Cuantificación por

espectrofotometría
derivada

Néstor Gutiérrez
Oscar Huenchuan
Profesora: Dra. Sandra Orellana
Licenciatura en Ciencias Químicas, QUIM 233
04-04-2018
Introducción

En la industria acuícola en chile existe uso de varios antibióticos, los cuales matan o inhiben
el crecimiento de otros microorganismos y son utilizados para el tratamiento o prevención de
enfermedades, los cuales están ligados a la necesidad de prevenir y controlar la incidencia de
patógenos que afectan los sistemas de cultivo, ya que tiene implicaciones económicas para la
industria acuícola. Los antibióticos utilizados en esta actividad practica fueron oxitetraciclina,
flumequina y ácido oxolínico, siendo el primero más utilizado en la industria acuícola, mientras
que los dos últimos presentan un descenso en su consumo para prevenir la posible selección de
resistencia en microorganismos [1].
La flumequina (figura 1a) es un antibiótico utilizado para tratar infecciones bacteria,
pertenece al grupo de las fluoroquinolonas, los cuales poseen un átomo de flúor en su estructura
permitiendo ampliar el espectro de acción hacia bacterias Gram positivas, además de mejorar la
penetración a las células bacterianas a diferencia de las quinolonas como el ácido oxolínico (figura
1b), el cual no posee este átomo de flúor y actúan solo sobre bacterias Gram negativas [1,2]. La
Oxitetraciclina (figura 1c), al contrario de los otros antibióticos corresponde al grupo de las
tetraciclinas y es un antibiótico de amplio espectro de acción utilizado en el tratamiento de
infecciones como rickettsias y flavobacteriosis [1].

a b c

Figura 1. Estructura química de a) flumequina, b) ácido oxolínico y c) oxitetraciclina.

En este practico implementamos un método de cuantificación mediante la técnica de

espectrofotometría derivada, que soluciona el problema cuando diferentes analitos absorben en
zonas cercanas, como es el caso de estos antibióticos que hace difícil la cuantificación por
espectrofotometría clásica. En esta técnica se mantienen todas las leyes de la espectrofotometría
clásica, por ejemplo, la dependencia del valor derivado con la concentración de analito y la ley de
aditividades. La diferenciación consiste en derivar la expresión de Lambert-Beer, con respecto a
(lamda) [3].

𝑛
𝑑𝑛 𝐴 𝑑𝑛 𝜀
𝐷 = 𝑛 = 𝑛 𝑐𝑏
𝑑𝜆 𝑑𝜆
Materiales y Métodos

Materiales Reactivos

1 Matraz aforado de 25 mL Flumequina

5 Matraz aforado de 10 mL Ácido Oxilinico
1 Vaso precipitado de 50 mL Oxitetraciclina
1 Micropipeta de 1000 µL
1 Espectrofotómetro Uv-Vis
1 Balanza analítica
2 Celda de cuarzo de 1 cm

Procedimiento Experimental:

Se preparo en un matraz de 25 mL tres disoluciones patrón de flumequina, ácido oxolínico

y oxitetraciclina a 1x10-3 M, utilizando acetonitrilo como disolvente (en la tabla 1 se presenta la
masa y molaridad para cada antibiótico), a partir de estos, se elaboró una curva de calibración para
cada antibiótico de 2x10-5, 4x10-5, 6x10-5, 8x10-5 y 10x10-5 M en matraces de 10 mL a partir
de las alícuotas presentes en la tabla 2. Posteriormente, se midió el espectro de absorbancia para
cada antibiótico en un rango de 190-450 nm.

Tabla 1. Masa y Concentración de las soluciones patrón.

Masa (g) Peso Molecular (g/mol) Concentración (mol/L)

Flumequina 0,0108 261,25 0,0017

Ácido oxolínico 0,0071 261,2 0,001

Oxitetraciclina 0.0144 460,439 0.00115

Tabla 2. Preparación y concentración de la curva de calibración para cada antibiótico.

Antibiótico Alícuota (mL) Concentración (mol/L)

Flumequina 0,1200 2,0x10-5

Flumequina 0,2400 4,0x10-5
Flumequina 0,3600 6,1x10-5
Flumequina 0,4800 8,2x10-5
Flumequina 0,6100 1,0x10-4
 Ácido oxolínico 0.0368 1,99x10-06
Ácido oxolínico 0.0735 3,9x10-06
Ácido oxolínico 0.1103 6,0x10-06
Ácido oxolínico 0.1471 7,9x10-06
Ácido oxolínico 0.1838 9,9x10-06
Oxitetraciclina 0.1818 2.0x10-5
Oxitetraciclina 0.3636 4.0x10-5
Oxitetraciclina 0.5450 6.0x10-5
Oxitetraciclina 0.7270 8.0x10-5
Oxitetraciclina 0.9090 10x10-5

Resultados y Discusión
En la Figura 2, observamos el espectro Uv-Visble tomado a cada una de las disoluciones
de los antibióticos (tabla 2), por lo tanto, en el caso de tener una muestra problema con estos
tres antibióticos se observaría un espectro donde las bandas de absorción están solapadas, ya
que absorben a longitudes de onda cercana. Entonces, del espectro sería imposible cuantificar
cualquiera de las tres especies de fármaco involucrada en esta mezcla, debido que para poder
cuantificar las concentraciones de cada antibiótico es necesario una curva de calibración en la
que ningún otro fármaco absorba a una misma longitud de onda.

Figura 2. Espectro UV-Vis de Flumequina (Rojo), Ácido oxolínico (Negro) y oxitetraciclina

(Verde) a distintas concentraciones.
 Debido a esta problemática es necesario la utilización del software UVProbe, con el cual
podemos calcular las derivadas de los espectros (Figura 2) respecto a la longitud de onda,
permitiendo obtener así las derivadas de primer, segundo, tercer y cuarto orden. Estas derivadas
nos entregan detalles espectrales, que no son observados en el espectro normal, permitiendo
realizar medidas para determinar la concentración de los antibióticos, por lo que al calcular la
derivada de primer orden (Figura 3), podemos cuantificar por medio del método gráfico y el
método zero crossing.

Figura 3. Primera derivada del espectro UV-Vis de Flumequina (Rojo), Ácido oxolínico (Negro)
y oxitetraciclina (Verde) a distintas concentraciones.

Entonces para cuantificar por medio del método zero crossing [3] se debe buscar las zonas
en que una especie absorba a una determinada longitud de onda y donde la otra especie presente
un valor igual a cero en la misma longitud de onda, entonces en una muestra problema esta longitud
de onda podría atribuirse solo al fármaco que está absorbiendo. Por otro lado, para cuantificar por
el método gráfico [3], se debe buscar un antibiótico que presente en un rango de longitud de onda
una señal, pero que el resto no presente una señal.
Dicho esto, en el espectro de la primera derivada (Figura 3) se puede observar que en el
rango de 360-424 nm, solo está absorbiendo la oxitetraciclina, por lo que es posible cuantificar
este antibiótico en ese rango de longitud de onda, como se puede observar en el espectro sin derivar
(Figura 2).
De la primera derivada también se encontró un zero crossing (Figura 3) a una longitud de
onda de 299 nm donde se hacen cero la oxitetraciclina y el ácido oxolínico, entonces podemos
cuantificar flumequina, para ver si este zero crossing es válido, se realizó una curva de calibración
con la concentración de flumequina vs las unidades de derivada (Gráfico 1), obteniendo un r2:
0,9984 el cual nos indica que es válido para poder determinar flumequina.
 40

y = 362686x - 0.3558
R² = 0.9984

Unidades de Derivada
30

20

10

0
0.0E+00 2.9E-05 5.8E-05 8.6E-05 1.2E-04
Concentración Molar Flumequina

Gráfico 1. Curva de calibración para cuantificar flumequina en zero crossing a una longitud de
onda de 299 nm.

Para la cuantificación del ácido oxolínico, en el espectro de la primera derivada (Figura 3),
no se logró encontrar un zero crossing, donde no absorbiera los otros dos antibióticos, Debido a la
baja intensidad de las señales del ácido oxolínico producto de su baja concentración, por lo tanto,
solo es posible la cuantificación de este antibiótico en presencia de un grado de flumequina como
se observa en la figura 3, a una longitud de onda de 267 nm, la cual al realizar la curva de
calibración con la concentración de ácido oxolínico vs la unidad de derivada (Gráfico 2)
obteniendo un r2 de 0,9895, lo que nos indica que es posible cuantificar este antibiótico a esa
longitud de onda.
16.000
y = 1E+06x + 0.4341
R² = 0.9876
Unidades de Derivada

12.000

8.000

4.000

0.000
0.00E+00 2.85E-06 5.70E-06 8.55E-06 1.14E-05
Concentración Molar

Gráfico 2. Curva de calibración para cuantificar ácido oxolínico en presencia de flumequina a una
longitud de onda de 267 nm.
 Es por ello es que para solucionar esto, se realizó una segunda derivada que se puede
observar en la figura 5. Sin embargo, las señales de ruido y solapamiento de estas últimas hacen
más difícil la tarea de cuantificación, asimismo, tampoco es posible diferenciar una señal en donde
se pueda determinar la concentración del ácido oxolínico sin la influencia de los otros dos
antibióticos.

Figura 5. Segunda derivada del espectro UV-Vis de Flumequina (Rojo), Ácido oxolínico (Negro)
y oxitetraciclina (Verde) a distintas concentraciones.

Se omitieron las derivadas de tercer y cuarto orden por la alta relación señal-ruido, debido
a que dificulta de manera significativa la cuantificación de las muestras.
Para la cuantificación de las tres especies se elaboró una curva de calibración en las
longitudes de onda donde se encontraban los puntos cero crossing. La expresión matemática para
determinar la concentración del antibiótico está definida como una ecuación de la recta.

𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 ; en la que:

𝑦 = 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎; 𝑚 = 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒; 𝑥 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑑𝑒𝑙𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜; 𝑏 = 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜

Conclusión

La espectrofotometría derivada nos permitió cuantificar flumequina, ácido oxolínico a

partir de los zero crossing obtenidos por la primera derivada y la oxitetraciclina se pudo cuantificar
por el método gráfico. Esto porque la técnica de espectrofotometría derivada de primer orden es
una buena metodología para cuantificar analitos que absorben y solapan a longitudes de onda
cercanas, como ocurre con los antibióticos flumequina y ácido oxolínico, que al ser similares
estructuralmente absorben en un rango de longitud de onda similar, razón por la cual se pudo
determinar oxitetraciclina mediante el método gráfico, cabe mencionar que también es aplicable
cuando estos analitos se encuentran en las mismas matrices a analizar. Sin embargo, no fue posible
utilizar los espectros derivados de segundo orden para esta metodología, ya que no se encontraron
zero crossing en que fuera posible cuantificar ácido oxolínico, sin que la presencia de flumequina
y la oxitetraciclina, por lo tanto, se tomó las derivadas de primer orden para cuantificar ácido
oxolínico en presencia de flumequina.

Bibliografía

[1] Barattini, P. (2017) Capitulo 8: Antibióticos en acuicultura. Pp 61-68.

http://www2.inia.cl/medios/biblioteca/boletines/NR40081.pdf
[2] Escobar, C. (2013). Determinación del período de resguardo de flumequina en huevos
obtenidos de gallinas de postura, Tesis pregrado. Universidad de Chile, Santiago, Chile. Pp 7-9.
[3] Toral, M. Inés, Orellana, Sandra, Saldías, Marta, & Soto, César. (2009). Estrategias en el
desarrollo de métodos analíticos para la determinación simultánea de compuestos orgánicos por
espectrofotometría derivada. Química Nova, 32(1), 257-262.