Efecto del ácido salicílico y el jasmonato de metilo en la producción de compuestos

fenólicos en cultivos de suspensión de células vegetales de Thevetia peruviana

El objetivo era mejorar la producción de los compuestos fenólicos en cultivos en suspensión de células vegetales de T.
peruvianaa escala de matraz de agitación. Se estudiaron los efectos del ácido salicílico (SA), el metil-jasmonato (MeJA) y
la combinación de ambos (SA / MeJA). La concentración del inductor, el tiempo de obtención y el tiempo de cosecha de
las células se optimizaron. El contenido de compuesto fenólico (PCC), el contenido de flavonoides (FC) y la actividad
antioxidante (AA) se determinaron mediante el método de folin-ciocalteu, el método de formación de complejos de
flavonoide-aluminio y el ensayo ABTS, respectivamente. Las diferencias entre los perfiles de metabolitos intracelulares
debido a los tratamientos mencionados se analizaron mediante cromatografía de capa fina y cromatografía líquida de
alta resolución. Los PCC, FC y AA más altos se obtuvieron bajo los siguientes tratamientos: 3 μM MeJA> 3 μM MeJA / 300
μM SA> 300 μM SA> control, cuando se obtuvo el 4to.día y cosechado 96 h después de la provocación. Se demostró que
la exposición a MeJA 3 μM aumenta 1.49 veces de PCC, 1.66 veces de AA y 2.55 veces de FC en comparación con el
cultivo de control.

1 . Introducción

Thevetia peruviana(Pers.) K. Schum es un arbusto ornamental que pertenece al orden Gentianales, familia Apocynaceae
. Se distribuye ampliamente en las regiones tropicales y subtropicales de América Central y del Sur, Asia y África [ 1]. Esta
planta es farmacológicamente reconocida por contener glucósidos cardiotónicoscomo el peruvosido y la vetina [2,3 ],
especialmente concentrada en sus semillas. Estos metabolitos tienen un efecto inotrópico positivo , como en la digoxina
[1,4]. Por lo tanto, el consumo no regulado de las frutas ha sido reportado como tóxico [5 ] T. peruviana también
produce compuestos fenólicos con uso potencial como antimicrobianos [ 6 , 7 ] y antineoplásicos [ 8 , 9 ]. Además, se
han identificado flavonoides en los frutos y las hojas de esta planta, y son capaces de inhibir la enzima integrasa y la
transcriptasa inversa asociada a la ADN polimerasa del virus de inmunodeficiencia humana VIH-1 [ 10 ]

Los compuestos fenólicos (PC) son uno de los metabolitos secundarios más
importantes en las plantas. Estos compuestos están relacionados con los mecanismos de
adaptación ambiental y estrés bajo condiciones de crecimiento in vivo [ 11 ]. Sin embargo, la
calidad y cantidad de PC y otros metabolitos secundarios producidos en cultivos de campo
es extremadamente variable y depende de las condiciones bióticas y abióticas
[ 12 ]. El cultivo in vitro de células vegetales es una alternativa viable para aumentar la tasa
de crecimiento de la biomasa y la estabilidad durante la producción continua de PC y otros
metabolitos. Además, in vitroEl cultivo permite la manipulación de variables de
crecimiento, así como el uso de precursores y / o inductores. Estas variables pueden
cambiar las vías biosintéticas de los compuestos, optimizando su producción [ 13 ].
Un inductor puede definirse como un compuesto (natural o sintético) que inicia o mejora
la biosíntesis de metabolitos específicos cuando se introduce en pequeñas concentraciones
en un sistema de células vivas [ 14 , 15 ]. Los jasmonates (JA) y el ácido salicílico (SA) son
moléculas de señalización que responden al estrés biótico y abiótico de las plantas. Estas
moléculas pueden usarse para inducir reacciones catalíticas por enzimas específicas
involucradas en la biosíntesis de PC [ 16 ]. JA y SA se han utilizado en la estimulación de la
producción de flavonoides y polifenoles en la suspensión celular , callos y
cultivos de tejidos de diversas familias de plantas [ [17] , [18] ,[19] , [20] , [21] ]. Un
estudio reciente publicado por Rincón et al. [ 22 ] informaron un aumento en la
producción de PC a partir del cultivo de callos de T. peruviana provocado con una
combinación de 100 μM de JA y 10 μM de ácido abscísico . Del mismo modo, MeJA, un
derivado del ácido jasmónico, también se ha utilizado para provocar el cultivo en
suspensión celular de T. peruviana , lo que resulta en una mayor producción de peruvosida,
un glucósido cardiotónico [ 23 ].
En este estudio, se evaluó el efecto de SA y MeJA en la producción de PC en un cultivo en suspensión de
células vegetales de T. peruviana a escala de matraz de agitación . Se estableció la concentración y el tiempo de
adición de los inductores que mejoran la producción de PC, así como el tiempo de cultivo de las células después
de la obtención.

2 . materiales y métodos
2.1 . Reactivos y materiales

El reactivo Folin-Ciocalteu (2.0 N), ácido salicílico , metil jasmonato (95%) y quercetina se compraron de
Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO). Se compraron placas de ácido gálico , ácido 2,2′-azino-bis (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfónico, ABTS) y vidrio de sílice HPTLC (High Performance TLC) 60 F 254 de Merck
(Darmstadt, Alemania).

2.2 . Cultura del callo

Se obtuvieron callos de pulpa de fruta de plantas de T. peruviana cultivadas en la Universidad Nacional de

Colombia, Medellín (6 ° 15′44 ″ N 75 ° 34′37 ″ O). Las frutas fueron desinfectadas siguiendo el protocolo
descrito previamente por Arias et al. [ 23 ] Brevemente, las frutas se sumergieron en etanol (70%) durante 5
min. Luego transfiéralo a una solución de NaClO al 10% (v / v) durante 5 min. En el medio y después de los
desinfectantes, las frutas se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente, los explantes se
transfirieron asépticamente a medio sólido (SH) Schenk e Hildebrandt suplementado con 2 mg / L de 2,4-D, 0,5
mg / L de cinetina, 7 g / L de agar, 30 g / L de sacarosa y 1 g / L mioinositol (pH 5.8), esterilizado a 20 psi
durante 15 min. Los cultivos se mantuvieron en el fotoperíodo.(12 h de luz / 12 h de oscuridad) a 25 ° C. Se
realizaron subcultivos cada 3 semanas hasta obtener callos friables.

2.3 . Cultivo en suspensión celular

Se transfirieron diez gramos de callos friables frescos (g FW) a 100 ml de medio estéril líquido SH
suplementado con 2 mg / L de 2,4-D, 0,5 mg / L de cinetina, 30 g / L de sacarosa y 1 g / L de mioinositol ( pH
5,8), en matraces de 250 ml. Los cultivos en suspensión celular se mantuvieron en un agitador orbital a 110 rpm
(New Brunswick ™ Innova® 2300), fotoperíodo natural y 25 ° C. Se realizaron subcultivos cada 2 semanas.

2.4 . Cinética de crecimiento

La cinética de crecimiento se realizó en matraces de 250 ml, utilizando un inóculo (cultivo de suspensión
celular) de 6 días desde el último subcultivo, y una concentración inicial de 2-3 g de peso seco por litro (DW /
L) en 100 ml de líquido SH suplementado medio estéril Las otras condiciones de los cultivos se mantuvieron
como se describió previamente. El crecimiento celular se determinó midiendo el DW de biomasa cada 2 días
durante 18 días, por duplicado. El contenido de cada matraz se filtró utilizando un sistema de vacío y papel de
filtro cuantitativo. La biomasa se enjuagó tres veces con agua destilada y se secó en un horno de convección a
60 ° C durante 48 h [ 24]. Los resultados se expresaron como g DW / L.

2.5 . Método de tratamiento inductor

SA y MeJA se prepararon en una solución acuosa de etanol al 50% (v / v) y se esterilizaron por filtración a
través de un filtro Millipore de 0,45 μm (Minisart®, Sartorius , Alemania). Los experimentos se realizaron con
suspensiones celulares de 6 días a una concentración de 2-3 g DW / L en matraces de 250 ml con 100 ml de
medio estéril líquido SH, en las mismas condiciones descritas anteriormente. Un experimento factorial basado
en un diseño completamente al azar.se usó para estudiar el efecto de las condiciones de obtención en la
producción de PC. Los factores evaluados fueron: concentración del inductor, tiempo de obtención y tiempo de
recolección de las células después de la obtención (ver archivo complementario). Todos los experimentos se
llevaron a cabo por triplicado utilizando un método de muestreo destructivo, que consistió en procesar la
muestra completa en cada momento de cosecha. Se usó solución de etanol al 50% (v / v) como control en estos
experimentos. Se encontró un efecto inductor no significativo cuando se usó etanol al 50% en comparación con
un cultivo sin etanol (datos no mostrados).

2.5.1 . Efecto de la concentración del inductor en la producción de PC

La concentración de cada inductor se evaluó inicialmente. MeJA se utilizó en concentraciones de 0, 1, 3 y 5

μM; mientras que SA se usó en concentraciones de 0, 100, 300 y 600 μM. Los rangos de concentración del
inductor utilizados en estos experimentos se eligieron mediante la revisión de estudios publicados [ 17 , 18 ] y
mediante un examen previo realizado en nuestro laboratorio. Se agregaron inductores durante la fase
de crecimiento exponencial (día 8). Las células se cosecharon 24 hy 96 h después de la adición del inductor.

2.5.2 . Efecto del tiempo de obtención en la producción de PC

Se agregaron inductores en tres momentos diferentes: al comienzo del cultivo (día 0) y durante la fase
exponencial (días 4 y 8), utilizando la mejor concentración de cada inductor, como se estableció
previamente. Las células se cosecharon 24 hy 96 h después de la adición del inductor.

2.5.3 . Efecto del tiempo de cosecha en la producción de PC

Se determinó el mejor tiempo de cultivo (24–48 - 72–96 y 120 h) después de la adición del inductor, utilizando
la concentración y el tiempo de activación establecidos previamente. Además, se midieron el contenido
de flavonoides (FC) y la actividad antioxidante (AA) para cada tiempo de cultivo.

2.6 . métodos analíticos

2.6.1 . Metabolitos intracelulares

La biomasa se secó en un horno de convección a 60 ° C durante 48 h y se pulverizó con mortero y una mano de
mortero. El polvo (0,3 g) se extrajo con 15 ml de una solución acuosa de etanol al 50% (v / v), en un baño
ultrasónico (40 kHz) a 30 ° C durante 30 min, para obtener los metabolitos intracelulares. Los extractos se
centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min; El sobrenadante se recogió y se almacenó en tubos de polipropileno a
- 4 ° C, protegido de la luz. Los extractos se usaron para la determinación cuantitativa de fenoles y
flavonoides. También se preparó un extracto de pulpa de fruta seca y en polvo de T. peruviana para determinar
los metabolitos presentes en el explante inicial, siguiendo la metodología prescrita para la extracción
intracelular de T. peruviana biomasa

2.6.2 . Metabolitos extracelulares

Los metabolitos extracelulares se determinaron directamente del medio de cultivo celular sin ningún paso de
extracción previo.

2.6.3 . Contenido de compuestos fenólicos (PCC)

Estos compuestos se determinaron con el método folin-ciocalteu, utilizando ácido gálico como estándar
[ 25 ]. Se mezcló un volumen de 2 ml de muestras (medio de cultivo o extractos intracelulares) con 2,5 ml del
reactivo folin-ciocalteu al 10% (v / v), en diferentes tubos de ensayo. Después de 2 min, 2 ml de 7,5% (p / v)
Na 2 CO 3 se añadieron; seguido de incubación durante 10 minutos a 50 ° C. La absorbancia de cada reacción se
midió a una longitud de onda de 765 nm en un espectrofotómetro Genesys 20 Spectronic (Thermo Fisher
Scientific®). El equipo se ajustó a absorbancia cero usando el siguiente blanco: 2 ml de agua más 2,5 ml de
reactivo de folin-ciocalteu al 10% y 2 ml de Na 2 CO 3 al 7,5%. Se preparó una calibración estándar usando ácido
gálico (80 - 40 - 20 - 10 y 5 μg / ml) y se calculó el PCC en cada muestra y se expresó
en miligramos equivalente a ácido gálico por gramo de peso de biomasa seca, mg GAE / g DW .

2.6.4 . Contenido de flavonoides (FC)

Los compuestos flavonoides se determinaron por el método de complejación flavonoide-aluminio (AlCl 3 )

[ 26 ], utilizando quercetina como estándar. Brevemente, se añadieron un volumen de 1 ml de las muestras en
diferentes tubos de ensayo y 0,3 ml de 5% (p / v) de NaNO 2 se añadió a cada muestra, seguido de 5 min de
incubación. Luego, se añadieron 0,5 ml de AlCl 3 al 2% (p / v) y la muestra se agitó suavemente y se neutralizó 6
minutos más tarde con 0,5 ml de NaOH 1 N. Después de 10 minutos, se leyó la absorbancia a una longitud de
onda de 425 nm. Muestras sin AlCl 3fueron utilizados como en blanco. La FC se calculó usando una calibración
estándar de solución alcohólica de quercetina (200 - 100 - 25 - 12.5 y 6.25 μg / mL) y se expresó en miligramos
de quercentina equivalente por gramo de peso de biomasa seca, mg QE / g DW.

2.6.5 . Actividad antioxidante (AA)

La actividad antioxidante se determinó usando el catión radical ABTS ensayo de decoloración

de [ 27 ]. Anteriormente, se preparó una solución acuosa de ABTS 7 mM y se obtuvo el catión radical ABTS
mezclando volúmenes iguales de solución ABTS 7 mM y persulfato de potasio 2,45 mM . La mezcla se incubó
en la oscuridad durante 16 ha 24 ° C. La solución concentrada de ABTS + se diluyó en agua destilada hasta que
se logró una absorbancia de 0,70 ± 0,1 a una longitud de onda de 734 nm.
Se mezcló un volumen de 100 μL de cada muestra con 3 ml de la solución ABTS + . La mezcla se incubó
durante 10 minutos en la oscuridad y luego se midió la absorbancia a 734 nm, usando metanol como blanco. El
AA se calculó utilizando una calibración estándar de solución metanólica Trolox (150-75-37,5-18,8 y 9,4 μg /
ml) y se expresó como miligramos equivalentes a Trolox por gramo de peso de biomasa seca (mg ET / g DW).

2.7 . Cromatografía de capa delgada (TLC)

Se realizó un análisis preliminar de la PC intracelular en las suspensiones celulares antes y después de los
tratamientos con los inductores por TLC. Se concentró un volumen de 10 ml de cada extracto intracelular en
un evaporador rotativo (IKA® HB10) a presión reducida (145 mbar), a 40 ° C y 110 rpm. Los extractos
concentrados se llevaron a 2 ml con etanol. Se aplicó un volumen de 5 μl de cada extracto concentrado en
placas de gel de sílice HPTLC 60 F 254 . Los disolventes utilizados como fases móviles fueron: butanol : ácido
acético: agua (4: 1: 5 v / v / v) y hexano : acetato de etilo : agua (20: 19: 1 v / v / v). Detección de fenólicoslos
compuestos se realizaron pulverizando reactivo de folin-Ciocalteau al 10% (v / v) en una solución acuosa de
metanol al 50% (v / v). Para la detección de flavonoides, las placas se rociaron con una solución etanólica de
AlCl 3 al10% (p / v) y se visualizaron bajo luz UV a 366 nm. Después de la tinción, las placas se fotografiaron
con el equipo ChemiDoc ™ MP System y se analizaron con el software ImageLab ™ (Bio-Rad®) y el software
de acceso libre JustQuantify (http://justquantify.eu/DefaultHD.aspx).

2.8 . HPLC-DAD

Un volumen de 2 ml de extractos intracelulares se diluyó a 10 ml en un matraz volumétrico con una solución

acuosa de etanol al 50% y luego se filtró en membranas de 0,45 μm. Los extractos diluidos se analizaron en un
equipo de HPLC Shimadzu Prominence acoplado a un detector de matriz de diodos (SPD-M20 A). Se usó una
columna de fase inversa LiChrospher® 250-4 RP-18, 5 μm (Merck SA) para la separación cromatográfica a 28
° C, utilizando un caudal de 1,5 ml min- 1 y el volumen de inyección 20 μL. La fase móvil consistió en: A (ácido
fórmico 1% en agua) y B (ácido fórmico 1% en acetonitrilo). El gradiente de elución siguiente manera: 0 min
(80% A + 20% B); 7 min (75% de A + 25% de B); 13 min (70% de A + 30% de B); 7 min (65% de A + 35% de
B); 3 min (80% A + 20% B). Para el análisis de datos, se seleccionó la longitud de onda de 280 nm. Los
tiempos de retención (t R) y se compararon los datos de absorbancia UV-vis de los picos presentes en las
muestras y los obtenidos a partir de patrones analíticos de compuestos flavonoides y fenólicos previamente
informados en T. peruviana [ 28 ]. Los estándares analíticos fueron de grado HPLC e incluyeron: ácido
clorogénico (≥95%), ácido trans-sinápico (≥99.0%), quercetina (≥95%), (±) -heperetina (≥98.0%)
y kaempferol (≥97.0% )

2.9 . análisis estadístico

Todos los datos obtenidos se analizaron con el software estadístico gratuito RStudio Versión 1.1.383. Los
resultados de PCC, FC y AA estuvieron presentes como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias
entre los tratamientos se evaluaron con un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con un nivel de
significancia de 0.05. Las comparaciones múltiples (por pares) se realizaron mediante la prueba honesta de
Tukey (HSD de Tukey) y los resultados se presentaron como intervalos de confianza al 95% (IC 95%).

3. Resultados y discusión
3.1 . Cinética de crecimiento

La fase de crecimiento exponencial del cultivo en suspensión celular de T. peruviana duró 12 días, seguida de
una fase estacionaria hasta el día 16, momento en el cual las células entran en la fase de muerte celular. La
concentración máxima observada de biomasa fue de 14.81 ± 0.32 g DW / L. Este comportamiento cinético es
comparable al informado en informes anteriores [ 23 , 24 ], lo que indica laestabilidad in vivo de estas especies
de células vegetales.

3.2 . Producción de PC en suspensiones celulares

Las PC se midieron en el medio de cultivo (compuestos extracelulares) y en la biomasa (compuestos

intracelulares) cada dos días durante 18 días. La PC extracelular aumentó en función del tiempo, alcanzando
una concentración máxima en el día 4 (8.54 ± 0.1 mg GAE / g DW), y luego disminuyó progresivamente a un
mínimo de 2.41 ± 0.04 mg GAE / g DW en el día 18 de cultivo ( Fig. 1 ) Es posible que después del día 4, los
niveles de compuestos fenólicos comenzaron a disminuir debido a la actividad enzimática extracelular . Berlin y
col. [ . 29 ] mostraron que el ácido cinámico y los derivados del ácido benzoico disminuyeron en las primeras
40 h del medio extracelular en cultivos de suspensión celular de frijol y soja, debido a las reacciones de
eliminación y la descarboxilación oxidativa
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La Fig. 1 . Curva de crecimiento y producción
de compuestos fenólicos extracelulares en cultivos de suspensión celular de T. peruviana . Los
resultados se presentan como valor de la media ± DE de dos experimentos independientes.
Por el contrario, la PC intracelular fue relativamente constante durante el crecimiento celular. La mayor
producción de estos compuestos estaba en 4 º día durante la fase exponencial (3,71 ± 0,11 mg GAE / g DW). El
contenido más bajo se encontró en los extractos de pulpa de fruta (2.47 ± 0.07 mg GAE / g DW) ( Tabla
1 ). Estos resultados demuestran que establecer el cultivo en suspensión celular de T. peruviana aumenta la
producción intracelular de PC en comparación con la fuente original de los cultivos.
Tabla 1 . Producción intracelular de compuestos fenólicos (PC), en cultivo de suspensión celular y pulpa
de fruta de T. peruviana .

Hora PC
(día) (mg GAE / g DW) *
00 2.561 ± 0.11 c
2 3.226 ± 0.48 abc
44 3.705 ± 0.11 a
66 3.382 ± 0.09 abc
8 2.651 ± 0.31 a. C.
10 3.656 ± 0.24 ab
12 3.299 ± 0.34 abc
Pulpa de fruta) 2.472 ± 0.07 c

3.3 . Efecto de la concentración del inductor en la producción de PC

La Tabla 2 muestra los efectos de la concentración de SA y MeJA en la producción de PC extracelular e

intracelular. A nivel extracelular, tanto SA como MeJA no afectaron significativamente la acumulación de PC
(p> 0.05). Por otro lado, a nivel intracelular, MeJA afectó la acumulación de PC de una manera dependiente de
la dosis. Los tratamientos con MeJA 3 μM (diferencia media: 1.226; IC 95%: 0.337–2.115) y SA 300 μM
(diferencia media: 0.748; IC 95%: 0.188–1.310) aumentaron significativamente el contenido de PC intracelular,
24 h después de la provocación . Después de 96 h, solo 3 μM de MeJA causaron una diferencia significativa en
la PC (diferencia media: 1.026; IC 95%: 0.137–1.914).
 Tabla 2 . Contenido fenólico intracelular y extracelular y acumulación de biomasa en el
cultivo en suspensión celular del crecimiento de T. peruviana con diferentes concentraciones de ácido
salicílico (SA) y metil jasmonato (MeJA).

Contenido fenólico
Elicitor Tiempo de cosecha (mg GAE / g DW) * Biomasa
(μM) (hora) (g DW / L)
Intracelular Extracelular
MeJA
00 3.250 ± 0.381 b 6.118 ± 1.586 ab 10.850 ± 1.282 ab
1 3.638 ± 0.129 ab 7.750 ± 1.142 a 8.386 ± 0.146 c
24
3 4.476 ± 0.097 a 7.697 ± 0.500 a 7.934 ± 0.150 c
55 3.257 ± 0.129 b 6.128 ± 0.975 ab 8.270 ± 1.012 c

00 3.258 ± 0.537 b 5.256 ± 0.752 ab 11.263 ± 0.499 a

1 3.920 ± 0.201 ab 3.295 ± 0.268 b 9.674 ± 1.40 abc
96
3 4.282 ± 0.051 a 4.785 ± 1.422 ab 8.742 ± 0.358 a. C.
55 3.812 ± 0.519 ab 4.755 ± 0.564 ab 8.994 ± 0.152 aC

SA
00 5.235 ± 0.408 aC 2.739 ± 0.346 a. C. 8.311 ± 0.790 b
100 4.890 ± 0.267 c 2.908 ± 0.232 a. C. 8.049 ± 0.331 b
24
300 5.983 ± 0.074 a 3.008 ± 0.532 a. C. 8.247 ± 0.282 b
600 5.613 ± 0.021 ab 2.161 ± 0.329 c 8.470 ± 0.076 b

00 5.131 ± 0.766 a. C. 4.691 ± 0.483 a 11.328 ± 0.086 a

100 4.830 ± 0.048 c 4.652 ± 1.093 a 12.073 ± 1.551 a
96
300 4.928 ± 0.239 c 3.780 ± 0.439 ab 10.925 ± 0.533 a
600 5.192 ± 0.059 a. C. 3.378 ± 0.065 abc 10.818 ± 0.257 a
Además, MeJA disminuyó significativamente la acumulación de biomasa de T. peruviana en ambos tiempos, 24
h ( valor de p = 0.0116) y 96 h después de la obtención ( valor de p = 0.0153). El efecto inhibidor de MeJA
sobre la acumulación de biomasa también se informó en cultivos de suspensión celular de Taxus [ 30 ] y fresas
[ 31 ]. Dos estudios independientes mostraron que MeJA inhibe el ciclo mitótico en las células vegetales,
deteniéndolos en la fase G1 antes de la transición a la fase S. Esto reduce la progresión del ciclo celular y, en
consecuencia, el número de células que se dividen activamente [ 30 , 32] Estos hallazgos explicarían la
reducción en el crecimiento celular que se observó en las suspensiones celulares de T. peruviana tratadas con
MeJA. En cuanto al tratamiento con SA, en nuestras condiciones experimentales, este inductor no afectó la
acumulación de biomasa en los cultivos de T. peruviana ( Tabla 2 ). Por esta razón, se implica que el
tratamiento con MeJA y / o SA no se recomienda cuando el objetivo es solo la producción de biomasa .

3.4 . Efecto del tiempo de activación en la producción intracelular de PC

 Para evaluar este parámetro, se agregaron los inductores (MeJA 3 μM y SA 300 μM) a las suspensiones
celulares al comienzo del crecimiento del cultivo (día 0) y durante la fase exponencial (día 4 y día 8). Figura
2muestra el contenido fenólico intracelular en los cultivos 24 y 96 h después de la adición del inductor. La PC
aumentó significativamente en comparación con los cultivos de control cuando se agregó SA el día 4 de
crecimiento; cuando se agregó SA al comienzo (día 0) o al final (día 8) de la fase exponencial, se produjo un
aumento no significativo de PC en comparación con el control. Por otro lado, MeJA aumentó significativamente
el contenido de PC en comparación con el control, en los tres tiempos de adición del inductor y 96 h después de
la provocación. El aumento de la acumulación de PC, después de la adición de MeJA en la fase exponencial, fue
descrita previamente por Wang et al. [ 33 ] Observaron específicamente el aumento en el contenido y la
producción de flavonoides en cultivos celulares de Hypericum perforatum .Sorprendentemente, el día 4 de
crecimiento demostró tener la mayor acumulación de PC después del tratamiento con MeJA y SA. Por lo tanto,
para producir estos metabolitos, el día 4 se toma como el momento óptimo para la adición de estos inductores a
los cultivos en suspensión celular de T. peruviana.

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Fig.2 . Efecto de los tiempos de adición de inductor sobre la producción de
compuestos fenólicos intracelulares (PC) en cultivos de suspensión celular de T. peruviana. Se
agregaron los inductores al comienzo del crecimiento del cultivo (día 0) ( Fig. 2 A) y durante la fase
exponencial (días 4 y 8) ( Fig. 2 B y C); los controles fueron cultivos celulares sin inductor. Las barras
representan las medias ± DE de tres réplicas experimentales independientes. Para cada parámetro, los
valores con letras diferentes son significativamente diferentes (p <0.05).
 3.5 . Efecto del tiempo de cultivo en la producción intracelular de PC

Este parámetro se evaluó en los cultivos tratados con MeJA 3 μM, 300 μM SA, y una combinación de ambos,
300 μM SA + 3 μM MeJA (SA / MeJA). Se agregaron inductores a los cultivos en suspensión el día 4 de
crecimiento, de acuerdo con los resultados anteriores. Además del efecto sobre la acumulación intracelular de
PCC, se evaluaron FC y AA a las 24-48-72-96 y 120 h después de la provocación ( Fig. 3 ).

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Fig.3 . Efecto del tiempo de cosecha en la producción intracelular de metabolitos en los cultivos en
suspensión celular de T. peruviana . La Fig. 3 A corresponde a los resultados de
los compuestos fenólicos -PC; Fig. 3 B al contenido de flavonoides -FC;Fig. 3 C de la actividad
antioxidante-AA en cultivo celular expuesto a MeJA 3 μM, 300 μM SA y mezcla SA / MeJA. Los datos
se presentan como media ± DE de tres réplicas experimentales independientes.
El tratamiento con SA, MeJA y SA / MeJA aumentó el biosíntesis de PC, en comparación con el control (sin
provocación) en todos los tiempos evaluados. Además, se observó una relación directa entre PCC, FC y
AA. Los niveles más altos de PCC y AA se encontraron en los tratamientos con MeJA 3 μM a las 96 h después
de la provocación (PCC = 4.47 ± 0.37 mg GAE / g DW; AA = 16.65 ± 1.43 mg TE / g DW), lo que representa
un aumento de 49.25% y 66.28% en comparación con el control, respectivamente. Además, el mayor contenido
de FC se encontró 72 h después de la estimulación con 3 μM de MeJA (FC = 6.88 ± 0.65 mg QE / g DW), lo
que representa un aumento del 105.26% en comparación con los cultivos sin tratamiento con MeJA.
Por otro lado, el efecto máximo inductor de SA se alcanzó durante las primeras horas de cultivo, logrando un
aumento de 21.41% de PCC y 36.5% de AA a las 24 h posteriores a la provocación, en comparación con el
control, mientras que FC aumentó 81.9% a 48 h post-provocación. La combinación de los inductores SA y
MeJA también aumentó la producción de estos metabolitos en comparación con el cultivo sin inductor, pero
estos niveles fueron más bajos que los obtenidos para MeJA solo y fueron más altos que aquellos con SA
solo. Estos resultados sugieren que SA y MeJA tienen diferentes mecanismos de acción sobre el cultivo en
suspensión de células vegetales de T. peruviana .
T. peruviana es una fuente importante de compuestos fenólicos y antioxidantes, especialmente en su fruto
[ 34 ]. En cultivos en suspensión celular de T. peruviana , también se ha informado de la producción de
PC. Rincón y col. [ 22 ] informaron un contenido de PC de 0.95 ± 0.01 mg GAE / g extracto seco (DE)
de callos de T. peruviana , que aumentó a 2.8 ± 0.02 mg GAE / g DE después del tratamiento con ácido
jasmónico (100 μM) más ácido abscísico (10 μM). Arias y col. [ 24 ] informó la producción de PC en
suspensión celular de T. peruvianacultivado a la luz con diferentes longitudes de onda y en la oscuridad y
encontró un contenido fenólico total entre 7.21–7.91 mg GAE / g DW en condiciones de luz y 9.46 mg GEA / g
DW en la oscuridad, a los 23 días de crecimiento. Este estudio también encontró una relación directa entre el
TPC y la capacidad antioxidante determinada por el FRAP (poder antioxidante reductor férrico)
y ensayo ABTS .

3.6 . TLC

Los extractos intracelulares obtenidos antes de la obtención mostraron 8 señales con reactivo folin-ciocalteu y
AlCl 3 / UV 366-nm, confirmando la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides, respectivamente. El
análisis de Rf en la placa rociada con AlCl 3 demostró que la señal con Rf = 0.527 aumentó su concentración a
medida que pasa el tiempo de cultivo. Por el contrario, la señal con Rf = 0.083 disminuyó con el tiempo, lo que
sugiere que algunos metabolitos se sintetizan de manera diferente a medida que las células crecen ( Fig. 4 ). La
biosíntesis diferencial de PC se ha informado previamente en Larrea divaricata Cav. cultivos en suspensión,
con metabolitos como p-cumarico, ácido ferúlicoy alcohol sináptico. Estas diferencias se atribuyeron a los
cambios en la velocidad máxima de las enzimas involucradas en la biosíntesis y la degradación de los
fenilpropanoides [ 35 ]. La expresión diferencial de genes implicados en la biosíntesis de fenilpropanoides
podría ser otra explicación de la variación en las concentraciones intracelulares de compuestos fenólicos y
flavonoides [ 36 ]. Además, hubo diferencias notorias en el perfil de TLC de los extractos de suspensiones
celulares y pulpa de fruta de T. peruviana . Las suspensiones celulares mostraron un perfil complejo de
compuestos que no se visualizaron en el extracto de fruta. Estudios anteriores han informado que las células
vegetales cultivadas in vitropuede sintetizar nuevos compuestos que pueden o no estar relacionados con los
previamente aislados en toda la planta [ 37 , 38 ].
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Fig.4 . Cromatografía en capa fina (TLC) de los extractos intracelulares de T. peruviana antes de su
obtención. Fig. 4 A - Se desarrolló TLC con butanol : ácido acético: agua (4: 1: 5 v / v / v) y se reveló
con una solución etanólica de AlCl 3 al 10% (p / v) y luz UV a 366 nm. . El carril 1 corresponde al
extracto de pulpa de fruta; los carriles 2–11 corresponden a suspensiones celulares a los 0, 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14, 16 y 18 días de cultivo. Se muestran las señales más intensas. Fig. 4 B - Cromatogramas
de TLC , las señales con Rf = 0.928, 0.527 y 0.083 mostraron cambios en la intensidad con el paso del
tiempo en el cultivo celular.
Además, la TLC de los extractos intracelulares de biomasa recolectada a las 96 h después de la extracción
mostró 19 señales con el reactivo folin-ciocalteu ( Fig. 5 ). La comparación de la señal de TLC mostró algunas
diferencias en el perfil de metabolitos entre los cultivos y el control provocados. El análisis por TLC permitió
una vista rápida del efecto de los inductores sobre el perfil de metabolitos producido por las suspensiones
celulares. Sin embargo, el TLC tiene la desventaja de la baja resolución, principalmente en la separación de
muestras complejas que contienen muchos componentes que difieren ampliamente en las actividades de
publicidad.
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Fig.5 . Cromatografía en capa fina (TLC) de los extractos intracelulares del cultivo de células
vegetales de T. peruviana a las 96 h después de la obtención. La TLC se desarrolló con hexano : acetato
de etilo: agua (20: 19: 1 v / v / v) y se reveló con un 10% (v / v) de reactivo de folin-ciocalteu. Los
carriles 1–3 corresponden al cultivo en suspensión celular tratado con 300 μM SA, 3μM MeJA y 3μM
MeJA / 300μM SA; el carril 4 corresponde al control del cultivo en suspensión celular.

3.7 . HPLC-DAD

Las suspensiones celulares tratadas con los inductores mostraron diferencias en el perfil de HPLC en
comparación con el control, independientemente del tiempo de cosecha. Se detectaron un total de 17 picos, sin
embargo, t R y UV-vis absorbancias de estos picos no lo hicieron correlato con los estándares analíticos
disponibles ( Tabla 3 ). Por lo tanto, no fue posible identificar estos picos. Los resultados mostraron una
respuesta temprana de las células al tratamiento con SA, a las 24 h después de la provocación hubo un aumento
en la producción de dos compuestos (picos 3 y 4 con t R  = 7.45 y 7.96 min, respectivamente) que no estaban
presentes en el control ( Fig. 6 ). Después de 48 h, hubo un aumento en la producción de un compuesto con t R =
11,62 min (pico 10) en los cultivos obtenidos con SA / MeJA. Este compuesto se detectó en el control y en
todos los tratamientos, pero solo aumentó en las suspensiones tratadas con la combinación SA / MeJA. Este
resultado sugiere un efecto sinérgico de ambos inductores para la biosíntesis del compuesto (pico 10). Efecto
elicitor sinérgica entre SA y MeJA también se observó para los compuestos con t R  = 12,5 y 12,85 min (picos
11 y 12). Por otro lado, compuestos con t R = 8.89 y 13.29 min (picos 5 y 13) solo aumentan en los tratamientos
con MeJA después de 72 h. Curiosamente, los mismos compuestos no aumentan después de la activación con
SA / MeJA, lo que sugiere un efecto antagonista de SA sobre MeJA para estos compuestos. Por lo tanto,
nuestros resultados indicaron que el tratamiento simultáneo de la suspensión celular con SA y MeJA produce un
efecto antagonista en algunos, pero no en todos los PC, en cultivos en suspensión celular de T. peruviana .
Tabla 3 . Tiempo de retención (Rt) y absorbancia UV-VIS de patrones y picos en las muestras analizadas
por HPLC.
Compuesto t R (min) Absorbancia máxima (UV / VIS)
Fórmula molecular
Ácido clorogénico C 16 H 18 O 9 9.096 214/324
(±) -Hesperetina C 16 H 14 O 6 18.884 220/286
ácido trans-sinápico C 11 H 12 O 5 12.015 222/321
Quercetina C 15 H 10 O 7 16,573 218/369
Kaempferol C 15 H 10 O 6 19.210 224/365
Pico 1 No identificado 1.749 222/258
Pico 2 No identificado 5.605 222/282
Pico 3 No identificado 7.456 222/236
Pico 4 No identificado 7,968 222/236
Pico 5 No identificado 8.896 222/236/323
Pico 6 No identificado 9.824 222/237
Pico 7 No identificado 10.058 222/237
Pico 8 No identificado 10.442 222/237
Pico 9 No identificado 11.051 222/237
Pico 10 No identificado 11,626 222/237
Pico 11 No identificado 12.501 222/237
Pico 12 No identificado 12.853 222/237
Pico 13 No identificado 13.291 222/237
Pico 14 No identificado 14.101 222/237
Pico 15 No identificado 14,698 222/237
Pico 16 No identificado 16.309 222/237
Pico 17 No identificado 17,824 222/237
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Fig.6 . Perfiles de HPLC obtenidos para extractos intracelulares de suspensiones de células vegetales
de T. peruviana . Los cromatogramas se registraron a 280 nm. La figura 6 A – E corresponde a las
células recolectadas a las 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la provocación.
Varios estudios han demostrado que el antagonismo entre SA endógeno y jasmonatos (JA) juega un papel
central en la modulación de la red de señalización inmune de la planta [ 39 ]. Del mismo modo, se ha informado
que el tratamiento exógeno con SA y JA puede resultar en un efecto antagónico en la producción de PC y
antioxidantes en las plantas, porque los salicilatos pueden anular aspectos de la cascada de señalización de JA
[ 40 , 41 ]. Sin embargo, el efecto antagonista no es generalizado y también puede producirse un efecto
sinérgico entre SA y MeJA sobre el metabolismo secundario de la planta [ 42 ].
Nuestro estudio no investigó los mecanismos bioquímicos de la obtención de cultivos de suspensión celular
de T. peruviana con SA y MeJA. Futuros experimentos deben llevarse a cabo para comprender estos
mecanismos. Por ejemplo, debe considerarse el análisis de enzimas del metabolismo de fenilpropanoide , como
la fenilalanina amoniaco liasa (PAL), los peróxidos (POD) y la polifenoloxidasa (PPO).

4 . Conclusión
Las vías metabólicas responsables de la síntesis de PC son activas en cultivos de suspensión celular de T.
peruviana . Estas vías produjeron un perfil de señal complejo que se detectó mediante análisis TLC y
HPLC. SA (300 μM) y MeJA (3 μM) aumentaron el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides , lo que
sugiere un efecto inductor de estos inductores en la vía metabólica de los fenilpropanoides. La adición de MeJA
3 μM en el día 4 de crecimiento y la recolección de las células a las 96 h después de la extracción produjo el
mayor contenido de estos metabolitos secundarios. . Por otro lado, la obtención con la mezcla SA y MeJA
puede afectar de manera diferencial la producción de algunas PC. Los resultados obtenidos en el presente
estudio nos permiten concluir que esta estrategia de obtención puede aplicarse conjuntamente con procesos de
escalamiento para aumentar la productividad global de estas culturas.

Declaraciones de interes
Ninguna.

Fondos
Este estudio fue apoyado por la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín (Beca No. 35515-2017 ) y
por el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación de Colombia - COLCIENCIAS (Beca
No. FP44842-006-2018 ).