Variaciones del PCR (Polymerase Chain Reaction)

Han surgido numerosas modificaciones derivadas del método básico inicial, con el propósito de
mejorar el rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares, amplificar
moléculas de ARN en lugar de ADN, producir cadenas de hebra sencilla.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

La PCR no es una técnica analítica, sino más bien una metodología, resultante de la aplicación
practica de tres conceptos:
 Desnaturalización del ADN para dar hebras sencillas. (Luque, 2001, pág. 188)
 Hibridación especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido. (Luque, 2001, pág.
188)
 Replicación de la hebra sencilla por un ADN polimerasa a partir del oligonucleótido
anterior como cebador. (Luque, 2001, pág. 188)
La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para
llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la
secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora).
Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello,
debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su ADN. (Luque, 2001, pág.
190)

Así, se trata de disponer en un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto de estudio.

Además, debemos añadir en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como
cebadores para el ADN polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos (cebadores o primers)
es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar. En concreto, deben ser
complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar:

A continuación, algunas variantes importantes del PCR.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o
ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras
de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del
inglés melting temperature). (Luque, 2001, pág. 193)

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas
en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo,
se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida
por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por
reacción, pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más
económica que la que usa sondas específicas. (Luque, 2001, pág. 194)

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando
la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia
(FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están
distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa del ADN polimerasa. Esto permite
monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.
(Luque, 2001, pág. 194)

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada

en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la
progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional
(en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de
ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de
forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede
automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a
su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La
mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es
decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no
queda limitado a unos reactivos determinados. (Luque, 2001, pág. 196)

RT-PCR: Amplificación de ADN

Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una
transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La transcripción reversa
genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN complementario el cual es estable
al calor y puede resistir la metodología PCR. (Luque, 2001, pág. 196)

Los pasos de la RT-PCR son:

1. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de ARN objetivo.

2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante la
incorporación de nucleótidos complementarios.
3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del ADNc complementario al ARN.
4. PCR.

El ARNm es copiado a ADNc (ADN complementario) por la transcriptasa reversa usando un

primer dT (los primers al azar se pueden también utilizar). En PCR en tiempo real, se utiliza
generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo H. Esto elimina el mRNA
permitiendo que la segunda hebra de ADN sea formada. Se adiciona una mezcla de PCR que
incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los primers específicos para
el gen de interés, los deoxinucleótidos y un buffer conveniente. (Luque, 2001, pág. 196)

Conversión de ARNm a ADNc por la enzima transcriptasa inversa.

El ANDc se desnaturaliza a más de 90ºC (~94ºC), las dos hebras se separan. A 50 o 60ºC los
primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de unión a
los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a 100 bases de
distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real a 72°C la polimerasa extiende el
DNA desde los primeros. Se obtienen 4 cadenas de ANDc. (Luque, 2001, pág. 196)

Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de ANDc, los productos de reacción son analizados

usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de etidio. Los geles
de agarosa para analizar los productos de ANDc de la RT-PCR no nos permiten la cuantificación
ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la
etapa logarítmica de amplificación. (Luque, 2001)

El SYBR green fluorece brillantemente cuando solo cuando se une a ADN de doble
cadena
El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de ADN intercalándose entre
los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Sin
embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR green, que son
mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el PCR en tiempo real.

Trabajos citados

Luque, J. y. (2001). Biología Molecular e Ingeniería Genética . ELSEVIER, 466.