EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE 3 DESINFECTANTES, FRENTE A

CEPAS DE Listeria monocytogenes AISLADAS DE INDUSTRIA CÁRNICA

COLOMBIANA

ANDRÉS FERNANDO HERRERA DE LA HOZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D. C., 23 de Mayo de 2011

1
 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE 3 DESINFECTANTES, FRENTE A
CEPAS DE Listeria monocytogenes AISLADAS DE INDUSTRIA CÁRNICA
COLOMBIANA

ANDRÉS FERNANDO HERRERA DE LA HOZ

APROBADO

JANETH ARIAS
Directora carrera Microbiología Industrial

INGRID SCHULLER
Decana Académica

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C., 23 de Mayo de 2011

2
 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE 3 DESINFECTANTES, FRENTE A
CEPAS DE Listeria monocytogenes AISLADAS DE INDUSTRIA CÁRNICA
COLOMBIANA

ANDRÉS FERNANDO HERRERA DE LA HOZ

ANA KARINA CARRASCAL

Directora de Tesis

DEYCI RODRIGUEZ
Jurado evaluador

3
 NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos

emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis.
Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica
y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

4
0. TABLA DE CONTENIDO

1. Resumen (pág.7)
2. Introducción (pág.8)
3. Justificación (pág.9)
4. Marco teórico (pág.9)
4.1. Producción de derivados cárnicos en Colombia (pág. 9)
4.2. Prevalencia en Colombia de L. monocytogenes en derivados cárnicos
(pág.10)
4.3. Limpieza y desinfección en la industria de derivados cárnicos
(pág.10)
4.4. Desinfectantes (pág.11)
4.4.1. Sales de Amonio Cuaternario (QAC‟s) (pág.11)
4.4.2. Guanidinas y Biguanidinas (pág.11)
5. Objetivos (pág.12)
5.1. Objetivo general (pág.12)
5.2. Objetivos específicos (pág.12)
6. Metodología (pág.12)
6.1. Diseño de la Investigación (pág.12)
6.1.1. Hipótesis (pág.12)
6.1.2. Prueba de Hipótesis (pág.12)
6.1.3. Población de Estudio y Muestra (pág.12)
6.1.3.1. Población universo (pág.12)
6.1.3.2. Población en estudio (pág.13)
6.1.3.3. Población muestra (pág.13)
6.1.4. Muestreo (pág.13)
6.1.5. Variables de estudio (pág.13)
6.2. Procedimiento (pág.13)
6.2.1. Suspensión bacteriana (pág.13)
6.2.1.1. Cultivos de primera generación de los organismos de prueba
(pág.13)
6.2.1.2. Cultivos de trabajo de los organismos de prueba (pág.13)
6.2.1.3. Suspensión bacteriana de prueba (pág.14)
6.2.1.4. Recuento de las suspensiones bacterianas de prueba (pág.14)
6.2.2. Solución del producto sometido a prueba (pág.14)
6.2.3. Solución Neutralizante (pág.15)
6.2.4. Método de dilución-neutralización (pág.15)
6.2.4.1. Generalidades (pág.15)
6.2.4.2. Procedimiento de prueba para verificar la actividad bactericida
de los productos (pág.15)
6.2.4.3. Recuento de la mezcla de la prueba (pág.15)
6.2.5. Cálculo de la disminución de viabilidad en la mezcla de prueba
(pág.15)
6.2.6. Cálculo del porcentaje de efectividad de cada concentración de
desinfectante (Análisis estadístico) (pág.16)
7. Resultados (pág.16)
7.1. Resultados (pág.16)
7.2. Resultados del análisis inferencial (pág.17)
8. Discusión (pág.17)
9. Conclusión (pág.21)

5
10. Recomendaciones (pág.21)
11. Bibliografía (pág.22)
12. Anexos (pág.24)

6
 1. RESUMEN

Para evitar problemas de salud pública y favorecer el desarrollo del sector

económico de derivados cárnicos, en Colombia, se debe llevar a cabo la
implementación adecuada de procesos de limpieza y desinfección, lo que
implica calificar los agentes desinfectantes utilizados en su desarrollo, de
manera que se eviten adaptaciones de resistencia en Listeria monocytogenes o
su persistencia en las instalaciones de procesamiento. Por ello, en el presente
estudio y mediante la aplicación de la NTC 5150, se determinó la efectividad
bactericida en suspensión, de 3 desinfectantes con Alquil-dimetil-bencil cloruro
de amonio (ADCA), Poli hexametilen-biguanida (PHMB) y Cloruro de
Cetilpiridinio (CCP), como principio activo, sobre 40 cepas de L.
monocytogenes aisladas de industrias cárnicas Colombianas. Según los
resultados obtenidos y los parámetros del estudio, los desinfectantes que
demostraron ser inefectivos fueron: el desinfectante B, a base de PHMB, en
todas sus concentraciones (B1, 0.5% v/v; B2, 1% v/v; B3, 2% v/v) y tiempos de
contacto evaluados (5 y 15 minutos); y el desinfectante C, a base de CCP, en
un tiempo de contacto de 5 minutos, para las concentraciones C1 (0.2% v/v) y
C2 (0.4% v/v;). Al presentarse tolerancia en varias de las cepas obtenidas de
chorizo, canal de cerdo y utensilios para el procesamiento de carne, se
presume su posible persistencia en las instalaciones de origen. Se considera al
uso de dosis sub-letales, como la principal causa del fenómeno de adaptación
evidenciado sobre el desinfectante A y especialmente sobre el B.

1. ABSTRACT

In order to avoid public health problems and promote economic development

sector of meat products in Colombia, it is necessary to carry out a process of
cleaning and disinfection, this require an evaluation and description of the
disinfecting agents used in its implementation as a way to avoid the
development of resistance adaptation on Listeria monocytogenes or its
persistence in the processing places. Therefore, in this study and by applying
NTC 5150, were investigated the bactericidal effect in suspension of 3
disinfectants with Bencyl Alkyl-dimethyl-ammonium chloride (ADCA),
Polyhexamethylene-biguanide (PHMB) and Cetylpiridinium Chloride (CCP) as
active agent, trough the implementation of the suspension test described in the
NTC 5150, on 40 L. monocytogenes strains, isolated from Colombian meat
industries. According to the results obtained and the study parameters,
disinfectants proved to be ineffective were: the B disinfectant, with PMHB as
active agent, in all the concentrations (B1, 0.5% v/v; B2, 1% v/v; B3, 2% v/v)
and contact times (5 and 15 minutes) evaluated; and the C disinfectant, with
CCP as active agent, in a contact time of 5 minutes and for the C1 (0.2% v/v)
and C2 (0.4% v/v;) concentration evaluated. The evidenced tolerance on some
strains of L. monocytogenes obtained from hog carcass, sausages and meat
processing utensils, it is presumed a possible persistence of those strains on
the meat-processing facilities where they come from. It is considered the use of
sub-lethal doses, as the main cause of the phenomenon of adaptation shown
on the disinfectant A and especially on the B.

7
2. INTRODUCCIÓN

L. monocytogenes, es un microorganismo patógeno emergente de gran

importancia para la industria de procesamiento de carnes por su capacidad
para convertirse en microorganismo persistente de sus instalaciones („„in-house
flora‟‟) y en un contaminante habitual de sus productos terminados, de acuerdo
a varias de sus cualidades inherentes como: 1. Su naturaleza como
microorganismo ubicuo y habitante común del intestino de ganado ovino,
porcino y caprino; 2. Su capacidad para crecer en condiciones de anaerobiosis,
pH ácido (4.2), salinidad y temperaturas de refrigeración (hasta de 0ºC); 3. y
especialmente por su capacidad de adhesión a diferentes tipos de superficies,
por medio de la formación de películas (1-3). Tan relevante es su capacidad de
supervivencia en las instalaciones de procesamiento de derivados cárnicos,
que recientemente se han desarrollado varios estudios por organizaciones
como la FAO (Food and Agriculture Organization), la Organización Mundial de
la Salud, la FDA (Food and Drug Administration) y la Secretaría Distrital de
Salud (SDS) de Bogotá, para determinar estrategias para su control (1).

En el caso particular del estudio llevado a cabo por la SDS de Bogotá, entre
Septiembre de 2001 y Agosto de 2004, el resultado de prevalencia para L.
monocytogenes encontrado de 11.7% y el alto índice de no aceptabilidad de los
derivados cárnicos evaluados, reflejó importantes problemas en la calidad de
sus materias primas y/o sus procesos de manipulación, que pueden ser
responsables de contaminación tanto de las instalaciones de procesamiento
como del producto en sí (4). Para evitar este tipo de inconvenientes, es
fundamental llevar a cabo procesos de limpieza y desinfección, en las
instalaciones de la industrias cárnica, cuya efectividad esté garantizada por
procedimientos de validación y en los cuales se califique la adecuada actividad
bactericida de los agentes desinfectantes utilizados.

En Colombia, actualmente existe la norma NTC 5150 del ICONTEC

específicamente desarrollada para calificar la actividad bactericida de
desinfectantes utilizados en plantas alimentos y que describe un método en
suspensión para determinar esta capacidad in vitro, según la disminución en la
concentración celular, de los microorganismos utilizados, luego de realizada la
prueba (5). Para calificaciones que provean información “in situ”, más cercana
al desempeño en campo de los agentes desinfectantes no existen en el país
normas que describan esta clase de procedimientos, pero el Comité Europeo
de Normalización (CEN), de donde la norma original proviene (Norma UNE EN
1040:1997), propone normas adicionales que se desarrollan en fases
posteriores a los resultados del desarrollo de ensayos como el de la NTC 5150
(6).

En el presente estudio, se calificó la actividad bactericida de tres desinfectantes

utilizados en industrias cárnicas Colombianas (dos a base de Amonio
Cuaternario y uno a base de Biguanidas, como componente activo), sobre 40
cepas de L. monocytogenes aisladas de distintas plantas para la elaboración
de derivados cárnicos, de acuerdo a la norma NTC 5150.

8
3. JUSTIFICACIÓN

Las tendencias actúales que rigen el consumo de alimentos, exigen cada vez
más una gama de alimentos de calidad, nutritivos y de fácil preparación. Los
consumidores disponen de menos tiempo para ocuparlo en la preparación de
comida o en cenas en su lugar de residencia, por ello su creciente interés en
alimentos que requieran de poca o ninguna preparación post-compra, para ser
consumidos (7). Como ejemplo actual de este tipo de alimentos, se encuentran
en el mercado aquellos derivados cárnicos (jamones, salchichas, mortadelas, -
etc.) denominados como Listos Para Consumo (LPC) y que por sus
características inherentes (consumo normalmente en crudo; ausencia de
cocción o de cualquier otro tipo de elaboración adicional luego de su compra, -
etc.) son considerados como susceptibles para ser el sustento de diferentes
tipos de microorganismos patógenos, incluyendo a L. monocytogenes (3).

Para evitar que este tipo de derivados cárnicos, sufran contaminaciones por L.
monocytogenes, mediante el Decreto 3075 de 1997 (8) y el Decreto 1500 de
2007 (9) son exigidas materias primas de excelente calidad y programas de
limpieza y desinfección que se lleven a cabo en las plantas de procesamiento
de carnes, como estrategia para el control de bacterias alteradoras y
especialmente de aquellas formadoras de biopelículas. Pero aunque este
proceso debería ser suficiente para este objetivo, distintos factores como la
inadecuada utilización de desinfectantes, ha generado inconvenientes de
tolerancia frente a ellos e ineficacia en la eliminación de este tipo de
microorganismos; el uso de concentraciones menores a las necesarias para
alcanzar un efecto letal suficiente, en el tiempo de desinfección utilizado,
permiten la supervivencia de la cantidad indicada de microorganismos que
puedan desarrollar mecanismos de tolerancia mediante adaptaciones
fenotípicas, alteraciones genéticas o mediante la adquisición de genes, que
generen cualidades de resistencia a futuros procesos de desinfección (10).
Para prevenir esta clase de inconvenientes y disminuir la probabilidad de
problemas de contaminación durante el procesamiento de alimentos, se
necesita predecir la efectividad en planta de los agentes desinfectantes
utilizados y dar sustento a su uso como herramienta adecuada en el control de
microorganismos indeseables, según pruebas de calificación de desinfectantes
indicadas por organismos de Normalización indicados (11-13).

4. MARCO TEÓRICO

4.1. Producción de derivados cárnicos en Colombia

La estructura productiva de la cadena de cárnicos en Colombia, inicia con la
cría y engorde del ganado (vacuno, porcino, aves de corral, etc.); continúa con
su transporte, sacrificio, corte, congelación y comercialización para la
producción de carnes u otros subproductos como grasas, sebos y sangre; y
termina con la elaboración de productos como carnes embutidas, arregladas y
frías. La comercialización y transporte se realiza en varias etapas de la cadena,
comenzando en el momento en que los animales son llevados desde las fincas
hasta los mataderos o plantas de beneficio y de ahí, hasta los centros de
procesamiento y/o centros de consumo final. Por último los productos y

9
subproductos cárnicos son distribuidos a través de hipermercados, tiendas
especializadas y tiendas al detal (14).

Para el período comprendido entre los meses de octubre y diciembre de 2010,

el sacrificio de ganado vacuno representó una variación positiva de 4,3% y
4,7% en la cantidad de cabezas sacrificadas y peso en canal respectivamente,
en comparación con el mismo período del año 2009. De igual manera y en el
mismo período, el sacrificio de porcinos representó una variación positiva de
9,0% en cabezas y de 12,7% de peso en canal (15). Así mismo, la producción
de carnes frías y embutidas resultó en una variación positiva, según los últimos
datos reportados por el Departamento de Planeación Nacional (DPN) para el
período comprendido entre los años 2006 a 2007 y en los cuales el valor de la
producción en miles de pesos llegó a ser de 916.299.948 y 992.467.324,
respectivamente (16). Aunque se considera que la producción ganadera de
carne y sus derivados alcanza a satisfacer la demanda del mercado local, la
admisibilidad de los productos cárnicos colombianos en el mercado
internacional se encuentra frenada por debilidades en estándares de
productividad y de competitividad, especialmente a nivel sanitario (17).

Para solucionar los inconvenientes que están interrumpiendo los avances

alcanzados por la industria cárnica colombiana a nivel comercial, en el 2010 se
expidió el documento aprobado del Consejo Nacional de Política Económica y
Social (CONPES) 3676, en el que se determinan las estrategias para la lograr
la admisibilidad de los productos cárnicos colombianos en los mercados de
interés y para alcanzar el principal objetivo del documento: “consolidar la
política sanitaria y de inocuidad para las cadenas de la leche y carne bovinas
como componente esencial de la competitividad del sector, del mejoramiento
de la salud pública y del acceso real a los mercados nacional e
internacional”(17).

4.2. Prevalencia en Colombia de L. monocytogenes en derivados

cárnicos
En el documento CONPES 3676 de 2010, se reconocen varios inconvenientes
sanitarios, cuya formulación se fundamenta en resultados de estudios llevados
a cabo en la última década, sobre el seguimiento a microorganismos patógenos
(1). Particularmente en la producción de cárnicos, el estudio de prevalencia de
L. monocytogenes en derivados cárnicos, llevado a cabo por la SDS de Bogotá
durante el 2001 al 2004, arrojó como resultado una prevalencia general del
11.2% de este patógeno en 1075 muestras de derivados cárnicos LPC, y un
37.7% de no aceptabilidad microbiológica de las 1611 muestras de derivados
cárnicos analizadas. Entre las diferentes causas propuestas por el estudio,
principalmente se encuentran fallas en la manipulación, las materias primas y
posibles contaminaciones cruzadas con microorganismos indeseables (4),
todas ellas relacionadas con consecuentes contaminaciones de las
instalaciones de procesamiento.

4.3. Limpieza y desinfección en la industria de derivados cárnicos

La limpieza y desinfección es un proceso obligatorio en las instalaciones de
elaboración de derivados cárnicos, donde el tipo de materia prima y suciedad
generada favorece la proliferación de L. monocytogenes, en superficies (18).

10
Este proceso consta de manera general de dos etapas consecutivas para
cumplir su principal objetivo de producir productos seguros y aumentar su
calidad y vida útil: 1º) Una etapa “mecánica”, en la que se remueven residuos
de materia orgánica y 2º) Un etapa de desinfección, en la que las superficies
limpias entran en contacto con un desinfectante, a una concentración y por un
tiempo indicado. Se considera, que para que este proceso genere el efecto
esperado, las características de ambas etapas deben ser determinadas de
manera cuidadosa y de acuerdo a resultados de pruebas de eficacia
preliminares y respectivas (13).

4.4. Desinfectantes
Los desinfectantes son agentes antimicrobianos que a diferencia de los
antibióticos no poseen una especificidad alta y buscan eliminar una gran
variedad de microorganismos, en diferentes tipos de industrias (19). Su
efectividad depende de factores como la carga antimicrobiana, el pH, la dureza
del agua, el tipo de microorganismo objetivo, la formación de Biofilms, su
concentración, el tiempo de contacto, entre otros muchos factores (20).

Cualquier tipo de desinfectante utilizado en la industria de alimentos, debe ser

elegido según el tipo de proceso llevado a cabo, el tipo de material de sus
superficies, y el tipo de microorganismos predominantes y su desarrollo.
Además, debe presentar ciertas características, como: no liberar residuos
tóxicos o que afecten las propiedades sensoriales del alimento, ser efectivo,
seguro, fácil de usar y de enjuagar (19). De manera particular, en el presente
estudio únicamente se evaluaron dos tipos de ellos.

4.4.1. Sales de Amonio Cuaternario (QAC)

Estos tipos de desinfectantes también denominados quats, son compuestos de
amonio en los que el Nitrógeno se encuentra unido a cuatro compuestos
orgánicos. El Nitrógeno adquiere una carga positiva y junto a sus cuatro
radicales orgánicos forman la parte catiónica de la molécula, generalmente, su
parte aniónica viene siendo un radical de Cloro o Bromo. Aunque su
mecanismo de acción no está completamente comprendido, se cree que actúa
rodeando la membrana externa de la célula y generando daños en la integridad
estructural de la pared, esto produce, rompimiento gradual de la pared celular,
liberación de componente internos y/o inhibición de actividad enzimática. Entre
sus ventajas se encuentran: ser inodoro e incoloro; no ser tóxico, ni corrosivo,
ni irritante; ser altamente estable en diferentes temperaturas, el tiempo y frente
a residuos de materia orgánica; presentar capacidad de penetración y de
actividad residual (21).

4.4.2. Guanidinas y Biguanidinas

Las Guanidinas o las Guanilguanidinas (Biguanidinas), son bases que
presentan fuertes reacciones alcalinas en medio acuoso y forman sales con
sustancias ácidas. De acuerdo con sus radicales alquilo, presentan distintas
actividades antimicrobianas y cualidades químicas. Entre las biguanidas más
utilizadas como desinfectantes se encuentran las del tipo PHMB, polímeros de
Guanilguanidinas que actúan uniéndose a componentes aniónicos de
membrana para bloquear su funcionamiento. Entre sus ventajas se encuentran

11
el generar menor cantidad de espuma que los QACs, su baja toxicidad y su
particular efectividad frente a bacterias (22).

5. OBJETIVOS

5.1. General
Determinar la eficacia de 3 desinfectantes, sobre cepas de L. monocytogenes
aisladas de distintas plantas de procesamiento de productos cárnicos, y
entendida como la reducción en 5Ulog bajo las condiciones de prueba de la
NTC 5150.

5.2. Objetivos específicos

 Establecer la concentración más efectiva del desinfectante A, a base de
ACBA, sobre cepas de L monocytogenes aisladas de distintas plantas de
procesamiento de productos cárnicos, según su respectivo porcentaje de
efectividad.
 Establecer la concentración más efectiva del desinfectante B, a base de
PHMB, sobre cepas de L monocytogenes aisladas de distintas plantas de
procesamiento de productos cárnicos, según su respectivo porcentaje de
efectividad.
 Establecer la concentración más efectiva del desinfectante C, a base de
CCP, sobre cepas de L monocytogenes aisladas de distintas plantas de
procesamiento de productos cárnicos, según su respectivo porcentaje de
efectividad.

6. METODOLOGÍA

6.1. Diseño de la Investigación

6.1.1. Hipótesis

Hipótesis de nulidad (Ho): La concentración recomendada por el fabricante

no inhibe el 90% de las cepas de L. monocytogenes, en el tiempo evaluado

Ho: μ ≤ 90 %

Hipótesis alterna (Hi): La concentración recomendada por el fabricante inhibe

más del 90% de las cepas de L. monocytogenes, en el tiempo evaluado

Hi: μ > 90 %

Nota: el resultado se estimo para un 95% de confianza

6.1.2. Prueba de Hipótesis

La prueba de hipótesis para proporciones, se desarrollo utilizando la
herramienta de Excel MegaStat versión 10.1 2/14/2007.

6.1.3. Población de Estudio y Muestra

6.1.3.1. Población universo
Cepas de L. monocytogenes encontradas en plantas de procesamiento de
productos cárnicos

12
6.1.3.2. Población en estudio
Cepas de L. monocytogenes encontradas en plantas de procesamiento de
productos cárnicos, en Colombia.

6.1.3.3. Población muestra

40 cepas aisladas de distintas plantas de procesamiento de cárnicos en
Colombia (El número de cepas evaluadas, según su fuente, se resume en la
Tabla Anexa 3.)

6.1.4. Muestreo
Las 40 cepas utilizadas en el estudio, se obtuvieron a partir del banco de cepas
de L. monocytogenes aisladas de distintas plantas de elaboración de derivados
cárnicos. El muestreo se realizó a conveniencia con las primeras 40 cepas
identificadas como L. monocytogenes.

6.1.5. Variables de estudio

Tabla 1. Descripción de las variables de estudio

Tipo de Unidad de
Variable Descripción
variable Medida
Independiente Tipo de desinfectante Cualitativa Nominal -
Concentración de cada Cuantitativa continua
Independiente g/L, %m/v
desinfectante de razón
Disminución de la Cuantitativa continua
Dependiente UFC/ml
concentración celular de razón
Efectividad de
Efectivo/No
Dependiente desinfección (>5 Cualitativa nominal
efectivo
Ulog/tiempo de contacto)
6.2. Procedimiento
Para la evaluación de la actividad bactericida de cada desinfectante se llevó a
cabo la metodología descrita por la NTC 5150 (5)

6.2.1. Suspensión bacteriana

6.2.1.1. Cultivos de primera generación de los organismos de prueba
Los cultivos de primera generación, se obtuvieron a partir del banco de L.
monocytogenes recuperadas de plantas de procesamiento de cárnicos, del
laboratorio de microbiología de alimentos de la Pontificia Universidad
Javeriana.

6.2.1.2. Cultivos de trabajo de los organismos de prueba

Para preparar el cultivo de trabajo de cada cepa de L. monocytogenes, se
subcultivó a partir de los cultivos de primera generación (véase el numeral
6.2.1.1) mediante siembra masiva sobre medio TSAYE fundido en placas Petri.
Cada siembra se incubó por 18 h - 24 h a 37 ± 1 °C, para su uso como fuente
de la suspensión bacteriana de prueba. En caso de no poderse utilizar el
primer subcultivo de trabajo, no se repitieron más de 3 repiques de cada
subcultivo. Los repiques se hicieron siempre y cuando estos hubiesen sido
mantenidos todo el tiempo en el incubador.
13
6.2.1.3. Suspensión bacteriana de prueba
A partir del cultivo de trabajo de cada cepa de L. monocytogenes recuperada
(véase el numeral 6.2.1.2), ser realizaron suspensiones de prueba en tubos de
vidrio tapa rosca y con 20 ml de Agua Triptona Bufferada. Cada suspensión fue
homogenizada y llevada hasta una concentración de 10 8 UFC/ml con ayuda del
patrón Numero 1 de Mc Farland (3*108 UFC/ml). Cada suspensión de prueba,
se mantuvo a 20 °C±1 °C en baño termostatado con agua y se utilizó antes de
2 h.

Para el control de la concentración de cada suspensión bacteriana de prueba,

se prepararon diluciones 10-6 y 10-7, utilizando como diluyente Agua Triptona
Bufferada. Cada dilución fue sembrada por profundidad en medio TSAYE
fundido y por duplicado, para su recuento posterior luego de 24 – 48 horas de
incubación a 37 ± 1 °C

6.2.1.4. Recuento de las suspensiones bacterianas de prueba

Para el recuento de las suspensiones bacterianas de prueba, se desecharon
todas aquellas que no permitieron su recuento. Las placas presentes en cada
caja, se contaron hasta un máximo de 300 colonias para determinar el número
de unidades formadoras de colonias (UFC) en cada una, a las 24 y 48 horas. El
número de colonias a tener en cuenta, luego de ambos recuentos, fue aquel
que presentará el número más alto de colonias para cada muestra. La
determinación del número de unidades formadoras de colonias se realizó
según el anexo 1.

6.2.2. Solución del producto sometido a prueba

Para la prueba se utilizaron 3 desinfectantes distintos (A, B y C) y cada uno se
probó en tres concentraciones distintas dentro del rango de trabajo
recomendado por el fabricante (ver Tabla 2). La menor concentración
trabajada para cada desinfectante, es la más baja de su rango de trabajo y la
mayor la más alta.

Tabla 2. Compuestos activos de cada desinfectante utilizado para la prueba de dilución-

neutralización y respectivas concentraciones de prueba

Desinfectante Compuesto Activo Concentraciones de prueba

Alquil dimetil bencil cloruro (A1) (A2) (A3)
A
de amonio 0.5%v/v 2%v/v 3%v/v
(B1) (B2) (B3)
B Poli hexametilen biguanida
0.5%v/v 1%v/v 2%v/v
(C1) (C2) (C3)
C Cloruro de Cetilpiridinio
0.2%v/v 0.3%v/v 0.4%v/v

Para la preparación de cada solución desinfectante de prueba, se utilizaron

aforos de 100ml y como diluyente se utilizó agua destilada. Las
concentraciones de desinfectante de prueba preparadas fueron 1.25 veces las
concentraciones de prueba trabajadas. De la solución desinfectante de prueba
preparada, se colocaron 8ml en tubos de vidrio junto con 1ml de agua
destilada. Los 9 ml resultantes, fueron tomados como la solución de prueba
para cada desinfectante y utilizados durante un tiempo no superior a 8 horas.
14
6.2.3. Solución Neutralizante
En principio, para cada tipo de desinfectante evaluado, se validó un
neutralizante adecuado, de acuerdo al procedimiento descrito en el Anexo 2. El
neutralizador validado para 5 min ± 10 s de contacto de neutralización, resultó
ser una solución de polisorbato 80 (30 g/l), laurilsulfato de sodio 4 (g/l) y lecitina
(3 g/l); como diluyente se utilizó una disolución tampón de fosfato (KH 2PO4,
0.25 mol/l) ajustada a pH 7,2 ± 0,2 con NaOH 1 mol/l en agua. Para la
preparación de la solución neutralizante, 8ml del neutralizante se colocaron en
tubos de vidrio junto con 1ml de agua destilada.

6.2.4. Método de dilución-neutralización

6.2.4.1. Generalidades
Antes de arrancar la prueba, se permitió que todos los reactivos (solución del
producto a prueba, suspensión bacteriana de prueba, neutralizador) alcanzaran
el equilibrio térmico a la temperatura de 20°C ± 1°C, utilizando un baño de agua
controlado a esa temperatura. El resto del ensayo se condujo bajo estas
condiciones de temperatura.

6.2.4.2 Procedimiento de prueba para verificar la actividad bactericida

de los productos
Una vez los reactivos alcanzaron la temperatura indicada, 1ml de la suspensión
del microorganismo se añadió al tubo con 9ml de la solución desinfectante de
prueba, se mezcló e inmediatamente se inicio la medición del tiempo con un
cronómetro. La solución resultante se volvió a colocar en el baño de agua
controlado.

Después de transcurridos 5 min (1er tiempo de contacto), 1 ml de la solución

anterior, se transfirió al tubo con 9 ml de la solución neutralizante. Luego de 5
min ± 10 s de neutralización, 1 ml de esta solución se recuperó y se sembró en
profundidad y por duplicado en Agar TSAYE, la incubación de llevó a cabo
durante 48h a 36 ± 1ºC.

El mismo procedimiento se realizó para el 2º tiempo de contacto (15 min).

6.2.4.3. Recuento de la mezcla de la prueba

Para el recuento de la mezcla de prueba, se desechó cualquier placa que no
permitiera su recuento. Las placas presentes en cada caja, se contaron hasta
un máximo de 300 colonias para determinar el número de UFC en cada una a
las 24 y 48 horas, el número más alto de colonias para cada caja, luego de
cada tiempo, fue el tenido en cuenta. La determinación del número de unidades
formadoras de colonias se realizó mediante la ecuación 1.

Ecuación 1. Ecuación para calcular el recuento viable de la mezcla de prueba, el factor de

-1
dilución es 10 . (Rp = Recuento de prueba; c = Sumatoria del numero de colonias en cada
placa; n = número de placas tenidas en cuenta para el recuento) (5)

6.2.5. Cálculo de la disminución de viabilidad en la mezcla de prueba

15
Para el cálculo de la disminución de la viabilidad se utilizó la ecuación 2.

Ecuación 2. Ecuación para calcular la reducción de viabilidad en la mezcla de prueba. (Ri =

Recuento inicial de la suspensión de prueba; Rp = Recuento de mezcla de prueba) (5)

La reducción de la viabilidad de cada caso (tiempo de contacto y

concentración, de cada desinfectante) se consideró efectiva, sí luego de la
prueba la disminución fuese mayor a 5 Ulog.

6.2.6. Cálculo del porcentaje de efectividad de cada concentración de

desinfectante (Análisis estadístico)

Para un nivel (cada tiempo de contacto):

Nota: Para cada concentración y tiempo de contacto.

Ecuación 3. Ecuación para calcular la efectividad de cada concentración de desinfectante,
para cada tiempo de contacto (EC = Porcentaje de efectividad). Para conocer el número de
cepas analizadas según origen, ver Anexo 3.

Para dos niveles (para cada tiempo de contacto y cada fuente de origen), se
utilizó la ecuación 3. pero tomando el total de cepas con disminuciones
efectivas de viabilidad, para cada origen de muestra (ver Anexo 3.), cada
tiempo de contacto y cada concentración de desinfectante evaluada.

El tiempo de contacto y la concentración, de cada desinfectante, se consideró

efectiva, si el porcentaje obtenido en el estudio brindó resultados suficientes
para afirmar su efectividad en más del 90% de los casos que se evalúa, en
términos de significancia estadística y con una seguridad del 95%.

7. RESULTADOS

7.1. Resultados
Para el desinfectante A, el porcentaje de efectividad fue de 100% para todas
las concentraciones y tiempos de contacto evaluados, es decir fue capaz de
reducir 5 UL en todos los casos. Para el desinfectante C, en las
concentraciones C1 (0.2%v/v) y C2 (0.3%v/v) se presentaron reducciones
97.5% y de 95%, respectivamente, en las demás concentraciones la efectividad
fue del 100%.

En el caso del desinfectante B, la única concentración con el 90% de

efectividad, fue la concentración B3 (2%v/v) para 15 minutos de contacto, el
resto de las concentraciones evaluadas presentaron un porcentaje de

16
 efectividad igual o menor al 87.5%, sugiriendo que no es efectivo para las
cepas evaluadas (Ver gráfico 1 y 2).

Los porcentajes de efectividad de los desinfectante B y C, según la fuente el

origen de cada cepa evaluada, se encuentran en el gráfico 3 y 4
respectivamente. No se incluyeron los datos del desinfectante A por ser todos
del 100%.

Los porcentajes de efectividad que se encontraron por debajo del 90%, para el
desinfectante B, se presentaron en tres fuentes particulares (ver gráfico 3.):
chorizo (5/6 casos), canal de cerdo (6/6casos) y utensilios (5/6 casos); en
promedio el porcentaje de efectividad de aquellos casos por debajo del 90%,
fue del 83.3%, 81.82% y de 66,7 % respectivamente. Para el desinfectante C,
el único porcentaje de efectividad menor al 90%, se encontró en ensayos
realizados sobre cepas obtenidas de muestras de chorizo (ver gráfico 4.) y fue
del 83.3%.

Nota: casos hace referencia al número de concentraciones evaluadas para el desinfectante, en

cada tiempo de contacto

7.2. Resultados del análisis inferencial

De acuerdo a la prueba de hipótesis realizada para los porcentajes de
efectividad de cada concentración según el tiempo de contacto (Ver Gráfico 1 y
2.), únicamente las concentraciones que fueron efectivas sobre el total de las
cepas y que poseen un p<0.05 que brindan resultados suficientes para
confirmar una efectividad mayor al 90%, en términos de significancia
estadística fueron.: 1) todas las concentraciones evaluadas para el
desinfectante A; 2) todas aquellas evaluadas para el desinfectante C, en 15
minutos de contacto; y 3) la mayor concentración evaluada para el
desinfectante C (0.4%v/v), en 5 minutos de contacto.

5 minutos 15 minutos
100
100

80
Efectividad de Desinfección (%)

Efectividad desinfección (%)

80

Desinfectante A
60 60 Desinfectante B
Desinfectante C

40 40

20 20

0 0
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3

Concentraciones de cada desinfectante Concentraciones de cada desinfectante

Grafico 1 y 2. Porcentaje de efectividad en los tres desinfectantes evaluados (tiempo y concentración)

8. DISCUSIÓN

De acuerdo a los resultados obtenidos y según los términos del estudio, todas
las concentraciones evaluadas para el desinfectante A, a base de ACBA,

17
fueron efectivas (ver numeral 6.2.6.) además, los resultados de su desempeño
fueron muy similares a los obtenidos para el desinfectante C, cuyo principio
activo es el CCP (Ver Gráfico 1 y 2.). Aunque ambos desinfectantes poseen
una sal de Amonio cuaternario como principio activo, el número de carbonos
del radical alquilo del CCP pudo disminuir la capacidad de solubilidad del
desinfectante C y de manera proporcional su velocidad de acción en las
concentraciones de 0,2% v/v (C1) y 0,3% v/v (C2), para un tiempo de contacto
de 5 minutos (ver gráfico 1.) (23). El número de carbonos de los radicales
alquilo de los QACs puede aumentar su hidrofobicidad, y en consecuencia
limitar: a) la unión de su porción catiónica con fosfolípidos presentes en la
pared celular de L. monocytogenes, b) su ingreso hasta la membrana
citoplasmática y al interior celular, y c) su capacidad de alterar funciones de
permeabilidad y de actividades enzimáticas vitales para la célula (19, 22).

En estudios realizados sobre superficies de alimentos, el CCP ha sido evaluado

en salchichas (1%v/v) (23) o carne de res (0,5%v/v) (24); en ambos casos el
CCP demostró ser efectivo para la eliminación de L. monocytogenes. Un
estudio previo realizado en suspensión con el mismo principio activo, sobre
microorganismos como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans, demostró ser
efectivo únicamente frente a bacterias Gram-positivas, lo que fue corroborado
en este caso, por la efectividad observada del desinfectante C sobre las cepas
de L. monocytogenes (Gram positivas), evaluadas en el presente estudio (25).

En el caso del ACBA, un estudio de desinfección se llevó a cabo en suspensión

con L. monocytogenes (ATCC 13932 serotipo 4B) y se reportaron resultados
con la misma efectividad obtenida en el presente estudio (26), lo que corrobora
la eficacia del desinfectante A. En otros estudios llevados a cabo con
desinfectantes del mismo tipo (QACs), se ha demostrado la efectividad de
algunos de ellos sobre bacterias Gram-positivas como Staphylococcus spp. y
S. aureus, inclusive en pruebas prácticas de superficies cilíndricas de acero
inoxidable (27), pero en ciertos casos, a pesar de la efectividad observada
después de la prueba en suspensión para el QAC evaluado, el mismo resultado
no fue observado en pruebas siguientes y llevadas a cabo en superficies de
discos de acero inoxidable y de perlas de vidrio, demostrando que existen
variaciones relacionadas con el método empleado (28). Aunque pruebas in vitro
revelen resultados de efectividad, hay factores como la presencia de
biopelículas, la unión de células a una superficie o la presencia de materia
orgánica, que en el uso práctico de los desinfectantes, interfieren con su
actividad hasta el punto de hacer que su acción en campo genere resultados
distintos a los obtenidos en pruebas in vitro (29, 30).

18
 100 100 100

Efectividad Concentración 3 (%)

Efectividad Concentración 2 (%)
Efectividad Concentración 1 (%)

80 80 80

Chorizo
Canal de cerdo
60 60 60 Jamón
Salchicha
Utensilio
40 40 40 Carne

20 20 20

0 0 0
5 min 15 min 5 min 15 min 5 min 15 min

Tiempo de contacto (min) Tiempo de contacto (min) Tiempo de contacto (min)

Gráfico 3. Efectividad de cada concentración trabajada del desinfectante B, según fuente de origen de las cepas evaluadas.

100 100 100

Efectividad Concentración 1 (%)

Efectividad Concentración 2 (%)

Efectividad Concentración 3 (%)

80 80 80

60 60 60

40 40 40

20 20 20

0 0 0
5 min 15 min 5 min 15 min 5 min 15 min

Tiempo de contacto (min) Tiempo de contacto (min) Tiempo de contacto (min)

Gráfico 4. Efectividad de cada concentración trabajada del desinfectante C, según fuente de origen de las cepas evaluadas.

19
En el caso del desinfectante B, los porcentajes de efectividad obtenidos reflejan
deficiencias en su acción bactericida (ver gráfico 1 y 2.) y especialmente, sobre
las cepas de L. monocytogenes obtenidas a partir de 3 fuentes específicas:
chorizo, canal de cerdo y utensilios (Ver gráfico 4.). De manera similar, las
fallas presentadas en la efectividad del desinfectante C, se dieron también en 2
de las fuentes antes mencionadas: chorizo y canal de cerdo (Ver gráfico 5.). De
alguna manera, la tolerancia presentada por las cepas obtenidas de estas
fuentes, frente a estos dos desinfectantes, podría relacionarse con su
persistencia particular, en las instalaciones y equipos de las plantas de chorizo
y canal de cerdo muestreadas, debido a que en ciertos casos, la tolerancia de
L. monocytogenes frente a ciertos desinfectantes, ha sido atribuida a su posible
persistencia en ciertas instalaciones de procesamiento de cárnicos (31). De no
ser así, esta condición también podría ser atribuida a: a) fallas en el proceso de
rotación del desinfectante B (29, 31, 32) y/o a b) su uso en tiempos de contacto
y/o en concentraciones sub-letales (27). De ambas situaciones, es relevante
considerar que tratándose de tolerancia a desinfectantes, el evitar la segunda,
parece ser la herramienta más indicada y recomendada en la prevención de
generación de adaptaciones de supervivencia en microorganismos como L.
monocytogenes (33), porque aunque el empleo de rotación de desinfectantes
ha sido recomendado para este mismo objetivo, otros estudios también han
resaltado su ineficiencia (31) o incluso su responsabilidad en generar mayores
respuestas de adaptación en los microorganismos objetivo (28, 29, 33).

En estudios anteriores para desinfectantes con PHMB como principio activo,

algunos ensayos se han llevado a cabo en bacterias Gram positivas, como: S.
aureus (ATCC 6538), E. faecium (ATCC 6057) (34) y S. epidermidis (ATCC
17917) (35). En el caso de ensayos en suspensión, concentraciones del 0,02%
de PHMB demostraron ser efectivas en la eliminación de bacterias Gram
positivas como S. aureus y E. faecium, pero en este ensayo se evaluó el
desinfectante en proporciones mucho mayores al inoculo de prueba (0,1ml de
inoculo de 108 UFC/ml, por cada 10ml de solución desinfectante) (34). Por otro
lado, en ensayos de dilución en tubo, la acción del PHMB se reportó como
“pobre” frente a la eliminación S. epidermis, teniendo en cuenta la proporción
de inoculo/desinfectante (1ml/9ml) evaluada en este último ensayo (35), el
desempeño del PHMB podría ser más cercano al observado en el presente
estudio.

En cualquiera de los casos, la capacidad de tolerancia a PHMB podría deberse

a mecanismos de adaptación propios de L. monocytogenes, como bombas de
contraflujo o modificaciones en la composición de ácidos grasos de su
membrana (31, 33), o a características inherentes del PHMB como su tamaño
molecular, por ejemplo, al estar conformado por polímeros de generalmente 12
moléculas de hexametilen-biguanidas (22) y ser considerablemente mayor que
el ACBA y el CCP (ver anexo 4.), el PHMB podría presentar deficiencias en su
capacidad de penetración de las barreras celulares. De acuerdo a los
resultados del presente estudio el mecanismo particular de tolerancia al
desinfectante B no pudo ser establecido por no ser objeto de esta
investigación.

20
9. CONCLUSIÓN

De acuerdo a los parámetros del estudio, el único desinfectante que no

demostró ser eficiente en ninguno de los casos evaluados, fue el desinfectante
B; el desinfectante C únicamente demostró ser inefectivo en un tiempo de
contacto de 5 minutos, para las concentraciones C1 (0.2%v/v) y C2 (0.3%v/v).
En el resto de los casos, los desinfectantes A y C, a base de QCAs,
demostraron presentar una efectividad superior al 90% y de manera
estadísticamente significativa. En los casos que se presentó tolerancia de
algunas cepas de L. monocytogenes, este fenómeno podría deberse a factores
inherentes del microorganismo o a características propias de cada uno de los
principios activos, de cada desinfectante.

De manera descriptiva, no se encontró diferencia entre los porcentajes de

efectividad del desinfectante A, por lo que no se pudo determinar la
concentración y tiempo de contacto más efectivo, respectivamente. En el caso
del desinfectante B, ningún caso de ensayo resultó efectivo (Porcentaje de
efectividad >90%). Y en cuanto al desinfectante C: para los 5 minutos de
contacto, la concentración más efectiva fue la C3; para 15 minutos de contacto,
los porcentajes de efectividad fueron los mismos y la concentración más
efectiva no se pudo determinar.

La efectividad observada en esta prueba para los desinfectantes evaluados, se

determinó en condiciones ideales de desinfección y sin utilizar ninguna
condición limitante real de su acción bactericida, como: mayor concentración de
células, formación de biopelículas o presencia de materia orgánica interferente.
Debido a esto, los resultados obtenidos aunque no son suficientes para
respaldar la utilización en campo de estos desinfectantes, en cada uno de los
casos evaluados, sí lo son para descartarlo en caso de no haber cumplido con
el parámetro de efectividad establecido por el estudio; según las condiciones
de ensayo, su desempeño debió ser completamente satisfactorio.

Debido a la tolerancia que ciertas cepas de L. monocytogenes, de fuentes

particulares, presentaron frente a algunos de los desinfectantes evaluados,
cabe la posibilidad de que exista una relación directa entre estas cualidades de
tolerancia y la persistencia estas cepas, en las instalaciones de procesamiento
de cárnicos de donde se obtuvieron.

Por último, es importante resaltar, que la gran importancia de este tipo de

pruebas radica en su papel como herramienta de prevención del desarrollo de
capacidades de tolerancia a agentes desinfectantes, por microorganismos
patógenos como L. monocytogenes, debido a que evitan el uso de estas
sustancias en condiciones sub-letales y responsables de este tipo de
inconvenientes, muy posiblemente en mayor medida que la no rotación de
desinfectantes.

10. RECOMENDACIONES

Se recomiendan pruebas en superficie y en campo, de los desinfectantes que

cumplieron satisfactoriamente con los estándares de efectividad planteados en

21
el estudio, de manera que se sustente su desempeño adecuado, en
condiciones de campo. Además, se debería determinar la presencia de
adaptaciones de supervivencia, en las cepas tolerantes identificadas por el
estudio, ya que este tipo de mecanismos también podrían estar asociados con
la resistencia a antibióticos, por eso se sugiere relacionar las cepas que
presentaron tolerancia a ciertos desinfectantes, en el presente estudio, con
aquellas que presentaron resistencia a antibióticos en el estudio de Velazco
2010 (36), realizado anteriormente con las mismas cepas del presente estudio.

11. BIBLIOGRAFÍA

1. Codex Alimentarius. DIRECTRICES SOBRE LA APLICACIÓN DE

PRINCIPIOS GENERALES DE HIGIENE DE LOS ALIMENTOS PARA EL
CONTROL DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN LOS ALIMENTOS.
CAC/GL 61 – 2007, 30p.
2. Even H, Bjørn-Arne L, Ole-Johan R, Traute V, Georg K, Truls N. Molecular
epidemiology and disinfectant susceptibility of Listeria monocytogenes from
meat processing plants and human infections. International Journal of Food
Microbiology 2004; 96, 85– 96
3. FAO, OMS. Evaluación de riesgos de Listeria monocytogenes en alimentos
listos para el consumo - Resumen interpretativo. Serie de evaluación de
riesgos microbiológicos. 2004, 88p.
4. Vera H, Ferro CJ, Triana LM. Prevalencia de Listeria moncytogenes en
derivados cárnicos cocidos para consumo directo analizados en el
laboratorio de salud pública, Bogotá 1 de septiembre 2001‐ 31 agosto de
2004. 2006, 20p.
5. ICONTEC. NTC 5150: Antisépticos y desinfectantes químicos. actividad
bactericida básica. Método de prueba y requisitos (FASE 1). 2003, 34p.
6. Martinez J. What is Disinfectant Validation?
http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/article/articleDetail.jsp?id=3112
52 Consultado el 25 de Febrero de 2011.
7. Ortiz SM. El consumo y el consumidor Colombiano. IAlimentos 2011; 19, 10
8. Colombia, Presidencia de la República (1997), “Decreto 3075 de 1997, Por
el cual se reglamenta parcialmente la Ley 09 de 1979 y se dictan otras,
disposiciones”, en Diario Oficial, núm. 43205, 31 de Diciembre de 1997,
Bogotá.
9. Colombia, Ministerio de la Protección Social (2007, 4 de Mayo), “Decreto
número 1500 de 2007 (Mayo 4), por el cual se establece el reglamento
técnico a través del cual se crea el Sistema Oficial de Inspección, Vigilancia
y Control de la Carne, Productos Cárnicos Comestibles y Derivados
Cárnicos Destinados para el Consumo Humano y los requisitos sanitarios y
de inocuidad que se deben cumplir en su producción primaria, beneficio,
desposte, desprese, procesamiento, almacenamiento, transporte,
comercialización, expendio, importación o exportación”, en Diario Oficial,
núm. 46.618, 4 de mayo de 2007, Bogotá.
10. Chapman JS. Disinfectant resistance mechanisms, cross-resistance, and
co-resistance. International Biodeterioration & Biodegradation 2003; 51, 271
– 276
22
11. Buckingham-Meyer K, Goeres DM, Hamilton MA. Comparative evaluation of
biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods 2007;
70, 236–244
12. Holah JT, Lavaud A, Peters W, Dye KA. Future techniques for disinfectant
efficacy testing. International Biodeterioration & Biodegradation 1998; 41,
273-279
13. Wirtanen G, Salo S. Disinfection in food processing – efficacy testing of
disinfectants. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 2003;
2, 293–306
14. Departamento nacional de planeación (DNP). Cadenas productivas:
Estructura, comercio internacional y protección. DNP, Colombia. 2004,
516p.
15. Dane. Sacrificio de ganado: Comunicado de Prensa - IV trimestre de 2010.
http://www.dane.gov.co/files/investigaciones/boletines/sacrificio/cp_sacrificio
_IVTrim10.pdf Consultado el 25 de Febrero de 2011
16. DNP. Análisis de cadenas productivas – cárnicos.
http://www.dnp.gov.co/PortalWeb/LinkClick.aspx?fileticket=CqpNix4ZJ5E%3
d&tabid=996 Consultado el 25 de Febrero de 2011
17. CONPES. Documento CONPES 3676: Consolidación de la política sanitaria
y de inocuidad para las cadenas láctea y cárnica. Bogotá D.C., Colombia.
2010, 84p.
18. Navratilova P, Schlegelova J, Sustackova A, Napravnikova E, Lukasova J,
Klimova E. Prevalence of Listeria monocytogenes in milk, meat and
foodstuff of animal origin and the phenotype of antibiotic resistance of
isolated strains. Vet. Med. – Czech 2004; 49 (7), 243–252
19. Denyera SP, Stewartb GS. Mechanisms of action of disinfectants.
International Biodeterioration & Biodegradation 1998; 41, 261-268
20. Mara D, Hora N. Handbook of Water and Wastewater Microbiology:
Microbial response to disinfectants. Academic Press. Londres, Inglaterra.
2003, 819 p.
21. Marriott NG, Gravani RB. Principles of Food Sanitation. Quinta Edición.
Food Science Text Series. Nueva York, Estados Unidos. 2006, 413 p.
22. Paulus W. Directory of Microbicides for the Protection of Materials. Springer
Netherlands. 2005, 787p.
23. Singh M, Gill VS, Thippareddi H, Phebus RK, Marsden JL, Herald TJ,
Nutsch AL. Antimicrobial Activity of Cetylpyridinium Chloride against Listeria
monocytogenes on Frankfurters and Subsequent Effect on Quality
Attributes. Journal of Food Protection 2005; 8 (9), 1823-1830
24. Lima K, Mustapha A. Inhibition of Escherichia coli O157:H7, Listeria
monocytogenes and Staphylococcus aureus on sliced roast beef by
cetylpyridinium chloride and acidified sodium chlorite. Food Microbiology
2007; 24, 89–94
25. Suller MTE, Russell AD. Antibiotic and biocide resistance in methicillin-
resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococcus.
Journal of Hospital infection 1999; 43, 28I-29I
26. LOPES JA. Evaluation of dairy and food plant sanitizers against Salmonella
typhimurium and Listeria monocytogenes. Journal of dairy science 1986; 6,
2791-2796

23
27. Ayla S，ENER*, Ayhan TEMI・Z Efficacy of some commercial disinfectants
against the bacterial isolates from a poultry slaughterhouse in Turkey.
Annals of Microbiology 2007; 57 (1), 101-108
28. Aarnisalo K, Lundén J, Korkeala H, Wirtanen G. Susceptibility of Listeria
monocytogenes strains to disinfectants and chlorinated alkaline cleaners at
cold temperatures. LWT 2007; 40, 1041–1048
29. Ruiz Z, Poutou RA, Carrascal AK. Review: Resistencia antimicrobiana y a
desinfectantes de Listeria spp. NOVA-Publicación Científica EN CIENCIAS
BIOMÉDICAS 2008; 10 (6), 101-236
30. Holah JT, Lavaud A, Peters W, Dye KA. Future techniques for disinfectant
efficacy testing. International Biodeterioration & Biodegradation 1998; 41,
273-279
31. Gandhi M, Chikindas ML. Review; Listeria: A foodborne pathogen that
knows how to survive. International Journal of Food Microbiology 2007; 113,
1–15
32. Heira E, Lindstedta B, Røtterudb O, Vardunda T, Kapperuda G, Nesbakkenb
T. Molecular epidemiology and disinfectant susceptibility of Listeria
monocytogenes from meat processing plants and human infections.
International Journal of Food Microbiology 2004; 96, 85– 96
33. Alonso-Hernando A, Capita R, Prieto M, Alonso-Calleja C. Adaptation and
croos adaptation of Listeria monocytogenes and Salmonella enterica to
poultry decontaminant. The Journal of Microbiology 2009; 47 (2),142-146
34. Müller G, Kramer A. In vitro action of a combination of selected antimicrobial
agents and chondroitin sulfate. Chemico-Biological Interactions 2000; 124,
77–85
35. Sakuma S, Reeh B, Dang D, Harris MG. Comparative efficacies of four soft
contact lens disinfection solutions. International Contact Lens Clinic 1996;
23, 234-241
36. Velazco, A. (2010), Detección de la susceptibilidad antimicrobiana de
aislamientos de Listeria monocytogenes “Trabajo de grado”, Bogotá D.C.
Pontificia Universidad Javeriana, Microbiología Industrial.

24
12. ANEXOS

Anexo 1. Cálculo del recuento viable de la suspensión bacteriana de

prueba (ufc/ml)

Los recuentos viables de la suspensión bacteriana de prueba se calcularon

según los principios descritos en la norma ISO 7218 de la forma siguiente:

a) Para el cálculo de los recuentos viables solo se utilizaron recuentos de

colonias que fuesen inferiores a 300 ufc/placa. Para que el resultado fuera
válido, los recuentos viables se calcularon utilizando al menos un par de
placas, que tuviesen más de 15 y menos de 300 colonias. Si las placas de
dos diluciones estaban en este intervalo, se calcula el número de ufc/ml
como la media ponderada de los recuentos. Si las placas de solamente una
de las diluciones están en este intervalo, se calcula la media aritmética de
los recuentos.

b) Para el cálculo de la media ponderada (en ufc/ml), se utilizó la fórmula

siguiente:

Ecuación Anexa 1. En donde: c, es la suma de las colonias contadas sobre todas las placas
que se tienen en cuenta; n1, es el número de placas que se toman en cuenta en la primera
dilución; n2, es el número de placas que se toman en cuenta en la segunda dilución; y d, es el
factor de dilución correspondiente a la primera dilución que se toma en cuenta.

Los resultados calculados se expresaron con dos cifras significativas. Para ello
se realizó un redondeo en el cual, si la última cifra era inferior a 5, la cifra
precedente no se modificaba; si la última cifra era superior a 5, la cifra
precedente se aumentaba en una unidad; si la última cifra era igual a 5, se
redondeaba la cifra precedente a la cifra par más cercana. Se procedió paso a
paso hasta expresar el resultado con dos cifras significativas.

c) De lo anterior se desprende que el número de ufc/ml se expresó por un

número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10
apropiada.
d) Para el cálculo de la media aritmética se procedió según la ecuación 1.

Anexo 2. Validación del método de dilución-neutralización

A 2.1. Preparación de la suspensión bacteriana

A 2.1.1. Cultivos de primera generación de los organismos de prueba
Los cultivos de primera generación, se obtuvieron a partir del banco de L.
monocytogenes recuperadas de plantas de procesamiento de cárnicos, del
laboratorio de microbiología de alimentos de la Pontificia Universidad Javeriana

A 2.1.2. Cultivos de trabajo de los organismos de prueba

Para preparar el cultivo de trabajo de cada cepa de L. monocytogenes, se
subcultivó a partir de los cultivos de primera generación (véase el numeral
6.2.1.1) mediante siembra masiva sobre medio TSAYE fundido en placas Petri.

25
Cada siembra se incubó por 18 h - 24 h a 37 ± 1 °C, para su uso como fuente
de la suspensión bacteriana de prueba. En caso de no poderse utilizar el
primer subcultivo de trabajo, se realizaron no más de 3 repiques de cada
subcultivo realizado para cada cepa, siempre y cuando estos hubieran sido
mantenidos todo el tiempo en el incubador.

A 2.1.3. Suspensión bacteriana de prueba

A partir del cultivo de trabajo de cada cepa de L. monocytogenes recuperada,
ser realizaron suspensiones de prueba en tubos de vidrio tapa rosca y con 20
ml de Agua Triptona Bufferada. Cada suspensión fue homogenizada y llevada
hasta una concentración comprendida entre 6x102 ufc/ml y 3 x 103 UFC/ml, con
ayuda del patrón Numero 1 de Mc Farland (3*108 UFC/ml) y posteriores
diluciones. Cada suspensión de prueba, se mantuvo a 20 °C±1 °C en baño de
agua controlado y se utilizó antes de 2 h.

Para el control de la concentración de cada suspensión bacteriana de prueba,

se preparó una dilución 10-1, utilizando como diluyente Agua Triptona
Bufferada, la cual fue sembrada por profundidad en medio TSAYE fundido y
por duplicado, para su posterior recuento luego de 24 – 48 horas de
incubación a 37 ± 1 °C

A 2.1.4. Recuento de la suspensión bacteriana de prueba (Nv).

Para el recuento de las suspensiones bacterianas de prueba, se desecharon
todas aquellas que no permitieron su recuento. Las placas presentes en cada
caja, se contaron hasta un máximo de 300 colonias para determinar el número
de unidades formadoras de colonias (UFC) en cada una, a las 24 y 48 horas. El
número de colonias a tener en cuenta, luego de ambos recuentos, fue aquel
que presentará el número más alto de colonias para cada muestra. La
determinación del número de unidades formadoras de colonias se realizó
según el anexo 1.

A 2.2. Preparación de la solución del producto sometido a prueba

Este procedimiento se llevó a cabo según el numeral 6.3., pero la única
concentración evaluada fue la mayor para cada desinfectante y no se
agregaron únicamente 1 ml de agua destilada, a cada tuvo con la solución
desinfectante, se agregaron 2ml de agua destilada por cada 8ml de solución
desinfectante.

A 2.3. Prueba de validación del neutralizante

A 2.3.1. Generalidades
Antes de arrancar la prueba, se dejó que todos los reactivos (solución del
producto a prueba, suspensión bacteriana de prueba, neutralizador) alcanzaran
el equilibrio térmico a la temperatura de 20°C ± 1°C, utilizando un baño de agua
controlado a esa temperatura. El resto del ensayo se condujo bajo estas
condiciones de temperatura.

A 2.3.2 Procedimiento de prueba para verificar la actividad neutralizante

del neutralizador

26
8,0 ml del neutralizador especificado en el numeral 6.2.3., se colocaron en cada
uno de dos recipientes de capacidad adecuada. Luego ambos recipientes se
llevaron a 20 °C ± 1 °C en baño de agua controlado.

 Para el control de toxicidad del neutralizador, se añadió 1,0 ml de agua

destilada al primer recipiente.
 Para el control del método de dilución-neutralización, se añadió 1,0 ml
de la solución del producto a ensayar, preparada como se describe en el
literal A 2.2., al segundo recipiente.

A continuación de este procedimiento, cada solución se mezcló y se dejó en

contacto durante 5 min ± 10 s. Pasado este tiempo, se añadió 1,0 ml de la
suspensión bacteriana preparada para la validación (véase el literal A 2.1.3.) a
cada uno de los recipientes y se mezcló. Por último, se dejó reposar a 20 °C ±
1 °C durante 30 min ± 1 min cada solución y se recuperó una muestra de 1,0 ml
de cada uno de los recipientes para su siembra en profundidad y por duplicado
en agar TSAYE. Cada siembra se incubó a 37 ºC ± 1 °C y por 24-48 h.

A 2.3.3. Recuento del control de la toxicidad del neutralizador (Nx) y del

control de dilución-neutralización (Nv)
Para el recuento del control de la toxicidad del neutralizador y del control de
dilución-neutralización, se desechó cualquier placa que no permitiera su
recuento. Las placas presentes en cada caja, se contaron hasta un máximo de
300 colonias para determinar el número de UFC en cada una a las 24 y 48
horas, el número más alto de colonias para cada caja, luego de cada tiempo,
fue el tenido en cuenta. La determinación del número de unidades formadoras
de colonias se realizó mediante la ecuación 1., tanto para el control de la
toxicidad del neutralizador (Nx) como para el control de dilución-neutralización
(Ny).

A 2.4. Verificación de la metodología y validación del método de dilución-

neutralización para la concentración del producto sometido a la prueba

Tabla Anexa 1. Descripción y ejemplo de los recuentos necesarios para la validación del
neutralizante. Tomado de la norma NTC 5150 (5).

27
Tabla Anexa 2. Resultados para la validación del neutralizante utilizado en el estudio

Recuento viable (UFC/ml)

Desinfectante
Suspensión Control de toxicidad Control de dilución-
bacteriana de con el neutralizador neutralización
prueba (véase el (véase el numeral A (véase el numeral A
Ensayo

numeral A 2.1.4.) 2.3.3.) 2.3.3.)

(N) (Nx) (Ny)
1 2*103 >3*103 >3*103
2 1,5*103 2,7*103 1,6*103
A 3 1,5*103 2,6*103 1,9*103
4 2,8*103 >3*103 2,7*103
5 2,8*103 2,6*103 2,7*103
1 2*103 >3*103 >3*103
2 1,5*103 2,7*103 1,7*103
3 1,5*103 2,6*103 1,9*103
B 4 1,9*103 4,1*102 2,7*102
5 1,9*103 4,4*102 3,3*102
6 2,8*103 >3*103 2,9*103
7 2,8*103 2,6*103 2,8*103
1 1,5*103 2,7*103 1,7*103
2 1,5*103 2,6*103 2,6*103
3 1,9*103 4,1*102 2,7*103
C
4 1,9*103 4,4*102 3,3*103
5 2,8*103 >3*103 2,9*103
6 2,8*103 2,6*103 2,9*103

Anexo 3. Origen de cada cepa evaluada en el estudio y respectiva

cantidad
Tabla Anexa 3. Resumen del
número de cepas evaluadas, según
su fuente

Total de
muestras
analizadas
Chorizo 6
Canal de
20
cerdo
Jamón 4
Salchicha 6
Utensilio 3
Carne 1
Total 40

28
 Anexo 4. Estructura molecular de los componentes activos de cada
desinfectante evaluado

Tabla anexa 4. Estructura molecular de los componentes activos de cada desinfectante

evaluado (22).
Desinfectante A Desinfectante B Desinfectante C

Alquil dimetil bencil cloruro de

Polihexametilenbiguanida Cloruro de Cetilpiridinio
amonio

29
30
31
32
33