FACULTAD DE CIENCIAS DE SALUD

“EXTRACCIÓN DEL ADN,

FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR) Y
FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS”

PROFESOR: Gerardo Sánchez

INTEGRANTES:
 Nieves Araujo, Guadalupe
 Nishijima Cadillo, Kiosany
 Zavala Mejia, Rossana
 Huaro Reyes, Milagros
 Irey Pomari, Fatima

HORARIO DE PRACTICA: 11:00 am – 1:00pm

FECHA REALIZADA: 28 de octubre – 04 de noviembre – 11 de noviembre
del 2019
FECHA DE ENTREGA: 18 de noviembre del 2019

2019
 INTRODUCCIÓN

El ADN que constituye el material genetico de los seres vivos y que ha sido punto de
investigación desde hace ya tiempo, ahora es posible ser observada y anlizada
atraves de distintos procesos.
En este presente informe explicaremos los procesos realizados en el laboratorio que
sirvieron para poder observar las bandas finales del ADN (muestra). Para poder
hacer esto posible se debe llevar a cabo tres procedimientos fundamentales, que
son:
 Extracción de ADN (muestra).
 Proceso de PCR.
 Electroforesis.
La extracción de ADN es una metodologia mediante la cual podemos obtener material
genetico que nos permite la manipulación del producto obtenido. Es un metodo por el
cual podemos estudiar mutaciones que esten involucradas con diferentes potologias
humanas, mapeos y secuenciación de genes con fines terapeuticos.
El proceso de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) es una tecnica utilizada para
obtener un gran numero de copias de un fragmento de ADN en una amplificación in
vitro, ademas de ser una amplificación selectiva la cual se basa en una capacidad de la
enzima ADN polimerasa para fabricar una cadena ADN complementaria a la existente.
La electroforesis es una tecnica utilizada para observar la concentración e integridad
del ADN, proteinas y otras biomoleculas. Ya que permite las separación de las
proteinas y acidos nucleicos a traves de una matriz tamponada de pH 8.
Estos procedimientos hacen posible una amplificación del ADN para asi poder
detectar o determinar ciertas patologias como errores geneticos, además de la
determinación de paternidad; esto nos permite tener un mejor conocimiento acerca
de la aplicación de estos metodos en el campo de la medicina y asi poder ponerlos en
practica en el momento adecuado.

MARCO TEORICO

La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la

etapa previa de todo análisis genético. En general; los métodos de extracción de
DNA tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del
origen de la muestra. Estos son, a saber: disrupción celular (ruptura de la bicapa
lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes
quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación
de las proteínas (que constituyen los principales contaminantes del extracto),
concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar
restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión.
El PCR (Reacción en la cadena de la polimerasa) es una técnica "in vitro" que imita la
habilidad natural de la célula de duplicar el ADN.Técnica usada para crear un gran
número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización,
apareamiento con cebadores y extensión por un ADN polimerasa termoresistente.
Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de
ADN en un tubo de ensayo, pueden generarse millones de moléculas idénticas, a
partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. La reacción
es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo
de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadenas de
nucleótidos que actúan como cebadores.
La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar moléculas
cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las moléculas cargadas positivamente se
desplazarán hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo
positivo. Uno de los factores que afecta la separación de las moléculas en una
electroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los grupos fosfato le dan la carga
a la molécula. Los grupos fosfato son grupos ácidos con pK bajos, esto significa que
a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan
cargados negativamente. Por lo anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son
moléculas cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético se
desplazarán hacia el polo positivo, es decir, separación de moléculas por diferencia
en su movilidad electroforética. Para separar moléculas de DNA de diferente tamaño
se incluye en el sistema la utilización de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida
(acrilamida más bis-acrilamida).

Ley De Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de
onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende
de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y, por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de
extinción- que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las
dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre
en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que
las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en
términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se
denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso
molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras unidades
distintas de M, por ejemplo, g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por
ejemplo, g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de
extinción específico (εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas;
para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de
dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
 Temperatura De Melting
Tm significa en inglés melting temperature y se refiere al temple a la que se hibridan
o se pegan los oligonucleótidos en los sitios que son complementarios. Este
procedimiento dependerá principalmente del prototipo de uniones (dobles o triples
enlaces de hidrógeno) que formarán sus bases, y por eso la serie de cada oligo es la
que se toma en recuento para echar de ver cuáles la temperatura óptima para su
alineamiento. Existen muchas maneras de calcularla, por ejemplo, una sencilla es:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T)
Aunque hay muchas otras que asimismo pueden utilizarse. Saber la Tm puede darnos
una imagen, pero no perennemente es la temperatura que se utiliza en el
termociclador, ya que además los iones y otras sustancias que haya en la reacción
pueden influir en el modo en que se unen los oligos. Una de estas fórmulas toma en
recuento los iones, pero en habitual hay que ensayar experimentalmente hasta hallar
la temperatura adecuada.

Dímero De Pirimidina
El título dímero de pirimidina hace indicación a un conjunto de enzimas con
actividades similares pertenecientes a diferentes especies entre las que se
encuentran varias bacterias y fagos, y que cataliza la separación endonucleolítica de
una serie de ADN en la población de un dímero de pirimidina. Esta enzima tiene
primacía para proceder sobre ADN de doble cadena, generando una muesca o corte
simple sobre la cadena dañada, más necesariamente en orientación 5' con relación al
espacio dañado, generando dos extremos uno hidroxi-3' y uno fosfato-5' este último
proximal al dímero. Otros nombres por los cuales se conoce a esta enzima son
endodesoxirribonucleasa V de bacteriófago T4 y T4 endonucleasa. Es una enzima
compleja que presenta en realidad dos actividades diferentes, una actividad ADN
glicosilasa sobre dímeros de pirimidina, y una actividad endonucleasa AP
(apurínica/apirimidínica).
1. La acción glicosilasa rompe el enlace N-glicosídico entre el extremo 5' del
dímero de pirimidina y el azúcar propio, creando un espacio AP
(apurínico/apirimidínico).
2. A continuidad, la acción endonucleasa AP hidroliza el enlace fosfodiéster en
el extremo 3' del sitio AP, generando un rompimiento en la serie afectada
 PCR Y Prueba De Paternidad

El proceder de conseguir un perfil de ADN se fundamento en formar millones de

copias o ampliar las secuencias del genoma que permiten diferenciar individuos,
en este caso los marcadores STRs. Esta técnica permite replicar al ADN in vitro, y
se conoce considerablemente por sus siglas en inglés como PCR (polymerase chain
reaction). La PCR se realiza por ciclos de temperatura en los que básicamente
suceden los siguientes tres pasos en cada período: 1) desnaturalización, por calor se
abren las cadenas de ADN, 2) alineamiento de secuencias cortas conocidas como
primers, que delimitan las regiones que se van a replicar, y 3) propagación,
formándose cadenas nuevas de ADN por acto de la Taq polimerasa,
una enzima termoestable capaz de añadir nucleótidos a los extremos de los primers.
En cada período de PCR se duplica la serie de utilidad (STRs), por lo que en solo 25
ciclos hipotéticamente habrá un sinnúmero de copias, a lo que se conoce como
“amplificado”, lo que facilitará considerablemente su análisis posterior. Para el
análisis post-PCR hay que acordarse que los alelos STRs se diferencian por la cifra
de veces que se repite una serie, esto significa que el tamaño o extensión va a ser
desigual de un alelo de otro. Para ver estas diferencias se emplea la electroforesis,
técnica para separar moléculas en una superficie de soporte (gel) por acto de un
campo eléctrico en base a la carga y tamaño de la molécula; las más pequeñas corren
más raudo mientras las grandes se van retrasando.

PROCEDIMIENTO

1. EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE TOTAL:

Para la práctica de extracción primero se extraerá sangre de los voluntarios con un

una lanceta esterilizada pinchando el dedo índice hasta obtener la cantidad
preferida para realizar la práctica y será colocada en un portaobjeto (ósea la
sangre). Tener en cuenta de que se realizará el mismo procedimiento para obtener
las 4 muestras.

En un tubo de eppendorf añadir la sangre fresca de 20 ul que será extraída con una
pipeta amarilla ( marcado 0.20) , de ahí agregar 20 ul de proteinasa k .Seguidamente
añadimos la ARNasa 20 ul al tubo de la muestra sometiéndose al vórtex 15 segundos
para que la sangre no se coagule e incubar en agua a 55 C por 10 minutos.
Extraer 100 ul de buffer lisis con la pipeta y agregarlo al tubo de la muestra y
homogeneizar utilizando el vórtex 15 segundos .Añadir 100 ul de etanol (alcohol)
extraído con la pipeta al tubo de la muestra .Mezclar en el vórtex 15 segundos y
reposar a temperatura ambiente 5 minutos, después de este proceso la muestra ya
no mantendrá el color original .
 2. PROCESO DE PURIFICACIÓN :

Traspasar el contenido (muestra) al tubo de sílica (columna de extracción) con una

pipeta marcada a 260 ul , luego centrifugar a 8000 rpm contra pasándolo con otros
tubos y descartamos el filtrado y colocamos el tubo de sílica en un nuevo tubo de
lavado . Lavar con 200 ul de buffer de lavado y centrifugado por un minuto a 8000
rpm , luego descartamos el filtrado .Seguidamente realizamos el mismo proceso pero
centrifugamos por 3 minutos y así filtramos todo lo que no sirve descartando.
Colocamos el tubo de sílica en un nuevo tubo y añadimos 100 ul buffer de elución al
tubo e incubar 1 minuto y centrifugar 1 minuto a velocidad máxima . Finalmente
votamos la columna de extracción y el tubo tendrá ADN puro (purificado) y este
será llevado a un almacén de -80 C para las siguiente práctica .

3. CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS :

Para la continuación de esta práctica usaremos la muestra obtenida del anterior

procedimiento y añadimos 2 ul del ADN extraído con una pipeta en el sensor del
espectrofotómetro (máquina nanodrop) y anotar los resultados .

Espectrofotómetro de Lambda

4. PCR- REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA :

Primero tener en cuenta de que las muestras ( 4 tubos ) estén rotuladas como
J1,J2,H1,H2.Luego en un tubo de PCR se le añadirá la muestra y el mix de PCR, la
cantidad será según lo mostrado en el siguiente cuadro :
 COMPONENTE CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN VOLUMEN A
A LA QUE SE FINAL EN LA AÑADIR ( ul )
CONSERVA REACCIÓN

AGUA …………….. ………………. 12,1 ul

TAMPÓN 10X 1X 6,6 ul

MgCl2 25 mM 1 mM 6,6 ul

PRIMERS R 10 uM 0.4 uM 0,6 ul

PRIMERS F 10 uM 0.4 um 0,6 ul

dNTPS 10mM 0.4 mM 6,6 ul

Taq 5 unidades (ul) 1 unidad ( 25 ul ) 6,6 ul

ADN …………………. ………………….. 5,1 ul

Luego de de que esté listo , centrifugar a 8500 rpm brevemente hasta mezclar
bien los componentes .
Después colocar los tubos en el termociclador , el cual ya debe de estar
programado de esta manera :

DESNATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN ELONGACIÓN N DE MANTENER A

CICLOS

94 C por 15 segundos 58 C por 30 72 C por 15 x1,x 25 ,x 1 20 C

segundos segundos
 En esta imagen observamos de una manera más específica la programación en el
termociclador según lo indicado.

Finalizando el proceso de amplificación , retirar los tubos del termociclador y

guardar las muestras a 20 C y este tomará un lapso de reposo y será utilizado en la
siguiente práctica.

CONCLUSIONES

Esta práctica podemos concluir que se logró la extracción y purificación de ADN de

células eucariotas obteniendo la muestra de sangre periférica, De esta manera, se
puedo separar de otros componentes como proteínas , lípidos ,carbohidratos, etc. se
concluye que la practica fue un éxito ya que se consiguió paso a paso como se debe
realizar la extracción y purificación del ADN .

La reacción de cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la

mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Sea presentado la base
teórica y práctica de la PCR existen muchas variantes de la PCR convencional , como
son la PCR en el tiempo real o PCR cuantitativa (que permite cuantificar la cantidad
de producto amplificado) o la PCR por transcripción inversa (mediante la cual se
obtiene una copia de DNA complementario, DNAc,utilizando como molde ácido
ribonucleico ,RNA) Existen gran cantidad de información referida tanto en la PCR
convencional como a sus variantes
Se observa que la mayor concentración de ADN hay mayor intensidad de la coloración
en la electroforesis. los resultados de ADN se pueden obtener gracias a que la
temperatura desnaturaliza proteínas dejando al ADN puro para su lectura en el
Qubit y su posterior corrida electroferica.
El peso molecular y el tamaño influirán en el movimiento del ADN por los poros de la
agarosa en los diferentes parámetros establecidos en la electroforesis.

REFERENCIA BIBLIOGRAFIA

 Advincula. Extracción del ADN .Santiago,Chile:Ministerio de Salud

Consultado el: [01 de noviembre de 2019].Disponible en
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S1851-
75872010000200001&script=sci_arttext
 Choque B. Extracción del ADN.Colombia.Zuckta.Consultado el: [01 de
noviembre de 2019].Disponible en:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf