de los nutrientes esenciales para
pias syriaca) contiene triterpenos que se acu- el mantenimiento de la salud, como es la pro-
mulan en las larvas de las mariposas Monarca, vitamina A (β-caroteno). El hecho que el arroz
un lepidóptero que se alimenta de esta planta. sea la principal fuente de alimentos de muchas
En los adultos, los triterpenos son almacena- poblaciones contribuye al problema de la defi-
dos en las alas de la mariposa y ello las vuelve ciencia en vitamina A, convirtiéndose en un se-
tóxicas para sus depredadores, los pájaros. El rio problema de salud pública. El arroz produce
triterpeno digitalis, obtenido de la dedalera o di- geranil-geranil difosfato, precursor de los caro-
gital (Digitalis purpurea), fortalece y enlentece tenos, pero carece de las enzimas correspon-
el músculo cardíaco. Fue desarrollado como dientes a esta ruta biosintética. Para completar
droga hacia el final del siglo XVIII basándose la vía de síntesis del β-caroteno es necesario

introducir por ingeniería genética 4 enzimas: CaMV. Los granos de arroz obtenidos a par-
la fitoeno sintetasa, la fitoeno desaturasa, la tir de las plantas transgénicas eran de color
caroteno desaturasa y la licopeno ciclasa. Al- amarillo debido a la producción de β-caroteno,
ternativamente, para simplificar el trabajo de esta característica fenotípica fue la que inspiró
transformación, el número de enzimas puede el nombre de esta líneas transgénicas como
ser reducido utilizando una fitoeno desaturasa "Arroz dorado" o en inglés "Golden rice".
bacteriana que es capaz de reemplazar a las
dos desaturasas vegetales (Figura 2). La in- Ingeniería metabólica de la síntesis
troducción de la vía de síntesis de β-caroteno de flavonoides.
en arroz se efectuó por transformación con Los flavonoides pertenecen a una de las
Agrobacterium tumefaciens portando vectores principales clases de metabolitos secundarios.
que contenían los siguientes genes: a) gen de Se caracterizan por ser compuestos polifenó-
fitoeno sintetasa (psy) de Narcissus pseudo- licos de estructura aromática presentes en to-
narcissus bajo el control del promotor glutelina dos los tejidos vegetales. Son una familia muy
específico de endosperma (Gt1); b) gen de la diversa de compuestos que se caracterizan
fitoeno desaturasa (crtl) de Erwinia uredovora por ser sintetizados a partir de una molécula
conteniendo la secuencia para el péptido de de fenilalanina y 3 de malonil-CoA (Figura 3).
tránsito de la subunidad menor de la Rubisco Esta estructura puede sufrir modificaciones y
de arveja bajo el control del promotor 35S del adiciones de grupos funcionales (glicosilacio-
Cauliflower mosaic virus (CaMV); c) gen de la nes, metilaciones o acetilaciones) generando
licopeno ciclasa (lcy) de Narcissus pseudonar- una gran diversidad de flavonoides. Hasta el
cissus conteniendo la secuencia para un pép- presente, han sido identificados más de 5.000
tido de tránsito que permite la importación a flavonoides diferentes. Estos se clasifican se-
plástidos bajo el control del promotor 35S de gún su estructura base en 5 grupos: chalconas,
flavononas, flavonoles, dihidro-
flavonoides y antocianinas.
Esta clase de metabolitos
secundarios se encuentran
presentes en casi todas las
familias de plantas, principal-
mente en la epidermis de ho-
jas, tallos, raíces, flores, semi-
llas y frutos. Por su condición
de polifenoles, los flavonoides
actúan como antioxidantes pro-
tegiendo a las plantas contra la
radiación UV (como por ejem-
plo los flavonoles kemferol y
quercetina). Por otro lado, pre-
sentan un rol fundamental en
la defensa de la planta frente
a depredadores (fitoalexinas) y
sobre el desarrollo y crecimien-
to de otra planta vecina frente a
estreses ambientales (alelopa-
tía). También, se encuentran in-
Figura 2. Manipulación del metabolismo de los terpenoides volucrados en los procesos de
en plantas de arroz. Arroz dorado. Se presenta la vía de sín- floración, polinización (a través
tesis del geranil-geranil difosfato en arroz y la obtención de ca-
del color u olor que le dan las
rotenos por sobreexpresión en arroz de las enzimas heterólogas
fitoeno sintetasa, fitoeno desaturasa y licopeno sintetasa. antocianinas a las flores) y en

Figura 3. Vías de síntesis de los flavonoides. Los flavonoides se clasifican según su estructura central
aglicona en 5 grupos: chalconas, flavononas, flavonoides, dihidroflavonoides y antocianinas.
la simbiosis vegetal (por inducción de la nodu- rales convencionales. En Petunia hybrida, una
lación de bacterias fijadoras del nitrógeno). de las plantas en que la vía de síntesis de an-
Este tipo de polifenoles son importantes eco- tocianinas ha sido más extensamente estudia-
nómicamente porque contribuyen al sabor, aro- da, se producen derivados de delfinidinas y de
ma y color de los alimentos y bebidas. Además cianidinas pero no derivados de pelargonidina.
en los últimos años han adquirido una gran im- Esto se debe a la especificidad de la enzima
portancia en la salud humana debido a estudios dihidroflavonol 4-reductasa de petunia, la cual
que sugieren que estos compuestos presentan no puede reducir al precursor de pelargonidina,
un efecto protector frente a ciertas enferme- el dihidrokemferol, en kemferol. Sin embargo,
dades y pueden actuar como antialergénicos. hace casi dos décadas se obtuvo una variedad
Debido a las propiedades benéficas para la sa- de petunias anaranjadas que representa el pri-
lud humana y a su importancia económica, las mer producto exitoso de modificación del color
vías biosintéticas de los flavonoides han sido de las flores por ingeniería genética. Esto se
extensamente estudiadas. Esto ha permitido el logró transformando una variedad de petunia
desarrollo de la ingeniería metabólica aplicada blanca con el gen de la dihidroflavonol 4-re-
al mejoramiento nutricional de ciertos cultivos ductasa (dfr) de maíz. La variedad de petunia
como también a la producción de flores de cor- blanca (mutante RLo1) acumula dihidrokemfe-
te. Una de las primeras aplicaciones de la in- rol debido a que los genes f3’h (3´flavonoide
geniería metabólica fue la manipulación de la hidroxilasa) y f3’5’ (3´-5´flavonoide hidroxilasa)
vía de síntesis de flavonoides y antocianinas se hallan afectados por mutaciones; en conse-
para cambiar el color de las flores. Esto se de- cuencia, produce flores que no muestran pig-
bió principalmente a que era una de las vías mentación. La transformación de esta variedad
más conocidas y los resultados eran fácilmen- con el gen de maíz condujo a la producción
te observables. Es inusual encontrar la gama y acumulación de pelargonidina, obteniéndo-
completa de colores dentro de las especies flo- se flores de petunia color anaranjado (Figura

4). Muchos de estos transformantes sufrieron de rosas azules. Con este fin clonaron y sobre-
inestabilidad epigenética (expresión inesta- expresaron en rosas dos enzimas de petunia
ble debido a la metilación del promotor), no encargadas de sintetizar el pigmento azul del-
pudiéndose obtener cultivares uniformemen- finidina, sin embargo los resultados que obtu-
te coloreados, lo cual impidió su comerciali- vieron no fueron los esperados. A pesar de ob-
zación. Sin embargo, los investigadores de la tener líneas transgénicas estables para dichas
empresa Novartis lograron obtener petunias enzimas, las rosas no presentaban coloración
anaranjadas uniformemente coloreadas por in- azul debido a la influencia del pH vacuolar en la
trogresión del gen dfr en plantas de petunia. coloración de los pigmentos. Cuando aplicaron
Otro ejemplo exitoso es el desarrollo de clave- la misma estrategia para la transformación de
les violetas por la empresa australiana Florige- claveles los resultados fueron sustancialmente
ne. En los años 90 los investigadores de esta diferentes, lograron desarrollar exitosamente
compañía tenían como proyecto la obtención seis líneas de claveles transgénicos que van
desde el color lila hasta el violeta. Los clave-
les modificados genéticamente se encuentran
actualmente disponibles en muchas partes del
mundo. Estos claveles transgénicos han sido
sometidos a un riguroso escrutinio regulatorio
y, en principio, no presentan mayores riesgos
para el ambiente que los obtenidos por méto-
dos convencionales debido a que la mayoría
de estos claveles son infértiles y a que la dis-
persión de semillas se ve limitada ya que las
flores son removidas de la planta cuando están
aún cerradas.
Una cantidad creciente de evidencias sugie-
re que los flavonoides son potentes antioxidan-
tes y que un aumento en su consumo diario
podría reducir el riesgo de enfermedades car-
diovasculares y prevenir ciertos tipos de cán-
cer. Por esta razón, existe gran interés en la
obtención de cultivos comestibles que produz-
can altos niveles de flavonoides. Uno de los
principales candidatos para desarrollar este
tipo de tecnología es el tomate. El tomate pro-
duce en su piel pequeñas cantidades de flavo-
noides, lo cual nos confirma la existencia de la
vía de síntesis de flavonoides en esta planta
y la potencialidad de aumentar sus niveles de
producción. A partir de la manipulación genéti-
ca de la expresión de factores de transcripción
se logró obtener líneas de tomate transgénicos
capaces de producir niveles cinco veces mayo-
res de flavonoles que la variedad salvaje. Los
Figura 4. Manipulación del metabolismo de las factores de transcripción que regulan la sínte-
antocianinas en Petunia hybrida. La expresión
sis de flavonoles en diversas plantas forman
del gen dfr de maíz en una línea de petunia que
acumula dihidrokemferol debido a dos mutaciones
parte de dos familias principales: la familia C1,
en los genes f3’h y f3’5’ induce la síntesis del pig- tipo MYB y la familia R, tipo MYC. Los auto-
mento pelargonidina (pelargonidina-3-glucósido), res sobreexpresaron en tomate los factores
de color ladrillo. Las petunias blancas no sintetizan de transcripción C1 y L1 de maíz. Y en forma

simultánea, transformaron plantas de tomates Los alcaloides producidos por las plantas
con pares de construcciones diferentes: a) gen constituyen uno de los grupos de productos
C1 bajo la regulación del promotor constitutivo naturales que provee mayor cantidad de com-
35S de CaMV y el gen L1 bajo la regulación del puestos farmacológicamente activos. En la
promotor específico de fruto E8 (35SC1/E8L1); actualidad diversos tipos de alcaloides son uti-
b) genes C1 y L1 bajo la regulación del promo- lizados tanto en la medicina tradicional como
tor específico de fruto E8 (E8C1/E8L1). Dado en la homeopatía. Generalmente actúan sobre
que los factores C1 y L1 actúan en forma co- el sistema nervioso central a nivel del sistema
ordinada se asumió que ambas estrategias, la nervioso parasimpático y simpático. En medi-
sobreexpresión individual y combinada de los cina, son utilizados para el tratamiento de en-
factores de transcripción, conducirían al incre- fermedades mentales como así también para
mento específico de flavonoles en el fruto. La calmar el dolor, ya que muchos de estos meta-
cantidad y tipo de flavonoles fue determinada bolitos son compuestos psicoactivos: morfina
por HPLC (cromatografía líquida de alto ren- (Papaver somniferum), atropina (Atropa bella-
dimiento, del inglés High Performance Liquid donna), colchicina, entre otros. Existen otros
Chromatography) a partir de pulpa de tomates tipos de alcaloides que son también farmaca-
controles y transgénicos. En este trabajo se lógicamente importantes debido a su uso en el
demuestra que sólo hubo producción de flavo- tratamiento de tumores. Se trata de la vinblasti-
noles en las plantas que expresaban los dos na, vincristina y la camptotecina. Otro alcaloide
factores, lo que comprueba que ambos son re- de extrema relevancia en medicina es la quini-
queridos para activar completamente esta vía. na (Cinchona officinalis), droga principal en el
Además, se observó un aumento de la activi- tratamiento de la malaria.
dad antioxidante de los tomates transgénicos La ingeniería genética aplicada a la manipu-
35SC1/E8L1 debido a la acumulación de los lación de la biosíntesis de estos compuestos
flavonoles kemferol y naringenina. ha generado varios éxitos durante los últimos
años. Uno de los casos más interesantes es el
Ingeniería metabólica de la síntesis de desarrollo de plantas de café transgénicas (Co-
alcaloides ffea canephora) con bajo contenido de cafeí-
Los alcaloides son el grupo de metaboli-
na. Existe una creciente demanda de café libre
tos secundarios más representativo, numero-
de cafeína debido a los efectos adversos que
so y diverso en la naturaleza. Debido a esto
este compuesto produce en personas sensi-
son muy difíciles de definir en forma general y
bles. El café descafeinado que consumimos en
precisa. Sin embargo, el carácter común que
la actualidad se obtiene mediante un proceso
presentan, es que en su estructura poseen un
industrial costoso y que da como resultado un
anillo heterocíclico con uno o más átomos de
café con menos sabor. La biosíntesis de cafeí-
nitrógeno. Son sintetizados a partir de aminoá-
na en plantas de café involucra tres enzimas:
cidos o de sus derivados inmediatos y se clasi-
CaXMT1, CaMXMT1 (ambas teobromina sin-
fican según su esqueleto carbonado. Hasta el
tetasas) y CaDXMT1 (cafeína sintetasa), que
momento se ha estimado que las plantas son
capaces de producir 12.000 especies de alca- agregan grupos metilos a la xantosina en forma
loides diferentes. sucesiva para producir cafeína. La obtención
La importancia de los alcaloides dentro de de plantas de café con menor contenido de
las plantas radica en que constituyen un reser- cafeína fue lograda por inhibición de la expre-
vorio de nitrógeno para la misma. Por otro lado, sión de la enzima CaMXMT1. La expresión de
al igual que algunos flavonoides, actúan como la enzima fue inhibida por sobreexpresión de
sustancias alelopáticas en la defensa frente a ARNs de interferencia (ARNi) dirigidos contra
otras especies vegetales, como así también, la región 3´ no codificante del gen CaMXMT1.
frente al ataque de ciertos patógenos o depre- Las bacterias de A. tumefaciens conteniendo
dadores. También actúan protegiendo a las los vectores con las construcciones de ARNi,
plantas del efecto de las radiaciones ultravio- fueron usadas para transformar plantas de Co-
letas. ffea canephora. En las líneas transformadas se

analizaron los niveles de expresión de las tres origen o en otras especies. En algunos casos,
enzimas por RT-PCR (transcripción reversa - la sobreexpresión resultó en un aumento de la
reacción en cadena de la polimerasa). El resul- acumulación de los compuestos deseados. Sin
tado indicó no sólo la supresión de CaMXMT1 embargo, en otros resultó sólo en el aumen-
sino también de las otras dos enzimas. Esto se to de la enzima codificada por el propio gen o,
debió a la elevada homología entre las secuen- peor aún, en la producción de compuestos no
cias codificantes de las enzimas. La reducción deseados. Estos resultados evidencian la com-
en los niveles de ARNm de CaXMT1, Ca- plejidad de las redes metabólicas y la limitada
MXMT1 y CaDXMT1 sugería una disminución capacidad existente para predecir las conse-
en la actividad de las enzimas. Esto fue con- cuencias de sobreexpresar determinados ge-
firmado directamente midiendo las cantidades nes estructurales. Esta situación prevalecerá
de sus productos, teobromina y cafeína, por aún por cierto tiempo, en tanto y en cuanto
HPLC. Las hojas jóvenes de las líneas trans- no se cuente con mayor información sobre la
formadas presentaron una reducción del 30 composición de las vías metabólicas que se
- 80% en el contenido de teobromina y un 50 desean modificar. En este sentido, la utilización
- 70% en el contenido de cafeína. Los autores de factores de transcripción para activar vías
también han logrado plantas descafeinadas de metabólicas completas parece ser actualmente
Coffea arabica, especie de la que se produce una estrategia prometedora. En los próximos
el 70% del café comercializado mundialmente, años, el principal desafío será obtener mayor
utilizando la misma técnica. información acerca de la regulación metabólica
Otro ejemplo de ingeniería metabólica en al- a todos los niveles: genético, enzimático, de la
caloides es la obtención de plantas transgéni- compartimentalización, del transporte y de la
cas de Papaver somniferum con altos niveles
acumulación. Dado que los metabolitos secun-
de morfina, codeína y tebaína. Estos compues-
darios son especie-específicos, la información
tos son muy importantes en la industria farma-
genética obtenida de Arabidopsis thaliana será
céutica debido a sus propiedades analgésicas.
de utilidad limitada, por lo que la secuencia-
La eficiencia de extracción a partir de frutos y
ción de otras especies de interés será de gran
tallos secos de este tipo de alcaloides depende
valor en este campo. A su vez, será necesario
de su nivel de acumulación en la planta. Es por
integrar los datos obtenidos de los estudios ge-
eso que el aumento de los niveles de estas sus-
nómicos con los de los estudios proteómicos
tancias traería como consecuencia un benefi-
cio económico debido al menor uso de tierras, y metabolómicos, lo que permitirá generar un
la disminución costos de extracción, almace- panorama más completo del conjunto de las
namiento y transporte. Una de las estrategias interacciones regulatorias. Cuando el objetivo
utilizadas para aumentar la concentración de de la modificación del metabolismo secundario
estos alcaloides fue la de sobreexpresar el gen sea mejorar la calidad nutricional de un cultivo
que codifica la enzima salutaridinol 7-O-acetil- comestible, será necesario considerar el riesgo
transferasa (SalAT), involucrada en la vía de de que la modificación realizada conduzca a la
síntesis de la morfina y sus derivados. La so- producción de compuestos tóxicos no desea-
breexpresión de esta enzima en la mayoría de dos. Para poder disminuir este riesgo, se re-
las líneas transgénicas resultó en un aumento quiere conocer con la mayor precisión posible
en las concentraciones de morfina, codeína y el perfil de los metabolitos que produce la plan-
tebaína en los frutos. La línea transgénica con ta, lo que es corrientemente conocido como
mayor contenido de estos compuestos aumen- su “metaboloma”. Sin embargo, no existen en
tó en un 42% su contenido total de este tipo de la actualidad métodos que nos permitan obte-
alcaloides. ner este perfil en forma completa. En muchos
casos, los métodos cromatográficos, como la
Perspectivas de la manipulación cromatografía gaseosa y la cromatografía lí-
genética del metabolismo secundario. quida de alta resolución, separan pobremen-
En los últimos años, se han sobreexpresado te componentes con propiedades físicas muy
numerosos genes, ya sea en sus plantas de distintas. La espectrometría HNMR (del inglés

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectros- Lectura recomendada
copy, espectroscopía de resonancia magnéti-
ca nuclear de 1H), que detecta todos los com- -Gantek P. Memelink J. 2002. Transcription
puestos presentes con la misma sensibilidad, factors: tools to engineer the production of
no puede registrar compuestos minoritarios. pharmacologically active plant metabolites.
De esta manera, para el análisis del metabo- Trends Pharmacology Science, 23, 563-9.
loma se deberán utilizar simultáneamente dife- -Petersen. 2007. Current status of metabolic
phytochemistry. Phytochemistry, 68, 2847-2860.
rentes métodos y, a su vez, mejorar las técni-
-Verpoorte R. and MemelinK J. 2002. Engineering
cas actuales. secondary metabolite production in plants,
A pesar del limitado conocimiento actual de Current Opinion in Biotechnology, 13, 181-187.
las vías metabólicas, se han obtenido ya resul-
tados muy interesantes, lo que demuestra el
gran potencial de la ingeniería genética en la
modificación del metabolismo secundario. Esta
capacidad se traducirá en el futuro en nume-
rosas aplicaciones en campos tales como mo-
lecular farming (producción de moléculas de
interés en organismos genéticamente modifi-
cados), fortalecimiento nutricional y resistencia
a patógenos.

V. Capítulo 14 importantes en la industria alimentaria. Hoy es
posible contar con cepas recombinantes resis-
tentes a la infección viral.
Mejoras de calidad en alimentos En cuanto al mejoramiento animal, el uso de
marcadores moleculares es actualmente posi-
Clara Rubinstein y Gabriela Levitus ble como herramienta gracias a los avances en
la genómica animal. El uso de tecnologías re-
Entre las aplicaciones biotecnológicas de la combinantes para este fin puede ejemplificarse
ingeniería genética para el mejoramiento de en el desarrollo del salmón “AquaAdvantage”
variedades alimentarias se encuentran ejem- (de la empresa Aqua Bounty Farms), que tiene
plos variados que incluyen la biofortificación de la capacidad de crecer hasta el tamaño para
cultivos con mayores cantidades de nutrientes la comercialización (entre 2,5 y 4,5 kg) en un
específicos, el desarrollo de variedades con año y medio, mientras que las prácticas de cría
perfiles composicionales más saludables o se- convencionales requieren dos a tres años para
guros, y el desarrollo de alimentos funcionales, lograr el mismo fin. Estos nuevos salmones
con determinada actividad benéfica sobre la podrían también contribuir a una práctica de
salud. acuicultura más sustentable, colaborando con
Asimismo, existen numerosos desarrollos la reducción de la sobrepesca de ejemplares
que apuntan a mejorar características organo- salvajes y bajando los costos para los consu-
lépticas u otras que resulten importantes desde midores.
el punto de vista de la tecnología de alimentos Los especialistas en genética animal tam-
o su comercialización. En este capítulo se re- bién están usando biotecnología para obtener
visarán brevemente algunas de estas aplica- carnes más saludables, como por ejemplo, car-
ciones, así como los criterios utilizados en la nes vacunas y porcinas con mejores perfiles
evaluación de la inocuidad y aptitud nutricional de ácidos grasos.
para este tipo de mejoras. Finalmente, las técnicas de clonación y
Si bien el foco de este trabajo es el mejo- otras, como la bio-nanotecnología, también
aportarán soluciones a los mejoradores y a los
ramiento vegetal, es importante notar que los
tecnólogos alimentarios en el corto y mediano
desarrollos biotecnológicos abarcan a otros
plazo.
organismos igualmente importantes desde el
En cuanto a las aplicaciones de la ingenie-
punto de vista alimentario, ya sea como ma-
ría genética para el mejoramiento de especies
terias primas o porque son fuente de adyuvan-
vegetales alimentarias, son muy diversos los
tes, suplementos, aditivos o preservantes. En proyectos que se están desarrollando. La bio-
efecto, numerosos microorganismos, así como tecnología puede ayudar a aumentar el valor
especies animales, pueden ser mejorados uti- nutritivo y la seguridad de muchos cultivos, en
lizando herramientas biotecnológicas. Estas particular, aquellos que son la base de la dieta
pueden incluir a la ingeniería genética, aunque en muchos países en desarrollo.
es de práctica común mejorar los microorga-
nismos utilizados en los procesos fermenta- Biofortificación
tivos mediante genética clásica, en particular Las deficiencias nutricionales de las dietas
por motivos económicos, dados los costos de afectan seriamente el desarrollo físico y mental
aprobación regulatoria de un organismo trans- con graves consecuencias para el rendimiento
génico y también por un tema de aceptación educativo, laboral, y por lo tanto, limitando o re-
en ciertos mercados. Un ejemplo de la apli- duciendo las oportunidades para aquellos que
cación de tecnología recombinante en este las sufren y sus potenciales contribuciones a
campo, es la mejora obtenida en cepas bac- la sociedad. La Organización Mundial para la
terianas utilizadas en la producción de lácteos Salud (OMS) ha reconocido que estas deficien-
fermentados (yogur, quesos, etc.). Estas cepas cias tienen graves efectos sobre la salud y la
son sensibles a la infección por fagos (virus calidad de vida de al menos dos mil millones
de bacterias), causando pérdidas económicas de personas.

Una nutrición inadecuada también contribu- La transformación genética mediante tecno-
ye a una mortalidad infantil aumentada a causa logías de ADN recombinante es uno de los ins-
de enfermedades infecciosas, algunas de las trumentos que pueden usarse para biofortificar
cuales no serían fatales para niños bien ali- las materias primas alimenticias, ya que permi-
mentados. te al animal o a la planta producir el nutriente
Las deficiencias en micronutrientes, como adicional, como por ejemplo, beta caroteno en
hierro, vitamina A, yodo, zinc y ácido fólico, el arroz. Otro ejemplo de estas iniciativas es el
afectan especialmente a niños y mujeres en desarrollo llevado adelante por científicos de la
edad reproductiva, resultando en una morbili- Universidad de Nehru en la India, que utilizaron
dad y mortalidad importantes. En este sentido, un gen identificado en el amaranto sudameri-
es obvio que la resolución de estos problemas cano para aumentar el contenido de proteínas
en el largo plazo y a gran escala se alcanzará de la papa en un 30% y también el nivel de
únicamente cuando sea posible acceder a una aminoácidos esenciales, normalmente no pre-
dieta variada, balanceada y abundante. sentes en las variedades convencionales.
Algunos nutrientes clave suelen añadirse
directamente a los alimentos en el momento El caso del arroz dorado:
de la elaboración, aunque es posible también Cerca del 70% de la población mundial basa
enriquecerlos indirectamente, es decir, a través su dieta en cereales. El arroz es el cereal más
del mejoramiento vegetal. Esto es lo que se de- importante para la nutrición humana y provee
nomina biofortificación, término definido por el el 30% de la ingesta de energía de la pobla-
CODEX en 2007 como: “la adición indirecta de ción asiática. El maíz está en tercer lugar des-
nutrientes esenciales u otras sustancias a los pués del trigo como uno de los tres cultivos
alimentos con el fin de lograr una mejora de la más importantes. Si bien el grano de maíz es
nutrición o de la salud”. usado fundamentalmente para alimentación
Es interesante resaltar que la reunión de animal en los países desarrollados, es la base
Consenso de Copenhagen de 2008, en la que dietaria en muchos países de América Latina
se reunieron economistas de todo el mundo y África. Otros cultivos, como la batata o papa
para ponderar los desafíos globales y esta- dulce, son cultivos secundarios también impor-
blecer soluciones prioritarias, concluyó que la tantes para países de Europa del Este y África,
biofortificación es una de las posibilidades más y en particular, para los agricultores de sub-
aplicables a la solución de las deficiencias nu- sistencia. La mayor parte de los cultivos, y por
tricionales respecto de otras estrategias, con- lo tanto los alimentos derivados de ellos, son
siderando que con 75 millones de dólares es deficientes en uno o más nutrientes esenciales
posible cubrir: (aquellos que deben ser incorporados a través
de la dieta). Por esto, la dieta de mucha gen-
• La suplementación con vitamina A para te que depende de estos cultivos en países en
un año, para 37,5 millones de chicos en desarrollo resulta deficiente y es poco diversa,
edad pre-escolar en Bangladesh, India y lo que aumenta los riesgos de deficiencias nu-
Pakistán. tricionales.
• La fortificación con hierro para un año, El arroz dorado (Golden Rice), denominado
para 375 millones de personas, aproxi- así por su color ámbar, es un ejemplo de este
madamente un 30% de la población de tipo de modificaciones y fue desarrollado para
Bangladesh, India, y Pakistán. expresar provitamina A (beta-caroteno) en al-
• El desarrollo y difusión de variedades tas cantidades, con la idea de contribuir a ali-
mejoradas (biofortificación por métodos viar las deficiencias en vitamina A en países del
convencionales o utilizando marcadores sudeste asiático y otros.
moleculares) de arroz y trigo ricas en hie- Actualmente, está en desarrollo el llamado
rro y zinc para el Sudeste Asiático, que “Golden Rice 2”, la segunda generación de
estarían disponibles año tras año a tra- este arroz, que expresa mayores cantidades
vés de la semilla. de beta-caroteno respecto de la primera ver-

sión (unas 20 veces más), y que permitiría que a retinol. Esta bio-conversión es variable, de
con 1/3 de taza (70 gramos) se provean 2/3 acuerdo a factores que dependen del tipo de
de la ingesta diaria recomendada de vitamina carotenoide, la matriz en la cual es incorpora-
A para niños en edad preescolar. do, el estado nutricional del consumidor, etc.
Para lograr esta modificación, se insertaron La biodisponibilidad del beta-caroteno ex-
dos genes: el gen psy de la fitoeno sintetasa presado en el Golden Rice 2 se ha evaluado,
de maíz y el gen crtl, codificante para la carote- y se estima que 70 gramos de arroz crudo po-
no desaturasa de la bacteria Erwinia uredovora drían proveer el 60% de la ingesta recomenda-
(Figura 1). da (en los EEUU) para lactantes de 1 a 2 años
de edad. La porción de arroz convencional pro-
medio para un niño de esa edad en Tailandia,
por ejemplo, es de 160 gramos.
La evaluación de inocuidad de este evento

sigue las recomendaciones del Codex Alimen-
tarius, utiliza al arroz convencional como com-
parador y examina riesgos y beneficios poten-
ciales. Las evidencias hasta el momento reco-
piladas para este evento, indican que:
Figura 1. Inserto presente en el Golden Rice 2
• La composición global del Golden
Rice 2, de acuerdo con las recomen-
Se utilizó la transformación mediada por daciones de la OECD (Organización
Agrobacterium tumefaciens para introducir la para la Cooperación y el Desarrollo
construcción en arroz (Oryza sativa). El sis- Económico), no se ha alterado, ex-
tema de selección utilizado fue el método de cepto en la vía metabólica modifica-
la fosfomanosa isomerasa de E. coli (PMI), un da, según lo esperado.
sistema alternativo al uso de genes de resisten- • El análisis bioinformático de la fi-
cia a antibióticos. Este sistema permite a los te- toenodesaturasa de Erwinia no
jidos vegetales en cultivo utilizar manosa como muestra relación con alérgenos, toxi-
fuente principal de carbono, no disponible para nas o anti-nutrientes.
las plantas porque carecen de la enzima PMI. • La fitoeno sintetasa de Zea mays es
La fitoeno sintetasa cataliza el paso limitante comúnmente consumida, es decir,
de la biosíntesis de carotenoides en plantas, tiene historia de uso seguro en ali-
resultando la del maíz la más eficiente desde mentación.
el punto de vista de la acumulación de caro- • El beta caroteno está biodisponible
tenoides totales y beta-caroteno en arroz. De
hecho, el Golden Rice 1 contiene cerca de
1,6 μg de carotenoides totales/gramo de peso
seco de grano, mientras que el Golden Rice 2
contiene hasta 37 μg/gramo de peso seco de
grano, de los cuales 31 μg/g es β-caroteno.
Ningún cultivar de arroz produce carotenoi-
des en el endosperma, si bien pueden producir
el precursor geranil-genaril difosfato. La fitoeno
sintetasa convierte este compuesto a fitoeno,
el precursor inmediato del beta-caroteno en
plantas. Figura 2: Comparación entre el arroz convencional
Para poder ser utilizada como vitamina A, el (izq), Golden Rice 1 (centro) y Golden Rice (der).
beta-caroteno debe ser absorbido y convertido (Tomado de Paine et al, 2006).

por ARN de interferencia han sido aplicadas a
la reducción de alérgenos en diferentes espe-
Alimentos más saludables o seguros cies, como la proteína P34 de soja, el alérgeno
de arroz de 14-16kda o las proteínas Lyc e1
Modificación en la composición de los Lyc e 3 de tomate.
aceites Asimismo, existen desarrollos que se enfo-
Ya existen en el mercado diferentes varieda- can en la eliminación de toxinas naturalmen-
des de oleaginosas que producen aceites con te presentes en algunos cultivos alimentarios,
perfiles de ácidos grasos más saludables, algu- como los glicoalcaloides de la papa o los com-
nas de ellas transgénicas. Las modificaciones puestos cianogénicos de la mandioca.
introducidas apuntan a obtener menor cantidad
de ácidos grasos saturados (los menos saluda- El caso del maní
bles), y enriquecer la composición de los acei- Utilizando la tecnología de ARN de interfe-
tes en ácidos grasos mono o poli-insaturados rencia es posible silenciar a los alérgenos más
potentes del maní. Un trabajo reciente mostró
(más deseables desde este punto de vista).
que es posible suprimir la expresión de Ara h
Estas modificaciones introducen pasos meta-
2 y Ara h 6 en forma específica utilizando esta
bólicos ausentes o bien silencian partes de una
tecnología.
vía metabólica, logrando derivar la síntesis a Se han identificado once proteínas alergé-
los productos deseados. nicas en el maní (denominadas Arah 1- 11).
Por ejemplo, se ha logrado la conversión Entre éstas, Ara h 2 y Ara h 6, se han recono-
de ácido linoleico en ácidos omega 3 simila- cido como los alérgenos más potentes. Entre
res a los encontrados en aceites de pescado, un 80 y un 90% de los pacientes alérgicos al
asociados con beneficios para la salud cardio- maní, presentan anticuerpos IgE específicos,
vascular. Del mismo modo, es posible evitar o anti-Arah 2 y 6 y el reconocimiento de estos
eliminar la hidrogenación industrial de los acei- alérgenos persiste por más de un año luego del
tes, que genera las indeseables grasas “trans”, desafío alimentario en niños. Los genes codi-
de conocidos efectos negativos sobre la salud. ficantes para estos polipéptidos fueron silen-
El proceso de hidrogenación es necesario para ciados en plantas transgénicas, y las pruebas
estabilizar los aceites o para conseguir grasas de unión a inmunoglobulina E confirmaron una
sólidas para diferentes aplicaciones alimenta- reducción en el binding a estas proteínas, se-
rias. Reducir el nivel de ácido linolénico o bien gún lo esperado, sugiriendo que estas técnicas
aumentar la cantidad de ácidos grasos como el constituyen una estrategia promisoria para de-
esteárico, son dos de las estrategias de mejo- sarrollar maní y otros cultivos hipoalergénicos.
ramiento utilizadas por los investigadores que
están desarrollando estas semillas. Modificaciones funcionales
Además de agregar nuevos nutrientes, es
Eliminación de alérgenos y toxinas posible también aumentar los beneficios para la
En cuanto al potencial alergénico de ciertos salud de los denominados alimentos funciona-
alimentos, la biotecnología también puede con- les. Estos son alimentos que contienen niveles
significativos de componentes biológicamente
tribuir a mejorar la seguridad de las materias
activos que confieren beneficios que van más
primas. El 95% de las alergias alimentarias
allá de cubrir las necesidades básicas de ca-
puede ser atribuida a un grupo de ocho alimen-
lorías, aminoácidos o ácidos grasos esencia-
tos, entre los que se encuentran el maní, la le-
les, vitaminas o minerales. Algunos ejemplos
che, la soja, el pescado, el huevo, etc. No sólo de alimentos considerados funcionales, son la
se han hecho grandes progresos en la identi- cebolla y el ajo, debido a componentes que au-
ficación de una serie de proteínas alergénicas mentan la respuesta inmune o reducen el co-
responsables de estas intolerancias, sino que lesterol o bien los glucosinolatos presentes en
también se ha tenido éxito en bloquear o eli- las coles, que estimulan enzimas con propie-
minar genes codificantes para alérgenos. En dades anti-cancerígenas. Del mismo modo, los
efecto, las técnicas de silenciamiento mediado antioxidantes encontrados en alimentos como

el té verde, el vino, el chocolate, etc., son tam- Las técnicas biotecnológicas se están uti-
bién considerados componentes funcionales. lizando ampliamente para obtener mejores
El caso del tomate características en alimentos e ingredientes,
Investigadores de la Universidad de Purdue ya sea para facilitar los procesos industriales
y del Departamento de Agricultura de los EEUU o hacerlos más atractivos para los consumi-
lograron tomates que contienen una cantidad dores. Prolongar la vida útil de frutas y vege-
tres veces mayor del antioxidante licopeno que tales, crear variedades sin semillas, extender
las variedades convencionales. El consumo de la disponibilidad geográfica de frutas de esta-
licopeno se ha asociado con un menor riesgo ción, mejorar el sabor y la textura de produc-
de cáncer de próstata y mama, y con menores tos como tomates, pimientos o peras, y crear
niveles en sangre de colesterol “malo”. variedades de té y café libres de cafeína, son
También en tomate, se está trabajando en todas mejoras posibles mediante la aplicación
el aumento de antocianinas, del mismo modo de estrategias biotecnológicas, algunas de las
asociadas a numerosos efectos benéficos para cuales incluyen a la ingeniería genética como
la salud. Dos genes (Del y Ros1) originarios herramienta.
del genoma de una planta ornamental (“cone- Por ejemplo, una estrategia utilizada para
jito”, Antirrhinum majus) fueron introducidos en mejorar la calidad de las papas, es modificar la
plantas de tomate convencional. Estos genes relación almidón/agua. Las papas con un ma-
inducen la expresión de enzimas clave en la yor contenido de almidón son más saludables
síntesis y el transporte de antocianinas a las porque absorben menos aceite al freírlas y re-
vacuolas de las células del tejido que conforma quieren menos energía para su procesamien-
la pulpa del tomate. El resultado final es un au- to. Otro ejemplo es el uso de tomates obteni-
mento de tres veces en el contenido de estas dos mediante variación somaclonal que contie-
antocianinas, que se refleja en el color violeta o nen un 30% menos agua y pueden procesarse
púrpura de estos tomates (Figura 3). Es impor- de manera más eficiente para producir sopas,
tante aclarar que no hay variedades de tomate pasta de tomate o ketchup.
transgénico disponibles en el mercado aún (ni En cuanto a la prolongación de la vida útil
estas ni otras), y que estos desarrollos se en- post-cosecha, se han desarrollado tomates y
cuentran en fase experimental. frambuesas de maduración retardada, utilizan-
De manera similar, se está trabajando en do técnicas de control de etileno)
la USDA para aumentar el contenido de áci- La siguiente tabla muestra los numerosos
do elágico en frutillas, un compuesto protector cultivos y mejoras que se encuentran en eta-
contra el cáncer. pas de experimentación y/o de desarrollo.
Otras modificaciones Lecturas y sitios recomendados
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V. Capítulo 15 minados son muy caros y, como consecuencia
de ello, muchos terrenos privados se abando-
nan en lugar de remediarse. Solamente en Es-
Fitorremediación tados Unidos, se gastan entre 6.000 y 8.000
millones de dólares anuales para el tratamiento
María Eugenia Segretin*, Paula Bey* y de zonas contaminadas, valores que, a escala
Alejandro Mentaberry mundial, alcanzan sumas de 25.000 y 50.000
* Ambas autoras contribuyeron por igual millones de dólares.
Los métodos actualmente utilizados para la
Introducción remediación ambiental se pueden clasificar en
La autotrofía es una de las características fisicoquímicos y biológicos. Los métodos fisi-
más importante de las plantas, dado que les coquímicos incluyen la excavación, transporte
permite utilizar la energía solar y el CO2 como y lavado de suelos, la extracción, bombeo y
fuentes de energía y carbono, respectivamen- tratamiento de aguas contaminadas y el trata-
te. Como consecuencia, las mismas dependen miento de aguas contaminadas mediante pre-
de sus raíces para incorporar agua del medio cipitación, intercambio iónico, ósmosis reversa
que las rodea y, con ella, compuestos minera- y microfiltración. Todos estos procedimientos
les, nitrógeno y otros nutrientes. Junto con és- son altamente costosos e impracticables si se
tos, las plantas absorben compuestos tóxicos trata de grandes superficies de tierra o volúme-
de origen variado por lo que, a lo largo de la nes de agua.
evolución, han generado mecanismos de de- Los métodos biológicos más utilizados se
toxificación que les permiten sobrevivir en am- basan agregar o estimular el crecimiento de
bientes adversos. Estos mecanismos pudieron bacterias que degraden o transformen el con-
haberse originado a partir de sistemas natura- taminante a tratar. Para que este enfoque re-
les de defensa contra aleloquímicos liberados sulte exitoso, se deben considerar factores
por organismos competidores, incluyendo mi- tales como la capacidad de supervivencia de
croorganismos, insectos y otras plantas. los microorganismos, la accesibilidad o bio-
La “fitorremediación” consiste en la utiliza- disponibilidad del compuesto contaminante y
ción de las plantas y de los microorganismos la presencia de inductores de las respectivas
asociados a las mismas con fines de descon- actividades enzimáticas. Muchos compuestos
taminación del medio ambiente. En este con- orgánicos son recalcitrantes a la degradación
texto, las plantas pueden considerarse como y no pueden ser utilizados como fuente de car-
sistemas naturales de extracción y tratamiento bono por los microorganismos involucrados.
de contaminantes. A diferencia de los métodos Además, los contaminantes son generalmen-
de tratamiento tradicionales, la energía reque- te metabolizados por enzimas que utilizan otro
rida para su funcionamiento proviene del sol, el sustrato natural, por lo que la presencia de éste
costo de mantenimiento es reducido y los efec- puede ser necesaria para inducir la expresión
tos indeseados son mínimos. de los genes correspondientes. Por otra parte,
Muchas actividades humanas, como la miel éxito de un proceso de biorremediación de-
nería, la agricultura, la industria y las operacio- pende de la presencia de fuentes de carbono
nes militares, han provocado la contaminación y energía suficientes en el sitio a tratar, por lo
de grandes superficies, incluyendo sitios con que usualmente se requiere adicionar conside-
altos niveles de concentración de compuestos rables cantidades de nutrientes para promover
tóxicos (por ejemplo luego de un derrame ac- el crecimiento bacteriano.
cidental) o con niveles escasamente detecta-
bles. Luego de largos períodos de exposición, La fitorremediación: aplicaciones,
estos últimos pueden ser perjudiciales para la ventajas y desventajas
salud humana y de otros organismos debido a La fitorremediación es una técnica de recien-
efectos acumulativos. Los procedimientos ac- te desarrollo que permite descontaminar de
tualmente utilizados para el tratar sitios conta- manera eficiente compuestos tóxicos orgáni-

cos e inorgánicos. La mayoría de los contami- cidas, pesticidas, metales, selenio), sitios
nantes orgánicos son generados por la acción industriales (compuestos orgánicos, me-
del hombre, siendo muchos de ellos carcino- tales), minas (metales) y sitios de trata-
génicos. Se producen como consecuencia de miento de maderas (hidrocarburos aro-
derrames (combustibles y solventes) y activi- máticos policíclicos);
dades agrícolas (pesticidas, herbicidas), indus- • Sustratos líquidos: aguas residuales (nu-
triales (deshechos químicos y petroquímicos) trientes, metales), drenajes agrícolas
o militares (explosivos y armas químicas). De- (nutrientes, fertilizantes, As, Se, B, pes-
pendiendo de sus propiedades, pueden ser de- ticidas, herbicidas), efluentes industriales
gradados en la raíz de la planta, o incorporados (metales), efluentes de minería (metales);
a tallos y hojas para su degradación, secuestro • Sustratos gaseosos: aire (óxidos de nitró-
o volatilización. Algunos ejemplos de compues- geno, SO2, ozono, CO2, gases neurotóxi-
cos, partículas de hollín, hidrocarburos
tos orgánicos eficientemente descontaminados
volátiles).
por fitorremediación incluyen solventes orgáni-
La fitorremediación presenta una serie de
cos (tricloroetileno), herbicidas (atrazina), ex-
ventajas sobre otras técnicas de descontami-
plosivos (trinitrotolueno), hidrocarburos deriva- nación que podrían resumirse de la siguiente
dos del petróleo (gasolina, benceno, tolueno, manera: a) costos energéticos muy inferiores
hidrocarburos aromáticos policíclicos) y bifeni- debido al uso de energía solar; b) empleo de
los policlorinados (dioxinas, polietileno), entre tratamientos in situ, con las consiguientes re-
otros. En comparación con los contaminantes ducciones de costos y riesgos para los huma-
inorgánicos, son relativamente menos tóxicos nos; c) adaptabilidad para la descontaminación
para las plantas, ya que son menos reactivos y de grandes superficies o para la "finalización"
no se acumulan. de áreas restringidas en plazos prolongados; d)
Los contaminantes inorgánicos pueden estar mayor velocidad de degradación para el caso
presentes naturalmente en la corteza terrestre de determinados compuestos; e) menor pro-
y/o en la atmósfera, o resultar de actividades ducción de residuos secundarios.
humanas como la minería, la industria, el trans- Asimismo, es importante considerar también
porte y la agricultura. A diferencia de los com- las limitaciones inherentes a esta técnica, entre
puestos orgánicos, no pueden ser degradados las cuales pueden incluirse: a) la fitotoxicidad
por las plantas, pero pueden acumularse en puede limitar el crecimiento de las plantas en
las partes cosechables de las mismas. Algunos áreas fuertemente contaminadas; b) la penetra-
ejemplos exitosos de fitorremediación de esta ción de las raíces restringe la utilidad de la téc-
clase de contaminantes incluyen, entre otros, nica a profundidades de hasta 3-4 m, y al tra-
macronutrientes vegetales (nitratos y fosfatos), tamiento aguas poco profundas; c) en algunos
elementos traza (Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn), ele- casos el proceso de remediación suele ser muy
mentos no esenciales (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, prolongado, siendo más lento en los suelos que
V y W), e isótopos radioactivos (238U, 137Cs y en los cuerpos de agua; d) la biodisponibilidad
de los compuestos o metales puede constituir
90
Sr). Muchos de estos compuestos son nor-
un factor limitante para una captación eficaz; e)
malmente necesarios para el desarrollo de las
las contaminaciones potenciales de las cade-
plantas, pero cuando se acumulan en exceso
nas alimentarias y de las napas de agua son
generan estrés oxidativo dañando a las células
riesgos que deben considerarse seriamente; f)
vegetales. los productos de degradación in planta (proce-
Más allá de la naturaleza química del con- sos de fitodegradación) no están bien estable-
taminante, la fitorremediación puede utilizarse cidos en muchos casos; g) el marco regulatorio
para detoxificar sustratos de naturaleza sólida, para procesos de fitorremediación se halla aún
líquida o gaseosa. Entre las principales aplica- en proceso de elaboración.
ciones de esta técnica pueden mencionarse el Algunas de las limitaciones mencionadas
tratamiento de: pueden atenuarse introduciendo modificacio-
• Sustratos sólidos: sitios militares (meta- nes a las técnicas utilizadas. Por ejemplo, la
les, explosivos), suelos agrícolas (herbi- profundidad de captación puede incrementar-

se mediante implantación de árboles en perfo- gias se resumen en la Figura 1 y se detallan a
raciones profundas o mediante el bombeo de continuación. Su uso depende de la superficie
aguas contaminadas para irrigar plantas fito- y características del ambiente a remediar y de
rremediadoras. Asimismo, la biodisponibilidad la naturaleza del contaminante, siendo posible
de ciertos contaminantes puede incrementarse implementar combinaciones de las mismas en
mediante el agregado de compuestos que au- algunos casos
menten su solubilidad. • Fitoextracción: esta estrategia tiene
El mercado actual de la fitorremediación en como fin concentrar el contaminante en
Estados Unidos representa entre 100 y 150 mi- tejidos cosechables de las plantas (prin-
llones de dólares al año (en 1999 fue de cerca cipalmente en la parte aérea). El material
de 45 millones de dólares), repartiéndose en cosechado puede convertirse en cenizas,
un 80% para el tratamiento de contaminantes
usarse con fines no alimentarios o, como
orgánicos y un 20% para contaminantes inorgá-
en el caso de algunos metales, para reci-
nicos. Este mercado es todavía incipiente si se
clar el contaminante ("fitominería"). Esta
considera que la fitorremediación abarca sólo
un 0,5% del mercado total de remediación (la técnica se usa principalmente para la re-
biorremediación en su conjunto representa cer- mediación de metales y de otros tóxicos
ca del 2% del mercado total). El uso de este tipo inorgánicos (Se, As, radionucleótidos).
de técnicas no es aún significativo en Europa, • Fitoestimulación/rizodegradación: el
pero se espera que, debido a las inversiones propósito de esta estrategia es facilitar la
realizadas en este campo, se vaya ampliando degradación de contaminantes presen-
en el corto y mediano plazo. La Tabla 1 muestra tes en la rizósfera mediante la actividad
una comparación de los costos de descontami- de microorganismos (bacterias y hongos)
nación para diferentes compuestos tóxicos con asociados a las plantas. Es comúnmente
distintas estrategias. Como puede verse, en el usada para remediar contaminantes or-
caso de los contaminantes listados la fitorreme- gánicos hidrofóbicos que no pueden ser
diación resulta la opción menos costosa. incorporados por las plantas, pero que
pueden ser degradados por los micro-
Estrategias de organismos. Los ejemplos más destaca-
fitorremediación dos de aplicaciones de esta estrategia
El término fitorremediación engloba diferen- se refieren a hidrocarburos aromáticos
tes estrategias para descontaminar el entorno policíclicos, bifenilos policlorinados e hi-
mediante el uso de las plantas. Estas estrate- drocarburos derivados del petróleo.
Tabla 1. Adaptada de Chappell, 1998
Costo estimado
Costo de
Contaminante usando otras
Fitorremediación
tecnologías
Metales U$D 87,5 por m3 U$D 250 por m3

petróleo U$D 70.000 por sitio U$D 850,000
4 Ha de tierra contaminada
U$D 500,000 U$D 12 millones
con plomo
Radionucleótidos en agua
U$D 2 a U$D 6 No determinado
superficial (4.000 litros)
1 hectarea a 15 cm de
profundidad (varios U$D 2.500 a U$D 15.000 No determinado
contaminantes)
Adaptada de Chappell, 1998.

Figura 1. Procesos involucrados en la fitorremediación. La fitorremediación puede involucrar varios
procesos: los contaminantes en el suelo y en el agua subterránea pueden ser incorporados a los tejidos
vegetales (fitoextracción), o adsorbidos a las raíces (rizofiltración); los contaminantes dentro de la planta
pueden ser transformados por enzimas vegetales (fitotransformación), o volatilizados y liberados a la at-
mósfera (fitovolatilización); los contaminantes del suelo pueden ser degradados por microorganismos de
la rizósfera (biorremediación rizosférica), o incorporados al material del suelo (fitoestabilización). Adaptado
de van Aken, 2008
• Fitoestabilización: esta estrategia se diante actividades enzimáticas propias,

basa en utilizar plantas para estabili- generando así subproductos no tóxicos
zar in situ los contaminantes del suelo. o menos tóxicos. El procedimiento ha re-
Por este medio, se previene el filtrado sultado útil para compuestos orgánicos
o escape de los contaminantes a capas que se movilizan fácilmente en los teji-
más profundas o a napas de agua y se dos de la planta, como los herbicidas, el
los convierte en formas menos biodis- trinitrotolueno, y el tricloroetileno.
ponibles (por ejemplo, por precipitación • Fitovolatilización/fitotransformación:
en la rizósfera). Para implementar este en este caso, las plantas incorporan el
enfoque pueden plantarse coberturas contaminante y lo convierten a formas
vegetales en sitios contaminados, o ár- volátiles que se liberan luego a la atmós-
boles que actúan como barreras hidráuli- fera a través de la transpiración. Este
cas, tanto para contaminantes orgánicos procedimiento permite extraer elemen-
como inorgánicos. tos como el selenio y algunas formas
• Fitodegradación/fitotransformación: del mercurio de barros y suelos, para
mediante esta estrategia, las plantas de- luego liberarlos a la atmósfera como va-
gradan los contaminantes orgánicos me- por detoxificado. Puede utilizarse para

compuestos orgánicos con formas volá- Los procesos mencionados no son mutua-
tiles (tricloroetileno) y para compuestos mente excluyentes. Por ejemplo, en un terreno
inorgánicos que pueden existir en forma anegado artificialmente, pueden ocurrir simul-
volátil, como Se y Hg. táneamente procesos de acumulación, estabi-
• Rizofiltración: este procedimiento con- lización y volatilización de los contaminantes.
siste en la eliminación de tóxicos de am- Algunos ejemplos de diseños planteados de fi-
bientes acuáticos mediante el sistema torremediación que resultan de la combinación
radicular de la planta. En este proceso, de las estrategias mencionadas se esquemati-
las plantas son crecidas en hidroponia zan en la Figura 2.
para luego ser transplantadas al cuerpo
de agua contaminado, donde adsorben Características deseables en
y acumulan metales en sus raíces. Si el una planta para fitorremediar
proceso se realiza en contenedores, es El diseño del sistema a utilizar para la des-
relativamente caro de implementar, sien- contaminación variará según el tipo de com-
do más bien apropiado para volúmenes puesto contaminante y su concentración, y de
pequeños de aguas residuales contami- las condiciones específicas del sitio a reme-
nadas, por ejemplo, con compuestos in- diar. Uno de los factores más importantes a de-
orgánicos peligrosos como radionucleó- terminar es la selección de la especie vegetal.
tidos. En general, se utilizan especies de rápido cre-
Figura 2. Esquemas de fitorremediación para tratar diferentes sustratos contaminados. Tecnologías

de fitorremediación utilizadas para remediar distintos sustratos contaminados: agua, suelo y/o aire. Los
círculos rojos representan al contaminante. Adaptado de Pilon-Smith, 2007

cimiento, fáciles de crecer y mantener, y que dativas. En cambio, si se emplea una estrategia
desarrollen gran cantidad de biomasa. Pueden de fitoestimulación, es importante que la planta
utilizarse plantas, árboles, pastos o algas, pre- tenga una gran superficie radicular y produzca
firiéndose en algunos diseños las especies au- los exudados necesarios para promover el cre-
tóctonas para no modificar la flora local. Las cimiento microbiano.
especies más utilizadas comprenden las frea- Existen especies de plantas conocidas como
tófitas (plantas de raíces profundas como el “hiperacumuladoras” que tienen la capacidad
álamo, sauce, algodonero), las pasturas (debi- de acumular compuestos fitotóxicos (particular-
do a que sus raíces son particularmente aptas mente metales) en concentraciones entre 50 y
para retener el suelo), las legumbres (porque 500 veces superiores a una planta promedio. El
permiten la fijación simbiótica de N2) y las acuá- alto poder de concentración del compuesto tóxi-
ticas (que permiten la degradación de contami- co, sumado a un sistema eficiente de transporte
nantes en ciénagas artificiales). Como es obvio, desde la raíz al tallo, califica a las hiperacumula-
la especie seleccionada deberá descontaminar doras como candidatas promisorias para ciertos
eficientemente la sustancia tóxica. procesos de detoxificación (Tabla 2).
Cada estrategia de fitorremediación requiere
la presencia de características especiales en la Procesos biológicos que afectan
planta a utilizar. Por ejemplo, si se desea em- la fitorremediación
plear la técnica de fitoextracción para contami- El proceso de fitorremediación depende de
nantes inorgánicos, éstos deben concentrarse una serie de procesos biológicos: aquellos re-
en la planta en altos niveles, translocarse efi- lacionados con las interacciones a nivel rizos-
cazmente y acumularse en los tejidos cosecha- férico; los mecanismos de captación, transloca-
bles. En un esquema basado en fitodegrada- ción y tolerancia presentes en la planta; la pre-
ción, se requerirán sistemas radiculares densos sencia de quelantes vegetales involucrados en
y abundantes y altos niveles de enzimas degra- transporte y almacenamiento, y el movimiento
Tabla 2. Adaptada de Cherian, 2005
Plantas
Hiperacumuladoras Metal Contaminantes y entorno
comunes
zinc(Zn), Metales pesados, selenio y
Thlaspi caerulescens Mostaza parda
cadmio (Cd) radionucleótidos en el suelo
Solventes clorados y nitratos
Berkheya coddii níquel (Ni) álamo en aguas subterráneas,
metales pesados en el suelo
Solventes clorados en agua
Astragalus racemosus selenio (Se) Álamo carolino
subterráneas; metales, nitratos
arsénico Desechos explosivos en
Pteris vittata Lenteja de agua
(As) aguas subterráneas
Hidrocarburos aromáticos
Ipomoea alpina cobre (Cu) mora
policíclicos (PAHs) en el suelo
Radionucleótidos en aguas
Haumaniastrum robertii cobalto (Co) girasol
subterráneas
Metales pesados e
Iberis intermedia talio (Tl) pastos
hidrocarburos en el suelo
Gysophila Hidrocarburos en suelos y
boro (B) alfalfa, enebro
spaerocephala aguas subterráneas
Adaptada de Cherian, 2005

de los contaminantes en los ecosistemas ha- lacionados con la degradación de conta-
cia niveles tróficos superiores. Algunos de los minantes. En la rizósfera ocurren proce-
parámetros más importantes relacionados con sos que pueden contribuir a incrementar
estos procesos se comentan a continuación: la biodisponibilidad del contaminante. Al-
• Biodisponibilidad del contaminante: la gunos ejemplos de estos procesos son:
biodisponibilidad de un contaminante de- a) la liberación de biosurfactantes bac-
pende fuertemente de sus propiedades terianos que aumentan la solubilidad de
químicas, en particular de su hidrofobici- compuestos hidrofóbicos; b) la liberación
dad y volatilidad. Por ejemplo, las molé- de exudados vegetales que promueven
culas de extrema hidrofobicidad (bifeni- la síntesis de biosurfactantes bacteria-
los policlorados, hidrocarburos aromáti- nos; c) la liberación de enzimas vegeta-
cos policíclicos y otros hidrocarburos) se les y bacterianas capaces de modificar
unen fuertemente a la materia orgánica y algunos compuestos orgánicos aumen-
no se disuelven en el agua atrapada en tando su biodisponibilidad; d) la libera-
sus poros, presentando así baja biodis- ción de quelantes por parte de plantas y
ponibilidad. Las propiedades del suelo bacterias (sideróforos, ácidos orgánicos
también influyen sobre la biodisponibi- y fenólicos) que permiten incrementar la
lidad; los suelos arcillosos y con mayor disponibilidad de metales; e) la extrusión
concentración de materia orgánica retie- de protones por las plantas para acidifi-
nen más agua que los suelos arenosos car el suelo; f) la liberación de enzimas
y tienen más sitios de unión para iones vegetales que convierten los metales en
(especialmente cationes). La biodisponi- formas menos tóxicas o más biodisponi-
bilidad de los contaminantes inorgánicos bles (por ejemplo, CrVI a CrIII).
que están presentes como cationes es • Captación por la planta: el proceso de
afectada por el pH del suelo (los pHs áci- captación depende de la naturaleza del
dos la incrementan porque los reempla- contaminante. Por lo general, las plantas
zan por protones en los sitios de unión). no poseen transportadores específicos
Las condiciones medioambientales son para los contaminantes orgánicos, los
otro parámetro importante; por ejemplo, cuales son en su mayoría productos de
la temperatura y la humedad pueden au- la actividad humana. De acuerdo con su
mentar la migración de contaminantes grado hidrofobicidad, estos compuestos
disueltos en agua. Dada la importancia difunden a través de los tejidos vegetales.
de este factor sobre la fitorremediación, En cambio, los contaminantes inorgá-
existen numerosas estrategias para au- nicos son incorporados mediante trans-
mentar la biodisponibilidad de los conta- portadores de membrana preexistentes
minantes, que incluyen el agregado de debido a que son naturalmente utilizados
quelantes y la acidificación de los suelos como nutrientes o guardan relación con
en el caso de los metales (fitoextracción compuestos normalmente captados por
asistida) y el agregado de surfactantes las plantas. Por ejemplo, el arsenato es
para contaminantes hidrofóbicos. incorporado por transportadores de fos-
• Procesos rizosféricos: en la rizósfera, fato y el selenato por transportadores de
la zona comprendida hasta 1 mm de dis- sulfato. A pesar de que son poco reac-
tancia de la raíz, existe una mayor con- tivos, su acumulación causa toxicidad
centración de microorganismos como debido a que dañan la estructura celular
consecuencia de la liberación de foto- mediante estrés oxidativo y reemplazan
sintatos. Muchos poseen capacidad re- nutrientes esenciales.
mediadora y la liberación de metabolitos • Quelación y compartimentalización:
secundarios por parte de la planta puede estos procesos que incluyen distintos ti-
activar en ellos la expresión de genes re- pos de conjugaciones y modificaciones,

o bien el secuestro en localizaciones como conjugados. La degradación pue-
subcelulares donde no interfieren con de ocurrir tanto en raíces como en la par-
el metabolismo celular, le permiten a las te aérea de la planta mediante enzimas
plantas tolerar distintos contaminantes. que modifican los grupos laterales de los
Algunos de estos procesos se resumen compuestos orgánicos permitiendo así
en la Figura 3. su solubilización. Algunas enzimas invo-
• Degradación: este proceso puede apli- lucradas en este proceso son las deha-
carse solo a contaminantes de tipo or- logenasas, mono/di-oxigenasas, peroxi-
gánico, que pueden ser completamente dasas, lacasas, nitrilasas, fosfatasas y
catabolizados (proceso que se denomi- nitroreductasas.
na "mineralización" y que tiene como
productos CO2, H2O y/o Cl2), o bien par- Diseño de un esquema de
cialmente degradados a intermediarios fitorremediación
estables que se almacenan en la planta El diseño del sistema a utilizar para la des-
Figura 3. Mecanismos de tolerancia de las células vegetales a contaminantes orgánicos e inorgáni-

cos. La detoxificación generalmente involucra procesos de conjugación seguidos por el secuestro activo
del complejo en la vacuola y/o el apoplasto, lugares donde el contaminante genera menos daño. Los
compuestos quelantes mostrados en el esquema son: GSH: glutation, Glu: glucosa, MT: metalotioneinas,
NA: nicotinamina, OA: ácidos orgánicos, PC: fitoquelatinas. Los transportadores activos se muestran como
cajas con flechas. Adaptado de Pilon-Smith, 2007

contaminación variará según la naturaleza de productos menos tóxicos que el conta-
los compuestos contaminantes, la concentra- minante original mediante el proceso de
ción de los mismos y las condiciones del sitio transpiración. Otros costos importantes
a remediar. La estrategia de fitorremediación a a considerar en el esquema son los de
utilizar es muy importante, ya que el diseño del implantación, fertilización, mantenimien-
sistema dependerá de ello. Algunos factores to y control, y tareas de cosecha y reco-
clave a tener en cuenta son: lección. Finalmente, no debe excluirse la
• Naturaleza de los contaminantes y ocurrencia de eventos recurrentes en la
selección de la especie vegetal: para agricultura, tales como plagas, sequías,
asegurar la correcta elección del sistema heladas o la depredación por animales,
de fitorremediación, es necesario esta- los que pueden introducir situaciones no
blecer fehacientemente el tipo de conta- previstas en el esquema planteado. Por
minación. Con el fin de utilizar el sistema esta razón, es recomendable disponer
más apropiado, pueden realizarse ende estrategias de contingencia para ase-
sayos a pequeña escala para comparar gurar el éxito del programa.
la efectividad de distintas especies de
plantas. Es necesario analizar también la Estrategias para incrementar la eficiencia
cantidad y las características de los com- de la fitorremediación
puestos que la planta produce y/o libera. Se han planteado diferentes estrategias para
• Esquema y densidad de las planta- mejorar la eficiencia de los sistemas de fitorre-
ciones: la densidad de plantación de- mediación haciendo uso de plantas transgéni-
penderá de la planta utilizada y del tipo cas. Algunas de estas estrategias son: a) au-
de aplicación. Es importante calcular la mento de la incorporación de contaminantes
cantidad de biomasa producida por uni- mediante la sobreexpresión y/o alteración de
dad de superficie a lo largo del tiempo y, la especificidad de distintos transportadores de
si es necesario realizar plantaciones su- membrana, o la expresión y secreción de pro-
cesivas que permitan alcanzar tasas de teínas o compuestos quelantes; b) aumento de
descontaminación adecuadas. la eficiencia de degradación de contaminantes
• Tasa de captación del contaminante y orgánicos mediante sobreexpresión de enzi-
tiempo de limpieza requerido: el tiem- mas específicas; c) aumento de la acumula-
po total requerido para un determinado ción de metales pesados, mediante expresión
esquema de fitorremediación dependerá de enzimas capaces de favorecer su conjuga-
de las variables apuntadas anteriormen- ción a moléculas tales como el glutation y/o las
te. La tasa de descontaminación puede fitoquelatinas.
determinarse aplicando distintas ecua- En muchos casos, los genes utilizados para
ciones desarrolladas especialmente con hacer más eficiente la fitorremediación pro-
este fin. vienen de animales o de microorganismos, ya
• Irrigación, insumos agronómicos y que éstos poseen el complemento enzimático
mantenimiento: la frecuencia y cantidad necesario para degradar y/o mineralizar las
de las lluvias y las características del cli- moléculas orgánicas, complementando así las
ma regional son factores que podrían de- capacidades metabólicas de las plantas. En la
terminar la necesidad de agua para rie- medida en que se diluciden las bases molecu-
go, lo que presupone la existencia costos lares y fisiológicas de los procesos de capta-
adicionales para los procesos de fitorre- ción, transporte y acumulación de los contami-
mediación terrestre. Es importante ana- nantes en las plantas fitorremediadoras, será
lizar los procesos de movimiento y des- posible encarar nuevas estrategias de modi-
tinación final del agua. Por ejemplo, un ficación genética en otras especies vegeta-
árbol maduro es capaz de liberar más de les. Otras líneas de investigación promisorias
760 litros de agua por año. En algunos apuntan a incrementar la eficiencia del proceso
casos, las plantas liberarán al ambiente de fitorremediación mejorando las interaccio-

nes entre las plantas y sus microorganismos presión combinada de los genes merB y merA
endófitos, ya sean naturales o genéticamente en una misma planta ha permitido la obtención
modificados. de líneas que resisten concentraciones de feni-
lmercurioacetato 100 veces mayores a las que
Ejemplos de fitorremediación resisten las plantas no transgénicas (Figura 4).
La fitorremediación para la descontami-
nación de aguas, suelos y aire ha resultado
exitosa en un número considerable de casos.
Los ejemplos de estas aplicaciones van desde
pruebas al nivel de laboratorio o escala piloto,
hasta procedimientos a gran escala en zonas
afectadas por determinados contaminantes. A
continuación se resumen algunos de los casos
exitosos.
Fitorremediación de mercurio: el mercu-
rio, presente naturalmente en la corteza terres-
tre, es un metal capaz de causar graves daños
cerebrales, cardíacos, hepáticos y pulmonares Figura 4. Plantas de Arabidopsis que expresan tanto
tanto en animales como en humanos. Se han merA como merB son altamente resistentes a mer-
utilizado distintas técnicas para minimizar el curio orgánico. La expresión de ambos transgenes
permite que el metilmercurio o el PMA se convier-
impacto ambiental del mercurio, y uno de las
ta a formas menos tóxicas, como Hg(0). Las plan-
más promisorias es el uso de plantas para ex- tas MerA/MerB (panel inferior izquierdo) crecen en
traer este elemento de aguas contaminadas. presencia de altas concentraciones de PMA (5 μM)
Por ejemplo se ha demostrado que el pequeño pero las transgénicas simples MerA (panel inferior
helecho Azolla caroliniana es capaz de remo- derecho), MerB y las plantas no transgénicas,
ver hasta el 93% del mercurio presente en una mueren. Tomada de Meagher y Heaton; 2005.
muestra de agua contaminada en sólo 12 días.
Por otro lado, se observó que plantas acuáticas
como la milhojas acuática (Myriophyllum aqua-
ticum), o la menta de agua (Mentha aquatica)
remueven el 99,8% del mercurio en un período Fitorremediación de fenol: los contaminan-
de 21 días. Investigaciones similares, realiza- tes fenólicos son considerados altamente peli-
das con el jacinto de agua (Eichornia crassi- grosos debido a su carcinogenicidad, su alta
pes), la lechuga de agua (Pistia stratiotes), el toxicidad, y su resistencia a la degradación. En
junco de agua (Scirpus tabernaemontani) y el general, esta clase de contaminantes se gene-
taro (Colocasia esculenta) refuerzan el posible ra a partir de diversas actividades industriales
uso de plantas para la remoción de mercurio dentro de las que se encuentran las refinerías
de aguas contaminadas. de petróleo, la producción de plásticos, y el
Una estrategia alternativa es el uso de plan- tratamiento de maderas. Los métodos conven-
tas genéticamente modificadas. Se han rea- cionales para eliminarlos son costosos y poco
lizado pruebas de concepto en Arabidopsis eficientes, incluso pueden generar subproduc-
thaliana, tabaco, canola y álamo introduciendo tos que resultan aún más perjudiciales que los
los genes merB y merA de Desulfovibrio des- compuestos originales. Un método interesan-
ulfuricans, que codifican una organomercúrico te para su descontaminación es el tratamiento
liasa y una mercúrico reductasa. La primera enzimático, que consiste en la remoción bio-
es capaz de transformar las formas tóxicas lógica de fenoles mediante el uso de peroxi-
del mercurio (metilmercuriales), en compues- dasas y oxidasas. Sin embargo, se necesitan
tos más inocuos (mercurio iónico y metano); grandes cantidades de enzimas para lograr
mientras que la segunda permite transformar el una eficiencia de descontaminación adecuada,
mercurio iónico en mercurio elemental. La ex- lo que dificulta su aplicación a escala industrial.

Una estrategia para superar esta limitación es y arsenito (As III). El primero interfiere con pro-
el uso de plantas enteras como “transformado- cesos celulares como la fosforilación oxidativa
ras” de fenoles. y la síntesis de ATP, mientras que el segundo
Una posible herramienta para procesos de se une a grupos sulfhidrilo en detrimento de la
fitorremediación es el cultivo de raíces transfor- función proteica en general. La mayor fuente
madas con Agrobacterium rhizogenes ("raíces de contaminación del agua bebible y de la ca-
en cabellera"). Las raíces de tomate tratadas dena alimentaria son los cursos de agua, sue-
con esta bacteria contienen altos niveles de los y sedimentos contaminados con As. Esto
ha causado envenenamientos masivos que,
peroxidadas, y en consecuencia son capaces
entre otros síntomas, generan lesiones y cán-
de remover fenoles. En un trabajo realizado en
ceres en la piel.
el año 2005, en la Universidad de Río Cuarto En la naturaleza, las actividades geoquímicas
(Córdoba, Argentina), se obtuvieron raíces en y microbianas contribuyen también a la movili-
cabellera transgénicas de tomate (Lycopersi- zación del As hacia el ambiente. Sin embargo,
cum esculentum Mill. cv. Pera) que sobreex- es la actividad humana la que más contribuye a
presan el gen tpx1 (Figura 5). Este gen codifica este proceso, exacerbando así el problema. En
una peroxidasa básica que se localiza en la India y Bangladesh, la contaminación de aguas
pared celular de las raíces de tomate. Se anali- con As pone en riesgo la alimentación basada
zó la capacidad de dichas raíces para remover en cultivos tales como el arroz y el maíz. Es-
fenol utilizando como controles raíces en ca- tas especies son capaces de acumular As en
bellera de plantas no transgénicas. Las raíces sus granos, lo que genera riesgos potenciales
transgénicas fueron capaces de remover hasta para los consumidores humanos. Los métodos
un 85% del fenol adicionado, mientras que los físicos y químicos aplicados hasta hoy para
controles no transgénicos sólo removieron un disminuir las contaminaciones de As no han re-
15%. Estos resultados sugieren que las raí- sultado exitosos. En este contexto, las algas y
ces en cabellera podrían resultar herramientas plantas acuáticas hiperacumuladoras de As se
muy útiles para la limpieza de efluentes conta- presentan como una opción prometedora.
En el año 2002 un grupo de investigado-
minados.
res diseñó un sistema de fitorremediación de
As basado en plantas de Arabidopsis thaliana
transgénicas, capaces de convertir el arsenato
en arsenito, el cuál era luego secuestrado en
las hojas en complejos de péptidos que contie-
nen tioles. En primer lugar generaron plantas
transgénicas que expresaban el gen bacteriano
de la arsenato reductasa (arsC), bajo la direc-
ción de un promotor de hoja inducible por luz.
En consecuencia, la enzima transgénica sólo
se expresa en las hojas y estas plantas son hi-
persensibles al arsenato. Por otra parte, se ob-
tuvieron plantas transgénicas que expresaban
el gen bacteriano γ-glutamilcisteina sintetasa
(γ-ECS) bajo un promotor constitutivo. Estas
Figura 5. (A) Planta transgénica de tomate in-vitro. plantas mostraron una moderada tolerancia al
(B) Raíces en cabellera transgénicas luego de 1 As en comparación con plantas no transgéni-
semana en medio líquido. (C) Raíces en cabellera cas. Finalmente, en aquellas plantas que ex-
transgénicas después de 4 semanas en medio líqui- presan simultáneamente ambos transgenes
do. Tomado de Weaver Oller y col., 2005 (arsC/γ-ECS), se observó un efecto potenciado
de tolerancia al As. En medios con concentra-
ciones elevadas de As, las plantas arsC/γ-ECS
Fitorremediación de arsénico: el arsénico crecen y son capaces de generar entre 4 y 17
(As) es un compuesto altamente tóxico, sus veces más biomasa que las plantas no trans-
formas predominantes son el arsenato (As V) génicas o las transgénicas que expresan solo

una de las enzimas. Además, se observó que debido al uso de pesticidas. La misma técnica
acumulaban entre 2 y 3 veces más arsénico de remoción de As se ha utilizado para descon-
por gramo de tejido que las plantas control. taminar agua utilizando un sistema de fitofiltra-
ción. Pteris vittata puede reducir la concentra-
Aplicaciones comerciales ción de As presente en el agua desde concen-
Tratamiento de contaminaciones traciones de 200 mg/L a menos de 50 mg/L en
con metales pesados sólo 2 días, permitiendo la remoción completa
La empresa norteamericana Edenspace al cabo de 3 días.
Systems Corporation comercializa plantas con
aplicaciones energéticas y ambientales. La Tratamiento de aguas residuales
compañía provee tecnologías fitoambientales urbanas
basadas en plantas hiperacumuladoras de me- Los sauces pueden ser utilizados con fi-
tales y brinda servicios para descontaminar ar- nes de fitorremediación para el tratamiento de
sénico, plomo, uranio y compuestos orgánicos aguas residuales urbanas que contienen altas
de suelos y aguas. Además, provee prestacio- concentraciones de nitrógeno y fósforo. Estas
nes complementarias a la fitorremediación que
sustancias forman una solución nutritiva que
incluyen análisis de factibilidad, biodisponibili-
puede ser utilizada para el riego de dichos ár-
dad, consultorías, etc. EdenfernTM (Figura 6) es
boles, y así son “biotransformadas” en bioma-
un sistema que se desarrolló en la Universidad
sa útil. En Enköping, una ciudad de Suecia con
de Florida y se licenció a Edenspace. Se basa
unos 20.000 habitantes, se utiliza un sistema
en el uso de un helecho (Pteris vittata) capaz
de absorber arsénico del suelo, lodo, o agua, de fitorremediación para tratar el agua residual
con una eficiencia 200 veces mayor que cual- rica en nitrógeno procedente del fango de al-
quier otra planta. Luego de un cierto período, cantarillado (previamente tratada en una planta
los helechos son removidos y descartados de depuradora). El efluente se distribuye por una
manera segura, dejando el terreno libre de ar- plantación de sauces de 75 hectáreas durante
sénico. Si se asume una concentración de ar- el período de crecimiento (Figura 7). Las aguas
sénico en el suelo de 50 mg/kg, este procedi- contaminadas contienen unos 800 mg/L de ni-
miento permite reducir los niveles de As hasta trógeno. El sistema trata unas 11 toneladas de
10 mg/kg en 2 - 4 meses. Este sistema puede nitrógeno y 0,2 toneladas de fósforo al año en
extraer arsénico del suelo en concentraciones un volumen de 200.000 m3 de aguas residua-
que van desde menos de 1 mg/kg hasta 2.500 les. Los posibles riesgos medioambientales,
mg/kg. En 2007 este sistema fue aplicado con como emisiones de óxido nitroso (N2O) a la
resultados promisorios en una pequeña propie- atmósfera, son analizados continuamente; los
dad residencial en Virginia (EEUU) cuyo sue- resultados obtenidos hasta el presente indican
lo contenía altas concentraciones de arsénico que los mismos son mínimos.
Figura 6. EdenfernTM

Figura 7. Sistema de fitorremediación que utiliza una plantación de 75 hectáreas de sauces en Enköping,
Suecia. Planta de tratamiento de aguas residuales (primer plano), piletas para almacenar las aguas en
invierno (al fondo) y campos de sauces regados con efluentes de fangos. P. Aronsson
Lecturas recomendadas Meagher RB, Heaton AC. 2005. Strategies

for the engineered phytoremediation of toxic
Bennicelli R, Stepniewska Z, Banach A, Sza- element pollution: mercury and arsenic. J Ind
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V . CAPÍTULO 16 Estos sistemas requieren de personal técni-
co especializado y conllevan grandes riesgos
económicos en caso de que ocurran contami-
Plantas como biorreactores
naciones en la línea de producción, aunque el
contaminante no sea patogénico para la salud
Fernando Almonacid Bravo; Sonia Wirth; humana.
María Eugenia Segretin; Mauro Morgenfeld; En este entorno la agricultura molecular o
Ezequiel Matías Lentz molecular pharming, es decir, la utilización de
animales o plantas como biorreactores para la
Introducción producción de proteínas recombinantes, cons-
En los últimos años, la demanda y el uso de tituye una alternativa a los sistemas de produc-
péptidos y proteínas terapéuticos en la medi- ción basados en microorganismos y cultivos de
cina humana y veterinaria han experimentado células.
un marcado incremento. El mercado mundial La producción de proteínas terapéuticas en
de biofármacos para uso humano alcanza ac- animales transgénicos permite obtener pro-
tualmente los 30.000 millones de dólares, y se ductos muy similares a los sintetizados en el
estima que se duplicará para el año 2010. Más organismo animal original, pero requiere de un
de 200 productos se encuentran en evaluación tiempo de desarrollo muy largo y costoso. El
clínica, liderados por los anticuerpos monoclo- aumento en la escala de producción es lento
nales de los cuales unos 70 se estarían comer- y se limita a los ciclos naturales de crecimien-
cializando en los próximos años. Sólo cuatro to de la especie utilizada. Además, existe el
moléculas comprenden el 75% de la produc- riesgo de contaminación con virus animales y
ción actual y, si las predicciones son correctas, priones.
la demanda podría superar la capacidad de Todas las dificultades mencionadas han in-
manufactura, a menos que se desarrollen nue- tensificado los esfuerzos para desarrollar nue-
vos sistemas de producción. vos sistemas de producción de moléculas re-
Actualmente, la producción de biofármacos combinantes seguras y a bajo costo.
se realiza utilizando básicamente dos siste- Es por ello que las ventajas asociadas a la
mas: microorganismos y cultivo de células de producción de proteínas recombinantes en bio-
mamífero. rreactores vegetales han transformado a éstos
Respecto al primer sistema, existe la dificul- en una opción altamente competitiva.
tad asociada a la incapacidad que tienen las
bacterias y hongos de producir en las proteínas Ventajas de las plantas como biorreactores
animales ciertas modificaciones que en la ma- La principal ventaja de las plantas como sis-
yoría de los casos son indispensables para su temas de producción es la disponibilidad prác-
funcionalidad, como por ejemplo, el agregado ticamente ilimitada de biomasa que puede ob-
de determinados azúcares (glicosilación). Ade- tenerse utilizando la infraestructura ya existen-
más, el plegado incorrecto de la proteína y la te para la siembra, cosecha, almacenamiento y
formación de agregados insolubles (cuerpos procesamiento de los cultivos. El capital de in-
de inclusión) limitan la obtención de productos versión inicial y el costo para el aumento en la
biológicamente activos o cuyo costo de purifi- escala de producción son relativamente bajos.
cación sea económicamente sostenible. Más aún, el volumen de producción es extre-
Los cultivos de células de mamífero, en cam- madamente flexible y puede adaptarse rápida-
bio, tienen la ventaja de que permiten la sínte- mente a las demandas del mercado incremen-
sis de proteínas animales muy similares a la tando o disminuyendo la superficie sembrada.
original. Sin embargo, la obtención y manteni- Por otra parte, una vez establecido el cultivo,
miento de las líneas celulares es un proceso no se requiere de personal especializado, no
largo y costoso que implica grandes inversio- hay riesgos de contaminación con patógenos
nes adicionales cuando se pretende incremen- animales, endotoxinas bacterianas o secuen-
tar la escala de producción. cias de ADN oncogénicas y puede aprovechar-

se el conocimiento previo de los sistemas de de la proteína recombinante puede lograrse si-
molienda y extracción en las primeras etapas guiendo diversas estrategias. La elección de la
del proceso de purificación. Una ventaja adi- misma o combinación de ellas dependerá de
cional es que las plantas permiten el almace- las características de la proteína a sintetizar,
namiento estable de la proteína recombinante de la especie vegetal utilizada y de las necesi-
en semillas y tubérculos, facilitando su con- dades de producción. Generalmente, es difícil
servación, transporte y distribución. Más aún, predecir cuál de estos aspectos tendrá mayor
los mecanismos de síntesis y modificaciones impacto para producir con éxito una proteína
posteriores son los propios de las células de particular. Ello requiere, por lo tanto, ensayar
mamíferos, permitiendo la producción y en- múltiples variables para lograr niveles óptimos
samblado de proteínas multiméricas, como los de producción. Los elementos a tener en cuen-
anticuerpos. Es importante recalcar que exista son la elección del sistema de expresión y
ten diferencias entre plantas y animales en la del germoplasma a transformar, y el uso de
glicosilación de proteínas, estas diferencias herramientas moleculares (secuencias regula-
pueden afectar la estabilidad, la actividad bio- doras de la expresión) para el diseño de las
lógica y la antigenicidad; en resumen podrían construcciones genéticas que contengan las
afectar la autenticidad del producto final. secuencias de las proteínas a expresar.
Cuando se comparan los costos de produc-
ción de proteínas recombinantes en distintos Elección del sistema de expresión
sistemas se demuestra que, a menos que los En cuanto a la elección del sistema de ex-
niveles de proteína recombinante alcanzados presión, las opciones comprenden dos grandes
sean excesivamente bajos, los costos de pro- grupos: sistemas integrativos y no integrativos.
ducción en plantas son generalmente inferio- El primer grupo se refiere a aquellos sistemas
res a los de otros sistemas. que permiten la integración estable de la cons-
Más del 85% del costo de producción de una trucción genética en el genoma vegetal, tanto
proteína recombinante depende del proceso en el núcleo como en las organelas. El resulta-
de purificación. Al respecto, las plantas poseen do es una transformación estable y heredable,
ventajas propias que permiten reducir estos requiere etapas de cultivo de tejidos y métodos
valores, a través de la expresión directa en te- de transformación eficientes, que por lo gene-
jidos comestibles o la acumulación en tubércu- ral insumen un tiempo considerable.
los o semillas. Las perspectivas de aumentar La transformación nuclear presenta la venta-
aún más los niveles de expresión (que se fa- ja de contar con protocolos de transformación
brique una mayor cantidad de la proteína de establecidos para muchas especies vegetales,
interés en los tejidos vegetales) y el desarrollo la desventaja es que debido a efectos de posi-
de técnicas más económicas de purificación, ción y/o silenciamiento génico, muchas veces
permitirán producir proteínas recombinantes a los niveles de expresión alcanzados no son lo
costos entre 10 y 100 veces inferiores a los de suficientemente altos como para hacer viable
los fermentadores bacterianos. la producción.
Resumiendo lo expuesto, para que la pro- La transformación de cloroplastos (organe-
ducción de proteínas recombinantes en plan- la característica de las células vegetales que
tas sea económicamente rentable es necesa- contiene su propio genoma) ha resultado ser
rio cumplir con tres requisitos primordiales: a) una alternativa muy interesante para la ex-
alcanzar altos niveles de expresión, b) reducir presión de proteínas por numerosas ventajas,
los costos de purificación, y c) lograr un pro- entre ellas, el gran número de cloroplastos por
ducto de características idénticas o similares al célula y el gran número de copias de su ma-
sintetizado en el sistema nativo (autenticidad). terial genético dentro de cada cloroplasto, lo
que permitiría alcanzar altos niveles de expre-
Estrategias para la optimización de la sión. La inserción al genoma ocurre mediante
producción recombinación homologa, permitiendo dirigir al
La optimización de los niveles de producción transgén a un espacio intergénico y, hasta el

momento, no se han reportado en cloroplas- do, inmediatamente después de la cosecha,
tos efecto de posición o silenciamiento génico. para ser transportado para su procesamiento
Más aún, al no transmitirse los cloroplastos al evitando la degradación de las proteínas re-
polen en la mayoría de las plantas, se dificul- combinantes. Al ser el tabaco una planta no
ta el flujo horizontal a especies relacionadas. comestible, presenta la ventaja de no ingresar
La desventaja que posee este sistema es las a la cadena alimentaria (bioseguridad), pero
proteínas sintetizadas en estas organelas no es necesario purificar la proteína para elimi-
pueden ser glicosiladas. nar compuestos tóxicos presentes en la planta
Los sistemas no integrativos, en cambio, no de tabaco tales como alcaloides; no obstante,
requieren de la integración del transgén, son existen variedades de tabaco con bajo conteni-
más rápidos, pero no son heredables a la pro- do de alcaloides.
genie. En este último grupo se encuentran la El uso de cereales como el maíz, permite
transformación transitoria con vectores virales acumular la proteína recombinante en las se-
y la agroinfiltración. Si bien no se presentan en millas, lo que facilita su almacenaje y da fle-
estos sistemas los problemas de baja expre- xibilidad al proceso de producción, ya que se
sión asociados a la posición de integración, sí puede almacenar el grano hasta el momento
existen limitaciones de expresión debido a si- que sea necesario comenzar con el proceso de
lenciamiento post-trancripcional. purificación. La desventaja es que al ser una
Recientemente, mediante el uso de vectores planta comestible podría ingresar involuntaria-
virales de nueva generación, se han logrado mente a la cadena alimentaria.
niveles de expresión muy altos, en un sistema Los sistemas de expresión basados en fru-
denominado “magninfection”. tas y hortalizas, permiten utilizar directamente
el tejido vegetal sin la necesidad de purificar
Elección de la especie vegetal la proteína y realizando solamente una estan-
En cuanto a la especie vegetal, existen dis- darización de los niveles de acumulación de
tintas plantas que han sido utilizadas como la proteína recombinante en el tejido vegetal.
plataforma en los biorreactores, entre las que Esto es de gran utilidad en la producción de va-
se incluyen tabaco, papa, tomate, maíz etc. En cunas orales, anticuerpos que serán utilizados
principio no existe una regla que permita ele- en aplicaciones tópicas y cuando el tejido será
gir la planta ideal para un determinado objeti- utilizado como suplemento dietario. La desven-
vo. Sin embargo, existen factores a tener en taja de estos cultivos es similar a la menciona-
cuenta al momento de decidir cuál será el sis- da para el maíz.
tema elegido. Entre ellos podemos citar: dis- Otra plataforma de producción es la que utili-
ponibilidad de protocolos de transformación y za a las lentejas de agua (Lemna minor). Estas
sistemas de expresión transitorios, facilidad de son plantas acuáticas que se reproducen a un
cultivo a gran escala, rendimiento de bioma- ritmo muy acelerado y se pueden cultivar en
sa, estabilidad de la proteína en los distintos condiciones controladas usando medios cuya
tejidos de la planta, posibilidad de expresar la composición es sencilla y económica. Las pro-
proteína en tejidos comestibles, facilidad de teínas recombinantes pueden ser secretadas
purificación, facilidad de contención del cultivo al medio de cultivo o bien purificadas a partir
y otros aspectos relacionados con la seguridad de la biomasa vegetal.
alimentaria y medioambiental, entre otros. Así Una alternativa al uso de plantas enteras
por ejemplo, la planta de tabaco presenta las como plataformas de expresión es la de utilizar
siguientes ventajas: cuenta con diversos siste- cultivos de células vegetales. Estos sistemas
mas de transformación, permite alcanzar altos permiten una producción en condiciones de
rendimientos (biomasa), existe infraestructura esterilidad y es un sistema contenido. Las pro-
para el procesamiento a gran escala y permite teínas expresadas en suspensiones de células
flexibilidad en el cambio de escala de produc- vegetales en cultivo pueden ser secretadas al
ción. Entre las desventajas podemos citar: el medio de cultivo o retenidas en el interior de la
tejido (hojas) debe ser enfriado o deshidrata- célula.

La tabla 1 muestra algunos de los sistemas tores específicos de un determinado órgano
utilizados y sus principales características. o tejido. La elección de los distintos tipos de
promotores permitirá entonces expresar la pro-
Optimización de los niveles de expresión teína recombinante en todos los tejidos de la
Existen muchas herramientas moleculares planta constitutivamente o sólo cuando uno lo
que permiten optimizar el sistema de expre- determina, mediante la aplicación de un es-
sión, e incluyen: timulo físico o químico externo, permitiendo
• la elección de elementos genéticos reproducir proteínas que podrían ser deletéreas
guladores para expresar la proteína en para la planta. Otra opción sería expresarlas
tejidos vegetales específicos. en aquel ambiente donde la proteína sea más
• la adaptación del uso de codones. estable, mediante el uso de promotores tejido
• la fusión a otras proteínas. específicos.
• la localización de la proteína en distin-
tos compartimentos intracelulares para Destino final de la proteína recombinante
aumentar su estabilidad y/o facilitar su Otros factores a tener en cuenta a la hora
purificación. de decidir una estrategia para la producción de
• la co-expresión de supresores del silen- proteínas en plantas, además de la elección
ciamiento virales para evitar el silencia- de la especie vegetal, es a qué compartimento
miento génico post-transcripcional. de la célula vegetal (citoplasma, retículo en-
Existen distintos tipos de promotores que doplásmico, vacuola, cloroplasto) se dirige su
han sido utilizados, entre ellos promotores acumulación. Si la proteína es inestable en el
constitutivos, promotores inducibles y promo- citosol, es posible agregar un péptido señal en
Figura 1. Rizosecreción en plantas transgénicas. Plantas transgénicas de tabaco que expresan hEGF,
creciendo en medio MS sobre un disco de nitrocelulosa (izquierda), ensayo de root blot realizado sobre
estas membranas y revelado con un anticuerpo anti-hEGF (derecha).
Tomate Consumo crudo de los frutos.

Disponibilidad de promotores específicos para la
expresión en frutos.
Cultivo en invernaderos a escala industrial bien
establecido.
Contenido proteico en frutos relativamente bajo.
Cereales Tecnología de producción ampliamente establecida.
Almacenamiento estable de la proteína recombinante en
las semillas.
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.
Alfalfa Alto contenido proteico en hojas.

Producción de biomasa abundante.
Lemna (lenteja Alta eficiencia de proliferación clonal.
de agua) Alta tasa de duplicación de la biomasa.
Rizosecresión muy eficiente.
Physcomitrella Genoma completamente secuenciado.
(musgo) Transformación por recombinación homologa.

su extremo N-terminal para que sea transpor-
tada al retículo endoplasmático; de no contar
con otra señal la proteína seguirá su camino
y luego de pasar por el Golgi será enviada al
espacio intercelular o espacio apoplástico. Si
posee la señal de retención (H/KDEL), la pro-
teína será entonces retenida en retículo y se
evita así que se produzcan las glicosilaciones
más complejas que ocurren en el Golgi. Alter-
nativamente, se puede agregar además del
péptido de envío a retículo, señales para que
el destino final sean las vacuolas. Finalmente,
se pueden expresar las proteínas en el cloro-
plasto (plantas transplastómicas) o dirigirlas
desde el citosol a los cloroplastos utilizando
señales amino-terminales adecuadas como,
por ejemplo, la de la subunidad pequeña de la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa Figura 1. Rizosecreción en plantas transgénicas.
(Rubisco). Existen publicaciones que muestran Plantas transgénicas de tabaco que expresan
hEGF, creciendo en medio MS sobre un disco de
variaciones muy significativas en los niveles de
nitrocelulosa (izquierda), ensayo de root blot rea-
expresión de una determinada proteína en di-
lizado sobre estas membranas y revelado con un
ferentes compartimentos. De ellas se deduce anticuerpo anti-hEGF (derecha).
la necesidad de enviar la proteína recombinan-
te a aquel espacio intracelular donde alcance
un correcto plegamiento y, en consecuencia,
mejores niveles de expresión al evitar los me- semillas, raíces, suspensiones celulares). La
canismos de proteólisis destinados a recuperar elección influirá en el mejoramiento de los ni-
aminoácidos de proteínas mal plegadas. veles de expresión, ya sea permitiendo obtener
Por ejemplo, la expresión de hEGF (factor de una mayor estabilidad y/o mejores condiciones
crecimiento epidérmico humano) en tabacos para su almacenamiento y así evitar su degra-
transgénicos es 10.000 veces mayor en apo- dación.
plasto que en citoplasma. El aumento consi- De todo lo expuesto se desprende que las
derable de los niveles de expresión, al dirigir plantas pueden constituir un sistema con nu-
la expresión de hEGF al espacio intercelular merosas ventajas frente a otros sistemas
(apoplasto), probablemente se deba a que al disponibles para la producción de proteínas
transitar a través del sistema de secreción pa- recombinantes de aplicación terapéutica o in-
sando por retículo, pueden formarse correcta- dustrial. Aunque para cada proteína en parti-
mente los puentes disulfuro presentes en esta cular se deban evaluar distintas alternativas
proteína que son necesarios para alcanzar su hasta encontrar aquella en la que los niveles
conformación más estable. Finalmente, la pro- de expresión sean óptimos, es de esperar que
teína es secretada al medio que rodea a las a corto plazo la utilización de las plantas como
raíces (rizosecreción), hecho que permitiría pu- biorreactores sea la opción más atractiva.
rificar hEGF recombinante del medio de cultivo
en el cuál se encuentran inmersas las raíces Estrategias para reducir los costos de
de plantas transgénicas creciendo en un siste- purificación
ma hidropónico (figura 1). Una estrategia comúnmente utilizada para
Por último, otro factor a tener en cuenta a la reducir los costos de purificación consiste en
hora de plantear una estrategia de expresión acumular la proteína sintetizada en el espacio
de proteínas heterólogas en plantas, es el te- extracelular o apoplasto. El envío al espacio
jido u órgano de la planta en cuál ha de acu- extracelular se logra fusionando el extremo
mularse dicha proteína (hojas, tubérculos, correspondiente al amino terminal del gen de

interés a una secuencia señal que dirige el Autenticidad del producto obtenido:
transporte de la proteína al retículo endoplas- glicosilación
mático y de allí a la vía de secreción. Estos Muchas proteínas terapéuticas son glico-
tipos de péptidos señal se hallan ampliamente proteínas, en las cuáles la glicosilación puede
conservados en su función y son procesados afectar características fundamentales, como
en forma co-traduccional por una peptidasa su resistencia a la desnaturalización térmica,
específica presente en el lumen del retículo degradación proteolítica, solubilidad y activi-
endoplasmático. El apoplasto vegetal está en dad biológica.
contacto directo con el medio externo, de ma- Una de las diferencias más importantes en
nera tal que si la raíz está creciendo en un las modificaciones post-traduccionales entre
sistema hidropónico, la proteína recombinante plantas y animales es el patrón de N-glicosi-
se acumulará en el medio. Como el número de lación. Las proteínas recombinantes humanas
proteínas secretadas es generalmente bajo, sintetizadas en plantas contienen grupos car-
esto facilita el proceso de purificación. Si la bohidratos del tipo β (1,2)-xilosa ausente en
solución que circula en torno a la rizósfera se proteínas humanas, y contienen una molécula
renueva constantemente, puede desarrollarse de fucosa unida por un enlace del tipo α (1,3)
así un sistema de extracción continua de la en lugar de α (1,6) como ocurre en humanos.
proteína en cuestión. Además, carecen de residuos terminales de
Otra estrategia que permite reducir los cos- galactosa y ácido siálico (ácido N-acetilneura-
tos de purificación se basa en la fusión de la nímico) encontrados en muchas proteínas na-
proteína de interés a una oleosina. Las oleosi- tivas humanas.
nas son proteínas pequeñas que se encuen- Aunque algunos trabajos han demostrado
tran insertadas en la monocapa de fosfolípi- que anticuerpos expresados en sistemas ve-
dos de los cuerpos grasos. Estas proteínas getales conteniendo glicanos específicos de
se acumulan en las semillas de las plantas plantas no son inmunogénicos en mamíferos,
oleaginosas a niveles elevados. En colza, re- y que las proteínas recombinantes expresadas
presentan entre el 8 y el 20% del total de las en otros sistemas animales (incluyendo células
proteínas de la semilla. Las construcciones en cultivo de mamífero como las CHO) presen-
incluyen una secuencia de reconocimiento estan diferencias en los patrones de glicosilación
pecífica para una proteasa. Una vez realizada respecto del humano, el uso terapéutico segu-
la purificación, la proteína de interés se resca- ro impone producir proteínas con las mismas
ta de la fusión por tratamiento con la proteasa características.
que reconoce esta secuencia peptídica. Por ello, se ha dedicado un gran esfuerzo en
La purificación de la proteína fusionada a diseñar estrategias que permitan la “humaniza-
oleosinas es sumamente sencilla y permite ción” de la glicosilación de las proteínas sinte-
concentrar varias veces el producto de inte- tizadas en plantas. Estas estrategias incluyen:
rés. Básicamente, consiste en el procesado y a) expresión de la β(1,4)-galactosiltransferasa
homogeneización del material vegetal (semi- humana en plantas transgénicas para la pro-
llas de la planta oleaginosa) seguido de una ducción de anticuerpos recombinantes con
centrifugación en la que se separan la fase glicanos extendidos en galactosa; b) retención
acuosa de la lipídica. Esta última, que contie- de la proteína en el retículo endoplásmático
ne los cuerpos grasos con la proteína de fu- (la diferenciación en los patrones de glicosila-
sión es separada, resuspendida y tratada con ción entre plantas y mamíferos ocurren a nivel
la proteasa que reconoce la secuencia que del aparato de Golgi, ver figura 2); c) inactiva-
permite liberar la proteína recombinante. La ción de la α(1,3)-fucosiltransferasa y la β(1,2)-
suspensión es luego centrifugada para sepa- xilosiltransferasa de plantas. Esto último ha
rar nuevamente la fase acuosa de la lipídica. sido logrado recientemente en Lemna minor
La proteína de interés se concentra así en la mediante silenciamiento post-transcripcional y
fase acuosa, la cual se utilizará para su purifi- en el musgo Physcomitrella patens mediante el
cación posterior. apagado o knock-out del gen en cuestión. Al-

Figura 2. Adición y procesamiento de N-glicanos en el retículo endoplásmico (ER) y aparato de Golgi en
células vegetales y de mamíferos. Un oligosacárido precursor ensamblado en un transportador de lípidos
es transferido a residuos Asn específicos en el polipéptido en síntesis. Durante los eventos de maduración
tardíos en el Golgi, se generan diferencias en el procesamiento de los N-glicanos complejos entre células
animales y vegetales.
ternativamente, se puede d) prevenir comple- las vacunas en muchas regiones geográficas

tamente la glicosilación inactivando los sitios del mundo. Sin embargo, no se puede obviar
de glicosilación al mutar los residuos Asn y Ser/ el principal desafío en la producción de una
Thr. Esta estrategia fue utilizada en la produc- vacuna que todo sistema de producción debe
ción de anticuerpos y se pudo comprobar que enfrentar; esto es, que el antígeno debe con-
la ausencia de glicosilación no modifico sus ca- servar su integridad estructural y actividad fun-
racterísticas biológicas. cional para inducir una respuesta inmune pro-
tectora. Es importante mencionar que, dada la
Proteínas expresadas en plantas: necesidad de aplicar dosis controladas de los
vacunas, anticuerpos y otros ejemplos compuestos farmacológicos, se plantea la pro-
Una de las aplicaciones más prometedoras ducción de cápsulas con tejido vegetal proce-
de las plantas como biorreactores es su po- sado en lugar del consumo de material vegetal
tencial uso para la producción de antígenos en fresco sin procesar.
tejidos comestibles (vacunas comestibles). La Hasta la actualidad, se han expresado en
producción de proteínas antigénicas en los te- plantas un número considerable de antígenos,
jidos vegetales permitiría protegerlas de la de- que incluyen potenciales vacunas contra los
gradación en el tracto gastrointestinal, un factor agentes causales de diarreas, como los rota-
crítico para desarrollar una vacuna oral exito- virus, cepas enteropatogénicas de Escherichia
sa. A su potencial bajo costo de producción, se coli, Vibrio cholerae y el virus Norwalk, así
suma la ventaja de su fácil distribución y admi- como contra las infecciones producidas por los
nistración. La expresión en tejidos de almace- virus de la hepatitis B y C, el virus de inmuno-
namiento (tubérculos o semillas, por ejemplo) deficiencia humana (HIV), el virus del papiloma
en los que las proteínas son estables a tempe- humano, el virus de la rabia y el virus de la fie-
ratura ambiente, permitiría obviar la necesidad bre aftosa. También se ha reportado la expre-
de mantener una cadena de frío, requerimiento sión de antígenos para vacunas contra agen-
que constituye una de las limitaciones econó- tes patógenos bacterianos como Staphylococ-
micas más importantes para la distribución de cus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Baci-

llus anthracis y el parásito responsable de la con la variante tradicional de producción a par-
malaria, Plasmodium falciparum, entre otros. tir de líquido ascítico de ratón, la obtención del
Algunos de estos antígenos ya se evaluaron anticuerpo en plantas de tabaco transgénicas,
en ensayos clínicos en humanos, incluyendo que crecen en condiciones de invernadero,
la inmunización por ingestión de hojas de le- ofrece ventajas tales como un mayor nivel de
chuga que contienen al antígeno de superficie seguridad y mejor escalado industrial.
del virus de la hepatitis B humana (HBsAg), tu- Además de los antígenos y anticuerpos,
bérculos de papa que expresan la subunidad B existen diversos ejemplos de proteínas de
de la toxina de E. coli enteropatogénicas, o la uso farmacológico e industrial expresadas en
cápside del virus Norwalk, y hojas de espinaca tejidos vegetales. La producción de somato-
que protegen contra la rabia. En todos ellos se tropina humana (hST) en semillas de tabaco,
observó algún tipo de respuesta inmune, tanto la seroalbúmina humana (HSA) en papas, la
sistémica como en mucosas, alentando la po- aprotinina bovina en semillas de maíz, y el fac-
sibilidad de desarrollar vacunas orales contra tor estimulante de granulocitos y macrófagos
éstos y otros patógenos humanos. Reciente- (hGM-CSF) en semillas de tabaco son sólo
mente la empresa DowAgroScience obtuvo la algunos de ellos. También se puede destacar
aprobación, en los Estados Unidos de America, la expresión en tabaco de la lipasa gástrica
para comercializar una vacuna contra el virus canina, utilizada para el tratamiento de insufi-
de la enfermedad de Newcastle, producida en ciencias pancreáticas y fibrosis quística, que
células de tabaco cultivadas in-vitro. Si bien se encuentra en la etapa de ensayos clínicos.
esta vacuna no ha sido introducida al mercado, Un ejemplo de desarrollo local en nuestro labo-
es considerado un paso importante que puede ratorio es la expresión del factor de crecimien-
ser utilizado como referencia para futuras libe- to epidérmico humano (hEGF) en plantas de
raciones comerciales. tabaco. El hEGF es un factor mitogénico que
Otros ejemplos de proteínas terapéuticas ex- interviene en el desarrollo, diferenciación, re-
presadas exitosamente en plantas incluyen los paración y protección de tejidos epiteliales. Se
anticuerpos que reconocen al antígeno de su- emplea para el tratamiento de heridas y que-
perficie del virus de la hepatitis B humano (HB- maduras, como agente reparador en transplan-
sAg), a la glicoproteína B del virus del herpes tes de córnea y para el tratamiento de úlceras
simple humano de tipo 2, HSV-2, anticuerpos gástricas y otras afecciones gastrointestinales.
anti-esperma para su utilización como anticon- También se están utilizando plantas como bio-
ceptivos, anti-idiotipos del linfoma no Hodkins rreactores para la producción de enzimas de
y reactivos para diagnóstico del HIV. Dentro de uso industrial, como la avidina de pollo y la
esta clase de moléculas cabe destacar el caso tripsina bovina producidas en semillas de maíz
de una IgA (inmunoglobulina A) secretoria ex- (ambas aprobadas para su comercialización),
presada en tabaco que reconoce un antígeno suplementos alimenticios como la fitasa del
de Streptococcus mutans, el principal agente hongo Aspergillus niger en semillas de tabaco
causal de la caries dental. En ensayos clíni- y colza, o polímeros como el colágeno, la seda
cos llevados a cabo en humanos, en los que de araña y plásticos biodegradables. Además
se aplicó este anticuerpo en forma tópica luego de las empresas mencionadas, existen otras
del tratamiento con un antiséptico, se verificó que están utilizando distintas plataformas y sis-
una protección efectiva y específica contra la temas de expresión para producir proteínas re-
recolonización por S. mutants durante al me- combinantes en plantas, como se muestra en
nos cuatro meses. Recientemente el Centro la tabla 2.
de Ingeniería Genética y Biotecnología de La
Habana, Cuba, ha logrado producir en plantas Marco regulatorio
transgénicas de tabaco un anticuerpo mono- El uso de plantas como biorreactores enfren-
clonal que esta siendo utilizado para la purifi- tará dos marcos regulatorios diferentes: uno
cación de un antígeno para la producción de relacionado con el de las plantas transgénicas,
vacuna contra la hepatitis B. En comparación y el otro el que tiene que ver con el desarrollo

Tabla 2. Algunas compañías que utilizan plantas como sistema de expresión.
Compania Plataforma Tecnología utilizada
SemBioSys Genetics Cártamo Transgénicas

Biolex Therapeutics Lemna Transgénicas
Meristem Therapeutics Maiz Transgénicas
Ventria Bioscience Arroz Transgénicas
Cobento Arabidopsis Transgénicas
Planet Biotechnology Tabaco Transgénicas
Down Agro Science Células de Tabaco Transgénicas
CIGB (Cuba) Tabaco Transgénicas
Chlorogen Tabaco Transplastómicas
Bayer (Icon Genetics) Tabaco Vectores Virales
de nuevos fármacos. El primero es más cono- Lecturas recomendadas

cido y existen antecedentes en nuestro país,
el último marco aún esta siendo desarrollado Bock, R. 2007. Plastid biotechnology: prospects
en varios países del mundo y no existen por for herbicide and insect resistance, metabolic
el momento pautas definitivas dado el bajo nu- engineering and molecular farming. Curr Opin
mero de productos derivados de plantas trans- Biotechnol 18:100-106.
Chadd H. and Chamow S. 2001. Therapeutic
génicas que han pasado por todas las etapas
antibody expression technology. Current Opinion
hasta llegar a su comercialización. in Biotechnology, 12:188-194.
Los primeros cultivos transgénicos tienen Daniell H., Streatfield S. and Wycoff K. 2001. Medical
como objetivo el de mejorar características molecular farming: production of antibodies,
agronómicas tales como tolerancia a herbici- biopharmaceuticals and edible vaccines in plants.
das y resistencia a insectos, o mejorar las cua- Trends in Plant Science, 6: 219-226.
lidades nutricionales; en ambos casos el desti- Daniell, H. 2006. Production of biopharmaceuticals
no de estos cultivos es la alimentación animal and vaccines in plants via the chloroplast genome.
o humana. En cambio, las plantas que serán Biotechnol J 1:1071-1079.
utilizadas como biorreactores para la produc- Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P.
and Twyman R. 2004. Plant-based production
ción de fármacos no deberían entrar a la cade-
of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant
na alimenticia y será necesario tomar las pre- Biology, 7:152-158.
cauciones necesarias para que esto no ocurra. Floss D., Falkenburg D. and Conrad U. 2007.
Ésta, junto con la posibilidad de transferencia Production of vaccines and therapeutic antibodies
horizontal de los transgenes, son las mayores for veterinary applications in transgenic plants: an
preocupaciones en lo que hace al uso de las overview. Transgenic Res 16:315-332.
plantas como biorreactores. Giddings, G. 2001. Transgenic plants as protein
En nuestro país, la Comisión Nacional de factories. Current Opinion in Biotechnology,
Biotecnología Agropecuaria (CONABIA), el 12:450-454.
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Ali- Gomord V, Chamberlain P, Jefferis R and Faye L.
2005. Biopharmaceutical production in plants:
mentaria (SENASA) y la Administración Nacio-
problems, solutions and opportunities. Trends
nal de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Biotechnol, 23:559–565.
médica (ANMAT) serán los organismos que Gomord V. and Faye L. 2004. Posttranslational
tendrán a su cargo la regulación de estos cul- modification of therapeutic proteins in plants.
tivos destinados a la producción de fármacos. Curr Opin Plant Biol, 7:171–181.

Lienard D., Sourrouille C., Gomord V. and Faye Twyman R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. and
L. 2007. Pharming and transgenic plants. Fischer R. 2003. Molecular farming in plants: host
Biotechnology Annual Review, 13:115-147. systems and expression technology. Trends in
Ma J., Drake P., and Christou P., 2003. The production Biotechnology, 21: 570-578.
of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Twyman R.M., Schillberg S., Fischer R. 2005.
Nature Reviews Genetics, 4: 794-805. Transgenic plants in the biopharmaceutical
Maliga P. 2004. Plastid transformation in higher market. Expert Opin. Emerg. Drugs 10, 185–218
plants. Annu. Rev. Plant Biol., 55:289-313. Walsh G and Jefferis R. 2006. Post-translational
Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk modifications in the context of therapeutic proteins.
V and Gleba Y. 2005. Systemic Agrobacterium Nat Biotechnol, 24:1241–1252.
tumefaciens-mediated transfection of viral Wirth S., Calamante G., Mentaberry A., Bussmann
replicons for efficient transient expression in L., Lattanzi M., Barañao L. and Bravo-Almonacid
plants. Nat Biotechnol, 23:718-723. F. 2004. Expression of active epidermal growth
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Genoma España. Sector Agroalimentario. http:// non-integrative systems. Mol. Breeding, 13: 23-35.
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and reality. Drug Discov Today 14:16-24.
Spok A., Twyman R., Fischer R., Ma J. and Sparrow
P. 2008. Evolution of a regulatory Framework
for pharmaceuticals derived from genetically
modified plants. Trends in Biotechnology 26:506-
517

PARTE VI
Manejo responsable
de la tecnología

VI. CAPÍTULO 1 cripto las más recientes, que se suman a otras,
utilizadas durante siglos con el mismo fin.
La aplicación de las técnicas de ADN re-
Bioseguridad y Regulación de combinante al mejoramiento vegetal en la
Organismos Vegetales década de 1980, sin embargo, marcan un
Genéticamente Modificados punto de inflexión, dada las preocupaciones
que ham generado en diferentes ámbitos y
(OVGM) posteriormente, también debido a su impac-
to en la percepción pública, en especial en la
Clara Rubinstein Unión Europea.
El National Research Council de los EEUU,
Criterios Científicos para la Evaluación publicó en 1989 un informe en el cual analiza
de la Bioseguridad de Organismos las diferencias entre el mejoramiento tradicio-
Genéticamente Modificados. nal y las nuevas biotecnologías para la modifi-
La plasticidad intrínseca de los genomas cación genética de plantas y microorganismos.
vegetales les confiere una alta adaptabi- En este informe, se incluye a las tecnologías
lidad a las plantas, y es fuente de un alto de ADN recombinante como parte integran-
potencial de variabilidad genética. Las tec- te de la secuencia de los avances del cono-
nologías de mejoramiento de variedades cimiento y de la tecnología científica, a lo
tradicionalmente utilizadas trabajan sobre largo de 10.000 años de desarrollo humano.
esta base, e introducen diferentes tipos de (NRC, 1989, ver Fig 1). También concluyen en
modificaciones genéticas, que actualmente que “Las mismas leyes físicas y biológicas go-
están siendo identificadas y caracterizadas biernan la respuesta de los organismos modifi-
en detalle. cados por los modernos métodos moleculares
Las tecnologías de ADN recombinante y celulares y aquellos producidos por métodos
se han sumado a las de mejoramiento con- clásicos”
vencional durante los últimos 30 años. Sin Al mismo tiempo, organismos internaciona-
embrago, presentan características propias les como FAO y OMS (la Organización para
que se han considerado lo suficientemen- la Alimentación y la Agricultura y la Organiza-
te novedosas a nivel de las organizaciones ción Mundial de la Salud, respectivamente), se
internacionales que han recomendado su han ocupado de la bioseguridad de las nue-
regulación. Las características de un orga- vas tecnologías aplicadas a la producción de
nismo vegetal genéticamente modificado
(OVGM) son estudiadas y evaluadas desde
las etapas más tempranas de su desarrollo
desde el punto de vista de su bioseguridad.
Para ello, se utiliza un Enfoque Comparati-
vo, descripto por primera vez en el contexto
de los OVGM, en un documento de la OECD
(Organización para la Cooperación y el De-
sarrollo Económico) de 1993. Este enfoque,
así como los criterios científicos utilizados
para su implementación, son presentados
en este capítulo, con énfasis en la inocuidad
para el consumo
A lo largo de la historia, los mejoradores han
apelado a todo tipo de tecnologías para generar Figura 1. Aumento en la capacidad de modificación
diversidad genética, de la cual poder seleccio- genética a través del tiempo
nar aquellas características deseadas. En los Fuente: Informe de Expertos del IFT (2000), adap-
capítulos y secciones anteriores se han des- tado de NRC, 1989

alimentos. Asimismo, el Codex Alimentarius dos seguros , por su historia de uso y expe-
(FAO-OMS) ha desarrollado recomendaciones riencia, aún cuando pudieran contener tóxicos
generales para la evaluación de la inocuidad. naturales o anti-nutrientes . En principio, los
Como se mencionó anteriormente, todas alimentos se han considerado seguros, a me-
las especies mejoradas por el hombre, son de nos que un peligro significativo se haya podido
un modo u otro, “genéticamente modificadas”. identificar”
A pesar de esto, la aplicación de las técnicas En este capítulo, se intentará dar un pano-
de ingeniería genética a la producción de ali- rama de los criterios científicos que se utilizan
mentos ha sido considerada lo suficientemente internacionalmente para evaluar la seguridad
nueva y diferente, como para justificar el con- de los cultivos transgénicos, también llamados
trol de su desarrollo e implementación. genéricamente OGM (Organismos Genética-
Esto tiene sus antecedentes en las primeras mente Modificados).
etapas del desarrollo de la ingeniería genética,
en los años 70. En 1974 y 1975, los Institutos 1. El análisis de riesgos y la identificación
Nacionales de Salud de los EEUU (NIH) convo- del peligro
can a las Conferencias de Asilomar (Califor- Se ha establecido que el análisis de riesgos,
nia); este fue el primer paso para la creación de consta de tres etapas fundamentales:
políticas para el control de la seguridad de or- La identificación del peligro : es la identi-
ganismos recombinantes. Desde allí, y en todo ficación y cuantificación de un efecto adverso,
el mundo, han evolucionado estas políticas y en general a partir de ensayos experimentales,
las regulaciones que controlan el desarrollo de por ejemplo de tipo toxicológico, en modelos
nuevos organismos y sus productos mediante animales.
técnicas de ADN recombinante. Valoración de la exposición: estimar cuán-
Estas regulaciones, se basan en criterios to, con qué frecuencia y durante cuánto tiempo
científicos y también empíricos, en particular, se está expuesto a dicho peligro.
en lo que hace a la seguridad de los alimentos. Caracterización del riesgo: es la estima-
Aunque los alimentos tradicionalmente dispo- ción que surge de evaluar el peligro en función
nibles en las diferentes culturas se aceptan de la exposición y evaluar diferentes escena-
como seguros, se sabe que algunos pueden rios de exposición máxima, para establecer
ser tóxicos, según la parte de la planta que se qué grado de exposición es aceptable en cuan-
consuma (por ejemplo el tallo se puede consu- to a la seguridad.
mir, pero no así las hojas o las raíces) o el es-
tadío de su desarrollo (papas verdes). También Este proceso se aplica a casos muy diferen-
hay alimentos de origen vegetal que deben ser tes, y existe amplia experiencia en su aplica-
cocinados para ser seguros (por ej. legumbres), ción a la evaluación de riesgos para aditivos
así como sabemos que hay grupos de alimen- alimentarios, agroquímicos y compuestos es-
tos que pueden provocar alergias en individuos pecíficos en general. En esos casos, es rela-
sensibles (maní, leche, nueces, huevo, soja). tivamente simple someter cantidades exac-
En 1986 la OECD (Organización para el tas y conocidas de un compuesto a ensayos
Desarrollo y la Cooperación Económica) con- toxicológicos clásicos en modelos animales, o
voca a reuniones de expertos que reúnen sus evaluaciones de residuos en alimentos, aguas,
recomendaciones en el llamado “Blue Book”. suelos, etc. De esta forma, se establecen pa-
Más adelante, en 1993, OECD resumió estos rámetros como el NOAEL (por No Adverse
conceptos: “La seguridad de los alimentos para Effect Level), que es el nivel de exposición
consumo humano se basa en que debe existir en el que no se observan efectos adversos.
una certeza razonable de que no resultará Este da una medida de la peligrosidad del com-
daño alguno del uso debido bajo las condicio- puesto: cuanto mayor el NOAEL, menor el
nes de consumo anticipadas. Históricamente, potencial tóxico del compuesto. Basándose
los alimentos preparados y utilizados bajo las en el NOAEL, es posible estimar un nivel de
condiciones tradicionales han sido considera- exposición seguro, que define el ADI (dosis

diaria aceptable, expresada por kg de peso Es oportuno aclarar que estas técnicas no en
corporal) y que dependiendo del tipo de sus- todos los casos van a tener como resultado la
tancia y otras variables, suele estar unas 100 expresión de un transgén, sino que hay otras
veces por encima del NOAEL. Este factor de estrategias experimentales - silenciamiento
multiplicación se conoce como margen de se- mediado por RNA de interferencia o anulación
guridad para la exposición. de la actividad de un gen por “knock out” - que
Sin embargo, estos principios no son tan si bien involucran manipulación in vitro y trans-
directamente aplicables al análisis de riesgos formación, no resultan en la adición de un gen
para OVGMs o sus derivados de uso alimenta- y/o una proteína nuevos.
rio, ya que constituyen mezclas complejas, que La base de esta estrategia para estable-
contienen miles de compuestos, macro y micro cer inocuidad de nuevos alimentos es la
nutrientes, tóxicos naturales(compuestos tóxi- historia de uso seguro del cultivo parental
cos que están naturalmente presentes en la (es decir aquel que es la base de la modifi-
especie), antinutrientes (compuestos que inhi- cación) .
ben la absorción o biodisponibilidad de algunos
nutrientes), metabolitos secundarios, etc. -Qué se compara y por qué
Por lo tanto, la evaluación de estos cultivos Es claro que toda modificación tiene un ob-
es más una evaluación de seguridad o ino- jetivo, ya sea obtener una mejora de tipo agro-
cuidad más que un análisis de riesgos “clási- nómica como resistencia a plagas o enferme-
co”, ya que hasta ahora no se han determinado dades, una mejora nutricional o de calidad o
peligros cuantificables en los OGMs estudia- bien la síntesis de un producto en particular,
dos. De hecho, en la práctica, en caso de iden- desde un fármaco hasta biocombustibles, pa-
tificarse efectos adversos, estos cultivos no se sando por vacunas comestibles. Es decir, que
autorizarían para su salida al mercado. la modificación tiene efectos intencionales
Por todo lo anterior, se ha desarrollado para medibles, que se traducen en una carácterís-
los OGMs un enfoque que ha sido utilizado tica fenotípica dada.
para otros casos de alimentos y que se basa Por otro lado, es posible que se produzcan
en la comparación del nuevo alimento o efectos no intencionales de la modificación,
cultivo con el tradicionalmente utilizado y que pueden o no tener un impacto negativo en
considerado seguro. Este enfoque se ha de- la seguridad de la planta modificada, pero que
sarrollado consensuadamente con la colabora- es pertinente estimar. Y es aquí donde el análi-
ción de diferentes organismos internacionales sis comparativo tiene un papel relevante.
(OECD, FAO ,OMS, International Life Sciences Los impactos no deseados de la introducción
Institute o ILSI) que periódicamente convocan de un gen o secuencia en el genoma de una
a paneles de expertos que revisan y actualizan planta, comprenden diferentes aspectos que
las recomendaciones de acuerdo a los avan- son examinados durante el proceso de evalua-
ces tecnológicos y el estado del conocimiento. ción:
• Toxicidad o alergenicidad de la(s) proteí-
2. El Enfoque Comparativo y la nas expresadas
Equivalencia Sustancial • Influencia de los productos de expresión
En 1993 la OECD formuló el concepto de sobre el metabolismo de la planta, que
Equivalencia Sustancial. Este concepto no lleve a cambios en el valor nutricional o
constituye en sí la evaluación de inocuidad, la concentración de tóxicos o alérgenos
aunque es un elemento clave de referencia, naturales.
y una conclusión posible a la que lleva el • Inserción no intencional en otros genes
análisis comparativo. Este enfoque no hace (“knock out” no intencional) que sean
otra cosa que tomar como referencia los culti- esenciales o activación de otros, que no
vos o alimentos conocidos y aceptados como se expresen normalmente.
seguros y compararlos con sus versiones me- • Efectos pleiotrópicos de los genes inser-
joradas mediante ingeniería genética. tados (efectos sobre la actividad de otros

genes o vías metabólicas, que se mani- nes es demostrar que el cultivo o alimen-
fiesten a diferentes niveles en el fenotipo to GM es "tan seguro como" el alimento
de la planta). tradicional conocido (Figura 2).
Es importante tener en cuenta que estos La evaluación de inocuidad de las proteínas
efectos también pueden producirse durante el de nueva expresión, así como del alimento
mejoramiento convencional (definido como el completo, se fundamenta en lo que se denomi-
que no utiliza ingeniería genética), si bien los na el “Peso de la Evidencia”. Este concepto
cultivos mejorados mediante tecnologías no se basa en el hecho de que no existe un solo
recombinantes no se someten por el momen- estudio o ensayo que pueda establecer la ino-
to, a este tipo de evaluación, con la excepción cuidad. Por ejemplo, en el caso del potencial
de Canadá, que sí regula algunos casos espe- alergénico de una proteína, no es posible hoy
ciales. La normativa canadiense, evalúa aque- contar con modelos que predigan adecuada-
llas variedades con rasgos suficientemente mente la alergenicidad en humanos. Dado que
novedosos, independientemente del proceso existe una serie de parámetros fisicoquímicos
utilizado para su obtención, si bien menciona que son compartidos por los alérgenos pro-
particularmente ciertas metodologías de mejo- teicos conocidos (que son un grupo reducido
ramiento, como la mutagénesis acelerada (inde proteínas de origen animal y vegetal), és-
ducida por agentes químicos o irradiación) o la tos pueden ser utilizados para estimar la po-
fusión celular. sible alergenicidad de la proteína introducida.
Como veremos en detalle a continuación, Por ejemplo, la resistencia a la digestión,
el proceso evaluativo recorre una serie de la prevalencia en el alimento (normalmente,
pasos que se basan en evidencia experi- los alérgenos proteicos son mayoritarios en
mental, y que van llevando a conclusiones que la composición final) y la similitud con otras
permiten tomar decisiones respecto de la ino- proteínas alergénicas, son algunos de estos
cuidad del OGM en cuestión (Ver Figura 3). parámetros. En efecto, se realizan análisis
Las evaluaciones de seguridad, entonces, bioinformáticos que comparan la secuencia
se concentran: de los productos de expresión presentes en
1. en la característica introducida: para los OGMs, contra bases de datos de todos los
ello, se caracteriza completamente el alérgenos conocidos.
gen insertado en el cultivo GM y se eva- En el caso de cultivos con actividad alergéni-
lúa la seguridad de la/s proteína/s resul- ca conocida (como la soja) es posible compa-
tantes. Si bien esta evaluación la deben rar los patrones de proteínas del suero de pa-
realizar los obtentores previamente a la cientes sensibles, que se unen a inmuglobulina
transformación , ya que no será aproba- E (la responsable de las reacciones alérgicas
do un cultivo que pueda presentar algún severas) en análisis de Western sobre geles bi-
problema toxicológico o de alergenici- dimensionales, para determinar si hay nuevas
dad, las agencias regulatorias encarga- proteínas o si el patrón endógeno se ha visto
das del control de estos productos efec- alterado por la modificación .
túan un exhaustivo análisis de seguridad Como ya se dijo, aún no se cuenta con mo-
de los genes insertados y sus productos delos animales que se encuentren lo suficien-
de expresión. temente desarrollados para ser validados a
2. en el cultivo o alimento como un todo: nivel internacional en cuanto a su capacidad
sobre el cultivo GM, se analizan los ras- predictiva de alergenicidad, pero numerosos
gos fenotípicos / agronómicos y la com- organismos e instituciones internacionales se
posición y se los compara con los de sus encuentran trabajando en ello.
contrapartes no-GM o convencionales.
Las diferencias encontradas, ya sean b) En base a los 50 años de experiencia ga-
intencionales o no, se convierten en el nada en mejoramiento tradicional (breeding),
centro de ulteriores evaluaciones de se- y evaluación de seguridad de otros productos
guridad. El objetivo de estas evaluacio- como medicamentos, alimentos, y químicos,

las agencias internacionales recomiendan Se observan y miden cuidadosamente las
comparar los siguientes parámetros de los características morfológicas, fisiológicas, y re-
OGMs respecto de contrapartes convenciona- productivas, la resistencia o susceptibilidad a
les, para poder contar con suficiente informa- plagas y enfermedades, e incluso característi-
ción que permita arribar a una certeza razona- cas como perfume o sabor de los frutos. Este
ble de inocuidad : proceso, que dirige la selección de aquellas
plantas transformadas (o “eventos”) que ten-
-Parámetros fenotípicos: estos son más gan las características deseadas, es crítico
relevantes para la evaluación agronómica del para eliminar efectos no intencionales.
nuevo cultivo. La caracterización fenotípica
/ agronómica del cultivo GM se hace tempra- -Composición Química: esta es la evalua-
namente durante el proceso de selección. Los ción en la que se fundamenta gran parte del
puntos evaluados ( por ej. morfología, rendi- análisis comparativo. Se realiza la determina-
miento) son muy sensibles a los cambios gené- ción analítica de la composición en diferentes
ticos y a las perturbaciones desfavorables en el tejidos de la planta, sobre muestras de ensa-
metabolismo, por lo tanto son buenos indicado- yos a campo controlados, realizados en am-
res de equivalencias entre el cultivo modificado bientes representativos de aquellos donde ese
y su contraparte tradicional. cultivo va a ser sembrado, a lo largo de varias
Figura 2. Esquema general del enfoque comparativo

Figura 3. Diagrama para la estimación de seguridad de OGMs
Adaptado de Cockburn , 2002

campañas de producción (años). Se determi- productos altamente refinados. El aceite
na la composición de macro y micronutrien- o la fructosa derivados de maíz GM, son
tes (proteínas, grasas, hidratos de carbono, totalmente equivalentes a los derivados
aminoácidos y ácidos grasos, vitaminas, etc), de maíz convencional.
minerales, tóxicos naturales y compuestos • El cultivo o alimento GM es sustancial-
bioactivos y/o metabolitos secundarios, mente equivalente a su contraparte
dependiendo del cultivo. Por ejemplo, se miden tradicional con la excepción de dife-
niveles de fitoestrógenos y antinutrientes (inhi- rencias claramente definidas (presen-
bidores de tripsina, lectinas) en soja, glucosino- cia de la/s proteínas introducidas y/o
latos en colza, cumarinas en apio y solaninas diferencias bien caracterizadas en otros
en papa. Tambien se pueden medir alérgenos elementos individuales). Dentro de esta
en soja (glicinina), beta carotenos en zapallo, y categoría caen la mayoría de los culti-
gosipol en algodón . La OECD ha publicado re- vos que expresan un rasgo único, tal
cientemente recomendaciones que especifican como la resistencia a herbicidas o la
qué componentes es más apropiado analizar protección contra insectos, y algunos
para cada cultivo en particular. con mejoras nutricionales o de cali-
A parte de la comparación en componen- dad. Para demostrar que los cultivos o
tes específicos, se realizan generalmente, alimentos GM son "tan seguros como" su
ensayos de aptitud nutricional en modelos contraparte tradicional, se debe mostrar
animales. Estos, apuntan a detectar cualquier que cada diferencia encontrada no tiene
efecto no intencional de la modificación que consecuencias toxicológicas ni nutricio-
pudiera haber afectado el valor nutricional nales. Esta evaluación se lleva a cabo
del alimento o su inocuidad. Es común que se caso por caso, y según se considere
utilicen ensayos de alimentación de duración necesario, pueden conducirse ensayos
variable (entre 42 y 120 días) dependiendo de toxicidad o estudios de alimentación
del modelo elegido. Uno de los más utilizados en animales grandes con el cultivo en-
y sensibles, es el de pollos parrilleros, ya que tero.
pasan de pesar 35 gramos a más de 2 kg en • El cultivo o alimento GM no es sustan-
42 días. Este crecimiento rápido, hace que se cialmente equivalente a su contraparte
puedan detectar pequeñas deficiencias nutri- tradicional o no existe un cultivo equiva-
cionales del alimento. lente con el cual compararlo. Ejemplo de
Mientras que la evaluación de seguridad esto serían cultivos con ciertos rasgos
de las proteínas introducidas se lleva a combinados o cultivos con valor nu-
cabo con la proteína (s) purificadas y gene- tritivo aumentado que contienen nue-
ralmente sintetizadas en modelos bacteria- vas vías metabólicas o modifican las
nos (por la cantidad que se necesita para endógenas. La evaluación de seguridad
los ensayos toxicológicos), los estudios se va a enfocar en las características de
de alimentación se realizan con el alimento los nuevos productos expresados. En
completo, por ejemplo, grano o forraje en el cada caso en particular se determinará el
caso de maíz, harinas de soja tostadas, o se- programa de estudios que corresponda .
milla de algodón como suplementación de la Actualmente, todos los cultivos modifica-
dieta . (Ver Tabla 2). dos y sus productos alimentarios derivados
Según los resultados de todos los puntos presentes en el mercado han sido analizados
analizados, es posible clasificar al cultivo o ali- en profundidad para evaluar su seguridad, de-
mento GM en una de estas tres categorías mostrándose que son sustancialmente equiva-
posibles (FAO/OMS/OECD): lentes, con la excepción de la/s proteínas intro-
• El producto GM es sustancialmente ducidas y son tan seguros como su contraparte
equivalente a la contraparte tradicional, tradicional.
no existiendo diferencias significativas. En la Tabla 1, se resume como ejemplo, el
Esta situación se da principalmente en tipo de componentes analizados en diferentes

Tabla 1. componentes analizados en semillas enteras de soja y en varias fracciones de soja procesada
(Tomado del Cuadernillo Técnico No1, Seguridad de la Soja RR tolerante a Glifosato (Monsanto Agricultura
España, 2001)
Soja entera Análisis de macronutrientes

Composición de aminoácidos
Composición de ácidos grasos
Inhibidor de tripsina
Lectinas
Fitoestrógenos
Actividad ureasa
Composición fosfolipídica
Harina tostada Análisis de macronutrientes
Lectinas
Fitoestrógenos
Actividad ureasa
Estaquiosa, rafinosa
Fitato
Solubilidad del nitrógeno
Harina desgrasada Análisis de macronutrientes
Actividad ureasa
Aislado de proteínas Análisis de macronutrientes
Concentrado de proteínas Análisis de macronutrientes
Aceite refinado, blanqueado y desodorizado Composición de ácidos grasos
fracciones, para la evaluación de seguridad su proceso de aprobación y control. Esta eva-

alimentaria para el evento de soja GM 40-3-2, luación debe basarse en hipótesis de riesgo, y
tolerante a glifosato (ver Parte VIII, capítulo 6). considerar el contexto de las tecnologías que
En la Tabla 2 se listan los diferentes modelos se utilizan con el mismo fin y de tecnologías
animales utilizados para la evaluación de apti- alternativas, en caso de existir.
tud nutricional de OGMs y los parámetros que En los Capítulos 2 y 3 de esta sección, se
se analizan en cada caso. desarrolla este aspecto en mayor detalle, por
a: los cultivos GM estudiados presentan tole- lo que se enunciarán los principales temas en
rancia a insectos (“Bt”) o a herbicidas (glifosa- los que se enfoca la evaluación que se reali-
to, glufosinato) za antes de la introducción de un OGM en los
b: en la mayor parte de los ensayos también agroecosistemas:
se efectuaron análisis de detección del ADN o
de las proteínas introducidas, en leche, hue- Capacidad de convertirse en maleza: en
vos, músculos, hígado, sangre o heces, con caso de que la planta GM tuviera característi-
resultados negativos en todos ellos. cas que la hicieran más resistente a las con-
diciones ambientales, o tuviera mayor poder
3. Evaluación de Impacto Ambiental reproductivo que su contraparte convencional.
La evaluación del impacto ambiental de nue- Posible impacto en especies benéficas o
vos cultivos GM es una parte fundamental de sobre la flora o fauna circundante: es evaluado

Tabla 2. Ensayos de alimentación con OGMs en modelos animales (adaptado de Kuiper et al, 2001, Faust
and Glenn, 2002)
a b
Cultivo GM / fracción Modelo Animal Parámetros analizados
Maiz/grano Pollos parrilleros Ganancia de peso, observaciones
Soja/alimento tostado. Gallinas ponedoras clínicas, ingesta, cal idad de carne,
producción y calidad de huevos,
digestibilidad
Maíz/ silaje/ forraje/ grano Ganancia de peso, ingesta,
Soja/alimento tostado. Vacas (ganado de carne) observaciones clínicas, producción
Soja cruda y calidad de carne, grasa
abdominal.
M aiz/grano Cerdos Ganancia de peso, ingesta,
Soja/alimento tostado. observaciones clínicas, calidad de
carne, contenido graso.
Algodón/ semilla Ganancia de peso, ingesta,
Maiz/grano Vacas lecheras observaciones clínicas, pH
Soja/alimento tostado. rumi nal, producción, calidad y
composición de la leche,
características para producción de
queso.
Maiz/grano Ovejas Digestibilidad
el impacto que el cultivo podría tener en espe- Todos estos puntos son analizados, del mis-
cies propias del agroecosistema. Por ejemplo, mo modo que la inocuidad alimentaria, caso
efectos sobre especies que no son el blanco de por caso. También se estima el cambio que
su actividad en el caso de cultivos GM protegi- podría provocar en el manejo agronómico, la
dos de insectos . introducción de un dado cultivo GM .
Mayor capacidad de cruzarse con plantas El objetivo de las evaluaciones de riesgo am-
de su entorno que la contraparte convencio- biental, es identificar impactos en el ambiente
nal. Incluso en caso de ser idéntica, se eva- (negativos o positivos), cuantificarlos y propor-
lúa cuáles serían las consecuencias de dichos cionar elementos para aquellos que deben ma-
cruzamientos (debido al llamado flujo génico nejar y minimizar estos riesgos, siempre en el
mediado por polen). contexto de la práctica agronómica corriente y
El flujo genético entre poblaciones es un de las tecnologías alternativas disponibles (por
fenómeno natural, responsable de una gran ejemplo, cultivos “Bt”, evaluados en relación
diversidad genética. Para estimar qué peso con las aplicaciones tradicionales de insectici-
puede tener un rasgo nuevo introducido por das químicos, y en el contexto del Manejo In-
ingeniería genética en el flujo génico gene- tegrado de Plagas, como una herramienta más
ral, es importante tener en cuenta qué efec- de control biológico).
to en particular producirá ese gen si se es-
tablece en otra población. Todo esto se exa- 4. Nuevas tecnologías potencialmente
mina en función de la existencia de parientes aplicables a la evaluación de la
silvestres de ese cultivo en la zona donde se lo bioseguridad
quiere introducir. Por ejemplo, en el caso de la Los avances en la tecnología científica de los
soja o el maíz, no existen parientes silvestres últimos años han transformado profundamente
en Argentina, pero sí en México (en el caso de la forma en la que se hace ciencia y se obtie-
maíz) y en China (en el caso de la soja). ne información de los sistemas biológicos. La

enorme capacidad de secuenciación en combi- Conclusión
nación con la bioinformática, han potenciado la El objetivo del análisis de riesgos para or-
identificación y caracterización de genes (Ge- ganismos y/o alimentos derivados del uso
nómica) y el estudio de su función (Genómica de la ingeniería genética (GM), es estimar
Funcional). el impacto que los efectos intencionales y
Otras tecnologías derivadas de las prime- los no intencionales de la modificación, pu-
ras y en constante evolución, se ocupan del dieran tener sobre la inocuidad del alimento
estudio del Transcriptoma, el Proteoma, el o del organismo GM, o sobre su impacto
Metaboloma, que abarcan todos los transcrip- ambiental.
tos, proteinas o metabolitos de una especie , El enfoque utilizado para aplicar este
respectivamente. Hoy se habla de las tecnolo- proceso (el enfoque comparativo), ha sido
gías “ómicas” en referencia global a este tipo consensuado a partir de consultas y discu-
de aproximación. siones a nivel internacional, y se basa en
Paralelamente, estas tecnologías permiten la comparación de parámetros como com-
el desarrollo de nuevos campos de la ciencia, posición, tóxicos naturales o aptitud nutri-
como la Farmacogenómica, la Toxicogenómica cional, con la contraparte convencional que
y la Nutrigenómica, que son versiones “ómi- tiene historia de uso seguro y es aceptado
cas” de las especialidades tradicionales que como alimento inocuo (OECD, 2000).
abordan el mismo problema.
Estas tecnologías hoy se encuentran en Lecturas y sitios sugeridos:
una etapa inicial de generación de enormes
cantidades de datos; sin embargo, el potencial Batista JC, Burachik M y Rubinstein C. 2007.
que presentan a corto y mediano plazo para el Evaluación de inocuidad alimentaria de OGMs:
descubrimiento y la comprensión de procesos Criterios y Recursos para su implementación.
biológicos, no tiene precedentes. United Nations University - ILSI. http://www.
Sin embargo, en el campo del análisis de ilsi.org.ar/contactos/docs_biotecnologia/
riesgo, especialmente en los aspectos toxicoló- Evaluacion_de_inocuidad.pdf
gico y nutricional, aunque sería valioso contar Burks AW, Fuchs RL (1995) Assessment of the
con tecnologías que permitan determinar los endogenous allergens in glyphosate tolerant
and commercial soybean varieties. J Allergy Clin
perfiles bioquímicos de OGMs y sus con-
Immunol 96:1008-1010
trapartes convencionales (profiling), por el
Carpenter J, Felsot A, Goode T., Hammig M,
momento no es posible establecer metodolo- Onstad D, Sankula S. (2002). Comparative
gías validadas que permitan aplicar esta in- Environmental Impacts of Biotechnology-derived
formación al análisis. El problema es que, al and Traditional Soybean, Corn, and Cotton Crops.
penetrar en niveles de resolución tan altos, se Council for Agricultural Science and Technology
encuentran una serie de cambios que incluso CAST: I-189.
son evidentes entre individuos del mismo grupo Cockburn, Andrew (2002). Assuring the safety of
(por ejemplo, individuos de la misma variedad Genetically Modified Foods: the importance
no GM ) en niveles mayores a los que se en- of an holistic, integrative approach. Journal of
cuentran entre un OVGM y su control, debido Biotechnology, 98, 79-106.
a la variabilidad natural. Esta variabilidad, hace FAO/WHO (2000) Safety aspects of genetically
modified foods of plant origin. Report of a
muy difícil poder interpretar de manera clara
Joint FAO/WHO Consultation. World Health
muchos de los resultados que se obtienen, y
Organization, Geneva WHO/SDE/PHE/FOS/00.6
su significación biológica real, para poder sa- Faust, M y Glenn, B. (2002) Animal feeds from Crops
car conclusiones en cuanto a su relevancia en Derived through Biotechnology: Farm Animal
la bioseguridad. Performance and Safety. En: Biotechnology and
Sin embargo, a medida que se avanza en Safety Assessment, 3ra edicion, John Thomas y
el conocimiento de los sistemas biológicos, Roy Fuchs, Elesevier. Capitulo 6.
será posible aplicar nuevas tecnologías a la Glare A, Travis R., Nap JP. 2003. The release
evaluación de la seguridad alimentaria, no of genetically modified crops into the
sólo de OGMs, sino de cualquier alimento. environment. Part II. Overview of ecological risk

assessment. The Plant Journal 33: 19-36. WHO (1995) Application of the principles of
ILSI Allergy and Immunology Institute and substantial equivalence to the safety evaluation
International Food Biotechnology Council of foods or food components from plants derived
(1996) Allergenicity of food produced by genetic by modern biotechnology. Report of a WHO
modification. Crit Rev Food Sci Nutr, vol 36 suppl, workshop. World Health Organization, Geneva.
CRC Press, Boca Raton . WHO/FNU/FOS/95 Wolt J, Keese P, Raybould
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soybeans treated with glyphosate. J Agric Food
Chem 47:4469-4473

Parte VI. Capitulo 2 establecer sistemas para la evaluación de
la bioseguridad de OGMs. Colombia, Chile,
Brasil, Uruguay, Paraguay y Perú, por ejem-
Bioseguridad plo, poseen comisiones técnicas evaluado-
ras, y en algunos de estos países ya se han
Moisés Burachik aprobado la comercialización y el cultivo de
variedades GM. Estos sistemas están siendo
establecidos en muchos otros países, espe-
Bioseguridad de Organismos cialmente apuntando a la implementación del
Genéticamente Modificados - Protocolo de Bioseguridad, también cono-
Marcos Regulatorios cido como Protocolo de Cartagena, vigente
desde Septiembre de 2003. Este protocolo,
firmado en el año 2000 por más de 130 es-
Panorama Internacional tados, regulará los movimientos transfron-
Desde 1986, algunos países como Japón, terizos de OGMs vivos o OVGMs , con el
por ejemplo, se han ocupado de elaborar y objeto de asegurar un nivel adecuado de bio-
desarrollar regulaciones para controlar la seguridad en el comercio internacional y la
entrada en el mercado de productos deriva- conservación de la biodiversidad . Para una
dos del uso de técnicas de ADN recombinan- actualización sobre marcos regulatorios en
te. En ese momento el foco estaba puesto America Latina, ver el listado de sitios reco-
en los ingredientes o aditivos alimentarios mendados.
producidos por microorganismos recom-
binantes, pero a medida que la tecnología Cuáles son los riesgos?
avanzaba y se aplicaba a otros organismos, Uno de los problemas inherentes a la con-
estas reglamentaciones se vieron extendidas cepción de un marco regulatorio para los en-
a plantas y animales modificados. sayos de campo de plantas GM es el de la
Numerosos países en los cinco continen- identificación de los riesgos que deben con-
tes, tienen en este momento un marco regu- siderarse. Esta identificación depende de las
latorio disponible para la evaluación y apro- opciones que se acepten de un conjunto de
bación de OGMs antes de su entrada en el posibilidades y de los valores a proteger. Es-
mercado. tos valores deben ser establecidos por cada
Entre los primeros países que han desa- país, con el aporte de la Sociedad ( cien-
rrollado estos procesos, se encuentran los tíficos, funcionarios, políticos, empresarios ,
países europeos, siendo la Comisión Euro- público en general). Esto es, deben compa-
pea, el órgano de evaluación y control de la tibilizarse criterios sobre lo que se consi-
Unión Europea. En los Estados Unidos, di- deran riesgos aceptables, en un marco de
ferentes agencias están involucradas en es- intereses muy variados.
tas evaluaciones: la Agencia de Alimentos y Por otra parte, si bien la identificación de
Drogas (FDA), la Agencia para la Protección los riesgos se basará en conocimiento cien-
del Medio Ambiente (EPA) y el Departamento tífico disponible ahora, existirá siempre un
de Agricultura (USDA). Canadá y Australia- componente de extrapolación (si bien plau-
Nueva Zelanda, han establecido sus siste- sible) cuando se estimen efectos adversos
mas regulatorios más recientemente (a partir “potenciales”, que es la materia misma y el
de 1993). objetivo del análisis de riesgos.
En cuanto a América Latina, Argentina No obstante estas limitaciones, la evalua-
fue el país pionero en esta materia, con la ción de efectos potenciales de una entidad y
creación de CONABIA en 1991, en el ámbi- sus implicaciones, para verificar y estimar la
to de la Secretaría de Agricultura, Ganade- posibilidad de ocurrencia de un efecto adver-
ría, Pesca y Alimentación . Otros países de so y caracterizar la naturaleza de tal efecto,
la región han comenzado desde entonces a es definible como una actividad científica,

como la ha declarado la Academia de Cien- lerancia a herbicidas, resistencia a insectos u
cias de los EEUU. otras plagas).
III Incremento de la presión de selección,
La Formulación del Problema tal que favorezca un aumento de la tolerancia
En la actualidad, se discute la aplicación de plagas a insumos defensivos actualmente
de la denominada Formulación del Proble- empleados. En el caso de insumos que por ra-
ma, a la evaluación de seguridad ambiental zones ambientales, económicas o de manejo
de OGMs. Este proceso, es el primer paso agrícola, son apreciados por el productor y/o
en la ERA (Evaluación de Riesgo Ambiental) por la Sociedad (p.ej., herbicidas post-emer-
y permite establecer un Marco Conceptual, gentes, productos biodegradables, insecticidas
en el que se consideran los objetivos, el al- biológicos, productos de menor costo, o sin
cance, los objetivos de estudio y las meto- restricciones relacionadas con la propiedad in-
dologías a aplicar, para llegar a plantear un telectual, etc.), el aumento de la tolerancia de
problema explícitamente definido y la aproxi- la plaga al producto es un efecto desfavorable,
mación para su análisis. ya que puede convertir a dicho insumo en inútil
La consistencia y la utilidad de la ERA para en el futuro.
plantas GM puede ser mejorada mediante IV Modificación de las relaciones preda-
una rigurosa formulación del problema, pro- dor-plaga entre insectos, en detrimento de
duciendo un plan de análisis que describa los insectos benéficos. Aquí se incluyen los
escenarios de exposición relevantes y las efectos sobre organismos no-blanco (caso
consecuencias potenciales de estos escena- de cultivos con incorporación de genes de
rios. Una formulación del problema ejecuta- resistencia a insectos). El conocimiento insu-
da adecuadamente, asegura que los resulta- ficiente sobre especies amenazadas de ex-
dos del ERA sean relevantes para la toma de tinción (p.ej., insectos benéficos, sus plantas-
decisiones. refugios, etc.), también es un factor a tener en
Entre las características comúnmente con- cuenta.
V Posibles cambios en los flujos comer-
sideradas cuando se plantean los potencia-
ciales.
les riesgos de las liberaciones de plantas
GM, se pueden mencionar los siguientes
Fundamentos de las normativas -
(muchos de estos puntos son también apli-
Definiciones
cables a nuevas variedades o híbridos desa-
La elaboración y evolución de un marco re-
rrollados convencionalmente):
gulatorio para la bioseguridad de una tecno-
I Pérdida de Diversidad Biológica:
logía novedosa como la biotecnología aplica-
Aquí nos referimos a la pérdida debida a la
da al mejoramiento vegetal, no está exenta
presión del mercado y de los costos sobre los
de dificultades.
productores, induciendo cambios en las prác-
Por una parte está la responsabilidad de
ticas agronómicas (menor uso de herbicidas asegurar la aplicación sustentable de la
e insecticidas) por la utilización (ventajosa) de nueva tecnología, y de preservar al hom-
OGMs, en desmedro de razas locales adapta- bre, la flora, la fauna y el medio ambiente de
das (landraces) empleadas en la actualidad. los potenciales efectos perjudiciales de las
Esto podría producirse si se cultivan OGMs innovaciones, tanto en el presente como en
en la vecindad de centros de origen o de diver- el futuro. Por otra parte, hay razones para
sidad de sus parientes silvestres o de especies no obstaculizar el desarrollo de las in-
sexualmente compatibles, por fenómenos de novaciones biotecnológicas, que ya han
introgresión génica (este riesgo es relativa- demostrado poseer un gran potencial para
mente más importante en el hemisferio Sur). brindar beneficios a la Sociedad. Toda acti-
II Transferencia genética a especies sil- vidad humana (especialmente la innovación
vestres o malezas sexualmente compatibles, tecnológica) implica peligros (riesgos) y por
con el resultado de la formación de híbridos lo tanto requiere la atención (gestión) de su
viables con fenotipos no deseados (p.ej., to- seguridad.

Figura 1. el sistema de regulación y aprobación de OGMs en Argentina
La seguridad se obtiene definiendo, eva- Consideramos una definición aceptable de

luando y gestionando los riesgos asocia- bioseguridad, como la protección de la sa-
dos con la innovación. lud humana y del ambiente con respecto a
Aplicando estos conceptos a la biotecnolo- los riesgos conocidos y/o percibidos de la
gía, que implica el uso de organismos vivos, técnica o proyecto en cuestión, de acuerdo
podemos enfocar el análisis de los ries- al estado actual de nuestros conocimien-
gos de los ensayos hacia los siguientes as- tos. Está implícita en esta definición que una
pectos generales: regulación para la bioseguridad, que significa
• Identificación de los todos organis- una regulación de los riesgos aceptables para
mos involucrados (donantes, recepto- la Sociedad, conlleva una condición de flexibili-
dad y de adaptación permanentes.
res, etc),
• Características de los organismos in-
Para la normativa argentina, un OGM es:
volucrados en la obtención del OGM • un organismo (vegetal, animal, microor-
(familiaridad, patogenicidad, etc) ganismo o virus)
• Manera en que serán utilizados los • en el cual se ha introducido información
OGMs (escala, contención) genética precisa y definida
• en forma deliberada y dirigida a obtener
Características de las zonas y de los un determinado fenotipo
otros organismos (lugares, medio receptor • siendo aquella introducción realizada de
potencial, incluyendo seres humanos) tal manera que dicha información gené-
La normativa argentina ha tomado en consi- tica no podría haber sido adquirida por
deración estos aspectos, entre otros, para ela- ese organismo por la vía de mutacio-
borar un marco regulatorio detallado para los nes, recombinaciones u otras formas de
Ensayos a Campo de Plantas Transgénicas, transferencia genética reconocidas como
que se describe a continuación en sus rasgos mecanismos que operan en la Naturale-
principales. za sin intervención humana.

Esta definición hace referencia al método de un inserto definido introducido en el
obtención del OGM, con el propósito de esta- genoma de la planta, admitiéndose un
blecer el campo de aplicación de la norma, ex- conjunto de eventos con un único vector
cluyendo, por ejemplo, los cruzamientos tradi- en las etapas muy preliminares del desa-
cionales. Sin embargo, en el análisis del ries- rrollo del OGM).
go de la liberación de un OGM, la característica • La escala de la liberación.
dominante, esto es, aquella que constituye el
foco del análisis de la Comisión, es el inser- Cualquiera de estas condiciones que no se
to, esto es, la porción de DNA efectivamente conserve (p.ej., el mismo evento presentado
presente en el genoma transformado, cuya por dos empresas o entes diferentes) repre-
naturaleza y consecuencias (geno- y fenotípi- sentará un caso diferente.
cas) caracterizan al OGM como tal. La normativa puesta en práctica es proac-
Al OGM o conjunto de OGMs con un dado tiva, en el sentido de que requiere un análisis
inserto se los denomina colectivamente previo de todas las previsibles consecuencias
evento. Varios OGMs pueden contener el mis- de una liberación antes de que tal liberación
mo evento, y por lo tanto sus análisis de riesgo sea autorizada.
serán equivalentes. Ocasionalmente, en etapas Como mencionamos antes, Argentina dispo-
tempranas del desarrollo de un OGM, se admite ne desde 1991 de un marco regulatorio para el
que el evento puede no estar inequívocamente Análisis y la Gestión de los Riesgos asociados
caracterizado, en el sentido de que no se ha con los Ensayos a Campo de Organismos Ge-
definido el inserto con la debida precisión (por néticamente Modificados (OGMs). Esta norma-
ejemplo, el inserto puede estar en diferentes tiva es administrada por la Comisión Nacio-
posiciones en el genoma del vegetal). En estos nal Asesora de Biotecnología Agropecuaria
casos, el análisis se enfoca en la construcción (CONABIA), que opera en el ámbito del Minis-
genética utilizada en la transformación. terio de Agricultura, Ganadería y Pesca. Esta
Definimos como transformación, el método Comisión es multisectorial (la forman repre-
utilizado para introducir la nueva información sentantes de los sectores público y privado),
genética, vehiculizada por el vector. multidisciplinaria, y es la encargada de emitir
Si bien la normativa argentina atiende as- las recomendaciones con respecto a la au-
pectos del proceso de obtención de un OGM torización para los ensayos solicitados (expe-
en el análisis de riesgo, esa atención sólo se rimentación y/o liberaciones a campo). Estas
enfoca en aquellas características que inte- recomendaciones son remitidas a la autoridad
resan en la evaluación del producto (y no del decisoria.
proceso de su obtención), en el sentido de que La consideración básica que guía el funcio-
esas características se encontrarán finalmente namiento y los dictámenes de la CONABIA es
en el OGM obtenido. la Bioseguridad, y su característica esencial
Otra característica del marco regulatorio ad- es que funda sus procedimientos operativos en
ministrado por la CONABIA es que considera consideraciones exclusivamente técnicas,
cada producto o liberación caso por caso. Si fundadas en los conocimientos científicos
bien los antecedentes (si los hubiera) se tienen disponibles.
en cuenta, y los casos similares son identifica- Los principales criterios aplicados en la nor-
dos y considerados como objetos de informa- mativa argentina son:
ción válida para la evaluación, los datos no • el criterio de bioseguridad: la defini-
son transferibles, y cada caso y/o solicitan- ción, evaluación y gestión de los ries-
te deben ser coherentes y autosuficientes en gos, es la consideración primaria y su
cuanto a la información que provee a la Comi- aplicación es proactiva, esto es, debe
sión. La definición de caso es entonces rele- realizarse antes de autorizarse la libe-
vante. Un caso está definido por: ración; los ensayos son evaluados caso
• La empresa o ente solicitante. por caso; el foco del interés está en el
• El evento de transformación (es decir: producto, pero aquellas características

del procedimiento de su obtención que 1. las evaluaciones de las liberaciones ex-
terminan afectando o manifestándose en perimentales cuyo propósito es determi-
el producto final, son también analizadas nar que la probabilidad de efectos sobre
• el enfoque precautorio: el marco re- el ambiente es no significativa –primera
gulatorio acompaña el desarrollo del fase de evaluación-, y
producto, y no se requiere la fundamen- 2. las evaluaciones de las liberaciones
tación científica completa para detener extensivas cuyo propósito es determi-
dicho desarrollo; basta que se presente nar que dichas liberaciones del OVGM
alguna de las siguientes situaciones: i) no generarán un impacto sobre el am-
no existe suficiente información sobre el biente que difiera significativamente del
sistema, ii) los riesgos no son aceptables que produciría el organismo homólogo
en base a presunciones razonables, iii) no GM –segunda fase de evaluación-.
la evaluación no sea concluyente, o iv) el (Ver Figura 1)
sistema es demasiado complejo
La CONABIA no interviene en las etapas ulte- Primera Fase de Evaluación:
riores (aprobación alimentaria, dictamen sobre Ensayos experimentales
el impacto en las exportaciones y registro, para Los solicitantes deben presentar un legajo
la comercialización) del camino de una planta de información específica, que consta de
GM hacia el mercado (Ver Figura 1). Sin em- una
bargo, emite un dictamen particular fundado Información General sobre la liberación y
sobre la bioseguridad de la producción masiva sobre el OGM en cuestión y de un apartado
a escala comercial del cultivo en cuestión. De sobre las Condiciones de Bioseguridad que
este modo, la CONABIA dictamina sobre la his- se pondrán en práctica.
toria de bioseguridad de la planta transgénica, El campo del análisis de los riesgos abar-
para información de las agencias específicas cado por estas informaciones, que debe pro-
del Estado encargadas de aquellos pasos. veer el solicitante, es amplio, e incluye tanto las
En los documentos que presentan a la CO- características de la liberación como las del
NABIA, los solicitantes de autorizaciones de OGM. Con respecto a las características de la
ensayos tienen la opción de hacer reserva de liberación, la Información General sometida
información que consideren confidencial. La in- al análisis incluirá:
formación así considerada, será examinada por • Si el material es importado: status regu-
solamente uno de los miembros de la Comisión, latorio en el país de origen.
quien deberá emitir un juicio fundado sobre la • Propósito de la liberación (objetivo, cro-
bioseguridad de la propuesta y exponer esta nograma, protocolos, antecedentes). Si
opinión (aunque no la información reservada) es a escala de invernadero o a campo
ante la Comisión. • Operaciones de transporte de OGM (in-
Esta operatoria de CONABIA permite asegu- greso al país, transportes internos).
rar, tanto para la Sociedad como para los secto- • Cantidad y tipo de material a liberar, an-
res empresariales, un balance correcto entre la tecedentes en otros países.
protección de la salud, la preservación de la ca- • Lugar de la liberación.
lidad ambiental y la sustentabilidad de los pro- • Detalles operativos para auditar la libe-
yectos aprobados, con la implementación regu- ración (fechas, instituciones, personas).
lada, en tiempo y forma, de las innovaciones
tecnológicas propuestas por los solicitantes. Con respecto a las características del
La CONABIA realiza las evaluaciones de to- OVGM, se analizará el genotipo del evento
das las Solicitudes de liberaciones de OVGM (es decir, las nuevas características genéti-
al ambiente, y recomienda al Ministro de Agri- cas introducidas), para lo cual el solicitante
cultura sobre la conveniencia o no de autorizar debe proveer información con respecto a:
dichas liberaciones. Estas evaluaciones com- • Descripción de la biología molecular del
prenden dos fases: sistema donante-vector-receptor

• Método de transformación utilizado ro: métodos o estructuras de contención
• Genes principales (y sus organismos do- contra el ingreso de vectores potenciales
nantes). Genes auxiliares (marcadores de material genético.
de selección). b) En los movimientos de materiales:
• Secuencias regulatorias (promotores, semillas, material vegetal acompañante, así
terminadores, enhancers, etc.). Otros como los lugares, normas e identificación del
elementos genéticos introducidos. material que sea almacenado.
• Productos de expresión, tejidos de la c) En lo relacionado con el destino del
planta en los que se expresan, niveles material cosechado: el solicitante deberá in-
de expresión. Homologías de secuencia formar sobre su utilización, aclarando si será
con proteínas tóxicas o alergénicas. local o si será exportado o destruído, e iden-
• Descripción fenotípica del organismo tificando los lugares de su almacenaje final o
receptor, centros de origen o diversidad transitorio.
genética. d) En lo relacionado con la disposición
• Estabilidad fenotípica y número de gene- final (OGM y materiales remanentes): En
raciones en los que se verificó. lo relacionado con la disposición final del
OGM y de los materiales remanentes, se re-
En cuanto a la sección sobre las Condi- quiere información sobre el tratamiento del
ciones de Bioseguridad, la información soli- suelo post-cosecha, el uso futuro del terreno,
citada depende de la escala de la liberación: los controles posteriores (detección de plan-
desde laboratorio/invernadero hasta pruebas a tas voluntarias) y su duración.
campo. En el caso de eventos que aún no han e) En el caso de un eventual escape del
obtenido la autorización de comercialización OGM y/o de cualquier material asociado:
en el país, es decir, eventos regulados, que El solicitante debe exponer con claridad los
se siembran a gran escala para producciones procedimientos que seguirá en el caso de
de semilla en contra-estación para el hemis- un eventual escape del OGM y/o de cual-
ferio Norte, o con otros fines, existe un proto- quier material asociado. Normalmente, esto
colo específico que es necesario presentar incluye métodos de identificación del OGM,
para obtener la autorización. procedimientos para limitar y controlar el es-
En todos los casos el solicitante debe pro- cape, así como la obligación de notificar pe-
veer información relativa a varios aspectos rentoriamente a la autoridad regulatoria.
básicos de los Procedimientos de Biosegu- f) Técnicas que se usarán para detectar
ridad, a saber: la transferencia de genes desde el OGM al
a) Durante la liberación: Descripción y ubi- ambiente biótico.
cación del lugar o instalación donde se reali- g) Usos previstos del terreno con poste-
zará la liberación. Localización precisa (mapas rioridad a la liberación solicitada. Control
detallados): distancia a caminos, lugares tran- posterior de la parcela, duración de los con-
sitados, límites del predio bajo control del so- troles post-cosecha.
licitante. Características constructivas de bio-
seguridad (laboratorio o invernadero) y normas Una vez completados los ensayos, es re-
de acceso. Tamaño y número de parcelas, su quisito indispensable para poder acceder a
diseño, plano de siembra y superficie a sem- nuevas autorizaciones, la entrega de un In-
brar. Medidas de aislamiento forme de Cierre de la Liberación, que inclu-
• En ensayos a campo: distancias, tiempos ye observaciones relativas al comportamien-
de floración, jaulas, cobertura para evitar to agronómico del OVGM en cuanto a ger-
la diseminación del polen, por viento o minación, crecimiento vegetativo, floración,
insectos, control de vectores potenciales susceptibilidad a enfermedades y plagas, así
de polen u otro material con capacidad como efectos sobre organismos no blanco y
de propagación, etc. características de la cosecha, los tratamien-
• En ensayos en laboratorio o invernade- tos realizados y la disposición final .

Es importante notar que estas liberacio- racterísticas del OGM; el evento, breve des-
nes son periódicamente inspeccionadas por cripción molecular del inserto; usos del OGM,
agentes habilitados por la SAGPyA. destacando los que difieran del organismo no
La normativa completa, así como los re- transformado; condiciones especiales, si las
querimientos de información detallados en hubiera, para el cultivo extendido en gran es-
los formularios que deben completarse para cala) y de una Solicitud que se compone de:
obtener una autorización de liberación, se
encuentran a disposición para la consulta a A) Información General, que se refiere a la
través del sitio de CONABIA. información anterior, pero de manera más de-
tallada. Deberá incluir, entro otras informacio-
Segunda Fase de Evaluación: el camino nes,
hacia el mercado • Caracterización del OVGM, incluyendo
Como ya se ha enfatizado antes, la incum- proteínas y/o RNAs que expresa el OGM
bencia básica de la CONABIA está limitada a originados en el inserto y el fenotipo que
la gestión de los riesgos y la bioseguridad de resulta de esa expresión; las ventajas
los ensayos a campo de plantas GM a dife- aportadas por la modificación genética;
rentes escalas. resultados de los ensayos de campo rea-
Los pasos siguientes hacia el mercado, es lizados, en el país y en el extranjero, en
decir la aprobación de su uso como materia lo que respecta a la bioseguridad .
prima alimentaria, la verificación de que su li- • Una declaración de equivalencia, dife-
beración comercial no afectará negativamen- rencia o no equivalencia del OVGM.
te nuestro comercio internacional, el registro El solicitante declarará aquí si el OVGM
de la nueva variedad, y la autorización para es equivalente al organismo no GM de
la producción comercial, son resorte de otras la misma especie, excepto por el fenoti-
agencias del Estado (Ver Figura 1). Esas depo aportado por la modificación genética
pendencias basan su decisión en dos clases introducida. La declaración se referirá a
de información: todas aquellas características del OVGM
• La información requerida a los solicitan- que no fue intención modificar en el even-
tes que es específica a sus necesidades to. Se deben citar los trabajos que sos-
(la aptitud alimentaria, la estructura de tienen esta declaración. La equivalencia
nuestro mercado de exportación). se referirá al menos a: a) composición
• La información suministrada por la CO- centesimal, procesamiento, productos y
NABIA sobre el comportamiento del subproductos; y b) características y prác-
OGM en cuestión a lo largo de los en- ticas agronómicas, áreas geográficas,
sayos autorizados que se han realizado. tipos de ambientes, precauciones espe-
cíficas para el cultivo extensivo, si las
Esta última información constituye una par- hubiera, con relación a efectos ambien-
te crucial del camino de la planta GM hacia el tales. Asimismo, se declararán aquí las
mercado, y es solicitada y analizada por la CO- observaciones sobre cualquier diferencia
NABIA. En la normativa argentina actual se la no intencional o no esperada, observada
denomina Segunda Fase de Evaluación. La en cualquier aspecto de la expresión fe-
condición necesaria para dar una respuesta notípica del OVGM en comparación con
positiva a estas solicitudes en la práctica, es el organismo no GM de la misma espe-
que la CONABIA considere que: cie. Se deberá incluir toda observación
“no existen riesgos para la salud humana, que haya surgido en el monitoreo post-
para el agroecosistema, y para la flora y la comercialización de este evento (si éste
fauna asociados, derivados del cultivo no ha sido liberado comercialmente en otros
confinado del OGM en consideración.” países), como así también las que resul-
taran de investigaciones realizadas con
Esta categorización requiere del solicitante posterioridad a dichas liberaciones co-
la presentación de un breve Resumen (ca- merciales.

• En caso que corresponda, el solicitante • Caracterización del inserto: análisis
declarará aquí si el tipo de modificación molecular de la inserción en el genoma
genética tiene el propósito de introducir del OVGM (número de sitios de integra-
diferencias que determinan que el OVGM ción, número de copias de cada gen,
no pueda considerarse sustancialmen- incorporación de porciones de genes),
te equivalente al no OVGM, explicando origen y función de cada elemento inser-
sucintamente aquellas diferencias. (Ver tado en el OVGM, información sobre si el
también Capítulo1). inserto (esto es, alguno de sus elemen-
• Una historia de experimentaciones y tos) confiere alguna función no requerida
ensayos previos, instrucciones sobre para la expresión del fenotipo esperado
manejo (agronómico y del producto) y en el OVGM, transposiciones y/o re-
almacenaje (producto, subproductos y arreglos dentro del inserto presente en
remanentes) si difieren del organismo no la planta (con respecto a las posiciones
transgénico. que los elementos genéticos tenían en el
• Propuestas para el envasado, rotulado y vector) y/o de/con porciones del geno-
procesamiento, si difieren del organismo ma de la planta dentro del inserto y en
no transgénico y medidas que deben to- sus regiones flanqueantes; información
marse en caso de liberación accidental o detallada de las secuencias del genoma
mal empleo. vegetal que flanquean del inserto y sobre
la presencia/ausencia de fragmentos del
inserto en regiones del genoma vegetal
B) Caracterización general del OVGM:
fuera del inserto funcional.
esta información se concentra en la metodolo-
• Los organismos donantes: caracte-
gía y la construcción utilizada en la obtención
rísticas patogénicas (con relación a las
del OGM y en la caracterización exhaustiva del
resultantes de la expresión de los ele-
mismo a nivel molecular y fenotípico. Se debe
mentos presentes en la construcción uti-
proporcionar información sobre:
lizada en la transformación). Caracterís-
• La especie receptora (características ticas perjudiciales para la salud humana
fenotípicas, centros de origen i diversi- o animal (con la observación del punto
dad, distribución geográfica en Argen- anterior), potencial y/o antecedentes de
tina, estabilidad genética, potencial de transferencia natural (esto es, en hábi-
transferencia y/o intercambio de genes tats y condiciones naturales) de los ele-
con otros organismos, reproducción, su- mentos que constituyen la construcción,
pervivencia, diseminación, interacciones desde los organismos donantes a otros
con otros organismos, características organismos, su probabilidad o frecuen-
patogénicas, tóxicas, antinutricionales, cia, y fenotipos posibles u observados de
alergénicas u otras, e historia de modifi- los organismos receptores.
caciones genéticas previas). • Caracterización del OVGM propia-
• La modificación genética: método de mente dicho: características fenotípicas
transformación empleado, descripción incorporadas, si alguna característica fe-
detallada del vector (cada elemento ge- notípica del organismo receptor no GM
nético componente, su origen, tamaño y no se expresa en el OVGM. Estabilidad
función; mapa del vector; secuencias nu- genética, segregación y transferencia a
cleotídicas o regiones de la construcción la progenie. Análisis molecular (Southern
cuyos productos o funciones no sean co- blot, PCR). Características de la expre-
nocidas; capacidad para transferir genes, sión del nuevo material genético. Pro-
o para ser movilizados por conjugación, ductos expresados (debe incluir todos
recombinación o integración; regiones los elementos genéticos que se incor-
del vector que se incorporan al OGM, es poran al OVGM, total o parcialmente),
decir constituyen el inserto). características de la expresión (p.ej.,

constitutiva, tejido-específica), tejidos • Impacto ambiental del OVGM en el
del OVGM en que se expresan los genes agroecosistema: efectos del OVGM
introducidos y niveles de expresión y su sobre la flora, fauna y población micro-
evolución temporal, en relación con el ci- biana, con énfasis en las especies be-
clo de la planta. Actividad biológica de las néficas. Efectos derivados de cambios
secuencias expresadas, ARNs transcrip- en las prácticas agronómicas (si los hu-
tos no traducidos, sus niveles, función y biera). Conceptos para el manejo de los
caracterización. Análisis detallado de las efectos mencionados en los puntos ante-
posibilidades de transcripción, que co- riores y condiciones específicas para el
mience dentro del inserto y se extienda manejo de efectos ambientales debidos
hacia el genoma de la planta ignorando al OVGM. Estudios realizados sobre el
señales de terminación, así como de escape de genes vía polen.
transcripción y traducción de proteínas • Comportamiento esperado en la pro-
de fusión o de marcos de lectura nuevos, ducción del OVGM a escala comer-
generados como consecuencia de la in- cial: esta información se refiere especí-
serción. También, se deben detallar las ficamente al impacto ambiental, a infor-
técnicas de detección del OVGM en el mación general sobre la inocuidad del
ambiente: Métodos moleculares y Méto- OVGM o sus derivados alimentarios y a
dos biológicos: su perfil composicional.
• Efectos sobre la salud humana: efec-
• Impacto Ambiental: efectos sobre la
tos tóxicos o alergénicos del OVGM,
flora y fauna, manejo de efectos no de-
sus materiales derivados, sus productos
seados potenciales (p.ej., desarrollo de
metabólicos, los productos resultantes
resistencia a Bt en insectos previamente
del procesamiento industrial habitual (in-
sensibles), programa de investigaciones
cluyendo pero no limitado a alimentos),
de seguimiento propuesto, para monito-
o los resultantes de interacciones de
estos productos con otros componentes rear posibles efectos sobre el ambiente
normales de la dieta humana. Efecto de en el largo plazo.
la modificación genética sobre aquellas • Efectos sobre la salud humana: con-
características del organismo no GM que ceptos y programa de investigaciones
constituyan un peligro o riesgo para la que se realizaron para la evaluación de
salud (incluyendo, pero no limitados a, la inocuidad de las nuevas proteínas ex-
los niveles de antinutrientes). presadas en el OVGM; evaluación de la
• Interacciones del OVGM con el am- toxicidad, digestión en jugo gástrico si-
biente: supervivencia en el ambiente mulado, a diferentes pH: velocidad, ca-
tasa de germinación y dormición, vigor racterización de los fragmentos origina-
vegetativo (calidad agronómica, sus- dos y su actividad biológica. Toxicidad
ceptibilidad a patógenos, a insectos, a aguda de las nuevas proteínas en ani-
factores de estrés ambiental), ventajas males de laboratorio; determinación del
adaptativas presentes o potenciales del nivel de efecto adverso no observable
OVGM frente al organismo no GM, en (sigla del inglés NOAEL), si es posible.
hábitats y condiciones naturales, y en Cálculo de la ingesta diaria aceptable
condiciones de agroecosistemas para la (IDA), y su comparación con la ingesta
misma especie y para otros cultivos geo- habitual para humanos en dietas nor-
gráficamente compatibles. Los modos males. Evaluación del potencial alergé-
y tasas de multiplicación y las formas nico, homologías de las secuencias de
naturales de propagación. Información aminoácidos de las nuevas proteínas
cuantitativa sobre interacciones: suscep- con otras proteínas relevantes (toxinas,
tibilidad a patógenos, plagas e insectos, alérgenos, etc.). Composición centesi-
capacidad de supervivencia (plantas vo- mal del OVGM, y comparación con el
luntarias) y rendimiento. correspondiente organismo no GM, en

todos los tejidos de la planta; proteínas Raybould A, Cooper I (2005) Tiered tests to
y composición en aminoácidos, lípidos assess the environmental risk of fitness
y composición de ácidos grasos, carbo- changes in hybrids between transgenic crops
hidratos y otros componentes (cenizas, and wild relatives: the example of virus
fibra, materia seca, vitaminas, etc.). resistant Brassica napus. Environ Biosafety
Res 4(3):127–140
USEPA (1998) Guidelines for ecological risk
Como se presenta en el esquema corres-
assessment, EPA/630/R-95-002F. Report nr
pondiente, la evaluación completa y detallada EPA/630/R-95-002F
de la inocuidad y aptitud alimentaria de los www.minagri.gob.ar (Biotecnología
OVGMs es llevada a cabo por otra Comisión Agropecuaria): normativa detallada que
Evaluadora, que funciona en la órbita del SE- puede consultarse libremente
NASA (Servicio Nacional de Calidad y Sani- www.senasa.gov.ar : resolución 412/2002
dad Agroalimentaria). Las características de http://www.cbd.int/biosafety/protocol.shtml:
esta etapa de evaluación son similares a las Protocolo de Bioseguridad
que lleva adelante CONABIA, y basa sus con- www.ctnbio.gov.br: sitio de la Comisión de
clusiones en toda la información presentada a Bioseguridad de Brasil
CONABIA, más otra serie de datos, evidencias www.oecd.org: Organización para el Desarrollo
experimentales y estudios que deben ser pre- y la Cooperación Económica
www.fda.gov: Agencia de Drogas y Alimentos
sentados específicamente en relación con los
de los EEUU
aspectos nutricionales y/o toxicológicos del www.fao.org: Agencia para la Agricultura y la
OVGM en cuestión, de acuerdo a los requisitos Alimentación de la Naciones Unidas
de la resolución oficial. www.redbio.org: ir a Marco Regulatorio, para
En ambas instancias de evaluación de información sobre bioseguridad en America
bioseguridad se aplica el enfoque compara- Latina y el Caribe
tivo desarrollado en el Capítulo 1 y la con- http://www.unep.ch/biosafety/: Programa
clusión a la que como mínimo, debe arri- ambiental de las Naciones Unidas . Información
barse para poder recomendar la autoriza- sobre el Protocolo de Bioseguridad y marcos
ción comercial, es : regulatorios internacionales
“El OGM es tan seguro como su contra-

parte no modificada, para el medio ambien-
te y la salud humana o animal y no menos
nutritivo”.
Lecturas /sitios recomendados
Wolt J, Keese P, Raybould A, Fitzpatrick J,

Burachik M, Gray A, Olin S, Schieman J,
Sears M y Wu F 2009. Problem formulation
in the environmental risk assessment for
genetically modified plants. Transgenic Res,
DOI 10.1007/s11248-009-9321-9
Burachik M y Traynor P. 2002. Análisis of a
Nacional Biosafety System: Regulatory
Policies and Procedures in Argentina. ISNAR
Country report 63. www.isnar.cgiar.org
McLean, MA, Mackenzie, DJ and Cole, BA, 2001.
Policy Choices in the Development of National
Frameworks for Biosafety Regulation. Report
for the International Service for National
Agricultural Research (ISNAR), The Hague.

VI. CAPÍTULO 3 y la evaluación del riesgo se centra en la con-
secuencia del flujo de transgenes resultante
sobre el ambiente
Flujo génico y su posible impacto
En especies alógamas o parcialmente aló-
ambiental gamas, la difusión del transgén dependerá de
los mecanismos de polinización, generalmente
Mónica Poverene; Soledad Ureta; por el viento (anemófila) o los insectos (ento-
Agustina Gutiérrez mófila). La mejor estrategia para prevenir la
difusión de transgenes es el aislamiento por
Flujo génico y riesgo de escape de distancia entre poblaciones. En los cultivos, se
transgenes al ambiente conocen las distancias mínimas de aislamiento
necesarias para prevenir la polinización cruza-
El flujo génico es el proceso de incorporada entre variedades. Estas constituyen la base
ción de genes de una población dentro de otra para determinar las medidas de bioseguridad
y ocurre entre individuos formalmente conside- que se exigirán en cada caso durante la fase
rados una especie o entre especies relaciona- de liberación experimental. Una vez aprobado
das. El intercambio de genes entre plantas es el cultivo para su siembra a escala comercial,
un proceso bien conocido en todos los cultivos
la aplicación de esas distancias en la práctica
mejorados por técnicas tradicionales o median-
agronómica queda en manos de los agricul-
te biotecnología y en las plantas silvestres em-
tores y depende de los intereses económicos
parentadas con ellos. La mayoría de los trans-
que para ellos represente la comercialización
genes en cultivos comerciales genéticamente
de un cultivo transgénico. Cuando coexisten
modificados (CGM) confieren tolerancia a her-
con cultivos tradicionales u orgánicos se re-
bicidas o resistencia a plagas, características
quieren medidas adecuadas durante el cultivo,
ciertamente favorables en ecosistemas agríco-
cosecha, transporte y almacenamiento, a fin de
las. Se denomina escape a la diseminación no
evitar la mezcla accidental de materiales GM y
intencional de la construcción genética de un
no GM. Engels y col. (2006) citan ejemplos de
CGM hacia otras poblaciones, mediante meca-
contaminación de lotes de semilla y mezclas
nismos biológicos naturales como la reproduc-
físicas en colza y tomate. Las recomendacio-
ción sexual o la transferencia horizontal. La re-
nes tendientes a evitarla consisten en: a) medi-
producción sexual implica la unión de gametos
das a tomar dentro del establecimiento, como
femeninos y masculinos, mientras que la trans-
respetar las distancias de aislamiento, colocar
ferencia génica horizontal o lateral consiste en
barreras a la dispersión del polen, o intercalar
el intercambio de material genético no sexual
lotes con cultivo de una especie distinta. b)
y ocurre generalmente en microorganismos.
cooperación entre establecimientos vecinos
En el caso de las plantas, el escape génico a
sobre planes de siembra, o uso de variedades
través del polen es el mecanismo natural. La
con tiempo de floración diferente. c) uso de
pérdida de semillas durante el transporte y su
servicios de extensión agrícola para informar a
establecimiento en banquinas y vías de comu-
los productores, monitoreo, intercambio de in-
nicación es muy importante en la dispersión
formación técnica y servicios de alarma.
de plantas fuera del cultivo. La semilla puede
trasladarse grandes distancias y sobrevive Los transgenes que confieren tolerancia
durante mucho más tiempo que el polen. En a herbicidas, resistencia a insectos o a pató-
regiones donde crecen parientes silvestres, se genos podrían transmitir las mismas caracte-
espera que ocurra hibridación espontánea con rísticas a plantas silvestres relacionadas, de-
el cultivo transgénico, a menos que las plantas terminando una mayor supervivencia bajo la
GM estén especialmente diseñadas para limi- presión de selección natural (insectos herbívo-
tar el flujo génico, reduciendo la dispersión de ros o patógenos) o de prácticas agronómicas
semillas o el movimiento de genes a través del usuales para el control de malezas, plagas o
polen. Para muchos CGM se asume que las enfermedades (uso de pesticidas, agentes de
plantas transgénicas se cruzarán abiertamente control biológico). En consecuencia, aumen-

taría el número o tamaño de las poblaciones vorios de diversidad genética de potencial uso
silvestres. El potencial impacto ambiental de- en el mejoramiento genético. Cuando crecen
pende tanto de la probabilidad de transferencia en la vecindad de cultivos a gran escala, existe
del transgén a la población silvestre como de la posibilidad de cruzamientos naturales y flujo
sus consecuencias. Según la probabilidad de génico a través del polen del cultivo hacia la
transferencia, los cultivos pueden clasificarse especie local. Esto puede resultar en una pér-
en tres grupos: dida de vigor y fertilidad en los descendientes,
1. Mínima probabilidad de transferencia a llamada depresión por alogamia, o pérdida de
especies silvestres, sea porque éstas no identidad genética por sucesivos ciclos de cru-
existen en el área o no hay compatibili- zamiento con el cultivo, de manera que paulati-
dad sexual entre el cultivo y su pariente namente la especie local decae hasta su com-
silvestre. pleta extinción. El proceso es dependiente de
2. Cultivos con baja probabilidad de trans- la frecuencia de cruzamiento, la cual a su vez
ferencia, cuando la compatibilidad sexual depende de la cantidad relativa de individuos
es limitada. de cada especie. Esto también puede evitarse
3. Cultivos con alta probabilidad de trans- mediante adecuadas medidas de conservación
ferencia, cuando especies silvestres y manejo del cultivo.
sexualmente compatibles crecen en la Se puede concluir que la posibilidad de es-
vecindad del área sembrada. cape de transgenes es de orden diferente se-
gún la población recipiente. Una variedad no
Las consecuencias de la transferencia de- GM de la misma especie ciertamente adquirirá
penden de la capacidad potencial del transgén el transgén si es expuesta al flujo de polen del
para conferir ventajas adaptativas a la especie cultivo GM. Una rara variedad local domestica-
silvestre receptora. De acuerdo a este criterio, da perderá identidad por contacto genético con
también se pueden agrupar los genes en dife- el cultivo. La situación no es tan simple si se
rentes clases. En la clase 1 se sitúan los trans- trata de una población silvestre emparentada,
genes que confieren pequeña o ninguna venta- ya que dependerá de las relaciones genéticas
ja adaptativa, como los marcadores de selec- con el cultivo, que determinan la probabilidad
ción, genes de androesterilidad o de madurez de hibridación. Se requerirá de una evaluación
retrasada. La clase 2 comprende genes que de la probabilidad de escape y del impacto que
pueden conferir alguna ventaja bajo la adecua- el transgén podría ocasionar en la población
da presión de selección, como los de tolerancia silvestre.
a herbicidas o de resistencia a insectos y enfer-
medades. En la clase 3 se sitúan genes para Factores que determinan el escape de
mejorar el crecimiento y la supervivencia, que transgenes y su impacto ambiental
conferirían ventajas adaptativas en cualquier Los cultivos en su mayoría están emparenta-
ambiente. La tabla 1 presenta una clasificación dos con especies silvestres o malezas, con las
de los cultivos GM autorizados o bajo ensayo que pueden hibridar y producir descendientes
en Argentina, según esos criterios. total o parcialmente fértiles. Esta hibridación
La pérdida de biodiversidad consiste en ha sido documentada en 22 de los 25 cultivos
la erosión o pérdida de variabilidad genética más importantes y es muy probable que sus
atribuida al monocultivo o al uso de unas po- genes se encuentren introgresados dentro de
cas variedades que dominen el mercado de las poblaciones silvestres. Trigo, arroz, avena,
semillas. Esta situación no es privativa de los sorgo, cebada, maíz, soja, girasol, colza, maní,
cultivos GM y puede prevenirse mediante una poroto, caña de azúcar, remolacha azucarera
adecuada planificación de la agricultura regio- algodón, papa, zapallo, frutilla, rábano, zana-
nal. Algunas especies crecen en ambientes horia, vid, tréboles son algunas de las especies
especializados o geográficamente limitados cultivadas que se encuentran en experimenta-
como raras especies silvestres o razas locales ción biotecnológica. El intercambio genético
domesticadas (landraces) constituyendo reser- de los cultivos con sus parientes silvestres es

Tabla 1. Clasificación de las especies GM en Argentina según la probabilidad de transferencia del transgén
(Grupo) y las consecuencias biológicas de la modificación genética (Clase) de acuerdo a Ahl Goy y Due-
sing (1996). Entre paréntesis se indica el número de autorizaciones entre 1997 y 2007.
Grupo Cultivo Clase 1 Clase 2 Clase 3
I Algodón Toler. herbicidas (47)

Resist. insectos (46)
Maíz Calidad alterada (68) Toler. herbicidas (463) Alto rendimiento (4)
Caracteres agronómicos (2) Toler. estrés ambiental (20)
Androesterilidad (3) Resist. insectos (564)
Resist. enfermedades (12)
Soja Calidad alterada (64) Toler. herbicidas (145) Alto rendimiento (97)
Modif. calidad de semilla (1) Tolerancia estrés ambiental
(1)
Tabaco Calidad alterada (3) Toler. herbicidas (20)
Toler. estrés ambiental (4)
Trigo Calidad alterada (5) Toler. herbicidas (6)
Calidad de marcadores Resist. enfermedades (7)
visuales (1) Toler. estrés ambiental (1)
II Caña de azúcar Toler. herbicidas (11)
Papa Toler. herbicidas (56)
Resist.insectos (2)
III Alfalfa Calidad alterada (2) Toler. herbicidas (6)

Propiedades nutracéuticas Resist. insectos (2)
(31)
Arroz Calidad alterada (3) Toler. herbicidas (2) Alto rendimiento (27)
Tolerancia estrés ambiental Alteración en la
(4) fertilidad (2)
Cártamo Calidad alterada (3)
Colza Calidad alterada (1) Toler. herbicidas (7)
Frutilla Resist. enfermedades (1)
Girasol Toler. herbicidas (3) Fijación de nitrógeno
Resist. enfermedades (49) (1)
Naranjo Resist. enfermedades (3)
Remolacha, Acelga Toler. herbicidas (3)
Tomate Resist. enfermedades (1)
Trébol blanco Retraso de la
senescencia (1)

uno de los mecanismos de origen de las ma- especie silvestre emparentada? ¿Esa variedad
lezas. Los cruzamientos ocurren naturalmen- es sexualmente compatible con sus parientes
te en regiones donde las especies conviven. silvestres? Todas las especies utilizadas para
Aproximadamente la mitad de los caracteres cultivo son derivadas de una o más especies
que determinan invasividad están controlados silvestres. Estos cultivos son sembrados en su
por genes únicos, de modo que existe la posi- mayoría lindantes con sus parientes silvestres
bilidad de que los transgenes persistan y mo- compatibles Para reducir el riesgo de hibrida-
difiquen poblaciones silvestres. Podría resultar ción cultivo-silvestre se debería restringir el cul-
que éstas se vuelvan más abundantes en su tivo transgénico a determinadas áreas donde
hábitat o invadan nuevos hábitats. El concepto no se encuentren los parientes silvestres. Por
de “supermaleza” ha surgido como consecuen- ejemplo, las poblaciones silvestres de maíz y
cia de reconocer la dificultad que implicaría el soja no son nativas ni se encuentran en Argen-
control de esas poblaciones. También podrían tina, por lo tanto los transgenes provenientes
tener efectos adicionales sobre poblaciones de de estos cultivos no pueden transferirse a po-
insectos o patógenos. blaciones silvestres. En cambio, colza, arroz y
No obstante, la probabilidad de introgresión girasol conviven con sus parientes silvestres y
de elementos transgénicos dentro de otras pueden cruzarse con ellos. El primer paso con-
variedades o germoplasmas dependerá de la siste en el estudio sistemático de la flora local.
biología de reproducción, fertilidad de los híbri- De todos modos, restringir los cultivos trans-
dos, dispersión de semilla y presión de selec- génicos a determinadas áreas fuera del rango
ción. Para que ocurra introgresión de genes, de ocurrencia de sus parientes silvestres sólo
cultivos sexualmente compatibles o parientes demorará el movimiento de transgenes.
silvestres deben estar presentes y cercanos al La hibridación del cultivo con especies sil-
“cultivo fuente”, el entrecruzamiento debe ser vestres emparentadas dependerá de la afini-
posible y los resultantes híbridos y sus respec- dad genética que tengan entre ellos, la cual
tivas retrocruzas tienen que ser fértiles. La in- determinará desde fertilidad completa o parcial
trogresión de genes es mayor en especies aló- hasta imposibilidad de cruzamiento. Para que
gamas, como maíz y es menor en autógamas, la cruza tenga lugar, ambos taxa deben flore-
como soja y arroz, siendo mínima en especies cer al mismo tiempo y el polen debe ser capaz
de propagación vegetativa, como papa. Aún en de germinar y efectuar la fecundación. La des-
estos casos los transgenes pueden ser intro- cendencia suele tener una fertilidad menor que
ducidos sin intención mediados por mezclas las especies parentales, pero raramente es por
físicas de semillas o propágulos. completo estéril. La fertilidad parcial de los hí-
La evaluación del riesgo de escape de trans- bridos permite la introgresión, la incorporación
genes comprende tres etapas: estable de genes de una especie en otra me-
a) Investigación de barreras genéticas o diante sucesivas retrocruzas de sus descen-
geográficas para el escape del transgén desde dientes con una o ambas especies parentales.
el cultivo hacia las poblaciones silvestres. La fertilidad de los híbridos cultivo-silvestre va-
b) Investigación del efecto del transgén so- ría drásticamente, aunque suele ser restaura-
bre la aptitud biológica de las plantas silvestres. da en las siguientes generaciones. Caracteres
c) Investigación de las consecuencias eco- morfológicos y fenológicos intermedios entre la
lógicas de la difusión del transgén en la pobla- especie cultivada y la silvestre constituyen un
ción silvestre. buen diagnóstico de hibridación e introgresión,
pero el estudio de marcadores moleculares re-
a. Barreras geográficas y genéticas entre sulta invalorable. Este ha demostrado que la
el cultivo y especies silvestres mayor parte de los cultivos hibrida con sus pa-
Para evaluar el riesgo de escape de genes rientes y que los alelos de las especies domes-
desde los cultivos a las poblaciones silvestres ticadas persisten durante generaciones en las
emparentadas, se plantean dos preguntas: poblaciones silvestres, aún cuando no se ad-
¿La planta cultivada transgénica convive con la viertan cambios morfológicos. Este es el caso

del girasol cultivado con Helianthus annuus sil- ya que si la tasa de hibridación fuera despre-
vestre y H. petiolaris en América del Norte. En ciable, no cabría preocuparse por las conse-
Argentina, donde ambas especies silvestres cuencias.
se han naturalizado, hemos encontrado nume-
rosas evidencias de hibridación e introgresión b. Efecto del transgén sobre la aptitud
con el cultivo en la región central del país, tan- biológica de las plantas silvestres
to por caracteres morfológicos y fenológicos Una vez comprobada la posibilidad de hibri-
como por marcadores moleculares, constatan- dación y la presencia de un transgén en plan-
do además la fertilidad parcial de los híbridos tas silvestres, surge la pregunta: ¿Se espera
mediante estudios del polen y de la producción que el transgén incremente su frecuencia en
de semillas. El flujo génico a través del polen las poblaciones silvestres? El destino de un
es una poderosa fuerza evolutiva y el impacto alelo en una población dependerá de su efec-
sobre las poblaciones silvestres depende de to sobre la aptitud biológica de los individuos
su magnitud, así como del efecto de los alelos que lo adquieren. La aptitud biológica o valor
transmitidos sobre la población recipiente. adaptativo es una medida relativa de la eficacia
La magnitud del flujo mediado por polen pue- reproductiva de un genotipo cuando se lo com-
de medirse a través de la frecuencia de mar- para con otro genotipo. Sus componentes son
cadores moleculares característicos del culti- la supervivencia y la fecundidad, que pueden
vo presentes en una población silvestre o sus resultar afectados en distintas fases del ciclo
descendientes. Estos han demostrado que la vital: germinación, establecimiento de plántula,
ubicación de un gen en el genoma tiene una floración, formación de polen y semilla.
importancia crucial para su difusión mediante Si el alelo no tiene efecto alguno en el am-
hibridación. En colza, un aloploide (AACC), la
biente ecológico, se trata de un alelo neutro y
introgresión de tolerancia a herbicidas y an-
su destino dependerá del azar, o sea que su
droesterilidad hacia la especie diploide Brassi-
frecuencia en la población estará sujeta a la
ca rapa (AA) sería menos probable si los trans-
deriva génica y persistirá o eventualmente se
genes que codifican esos rasgos estuvieran en
perderá. Si el alelo es beneficioso, el flujo gé-
el genoma C, porque implicaría una recombi-
nico acelerará su diseminación en la población
nación intergenómica. En girasol, Helianthus
silvestre y la frecuencia alélica aumentará rápi-
annuus donde ha ocurrido una extensa remo-
delación cromosómica mediante inversiones y damente, en forma proporcional al movimiento
translocaciones, la transferencia de un trans- de polen desde el cultivo a la población silves-
gén hacia la especie silvestre H. petiolaris es tre. Si su efecto es deletéreo conducirá a una
improbable si éste no está situado en las por- depresión alogámica, con disminución de la
ciones colineares entre ambos genomas. viabilidad y fertilidad de los híbridos. El efec-
Se están evaluando métodos para reducir la to nuevamente dependerá de la magnitud del
probabilidad de introgresión, como por ejem- flujo génico y cuanto mayor sea, mayor será
plo, ubicar los transgenes dentro de cromoso- el riesgo de extinción de la población silvestre.
mas o segmentos cromosómicos que tengan La diseminación de un transgén en la pobla-
menor probabilidad de ser transferidos a las ción silvestre requiere que los híbridos cultivo-
poblaciones silvestres. Otra alternativa es co- silvestre se reproduzcan en condiciones natu-
locar el transgén muy cercano a algún “gen de rales. Estudios previos de hibridación entre cul-
domesticación” que confiera una menor aptitud tivos no transgénicos de colza, sorgo, girasol,
en las poblaciones silvestres y el uso de tecno- rábano, poroto y trigo y sus parientes silvestres
logías de restricción para controlar la viabilidad han demostrado que no sólo lo hacen, sino que
o fertilidad de la progenie híbrida. su aptitud biológica puede ser incluso mayor
La cuantificación de la tasa de hibridación que la de sus progenitores silvestres. En uno
e introgresión entre el cultivo y la especie sil- de los primeros estudios de transmisión de un
vestre mediante experimentos adecuados es transgén a poblaciones silvestres, se encon-
previa a la investigación de las consecuencias tró una baja frecuencia de plantas híbridas de
génicas y ecológicas del escape del transgén, Brassica rapa portadoras de un transgén de

colza considerado neutral y se concluyó que el planta que lo adquiera debido a efectos pleio-
riesgo de transmisión era bajo. Diez años des- trópicos sobre otros caracteres fenotípicos que
pués se confirmó la persistencia de transgenes a su vez afecten la aptitud. El beneficio de un
de resistencia a herbicida en poblaciones de transgén asociado a la resistencia a determina-
B. rapa durante seis años consecutivos. Los da plaga debe ser evaluado comparando la ap-
híbridos entre calabaza GM y zapallo silvestre titud biológica de plantas con y sin el transgén
resultaron lo suficientemente vigorosos como que hayan sido expuestas a esa plaga. Por el
para permitir la rápida introgresión de trans- contrario, el costo de adquirir el transgén debe
genes neutrales y beneficiosos en las pobla- ser medido comparando la aptitud biológica
ciones silvestres. En girasol, un transgén que de plantas que lo llevan o no, en ausencia de
confiere resistencia a lepidópteros mediante la la plaga. Híbridos transgénicos entre B. rapa
producción de la proteína Bt Cry1Ac, aumentó y B. napus que contienen el transgén Bt han
considerablemente la fecundidad de las plantas demostrado una mayor aptitud en presencia
silvestres recipientes, aunque este efecto varió de herbívoros, mientras que su aptitud dismi-
entre localidades y años. De acuerdo a estas nuía en ausencia de los mismos comparado
observaciones, podría esperarse que el gen Bt con B. rapa, demostrando un costo fisiológico
aumente la aptitud biológica de girasoles silves- del transgén. Además, los caracteres que de-
tres e incremente rápidamente su frecuencia en terminan supervivencia y fecundidad pueden
las poblaciones naturales, debido a que reduce ser afectados por las condiciones ambientales,
el daño producido por varias especies de insec- por lo que es necesario estimarlos en distintos
tos herbívoros. Sin embargo, el transgén OxOx, ambientes y a lo largo de varias estaciones de
que confiere resistencia al hongo Sclerotinia, crecimiento.
no aumentó significativamente la fecundidad de Es el equilibrio de los costos y beneficios el
plantas de girasol silvestre, sugiriendo que su que determina el impacto total de un transgén
diseminación sería prácticamente neutral luego en términos de aptitud. En el caso de resisten-
de un escape hacia poblaciones naturales. En cia a herbicidas, el valor positivo del rasgo será
Brassica rapa un transgén Bt adquirido por cru- restringido a los hábitats en el agroecosistema
zamiento con colza transgénica disminuyó su en donde se aplica el herbicida. Esto demues-
agresividad como maleza en un 20% compa- tra la importancia de conducir estudios de ries-
rado con B. rapa no GM. Estos son ejemplos go en híbridos transgénicos bajo condiciones
contrastantes de los efectos de transgenes so- realistas de agricultura y ecología ya que cual-
bre la aptitud y comportamiento ecológico de quier costo de llevar transgenes puede ser evi-
poblaciones silvestres. dente solamente bajo ciertas condiciones.
¿Cómo estimar los costos y beneficios de un
transgén para la aptitud biológica de una es- c. Consecuencias ecológicas de la
pecie silvestre? En este caso, los genotipos a difusión del transgén en la población
comparar son el que ha adquirido el transgén silvestre
por hibridación con el cultivo y el que no lo ha Finalmente, si el transgén aumenta la apti-
adquirido, o sea el genotipo silvestre de la po- tud de las poblaciones silvestres se espera que
blación en ausencia de flujo génico del culti- aumente su frecuencia por selección natural.
vo. En general, las poblaciones silvestres son La siguiente pregunta es: ¿Cuáles son las con-
menos susceptibles a patógenos y plagas que secuencias ecológicas del escape del transgén
sus parientes cultivados. Mayor diversidad ge- en una población silvestre? El impacto ambien-
notípica, menor densidad de plantas y ausen- tal dependerá no sólo de la frecuencia, sino del
cia de laboreo son algunas de las causas de cambio en las interacciones bióticas y abióticas
esa diferencia. Por ello, un transgén que con- de ese genotipo silvestre en su ambiente. La
fiere resistencia a una plaga o patógeno puede predicción de las consecuencias de un escape
no representar para la especie silvestre una de transgenes requiere del estudio de la altera-
ventaja tan grande como para el cultivo. Por ción de las interacciones ecológicas existentes
el contrario, puede significar un costo para la entre las especies. Un gen de resistencia a in-

sectos o a enfermedades modificará la herbi- El uso comercial de cultivos Bt ejerce una
voría o la relación huésped-patógeno entre la presión selectiva que podría favorecer la selec-
especie silvestre y otras especies de su hábi- ción de insectos resistentes a las toxinas. La
tat, así como un transgén que favorezca el cre- descendencia podría heredar los genes de re-
cimiento modificará las relaciones de compe- sistencia y en unos pocos años, la biotecnolo-
tencia intra e interespecíficas. Cuanto más se gía desarrollada para el control de insectos se
conozca acerca de la dinámica poblacional de volvería inefectiva. Para evitar esta situación se
una especie, más fácilmente se podrá evaluar ha ideado la estrategia del cultivo refugio, que
el impacto ambiental. En Cucurbita pepo, hí- consiste en sembrar una franja de variedad no
bridos entre un cultivar GM y plantas silvestres transgénica junto a la variedad Bt. Los insec-
mostraron amplias variaciones en fecundidad tos se reproducen libremente en esa franja, de
entre años y localidades que fueron atribuidas modo que los raros portadores de resistencia
a condiciones de suelo y clima, densidad de se mantendrán en una frecuencia relativamen-
herbívoros, competencia con malezas, enfer- te baja en la población total de insectos. Esta
medades y otros factores ambientales. El creci- estrategia se detalla en el capítulo 5. En culti-
miento poblacional a través de la producción de vos de algodón y maíz el sistema de refugios
semilla es una limitante para especies anuales, es efectivo y ayuda a retrasar la resistencia en
por ello caracteres que aumenten la produc- insectos. La pérdida de la eficacia Bt es actual-
ción o germinación de semilla tienen un gran mente uno de los mayores riesgos ambientales
efecto ecológico. Resultados preliminares en derivados del uso de biotecnología agrícola.
poblaciones experimentales de girasol silves- El primer caso de insectos Bt-resistentes se-
tre sometidas a flujo génico de un cultivo GM leccionado en laboratorio se encontró en una
(Bt) indicaron que el aumento de la producción población de Plodia interpunctella. Sin embar-
de semilla determinó mayor número de plántu- go, la situación en el campo es muy diferente.
las, mayor supervivencia hasta la edad repro- Hasta la fecha, las únicas poblaciones natura-
ductiva, mayor número de inflorescencias con les que han desarrollado resistencia a Bt han
semilla y mayor área total de capítulo al año sido poblaciones de Plutella xylostella (L.) en
siguiente. El incremento en tamaño y número plantas de berro en Hawai.
de las poblaciones silvestres de una especie La transgénesis también puede tener efec-
afectará a otras especies vegetales del hábitat, tos inesperados en los cultivos. El contenido
cuya frecuencia relativa podría disminuir. de lignina del maíz Bt es perceptiblemente
Uno de los riesgos asociados al escape de más alto que el de maíz no-Bt. Un cambio en el
un transgén Bt de resistencia a insectos en una contenido de lignina pude afectar la acción de
población silvestre es el potencial efecto adver- herbívoros y tener consecuencias ecológicas.
so sobre especies no-blanco (aquellas que no
reducen la producción del cultivo) algunas de Conclusiones
las cuales pueden ser especialistas, alimentán- El estudio de impacto ambiental precede
dose con exclusividad de la especie silvestre a la liberación de cualquier nuevo evento de
receptora. Como ejemplo, se pueden citar es- transformación en plantas para tener resulta-
pecies de artrópodos que cumplen importantes dos confiables en el ambiente de la liberación.
funciones como controladores biológicos, poli- La mayor parte de los efectos no deseados del
nizadores y descomponedores. Las toxinas Bt escape de un transgén pueden evitarse me-
son altamente específicas para determinados diante acciones planificadas anticipadamente:
tipos de herbívoros (lepidópteros, coleópteros, manejo del cultivo, bancos de germoplasma,
dípteros) y la disminución de uno de ellos pue- cultivos refugio, etc. Sin embargo, la difusión
de alterar las relaciones de competencia con de un transgén hacia poblaciones silvestres
los demás. Las relaciones ecológicas entre emparentadas es difícil de evitar debido a que
herbívoros suelen implicar un delicado equili- el polen de los cultivos puede alcanzar grandes
brio demográfico cuyo colapso podría contri- distancias. Los cultivos GM ya se utilizan en
buir a mayores niveles de infestación y daño. gran escala, por lo que es necesario evaluar

cuidadosamente el riesgo de escape de trans- Pilson D, Prendeville HR. 2004. Ecological effects
genes para cada uno de ellos. Esa evaluación, of transgenic crops and the escape of transgenes
realizada por equipos multidisciplinarios, de- into wild populations. Annu Rev Ecol Evol Syst
bería considerar los siguientes aspectos: a) 35:149–174.
Sanchis V, Bourguet D. 2008. Bacillus thuringiensis:
Presencia de especies silvestres sexualmente
applications in agriculture and insect resistance
compatibles con el cultivo y la probabilidad de management. A review. Agron Sustain Dev 28:
que el transgén difunda en ellas. b) Cambios 11–20.
en las características de poblaciones de pató- Scott SE, Wilkinson MJ (1998) Transgene risk is
genos, insectos y malezas relacionadas con el low. Nature 393: 320
cultivo GM y medidas para evitar o retardar la Snow AA, Pilson D, Rieseberg LH, Paulsen MJ,
aparición de biotipos resistentes. c) Cambios Pleskac N, Reagon MR, Wolf DE, Selbo SM
en la dinámica de poblaciones de otras espe- (2003) A Bt transgene reduces herbivory and
cies vegetales y animales que comparten el enhances fecundity in wild sunflowers. Ecological
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Lecturas recomendadas gene flow. Heredity 86: 694-702
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VI. CAPÍTULO 4 Unidos, Argentina, Brasil, Canadá, India, Chi-
na, Paraguay y Sudáfrica. Dentro de los países
de la Unión Europea se encuentran Francia,
Detección de OGM en la Cadena España y Polonia quienes cultivan semillas con
Agroalimentaria algunos de los eventos existentes. En total su-
man 114,3 millones de hectáreas OGMs para
sembradas con la campaña 2007/2008.
Florencia Longo; Ana Vicario
La aplicación de la biotecnología moderna
en la cadena de producción de los alimentos
ha generado grandes controversias en todo el
Introducción mundo. Esto ha provocado que muchos paí-
En el año 1996 se aprobó para su comer- ses, especialmente los de la Unión Europea,
cialización en Argentina la primera variedad impongan restricciones al ingreso de productos
vegetal mejorada que llevaba una caracterís- que contengan organismos modificados gené-
tica transgénica. Se trató de una variedad de ticamente. Así se han generado normativas
soja con tolerancia a un herbicida. A partir de que regulan las transacciones internacionales
ese momento y hasta la actualidad Argentina de estos productos, como el Protocolo de Car-
ha aprobado 10 eventos transgénicos más: 9 tagena sobre Seguridad de la Biotecnología
en maíz y 2 en algodón. del Convenio sobre la Diversidad Biológica.
A grandes rasgos, una planta genéticamente Este protocolo establece un sistema regulato-
modificada es aquella a cuyo genoma se han rio para el intercambio y manejo de los orga-
incorporado uno o más transgenes mediante nismos vivos genéticamente modificados, con
alguna de las técnicas de ingeniería genéti- especial énfasis en su movimiento transfronte-
ca. Estos transgenes poseen una secuencia rizo. Esto requiere de entrenamiento especiali-
nucleotídica específica y algunos de ellos se zado tanto en técnicas de laboratorio como de
expresan generando una proteína nueva en el gestión de la producción y de la armonización
organismo, lo cual le va a conferir un nuevo fe- internacional de estos métodos.
notipo, o característica especial a la planta. Aunque las normas de etiquetado y comer-
Según la definición de la Comisión Nacional cialización de granos genéticamente modifica-
Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CO- dos (GM) y sus derivados difieren de un país a
NABIA), un organismo genéticamente modifi- otro, en todos los casos se requiere de metodo-
cado (OGM), “es un organismo al cual se le ha logías capaces de detectar niveles muy bajos
introducido, en forma deliberada y controlada, de proteínas, ácido desoxiribonucleico (ADN),
alguna modificación en su material genético semillas o granos GM, éstos últimos, con dis-
haciendo uso de las técnicas modernas de bio- tinto grado de procesamiento industrial, y para
logía molecular. Esta modificación consiste en los cuales se puede solicitar determinar tanto la
incorporar información para conseguir que el presencia de estructuras comunes a cualquier
organismo adquiera una determinada caracte- evento (lo que se denomina “screening”) como
rística que antes no poseía”. Se denomina en- la de eventos particulares y su cuantificación.
tonces “evento transgénico a un OGM carac- Como se mencionó anteriormente, la se-
terizado por un segmento específico de ADN cuencia que se introduce en un OGM puede
nuevo que se ha insertado de manera definida dar origen a una proteína y ésta, a su vez, a
y controlada en el genoma original”. un determinado fenotipo. Es por eso, que para
Mundialmente existen otros eventos apro- determinar la presencia de organismos trans-
bados por distintos países, en otras especies génicos en una muestra o lote de un determi-
como colza, alfalfa, papaya y tomate, entre nado producto, se podrá verificar la presencia
otros (www.ISAAA.org). Según datos de la In- de determinadas secuencias de ADN, de pro-
ternational Service for the Acquisition of Agri- teínas o de características fisiológicas de las
biotech Applications (ISAAA), en el año 2007 plantas. Estas determinaciones podrán ser de
existían 23 países que cultivan semillas trans- tipo cualitativa o cuantitativas, dependiendo del
génicas, siendo los ocho principales Estados método analítico se que utilice.

A continuación se detallan los métodos y en- reactivas), teniendo en cuenta que el tamaño
foques de análisis más utilizados. Asimismo, de los grupos de análisis no debe ser mayor a
se enuncian algunas consideraciones genera- la sensibilidad del método utilizado (es decir,
les al momento de llevar adelante los ensayos si el método es capaz de detectar una semi-
y la estructura física que se recomienda que lla transgénica en 500 semillas, los grupos de
dispongan los laboratorios que realizan este análisis no deben ser mayores a 500 semillas).
tipo de ensayos. Finalmente se hace una revi-
sión de las normas internacionales que existen Ensayos cuantitativos
en la materia. Los ensayos cuantitativos se refieren a la
determinación del porcentaje de OGM en una
Estrategias de análisis muestra o lote. Esta cuantificación es posible
debido a la metodología empleada y no debido
Ensayos cualitativos a una estimación estadística, como en el caso
Los ensayos cualitativos se refieren a aque- del sub-muestreo. La técnica cuantitativa por
llos que dan una respuesta positiva o negati- excelencia, ampliamente utilizada en las tran-
va respecto de la presencia de un analito. Es sacciones comerciales, es la PCR en tiempo
decir, en el caso de los transgénicos, aquellos real o PCR cuantitativa.
que determinan presencia o ausencia de una
secuencia de ADN, de proteína o fenotipo de- Métodos de Detección
bido al transgén. Un ensayo típicamente cuali-
tativo es el bioensayo, pero también lo es una Bioensayos
PCR (Polymerase Chain Reaction) en tiempo Este método cualitativo consiste en la eva-
final, un análisis de proteínas utilizando tiras luación de la respuesta fisiológica de manera
reactivas o un ensayo ELISA (Enzyme-Linked de determinar la presencia del transgén bus-
ImmunoSorbent Assay) cualitativo. cado, como por ejemplo la tolerancia a un her-
bicida. En el caso de plantas tolerantes a un
Ensayos semi-cuantitativos: herbicida, el ensayo consiste en poner a ger-
sub-muestreo minar las semillas y evaluar la emergencia de
Estos ensayos implican el análisis de una plántulas normales bajo el efecto del herbicida.
determinada cantidad de sub-muestras de El porcentaje de plántulas tolerantes se deter-
análisis (grupos o “pooles”). Para cada sub- mina contando a aquellas normales sobre las
muestra, la presencia o ausencia de un deter- semillas totales. Paralelamente a este ensayo
minado analito, se determina de manera cuali- debe realizarse el ensayo control, que consiste
tativa. La estrategia radica en el análisis de una en la prueba de germinación sin el herbicida,
determinada cantidad de grupos (N) de tamaño de manera de determinar el poder germinativo
conocido de semillas o granos (m) y la estima- de la muestra.
ción estadística (siguiendo una distribución bi- La evaluación de la resistencia a insectos se
nomial o de poisson) del porcentaje de analito realiza mediante ensayos biológicos complejos
presente en la muestra. Existen planillas de y de larga duración, y es por eso que los bio-
cálculo con ayuda de las cuales se puede deci- ensayos no son una alternativa práctica para
dir sobre el número de semillas o granos a uti- dicha característica.
lizar y el tamaño y cantidad de grupos, según El bioensayo para tolerancia a herbicida re-
un porcentaje de confianza establecido para la quiere aproximadamente una semana para
prueba y un límite máximo de OGM aceptado completarse, o el tiempo que tome lograr ob-
para la muestra o lote en estudio (Programa tener una plántula para la especie en estudio.
estadístico SeedCalc v8). La cantidad de semillas a evaluar se determina
Esta estrategia puede llevarse a cabo utili- según el porcentaje de confianza con el que se
zando tanto una PCR en tiempo final como en- desee realizar la prueba y en función del límite
sayos para determinación de proteínas (ensa- máximo de OGM aceptado para la muestra o
yo inmunológico del tipo ELISA en placa o tiras lote (www.seedtest.org).

Determinación de proteínas la proteína GM depende de que ésta se expre-
Las proteínas producto de la expresión de un se en el tejido de análisis. Puede ocurrir que no
transgén pueden determinarse utilizando una sea posible generar un anticuerpo para detec-
reacción inmunológica de tipo proteína GM-an- tar la proteína introducida debido a que es muy
ticuerpo que es posible realizar tanto en placa similar a proteínas propias de la planta original
(ELISA), como sobre un soporte de nitrocelulo- y por lo tanto no se pude obtener un anticuerpo
sa (tiras reactivas o inmunostrips). Básicamen- que detecte a la proteína introducida sin detec-
te estos ensayos consisten en la detección de tar también la ya presente en la planta, lo que
la sustancia de interés (la proteína) mediante la se denomina reacción cruzada.
formación de un complejo antígeno-anticuerpo La determinación de proteínas es un ensayo
que luego es detectado mediante un comple- de tipo cualitativo, aunque en el caso de ELISA
jo enzimático que se une específicamente al en placa, es posible ajustarlo de manera tal de
complejo anterior permitiendo su visualización. poder realizar una determinación cuantitativa.
Es aconsejable que se realicen sobre semillas/ En el caso que se realicen ensayos utilizando
grano u otro material vegetal “joven”, ya que una estrategia de sub-muestreo, debe tenerse
las proteínas se degradan con facilidad, y es en cuenta el nivel de sensibilidad del ensayo
por eso también que no se recomienda su uso (tanto en ELISA como en tiras reactivas). La
para casos de alimentos procesados. cantidad de semillas o granos a evaluar así
El nivel de expresión de las proteínas varía como la cantidad de grupos y su tamaño, se
según el tejido del que se trate, desde niveles determina según el porcentaje de confianza
muy altos hasta trazas casi imperceptibles. Es con el que se desee realizar la prueba y en fun-
por eso que se recomienda, además de seguir ción del límite máximo de OGM aceptado para
-en el caso de utilizar los “kits” comerciales-, la muestra o lote (www.seedtest.org).
las instrucciones del fabricante, contar con los Este tipo de determinación es sencilla de rea-
correspondientes controles de los ensayos. lizar y no necesita alta capacitación del perso-
Utilizando esta metodología se pueden obte- nal ni materiales o equipos sofisticados. Entre
ner resultados en unas pocas horas. Según el los inconvenientes que presenta se encuentran
evento transgénico del que se trate, los niveles que no permite la identificación entre cultivos
de proteínas varían en los distintos tejidos de distintos que presentan la misma proteína GM
la planta. Pueden ser mucho más altos en ho- (ya sea en cuanto a especie o con relación a
jas o raíces y prácticamente nulos en granos la construcción introducida). Sumado a ello, es
y por lo tanto es bueno considerarlo antes de preciso aclarar que su utilización para la cuan-
tomar decisiones sobre los ensayos a realizar. tificación puede conducir a errores debido a las
Para obtener más información sobre tejidos de diferencias en los niveles de expresión de la
expresión de proteínas transgénicas se puede proteína GM por el origen del tejido, su varia-
consultar el sitio AGBIOS (http://www.agbios. ción con la edad de la planta o por el efecto de
com). las condiciones ambientales en las cuales se
Asimismo, hay que considerar que distintos desarrolla.
eventos trangénicos han incorporado las mis- Existe una gran diversidad de anticuerpos
mas proteínas por lo que no es posible, en es- para distintas proteínas provenientes de un
tos casos, determinar de qué evento se trata si transgén. Se puede obtener más información
el resultado es positivo. visitando las páginas web de distintos provee-
Este tipo de análisis solo tiene utilidad cuan- dores.
do se lo realiza sobre muestras o tejidos que
expresan la proteína GM y en productos sin Determinación de secuencias
procesamiento como hojas, granos y los pri- transgénicas
meros productos de la molienda, pero no en La determinación de secuencias de ADN,
alimentos donde las proteínas se desnatura- molécula que lleva la información genética de
lizan por completo y pierden sus propiedades un organismo, es uno de los ensayos más uti-
inmunológicas. Por otra parte, la detección de lizados para estudiar la presencia de un tran-

gén. Este análisis se lleva a cabo mediante la de sub-muestreo, como se explicó más arriba,
Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR siempre contando con los controles adecuados
en sus siglas en inglés. para el ensayo.
Esta reacción imita lo que ocurre naturalmen- En el caso de la PCR en tiempo real, se ob-
te al momento de duplicarse la carga genética tienen resultados cuantitativos, debido a que
de una célula (duplicación del ADN), sólo que se realiza una reacción con características es-
en este caso se copia un solo y relativamente peciales. La técnica de PCR en tiempo Real re-
pequeño fragmento de ADN de manera tal de sulta ser una alternativa a la PCR convencional
generar miles de copias. La PCR es una reac- con la que se obtienen resultados cuantitativos
ción química exponencial, es decir, a partir de muy precisos del número de copias o la acti-
un fragmento de ADN, se obtienen dos, y de vidad transcripcional de un gen particular en
esos dos, cuatro y luego ocho, etc. Esto hace un menor tiempo. La denominación de “tiempo
que luego de 30 ciclos de amplificación, se ob- real” se debe a que el ADN amplificado pue-
tengan miles y miles de fragmentos iguales, de ser detectado en línea durante el proceso
permitiendo así la visualización de los mismos. de PCR y no al final del mismo, como sucede
Esta visualización puede hacerse mediante con la PCR convencional. La lectura de los re-
distintos procedimientos. Los más frecuentes sultados se realiza durante la fase exponencial
son en geles de agarosa, geles de poliacrilami- de la reacción, garantizando así una cuantifi-
da o sistemas cuantitativos de detección como cación más adecuada y precisa del producto
en el caso de la PCR en tiempo real. amplificado.
La PCR es un proceso altamente específico La PCR en tiempo real permite obtener una
que permite determinar el evento transgénico mayor sensibilidad y especificidad y reduce la
que contiene una muestra, algo que no se pue- posibilidad de contaminación por presencia de
de lograr de manera fehaciente con los otros productos de PCR ya que no es necesario, una
métodos, como los que nos permiten evaluar vez terminada la reacción, manipular los pro-
una respuesta fisiológica o la presencia de de- ductos de amplificación (ver más adelante las
terminadas proteínas. Esta especificidad está consideraciones generales para los ensayos).
dada por los “primers” o cebadores que son pe- Entre las desventajas que presenta frente a la
queños fragmentos de ADN que reconocen la PCR convencional se puede señalar su mayor
secuencia a amplificar y se adhieren a ella (lo costo, tanto en el equipo como en los reacti-
que se conoce como “annealing”) permitiendo vos utilizados y la complejidad del diseño de
iniciar la reacción de amplificación. Distintos los cebadores y sondas, que en muchos casos
“primers” son capaces de pegarse en diferen- resulta más exigente.
tes zonas del fragmento de ADN introducido. La PCR en tiempo real combina el uso de un
Estas zonas son cuatro: secuencias promoto- termociclador, un fluorímetro y un ordenador. El
ras o terminadores que suelen ser comunes a termociclador efectúa la PCR en condiciones
varios eventos; el gen que confiere el carácter donde un fluorocromo excitado por un láser va
específico; una región denominada “construc- emitiendo una señal de manera proporcional a
ción específica” que es aquella que vincula la cantidad de ADN que se va generando du-
distintos elementos del fragmento de ADN in- rante los sucesivos pasos de la reacción. La
troducido, por ejemplo la región promotora y el emisión de la señal fluorescente es enviada al
gen; y lo que se denomina “evento específico” lector de fluorescencia que cuantifica la señal
que es una región que vincula el fragmento in- emitida. El ordenador procesa la información
troducido con el genoma original de la planta. y despliega, durante cada ciclo de amplifica-
El ensayo de PCR puede ser de tipo cualita- ción, la fluorescencia leída en cada muestra.
tivo, lo que se conoce como PCR convencional La señal aparecerá claramente a partir de un
o en tiempo final, o cuantitativo, refiriéndose número determinado de ciclos, dependiendo
a la PCR en tiempo real. En el primer caso, de la concentración de partida de la secuencia
se puede estimar el porcentaje de un OGM en de interés, es decir, la señal es apreciable por
una muestra o lote siguiendo una estrategia el equipo una vez que sobrepasa el límite infe-

rior de detección. A partir de ése momento, la realizará la lectura, identificando los puntos
cinética de la reacción debe permitir la acumu- marcados y por lo tanto las secuencias que es-
lación de la señal de manera exponencial en el tén presentes en la muestra bajo análisis.
tiempo. La señal de fluorescencia generada es La ventaja que presentan las micromatrices
directamente proporcional a la cantidad de pro- es que posibilita la detección simultánea de de-
ducto de PCR amplificado. Existen actualmen- cenas de miles de secuencias de ADN distin-
te distintas metodologías para la detección del tas. Entre los inconvenientes que se presentan
producto de amplificación utilizando la PCR en se puede señalar los costos elevados, la falta
tiempo real. Ellas son las sondas fluorescen- de referencias adecuadas para la validación
tes y los agente intercalantes de ADN. Desde del método, la complejidad sobre los criterios
hace algunos años, esta metodología ha sido a utilizar para la interpretación estadística de
adoptada para realizar los análisis de validez los datos obtenidos así como las dificultades
comercial. para obtener resultados cuantitativos sensibles
y reproducibles para los niveles exigidos en la
Nuevas metodologías actualidad para la detección de OGMs.
Cada vez son más los eventos transgénicos Actualmente se encuentra en el mercado un
aprobados para su comercialización. Anterior- sistema para detección simultánea de eventos
mente, utilizando “primers” para la amplifica- transgénicos que se basa en una PCR en tiem-
ción de la secuencia promotora denominada po final. Es el denominado GMO Dualchip que
35S, o el terminador NOS, comunes a la ma- contiene 14 genes y 20 controles en triplica-
yoría de los eventos, era posible determinar la do. Para más información se puede consultar
presencia de ADN transgénico en una muestra. www.coextra.eu/researchlive/reportage 1120.
Si no se detectaba la presencia de alguna de html.
esas secuencias en la muestra, se podía inferir
que ésta no contenía el 90% de los eventos co- Valoración comparativa de los distintos
merciales. Se prevé que en el futuro, existirán métodos de análisis
gran diversidad de secuencias a determinar
(debido a nuevos genes introducidos) y que, si Ver Tabla comparativa (tabla 1).
las exigencias comerciales de etiquetado con-
tinúan, se requerirá de sistemas más sofistica- Consideraciones generales sobre
dos que permitan detectar varias secuencias a los ensayos
la vez y de manera rápida.
Existe una tecnología, relativamente nue- Falsos Negativos
va, denominada de microchips o microarrays Se define como “falsos negativos” a aquellas
o micromatrices, que podría permitir detectar y reacciones para las que NO se detecta proteína
cuantificar en un solo ensayo la presencia de o secuencia de ADN, cuando en realidad sí la
cientos o miles de secuencias. A grandes ras- contienen. Estos resultados pueden darse por
gos, una micromatriz es un pequeño soporte diversas razones: la presencia de sustancias
sólido del tamaño de un cubre objetos de los inhibidoras de la reacción que se está llevando
utilizados en microscopía óptica, en el cual se a cabo; ADN o proteínas degradados por diver-
han fijado puntos ordenados y microscópicos sos motivos (por ejemplo, tratamientos y tiem-
de secuencias de ADN de simple cadena co- pos excesivos previo al envío de la muestra al
nocidas. Estas secuencias tienen la capacidad laboratorio, por tratamientos de preparación
de pegarse (hibridar) con un ADN que le sea de la muestra en el laboratorio); tamaño de la
complementario, y que estará marcado con muestra inferior al requerido para el análisis;
una molécula fluorescente. Si existen secuen- incorrecta elección del método o de la estrate-
cias complementarias, ocurrirá la hibridación y gia de análisis, presencia del analito a detectar
el punto de la micromatriz quedará marcado. por debajo del límite de detección del método.
Para poder realizar la observación de este pe- Para la detección de los falsos negativos se
queño punto, un aparato de barrido especial utilizan de manera rutinaria distintos controles

Tabla1.
Bioensayo Determinación de proteínas PCR tiempo final PCR tiempo real
Objetivo del Detección de características Detección de proteínas. Detección de secuencias de ADN Detección de secuencias de ADN
ensayo biológicas o de una Determinación de la reacción proteína GM-anticuerpo
respuesta fisiológica
Tipo de resultado Cualitativo Cualitativo Cuantitativo
Cualitativo Semi-cuantitativo (utilizando la estrategia de sub-muestreo) Semi-cuantitativo (utilizando la
ELISA en placa puede ser cuantitativo estrategia de sub-muestreo)
Matriz sobre la que Semillas, granos, plántulas Semillas, granos, material verde joven, raíces, alimentos sin procesamiento Semillas, granos, tejidos, Semillas, granos, tejidos, alimentos con y
se puede realizar alimentos con y sin sin procesamiento
procesamiento
Ventajas Para tolerancia a herbicidas Método sencillo y fácil de llevar a cabo. Permite la detección “in situ”. No Método sensible, exacto y Método sensible, exacto y específico.
(TH): Método sencillo, necesita material ni instalaciones sofisticadas. específico. Permite la identificación y cuantificación
preciso y económico Preciso, exacto y rápido. Permite la identificación especifica de eventos.
específica de eventos. Utilización sobre cualquier tipo de matriz
Utilización sobre cualquier tipo de sin importar grado de procesamiento.
matriz sin importar grado de Método rápido
procesamiento
Desventajas Demora para la lectura de los Necesita una buena expresión de la proteína en la matriz de análisis. Debe Detección compleja si no se Cuantificación compleja si no se definen
resultados (al menos una conservarse intacta la estructura proteica a detectar. No permite la definen adecuadamente el adecuadamente el muestreo, la
semana para TH) identificación entre eventos GM distintos que expresen la misma proteína. muestreo, la estrategia de estrategia de detección y los materiales
Para resistencia a insectos: Problemas para la cuantificación directa (ELISA en placa). No permite la detección y los materiales de de referencia. Mayor costo en equipos y
Método costoso y de identificación de proteínas similares entre la proteína GM y la convencional referencia. reactivos
dificultosa realización Mayor posibilidad de
contaminación.
Mayor costo en equipos y

reactivos.
Preparación de la Preparación sencilla Requiere de pasos previos para la extracción de proteínas. En general son Requiere de pasos previos para Requiere de pasos previos para la
muestra procedimientos sencillos la extracción de ADN. En general extracción de ADN. En general son
son procedimientos de mayor procedimientos de mayor complejidad.
complejidad.
Tiempo promedio Dependiendo del cultivo, Horas Días (2 a 3 días) Días (1 a 2 días)
para obtención de entre 7 y 10 días
los resultados
Nivel de Requiere manejo mínimo de Requiere manejo mínimo de la técnica. Capacitación en técnicas de Capacitación en técnicas de biología
preparación del la técnica. Requiere mayor capacitación en el caso de ELISA en placa. biología molecular molecular
personal
Exigencia para Instalaciones básicas Laboratorio con instalaciones básicas. Puede realizarse in situ (tiras Laboratorio de Biología Molecular Laboratorio de Biología Molecular
instalaciones reactivas) y laboratorios básicos de inmunologia (ELISA en placa)
Aplicación del En general para Determinación de pureza del carácter y presencia adventicia por parte de Determinación de pureza del Por tratarse de determinaciones
método determinación de pureza del organismos de control y/o la industria semillera. carácter y presencia adventicia cuantitativas, es el método de elección
carácter por organismos de por parte de organismos de para transacciones comerciales.
control o la industria control y/o la industria semillera.
semillera. Transacciones comerciales.
Uso habitual En semillas (para TH) Método de screening rápido en semillas, tejidos varios y alimentos sin Transacciones comerciales en Transacciones comerciales en todo tipo
No se aplica hasta el procesamiento todo tipo de matriz de matriz donde exigen resultados
momento para la cuantitativos
característica de resistencia a
insectos
Material de Semillas o granos Material GM y no GM(Granos, semillas y/o tejidos). Harinas GM, ADN y plásmidos. Disponibles Harinas GM, ADN y plásmidos. Disponibles
referencia a utilizar GM y no GM Disponibles comercialmente para algunas especies y eventos. comercialmente para algunas especies comercialmente para algunas especies y eventos.
y eventos.
durante el análisis. Entre estos controles, se presente en la muestra, que puede ser detec-
encuentran las muestras positivas para la ca- tado. Este límite varía de acuerdo al método de
racterística a detectar y controles específicos elección y dentro de cada método, de acuerdo
para la detección de sustancias inhibidoras del al tipo de muestra analizada.
análisis. El límite de cuantificación es la menor con-
centración del analito de interés presente en la
Falsos positivos muestra de estudio que puede ser cuantificado
Se define como “falsos positivos” a aquellas con un aceptable nivel de exactitud y precisión.
reacciones para las que se detecta proteína o En ambos casos, dependerá de la matriz so-
secuencia de ADN, cuando en realidad NO la bre la que se realiza el análisis y del método
contienen. Gran parte de este tipo de resulta- en sí mismo. Es de suma importancia conocer
dos no provienen de la muestra original, sino
estos límites de manera de aplicar adecuada-
que se deben a la contaminación de la misma
mente los métodos. El laboratorio deberá en-
por errores de manipuleo. La contaminación
tonces validar sus metodologías mediante en-
puede darse a lo largo de todo el proceso de
sayos de validación y en lo posible mediante
análisis. Esta puede ser previa al envío de la
misma al laboratorio así como dentro del la- pruebas de interlaboratorio.
boratorio, ya sea durante la preparación de la
misma para el análisis como en el momento Los materiales de referencia
de su detección específica. La técnica de PCR Los materiales de referencia son una herra-
es muy sensible, por lo tanto niveles ínfimos mienta fundamental para cualquier análisis.
de contaminación con ADN en una muestra Por un lado, permiten conocer como se com-
pueden generar un resultado positivo falso. La porta el método con una muestra positiva y con
amplificación repetida del mismo fragmento de una negativa para la característica a detectar,
ADN (amplicón) va generando cientos de miles y por otro son fundamentales para la validación
de millones de copias dentro del mismo labo- del mismo y su comparación con otros labora-
ratorio y estas copias pueden contaminar las torios. Comercialmente se encuentran materia-
nuevas muestras y los reactivos si no se tienen les de referencia disponibles y confiables para
cuidados especiales. Además, restos de mo- distintos eventos y concentraciones. Los más
lienda de semillas o granos u otros tejidos ve- utilizados y difundidos son las harinas o granos
getales de muestras previas, pueden llevar la GM, las secuencias de ADN y los plásmidos.
contaminación a nuevas muestras. Asimismo, En la actualidad no existe un único material
en el caso de la PCR pueden informarse fal- de referencia que pueda aplicarse para la de-
sos positivos por elección de una estrategia de tección y/o cuantificación de todos los produc-
detección inadecuada. Los casos más comu- tos a ser analizados. Ello conduce a que, cuan-
nes se dan cuando se realiza la detección del do estén disponibles, éstos deben ser elegidos
Promotor 35S en crucíferas o en alimentos que y utilizados de acuerdo al tipo de matriz que se
las contengan (por infección con el virus del quiere analizar. No siempre es sencillo estable-
Mosaico del Coliflor) y en el caso de Agrobac-
cer cuál es el mejor material de referencia a ser
terium con la detección del Terminador NOS.
utilizado como control positivo, sobre todo para
Para la detección de los falsos positivos se
efectos de cuantificación, ya que el número de
utilizan de manera rutinaria controles nega-
copias por genoma haploide varía para cada
tivos. Estos controles consisten en muestras
que no contienen la característica especial que evento, además de la existencia de variables
cada método permite detectar (secuencia de propias para las matrices de cada muestra.
ADN, proteína o directamente la matriz a ana- En relación a los controles negativos, se debe
lizar). asegurar la ausencia de la característica GM
por debajo de cierto umbral y con un rango de
Límite de Detección y Límite de tolerancia.
Cuantificación La temática de los materiales de referencia
Se considera como límite de detección a la presenta una serie de consideraciones, com-
mínima concentración del analito de interés plejidades, problemáticas y usos que exceden

los límites de este capítulo. Es por ello que sólo Existen además múltiples consideraciones,
se hace esta mención a los mismos. ya sean biológicas, de muestreo o del método
analítico a tener en cuenta cuando se realiza la
Redacción del informe de resultados cuantificación. Entre ellas señalamos el estado
Los resultados de cada ensayo efectuado de ploidía de la matriz bajo análisis, el esta-
por el laboratorio, deben ser informados en do de cigosis, el método de detección elegido,
forma exacta, clara, no ambigua y objetiva. Es el muestreo utilizado y la cantidad de muestra
necesario que se especifiquen los datos del la- para la realización del análisis así como los ma-
boratorio que realizó el ensayo y los datos del teriales de referencia utilizados y la presencia
cliente, así como también la descripción del de eventos apilados en la matriz bajo estudio.
método utilizado con sus respectivos límites de
detección y cuantificación, cuando correspon- Consideraciones generales para la
da. Además, deben indicarse las condiciones infraestructura básica de los laboratorios
y cantidad de muestra recibida en el laborato- El laboratorio donde se realizan los análisis
rio así como la cantidad utilizada para hacer debe ser un ámbito de trabajo que permita la
el análisis, los materiales de referencia utili- adecuada realización de los mismos. Para ello
zados y su resultado (que deben ser según lo se requiere contar con instalaciones y condi-
esperado), el nivel de confianza de la prueba y ciones ambientales que cumplan con los requi-
cualquier observación o interpretación que se sitos de confort y con los recursos necesarios
considere necesaria. para no poner en riesgo al personal que tra-
La forma correcta de presentar los resulta- baja en el mismo ni la calidad de los análisis
dos para análisis de tipo cualitativo debe conte- realizados. El grado de complejidad de esta
ner: “No se detectó” o en el caso de dar positivo infraestructura depende del tipo de análisis en
“Se detectó la presencia de material GM o de cuestión. Los laboratorios con mayor grado de
la secuencia XX o proteína XX en la muestra sofisticación en su infraestructura y condicio-
al límite de detección de la técnica”. Cuando nes de trabajo son aquellos que utilizan la téc-
corresponda, se puede informar el lote a partir nica de PCR.
del cual se tomó la muestra analizada. Debido a la contaminación cruzada que se
En el caso de resultados para análisis cuan-
puede originar, especialmente cuando se rea-
titativos, se informará como "Menor al límite de
lizan ensayos por PCR, es fundamental tener
detección de la técnica” (para aquellos resulta-
máximos cuidados en el manipuleo de las
dos donde no se detecte el analito en estudio)
muestras y de todos los materiales e instru-
y en valor numérico (porcentaje) cuando el re-
mentos utilizados para realizar los ensayos.
sultado sea positivo y no supere el rango de
En este tipo de laboratorios se requiere de un
linealidad del método de laboratorio. Siempre
ámbito de trabajo especialmente diseñado con
deben quedar indicadas en el informe las uni-
cuatro áreas separadas para las distintas eta-
dades en las que se expresan los resultados
pas del análisis y con un flujo unidireccional
así como los límites de detección, de cuantifi-
de la muestra desde el ingreso (zona limpia,
cación y la incertidumbre para la matriz en es-
tudio. donde no hay productos de amplificación) has-
En el caso de análisis por PCR todavía no ta la zona donde se leerá el resultado (zona
existe una única forma de expresar los resul- "sucia").
tados. Es por ello muy importante para la com- En el primer cuarto se realiza la preparación
prensión de los resultados que cada laboratorio -y en aquellos caso que se requiera- molien-
indique claramente las unidades en que infor- da de la muestra, en el segundo se realiza la
man los mismos. Algunas de estas expresio- extracción y purificación el ADN, en un tercero
nes refieren a “masa GM/masa total de la ma- se prepara la reacción de PCR y en el último
triz”, “secuencias de ADN GM /ADN total en la se produce la amplificación (y observación del
matriz por especie”. Para el caso de semillas, resultado en el caso de la PCR cuantitativa) y
ISTA se ha manifestado al respecto (consultar luego la electroforesis. En este último paso,
www.seedtest.org). para el método de PCR en tiempo final, se abre

el tubo de reacción y es donde existe mayor muestras propuesta por la CEN, fue rechaza-
posibilidad de “escape” de los productos de da por ISO, dado que manifestó que ya cont-
amplificación, por lo tanto es el punto de mayor aba con normas específicas para la toma de
posibilidad de contaminación. Es conveniente muestra para el caso de cereales y oleagino-
que el primer y último cuarto tengan presión sas. Este documento sólo continuó su estudio
negativa (de manera de sacar al exterior la po- dentro de la normativa CEN.
sible fuente de contaminación), mientras que
en el de purificación y PCR la presión debe ser Reglas ISTA
positiva (permitiendo el ingreso de aire limpio). La Asociación Internacional de Análisis en
Cada cuarto debe ser limpiado regularmen- Semillas (ISTA en sus siglas en inglés) pub-
te con hipoclorito de sodio, en lo posible po- licó en el año 2006 su estrategia para la de-
seer un sistema de luz ultra violeta (UV) para terminación de semillas GM. Específicamente
la destrucción del ADN y contar con sus pro- manifiesta que, debido a que las técnicas para
pios elementos de seguridad para el trabajo determinación de trangénicos son tan diversas,
(guardapolvos, guantes, anteojos protectores), y que se espera que continuamente se incor-
instrumentos y materiales (equipos en general, poren nuevos ensayos debido a la aparición
pipetas, tips). Se recomienda que sólo perso- de nuevos eventos, no es posible fijar metod-
nal autorizado para el trabajo dentro de cada ologías. Es por ello, que elabora una estrategia
área ingrese a los laboratorios para minimizar de acreditación de laboratorios para la detec-
el transporte de productos de amplificación de ción de características específicas. La misma
un cuarto a otro. se basa en el cumplimiento de una serie de
requisitos técnicos, de capacitación, de desem-
Los organismos internacionales y peño y de la gestión por parte de los laborato-
la determinación de OGM rios. Más detalles sobre los documentos referi-
Normas ISO dos a este tema se pueden encontrar en www.
La Internacional Standarization Organiza- seedtest.org.
tion (ISO en sus siglas en inglés), a través del
Working Group 7 (WG 7) se ha ocupado en los Consideraciones finales
últimos 8 años de la redacción de normas es- El desarrollo y aprobación para la comercial-
pecíficas en el tema. Estas se han desarrollado ización de los distintos cultivos genéticamente
bajo el Acuerdo de Viena donde la Comisión modificados en el mundo ha generado diversas
Europea de Normas (CEN) es quien lidera el y variadas acciones y reacciones. En el ámbito
desarrollo normativo. En la actualidad 5 nor- del comercio mundial se han puesto en marcha
mas han sido publicadas bajo el Acuerdo y una distintos procedimientos, legislaciones y proto-
Especificación Técnica (TS) que sólo fue publi- colos tendientes a conocer y regular su produc-
cada por ISO. Estas normas son: ción y comercialización.
Protein Based Methods (ISO 21572 - Publi- La necesidad de monitorear, identificar y en
cada en 2004; Modificada en el año 2005 don- algunos casos cuantificar la presencia o no
de el anexo pasó a ser informativo). de OGMs y sus derivados ha generado el de-
Nucleic Acid Extraction (ISO 21571 – Publi- sarrollo y la implementación de distintas her-
cada en febrero 2005). ramientas analíticas que permiten la detección
Qualitative Nucleic Acid Based Methods (ISO de los diferentes cultivos GM y sus derivados.
21569 - Publicada en julio 2005). Asimismo, los laboratorios han debido desarr-
Quantitative Nucleic Acid Based Methods ollar, adaptar y validar métodos para poder de-
(ISO 21570 - Publicada en noviembre 2005). tectar este tipo de eventos.
General Requirements and Definitions (ISO Distintos organismos internacionales dedica-
24276 - Publicada en febrero 2006). dos a la elaboración de normas se han ocupado
Acceptability Criteria for Methods (TS – ISO del desarrollo de diversos procedimientos con
21098 - Publicada en febrero 2006). la intención de unificar criterios para la determi-
La norma que discute el tema de toma de nación de OGMs. Este desarrollo normativo se

encuentra todavía en discusión, principalmente Tozzini, Alejandro. 2004. Detección de OGM en la
para el caso de granos y alimentos. Los princi- cadena agroalimentaria. Parte IX, Capítulo 4.
pales puntos de conflicto se refieren a la toma Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Editores
de muestra y a la expresión de los resultados Viviana Echenique, Clara Rubinstein, Luis
Mroginski, Buenos Aires. Ediciones INTA.
para las PCR cuantitativas.
La constante aprobación de nuevos even-
tos en los distintos países plantea el desafío
de la continua actualización y el desarrollo de
nuevos métodos y sistemas para la determi-
nación de OGMs en semillas granos y alimen-
tos que se dirigen a países con sistemas de
control de OGMs
Es de esperar que en el futuro las decisiones
que involucren la implementación de siste-
mas de control de OGMs tengan en cuenta las
distintas y múltiples voces y situaciones, aun
aquellas que parecen antagónicas. Para ello,
será fundamental que las decisiones políticas
y los fundamentos científicos trabajen de man-
era conjunta y coordinada.
CONABIA. Definición de eventos.

h t t p : / / w w w. s a g p y a . m e c o n . g o v. a r / n e w / 0 - 0 /
programas/biotecnologia/respuestas.php
CONABIA. Eventos aprobados comerciales.
h t t p : / / w w w. s a g p y a . m e c o n . g o v. a r / n e w / 0 -
0/programas/conabia/bioseguridad_
agropecuaria2.php#eventos
ISAAA. www.ISAAA.org.
http://www.isaaa.org/resources/publications/
briefs/37/executivesummary/default.html
ISTA www.seedtest.org. Herramientas estadísticas
para el análisis de semillas.
http://www.seedtest.org/en/content---1--1143.html
ISTA www.seedtest.org. Información referida a
análisis de OGM.
http://www.seedtest.org/en/info_platform_for_gm_
seed_content---1--1195.html.
ISTA www.seedtest.org. Acreditación de Laboratorios
que realizan ensayos de determinación de OGM.
http://www.seedtest.org/en/for_specified_traits_
content---1--1184.html
ISTA www.seedtest.org. Posición respecto de las
unidades de medida.
h t t p : / / w w w. s e e d t e s t . o r g / e n / c l a r i f i c a t i o n _
document_+units+_content---1--1273.html
Longo, F, y Castro, IG. 2006. Métodos de Detección
de Organismos Genéticamente Modificados
(OGMs) en la Cadena Alimentaria. Conceptos
básicos para su implementación. Buenos Aires.
Editor: Juan Dellacha. 64 páginas.

VI. CAPÍTULO 5 no sólo un riesgo en cuanto a la efectividad de
los cultivos Bt, sino que también en cuanto a la
pérdida de uno de los más exitosos insectici-
Manejo integrado de plagas – das microbianos con los que se contaba hasta
Programa de Refugios ese momento. Se consideró necesario enton-
ces crear un programa de “manejo integrado
Viviana Confalonieri; Cecilia Roca de plagas” específicamente diseñado para el
sector agropecuario, que prevenga justamente
La bioseguridad es uno de los puntos clave el aumento de la resistencia en las poblaciones
que debe ser abordado cuando se introducen de insectos que se quería atacar.
organismos genéticamente modificados (OGM) El programa de manejo mas conocido que
en un ecosistema, así como la perduración en se aplica en la actualidad es el de “alta dosis +
el tiempo del efecto benéfico de estos OGM, refugio” a través del cual altos niveles de expre-
particularmente en aquellos casos en los que sión de la toxina en las plantas Bt se asocian a
se han introducido genes de tipo insecticida. “refugios” o extensiones de campo cultivados
Los cultivos GM con propiedades insectici- con plantas libres de Bt. Este programa se vie-
das que se encuentran actualmente en el mer- ne aplicando hasta ahora con relativo éxito en
cado, producen una proteína cristalina (Cry) plantas transgénicas para una única toxina y
que proviene de la bacteria Bacillus thuringien- se cree que será necesario de aplicar también
sis (Bt). Estas proteínas son letales para los in- para los cultivos “dobles Bt”.
sectos susceptibles ya que al ser ingeridas de- La función de los refugios es la de mantener
gradan las paredes de su tubo digestivo. Este alelos susceptibles en las poblaciones de in-
efecto constituye la base de la defensa contra sectos. Los insectos susceptibles que se desa-
insectos plaga de todos de los OGM comercia- rrollan en gran número sobre plantas no trans-
les que se cultivan de la actualidad, reduciendo génicas se cruzarán con los potenciales insec-
de este modo el uso de insecticidas químicos, tos resistentes que puedan sobrevivir en las
lo que se traduce en beneficios tanto económi- plantas transgénicas. La progenie heterocigota
cos como para la salud y el medio ambiente. que resulte de estos cruzamientos será elimi-
Los organismos Bt fueron cultivados por nada por las altas dosis de proteína insecticida
primera vez a gran escala en 1996, gracias al presente en las plantas transgénicas (figura 1).
aval de la “Environmental Protection Agency” En este sentido, juega un papel importante la
(EPA) que permitió su uso comercial. En el año dosis de la toxina en las plantas Bt, ya que la
2007, casi 42 millones de hectáreas en todo dominancia funcional de los resistentes dismi-
el mundo presentaban estos cultivos, con una nuye a medida que aumenta la concentración
cantidad acumulativa de más de 200 millones de la toxina. Si los heterocigotos mueren en las
desde 1996. Aunque en la actualidad existe plantas Bt, condición que se cumple a medida
una gran diversidad de toxinas Bt, durante la que el alelo resistente se hace mas recesivo, la
primera década se cultivaron casi exclusiva- resistencia tardará muchas mas generaciones
mente algodón y maíces transgénicos para las en fijarse.
toxinas Cry1Ac y Cry1Ab, respectivamente. La teoría que subyace a los programas de
Estas toxinas matan alguna de las más impor- manejo integrado se basa fundamentalmente
tantes plagas de lepidópteros. en modelos genético-poblacionales. Los mo-
El aval dado por la EPA en 1996 fue consi- delos son conjuntos de hipótesis sobre como
derado por muchos científicos y ambientalistas se relacionan determinados parámetros en un
como muy prematuro. La mayor preocupación sistema, y permiten simplificar una realidad en
era que se carecía de información sobre la la que interactúan diversos factores de manera
forma de evitar que las especies blanco ge- compleja. Los parámetros que se incorporan
neraran resistencia al carácter introducido, ya en este caso son poblacionales, tales como las
que existían evidencias de que éste fenómeno frecuencias iniciales de los alelos de resisten-
podía ocurrir en el laboratorio. Esto implicaba cia y los coeficientes de selección asociados a

neraciones. El carácter se su-
pone que presenta cierto valor
selectivo, el cual varía de acuer-
do al microambiente disponible:
zona con plantas Bt y zona libre
de plantas Bt (refugio). Asimis-
mo, existirían sólo dos alelos
para ese carácter, S o alelo de
sensibilidad y R, o alelo de re-
sistencia. Se definirá “p” como
la frecuencia poblacional del
alelo “R” y “q” como la frecuen-
Figura 1. RR, RS y SS genotipos homocigotos resistentes, cia del alelo “S”.
heterocigotos y homocigotos sensibles a la toxina Bt, respec- Otros supuestos serán que:
tivamente. Las flechas indican que los insectos pueden circu- • las generaciones de in-
lar libremente entre las regiones con plantas transgénicas Bt sectos no se superponen.
y con plantas libres de Bt, o refugios. • las poblaciones son de ta-
maño infinito.
• el apareamiento es al
azar.
los distintos fenotipos sensibles y resistentes. • no existe migración.
De este modo, es posible predecir bajo distin- • no existe mutación.
tas condiciones ambientales, como será la evo- • los coeficientes de selección son simila-
lución del carácter en cuestión y estimar valores en ambos sexos.
res de fundamental importancia para el sector A continuación se deducirá el cambio en la
agropecuario, como lo es el porcentaje mínimo frecuencia del alelo R luego de una genera-
de superficie libre de Bt que se requiere cultivar ción de selección, siguiendo el modelo clásico
para evitar que el alelo de resistencia se fije. descrito en Hartl y Clark (1989) (tabla 1). En la
El propósito de este capítulo es explicar des- generación “t” se parte de gametas portadoras
de una perspectiva genético-poblacional los del alelo de resistencia R y gametas portadoras
fundamentos de estos modelos teóricos y su del alelo de sensibilidad S, en frecuencias p y q
valor como herramienta predictiva en progra- respectivamente. Debido a que existe aparea-
mas de manejo integrado de plagas. Asimismo, miento aleatorio, las frecuencias de los zigotos
otro objetivo es el de describir los elementos que se formen responderán a las frecuencias
típicos que componen un plan de manejo de del equilibrio de Hardy Weinberg: p2 , 2pq y q2.
resistencia de insectos y por último, presentar Sin embargo, sobre esos zigotos actuará la se-
un panorama sobre la manera en que estos lección natural (ejercida en este caso particular
planes se aplican en Argentina. por los efectos de la toxina Bt) modificando la
contribución de adultos a esa generación t + 1
Modelos poblacionales y la de los genotipos RR, SR y SS en un factor que
evolución del gen de resistencia dependerá del valor adaptativo (W) de cada
Como se mencionó previamente, los mode- uno de ellos (WRR, WSR y WSS respectivamente)
los son simplificaciones de una realidad que (tabla 1). Las frecuencias genotípicas relativas
es de por sí compleja. Estas simplificaciones se calculan dividiendo por el valor adaptativo
implican supuestos que se deben cumplir si se medio de la población (W M) que es igual a:
quiere que el modelo efectivamente refleje esa
realidad. En el caso particular que se trata en WM = p2 W RR +2pq W SR + q2 W SS = p (p W RR
este capítulo se trabajará con una población + q W SR) + q (q W SS + p W SR)
de insectos que presenta variabilidad para el
carácter “resistencia a la toxina Bt”, y se ana- Las frecuencias de las gametas de cada tipo
lizará, mediante modelos matemáticos, como (p y q) en la generación t + 1 se calculan me-
evolucionaría ese carácter a través de las ge- diante la fórmula:

Tabla 1. Cambio en las frecuencias genotípicas relativas luego de una generación de selección.
Generación Estadio del ciclo de Frecuencias

vida
t Gametas R S
Frecuencia de las
p q
gametas
t+1 Genotipos RR SR SS
Frecuencia de los
p2 2pq q
2
genotipos (zigotos)
Fitness (viabilidad) W RR W SR W SS
Contribución ponderada
p2 W RR 2pq W SR 2
q W SS
(adultos)
Frecuencia relativa de
cada genotipo luego de
p2 W RR / W M 2pq W SR / W M Q2 W SS / W M
una generación de
selección
p= frecuencia relativa de homocigotos RR + Estimación de los valores adaptativos

½ de la frecuencia relativa de het. SR Los valores adaptativos de los homocigotas
q= frecuencia relativa de homocigotos SS + susceptibles y resistentes serán distintos de-
½ de la frecuencia relativa de het. SR pendiendo del origen de dichos individuos. El
Reemplazando de acuerdo a la tabla 1, se valor adaptativo medio de estos dos genotipos
obtiene:
deberá tener en cuenta entonces el porcentaje
relativo de refugio y plantas Bt cultivado, como
pt+1= (p2 WRR + ½ 2pq WSR ) / WM = (p (p WRR
+ q WSR))/ WM sigue:
qt+1= (q2 WSS + ½ 2pq WSR) / WM = (q (q WSS
+ p WSR)) / WM WRR = ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt ) ec.2
WSS = ref (WSS/ref ) + Bt (WSS/Bt ) ec.3
El cambio en la frecuencia génica luego de
una generación de selección para el alelo R, donde ref y Bt (= 1- ref ) son las proporciones
∆p, será entonces: de hectáreas cultivadas de refugio y plantas Bt,
respectivamente; WRR/ref y WRR/Bt son los valores
∆p = pt+1 – pt =((p (p WRR + q WSR)) / WM ) - p adaptativos de los individuos RR en el refugio y
en los campos con plantas Bt, respectivamen-
que es lo mismo que, te; y WSS/ref y WSS/Bt son los valores adaptativos
∆p= (p q (p (WRR - WSR) + q (WSR – WSS))) /
de los individuos SS en el refugio y en los cam-
WM ec.1
pos con plantas Bt, respectivamente.
De este modo se llega a un modelo poblacio-
nal que permitirá estimar cómo será el cambio Si bien existen distintos valores de domi-
en la frecuencia del gen de resistencia, el cual nancias funcionales para el alelo resistente,
dependerá de su frecuencia inicial y de los va- se considerará para todos los cálculos que la
lores adaptativos de los tres genotipos. resistencia es recesiva. De hecho, las altas

dosis de toxina Bt tienen por objeto llevar a la por lo tanto en el equilibrio
dominancia funcional del resistente a cero, lo p (WRR - WSR) + q (WSR – WSS) = 0
que favorece el retraso en el aumento de la ec.4
frecuencia de este alelo en las poblaciones.
Por lo tanto, se considerará que WSS = WRS. En Si se supone que el alelo de resistencia es
Tabashnik y col. (2005) se describe detallada- completamente recesivo, entonces WSS = WSR
mente cómo calcular empíricamente los costos por lo tanto el segundo término de la ecuación
4 se anula, y al reemplazar WSR por WSS en el
selectivos, lo cual se lleva a cabo, en términos
primer término, esta ecuación se reduce a:
generales, analizando la supervivencia relativa
de las larvas de líneas sensibles y resistentes p (WRR - WSS) = 0 ec.5
sobre plantas Bt y libres de Bt, tanto en el cam-
po como en estaciones experimentales. Sustituyendo WRR y WSS según las ecuacio-
nes 2 y 3 del apartado anterior, se obtiene:
Estimación del porcentaje de
refugio en condiciones de p ((ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt )) – (ref (WSS/ref ) +
equilibrio Bt (WSS/Bt ))) = 0
En genética de poblaciones se denomina
Teniendo en cuenta que p>0, y que el valor
“condición de equilibrio” aquella en la que no
selectivo de los individuos homocigotas sus-
existe un cambio neto en las frecuencias aléli-
ceptibles en los campos Bt (WSS/Bt) es 0, en-
cas de un determinado carácter a través de las tonces,
generaciones. En el caso particular de los cul-
tivos transgénicos Bt, el objetivo que se quiere ref (WRR/ref ) + Bt (WRR/Bt ) – ref (WSS/ref )= 0
lograr es el de llegar a ese equilibrio, mante- es decir,
niendo estable la frecuencia del alelo de resis- Bt (WRR/Bt) - ref (WSS/ref - WRR/ref) = 0
tencia en las poblaciones de insectos, con el ec.6
fin de que no se diluya el efecto insecticida del
Bt. El “programa de refugios”, que implica cul- La resistencia se mantendrá estable, enton-
ces, cuando el efecto neto de la selección para
tivar zonas con plantas libres de Bt junto a los
resistencia que favorece a los RR en los cam-
campos con plantas Bt, persigue justamente
pos Bt sea igual al efecto neto de los costos
ese objetivo: el de generar un microambiente de selección en contra de ese mismo genotipo
en donde los valores selectivos de los indivi- en los refugios. La frecuencia de la resistencia
duos sensibles a la toxina Bt sea máximo, ase- disminuirá si aumenta el porcentaje de refugio,
gurando de este modo que el alelo S nunca se disminuye el valor selectivo de los resistentes
pierda. El problema que surge entonces para en campos libres de Bt, y aumenta la desven-
el productor agrícola es cuál será el porcentaje taja de los resistentes en los campos Bt en re-
mínimo que se debe cultivar con plantas libres lación a los campos libres de Bt.
de Bt para que el programa funcione, ya que es Por lo tanto, el porcentaje de refugio ade-
cuado para que el alelo de resistencia se man-
obvio que el rendimiento económico de estas
tenga estable se puede estimar mediante la
plantas susceptibles de ser atacadas por los
ecuación 6 siempre y cuando se conozcan los
lepidópteros será menor. distintos valores selectivos. Por ejemplo, en un
El porcentaje de refugio necesario para que estudio realizado en campos de algodón de
se alcance la condición de equilibrio se puede Arizona entre los años 1997 y 2004, Tabash-
deducir de la ecuación 1 (ec.1) como sigue: nik y col. (2005) estimaron que, de acuerdo a
valores selectivos empíricos medios de los RR
∆p= (p q (p (WRR - WSR) + q (WSR – WSS))) / en los refugios, y en los campos Bt de esa re-
WM = 0 gión, la frecuencia del alelo de resistencia se

mantendrá estable con valores de porcentaje el porcentaje de refugio para las dos primeras
de refugios que ronden el 23%. Sin embargo, regiones de 39%, y para Carolina del Norte del
este valor obtenido de tamaño de refugio para 82%. Con estos tamaños, H. zea fijaría la resis-
el equilibrio, que como veremos mas adelante tencia en 9 años en Arkansas y Missisipi, y en
es un valor relativamente bajo en comparación mucho mas de 20 años en Carolina del Norte.
a los que se consideran en la práctica valores Es evidente entonces que el porcentaje más
efectivos de tamaños de refugios, se basó en alto de refugio, está impidiendo que la resis-
estimas de valores selectivos de los individuos tencia evolucione más rápidamente en pobla-
resistentes en los campos Bt (WRR/Bt) que tam- ciones de H. zea de Carolina del Norte. Altos
bién fueron bajos. porcentajes de refugios también retardaron la
evolución de la resistencia de H. armigera a
Modelos teóricos vs. datos reales: Cry1Ac en Australia y China, de P. gossypiella
¿funcionan los refugios? en Arizona, y de S. nonagrioides en España.
Un estudio recientemente publicado que En Australia, el tamaño del refugio fue del 70%,
recavó información de monitoreo de la evolu- en China del 87-95%, en Arizona, del 50% y
ción de la resistencia en distintos países de en España fue de alrededor del 95%. Sin em-
todo el mundo, demostró que la estrategia de bargo, en estas especies una ventaja adicio-
los refugios es en general efectiva y que los nal con respecto a H. zea fue la dominancia
modelos teóricos son herramienta útiles para funcional (h) del gen de resistencia, que en la
predecir dicha evolución bajo distintos escena- mayoría de ellas es completamente recesivo
rios. El estudio se basó en resultados previos (h=0) y en H. zea tiene un valor alto (h=0,826)
de análisis de la resistencia a Bt en campos favoreciendo la fijación rápida de la resistencia.
de Australia, China, Japón, España y Estados Por último, cabe destacar que un estudio
Unidos, de seis de las principales plagas de reciente de simulación que aplica modelos ge-
insectos: Helicoverpa armigera, H. zea, Helio- nético poblacionales como los expuestos aquí,
this virescens, Ostrina nubilalis, Pectinophora pero que contemplan un mayor número de pa-
gossypiella y Sesamia nonagrioides. Sólo en rámetros en el cálculo de los valores adapta-
Helicoverpa zea se observó evolución para la tivos (por ejemplo la reducción en la tasa de
resistencia, medida mediante bioensayos, los mortalidad de los genotipos sensibles a medi-
que demostraron un aumento en la concen- da que aumenta la edad de la planta y dismi-
tración media letal (LC50) de toxina Bt Cry 1Ac nuye la expresión de la toxina, o la mortalidad
para poblaciones coleccionadas en campos inducida por insecticidas químicos fumigados
cultivados con plantas Bt, en comparación con en la zona de refugios) demuestra de manera
cepas específicas de laboratorio que nunca teórica que los refugios siguen siendo esencia-
habían sido expuestas a una dieta Bt. Cuando les incluso en el caso de cultivos de algodón
se incorporaron los parámetros reales iniciales que expresan dos toxinas. Estos cultivos “do-
del monitoreo (frecuencias iniciales, porcenta- bles Bt” se comenzaron a comercializar hace
je de refugio, valores selectivos) a los modelos relativamente poco tiempo, por lo que faltan al-
teóricos, se obtuvieron resultados similares en gunos años para poner a prueba mediante da-
el cambio esperado teórico en dichas frecuen- tos de monitoreo a campo estas simulaciones
cias que las obtenidas al cabo de unos años teóricas y demostrar, una vez mas la efectivi-
de observación, demostrando la efectividad de dad real de los refugios.
los modelos para la predicción futura en pro-
gramas de manejo integrado de plagas. Elementos típicos de un plan de
Los modelos teóricos predicen que H. zea manejo de resistencia
evolucionará mas rápido para resistencia que El desarrollo de resistencia en las poblacio-
las otras plagas antes mencionadas. De hecho, nes de insectos, consecuencia del proceso na-
el aumento en la frecuencia del alelo de resis- tural de evolución, surge como adaptación a
tencia en esta especie fue mayor en Arkansas las prácticas de manejo y por ende no se limita
y Missisipi que en Carolina del Norte, siendo a un sistema particular de cultivo. Los insectos

pueden adaptarse a cualquier práctica de ma- diagnóstico de la situación con respecto a la
nejo dependiendo de la presión de selección adopción de los refugios, no sólo para medir
ejercida sobre ellos. Hay numerosos ejemplos la aplicación real de la práctica, sino también
de este fenómeno en insectos que han desa- como herramienta para ajustar la estrategia
rrollado mecanismos de defensa fisiológicos, de comunicación dirigida al productor. Las en-
de comportamiento y metabólicos frente a in- cuestas periódicas son una herramienta utiliza-
secticidas químicos, agentes de control bioló- da en muchos países para estas mediciones.
gico y controles culturales.
3) Monitoreo. El objetivo del monitoreo es
En el caso particular de la tecnología Bt la
detectar y confirmar cualquier posible desarro-
presencia de la proteína durante todo el pe- llo de resistencia con la suficiente antelación
ríodo de crecimiento del cultivo, aumenta la como para implementar medidas de remedia-
presión de selección y hace necesaria la incor- ción que permitan retrasar o prevenir la difu-
poración de refugios para el manejo de resis- sión de la resistencia y evitar que se pierda
tencia de insectos (IRM) y como parte integra- la capacidad de control de los maíces Bt. La
da del método de manejo de plagas. En todos herramienta apropiada para monitorear la re-
los países donde esta tecnología se encuentra sistencia a campo depende del patrón de evo-
disponible se han desarrollado programas de lución de la resistencia. El patrón espacial de
manejo de resistencia de insectos. Estos pro- evolución de la resistencia en el campo pue-
gramas son desarrollados en forma local y en de surgir en un foco localizado que evoluciona
colaboración entre los sectores académicos y rápidamente y se expande, o a partir de una
de investigación, los gobiernos y la industria, población donde la resistencia está dispersa y
sobre bases científicas y analizando la situa- evoluciona lentamente con un incremento más
ción local en cuanto a plagas presentes y el gradual en la frecuencia de alelos resistentes.
Es improbable que el muestreo al azar de la
ambiente agroecológico.
población permita detectar resistencia localiza-
Los elementos típicos de un plan de manejo
da, a menos que se lleve a cabo a una escala
de resistencia incluyen: impracticable. En estos casos es mejor utilizar
como herramienta de monitoreo la identifica-
1) Investigación. Las características de los ción de lotes del cultivo con daños no espera-
refugios están dadas por su tamaño (porcenta- dos en las plantas. Para esto es fundamental
je sobre el total del área sembrada con maíz), que los productores estén capacitados para
distancia entre ellos y forma. Si bien general- informar a la empresa proveedora de semilla
mente en todos los países se utilizan recomen- la presencia de plantas del lote con daños de
daciones similares que garantizan ampliamen- larvas. Una vez detectado e informado el daño
te un correcto manejo de resistencia de insec- no esperado, se deberá confirmar que la planta
tos, las características de los refugios estarán es una planta Bt, que se esté expresando en
dadas entre otras cosas por las plagas objetivo sus tejidos el nivel de proteína esperado y que
presentes, por lo tanto los programas se sus- el daño no haya sido producido por otra espe-
tentan sobre ensayos que permiten ampliar las cie no susceptible al maíz Bt o por cuestiones
climáticas. Por otra parte, si la resistencia evo-
herramientas disponibles para evaluar las re-
luciona lentamente a partir de áreas dispersas,
comendaciones de IRM dadas al productor.
los daños no esperados sólo podrán ser detec-
tados cuando una gran proporción de la pobla-
2) Comunicación. Debido al papel clave del ción se haya vuelto resistente. En este caso,
conocimiento del productor en el logro de un la herramienta de monitoreo apropiada es el
manejo exitoso y responsable de los maíces muestreo al azar de la población y el análisis
Bt, la comunicación es uno de los pilares de en laboratorio para detectar frecuencias relati-
los programas de IRM. Los materiales educa- vamente bajas de alelos de resistencia.
tivos, la difusión en los medios especializados
y la capacitación directa a los productores son 4) Remediación. En caso de confirmarse la
algunas de las herramientas más utilizadas aparición de resistencia, deberá aplicarse un
para lograrlo. Por otra parte es importante el plan de remediación que permita reducir la fre-

cuencia de insectos resistentes. Cuando la reque permita retrasar cualquier potencial desa-
sistencia se detecta a través de la aparición de rrollo de resistencia y detectar inmediatamente
plantas con daños no esperados en el cultivo, cualquier cambio en la susceptibilidad de la po-
es esperable que la proporción de resistencia blación de insectos.
en la población de insectos sea significativa. En Para cumplir con el objetivo propuesto, ASA fi-
este caso las acciones a tomar podrán incluir la nancia estudios locales realizados por del INTA,
aplicación de insecticidas químicos para redu- la Estación Agro Industrial Obispo Colombres, y
cir la frecuencia de insectos resistentes e inclu- profesionales de laboratorios privados, que per-
so la suspensión de la aplicación de cultivos Bt miten ampliar la comprensión de la bioecología
en la zona afectada. Por el contrario, si a tra- de las plagas objetivo y contar con herramientas
vés de un programa de monitoreo al azar y del para monitorear su susceptibilidad a las proteí-
análisis en laboratorio se detectara la presen- nas Bt actualmente en el mercado.
cia de alelos de resistencia en una población Con respecto a la comunicación hacia el pro-
de insectos, pero la resistencia no se hubiera ductor y a la difusión del manejo adecuado de la
manifestado aún a campo, se podrían tomar
tecnología Bt, ASA hace especial hincapié en la
otras medidas para caracterizar la resistencia
difusión de un mensaje unificado entre todas las
y, de ser necesario, disminuir su dispersión.
empresas quienes se encuentran activamente
Estas medidas podrían incluir la confirmación
comprometidas con el programa, como sigue:
de la heredabilidad de la resistencia, determi-
Los refugios deben sembrarse con un maíz
nar si la resistencia es recesiva o dominante,
no Bt de ciclo similar en la misma fecha de siem-
su frecuencia, etc.
bra que el lote Bt.
El manejo de la resistencia a El refugio debe ser el 10% de la superficie del
insectos en Argentina lote. Por ejemplo, cada 9 hectáreas sembradas
En Argentina, el Programa de Manejo de Re- con maíz Bt, debemos sembrar 1 hectárea con
sistencia de Insectos (MRI) en maíz Bt apro- maíz no Bt.
bado por la Comisión Nacional Asesora de Los refugios deben sembrarse en bloque en
Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) en uno de los bordes del lote. Si el lote mide más
1999, es llevado a cabo por la Asociación de de 1500 m de lado, el bloque de refugio deberá
Semilleros Argentinos (ASA) entidad que nu- sembrarse en el centro del mismo, para asegu-
clea a todas las empresas que comercializan rar que los insectos del refugio puedan volar y
maíz Bt en el país. El objetivo del programa es cruzarse con cualquier potencial sobreviviente
promover un uso responsable de la tecnología, del maíz Bt. (figura 2).
Tratamientos químicos: a) No
deben realizarse aplicaciones de
insecticidas para el control del
barrenador del tallo (Diatraea sa-
ccharalis) en los refugios. b) En
caso de detectarse ataque de gu-
sano cogollero (Spodoptera frugi-
perda) por encima del umbral de
acción, pueden aplicarse insecti-
cidas. El mejor control del gusano
cogollero se obtiene con aplica-
ción de insecticidas en los prime-
ros estadios del cultivo. De esta
forma, además de facilitarse el tra-
Figura 2: Distribución del refugio en el lote de acuerdo a las bajo, se disminuye la presión de la
dimensiones del mismo. Bt= zona sembrada con maíz Bt. plaga en estadios más avanzados,
Ref.= zona de refugio. preservando la función del refugio.

Lecturas recomendadas Proceedings of an International Symposium held
at CIMMYT.
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Meredia K. M. 1994. “Sustaining Host Plant
Resistance Derived Through Conventional and
Biotechnological Means” Insect Resistant Maize.

VI. CAPÍTULO 6 especial atención, por constituir una alternativa
ante el uso excesivo de herbicidas. Una de las
Resistencia de malezas a
opciones más conocidas y aplicadas es la rota-
herbicidas: evolución y ción de cultivos con diferente ciclo y hábito de
estrategias de manejo crecimiento, la elección de cultivares competiti-
vos, la modificación de la fecha de siembra y el
Danie l Tuesca; Luisa Nisensohn; acortamiento de la distancia entre surcos a los
Mario R Sabbatini; Guillermo Chantre fines de aumentar la habilidad competitiva de
los cultivos frente a las malezas.
Introducción En las últimas décadas el enfoque alterna-
En los agroecosistemas la presencia de tivo más utilizado para solucionar el problema
malezas interfiere dificultando las tareas de de las malezas consistió en el control químico
siembra y cosecha y generando pérdidas de utilizando herbicidas. Una de las razones de
rendimiento por competencia con los cultivos. este predominio radica en la relativa simplici-
La magnitud de estas pérdidas varía en fun- dad de la tecnología, que permite su empleo
ción de la interacción de numerosos factores aún con conocimientos escasos de los funda-
tales como la composición de la comunidad de mentos en que se sustenta. La elección de es-
malezas, la abundancia relativa de cada una trategias de reducción o de erradicación de ma-
de las especies que la integran, las condicio- lezas en reemplazo de estrategias de preven-
nes ambientales, la modalidad de conducción ción y contención se vio favorecida no sólo por
del cultivo, entre otros. Los niveles de pérdida factores tecnológicos, como la eficacia de los
causados por las malezas pueden oscilar en- principios activos y la tecnología de aplicación,
tre 0 y 30% para especies poco agresivas con sino también por factores económicos y socio-
bajos niveles de infestación hasta un 80% para culturales como la disminución de los costos
malezas más competitivas, en densidades muy relativos, el aumento de la escala productiva
altas y frecuentemente coexistiendo con el cul- y las características de los actores involucra-
tivo durante todo su ciclo. dos en el proceso de producción. A pesar de la
La reducción del grado de abundancia de las continua generación y sustitución de diversos
poblaciones de malezas que acompañan los herbicidas en las últimas dos décadas no fue
cultivos puede efectuarse mediante el control posible erradicar a las malezas sino que por el
mecánico, empleando diversas herramientas contrario se seleccionaron biotipos tolerantes
de labranza; el control biológico, que utiliza y/o resistentes a algunos principios activos. La
agentes biocontroladores (fundamentalmente resistencia de diferentes biotipos de insectos
insectos y hongos) que afectan malezas es- a diversos plaguicidas es el mayor desafío del
pecíficas; el control cultural, donde se aprove- control de plagas desde hace medio siglo en
chan las características propias de los cultivos todo el mundo. En los últimos años, este mis-
que integran la secuencia, y el control químico, mo desafío se ha trasladado al control de ma-
que involucra el empleo de herbicidas. Actual- lezas, fundamentalmente en aquellos cultivos
mente, el control mecánico tiene una utilidad en los que se aplican intensamente herbicidas.
limitada debido a la adopción masiva de sis- En el manejo de malezas en cultivos se han
temas con labranza mínima o directamente diferenciado dos conceptos que se relacionan
sin labranza (siembra directa). El control biocon la capacidad que tienen algunas plantas
lógico, si bien es una metodología de mane- de sobrevivir a los tratamientos con herbicidas.
jo de plagas altamente recomendado por su Así, el término tolerancia se emplea para definir
bajo impacto ambiental, se encuentra limitado la capacidad natural heredable de una especie
a aquellas especies de malezas de las cuales para sobrevivir y reproducirse luego de un tra-
se han aislado y autorizado el uso de agentes tamiento herbicida, mientras que la resistencia
biocontroladores. El control cultural, utilizado a herbicidas se define como la capacidad he-
por los agricultores desde el inicio mismo de la redable de una población o biotipo para sobre-
agricultura, ha recibido en los últimos años una vivir y reproducirse después de la aplicación

de una dosis de herbicida que era letal para
la población original. Desde la aparición de los
primeros herbicidas selectivos en el mercado
argentino en los años 60´, los agricultores han
lidiado con el problema de la tolerancia. Así
por ejemplo, varias especies de malezas son
tolerantes al 2,4-D y a la atrazina, dos herbi-
cidas selectivos ampliamente utilizados des-
de hace muchos años en los cultivos de trigo
y maíz, respectivamente. Para controlar esas
malezas tolerantes se utilizan otros herbicidas
o se emplean diferentes métodos de control.
En cambio, la resistencia es un fenómeno rela-
tivamente nuevo, y si bien en nuestro país se
Figura 1. Distribución de los casos registrados de
ha manifestado en unas pocas especies, está resistencia en función de los distintos grupos de
generando una creciente preocupación en los herbicidas.
agricultores.
Desarrollo de resistencia en
poblaciones de malezas
El primer registro de resistencia a herbicidas
se reportó en 1970 en Estados Unidos, en una
población de Senecio vulgaris (senecio) que
mostró resistencia a simazina y atrazina lue-
go de un período de diez años en el que estos
principios activos se aplicaban una o dos veces
por año. A nivel mundial, la tasa de aparición
de biotipos resistentes se ha incrementado
notablemente. En 1983 se habían detectado
60 casos de resistencia y en la actualidad se
registran 321 biotipos resistentes que corres-
ponden a 185 especies, de las cuales 111 son
dicotiledóneas y 74 son gramíneas. Si bien se
ha documentado resistencia a la mayoría de
Figura 2. Evolución de la resistencia. (A) una po-
los grupos químicos, un alto porcentaje de los blación de malezas que presenta mayoría de plan-
casos corresponden a inhibidores de la enzima tas susceptibles es pulverizada con un herbicida.
acetolactato sintasa (ALS), de los fotosistemas Como el biotipo resistente al herbicida se encuentra
I y II, de la síntesis de ácidos grasos y de las en una frecuencia muy baja, la población en general
auxinas sintéticas (figura 1). es eficientemente controlada. (B) Con la aplicación
En las poblaciones de malezas, el desarro- recurrente del mismo herbicida (u otros herbicidas
llo de resistencia es un proceso evolutivo en que actúan en el mismo sitio de acción) las plantas
respuesta a la presión de selección ejercida susceptibles son eliminadas antes de formar se-
millas que garantizan su supervivencia. Contraria-
por el uso repetido de herbicidas con el mismo
mente, la frecuencia del biotipo resistente se incre-
sitio de acción. Los biotipos susceptibles mue- menta ya que dispersan sus semillas normalmente.
ren, mientras que los resistentes sobreviven y (C) Al persistir la aplicación de estos herbicidas, la
producen semillas. Si continúa la aplicación de densidad del biotipo resistente se incrementa signi-
herbicidas que actúan sobre el mismo sitio de ficativamente. (D) Luego de algunos años la mayo-
acción, la proporción del biotipo resistente se ría de los individuos de la población es resistente y
incrementa en relación al biotipo susceptible el herbicida ya no resulta una herramienta eficiente
(figura 2). para el control de la maleza.

La detección de biotipos resistentes no es in- cimiento vegetal. Este paso frecuentemente es
mediata; este proceso sólo comienza a percibir- precedido por una desactivación por conjuga-
se cuando los individuos resistentes represen- ción con otra molécula (por ejemplo, un azú-
tan aproximadamente el 30% de la población. car). Se produce de este modo una reducción
Uno de los requisitos para la evolución de re- de la concentración del herbicida en el sitio de
sistencia en las poblaciones de malezas es la acción. Este mecanismo ha sido sugerido en
presencia de variación genética heredable para algunos casos de resistencia a los inhibidores
la resistencia. Así, en poblaciones no seleccio- de la síntesis de ácidos grasos y del fotosiste-
nadas se pueden distinguir dos situaciones: ma I.
la población no posee alelos que confieren re-
sistencia al herbicida cuando se inicia el proce- Factores que modifican la tasa de
so de selección. En este caso la probabilidad de evolución de la resistencia
que la población adquiera resistencia a través En las poblaciones de malezas existen di-
de mutación, dependerá de i) la frecuencia de ferentes factores que influyen en los procesos
mutación, ii) las desventajas selectivas de los evolutivos y que interactúan para determinar
alelos o genes que confieren resistencia en un tanto la probabilidad como la velocidad a la
ambiente sin selección y iii) el tamaño de la po- que puede ocurrir la resistencia. Estos factores
blación. están relacionados con características de las
preexistencia de genes resistentes. En este poblaciones de malezas, de los herbicidas y de
caso los alelos que confieren resistencia están los sistemas de manejo del agroecosistema.
presentes en la población antes de aplicarse el
herbicida, aunque en una frecuencia muy baja 1 Factores relacionados con la biología y
para ser detectados. En esta situación, la evolu- genética de las poblaciones de malezas:
ción de la resistencia será más rápida que en 1. 1.a. Frecuencia de alelos resistentes. A me-
dida que dicha frecuencia aumenta en una po-
Mecanismos de resistencia blación, la tasa de evolución de la resistencia
Existen tres mecanismos por los cuales se será mayor.
anula la actividad fitotóxica del herbicida dentro 1.b. El modo de herencia de la resistencia. Si
de la planta y se genera resistencia: la resistencia es conferida por alelos dominan-
tes la evolución será más rápida, debido a que
Modificación del sitio de acción. Se produ- tanto los individuos homocigotas como hetero-
cen cambios estructurales en la molécula que cigotas resultarán resistentes.
constituye el sitio de acción del herbicida. De 1.c. Número de genes que confieren resis-
esta manera, el herbicida no puede unirse a tencia. La herencia de la resistencia es común-
dicha molécula y se inhibe el efecto fitotóxico mente monogénica, es decir que está contro-
(ej.: resistencia a las triazinas o a los inhibido- lada por un solo gen, dando lugar a tasas de
res de ALS). evolución relativamente elevadas. Por el con-
Detoxificación por metabolización. Se trario, cuando la resistencia es poligénica y
producen cambios en la tasa de detoxificación está asociada con varios genes, la evolución
del herbicida. En una planta resistente, el her- es más lenta, ya que se requieren recombina-
bicida se degrada a metabolitos no fitotóxicos ciones genéticas durante varias generaciones
en forma más rápida que en una planta sus- para reunir un número suficiente de alelos que
ceptible (ej.: algunos casos de resistencia a los den lugar a un genotipo resistente.
inhibidores de la síntesis de ácidos grasos). 1.d. Características reproductivas de la es-
Reducida absorción, transporte o se- pecie. En las especies alógamas, los alelos de
cuestro. El secuestro o aislamiento implica resistencia pueden dispersarse no sólo a tra-
que el herbicida sea apartado de las regiones vés de las semillas, sino también mediante el
metabólicamente activas de la célula vegetal, polen transportado por el viento o por insec-
y trasladado a sitios menos activos (por ejem- tos. En las especies autógamas el flujo génico
plo, una vacuola) donde es inocuo para el cre- es sumamente reducido entre individuos, y en

este caso la dispersión de alelos resistentes se tibles (SS), la evolución de la resistencia será
produce casi exclusivamente a través de se- rápida. Si en cambio, los heterocigotas poseen
millas. un fitness similar al de los susceptibles, la resis-
1.e. Capacidad reproductiva de la maleza. tencia evolucionará más lentamente. En algu-
La producción de un elevado número de se- nos casos, el genotipo resistente tiene un valor
millas favorece la dispersión de la resistencia. adaptativo menor que el susceptible, y en esta
1.f. Tamaño de la población de malezas. En situación si se reduce la presión de selección.
poblaciones de malezas con densidades ele- Por ejemplo, utilizando herbicidas con distinto
vadas, la probabilidad de que algunos indivi- sitio de acción, la frecuencia del genotipo resis-
duos resistentes estén presentes será mayor. tente disminuye rápidamente en la población.
1.g. Longevidad de las semillas en el sue-
lo. En las especies que poseen un banco de 2 Factores relacionados con el herbicida
semillas persistente, sólo una fracción de éste 2.a. Dosis empleadas. Cuando la resistencia
estará expuesto a la selección por el herbicida es monogénica, el empleo de dosis elevadas
en cada estación de crecimiento. Así, en años aumenta la presión de selección y favorece la
sucesivos las poblaciones de plántulas reclu- evolución de la resistencia. Por el contrario, la
tadas a partir del banco incluirán una propor- utilización de sub-dosis, al disminuir la presión
ción de individuos susceptibles. Esto resultará de selección, puede atrasar la aparición de
en una disminución de la frecuencia de alelos la resistencia. En esta situación, las semillas
resistentes y hará más lenta la evolución de la provenientes de plantas susceptibles sobrevi-
resistencia. vientes al herbicida, contribuirán a que en la
1.h. Mecanismos de dispersión de semillas. siguiente generación disminuya la frecuencia
En el caso de especies anemófilas, el viento de alelos resistentes en la población total. Si la
puede dispersar semillas de genotipos resis- resistencia es poligénica es necesario que
tentes a áreas no infestadas. La dispersión se produzcan recombinaciones entre indi-
por efecto antrópico también debe tenerse en viduos durante varias generaciones para al-
cuenta, ya que la maquinaria es una vía de canzar un número suficiente de alelos que
transporte de estos genotipos hacia áreas li- generen un genotipo resistente. En este
bres de individuos resistentes. caso, la utilización de sub-dosis de herbi-
1.i. Período de emergencia. En la medida en cidas permitirá que aquellos individuos que
que las poblaciones de malezas tengan perío- expresan mecanismos de resistencia relativa-
dos prolongados de germinación, la probabili- mente débiles por no poseer la cantidad de ale-
dad de que el herbicida afecte sólo a una parte los suficientes sobrevivan y contribuyan al pool
de dicha población se incrementa. Los indivi- de genes de resistencia. En cambio, al aplicar
duos susceptibles que emerjan con posteriori- dosis altas se elimina la mayoría de la pobla-
dad a la aplicación contribuirán a disminuir la ción disminuyendo así la frecuencia de alelos
frecuencia de alelos resistentes y la evolución resistentes en la población total.
de la resistencia será más lenta. 2.b. Eficacia. La eficacia de un herbicida
1.j. El valor adaptativo (fitness) relativo de los está relacionada con la mortalidad que causa
genotipos resistentes y susceptibles. El valor en una población de malezas. Como se indicó
adaptativo de un genotipo se mide a través del en el punto anterior, en caso que la resistencia
éxito reproductivo, es decir la cantidad de des- sea monogénica, los herbicidas más eficaces
cendientes que están presentes en la siguiente eliminarán una mayor proporción de individuos
generación. En poblaciones que se aparean al susceptibles y de este modo facilitarán la evo-
azar casi todos los alelos de la población van a lución de la resistencia. En cambio, si la resis-
estar en forma heterocigota durante los prime- tencia es poligénica, una menor eficacia de los
ros estadios de la evolución de la resistencia. herbicidas podría beneficiar la sobrevivencia
En el caso que frente a las aplicaciones de her- de algunos alelos que, por acumulación, in-
bicidas, los individuos heterocigotas (RS) ten- crementarán el pool de genes resistentes. Así,
gan más fitness que los homocigotas suscep- tanto los herbicidas eficaces como ineficaces

contribuyen a aumentar, mediante diferentes y triazolopirimidinas, debido a una altera-
mecanismos, el desarrollo de la resistencia. La ción de la ALS.
evolución de la resistencia por ello puede de- 2. Resistencia cruzada no asociada con la
morarse, pero es un proceso inevitable mien- modificación del sitio de acción. En este
tras se usen herbicidas como única herramien- caso, la resistencia a dos o más herbici-
ta del manejo de malezas. das es debida a un mecanismo de resis-
2.c. Especificidad del sitio de acción. En el tencia diferente a la modificación del sitio
caso de herbicidas que interfieren con un solo de acción. Los mecanismos potenciales
sitio de acción, el cambio en un solo gen puede incluyen: reducida absorción y transpor-
ser suficiente para afectar la unión de la mo- te, secuestro y detoxificación del herbici-
lécula herbicida al sitio de acción. El uso de da. Biotipos de Lolium rigidum presentan
herbicidas con múltiples sitios de acción tendrá resistencia cruzada a herbicidas del gru-
menor probabilidad de generar biotipos resis- po de las triazinas y de las ureas debida
tentes. a un aumento en la tasa de detoxifica-
2.d. Residualidad. Los herbicidas no resi- ción de esos herbicidas.
duales sólo actúan sobre los individuos de la Resistencia múltiple: comprende la resis-
población ya emergidos. Los herbicidas re- tencia a uno o más herbicidas del mismo o
siduales afectan además a las cohortes que de diferentes grupos químicos debida a dos
emergerán posteriormente a la aplicación, eli- o más mecanismos. Los casos más simples
minando así una mayor proporción de indivi-
de resistencia múltiple son aquellos donde
duos susceptibles de la población y favorecien-
un individuo o población posee dos o más
do la evolución de la resistencia.
mecanismos que le confieren resistencia a
2e. Patrones de uso. El empleo repetido,
un herbicida o grupo de herbicidas. Una si-
dentro de la misma campaña agrícola o en
tuación más compleja es aquella donde la
campañas sucesivas del mismo herbicida o de
resistencia es a diferentes grupos químicos.
herbicidas con igual sitio de acción favorecerá
Tal es el caso de un biotipo de Lolium rigi-
la evolución de poblaciones resistentes.
dum en Australia que presenta resistencia
Clasificación de la resistencia a nueve grupos de herbicidas conferida por
La clasificación de la resistencia se asocia distintos mecanismos.
con los mecanismos de resistencia involucra-
dos. Así pueden distinguirse dos tipos de resis- Diagnóstico de malezas resistentes a
tencia: cruzada y múltiple. herbicidas
Resistencia cruzada: se refiere a la resis- La detección temprana de la resistencia per-
tencia a dos o más herbicidas del mismo o de mite maximizar la efectividad de los programas
diferentes grupos químicos provocada por un de manejo y prevenir su dispersión a campos
único mecanismo. Dentro de este tipo se pue- vecinos. Las fallas en el control de malezas no
den definir dos categorías: siempre están asociadas con la presencia de
1. Resistencia cruzada asociada con la mo- biotipos resistentes sino que pueden relacio-
dificación del sitio de acción. Es el tipo narse con empleo de dosis de herbicidas inade-
más frecuente de resistencia cruzada y cuadas, deficiente incorporación del herbicida,
ocurre cuando un cambio en el sitio de incorrecto uso de coadyuvantes y surfactantes,
acción de un herbicida confiere resisten- condiciones ambientales desfavorables para la
cia a herbicidas que inhiben el mismo si- actividad del herbicida, momento inadecuado
tio de acción. Esta modificación no nece- de aplicación o flujos de emergencia poste-
sariamente resulta en resistencia a todos riores a la aplicación en el caso de herbicidas
los grupos de herbicidas con similar sitio poco residuales.
de acción ni a todos los herbicidas dentro Una vez que estas causas han sido descar-
de un mismo grupo químico. Es el caso tadas deben considerarse los siguientes as-
de biotipos de Amaranthus quitensis re- pectos que caracterizan lotes con poblaciones
sistentes a sulfonilureas, imidazolinonas de malezas que han desarrollado resistencia:

• La especie sospechosa está inicialmente Otro indicador utilizado para comparar los di-
confinada en pequeños manchones. ferentes grados de resistencia entre biotipos es
• Todas las especies susceptibles al her- el factor de resistencia que indica el número de
bicida son bien controladas, excepto la veces que es necesario aumentar la dosis de
especie sospechosa. un herbicida en un biotipo resistente para al-
• Se detectan individuos de la especie canzar un control similar al obtenido en el bioti-
sospechosa sin síntomas y dispersos en- po susceptible. Este factor resulta del cociente
tre plantas de la misma especie que han entre valores de DL , GR o I del biotipo re-
50 50 50
sido controladas. sistente y los valores de estos mismos índices
• La especie sospechosa normalmente es del biotipo susceptible.
muy susceptible al herbicida empleado.
• Se ha utilizado el mismo herbicida en for- Casos de resistencia en Argentina
ma repetida sin emplear otros métodos Hasta el año 2005, el único caso de resisten-
de control (mecánico o cultural). cia documentado en Argentina correspondía
• La historia del lote indica un uso exten- a Amararanthus quitensis (yuyo colorado) re-
sivo e intensivo a lo largo del tiempo del sistente a herbicidas inhibidores de la enzima
herbicida aplicado o de herbicidas con el acetolactato sintasa (ALS) como por ejemplo,
mismo sitio de acción. imazetapir, clorimurón etil y flumetsulam.
El empleo generalizado de siembra directa
Cuantificación de la resistencia y la introducción de cultivares de soja resisten-
La resistencia puede ser cuantificada com- tes a glifosato a partir de 1997 produjo impor-
parando valores experimentales derivados de tantes modificaciones en las comunidades de
biotipos resistentes y susceptibles. Por ejem- malezas. Asociado con algunas características
plo, se puede comparar la dosis de herbicida específicas del glifosato, se estimaba una baja
requerida para controlar el 50 % de la pobla- probabilidad de que las malezas desarrollaran
ción de malezas (DL ), la dosis que causa un resistencia a este principio activo; no obstante
50
50% de reducción en la biomasa (GR ) o la hasta la fecha se han detectado 15 casos de
50
dosis que disminuye en un 50% la actividad resistencia a glifosato en distintas especies de
de una enzima específica (I ). La metodología malezas a nivel mundial.
50
empleada para la estimación de estos valores El primer caso de resistencia a glifosato en
se basa en la construcción de curvas de dosis– Argentina se confirmó en el año 2005 en bioti-
respuesta. Los valores de estos índices serán pos de sorgo de Alepo (Sorghum halepense).
menores en biotipos susceptibles y aumenta- Las primeras deficiencias en el control con este
rán a medida que los biotipos presenten mayor herbicida se observaron en las provincias de
grado de resistencia (figura 3). Salta y Tucumán, en el año 2003 y experimen-
tos realizados posteriormente corroboraron la
resistencia a ese principio activo. Investigacio-
nes recientes permiten asegurar que el número
de biotipos de sorgo de Alepo resistente a glifo-
sato está aumentando, y el área de distribución
de los mismos incluye la región sojera núcleo.
En ensayos realizados comparando estos bio-
tipos con otros susceptibles, se determinó un
grado relativamente alto de resistencia a glifo-
sato. Resta evaluar si estos biotipos resisten-
tes se han generado en forma independiente o
guardan alguna relación con los casos encon-
trados en el noroeste argentino.
Figura 3. Curvas dosis-respuesta para biotipos con Estudios realizados en el sudoeste de la
distinto grado de resistencia. Provincia de Buenos Aires indican la existencia

de poblaciones de raigrás (Lolium multiflorum) de las malezas puede demorar la aparición de
con una menor sensibilidad al glifosato, lo cual resistencia, pero no erradicarla. Las prácticas
sugeriría el desarrollo de biotipos resistentes. conducentes a la erradicación de la resisten-
En poblaciones con un historial de alta frecuencia son las del control integrado, que resulta de
cia de aplicación de glifosato se detectaron va- combinar el control químico con el control me-
lores de GR50 entre 3,6 y 4 veces superiores cánico, cultural y/o biológico. Así, resulta acon-
al de poblaciones sin registro de uso de este sejable sumar al uso de herbicidas, algunas de
herbicida. Además, se observaron valores de las siguientes prácticas:
hasta 20% de supervivencia en individuos • Realizar rotaciones de cultivos con dife-
de poblaciones tolerantes a dosis de 1440 gr rentes ciclos de crecimiento. Esta prác-
e.a.ha-1, mientras que la supervivencia fue nula tica presenta varias ventajas: permitir el
para los individuos de poblaciones sensibles a uso de herbicidas con diferentes sitios
una dosis de 360 gr e.a.ha-1. Experiencias re- de acción; y permite utilizar diferentes fe-
cientes indicaron valores de supervivencia de chas de siembra en los distintos cultivos,
hasta 40% a una dosis de 1680 gr e.a.ha-1 en formas de preparación del suelo y otros
plántulas obtenidas a partir de semillas cose- métodos culturales para controlar un pro-
chadas de una población que sobrevivió a una blema particular de malezas.
aplicación comercial de glifosato. Existen ca- • Laboreo antes de la siembra para contro-
sos confirmados de biotipos de raigrás resis- lar las plantas nacidas y enterrar semillas
tentes a glifosato en Chile y Brasil. no germinadas.
El contexto favorable para el mercado inter- • Retraso de la siembra de manera de
nacional de commodities, el precio relativamen- controlar los primeros flujos de emergen-
te bajo del glifosato respecto a otros herbicidas cia de malezas con control mecánico o
y su probada eficacia en un amplio espectro de herbicidas no selectivos.
malezas, redundarán en un creciente aumen- • Evitar la dispersión de semillas de male-
to del área sembrada con cultivos resistentes zas resistentes. Para ello utilizar herbici-
a este herbicida. Es necesario implementar das no selectivos en precosecha de los
medidas de manejo integrado para prevenir el cultivos antes de la madurez de las semi-
incremento en las poblaciones de malezas to- llas de las malezas y limpiar los equipos
lerantes y resistentes a glifosato. de labranza y cosecha antes de trans-
portarlos a otros lotes.
Manejo integrado para prevenir la • Relevar los campos regularmente, identi-
evolución de la resistencia ficando las malezas presentes de manera
Existen dos estrategias principales para de- de responder rápidamente a cambios en
morar la manifestación de la resistencia utili- las poblaciones de malezas para restrin-
zando herbicidas: gir la dispersión de biotipos resistentes
1. Rotar herbicidas con distintos sitios de que puedan haber sido seleccionados.
acción y no realizar más de dos aplica- • Iniciar programas de control biológico a
ciones consecutivas de herbicidas con el los fines de identificar biocontroladores
que disminuyan los perjuicios ocasiona-
mismo sitio de acción en el mismo lote
dos por las especies de malezas más
a menos que se incluyan otras prácticas
importantes de la región.
de control efectivas en el manejo del sis-
Si bien la combinación de diferentes méto-
tema.
dos de control es la estrategia más recomen-
2. Emplear mezclas de herbicidas con dis-
dada para demorar o evitar la evolución de
tintos sitios de acción o aplicar en forma
resistencia, un enfoque interdisciplinario de
secuencial herbicidas con distintos sitios esta problemática surge como esencial para
de acción pero similar espectro de ac- una solución de largo plazo. Un programa de
ción sobre las malezas a controlar. Manejo Integrado de Malezas es un sistema
Como ya se indicó anteriormente, el uso del de manejo que enfoca el problema de forma
control químico como única medida de manejo compatible con la preservación de la calidad

del ambiente, utilizando diferentes tácticas y Resistance in Plants: Biochemical and Genetic Basis
estrategias de control con el objeto de reducir of Resistance. Weed Technology, 20:282–289.
la población de malezas a niveles tales que los Powles, S.B. y Holtum, J.M. 1994. Herbicide resistance
perjuicios económicos producidos resulten in- in plants: Biology and biochemistry. Lewis Publishers,
feriores a un umbral económico aceptable para Boca Raton, Florida.
Puricelli, E. y Tuesca, D. 2005. Weed density and
el sistema general de producción. Este progra-
diversity under glyphosate-resistant crop sequences.
ma puede involucrar, además de los métodos
Crop Protection, 24: 533-542.
de control ya señalados, estudios básicos de Sabbatini, M.R., Irigoyen, J.H. y Vernavá, M.N. 2004.
la bioecología de las malezas, medidas pre- Capítulo 11: Estrategias Para el Manejo Integrado
ventivas, entrenamiento de personal calificado, de Malezas: Problemática, Resistencia a Herbicidas
extensión a agricultores, entre otros. Un ma- y Aportes de la Biotecnología, En: Biotecnología
nejo integrado de malezas, en el que múltiples y mejoramiento Vegetal, Eds: V. Echenique, C.
estrategias son implementadas de una manera Rubinstein y L. Mroginski. Editorial INTA, 343-354.
racional, es la única solución en el marco de Tuesca, D. y Nisensohn, L. 2001. Resistencia de
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clorimurón-etil. Pesquisa Agropecuaria Brasileira,
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Bradshaw L. D., S. R. Padgette S. L. Kimball, and Wells and herbicide treatments on weed abundance and
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PARTE VII
Biotecnología y Sociedad

VII. CAPÍTULO 1 La maquinaria y los sistemas de labranza
La renovación del parque de tractores se dio
en forma paralela a un cambio de gran signifi-
La transformación tecnológica y
cación: la modernización de la maquinaria de
los nuevos desafíos arrastre y autopropulsada. En el caso de sem-
bradoras, pulverizadoras y herramientas para
Carmen Vicién la aplicación de fertilizante, se desarrollaron
sistemas de precisión, que permitieron el logro
Durante los últimos 20 años, los sistemas de mayor uniformidad de siembra, y eficiencia
productivos agropecuarios sufrieron una trans- en la aplicación.
formación sustancial, lo cual dio por resulta- Los sistemas de labranza tradicionales fue-
do no sólo una sucesión de niveles record de ron reemplazados gradualmente por otros que
producción y productividad, sino también una implicaban menor remoción del perfil. La siem-
redefinición de la composición de la oferta gra- bra directa, de escasa difusión a comienzos
naria. de la década del 90, abarca hoy más del 50
La expansión de la frontera agrícola argenti- % del área bajo cultivo. La introducción y rápi-
na generó cambios en el uso de la tierra en vada expansión de la siembra directa, que redujo
rias regiones del país. La mayor parte del cre- la erosión del suelo y produjo modificaciones
cimiento productivo se concentró en la región importantes en la organización del ecosiste-
pampeana, pero la transformación alcanzó, en ma agrario, probablemente sea el cambio de
mayor o menor medida, a casi todas las áreas alcances ambientales más significativo gene-
del país con aptitud agrícola. La disponibilidad rado por las innovaciones tecnológicas de la
tecnológica, las características de los suelos, agricultura argentina en las dos últimas déca-
la capacitación de la mano de obra local, las das. El incremento en la superficie implantada
tendencias climáticas, la relación de los pre- con siembra directa fue acompañado de una
cios de los productos y los insumos influyeron mayor utilización de herbicidas asociados a
en la tasa de difusión de los cultivos en las di- esta técnica y un crecimiento en la venta de
ferentes regiones. sembradoras específicas.
En definitiva, el eje central de este desarro-
llo agropecuario consistió en la difusión de un La cosecha y el almacenaje
paquete tecnológico que combinaba innova- La tecnología de cosecha progresó en forma
ciones genéticas, fundamentalmente deriva- considerable, mejorando la calidad de trilla, lo
das de la biotecnología moderna, insumos y cual permitió reducir las pérdidas. Los navega-
equipos, prácticas agronómicas y nuevos, o en dores satelitales constituyeron otra nueva he-
algunos casos, remozados agentes especiali- rramienta a emplear. La confección de mapas
zados, que llevaron a la creación de redes de de rinde, al posibilitar mejorar el conocimiento
articulación mucho más complejas. del terreno, ayuda a lograr un uso más eficien-
Esto fue acompañado por un proceso de este del recurso edáfico.
pecialización, tanto en lo productivo como en Simultáneamente, el manejo de los volúme-
las exportaciones, basado en la trama oleagi- nes cosechados presenta aspectos importan-
nosa, fundamentalmente del cultivo de soja. tes por resolver, como la falta de un sistema
Los potenciales efectos ambientales negati- de almacenamiento adecuado en origen, la
vos fueron mitigados por el uso de tecnologías, dificultad en instrumentar un almacenamiento
como la siembra directa, la rotación de cultivos, diferencial por calidad o las deficiencias en in-
la mayor aplicación de fertilizantes y herbici- fraestructura para el manejo de la producción y
das, y la agricultura de precisión. su traslado.
Primeramente haremos un breve repaso de
algunos de los aspectos más destacados de Los productos fitosanitarios
esta transformación, para luego plantear algu- En cuanto a la evolución del mercado de pro-
nos desafíos pendientes. ductos fitosanitarios, en la década del noventa

se observa que hasta 1999 hubo un aumen- resulta de utilidad cuando se conocen las ca-
to en el consumo, en especial de herbicidas. rencias de macro y micro nutrientes del suelo,
Durante el período 2000 a 2002, descendió el los requerimientos del cultivo y las recomenda-
total de ventas, debido a la recesión de casi ciones de aplicación. En este sentido, subsis-
cuatro años que vivió el país a partir de fines ten aún deficiencias en cuanto al conocimien-
del 2001. En el año 2003 hubo una marcada to de los requerimientos de los cultivos y los
recuperación, equivalente a un crecimiento del aportes necesarios. Existe además necesidad
32 % en la cantidad total comercializada y del 9 de contar con la posibilidad de realizar análisis
%, en el valor monetario del mercado. A pesar de suelos con mayor grado de confiabilidad.
de esta caída, se triplicó la cantidad física co- Los balances de nutrientes continúan sien-
mercializada, con un notable aumento para los do negativos para los suelos. La necesidad de
insumos empleados en los sistemas de siem- sostener los niveles de producción no se logra
bra directa, en especial el glifosato. solamente con el aporte de nutrientes a través
de una fertilización balanceada, sino también
Los fertilizantes y el uso del suelo con prácticas de manejo tales como rotación
El de los fertilizantes constituye una incorpo- de cultivos, siembra directa, incorporación de
ración tecnológica destacada de comienzos de cultivos de cobertura y manejo integrado de
los años noventa. Si se toma como base el año plagas y enfermedades, de manera de contri-
1991, en cuatro años se cuadriplicó el consu- buir a preservar y mejorar la sustentabilidad y
mo aparente de fertilizantes. En el año 2007, calidad del recurso suelo.
el consumo de nutrientes (N+P2O5+K2O+S) Se destaca además la gran reducción de la
puede ser estimado en 1,75 millones de t, con superficie ocupada por pasturas permanentes
una tasa de incremento de 98700 t por año en en las regiones más productivas. Esto supo-
el período 1993-2007. Este crecimiento en el ne el riesgo que disminuya la incorporación
consumo de fertilizante fue ocasionado por au- de carbono originado en materia orgánica, el
mentos en las superficies cultivadas y mejoras cual es crucial para el mantenimiento de las
en la tecnología aplicada a los principales cul- propiedades físicas, químicas y biológicas de
tivos. los suelos.
Al respecto cabe mencionar que, en años re- Por otra parte, en muchas regiones no se
cientes, se registra una marcada disminución dispone de información con cierto nivel de de-
en el uso de fertilizantes (el año 2008 concluyó talle sobre cómo los cambios en el uso del sue-
con un consumo 30% inferior al de 2007). Los lo pueden afectar los servicios que brindan los
números de la campaña 2008/2009 son aún agro-ecosistemas (regulación, hídrica, control
más bajos, donde si bien la cosecha y la ex- de la erosión, conservación de la biodiversi-
tracción de nutrientes fue menor, la reposición dad).
de nutrientes fue muy baja.
La trascendencia del uso de fertilizantes en Las semillas y la biotecnología
Argentina no pasó inadvertida y, en consecuen- En casi todos los cultivos se ha observado
cia, las empresas distribuidoras comenzaron a una mejora en la calidad de la semilla utiliza-
realizar una importante inversión en logística da, mayor adaptación de los híbridos y de las
portuaria y de distribución, con el propósito de variedades a los ecosistemas presentes en el
adaptarse a los cambios ocurridos. país y mejor implementación de las prácticas
Varias empresas comercializadoras de ferti- de manejo de los cultivos.
lizantes han instalado centros de distribución y Es conocido y significativo el hecho que des-
aplicación de fertilizante en el interior del país. de hace unos nueve años Argentina presenta
Las mezclas de fertilizante a granel han apa- el segundo lugar en el mundo, en cuanto a su-
recido en el mercado como una nueva forma perficie cultivada con materiales genéticamen-
de diferenciación de producto, destinadas a te modificados (GM). Al presente, más del 99%
cubrir carencias específicas de los cultivos. Sin de la soja, el 80% del maíz y el 90% del algo-
embargo, la utilización de mezclas específicas dón son sembrados con esos materiales. En el

mercado existen once eventos de transforma- Las formas de administración de las
ción, que corresponden a dos características empresas
funcionales relacionadas con aspectos de la La profesionalización de la administración
producción agrícola (tolerancia a herbicidas y de las empresas agropecuarias constituye otro
resistencia a insectos), en tres especies (soja, importante factor de cambio tecnológico. Los
maíz y algodón). productores comprenden cada vez mejor que
En el caso particular de la soja, la rápida la adquisición de insumos y la comercialización
adopción de los materiales GM coincidió con de los productos son componentes fundamen-
el proceso de expansión del área dedicada al tales de su actividad. Cuando el tamaño de
cultivo. La difusión de la soja GM tolerante a la explotación constituye una limitante, estos
glifosato es uno de los casos de mayor dina- productores recurren a diferentes formas de
mismo en el ámbito internacional en cuanto a asociación con el propósito de incrementar el
la incorporación a gran escala de una innova- resultado final de su actividad, mejorando la
ción tecnológica, desde su aprobación para ser logística de compra o la colocación de sus pro-
comercializada en el año 1996. Otro aspecto ductos.
a puntualizar es el hecho que la introducción La integración con las cadenas comerciales
de este material se produjo prácticamente en e industriales ha sido otro recurso que ha co-
el mismo momento en que estas tecnologías brado auge en los últimos tiempos. Las diferen-
estuvieron disponibles en el mundo. tes formas de integración han creado un am-
Entre los factores que motivaron semejan-
plio espectro de modalidades, donde el factor
te incorporación y expansión se encuentra la
común suele ser la contribución de los agentes
excelente asociación de la soja genéticamente
más avanzados de la cadena en la incorpora-
modificada con el sistema de siembra directa.
ción y difusión de tecnología en el agro.
A ello se unen las mejoras introducidas en el
Algo similar ha ocurrido en la etapa de co-
manejo y laboreo del cultivo que redundaron
mercialización de productos. Abundan los
en un sistema productivo más simple que el
ejemplos de asociación entre productores para
empleado anteriormente.
Sin embargo, es obvio que una de las razo- comercializar productos específicos, tanto en
nes principales para la rápida adopción de los el mercado interno como en el mercado inter-
cultivos genéticamente modificados se basó nacional. La adaptación a nuevas modalidades
en el beneficio obtenido por los productores de comercialización no ha sido tarea sencilla
agropecuarios. Los resultados económico-fi- para muchos productores agropecuarios.
nancieros de la soja obtenidos en las explota-
ciones agropecuarias muestran la estabilidad Los actores sociales
que este cultivo da a los sistemas productivos, La innovación tecnológica se convirtió en el
pues su predominancia se conserva aún ante factor central de la rentabilidad de las explota-
profundos cambios en los precios de los insu- ciones agrarias, pero fue más fácilmente incor-
mos y de los productos. porada por las grandes que por las pequeñas,
porque una parte importante del nuevo patrón
Los servicios para el agro tecnológico estaba asociado con bienes per-
En forma paralela a la intensificación en el manentes de capital, como maquinaria para
uso de tecnología crecieron las empresas de siembra directa, o con capital de trabajo, como
servicios para el agro, fundamentalmente en el productos fitosanitarios.
caso de aplicación de productos fitosanitarios, Este contexto económico y tecnológico favo-
abonos químicos, confección de reservas fo- reció la figura del contratista con capacidad para
rrajeras y cosecha. endeudarse y hacer uso eficiente del capital. La
El acceso a la información ha sido otro fac- situación dio también lugar a la aparición de nue-
tor de progreso; los sistemas de comunicación vas formas de organización, además del mencio-
han mejorado en el interior del país. A ello se nado contratista, y contribuyó a establecer un
suma la proliferación de muestras agropecua- mercado especial de capitales urbanos intere-
rias y reuniones técnicas en el interior del país. sados en la agricultura. Se trata de gestores

del negocio agropecuario que combinan la po- un nuevo piso de producción, pero aún que-
sesión de la tierra, obtenida a través de distin- da mucho por hacer, más allá de las pequeñas
tas formas de arrendamiento o aparcería, con menciones efectuadas anteriormente, que no
el capital de terceros, aportando la tecnología y pretenden ser exhaustivas.
la capacidad de gerenciamiento. En el conjunto En el caso particular de la biotecnología, so-
de nuevas y remozadas formas de organiza- bre la base de los materiales GM en evaluación
ción de la producción se encuentra una gran en Argentina y en el mundo, los desarrollos que
diversidad. se avizoran en el mediano y corto plazo inclu-
Como contrapartida, se incrementó la canti- yen una amplia gama de caracteres agronómi-
dad de medianos y pequeños propietarios rura- cos. Así se cuenta con tolerancia a diferentes
les que se convirtieron en rentistas. Durante la herbicidas, resistencia a insectos Lepidópteros
última parte de la década del 90 las condiciones y Coleópteros, y resistencia a virus; resistencia
de precios relativos de la producción agrope- a stress (hídrico, salinidad y restricción de nu-
cuaria con relación a los bienes no transables, trientes en el suelo) y mejora en el valor nutriti-
que inciden considerablemente en el costo de vo de los cultivos alimenticios (modificación en
vida, hicieron inviables a las explotaciones de la composición de aceites; mejoras proteicas,
menor tamaño, que por muchos años habían modificación enzimática para uso en procesos
sido viables. Esto generó un proceso de des- industriales; modificación en el contenido de
mantelamiento de explotaciones familiares de carbohidratos en el grano).
menor tamaño, la emigración de sus propieta- Sin embargo, cabe reflexionar que la oferta
rios a zonas urbanas, especialmente rurales, de tecnología en Argentina, salvo la incorpora-
y el arrendamiento de sus parcelas a vecinos ción al paquete de alternativas productivas de
u otras empresas de mayor tamaño. También la soja y en menor medida el maíz, muestra
hubo situaciones de pérdida de las propieda- escasa diversificación. Esta especialización
des. productiva es, en gran medida, inconsistente
La caída en el número de productores, vincu- con la amplitud agro-ecológica de los recursos
lada con procesos de concentración del capital, del país que puede ser empleada para obtener
no es asimilable estrictamente a la disminución una cartera de productos mucho más amplia.
del número de personas que trabajan en el ám- Los actores sociales que han sido parte de la
bito rural. Una gran cantidad de oferentes de transformación tecnológica de los últimos años
servicios agropecuarios, especialmente de ta- tienen que avanzar, enfrentando nuevos desa-
reas mecánicas, y los familiares y asalariados fíos.
que los acompañan, viven generalmente en los
pueblos y ciudades intermedias. Además de
los proveedores de servicios para tareas rea- Lecturas recomendadas
lizadas en el campo, existe una gama de acti-
vidades como la venta de insumos, talleres de Barsky O. 2003. Censo del campo: una foto nítida.
reparación de vehículos y maquinaria, el trans- Clarín Rural. 9 de abril de 2003.
porte y el comercio, que ocupan a importantes Bertolasi, R. 2004. Formas de organización de la
núcleos de población. Los casos más visibles producción. www.bancomundial.org.ar
Bisang, R. y Gutman, G. 2003. Dinámicas recientes
son los de las poblaciones donde funcionan fá-
en la producción agroalimentaria Argentina.
bricas de maquinaria e implementos agrícolas. Revista Encrucijadas N° 21. Febrero 2003
Della Valle, C. y García, M. 2003. El cultivo de maíz
Hacia el futuro en alerta amarillo. Secretaría de Agricultura,
Las modificaciones mencionadas son rele- Ganadería, Pesca y Alimentos. Subsecretaría
vantes, tanto por el nivel de hectáreas conside- de Economía Agropecuaria. Dirección de
radas, como por el hecho que los procesos no se Agricultura. 47 p.
restringieron a un grupo limitado de productores Ghersa, C. y Martínez-Ghersa, M. A. Consecuencias
de avanzada. Los cambios experimentados en de los recientes cambios agrícolas. Ciencia Hoy.
la agricultura argentina han permitido alcanzar Volumen 15 Nº 87. Junio/Julio 2005.37- 45 p.
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Vicién, C., Pena de Ladaga, S. y Di Paola, M. M. 2008.
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sobre la evolución de las explotaciones agrícolas
en Argentina. p 173-193. En: Modelización
Económica en el Sector Agropecuario II. Carmen
Vicién, Susana Pena de Ladaga y Gerardo Petri
(Eds). Orientación Gráfica Editora. Buenos Aires.
Septiembre de 2008. 193 p. ISBN 978-987-9260-
62-3.

VII. CAPÍTULO 2
Adopción de los cultivos

genéticamente modificados en
Argentina y en el mundo
Gabriela Levitus
Los primeros cultivos genéticamente modifi-

cados (GM) o transgénicos se sembraron co-
mercialmente en 1996 y desde ese entonces
su adopción global ha aumentado en forma
consistente y con tasas sin precedentes en la
historia de la agricultura. Figura. 1. Área cultivada con cultivos GM en 2008,
Esta rápida adopción, que creció de 1,7 a por país, sobre 125 millones de hectáreas. Otros:
Uruguay, Bolivia, Filipinas, Australia, México, Espa-
125 millones de hectáreas en trece años, re-
ña, Chile, Colombia, Honduras, Burkina Faso, Re-
fleja la satisfacción del agricultor con los pro- pública Checa, Rumania, Portugal, Alemania, Polo-
ductos de la tecnología, que ofrecen varios be- nia, Eslovaquia, Egipto. Fuente: ISAAA.
neficios, como la reducción de los costos de
producción, mayor flexibilidad en el manejo de
los cultivos, disminución en el empleo de insec-
ticidas, mayor rendimiento y mejor calidad. (soja, maíz, algodón, canola y alfalfa), el 15%
con cultivos resistentes a insectos-Bt (maíz y
Distribución por país algodón), y el 22% con cultivos que contenían
Según el Servicio para la Adquisición de ambas características acumuladas por cruza-
Aplicaciones Agrobiotecnológicas (ISAAA), en miento convencional (maíz y algodón). Tam-
2008 13,3 millones de agricultores de 25 paí- bién se sembraron cultivos resistentes a virus
ses sembraron 125 millones de hectáreas con (papaya y zapallo), aunque en superficies mu-
cultivos transgénicos. Catorce lo hicieron en cho menores.
100.000 hectáreas o más, aunque el 98% del
área global se concentró sólo en ocho: Estados Los cultivos transgénicos en
Unidos, Argentina, Brasil, India, Canadá, Chi- Argentina
na, Paraguay y Sudáfrica (Fig. 1 y Tabla 1). En 2008 Argentina se mantuvo en el se-
gundo lugar en la lista de países productores
Distribución por cultivo y de transgénicos, sembrando en la campaña
característica 2008/2009 una proporción mayor de varieda-
En 2008, el 52,6% de las hectáreas sembra- des transgénicas que en la campaña anterior
das con cultivos GM correspondieron a soja, el (Fig. 1). Efectivamente, casi el 100% de la su-
29,8% a maíz, el 12,4% a algodón y el 4,7% a perficie de soja fue sembrada con soja toleran-
canola. Estas superficies significaron el 70%, te al herbicida glifosato, mientras que el maíz
24%, 46% y 20% de las áreas totales de cada transgénico ocupó el 83% del área destinada
uno de esos cultivos, respectivamente. Tam- a maíz (comparado con el 74% en 2007/08) y
bién se sembraron, aunque en áreas muy pe- el algodón genéticamente modificado ocupó el
queñas, variedades transgénicas de alfalfa, 94% del área total del cultivo (comparado con
papaya, zapallo, álamo, clavel y remolacha el 90% en 2007/08) (Fig. 2).
azucarera.
Con respecto a las características introduci- Cultivos tolerantes a glifosato
das, el 63% de la superficie total de cultivos GM El crecimiento de las malezas disminuye
se sembró con cultivos tolerantes a herbicida drásticamente el rendimiento y la calidad de

Tabla 1: Adopción de cultivos transgénicos en 2008, por país. Fuente: ISAAA.
* Sólo para producción se semillas
País Cultivos GM
Soja, algodón, maíz, canola, alfalfa, papaya,
EEUU
zapallo, remolacha azucarera
Argentina Soja, algodón, maíz
Brasil Soja, algodón, maíz
Canadá Maíz, soja, canola, remolacha azucarera
India Algodón (Bt)
China Algodón, tomate, papaya, álamo, petunia, pimiento
Paraguay Soja
Sudáfrica Algodón, maíz, soja
Uruguay Maíz, soja
Bolivia Soja
Filipinas Maiz
Australia Algodón, canola, clavel
España Maíz
México Algodón, soja
Colombia Algodón, clavel
Chile* Maíz, soja, canola
Honduras Maíz
Rep. Checa Maíz
Portugal Maíz
Alemania Maíz
Eslovaquia Maíz
Rumania Maíz
Polonia Maíz
Burkina
Algodón
Faso
Egipto Maíz
los cultivos. Muchos herbicidas sirven para un En las plantas, la enzima 3-enolpiruvil-shi-
determinado tipo de malezas y suelen dejar re- quimato-5-fosfato sintasa (EPSPS) es clave
siduos que permanecen en el suelo por años. en las rutas metabólicas que llevan a la pro-
El empleo de cultivos tolerantes a herbicidas ducción de los aminoácidos aromáticos (fenila-
resuelve estos problemas, ya que estos culti- lanina, tirosina y triptófano). Esta enzima sólo
vos son tolerantes a los herbicidas glifosato o está presente en plantas y microorganismos,
glufosinato, ambos de amplio espectro (es de- tales como bacterias y hongos, y ausente en
cir, eliminan a casi todas las plantas, excepto animales y humanos. En la década de 1970 se
aquellas tolerantes a dichos herbicidas) y de descubrió que el glifosato inhibía a la enzima
menor efecto residual que los herbicidas tradi- EPSPS, impidiendo la producción de aminoáci-
cionales. Además, el productor se beneficia en dos aromáticos. Los aminoácidos son esencia-
gran medida porque con puede usar métodos les para la síntesis proteica y las proteínas son
de labranza más conservacionistas, como la necesarias para el crecimiento y las funciones
siembra directa, que ayuda a conservar el sue- vitales, por lo tanto, la aplicación del glifosa-
lo y la humedad, simplifica el manejo y reduce to lleva a la muerte de la planta. Las plantas
los costos de producción. tolerantes a glifosato tienen el gen epsps de

Fig. 2: Evolución de la superficie sembrada con cultivos GM en Argentina.
la cepa CP4 de la bacteria del suelo Agrobac- El maíz tolerante a glifosato se aprobó para
terium tumefaciens. Como la enzima EPSPS su siembra comercial en 2004, y desde ese en-
producida en esta cepa bacteriana no es afec- tonces su adopción creció en forma sostenida,
tada por el glifosato, su introducción en el ge- alcanzando en la campaña 2008/09 las 320 mil
noma de las plantas las vuelve tolerantes al hectáreas (el 10% del maíz transgénico total).
herbicida. Uno de los nombres comerciales del También se han cultivado híbridos de maíz que
glifosato es “Roundup”, por eso, quienes de- contienen dos características acumuladas: la
sarrollaron esta tecnología denominaron a los resistencia a insectos y la tolerancia a glifosato
cultivos tolerantes al glifosato con el nombre de (800 mil hectáreas). La adopción del algodón
“Roundup Ready”, o RR. tolerante a glifosato también se incrementó en
Como método alternativo, también se obtuvo gran medida en los últimos años, alcanzando
maíz tolerante a glifosato por introducción del en la campaña 2008/09 las 210 mil hectáreas
gen de la EPSPS del maíz, pero con modifi- (el 70% del algodón sembrado en Argentina).
caciones en su secuencia para que la enzima
resulte resistente al herbicida. Cultivos resistentes a insectos
En Argentina se cultivan soja, maíz y algo- El barrenador del tallo (Diatraea sacchara-
dón tolerantes a glifosato. La soja fue el primer lis) es un insecto lepidóptero que constituye
cultivo en el mercado argentino en incorporar la principal plaga de los cultivos de maíz en
una característica a través de transgénesis. En nuestro país. Sus larvas se alimentan de los
1996 fueron inscriptas en el Registro Nacional tallos y las hojas, dejando galerías que dañan
de Propiedad de Cultivares las primeras varie- la planta, la quiebran, impiden el transporte de
dades de soja tolerante a glifosato de la empre- nutrientes y sustancias y son vía de entrada
sa Nidera y ya en la campaña 97/98 se sem- para hongos, cuyas toxinas (micotoxinas) son
braron 1.750.000 de hectáreas. Hoy hay varias muy peligrosas para nuestra salud.
empresas semilleras que ofrecen al mercado La denominación Bt deriva de Bacillus
un gran número de variedades de soja con thuringiensis, una bacteria que normalmen-
esta característica, encontrándose variedades te habita el suelo y cuyas esporas contienen
de los grupos III a VIII, adaptadas a una amplia proteínas tóxicas para ciertos insectos. Estas
gama de regiones y necesidades. En 2008/09, proteínas, denominadas Cry, se activan en el
la superficie de soja transgénica ascendió a 17 sistema digestivo del insecto y se adhieren a
millones de hectáreas. su epitelio intestinal, alterando el equilibrio os-

mótico del intestino. Esto provoca la parálisis Lecturas y sitios recomendados:
del sistema digestivo del insecto el cual deja
de alimentarse y muere a los pocos días. Las James, C. 2008. Global Status of Commercialized
toxinas Cry son consideradas inocuas para Biotech/GM Crops: 2008. ISAAA Brief Nº 38.
mamíferos, pájaros e insectos “no-blanco”.Hay Servicio para la Adquisición de Aplicaciones
varias proteínas Cry (y por lo tanto diferentes Agrobiotecnológicas (ISAAA) www.isaaa.org
Consejo Argentino para la Información y el
genes cry) y cada una es específica para un
Desarrollo de la Biotecnología, ArgenBio, www.
tipo o grupo de insectos. argenbio.org
El maíz Bt es un maíz transgénico o genéti- Trigo E, Cap, E. 2006. Diez años de cultivos
camente modificado que produce en sus tejidos genéticamente modificados en la Agricultura
proteínas Cry. Así, cuando las larvas del barre- Argentina. ArgenBio.
nador del tallo intentan alimentarse de la hoja
o del tallo del maíz Bt, mueren. Actualmente,
el 48% del maíz cultivado en Argentina es Bt.
Cabe mencionar que también se han cultivado
en la campaña 2008/09 híbridos de maíz que
contienen dos características acumuladas: la
resistencia a insectos y la tolerancia a glifosato
(800 mil hectáreas).
Los beneficios que presenta el maíz Bt se
centran en la posibilidad que tiene el agricultor
de controlar las plagas sin emplear insecticidas,
lo que constituye, además, un beneficio directo
para el medio ambiente. En particular, el con-
trol eficiente de las plagas permite una máxima
expresión del potencial de rendimiento, un ma-
nejo más flexible de las fechas de siembra y
cosecha, y una mejor calidad del grano. Por su
parte, la reducción en el nivel de micotoxinas
es un beneficio para la salud humana y animal.
De la misma manera que el maíz Bt, el algodón
Bt resulta de la incorporación de los genes Cry
al genoma del algodón. Así, el algodón Bt que
se cultiva en la Argentina también es resisten-
te a insectos lepidópteros y en particular, a la
oruga del capullo, la oruga de la hoja del algo-
donero y la lagarta rosada.
En 1998 se comercializó la primera variedad
de algodón Bt en el país. Los principales bene-
ficios del uso de algodón Bt son el aumento en
los rendimientos debido al control de insectos
y la disminución de costos y del impacto am-
biental y para la salud debido al menor número
de aplicaciones de insecticidas. En la campaña
2008/09 se sembraron unas 72.000 hectáreas
de algodón Bt en Argentina.

VII. CAPÍTULO 3 los involucraban a todos: los impuestos, las tie-
rras, los códigos de convivencia. En este con-
texto, las personas se reunían en asambleas
Biotecnología en la mira: el donde trataban los temas de interés común o
problema de la percepción controversiales, había personas destacadas
que cumplían el papel de líderes (la persona
Durand, Valeria de mayor de mayor edad, el patriarca) quie-
nes dirigían el debate y luego se llegaba a un
¿Qué es la percepción? acuerdo.
Según el Diccionario de la Real Academia La sociedad moderna, por el contrario, es
Española y la psicología la percepción es un globalizada, es una sociedad de masas y no
proceso cognoscitivo, a través del cual los su- de pequeñas comunidades, está hiper-comu-
jetos captan información del medio, la elaboran nicada, los intereses comunes son amplios,
e interpretan y forman con estos datos una re- dada la diversidad cultural e ideológica de los
presentación de la realidad de su entorno y/o de miembros que la integran y los problemas son
un tema en particular dentro de dicho entorno. no sólo locales sino globales. Esto define a
Esta “representación” es lo que en el lenguaje la sociedad moderna como compleja, móvil y
cotidiano se conoce como opinión o creencias cambiante. Han aparecido nuevos factores y
que las personas tienen sobre determinados dificultades en el proceso de elaboración de
aspectos, hechos o temas de su realidad. opiniones y acuerdos sobre temas en común.
Si se traslada esta definición que brinda la Por un lado, dada la diversidad cultural, cabe
psicología al terreno de la sociología surgen preguntarse ¿qué se puede considerar “de
los términos “percepción pública” y “opinión interés común”? Existen temas que sin duda
pública”. Si la psicología explica este proceso son importantes para todos, como la salud y
cognoscitivo desde lo individual, la sociología la seguridad; pero ¿qué grado de importancia
lo explica y estudia desde lo grupal. De esta le da cada individuo o cuán relevante es real-
manera, se llama percepción pública al proce- mente un tema para “todos”? Lo que puede ser
so por el cual un grupo de personas interpre- de sumo interés para un grupo, puede no serlo
ta y ve la realidad de su entorno, y en base a tanto para otro. Por otro lado, el individuo ya no
esta interpretación forma determinadas creen- puede cubrir el área total de los intereses de
cias sobre los hechos y temas de su medio. El la sociedad. Son demasiados los temas “en el
conjunto de estas percepciones dan origen a la tapete” y además, no siempre son los mismos
opinión pública, entendida como las creencias temas los que están en el foco de la escena.
y puntos de vista sostenidos por un público en Esto es clave para comprender que, dada esta
cierto momento y sobre un tema en particular, imposibilidad de abarcar y conocer el área total
que no necesariamente concuerdan entre sí. de los intereses, el individuo y los grupos que
Si bien existe un paralelo entre lo que la integran la sociedad moderna recurren a diver-
psicología y la sociología entienden por persas fuentes de información y de interpretación
cepción y opinión, la naturaleza de “lo grupal” para crear una representación de la realidad y
hace que estos términos tengan determinadas formar una opinión. Es decir, los individuos de-
particularidades que serán detalladas a conti- legan en otros la tarea de elaborar e interpretar
nuación. la realidad de una determinada forma y, lo que
es más importante, dejan que esos otros hablen
Haciendo historia por ellos. Las instituciones y organizaciones en
Antes del advenimiento de la Revolución In- las cuales el hombre moderno ha depositado
dustrial, las comunicaciones y la tecnología, la estas funciones son principalmente: los medios
sociedad estaba conformada por comunidades de comunicación, los líderes de opinión (perio-
pequeñas y aisladas. Los intereses de los inte- distas, celebridades) y las organizaciones sin
grantes de estas comunidades se limitaban a fines de lucro (grupos activistas, organizacio-
su pequeña ciudad o vecindario y a temas que nes no gubernamentales - ONGs, asociacio-

nes de defensa del consumidor). La sociedad tulo: la percepción pública de la biotecnología,
ha depositado su confianza en ellos, a quienes brevemente se hará referencia a los métodos
en este capítulo llamaremos “influenciadores” utilizados para medir la percepción. Existen di-
por considerarlos creíbles. Asimismo, estas versas metodologías, entre las cuales se des-
personas e instituciones, concientes de este tacan tres:
voto de confianza, se han apropiado de este • Focus groups.
rol y se autodefinen como los voceros de la • Observaciones de campo.
opinión pública, los que representan y defien- • Sondeos o encuestas de opinión.
den los intereses comunes de la sociedad. • Tomaremos el sondeo o encuesta de
opinión, por ser uno de los métodos más
Zonas grises utilizados, de tipo cuantitativo y, cuando
No todo es blanco y negro en el mundo de la bien diseñado e implementado, con me-
percepción y la opinión pública. La primer zona nor margen de error.
gris que podemos identificar está relacionada • La encuesta o sondeo de opinión consis-
con el hecho de que el hombre no es sólo un te en tomar una muestra representativa
ser racional y objetivo sino también emocional. de cierto segmento de la sociedad y, en
Por lo tanto, la opinión pública no se forma forma periódica o en un momento deter-
exclusivamente en base a juicios objetivos ni minado, se le hacen una serie de pregun-
análisis fríos y desinteresados de un tema. Por tas en relación con el tema en cuestión.
el contrario, en la formación de opinión tam- Dichas preguntas son de tipo cerradas.
bién intervienen una serie de factores de ín- La periodicidad de este método permite
dole emocional de gran importancia: deseos, predecir la dirección o tendencia hacia
miedos, creencias religiosas, mitos, leyendas, donde va un determinado punto de vista
costumbres, entre otros. Los influenciadores o, cuál es dicha tendencia en un momen-
saben esto muy bien y lo utilizan de manera to y circunstancias determinadas.
apropiada para lograr adhesión a sus causas. • Incluir o definir a las encuestas de opi-
(Se mencionarán ejemplos más adelante en nión como una “zona gris” significa que
este capítulo). dicho método, mal empleado, es imper-
La segunda zona gris tiene que ver con una fecto y puede llevar a conceptos erró-
característica mencionada en párrafos anterio- neos básicamente porque:
res de la sociedad moderna: Es una sociedad • Los resultados se pueden ver afectados
de masas. Por lo tanto, su comportamiento es por la forma como es formulada la pre-
más similar al comportamiento de las masas gunta.
que al del individuo. La “masa” es irracional, • La toma de la muestra puede ser inco-
difusa, son “todos y a su vez nadie”, es cam- rrecta o no representativa.
biante y está dispersa. • Las preguntas abiertas y subjetivas, si se
La tercer y última zona gris está relacionada incluyen, se prestan a interpretaciones y
con los métodos de medición de la percepción confusiones.
pública, los cuales pueden arrojar resultados
poco precisos que brindan una interpretación Ejemplos:
errónea de lo que el público cree o siente en Se presentan a continuación dos preguntas
relación a un tema. extraídas de dos sondeos de opinión realiza-
Tener en cuenta estas “zonas grises” es dos en los años 2003 y 2005.
clave para comprender determinadas mani- a) “¿Está interesado en informarse acer-
festaciones de la percepción pública: cómo ca del consumo de alimentos transgénicos?”
reacciona una sociedad ante cierto problema (Consulta sobre Biotecnología en Argentina –
o tema de controversia. SAGPyA -2003).
b) “¿El consumidor tiene derecho a decidir y
Cómo se mide la percepción pública saber si consume o no transgénicos? (Green-
Antes de pasar al tema central de este capí- peace México - Septiembre, 2005).

Ambas preguntas apuntan a recavar datos información que ya se brinda, demuestra
acerca del derecho a la información y el interés que: algunos consumidores dicen querer
del consumidor por estar informado. La res- información pero no tienen el hábito de
puesta a la pregunta “a” marcaría una tenden- leer las etiquetas de los alimentos, y que
cia hacia el querer recibir información o bien la opinión pública es irracional y a veces
mostraría una tendencia hacia el desinterés no sigue el sentido común.
por el tema, si la mayoría de las respuestas En conclusión, el sondeo de opinión es im-
fuesen negativas. Por otra parte, la respuesta portante y sus resultados válidos y útiles en
a la pregunta “b” no daría como resultado una muchos casos. De todos modos, es una herra-
tendencia sino una creencia o punto de vista mienta que debe ser utilizada y diseñada por
subjetivo de quien responde. profesionales expertos y sus resultados inter-
En relación al derecho a la información y pretados bajo el contexto y momento en que se
yendo al análisis de las dos preguntas más llevó adelante la investigación.
en profundidad, en primer lugar nadie pone en
duda que todo individuo en una sociedad de- La percepción pública: el caso de la
mocrática tiene derecho a estar informado, por biotecnología
lo cual la respuesta a “b” sería obvia. Extraña- Hecha la breve introducción a la definición
mente alguien respondería de manera negati- de la percepción pública y cómo se conoce y
va, fuese cual fuese el tema en cuestión. Por estudia, se procederá a continuación a analizar
otro lado, en ciertos aspectos pueden aparecer el caso en particular de la percepción pública
paradojas. El IFIC (Consejo Internacional para de la biotecnología, con especial foco en la si-
la Información sobre Alimentos de los Estados tuación en Argentina.
Unidos), presentó en 2008 en Argentina los re- En ciertos sectores de la sociedad, existe
sultados de una encuesta de percepción cuan- una percepción negativa, o al menos una mi-
titativa realizada en 2007 en Estados Unidos rada desconfiada hacia los productos de la bio-
con el fin de seguir la tendencia de las actitu- tecnología, especialmente los cultivos transgé-
des de los consumidores hacia la biotecnolo- nicos. Ante dicha situación, surge la pregunta
gía en alimentos. Sorprendentemente, ante la ¿Cuáles son los factores que dieron origen a
pregunta “¿Qué información desea Ud. que esta percepción negativa?
brinden las etiquetas de los alimentos?”, 84% • Los mismos pueden resumirse en tres
respondió que no sabía y sólo un 1% respondió puntos:
que deseaba información sobre biotecnología. • Factores psicológicos inherentes al ser
El 15% restante de los encuestados que nom- humano.
braron qué información deseaban obtener de • La acción de los influenciadores.
las etiquetas, paradójicamente pidieron infor- • Tendencias en la sociedad moderna.
mación que ya aparece en las mismas.
De lo expuesto es posible sacar algunas El hombre: ser racional y emocional
conclusiones a modo de ejemplo: Como ya se mencionó en la primera parte, el
• La pregunta apropiada tal vez no sería hombre no actúa sólo en base a lo que le dicta
“¿Desearía información sobre…?” ya la razón, sino también “el corazón”. A lo largo
que todos, si nos preguntan si desea- de la historia, el advenimiento de nuevas tec-
mos contar con información para nuestra nologías trajo consigo muchos beneficios pero
salud y alimentación tenderíamos a res- también supuestos riesgos e inconvenientes, y
ponder que sí. La pregunta más apropia- despertó temores y desconfianza. Klaus Am-
da podría ser “¿Qué información desea mann, profesor emérito de la Universidad de
saber?” e incluir opciones para que el Berna (Suiza) y experto en biotecnología, en
entrevistado elija. una visita a Argentina en diciembre de 2007
• La incongruencia entre decir “Sí, deseo planteó que el camino que usualmente recorre
información” pero luego no saber res- toda nueva tecnología ni bien es conocida por
ponder qué información se desea o pedir la sociedad es:

1. Sospecha/desconfianza. conocemos los riesgos o posibles contraindi-
2. Rechazo absoluto y “combate”. caciones; sin embargo, consideramos el be-
3. La tecnología sigue su curso y se de- neficio de curarnos del dolor específico como
muestran sus beneficios y/o inocuidad. prioritario y consumimos el medicamento de to-
4. Neutralidad/precaución. dos modos. Yendo a un ejemplo más cotidiano,
5. Aceptación, incorporación y uso. conocemos los riesgos de manejar un auto, sin
embargo, lo hacemos porque damos prioridad
Después de todo, es lógico desconfiar de lo a las ventajas de comodidad, rapidez, entre
nuevo, de lo que no se conoce. Por ejemplo, el otras. En el caso de la biotecnología, algunos
rechazo de muchos en el siglo XIX a las vacu- sectores sintieron claramente los beneficios de
nas, aceptadas hoy en día y utilizadas por to- la biotecnología, como el caso de los produc-
dos, pone de manifiesto que la llegada de una tores, sin embargo, el consumidor común no
nueva tecnología no siempre es bien recibida logra ver aún los beneficios directos de esta
y que se desconfía de sus supuestos benefi- tecnología, por lo tanto, aún desconfía. Asimis-
cios. Cuenta la historia que los experimentos mo, es más fácil comprender por qué la bio-
de Luis Pasteur conmocionaron en su época a tecnología aplicada al desarrollo de productos
la comunidad científica, que veía con horror la farmacéuticos goza de “mejor prensa” que la
introducción deliberada de un microorganismo biotecnología aplicada al desarrollo de cultivos
mortal en el cuerpo humano. Algunos seguido- transgénicos.
res de Pasteur se escandalizaron de su proce-
Por último, se enumerarán algunos factores
der y hasta abandonaron su laboratorio como
que sirven para comprender un poco más por
protesta.
qué el hombre tiende a rechazar una nueva
Si pensamos en el caso de la biotecnología,
tecnología:
quizás podríamos decir que nos encontramos
• La inmediatez y disponibilidad de gran
entre los puntos 3 y 4 del “camino” que marca
flujo de información que hoy hay disponi-
Klauss Ammann. Quedaron atrás las épocas
ble. La sobredosis de información puede
de rechazo absoluto, motivadas por fuertes
campañas de ciertas organizaciones activis- generar confusión e incertidumbre.
tas. La tecnología ha seguido su curso, cier- • El “historial” del uso no ético o incorrecto
tos sectores, como la agricultura, la industria de ciertas tecnologías y avances cientí-
farmacéutica y la alimenticia, la han aceptado ficos.
y la están utilizando, pero aún queda un largo • La propia “naturaleza humana” que res-
camino por recorrer en el terreno de lo que per- ponde no sólo a fundamentos racionales
cibe y sabe el consumidor. sino que también se mueve por emocio-
Continuando con los factores de tipo psicoló- nes.
gicos que afectan la percepción de la biotecno- • La desconfianza de la sociedad en sus
logía, además del miedo a lo nuevo, las recien- organismos reguladores y controladores.
tes teorías de comunicación del riesgo ponen • Los cambios sociales y económicos, di-
de manifiesto que los riesgos asociados con rectos e indirectos, generados por toda
una percepción errónea de la realidad son más nueva tecnología que se perciben como
preocupantes y nocivos que los reales riesgos buenos para algunos sectores y neutros
que estas nuevas tecnologías puedan implicar. o perjudiciales para otros.
Asimismo, está comprobado que ante la ecua- • El devenir de la ciencia (el “estado del
ción riesgo/beneficio, si el hombre percibe que arte”). Por ejemplo, algunos consumido-
el beneficio es mayor o sumamente relevante, res dicen “Recién ahora se conoce que
asume los riesgos implicados. De lo contrario, las grasas trans son nocivas. ¿Qué más
si no percibe beneficios claros o inmediatos, da se descubrirá en unos años? ¿Y si esta-
prioridad o mayor importancia al supuesto ries- mos comiendo hoy algo que se cree ino-
go. El ejemplo más claro de esto es el consu- cuo y años más tarde se descubre que
mo de medicamentos. Si leemos un prospecto, no lo es?”

El trabajo de los influenciadotes ellos. Además, como se vio en la prime-
La teoría de las comunicaciones presenta ra parte, ellos se autodefinen como los
el concepto de “influenciador”. El influenciador “voceros” de la opinión pública, los que
es toda persona o institución referente en una reflejan “lo que la gente quiere”.
industria o especialidad, que es considerada • Elaboran sus mensajes de manera inte-
fuente experta autorizada en dicha especiali- ligente, apelando a lo emocional y al alto
dad, referente de la misma, confiable y veraz. impacto.
Las creencias o afirmaciones de un influencia- • Son, en general, proactivos para comu-
dor por lo general no son puestas en tela de jui- nicar.
cio y tienen un efecto multiplicador en el senti- • Trabajan en conjunto: las ONGs utilizan
do que otros las copian, adoptan o toman como a los medios para transmitir sus mensa-
modelo. El influenciador suele ser una persona jes montando campañas mediáticas y
con amplias habilidades comunicativas, con un tienen como voceros a diversas celebri-
alto poder de convencimiento y argumentación. dades. Ejemplo: La participación de ac-
En el ámbito de la biotecnología, hay diver- tores, cantantes y famosos en campañas
sos influenciadores que envían información de ONGs.
al consumidor e intervienen en el proceso de • Si bien, todos estos grupos tienen poder
percepción de la biotecnología. No actúan en para que el público se adhiera o no a una
forma aislada, sino que conforman una red causa, no todos tienen el mismo nivel de
donde interactúan entre sí e intercambian in- llegada o actúan de la misma forma. Por
formación. En la figura 1 se muestra cuáles son tal motivo, su grado de influencia varía.
estos influenciadores. A continuación se mencionarán breve-
mente algunas características de estos
influenciadores y en algunos casos, cier-
tas problemáticas que afectan su grado o
nivel de influencia.
• La comunidad científica maneja gran
cantidad de información, pero suele “en-
cerrarse” en sí misma y ser poco proac-
tiva con respecto a las actividades de
divulgación. Si bien en los últimos años
aparecieron muchos proyectos de comu-
nicación (a través del Canal Encuentro,
por ejemplo, la Agencia de Noticias Cien-
tíficas - Cyta - del Instituto Leloir, entre
Figura 1. otros), los científicos “están para traba-
jar en la mesada”. Es necesario traducir
Bajo el término “comunidad científica” se in- sus mensajes a un lenguaje accesible y
cluyen: los equipos de trabajo de centros de comprensible para que las personas no
investigación públicos, las universidades, los expertas comprendan el tema en cues-
médicos, asociaciones médicas, y demás aso- tión. Además, el científico habla con un
ciaciones profesionales. lenguaje objetivo y basado en evidencia
El consumidor recibe información de muchos científica, no apela a lo emocional, no
otros sectores: las empresas o la industria, a busca adeptos a una causa.
través de la publicidad; el poder político, a tra- • Por el contrario, las organizaciones ac-
vés de sus campañas; los educadores. Sin em- tivistas y ONGs tienen una fuerte rela-
bargo, los verdaderos influenciadores son los ción con los medios de comunicación,
que aparecen en la figura porque: a quienes llegan con mensajes de alto
• Son grupos con alta credibilidad, la so- impacto emocional (demostraciones, pi-
ciedad confía en ellos y simpatiza con quetes, etc.) que los medios encuentran

atractivos o “prensables”. Asimismo, a Afortunadamente en nuestro país, cada vez
través de artículos, campañas publicita- son más los periodistas científicos y los depar-
rias, propagandas con líderes de opinión tamentos de prensa de institutos científicos y
y personajes famosos, los consumidores universidades, con lo cual las actividades de
reciben de estos grupos diversos men- divulgación científica han crecido y existe aún
sajes. Además, a través de actividades mucho por hacer en este terreno.
de lobby y recursos legales tales como
juntar firmas, petitorios, cadenas de co- El nivel de impacto de los mensajes de
rreo electrónico, etc., los grupos oposito- los influenciadores
res se relacionan con el poder político e Se entiende por nivel de impacto la fuerza
intentan influir sobre las políticas científi- con que el mensaje llega al público. ¿Es regis-
cas y tecnológicas. trado con inmediatez? ¿La comunidad habla y
• Las celebridades o personajes famo- comenta este mensaje, o pasa desapercibido?
sos, se suman a causas relacionadas ¿Provoca alguna reacción en el público (ma-
con el medio ambiente, la educación y nifestación de rechazo, apoyo, acuerdo, des-
otros temas sociales. Al consumidor poco acuerdo o indiferencia)? Se entiende por grado
le importa que dicho personaje conozca de influencia el poder del mensaje para modi-
o no el tema sobre el cual predica. Aquí ficar hábitos y / o costumbres del público que
entra en juego lo emocional, pesa más la lo recibe.
simpatía por el personaje y su imagen,
Es posible representar estos parámetros
que su formación o conocimiento acadé-
(impacto e influencia) en relación con los in-
mico.
fluenciadores y otros comunicadores mediante
• En cuanto a los periodistas, reciben in-
un gráfico donde el eje vertical simboliza el gra-
formación de todos estos influenciado-
do de influencia e impacto y el eje horizontal la
res y divulgan o no sus mensajes según
proactividad del influenciador o comunicador,
los ven prensables o no. Todo tema de
controversia genera interés en la prensa, es decir, su iniciativa para salir a “contar su his-
todo lo que diga un famoso, también. De toria” o transmitir su mensaje (figura 2). El cua-
este modo, los medios eligen los hechos drante del ángulo izquierdo inferior está vacío,
que consideran noticia y los difunden. lo cual indica que ninguno de los grupos men-
Usualmente, las demostraciones de alto cionados es 100% inactivo, ni emite mensajes
impacto que realizan grupos activistas carentes de impacto. Se observa que la comu-
suelen tener cabida en la prensa y es- nidad científica es un grupo de gran credibili-
tos grupos mantienen una fluida relación dad e influencia (cuadrante izquierdo superior),
con los medios. Un hecho importante a es decir, sus mensajes son altamente escucha-
destacar es que en ciertos temas que dos y tenidos en cuenta. La sociedad cree en
despiertan controversia, los medios es-
cudados bajo el lema de “mostrar las dos
caras” presentan con igual importancia a
un experto que a un no experto. Ejemplo:
En un programa de TV emitido en 2007
por América, se presentaron expertos
en minería de una empresa del rubro y
una joven actriz, quien representaba a
una ONG, para debatir sobre la minería
química a cielo abierto. Sin duda, la pre-
sencia de la actriz, su imagen positiva y
habilidades comunicacionales frente a
cámara opacaron e hicieron poco efecti-
vos los argumentos de los desconocidos
expertos. Figura 2.

los científicos argentinos y los valora y admira. pacio a que “todos opinen”.
De todos modos, las estrategias de comuni- • Las pocas actividades de divulgación
cación que emplean son escasas y de ningún científica de la biotecnología.
tipo de impacto emocional. Son divulgadores El impacto
pero no buscan adeptos, no son activistas. Por En base a lo expuesto en los párrafos an-
otra parte, el público escucha con atención los teriores, reflexionemos acerca del tema de la
mensajes de los activistas y la prensa, a quie- percepción de la biotecnología a través del
nes perciben como confiables, denunciantes y análisis de algunos ejemplos concretos.
defensores de los derechos de los consumido- El folleto siguiente (Folleto informativo del
res y del medio ambiente, por ello es que sus Consejo para la Información de la Biotecnolo-
mensajes tienen un alto impacto en la sociedad gía en Brasil www.cbi.org.br) y el panfleto de la
(cuadrante derecho superior). Por último, el derecha (figura 3), ambos bregan por el dere-
grupo comprendido por las empresas,
el sector agrícola incluyendo la prensa
especializada, el poder político y los or-
ganismos reguladores pueden ser pro-
activos en cuanto a sus estrategias de
comunicación y se acercan al público
de interés que quieren contactar utili-
zando diferentes medios: conferencias
y comunicados de prensa, publicidad,
propaganda, campañas de comunica-
ción, entre otros. Asimismo, sus men-
sajes pueden pasar desapercibidos o
no producir impacto alguno, dado que
el índice de credibilidad de alguno de
estos grupos es bajo o porque el públi-
co al que se dirigen es reducido o con Figura 3.
intereses específicos y no apuntan al
público en general, como es el caso de
la prensa rural. Cabe mencionar que la imagen cho a la información. ¿Cuál cree el lector que
o credibilidad de los organismos regulatorios tiene mayor impacto en el público? ¿Qué men-
es variable en los diferentes países. Por ejem- sajes transmiten?
plo, los norteamericanos confían en sus siste-
mas de regulación y control, pero los europeos, Tendencias en la sociedad moderna:
debido a casos históricos, como el del Mal de otros factores que influyen en la
la Vaca Loca, confían menos. En los países en percepción de la biotecnología
desarrollo la gente no confía en general en las Hay otros factores que también influyen en
instituciones políticas y de control, y ante estas la aceptación o rechazo de ciertas tecnologías,
circunstancias, los mensajes de estos organis- alimentos o avances científicos, y la biotecno-
mos pierden fuerza. logía también se ve influenciada por ellos. Se
De lo expuesto anteriormente sobre el accio- denominará este último grupo de factores bajo
nar de los influenciadores, es simple deducir el nombre de “tendencias o modas”, es decir,
que la mala imagen de la biotecnología, espe- usos, gustos, costumbres que se imponen
cialmente de la biotecnología agrícola, surge de: en un determinado momento, logran muchos
• El éxito de las campañas de las organi- adeptos y con el correr del tiempo pueden per-
zaciones activistas. durar, desaparecer o perder fuerza.
• Los mensajes de tipo emocionales que Estas tendencias son las siguientes:
ellos han sabido transmitir. • La moda, la industria de la belleza y las
• El accionar de la prensa que ha dado es- celebridades promueven el cuidado del

medioambiente. ceptos “vegetariano – natural = belleza perfec-
• La tendencia de “volver a las raíces o lo ta”. Veamos a continuación un ejemplo de la
natural” es pregonada por ciertos grupos industria de la cosmética (figura 4), se notarán
y asociaciones. en él los conceptos de “natural, sustentable y
• La belleza y “lo natural” van de la mano. de vuelta a las raíces”. En base a estos ejem-
• Las empresas deben ser socialmente plos, se aprecia cómo se interrelacionan los
responsables. conceptos de “natural, sustentable, belleza,
espíritu, salud” como opuesto a “tecnología,
Existe una tendencia actual a que muchas de consumo, negocio, capitalismo, manipulación
las empresas y marcas del mundo de la moda y maltrato del medioambiente”.
y los cosméticos traten de asociar su imagen al A estos factores se debe sumar un concepto
concepto del cuidado del medio ambiente y la que especialmente afecta a la percepción de
solidaridad. De esta forma, transmiten mensa-
jes tales como “no al uso de productos quími-
cos en las fibras”, “no a la manipulación”, “no
a la explotación de campesinos para sembrar
algodón”, “no a la matanza de animales para
hacer carteras, etc.”. La palabra de moda es
“sustentable”.
Con mensajes como éstos, las empresas
desarrollan “Campañas de Responsabilidad
Social Corporativa o Empresaria” que consis-
ten en realizar actividades al servicio de la co-
munidad relacionadas con la industria en que
la empresa se desempeña. Usualmente estas
campañas tienen que ver con la educación, el
medioambiente y la salud. Figura 4.
Por último, existe una tendencia que en este
capítulo denominamos “vuelta a las raíces o
vuelta a lo natural”. Existen grupos y asocia- la biotecnología y es el hecho de entender a
ciones que pregonan el rechazo a las tecno- la biotecnología como un negocio. Las orga-
logías, al confort de la sociedad moderna, y al nizaciones activistas han hecho importantes
consumo; y bregan por volver “a las raíces”. campañas y de hecho éste es el argumento
Son ejemplos de esto, el movimiento llamado que continúan esgrimiendo, denunciando que
Permacultura, definido según su página web la manipulación genética no tiene otro fin más
de la siguiente forma: “Permacultura es produ- que generar ganancias para la empresa que
cir alimentos sin trabajar la tierra, no comprar desarrolla el transgénico. La sociedad parece
electricidad, agua, gas, no generar basura,
simpatizar con esta idea, sin embargo, castiga
soluciones regionales, la armonía en el plano
a la agrobiotecnología como negocio pero no a
material”. Este modo de vida que sus seguido-
la biotecnología aplicada al desarrollo de medi-
res definen como saludable, pleno y armonio-
camentos, que también es un negocio para la
so con el planeta se desarrolla en las llamadas
“eco villas” situadas en diferentes puntos del industria farmacéutica. Asimismo, en la pelea
mundo, inclusive en Argentina. Principalmente, público – privado, el científico que trabaja para
rechazan la agricultura convencional. el sector público es un héroe para los argenti-
Algunas celebridades y marcas también bre- nos, mientras que el científico que trabaja para
gan por la vuelta a lo natural. Es común es- la industria goza de menor prestigio. Nueva-
cuchar hoy que actrices y modelos son, por mente se percibe ante esto la irracionalidad de
ejemplo, vegetarianas, lo cual inmediatamente la opinión pública y la conjugación de diversos
asocia en el imaginario del consumidor los con- intereses que van más allá de lo científico.

La siguiente ilustración y la caricatura (figura Lecturas recomendadas
5) que fueron publicadas en el Diario La Nación
en noviembre de 2005 para ilustrar una nota Einsele, Arthur. 2007. The Gap between Science
sobre ingeniería genética, muestran el concep- and Perception: The Case of Plant Biotechnology
to “La biotecnología es un negocio”. in Europe. Adv. Springer, Verlag, Berlin.
International Food Information Council, www.ific.
org.
McHughen, Alan. 2007. Public Perceptions of
biotechnology. University of California, Riverside,
CA, USA.
Ridner, Edgardo; Gamberale, María Cristina;
Burachik, Moisés; Lema, Martín; Rubinstein,
Clara; Levitus, Gabriela. 2008. Alimentos
transgénicos: mitos y realidades. 1º edición.
Buenos Aires: Nutrición y Salud.
SAGPyA, www.sagpya.mecon.gov.ar.
Young, K y otros. 1986. La opinión pública y la
propaganda. Paidos Studio. Méjico.
Figura 5.
Conclusiones
La aceptación o rechazo de una tecnología
por parte de la sociedad puede determinar su
éxito o su fracaso, la introducción de algo nue-
vo siempre genera debate y las campañas de
información son fundamentales. La divulgación
científica objetiva, seria y sin tinte emocional,
es una herramienta muy útil para desenterrar
mitos e interrogantes. La sociedad necesita in-
formación veraz y de base científica: la infor-
mación y la educación son la clave.

Auspicios
ArgenBio es el Consejo Argentino para la Información y Desarrollo de la

Biotecnología. Es una organización sin fines de lucro que tiene como misión divulgar
Biotecnología
información sobre la biotecnología, contribuyendo a su comprensión a través de la
educación y estimulando su desarrollo. y Mejoramiento Vegetal II
Consideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnología y
dirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro
Editores:
cubre una necesidad importante ya que aporta información completa y actualizada Gabriela Levitus, Viviana Echenique,
sobre las tecnologías de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginski
por especialistas y en idioma español.
Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarán en este libro una
excelente fuente de información.
Consejo Argentino para la Información
Para conocer más sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org y el Desarrollo de la Biotecnología
Ediciones
Instituto Nacional de
INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA
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ArgenBio es el Consejo Argentino para la Información y Desarrollo de la

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 1

Parte I: Herramientas Básicas ........................................................................................... 15

Capítulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro

Parte II: Métodos para generar y analizar diversidad 183

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 3

Parte IV: Métodos de propagación y conservación de germoplasma 351

Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal 377

Capítulo 1: Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra-

4 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Parte VI: Manejo responsable de la tecnología 569

Capítulo 1: Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de Organismos Genéti-

Capítulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolución y estrategias de manejo. Daniel

Parte VII: Biotecnología y sociedad 631

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 5

6 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

En oportunidad de la Primera Edición de “Biotecnología y Mejoramiento Vegetal”, nos habíamos

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 7

LISTAS DE AUTORES (por orden alfabético)

Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnología, INTA Castelar

8 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 9

10 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Prólogo a la primera edición

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 11

12 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 13

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 15

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 17

18 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 19

20 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 21

Sustancias reguladoras del crecimiento: En 5. Condiciones ambientales para la

22 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 23

24 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Luna

GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR-

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 25

En condiciones de cultivo in vitro, las células

26 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 27

Las células embriogénicas son similares a las po de células embriogénicas, el desarrollo de

28 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 29

de los estratos procambiales y de manera su- la raíz y al procambium en respuesta a la elon-

30 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 31

32 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 33

34 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 35

36 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 37

38 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 39

40 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 41

42 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 43

44 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II

acepta HA que indica la existencia de ligamien- X 2( E O )2

2.3.3. Estimación de la frecuencia de número de gametas recombinantes (4 3)