Calibración (análisis cuantitativo)

En esta sección se discutirá:

• El análisis cualitativo
• El análisis cuantitativo
• Métodos de calibración (estándar interno, externo) .
• Calibraciones simples y de Múltiples puntos
• La diferencia entre precisión y exactitud.
Análisis cualitativo.

• Determina que esta presente en la muestra.

• Compara los tiempos de retención de un compuesto
desconocido con el de un estándar en las mismas
condiciones, debe ser la misma fase estacionaria,
longitud de la columna, velocidad lineal, temperatura de
la columna, etc.
 Análisis cuantitativo (Cuantificación )

Análisis cuantitativo:
• Determina la cantidad de un componente en una
muestra.
• Midiendo la altura o el área del pico ( se usa
preferiblemente el área del pico)
• Compara la respuesta de una muestra desconocida con
la respuesta en la concentración de una muestra
conocida
Cuantificación - Cálculos

Se pueden elegir cualquiera de los procedimientos

para cuantificar:

• Área % o altura %.
• Estándar externo (ESTD).
• Estándar interno (ISTD).

La calibración es el proceso que relaciona el área o la

altura del pico de un componente con la concentración
.
% Área y % altura: procedimiento sin
calibrar
• Análisis de una muestra que
Cuantas de contiene cantidades
área Área % desconocidas de C-12, C14, C-
C12 280 26.2 16 y C-18.
C14 250 23.4
• Esteres metilicos del ácido graso
(“Fame”) por el método de % de
C16 220 20.6 área
C18 320 29.9

1070 100
280
Area % de C12 = X 100 = 26.2
280 + 250 + 220 + 320

AREA (pk)
Σ AREA (pk)
Nota: el % de área y del pico conducen a menudo a resultados
incorrectos. Esta técnica asume que todos los máximos dan
respuesta equivalente y y que todos los picos detectables
representan el 100% de la muestra, Estas 2 suposiciones
raramente son ciertas.
Cuantificación por - estándar externo

Principio:

• Se utilizan compuestos de referencia, preparando soluciones

estándar con concentraciones conocidas.
• La respuesta se determina por área o altura
• La respuesta se grafica contra las cantidades conocidas

Respuesta respuesta

Respuesta x

cantidad

Cantidad x
Cálculos por el método del estándar externo

Cuentas de
área Área % FR
C12 250 20.2 25/250 = 0.100
C14 290 23.4 25/290 = 0.086
C16 330 20.6 25/330 = 0.076
C18 370 29.9 25/370 = 0.068
1240 100.0

Calibración de una muestra estándar externo que contiene 25 ng de cada uno C-12, C-14, C-16, C-
18 (FAME )
El factor de respuesta es usado para determinar la cantidad de cada componente en la muestra que
contiene cantidades desconocidas de C-12, C-14, C-16, y C-18

FACTOR DE RESPUESTA = CANTIDAD / AREA

CANTIDAD DESCONOCIDA = AREA (pk) X RF(pk)

El factor de respuesta considera que las cantidades iguales no dan respuesta

igual al detector.
NOTA: EL ESTÁNDAR EXTERNO REQUIERE VOLUMENES DE INYECCIÓN REPRODUCIBLES
Calibración con un punto y múltiples puntos

C A
C A
C A B
A B
B
B

1 0.5 1.5 1.5 1.0 2.0 2.0 1.5 3.0 3.0 2.0 4.0

LEVEL 1 LEVEL 2 LEVEL 3 LEVEL 4

SINGLE POINT FOR

COMPONENT A
AREA/HEIGHT

Level 4

Level 3

AREA/HEIGHT
Level 2

Level 1
Area
Response of
Unknown

CONCENTRATION CONCENTRATION
Calculated
Amount MULTI-LEVEL FOR
COMPONENT C
Cuantificación por - estándar interno
Principio:
Un compuesto característico que no esta presente en la
muestra se agrega en concentración conocida a las
soluciones, estándar y a la muestra.
- Se calcula el cociente de la respuesta del ISTD y del analito.
- Se grafica el cociente de la respuesta contra el cociente de la
cantidad.
Relación de la
ISTD respuesta
5
R
e
s
p 2
o 3
n
1 4
s
e 6

time
Cantidad del Relación de
compuesto 5 ? cantidad
Cálculos con el estándar interno
Calibración Calibración de un solo punto de un
Cuentas de muestra
área FR
Estándar que contiene 25 ng de cada
C12 250 0.100
compuesto,
C14 290 0.086
Calibración por un solo punto de una
C15 310 0.081
muestra estándar que contiene
C16 330 0.076
25 ng de C-12, C-14, C 15, C-16, C-18
C18 370 0.068
donde el
C – 15 actúa como estándar interno
Muestra
desconocida
Cuentas de FR X Área ISTD CONC ISTD
área (ESTD) AREA ISTD X FR ISTD Resultado
C12 280 28.0 ng X 1.10 = 30.8 ng
C14 250 21.5 ng X 1.10 = 23.7 ng
C15 280 22.7 ng X 1.10 = 25.0
C16 220 16.7 ng X 1.10 = 18.4
C18 320 21.8 ng X 1.10 = 24.0 ng
ISTD Factor de Corrección : 25 / 22.7 = 1.10
 Cálculos con el estándar interno

Relación de Respuesta = Respuesta x

Respuesta ISTD

Cantidad de x = ( Relación de la respuesta * FR x) *(cantidad ISTD) *

M*D

RF x = factor de respuesta del componente x

M = multiplicador
D = factor de dilución
Cuantificación - estándar interno

Requerimientos para EL ESTÁNDAR INTERNO

• El compuesto no debe estar presente en la muestra

• El compuesto debe separarse bien del resto de
compuestos en el cromatograma
• El compuesto debe ser estable
• Las propiedades químicas y físicas deben ser similares a
las del analito.
Criterios para elegir el estándar interno.

• No debe estar presente en la muestra.

• Fácilmente disponible
• Químicamente similar a la muestra.
• Encontrase en el rango de concentración de la muestra
• No reaccionar con la muestra.
• No eluir cerca de los compuestos de interés
• Picos limpios y aislados
• Cromatograficamente estable.
Precisión y exactitud

Precisión + Calibración = Exactitud

• Precisión
medida de la reproducibilidad, la
cual depende de la habilidad para
xx definir y controlar las condiciones
xx del instrumento de análisis
• Exactitud
dependiente del sistema de
calibración con estándares
confiables

Buena precisión y mala exactitud.

Buena exactitud, pero mala precisión .

x Buena precisión y exactitud