EXPRESION DE

ANTIGENOS EN
PLANTAS
■ • Ventajas
■ Las plantas funcionan como
biofábricas.
■ Son sistemas relativamente
baratos y requieren escasa
inversión en facilidades e
infraestructura.
■ Se dispone de sistemas de
expresión integrativos (plantas
transgénicas) y no integrativos
(vectores virales).
■ Las plantas son un vehículo
ideal para la vacunación por
vía oral.
■ Presentan las ventajas de los
entornos de expresión
eucariotas.
■ Los productos obtenidos
están libres de patógenos de
mamíferos.
 DNA sintético
■ Actualmente, mediante síntesis química se obtienen
miles de fragmentos de ADN cada día. El factor clave
para la simplificación del procedimiento consistió en
lograr la síntesis en fase sólida, que es susceptible de
ser adaptada a una máquina automática. Las
limitaciones de esta técnica sólo permiten sintetizar
directamente fragmentos de ADN de un tamaño
menor a unas 100 bases, por lo que normalmente se les
conoce como oligonucleótidos (o simplemente oligos).

■ De cualquier manera, utilizando las propiedades de

polimerización del ADN y de la enzima ADN ligasa, se
pueden construir grandes trechos de ADN de doble
cadena.
 Síntesis química de
oligonucleótidos
* Proceso cíclico en el que cada nucleótido es incorporado
secuencialmente
(desde 3’ a 5’) para formar una cadena de nucleótidos.
* El nucleótido 3’ es covalentemente unido a un soporte sólido, y sobre
el
se van añadiendo monómeros de uno en uno en un proceso que implica
cuatro reacciones químicas:

Detritilación
Acoplamiento
Capping
Oxidación
* El producto final contiene extremos 5’-OH y 3’-OH (no
fosforilado).
Detritylation: The acid-labile DMT group of the support-bound monomer is removed with Dichloroacetic
acid (DCA) in order to get a free 5’- OH group.

Coupling: The 3’-end of the next nucleotide monomer is activated by tetrazole. Tetrazole, a weak acid,
protonates the tertiary nitrogen group of the phophoramidites so that the diisopropylamine moiety becomes
a good leaving group. The nucleophilic attack by the free 5’-hydroxyl group on the 3’phosphorous of the
incoming activated monomer results in a internucleotide binding.

Capping: The unreacted chains (failure sequences) must be capped to prevent further elongation in the
next cycles. For this step, acetic anhydride and N-methyl-imidazole are mixed to form an activated
acetylating agent.

Oxidation: The trivalent phosphate bond is oxidised with iodine to a more stable pentavalent bond. Steps
1 through 4 are repeated, beginning with the detritylation step, until the chain elongation is complete.
 TECNICA EN FASE SÓLIDA

■ El DNA se sintetiza por un procedimiento en fase

sólida en el cual el primer nucleótido de la cadena se
sujeta a un soporte poroso por ej. gel de silice de 50mu
de tamaño; se necesitan varias etapas químicas para la
adición de cada uno de los nucleótidos, una vez cada
completada cada etapa la fase solida que contiene en
crecimiento se elimina de la mezcla de reacción por
filtración o centrifugación; una vez lograda la longitud
de DNA deseada se retira del soporte de fase sólida y
se purifica para eliminar los subproductos.
 Síntesis química de
DiMetoxiTriti
l
oligonucleótidos
(acido-labil)

5’- 3’-
OH OH
C C G T A G C A
 TECNICA POR GRUPOS PROTEGIDOS
■ Otro método consiste en la utilización de grupos protectores
a los extremos 3' o 5' de los mononucleotidos; estos grupos
son grandes residuos orgánicos que impiden la formación de
enlaces fosfodiestericos, pero que se pueden eliminar cuando
se desee.
■ Si se condensa un nucleótido protegido en 5' con otro
protegido en 3' se formara un enlace fosfodiesterico normal
entre los extremos libres y aparecera un dinucleotido con
ambos extremos protegidos, dependiendo del lado al que se
desea incorporar un nucleótido el grupo protector se elimina
con un ácido o una base, se repite el ciclo de condensación,
eliminación de un grupo protector y recondensación hasta
conseguir la secuencia deseada.
TECNICAS PARA PREPARAR SONDAS

• Sondas de DNA:
• Técnica de Nick translation (corte-
sustitución)
• Técnica de Random Primer (marcaje al
azar)

• Sondas de RNA
• Técnica SP6 RNA polimerasa
 Marcaje de ácidos nucleicos: Síntesis de DNA uniformemente
marcado.
a) Nick b) Random priming
translation
DNA duplex

Corte (nick)
1 por DNAsa
Desnaturalización por
calor
I
(10 ºC, 10 min)

+ Generación de cadenas
simples

Actividad exo
2 5’-3’
Unión de oligos (6-10 nt)
de DNA pol. I
“random”
5’ 3’ 5’ 3’

Incorporación dNTP
3 dNT marcados Extensión mediante
P por act. polimerasa 5’
Klenow
3’
5’ 3’
de DNA pol. I

Generación de
fragmentos
5 Marcados3 (150-200 nt)
c) Mediante ’ ’

PCR
& Nick - Translation (corte - sustitución) :
Sondas DNA.
5 3 nicked DNA duplex
’ ’
E. coli DNA polymerase I
3 5+
’ ’
4 dNTPs (α 32 P-labelled)

PP
Pα
* O I P O
H
Pβ H
Pν
B
B
EXONUCLEOLYSIS
P
5 P P P O P 3
' H '

B B B B B B
B B B B B B

3 P P P P P 5
' '

Continued
5 3
reaction
’ ’ Labelled, nicked DNA duplex
& Randon Primer (Marcaje al azar) : Sondas DNA
Duplex DNA

Denatur
e
Single strands
+
Add random
sequence primers
Single strand
+ random primers
Add klenow polymerase unlabelled
dNTPs labelled dCTP (*)
Primer
extension * * * *
Denature to
Template release labelled probe
single
strand

Labelled * * * *
probe

Add to hybridization
& Sistema SP 6 - RNA polimerasa : Sondas RNA

Promotor
SP6 Secuencia
de la
Sonda Sonda
insertada vecto
GEN secuenci
r
a

plasmido
Linearizado

Adición SP6 RNA

polimerasa
No marcado CTP, ATP, GTP
marcado UTP

Sondas
RNA
 BIOTINA & Biotina - Avidina
BIOTINA
(Sondas frias) :
Sondas DNA
Adición
avidina
BIOTINA AVIDINA

BIOTINA AVIDINA

Adición biotina fosfatasa

alcalina
Biotina fosfatasa
BIOTINA AVIDINA
alcalina
Biotina fosfatasa
BIOTINA AVIDINA
alcalina

Add nitroblue tetrazolium + bromo-chloro-

indolyl
(NBT) phosphate(BCIP)
NB
(BCIP BC T
) Insolubl
phosphat L e
REQUERIMIENTOS
- Sonda : Secuencia específica del agente patógeno
- DNA blanco : DNA de las muestras a analizar
(paciente)
- Señal de detección : marcaje de la sonda

EL USO DE SONDAS EN EL Dx OFRECEN

Especificidad : Producen respuesta a partir de un
solo organismo o molécula.
Sensitividad : Identifican pequeñas cantidades del
patógeno aún en presencia de otros patógenos.
Simplicidad : Desarrollo kits comerciales para
patógenos humanos, contaminantes de alimentos, etc.
Dx bacterias, virus, parásitos.
La técnica de Southern
blot
 NORTHERN
BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso
de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
*1. Expresión génica
Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda 3
molécula de 2
molécula s DNA
s de RNA P
…TAACGT
de RNA … RNA
…AUUGCA interé
… s

Resultad
o
Gel Northern BLOT
Agarosa
4. Revelado

RNA
interé 3

s 2
e
-

Todos RNA
los de
RNA interés
SECUENCIACION DE DNA
 Métodos

Hay dos métodos principales:

■ Metodo Quimico o de Maxam-Gilbert

■ Metodo Enzimatico o de Sanger
(secuenciación dideoxy o terminación de
cadena)
 Método Químico o MÉTODO DE MAXMAN
& GILBERT
■ Esta basado en la desestabilización mas o menos
selectiva de las bases nitrogenadas ante un
determinado reactivo químico; asi por ej.
■ El dimetil sulfato desestabiliza y rompe en G;
■ la hidrazina a altas concentraciones de NaCl rompe en
C, en medios ácidos rompe en A, G.

■ De tal manera que si las condiciones son fijadas para

que solo 1 o máximo 2 sitios sean rotos al azar se
obtendrá una muestra heterogénea de diferentes
tamaños de DNA.
■ Un fragmento de ADN se marca radiactivamente en
sus extremos con gamma 32P.
■ La técnica consiste en romper estas moléculas
marcadas con reacciones químicas específicas para
cada una de las cuatro bases.
■ Cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo
condiciones distintas, posteriormente el tratamiento
con piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de
la base modificada.
■ Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven
en función de su tamaño en geles de poliacrilamida
donde la secuencia puede leerse en base al patrón de
bandas radiactivas obtenidas.
 SECUENCIACIÓN DEL DNA
* Método del didesoxi de Sanger – método de la
interrupción controlada de la reacción enzimática (de
la polimerización de DNA).
Frederick
* Elementos necesarios: Sanger

- DNA polimerasa

- Oligonucleótido (primer o cebador):

• 18-30 nucleótidos.
• complementario a una parte de la secuencia del DNA que queremos
secuenciar

- Mezcla de los 4 desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)

- Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleótidos

(ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados radioactivamente (*)
Este método utiliza los didesoxirribonucleótidos,
análogos de base que han perdido su grupo
alcohol OH del carbono 3'.
 SECUENCIACIÓN DEL DNA

* Reacción de la
polimerasa:

Enlace fosfodiéster entre 3’-OH

de la cadena cebadora y P del
dNTP (liberación de PPi).

Desoxi Didesoxi nucleótido

nucleótido (bloqueo de la síntesis de
DNA)

O
dNT H
P
■ Este método emplea análogos de bases (ddNTPs), que
carecen de OH en la posición 3' pero si presentan el
fosfato en 5',y sirven de sustrato de la DNApolimerasa
I para unirse a la cadena de DNA que esta siendo
sintetizada; pero dado que el análogo es incapaz de
formar un enlace fosfodiester con dNTP normal, la
síntesis del DNA se detiene cuando se incorpora un
ddNTP, pero como además de los ddNTPs la
reacción se incuba con los 4 dNTPs normales la
interrupción de la sintesis del DNA ocurre al azar.
■ El procedimiento consiste en preparar 4 alicuotas de
la cadena de DNA a secuenciar marcado con P32 en
uno de sus extremos; a los cuales se adiciona DNA
polimerasa I, 4dNTPs y 1 ddNTP.

■ Los fragmentos resultantes de la síntesis de las nuevas

cadenas se separan por tamaños en electroforesis en
gel de poliacrilamida y por auto radiografía se lee
directamente las bandas de secuenciamiento de DNA.
 SECUENCIACIÓN DEL DNA

- Método antiguo

- Nucleótidos marcados con 32

P

- 4 tubos de reacción
(1 para cada ddNTP)

- Lectura: electroforesis
y autorradiografía
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
EMPLEANDO EL METODO
ENZIMÁTICO
■ Es una alternativa al método de Sanger.
Consiste en marcar el oligo cebador o los
terminadores con un compuesto fluorescente y
activar la reacción de secuencia. Los productos
de la reacción se detectan directamente durante
la electroforésis al pasar por delante de un láser
que al excitar los fluoróforos permite detectar la
fluorescencia emitida.
 Secuenciación empleando terminadores
fluorescentes

■ Se realiza una única reacción de secuencia en

presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de
ellos marcados con una sonda fluorescente
distinta.
■ SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
o Secuenciadores automáticos capilares
o Secuenciación automática en geles
desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida
 SECUENCIACIÓN DEL DNA
- Secuenciador automático (detección por fluorescencia)
- Usa 4 ddNTPs unidos a una molécula fluorescente (de diferente color para cada uno)
- Una única reacción
- Lectura: electroforesis en gel capilar, láser + detector fluorescencia (automatizado)

→
 Secuenciación de DNA (automática en
gel)

a) Reacción de b) Análisis de la
secuenciación reacción
Secuenciación de DNA (automática en
capilar)

tio
za
ali
tur
na
de
n
■ SECUENCIACION DE DNA
Secuenciador
automatico
 MICROARRAYS DE DNA
* Permiten comparar patrones de expresión entre dos estados celulares
(p.ej. normal-patológico, entre tipos celulares, entre diferentes fases
del desarrollo, en respuesta a un estímulo…)

Microarray o microchip:
Superficie con
diferentes
secuencias conocidas
de DNA
inmovilizadas (cada
punto se corresponde
con un determinado
gen)
MICROARRAYS DE DNA
Microarrays de DNA
 PCR
Introducción:

* Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa)

* Amplificación in vitro de secuencias de DNA de hasta 10 kb. A partir de

una copia se pueden obtener millones en pocas horas.

* Es necesario conocer la secuencia de las regiones colindantes al fragmento

de DNA que se pretende amplificar.

Aplicaciones:

* Clínicas: - diagnóstico de enfermedades infecciosas y parasitarias:

detección de bacterias, virus y parásitos (p. ej. Leishmania,
tuberculosis, VIH…)
- diagnóstico de cáncer (mutaciones en genes ras , detección
de leucemias causadas por reorganización de cromosomas)

* Medicina forense y legal: parentescos biológicos, esclarecimiento de

crímenes…

* Clonaje de DNA y mutagénesis dirigida

 TAQ-POLIMERASA
1976: Thermus aquaticus → 1988: polymerase chain reaction (PCR)

Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase.
Science. 1988, 239(4839):487-91

Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC.

(Taq polimerasa sólo 10% activ. a 37 ºC)

Muy utilizadas en reacciones de PCR

y secuenciación de DNA
 PCR
* Elementos necesarios para la PCR (mezcla de
reacción):
- DNA que queremos amplificar (DNA molde)
- 2 oligonucleótidos (~20 nucleótidos) que
hibriden en regiones flanqueantes al fragmento
de DNA a amplificarprimers
( , cebadores o
iniciadores)
- DNA polimerasa termoestable
- Nucleótidos
(dNTPs)
- Cofactor:
- MgCl2
Tampón de
PCR
* Termociclador → Repetir ciclos (unos 30)
de:

1. Desnaturalización → 94 ºC
2. Annealing → 50-60 ºC
3. Elongación → 72 ºC
 La temperatura de hibridación:
■ La temperatura de hibridación elegida para la PCR es
genralmente igual ó superior en 2 à 3°C a la
temperatura de fusión del oligonucleótido ( Tm ó
melting temperature). Una manera calcular ésta
temperatura es la siguiente:
■ Tm = 2°C x (número de bases A, T) + 4°C x (número
de bases G, C)
■ eJ : oligo CTC.AGA.ACC.ACC.GAG.CCC

■ Tm = 4°C x 12 G,C + 2°C x 6 A,T = 48 + 12 = 60°C

Polymerase chain reaction (PCR)

EL PRODUCTO FORMADO A PARTIR DE LA PCR SE PUEDE LLAMAR

AMPLICON. ES ESPECIFICO Y SOLO DEBE VERSE UNA BANDA POR
AMPLIFICACION CON PRIMERS ESPECIFICOS.
Polymerase chain reaction (PCR)
CONCEPTOS BASICOS:

■ ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO DE

AMPLIFICACION

■ EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION EN

FUNCION DEL NUMERO DE CICLOS

■ FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA

POLIMERASA DURANTE LA COPIA

■ SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE NECESITA

PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE COPIAS
Polymerase chain reaction (PCR)
Cinética de una reacción de
PCR

Ct. (Cycle Thereshold). Primer ciclo

donde se detecta la señal procedente
del proceso de amplificación

Higuchi et.al.
(1992).
 FILIACION
VARIABILIDAD GENETICA DE LA ESPECIE HUMANA

POLIMORFISMO GENETICO EN LA POBLACION

LOS POLIMORFISMOS SON DIFERENTES FORMAS DEL MISMO ALELO

EN LA POBLACION

LA FRECUENCIA DE LOS ALELOS RAROS DEBEN AL MENOS SER DEL

0.01 PARA SER CONSIDERADAS POLIMORFISMOS Y NO UNA
MUTACION RECURRENTE

LOS ALELOS DEL GRUPO DE SANGRE ABO SON EJEMPLOS

GENETICOS DE POLIMORFISMO
 FILIACION
EL TERMINO POLIMORFISMO HA SIDO DEFINIDO POR VOGEL

EN 1986

COMO EL RASGO MENDELIANO QUE EXISTE EN LA

POBLACION EN POR LO MENOS DOS FENOTIPOS,

NINGUNO DE LOS CUALES OCURRE CON UNA FRECUENCIA

MENOR AL 1%

SE HEREDA COMO UN RASGO MENDELIANO

 FILIACION
1 INDIVIDUO: 2 ALELOS POR GEN

POBLACION: HAY POLIMORFISMO PARA LOS ALELOS

EN LA POBLACION LOS INDIVIUOS PUEDEN PRESENTAR

DIFERENTES POLIMORFISMO QUE DAN LUGAR A DIFERENTES
FENOTIPOS

EN LA POBLACION EXISTE UN ELEVADO NUMERO DE GENES QUE

PRESENTAN POLIMORFISMO = QUE TIENEN GRAN NUMERO DE
DISTINTOS ALELOS = QUE TIENEN ALELOS CON DISTINTA
SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS
 FILIACION

EL GENOMA HUMANO CONTIENE 3,2 x 109 PARES DE BASES (ADN)

EL 10% REPRESENTA UN TOTAL DE APROXIMADAMENTE 70.000
GENES

EL RESTO DEL ADN SON SECUENCIAS NO GENICAS QUE:

MANTIENEN LA ESCTRUCTURA DEL ADN,
SON REGULATORIAS (PERMITEN LA TRANSCRIPCION),
SON SECUENCIAS REPETIDAS
 FILIACION

SECUENCIAS REPETIDAS

ALGUNAS DE ELLAS SON REPETICIONES DE 2 NUCLEOTIDOS:

(CA)n --- (GT)n

(CT)n --- (GA)n

SE LLAMAN MICROSATELITES DE DINUCLEOTIDOS

ELLAS PRESENTAN POLIMORFISMO PARA n EN DIFERENTES

INDIVIDUOS,
PUEDEN SER UTILIZADAS COMO MARCADORES GENETICOS
 FILIACION
ESTUDIOS DE FILIACION

SE ANALIZA EL PATRON DE 4 A 5 MARCADORES

MICROSATELITES DINUCLEOTIDOS POR INDIVIDUO

SE UTILIZA UNA TECNICA QUE PERMITE VISUALIZAR EL

SEGMENTO DE ADN QUE TIENE ESTOS MARCADORES

PARA EL ESTUDIO DE PATERNIDAD SE DEBE TOMAR LA MUESTRA DE
LA MADRE, HIJO Y POSIBLE PADRE

SE REALIZA LA TECNICA DE PCR PARA EL LOCUS D1S80 (marcador

microsatélite Dinucleotido del cromosoma 1 Satelite No 80)

CROMOSOMA 1 -------→→→→→→→---------- 7 REPETICIONES

PCR PARA EL MARCADOR
→→→→→→→
→→→→→→→
→→→→→→→

CROMOSOMA 1 ---------------→→→---------------- 3 REPETICIONES

PCR PARA EL MARCADOR
→→→
→→→
→→→

CADA UNO ES UN ALELO DIFERENTE ENTRE INDIVIDUOS

 FILIACION
LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS PARA EL LOCUS D1S80 VAN DE 375
PARES DE BASE A 850 PARES DE BASES.
ESTA DIFERENCIA DE TAMAÑO SE PUEDE VER EN LA
ELECTROFORESIS Y ASIGNAR LOS ALELOS PARA CADA INDIVIDUO
DIRECTAMENTE

EL TRABAJO SE REALIZA EN DOS DIAS:

DIA 1: SE OBTIENEN LAS MUESTRAS Y SE REALIZA LA TECNICA PCR

DIA 2: SE REALIZA LA ELECTROFORESIS Y SE VISUALIZA EL

RESULTADO

SE VISUALIZA POR
ELECTROFORESIS
FILIACION
 TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

ADN / ARN

CON AMPLIFICACIÓN / SIN AMPLIFICACIÓN

DIAGNÓSTICO clínico

IDENTIFICACIÓN bacteriana

ESTUDIOS DE RESISTENCIAS

FINES EPIDEMIOLÓGICOS
INDICACIONES DE LOS MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR EN EL

DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS

CONFIRMA M. TUBERCULOSIS EN MUESTRAS BAAR POSITIVAS

DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN MUESTRAS RESPIRATORIAS BAAR NEGATIVAS

DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE CASOS DIFÍCILES

( MENINGITIS, - TB DISEMINADA EN PACIENTES CON SIDA)

MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR EN LA IDENTIFICACIÓN DE LAS

MICOBACTERIAS

PCR : IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE MYCOBACTERIUM

por amplificación

de FRAGMENTOS DE ADN CONSTANTES

Y ESPECÍFICOS DE ESPECIE

EJEMPLOS: Frag. IS6110 específico del complejo M. tuberculosis.

RD1.RD2 Y ETDR Específicos de M. BCG

De esta manera

combinando una PCR para los diferentes fragmentos

 IS 6110
M 1 2 3 4 M

600
500
400
300

200

100
 RD1

Útil para diferenciar MB-BCG de MTBC

M 1 2 3 4 5 6 M