LABORATORIO Nº 3: RECONOCIMIENTO Y PRODUCCION DE

ENTOMOPATOGENOS
Rafael Antonio Rojas 1611175
Universidad Francisco de Paula Santander
Ingeniería Biotecnológica
BIOTECNOLOGIA AGRICOLA, Grupo A
Cúcuta, Norte de Santander, Colombia
Dirigido a: Ramírez Caicedo Lilian Trinidad

RESUMEN

En este laboratorio se realizó una secuencia de pasos con el fin de reconocer y producir posibles
microrganismos entomopatogenos, utilizando la bacteria Bacillus thuringiensis y los hongos
Lecanicillium lecanii y Beauveria bassiana. Se empezó por una cateterización macroscópica y
microscópica de dichos microorganismos, seguidamente se realizó la producción de cada uno de
estos para finalmente realizarse los procedimientos de control de calidad asegurando la
efectividad e inocuidad del producto. Estos procedimientos incluían pruebas tales como:
concentración y pureza tanto para hongos como bacterias, viabilidad y virulencia solo para
hongos.

Palabras clave: Entomopatogeno, pruebas, control de calidad, bacteria y hongo.

ABSTRACT

In this laboratory, a sequence of steps was performed in order to recognize and produce possible
entomopathogenic microorganisms, using the bacterium Bacillus thuringiensis and the fungi
Lecanicillium lecanii and Beauveria bassiana. It was started by a macroscopic and microscopic
catheterization of these microorganisms, followed by the production of each one of these to
finally perform the procedures of quality control ensuring the effectiveness and safety of the
product. These procedures included tests such as concentration and purity of both fungi and
bacteria, viability, and virulence only for fungi.

Key words: entomopathogen, tests, QA, bacterium and fungus

 INTRODUCCIÓN luego ser inoculados en mayor
número al campo. A estos productos
Existen organismos capaces de
obtenidos, llamados inoculantes y
producir enfermedades en los
algunas veces biopreparados, deben
insectos. Esto ha sido aprovechado
realizarse procedimientos de control
en el control de organismos plagas
de calidad para asegurar la
mediante microorganismos como
efectividad e inocuidad del producto.
bacterias, hongos y nematodos,
La calidad se define como un
además de virus, a los cuales se les
conjunto de propiedades y
denomina entonces,
características de un producto o
entomopatógenos. La identificación
servicio que lo hacen apto para
de organismos entomopatógenos
satisfacer las necesidades para lo
permiten su reconocimiento en el
cual fue creado.
laboratorio y encampo, atendiendo
Los tres tipos de control de calidad
sus características macroscópicas, sin
que se han establecido son
embargo es necesario conocer sus
• El control de la producción,
estructuras microscópicas para la
donde se realiza seguimiento de la
mejor descripción de cada una delas
ejecución de todas las operaciones,
especies que han sido trabajadas en
procedimientos, equipos y
el control biológico de organismos
condiciones ambientales de
plaga, dentro de los grupos fúngicos
producción con el objetivo de
bacterianos. Luego de un proceso de
mantener el rendimiento
reconocimiento de insectos enfermos
• El control de Proceso, que
o muertos en campo con la presencia
consiste en el seguimiento de la
de organismos entomopatógenos, se
calidad del producto no terminado,
realiza el proceso de aislamiento y
como la detección de contaminantes
caracterización de estos
y
microorganismos en cultivo puro con
• EL Control del producto,
el objetivo de producirlos
como seguimiento de la calidad del
masivamente en el laboratorio para
producto final. En la calidad del
 producto final se analizan la cantidad cuales son manipulados y reproducidos
de esporas, conidios o unidades masivamente para ser utilizados
infectivas la viabilidad, la virulencia, comercialmente en el control de plagas
en caso de bioinsecticidas y la pureza agrícolas, desarrollándose así el concepto de
control microbial Uno de los componentes
del control microbial, es el uso de hongos
Los inconvenientes que presenta el control entomopatogenos, los cuales causan
químico se han potenciado en los últimos enfermedades en los insectos, siendo
años por el cambio en los sistemas de muchos de ellos utilizados exitosamente en
cultivo, monocultivos, explotaciones programas de manejo de plagas.
intensivas, todo esto unido a una mayor
Aunque muchos microorganismos pueden
conciencia social ante el enorme deterioro
ser efectivos para el control de plagas no
medioambiental debido a la utilización
todos pueden ser utilizados como agentes de
masiva de compuestos químicos, ha
control microbial, para que estos sean
provocado un gran interés en la búsqueda de
usados como agentes de control biológico
sistemas de control alternativo.
tienen que ser seguros para los seres
La aplicación de métodos biológicos para el humanos, genéticamente estables, no
control de insectos plaga que afectan a patogénicos a los cultivos, eficaces contra
diversos cultivos, implica la búsqueda de un amplio rango de insectos plaga,
microorganismos entomopatogenos eficaces, compatibles con las medidas culturales,
así como el desarrollo de metodologías para fáciles de usar y que tenga una relación
su multiplicación masiva, con el fin de beneficio costo favorable para el agricultor.
producir biopreparados a bajo costo, los La utilización de microorganismos benéficos
cuales puedan ser accesibles a la mayoría de como hongos entomopatogenos, involucra
los agricultores. una serie de procesos para su producción

En la naturaleza existe una gran diversidad masiva, desde la preparación del materiales

de microorganismos entomopatógenos, que y medios de cultivo, así como técnicas de

afectan a una serie de insectos plaga asepsia para evitar contaminantes, cuyo

reduciendo sus poblaciones. Entre estos objetivo principal es la obtención de

microorganismos se encuentran hongos, material que, una vez aplicado en campo,
bacterias, virus y nematodos, muchos de los actúe directamente como el estado más
infectivo del microorganismo o posibilite la
formación de ese estado en el campo
(Gómez et al., 2014)
En el caso de hongos se usaron las cepas
de Lecanicillium lecanii y Beauveria
bassiana, cuya caracterización
microscópica se realizó por medio de
una tinción simple con la técnica “cinta
impronta” y el colorante azul de lacto

OBJETIVOS fenol.

 Reconocer las características Producción:

macroscópicas y microscopias de Se hizo la suspensión de las cepas de los

algunos microorganismos microorganismos anteriores. Para
entomopatogenos utilizados en bacterias se hizo un arrastrado total de la
control biológico. caja de Bacillus bien esporulada, con un
 Producir bacterias y hongos asa redonda previamente esterilizada;
entomopatogenos en birreactores a esto se suspendió en un frasco con 90ml
escala de laboratorio. de solución salina que sería la primer
 Realizar metodologías de laboratorio dilución (100). De esta se tomaron 10 ml
que permitan analizar algunos con ayuda de una pipeta y se agregaron
parámetros de calidad de inoculantes al birreactor (solución liquida)
biológicos. previamente montado, se homogeneizo
bien y se dejó en aireación por 24 horas.
Finalmente a partir de esta primer
MATERIALES Y METODOS
dilución (100) se hacen diluciones hasta
Caracterización macro y
10-4, y luego un recuento por medio de la
microscópica:
técnica de microgota. Esta consistió en
En el caso de bacterias se usó la cepa de sembrar en cajas con agar nutritivo las
Bacillus thuringiensis cuya últimas tres diluciones (10-2, 10-3 y 10-4)
caracterización microscópica se realizó dividiendo las cajas a la mitad y con una
por medio de la tinción de GRAM y la micro pipeta de 10-100µl se tomaron
tinción de esporas. 50µl de la dilución correspondiente
sembrando en cada división.
Para hongos al igual que para bacterias
se hizo un arrastre total de la caja con el
microorganismo y se suspendió en un
frasco con 40ml de agua estéril con
0.01% de Tween, siendo esta la dilución
(100). De esa suspensión se tomó 10ml
con una pipeta y se agregó al birreactor
con arroz (solución solida) previamente
montado, dejando incubar por 8 días.
Luego se hicieron diluciones seriadas de
la suspensión celular (100) hasta 10-5 y
realizó recuento en cámara de Neubauer
para así hallar la concentración de
conidios por ml.
Pruebas de control de calidad:
Se realizaron pruebas de: concentración
y pureza tanto para bacterias como para
hongos, viabilidad y virulencia solo para
hongos.
Para la prueba de concentración, en
bacterias a partir de inoculante obtenido
del birreactor (solución liquida) se tomó
1ml con la pipeta y realizaron diluciones
seriadas hasta 10-8. Luego se tomó las 2
últimas de estas diluciones (10-7 y 10-8) y
se sembró según la técnica de microgota
por duplicado en agar Nutritivo. Para
hongos esta prueba consistió en tomar 30
gramos del inoculante obtenido del
birreactor con arroz (solución solida),
usando la balanza de tres brazos y un
levanta leguas estéril, y agregarlos a un
frasco con 90ml de agua estéril con
0.01% de Tween. A partir de esta
dilución (10-1) se hizo diluciones
seriadas hasta 10-5 y se realizó el
recuento en cámara de Neubauer para
determinar la concentración final del
inoculante (conidios/gr).
Para la prueba de pureza, en bacterias
se observó el crecimiento de otros
microorganismos presentes en las cajas
sembradas por duplicado en la prueba de
concentración y se contó, haciendo
tinción de GRAM, contando las UFC/ml
de producto. En el caso de hongos, de la
primera dilución (10-1) se tomó 100µl y
se sembró en superficie sobre agar PDA
extendiendo bien con un rastrillo estéril.
Finalmente se llevó a incubar para luego
observar si hubo crecimiento de otros
microorganismos ajenos al esperado y
contar las UFC/g de producto.
Para la prueba de viabilidad, de la
dilución (10-1) se tomó con la
micropipeta 100µl y realizó un sembrado
en superficie, extendiendo con el
rastrillo estéril. Se llevó a incubar por 12
horas y se procedió a hacer una tinción
aplicando azul de lactofenol para teñir
las colonias, que se agregó a un
cuadrado de más o menos 1 cm2 de agar
y este se colocó sobre un portaobjetos
cubriéndolo con su cubreobjetos. Se
montó al microscopio en el aumento de
hormiga en agar PDA y se analizó si
creció el hongo esperado.
RESULTADOS

40x, para hacer recuento de conidios Fig. 1. Caracterización macroscópica

germinados y no germinados en 10 Bacillus thuringiensis
campos de observación. Al final se  Forma= irregular
 Elevación= plana
sumaba todos los conidios y se sacó el
 Color=crema
porcentaje de conidios viables  Borde=ondulado
(germinados).  Superficie=granular-opaca

Para la prueba de virulencia, se realizó la

recolección de 8 hormigas adultas, se
desinfectaron con NaCl al 0.7% por 3
minutos y se enjuagaron con agua
destilada estéril. Se tomaron 8 frascos y
en cada uno de ellos se colocó una
hormiga con un algodón humedecido
con agua azucarada y a partir de la
dilución 10-1 se tomaba 1 ml para
Bacilos Gram positivos, formando cadenas
inocularlo en la mitad de los frascos con
cortas al microscopio. 40X
la hormiga (4 frascos), la otra mitad de
 Gram(+)
los frascos se inocularon con 1ml de
 Parejas
agua estéril que servirían como control.
 Diplobacilos
Se observó diariamente el
 Empalizados
comportamiento de los insectos hasta
registrar el día que murieron, se procedió  bacilos

a tomar con unas pinzas la hormiga

muerta y ubicarla en cámara húmeda
durante 7 días y así evaluar la micosis.
Una vez pasado este tiempo se sembró la
 Hongos

Fig. 3. Caracterización macroscópica

Lecanicillium lecanii
 Color=blanco
 Textura= algodonoso
 Amberso= blanco
 Reverso=brillante

Fig. 2. Caracterización macroscópica

Purpureo cillium lilacinum
 Color=rosado – violeta
 Textura= terciopelo
 Amberso= rosado-violeta
 Reverso=dematiaceo
Fig.4.Caracterización macroscópica y
microscópica de Beauveria bassiana.

 Color=blanco
 Textura= algodonoso
 Amberso= blanco
 Reverso=brillante

Fig.4.Caracterización macroscópica y
microscópica de. Metarhizium anisopliae

 Color=verde
 Textura= granular
 Amberso= verde
 Reverso=dematiaceo
Tabla 1. Pruebas de calidad de Bacillus thuringiensis.

PRUEBA DE
IMAGEN RESULTADO
CALIDAD

10-4: Incontable >1600x104UFC/ml

Concentración

7 colonias lado izquierdo

5 colonias lado derecho

12 colonias en total/2= 6*20*104

= 12*105 UFC/ml

Se comprobó por medio de la tinción

de Gram que no hubo crecimiento de

Pureza
otros microorganismos ajenos al

esperado (Bacillus thuringiensis) y

mostrando así 2 UFC/ml de producto.

Se observaron bacilos Gram positivos

en cadenas, lo que corresponde a las

características mostradas en la parte

de caracterización microscópica de

dicho microorganismos.
Tabla 2. Pruebas de calidad de Lecanicillium lecanii.

PRUEBA DE
IMAGEN RESULTADO
CALIDAD

C= 7*5x104*101
Concentración
C= 3500000 cells/ml

Se observó la formación

de colonias y se comprobó
Pureza
que no hubo crecimiento

de otros microorganismos.

La lectura hecha después

de 36 horas fue como
resultado que todos los
Viabilidad
conidios germinaron y
además hubo
contaminación de Bacillus.
 En las imágenes superiores
Virulencia se muestra a las hormigas
muertas por el hongo,.

DISCUSIONES contaminantes más comunes están los

hongos y las bacterias; por las características
Para poder proceder a la utilización de un
de crecimiento algunos de ellos son más
posible hongo entomopatógenos, este debe
difíciles de eliminar que otros (Monzón,
pasar por una serie de pruebas de calidad
2001).
para comprobar su efectividad y
rendimiento, y por ultimo determinar si Se puso a prueba los siguientes
efectivamente el hongo puede ser utilizado y microorganismos:
producido en masa por sus propiedades
entomopatogenicas.
 Bacillus thuringiensis:
En el proceso de producción de hongos
entomopatógenos el control de calidad
Las bacterias, en especial las
constituye un factor clave. Este consiste en
diferentes subespecies de Bacillus
la evaluación rigurosa de la calidad en cada
thuringiensis , han sido los patógenos
uno de los pasos del proceso de producción.
de insectos más usados en programas
Su objetivo principal es evitar los problemas
de control de insectos . Las razones
de contaminación y garantizar la calidad del
para esto son: producción masiva
hongo producido. Existen una variedad de
fácil, sencillas de formular y usar en
microorganismos contaminantes que pueden
grandes programas de control, matan
afectar el proceso, algunos de los cuales son
la plaga con facilidad (alrededor de
patógenos al hombre. Entre los
48 horas), tienen un espectro de
actividad que incluye muchas plagas
de interés económico y brindan una
seguridad muy superior para los
organismos benéficos y el ambiente
que cualquier insecticida sintético.
Esta bacteria mata los insectos
principalmente por medio de la
acción insecticida de la toxina, que
produce una toxina (compuesta por
una proteína: delta-endotoxina y un
nucleótido: exotoxina) capaz de
matar insectos que estén o no
directamente asociados con la
bacteria. La toxina está en un cristal
proteico que se forma durante la
esporulación y se localiza cerca de la
espora en el esporangio bacterial. La
mayoría de las bacterias que se usan
y que están en desarrollo para
emplearse como agentes de control
microbial son formadoras de esporas,
pertenecen a la familia Bacillaceae y
al género Bacillus . Estos bacilos
patogénicos ocurren en insectos
sanos y enfermos, pero también se
presentan en otros hábitats como
suelo, plantas, graneros y ambientes
acuáticos; pueden aislarse
fácilmente. (Nicholls, 2008).
Las pruebas de calidad empleadas
fueron:
- Concentración: hubo una
medición de 12*105 UFC/ml, por
lo tanto, hay una gran cantidad
de UFC por cada mililitro, se
puede deducir que hay una gran
concentración.
- Pureza: comparando lo visto en
la tinción de gram con la
caracterización microscópica
antes de su producción (figura 1),
se puede notar como se ven
también bacilos Gran positivos
en cadena, por lo tanto, la
bacteria se mantuvo pura. Y lo
visto en la caja y comparándolo
con la caracterización
microscópica de Bacillus
thuringiensis antes de hacer su
producción (figura 1), se puede
ver una uniformidad en las
colonias de la caja Petri.
Bacillus thuringiensis muestra
actividad contra un gran número de
larvas de lepidópteros, contra larvas
de mosquitos y jejenes, y contra
algunas especies de coleópteros. La
especificidad que muestra contra
estos insectos representa una de las
 grandes ventajas de este descritos como causantes de
bioinsecticida, ya que resulta por enfermedades en insectos. A
completo inocuo a otro tipo de diferencia de otros patógenos, los
insectos, especialmente los hongos usualmente infectan los
benéficos. De esta forma, su insectos mediante una penetración
eficiencia en el manejo ecológico de activa a través de la cutícula, esta
plagases muy alta. Asimismo, existe característica los vuelve más
un cúmulo de evidencias que atractivos como controladores de
certifican su inocuidad hacia insectos chupadores. Sin embargo, la
vertebrados (incluyendo al hombre), transmisión transovárica se ha
lo cual hace de Bt, junto con su demostrado en las levaduras
incapacidad de contaminar el medio mutualistas. Penetran por medio de
ambiente, una de las alternativas acción enzimática y física como es el
ecológicas más atractivas (Nicholls, caso de Beuveria bassiana y
2008) Paecilomyces farinosus, los cuales
producen proteasa y quitinasa
Por lo anterior dicho y por los
(Nicholls, 2008).
resultados obtenidos en el proceso de
pruebas de calidad del Este hongo fue observado a nivel
microorganismo, se puede microscópico y macroscópico en el
determinar que Bacillus laboratorio, pero no se llegó a
thuringiensis es un eficaz reproducir ni a evaluar su capacidad
entomopatógenos y puede ser como entomopatógenos, según la
utilizada para su producción, así literatura es una opción válida y
como controlador de larvas de funcional a la hora de su utilización.
lepidópteras y algunos coleópteros.
Desafortunadamente, enemigos
naturales como las mariquitas
también son susceptibles. Un método
 Beauveria bassiana:
de aplicación que evite el daño a
enemigos naturales lo constituye el
Los hongos representan los uso de trampas o cebos de feromonas
principales microorganismos
 contaminados con el hongo, los diferentes cepas, que presentan un
cuales sólo atraen a especies abanico muy amplio
específicas. Desde esta primera de hospedadores, aunque no actúa
iniciativa se han presentado muchos necesariamente como parásito
esfuerzos para desarrollar obligado, ya que puede vivir también
comercialmente los hongos como de forma saprofítica, sobre la materia
insecticidas microbianos. M. orgánica seca. En cuanto a sus
anisopliae y Beauveria bassiana se esporas, pueden sobrevivir
producen y usan con gran éxito en durante periodos muy largos de
países como Brasil, Cuba, China y tiempo, tanto en la tierra como en
Rusia. La compañía Mycotech, en líquidos aireados.
Estados Unidos, ha desarrollado una
nueva estrategia de fermentación Su mecanismo de acción es por
para producir B. bassiana para el contacto. En el momento que la
control de insectos. Los productos espora entra en contacto con el
producidos con este método se insecto, se adhiere a su cutícula,
encuentran ahora en el mercado y su activando quitinasas, lipasas y
evaluación se ha hecho para el proteasas, que facilitarán su entrada a
control de coleópteros plaga en el través de ella. Una vez dentro, la
suelo, áfidos y moscas blancas en espora comienza a germinar, dando
invernadero y para el control de lugar a las hifas del hongo, que se
poblaciones grandes de langostas extenderán por toda la hemolinfa de
(Nicholls, 2008). su presa.

A medida que tiene lugar

 Lecanicillium lecanii: la invasión, se sintetizan un gran
número de compuestos tóxicos,
Es un hongo como fenilalanina anhidra, ácido
entomopatógeno de reproducción dipicolínico o ácidos
asexual, perteneciente al hidroxicarboxílicos, que terminan
orden Moniliales. Consta de por ocasionar la muerte del insecto,
sin causar ningún tipo de efecto e igual a la observación
perjudicial en las hojas de la planta y macroscópica del hongo antes de
tampoco en humanos, pájaros, peces su producción, sin presencia de
o mamíferos. Realiza un control en un microorganismo diferente. Por
Homópteros en general como: lo tanto, es puro.
Pulgones, escamas, moscas blancas, - Viabilidad: Se realiza como un
trips, etc. (Martin, 2016). indicador de la capacidad y
velocidad de los conidios del
Se realizaron estudios de calidad a la hongo, para emitir un tubo
cepa utilizada para su producción y germinativo in vivo y poder
se obtuvo: penetrar potencialmente la
cutícula del insecto meta (Castro,
- Concentración: se evaluó en 2013). Esta prueba no se pudo
cámara de neubauer una evaluar por problemas de
concentración de 3’500.000 contaminación de un bacilo y por
células/ml, lo que es una dejar crecer excesivamente el
concentración bastante hongo; no se pueden concluir
considerable. datos reales de este proceso, ya
- Pureza: La prueba de pureza que la lectura de esta prueba debe
tiene como finalidad establecer la ser hecha a las 12 horas y
proporción del agente biológico nosotros hicimos la lectura de
en la formulación e identificar viabilidad más de 24 horas
los microorganismos después, por lo tanto, no se puede
contaminadores, contribuyendo a determinar la viabilidad.
mejorar el proceso de producción - Virulencia: La virulencia es el
y formulación de los poder de un microorganismo de
entomopatógenos. Los lotes producir enfermedad, es decir, la
deberán estar libres de todo tipo habilidad de un microorganismo
de contaminaciones (Castro, de invadir y causar daño al
2013). En la caja de Petri se hospedero. Es la capacidad de un
observó un crecimiento uniforme microorganismo para evitar los
 mecanismos de defensa del para la eliminación de plagas,
hospedero. Un patógeno puede aunque pueden presentar diferentes
ser muy virulento a causa de la complicaciones a la hora de
baja resistencia o alta probarlas en campo y por eso mismo
susceptibilidad del hospedero, y se les realizan pruebas de calidad
a su vez puede tener baja para probar su eficiencia a posibles
virulencia por la alta resistencia o microorganismos entomopatógenos.
baja susceptibilidad del  Después de realizada la práctica,
hospedero (Nicholls, 2008). La podemos concluir que reconocer las
virulencia de este hongo fue características macroscópicas de
comprobada, como se muestra en algunos microorganismos de
las imágenes, de las 4 hormigas entomopatógenos, es importante
infectadas todas murieron, pero dentro del manejo del control
en solo dos se encontró el biológico de organismos plaga.
microorganismo presente; la  Producir de manera adecuada
muerte de las otras dos hormigas bacterias y hongos
(comparándolas con las de entomopatógenos a escala de
control) pudo ser provocada por laboratorio permite observar su
un tratamiento agresivo de las crecimiento y comportamiento sobre
hormigas al momento de la insectos plaga.
recolección o su limpieza. De las  El arroz proporciona un medio
hormigas con presencia del nutritivo para la producción conidial
hongo, estas murieron a los 2 de Lecanicillium lecanii. Este hongo
días, por lo tanto, está produce mayor cantidad de conidios
comprobada su virulencia. cuando se cultiva en sustratos que le
proporcionan mejores condiciones

CONCLUSIONES para su crecimiento(Cortez, 2001)

 El uso de hongos entomopatógenos
 Los microorganismos
se ha reconocido como una
entomopatógenos son una alternativa
alternativa eficaz para controlar
al uso convencional de químicos
plagas agrícolas, además de contar
 con cepas específicas para una plaga http://Formulacióndehongosentomopatógeno
determinada; y el tener scomocontrolbiológicoFormulacióndehongo
formulaciones adecuadas son sentomopatógenoscomocontrolbiológico-
factores que inciden en el éxito de Agricultura-2-7-2007-Engormix_com.htm
este tipo de control.

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