SEPARACION DE AMINOACIDOS POR (phase stationary), on which the components
CROMATOGRAFIA are deposited in specific places
SEPARATION OF AMINO ACIDS BY Palabras claves: cromatografía, capilaridad,
CHROMATOGRAPHY papel, separación, adsorción, fase
Autores Key words: chromatography, capillarity,
paper, separation, adsorption, phase Arturo J. Suarez Introducción Daniela A. Pedroza En bioquímica se emplean diversos métodos Juan D. Patrón para trabajar en el laboratorio. Uno de los Keila D. Vellogin más utilizados es la de la cromatografía en papel, las diversas técnicas de cromatografía Víctor M. Jiménez se utilizan para aislar y separar los diversos Resumen compuestos, medir su peso molecular y evaluar la pureza de los mismos. La La cromatografía es una técnica de análisis cromatografía en papel es un tipo de químico cuyo objetivo es la separación de cromatografía de reparto, en donde los sustancias puras en mezclas complejas. Esta componentes de una mezcla se separan en técnica depende del principio de absorción base a una distribución diferente entre la fase selectiva. Debido a ciertas limitaciones que se móvil y la fase estacionaria. Existen diferentes presentan para la identificación de sustancias tipos de cromatografía en los cuales se se hace necesario recurrir a métodos más utilizan una fase móvil y una estacionaria. De confiables tales como la cromatografía de acuerdo a los tipos de fase estacionaria y papel, en la cromatografía en papel, una móvil, los tipos de cromatografía pueden ser muestra liquida (fase móvil) fluye por una tira en papel, en capa fina, gas, liquido, en gel y de vertical de papel absorbente (fase afinidad. El presente artículo pretende estacionaria), sobre la cual se van interpretar un cromatograma de una corrida depositando los componentes en lugares cromatografía en papel y calcular su RF para específicos. identificar una muestra determinada. Abstract Materiales y métodos Chromatography is a chemical analysis 1. Papel de filtro (Whatman N° 1) technique whose objective is the separation 2. Muestra (solución de aminoácidos) of pure substances in complex mixtures. This 3. Soluciones estándar de aminoácidos technique depends on the principle of 0,1M. selective absorption. Due to certain 4. Solvente: mezclar en volúmenes 100 limitations that arise for the identification of partes de n-butanol, 30 partes de substances it is necessary to resort to more ácido fórmico y 25 partes de agua. reliable methods such as paper 5. Revelador: solución de ninhidrina al chromatography, in the chromatography on 0,1% en acetona 6. Cámara cromatografíca paper, a liquid sample (mobile phase) flows 7. Tubos capilares through a vertical strip of absorbent paper 8. Estufa a 100 ◦c 9. Nebulizador Para realizar la práctica se cortó un papel con aproximadamente 15 x 15 cm. Luego, se trazó con lápiz una línea a lo largo de una de las extremidades a 2,5 cm del borde. Se marcaron cuatro puntos distintos con distancias adecuadas a lo largo de la línea, se aplicó trionina (p1), valina (p2), lisina (p3) y el punto de muestra (p4) de 0,5 cm de diámetro usando tubos capilares. Se grapo el papel en forma circular se introdujo el papel en la cámara cromatografía cuidando que la línea marcada no tocara el solvente. Se selló la cámara cromatografía y dejó que el solvente actuara por aproximadamente 30 min hasta que alcanzó 1cm sobre la parte superior del papel. A continuación, se retiró el cilindro de Figura 2: Corresponde a los primeros pasos papel y se marcó con lápiz la altura que de la técnica, que es marcar con líneas y alcanzo el solvente, se llevó a secar a la estufa, colocar los puntos para las muestras. finalmente se adiciono ninhidrina al 0,1 en acetona y se dejó secar. En el grupo de trabajo se tomaron anotaciones al respectó.
Resultado y discusión
A continuación, se ilustra los resultados
obtenidos en la práctica:
Figura 3: se aprecia como el solvente (fase
móvil), asciende por capilaridad a través del papel cromatográfico (fase estacionaria) Figura 1: En la imagen se observa las distintas muestras que se utilizaron en la . práctica p1, p2, p3, p4. 𝟐.𝟔 𝒄𝒎 𝑹𝑭𝒑𝟒 = = 𝟎, 𝟒𝟕𝟐 𝒄𝒎 𝟓,𝟓 𝒄𝒎
Comparando los valores conocidos de los
patrones con los valores obtenidos de los aminoácidos de la sustancia problema podemos afirmar que la lisina tuvo la distancia recorrida más baja de todas, seguida de la treonina que la distancia fue baja, aunque un poco más que la lisina, luego le sigue la mezcla y por último la valina fue la que más recorrió en distancia. Esto se debe a que podemos Figura 4: apreciamos el resultado final de la comparar la polaridad de los cromatografía de papel. aminoácidos, observando la distancia Las medidas obtenidas fueron las siguientes: recorrida por cada uno de ellos en el cromatograma. A mayor polaridad menos Sustancia Distancia recorrida por distancia recorrerá como es el caso de la la muestra lisina y treonina, a la inversa, una mayor P1 Treonina 0.1 N 1.7 cm distancia recorrida indicara menor P2 mezcla 2.3 cm polaridad, por tener afinidad por la fase P3 lisina 0.8 cm móvil como es el caso de la valina. P4 Valina 0.1 N 2.6 cm Distancia recorrida 5.5 cm Investigación. por el solvente: Tabla 1: resultados del laboratorio o ¿Qué factores afectan el proceso de cromatografía de papel? Ahora aplicamos la fórmula del factor R/ a. La aplicación de muestra en retención: exceso o de una disolución muy concentrada de ésta en la placa o en la columna de cromatografía: 𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 Cuando se inyecta una masa excesiva 𝑹𝑭 = 𝒅𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒔𝒐𝒍𝒗𝒆𝒏𝒕𝒆 de solutos a separar, se sobrecarga la columna, al realizar la separación la columna de cromatografía puede ser 𝟏.𝟕 𝒄𝒎 𝑹𝑭𝑷𝟏 = 𝟓.𝟓 𝒄𝒎 = 𝟎. 𝟑𝟎𝟗 𝒄𝒎 demasiado corta para separar completamente la muestra, generando una pérdida 𝟐.𝟑 𝒄𝒎 b. El uso de una fase móvil de 𝑹𝑭𝑷𝟐 = 𝟓.𝟓 𝒄𝒎 = 𝟎, 𝟒𝟏𝟖 𝒄𝒎 alta polaridad en un sistema cromatográfico en fase normal. c. El uso de una fase móvil de 𝟎.𝟖 𝒄𝒎 𝑹𝑭𝑷𝟑 = 𝟓,𝟓 𝒄𝒎 = 𝟎, 𝟏𝟒𝟓 𝒄𝒎 alta polaridad en un sistema cromatográfico en fase inversa. En la muy versátil; a sapiencia de que el cromatografía en fase inversa, el flujo de la fase móvil es producido compuesto unido químicamente es por capilares. Además de ello no polar, frecuentemente presenta características tales como: hidrocarburo alifático, y se emplean es sencilla, rápida y principalmente las fases móviles son solventes no requiere el uso de aparatos polares (agua, metanol, acetonitrilo). complicados. En este caso, las sustancias más Bibliografía polares eluyen primero y las hidrofóbicas quedan más retenidas. Murray. Bioquímica ilustrada de Harper.29 d. La disposición de una Ed. Mc Graw Hill. México. 2012. cantidad excesiva de fase móvil en la cámara de desarrollo cromatográfico LAITINEN, HERBERT Y HARRIS, WALTER. e. La aplicación de la muestra Análisis químico 1ra edición. México: editorial muy cerca del extremo de la placa reverte S. A. que se sumerge en la fase móvil. Si se MERCK Y DARMSTADT. Información sobre aplica o siembre la muestra muy cromatografía en capa fina 1. Alemania. cerca de un extremo del papel, puede que al sumergirlo en el solvente en la cámara cromatográfica, este en vez de arrastrar la siembra a lo largo del papel, esta se diluirá en el solvente sin permitir ver la separación de la siembra.
Conclusión
Este método es muy efectivo, ya que
permite observar de una manera fácil los aminoácidos presentes en la muestra.
Para realizar una mejor cromatografía
en papel de aminoácidos, se sugiere utilizar fases móviles polares y corridas bidimensionales para que la separación sea eficiente. La cromatografía en papel es una técnica que mediante la ayuda de un solvente permite separar diferentes sustancias en este caso aminoácidos gracias a su diferencia en los factores de retención. Llevada a cabo esta práctica se pudo comprender que la cromatografía en papel, es una técnica de separación