REVISTA INTERNACIONAL DE LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y TECNOLOGÍA DE VOLUMEN 2, NÚMERO 10 DE OCTUBRE DE 2013 ISSN 2277-8616

Aislamiento de bacterias lipolíticas a partir de residuos del suelo

contaminado: Un estudio con respecto a la
Proceso de optimización para la lipasa
Kalpana Sagar, Yasir Bashir, Mayur M Phukan, BK Konwar

Resumen: La producción de metabolitos valiosos por microorganismos siempre ha sido una de las principales áreas de investigación científica intensa en los últimos años. En este sentido, el presente estudio se realizó
para la producción de lipasa bacterias aislar de sitio de los residuos contaminados y posterior optimización de los parámetros de cultivo (temperatura, pH, tiempo de incubación, la velocidad de agitación, la
especificidad de sustrato) para la producción de lipasa extra-celular. Efecto de la fuente de carbono, se evaluaron además iones fuente de nitrógeno y metales para determinar la máxima actividad lipasa. Selección de
los aislados bacterianos se logró por cultivo en agar tributirina (un medio selectivo para las bacterias productoras de lipasa). Fuera de 18 aislados bacterianos, se encontraron 2 aislamientos (TU-L1 y TU-L2) a ser
prominente con respecto a la actividad lipolítica. La temperatura óptima, pH y condiciones de incubación de tiempo para TU-L1 y L2 eran TU-45ºC, 8,0, 18 h; y 37 ° C, 7,0 y 24 horas, respectivamente. El presente
estudio garantiza la viabilidad de aislamiento de microorganismos de importancia industrial de los sitios de residuos contaminados.

palabras clave: Las bacterias, fuente de carbono, extra-celulares, desechos de cocina, lipasa, restos de aceite, triacilglicerol
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1. Introducción 2. Materiales y métodos

Las enzimas hidrolíticas como lipasas ofrecen el mayor participación en el mercado de
enzimas industriales. Las lipasas (triacilglicerol, EC
3.1.1.3) son un grupo importante de biocatalizadores que catalizan la hidrólisis de
triacilglicerol a glicerol y ácidos grasos [1]. En consecuencia de
reciente avances en microbiología y
biotecnología, lipasas han surgido como enzimas clave debido a sus propiedades
multifacéticos que encuentran uso en una amplia gama de aplicaciones industriales [2,
3]. La lipasa se han aislado y purificado a partir de fuentes de hongos, levaduras,
bacterias, plantas y animales, pero las lipasas bacterianas son más económicos y
estable [4]. Bacteriano
lipasas se utilizan ampliamente en la industria de productos lácteos
alimentos y, queso de maduración, la mejora del sabor [5], industria de los detergentes [6],
la industria textil [7], para la síntesis de polímeros biodegradables o compuestos [8],
diferentes transesterificación
reacciones [9], la industria cosmética [10], en la pulpa y la industria de papel [11],
en la síntesis de biodiesel [12], y en las industrias farmacéuticas [13]. La presente
investigación se llevó a cabo para la producción de lipasa bacterias aislar a partir de
residuos contaminados (básicamente el vertido de residuos de cocina) sitios. Es
discutible esperar la presencia de bacterias productoras de lipasa en tales sitios ya
que numerosos restos lipídicos de cocinar y procesos no-cocción se vierten
directamente en estos sitios. Los restos de petróleo en estos sitios se compone de
triacilgliceroles de cadena larga que son sustratos naturales de lipasas. posterior
optimización de los parámetros de cultivo para la producción de lipasa ha sido más
dirigida.
2.1 Sitio de estudio
El sitio de estudio de la presente investigación fue el sitio de vertido de residuos
domésticos [26.7008 ° N y 92,8303 ° E] de la Universidad de Tezpur, Assam, India.
2.2 Recogida de muestras
muestras de suelo Replicar se recogieron de una profundidad de 5-10 cm con la
ayuda de una espátula estéril y se almacenaron en bolsas de plástico estériles. Tras
la recogida, las muestras de suelo se transfirieron inmediatamente al laboratorio para
su examen y análisis posterior ..
2.3 Aislamiento y selección de cepas bacterianas productoras de
lipasa
Un total de dieciocho cepas bacterianas se aislaron a partir del sitio de estudio por
dilución en serie. Para la dilución en serie, 1 g de muestra de suelo se disolvió en 10
ml de agua destilada estéril en un erlenmeyer de 50 ml, y se agitó a 120 rpm durante
30 min a 37 ° C en un agitador rotatorio. La muestra (suspensión acuosa) se diluyó en
serie hasta 10- 6 dilución usando 0,8% de solución salina. 100 l de cada dilución se
extendió sobre tributirina placas de agar que contienen
0.5% (w / v) peptona, 0,3% (w / v) extracto de levadura, 1% tributirina y 2% de agar
mediante la técnica de extensión en placa. Las placas se incubaron a 37 ° C durante
24-72 horas siguientes, que se determinó la actividad lipolítica (observación visual por
la formación de la zona de hidrólisis alrededor de las colonias bacterianas). Fuera de
dieciocho cepas aisladas, dos adhesiones viz., TU-L1 y TU-L2 se encontraron
prominente con respecto a la actividad lipolítica. Los criterios para la selección de las
adhesiones anteriores fueron sobre la base de la utilización de diferentes sustratos
como la tributirina, aceite de oliva, y detergentes aniónicos (Tween-20 y Tween 80).

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2.4 Caracterización morfológica y bioquímica de la lipasa produciendo cepas

• Kalpana Sagar es actualmente un doctorado en el Departamento Académico de
bacterianas
Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Tezpur, Assam, India. Email: kalpsaga@gmail.com
La caracterización morfológica y bioquímica de la producción de aislados bacterianos de
la lipasa se hizo de acuerdo con el Manual de instrucciones de la bacteriología
• Yasir Bashir y Mayur M Phukan están actualmente PhD eruditos en
sistemática de Bergey.
Departamento de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de
Tezpur, Assam, India
2,5 producción de lipasa y Aislamiento
• BK Konwar Actualmente es el rector de la Vice
El medio de cultivo líquido (caldo de soja tríptico) que contiene (g / L) caseína
Universidad de Nagaland, Lumami, Nagaland, India
pancreática, 17; enzimática soja Digest, 3; NaCl, 5;

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fosfato dipotásico, 2,5; glucosa, 2,5; 1% de aceite de oliva; pH 7,5 se utilizó para la
producción de lipasa. Para la producción de lipasa, un matraz Erlenmeyer (250 ml)
que contiene 100 ml de medio se inoculó con una alícuota de aproximadamente 1%
del precultivo preparado en caldo LB (g / L); Triptona, 10; El extracto de levadura, 5:
NaCl, 10; pH 7,5. Los matraces inoculados se incubaron a continuación durante un
período de 16 horas a 37 ° C con agitación constante a 200 rpm. sobrenadante libre
de células se recuperó por centrifugación a 5.000 rpm durante 15 min a 4ºC y se
usó el sobrenadante claro para determinar la actividad lipolítica por método
universal de titulación [14, 15].
2.6 Ensayo enzimático
actividad de la lipasa se midió por el método de titulación usando aceite de oliva
como sustrato. 10% de aceite de oliva (v / v) se emulsionó con 5% de goma arábiga
(w / v) en 50 mM tampón fosfato de sodio pH 7,0. Se añadieron 100 l de
sobrenadante de cultivo libre de células a la emulsión y se incubaron durante 15
minutos a 37ºC. La reacción se detuvo y los ácidos grasos se extrajeron mediante la
adición de 1,0 ml de acetona: solución de etanol (1: 1). Las cantidades de ácidos
grasos liberada se estimaron por titulación con NaOH 0,05 M hasta pH 10,5 utilizando
fenolftaleína como un indicador [16].
2.7 Optimización de la producción de lipasa
La producción de lipasa se determinó después del cultivo en caldo de soja tríptico
6-72 h a 28ºC, 30ºC, 37ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC. La producción de lipasa
se evaluó a continuación sobre una amplia gama de pH que va de 3 a 10,5. El pH
del medio se ajustó antes de la esterilización en autoclave. Además, los cambios en
la producción de lipasa en respuesta a las siguientes fuentes de carbono (1% w / v)
fueron evaluados: glucosa, fructosa, xilosa,
lactosa, sacarosa, manitol y almidón. aceite de oliva, aceite de soja,
tributirina, y aniónicos detergentes (Tween-80 y Tween-100) se utilizaron como
inductores de la lipasa a una concentración de
0,5% (v / v). El control positivo para el ensayo compuesta de un medio sin inductor
lipasa.
2.8 Optimización de los parámetros de los medios de comunicación para la actividad enzimática
profunda
2.8.1 Efecto del Período de incubación en la actividad de la lipasa
TU-L1 y TU-L2 se cultivaron en medios que contienen extracto de levadura, peptona y
NaCl. se añadieron 1% tributirina y aceite de oliva en medios de cultivo como un
sustrato para TU-L1 y TU-L2, respectivamente. Los cultivos bacterianos se incubaron
a 37ºC en un agitador orbital con una velocidad de agitación de 180 rpm. El caldo de
cultivo se recogió después de intervalos de 6 horas por centrifugación a 8000xg
durante 20 min y 4ºC. El sobrenadante se usa como solución de enzima cruda y se
ensayó para determinar la actividad enzimática.
2.8.2 Efecto de la temperatura sobre la actividad lipasa
TU-L1 y TU-L2 se cultivaron a temperaturas que varían de 20ºC a 45ºC para
seleccionar la temperatura óptima para la producción máxima de la enzima
manteniendo los parámetros constante restante.
2.8.3 Efecto del pH sobre la actividad lipasa
El pH óptimo para TU-L1 y TU-L2 para la producción máxima de la enzima se ha
optimizado variando el pH del caldo de tributirina del 5 al 11 mientras que los otros
parámetros se alteraron.
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2.8.4 Efecto de los iones metálicos en la actividad de la lipasa
Para evaluar el efecto de diversos metales divalente iones en
actividad de la enzima, Hg2 +, Fe2 +, Zn2 +, Cu2 +, Ni2 +, Mn2 +, Ca2 +, Co2 + y Mg2
+ se añadieron a la mezcla de reacción a una concentración final de 1 mM.
2.8.5 Efecto de fuentes de nitrógeno como lipasa Inductores
Diferentes fuentes de nitrógeno tales como extracto de levadura, soja, triptona,
peptona y se añadieron al caldo a concentraciones variables para ver el efecto de
la fuente de nitrógeno en la actividad enzimática. parámetros restantes se alteraron.
2.8.6 Efecto de fuentes de carbono como lipasa Inductores
TU-L1 y TU-L2 se cultivaron en tributirina caldo suplementado con diferentes
fuentes de carbono como la sacarosa, xilosa, fructosa, manitol, almidón, y glucosa
al medio de cultivo a concentraciones variables para ver el efecto de la fuente de
carbono sobre la actividad enzimática. parámetros restantes se alteraron.
2.8.7 Efecto del sustrato sobre la actividad de lipasa
Para evaluar el efecto de diferentes sustratos sobre la actividad de la lipasa, 1% de diferentes
sustratos como Tween-20, Tween-80, tributirina, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de
mostaza, aceite de cacahuete y aceite de soja se añadieron a la mezcla de reacción.
3. Resultados y Discusión
3.1 Detección y morfológica Identificacion de
Los aislados lipolíticas
Un total de 18 cepas bacterianas morfológicamente distintos fueron aisladas de suelo de
residuos contaminados de la Universidad de Tezpur, Assam, India. Perder el suelo
contaminado en este estudio se refiere básicamente a la suciedad de los vertederos de
desperdicios de cocina. desechos de cocina por lo general comprenden de una
proporción significativa de restos de aceite, y como tal es discutible tranquilo para
esperar una amplia gama de cepas bacterianas en estos sitios que pueden utilizar
restos de aceite (lípidos) como única fuente de carbono. Las cepas aisladas se
seleccionaron para la lipasa extracelular utilizando medios de agar tributirina. Dos de los
aislados (TU-L1 y TU-L2) produjeron zona clara más grande (23 mm y 21 mm
respectivamente) que los otros, que indica una mayor actividad de la lipasa. Estas dos
cepas fueron identificadas basado en la caracterización morfológica y bioquímica (Tabla
1). Tanto las cepas bacterianas fueron Gram positivo y cocoides en forma. En acuerdo
con el manual de bacteriología sistemática de Bergey, los aislados eran propensos a ser
pertenecientes al género
Estafilococo.
3.2 Optimización de las condiciones de cultivo
TU-L1 mostró máxima actividad enzimática a 45ºC y pH 8,0 mientras que TU-L2
mostró que la actividad enzimática máxima a 37 ° C y pH 7,0 (Fig 1). Tanto las
enzimas mostraron estabilidad durante un intervalo de pH de 6,0 a 11,0 (Fig 2). Se
observó la máxima actividad enzimática a 18 horas y 24 horas de tiempo de
incubación para TU-L1 y TU-L2, respectivamente. La actividad enzimática disminuyó
gradualmente después de 18 horas de tiempo de incubación para TU-L1 y 24 horas de
tiempo de incubación para TU-L2 (figura 3). Las lipasas activas y estables en medios
alcalinos están muy atrayendo, por ejemplo, lipasa producida por Acinetobacter
radioresistens tiene un pH óptimo de 10,0 y era estable durante un intervalo de pH de
6,0-10,0; esta enzima tiene un gran potencial para su aplicación en la industria de
detergentes [17,18]. TU-L2 también mostró un pH óptimo de 8,0 (alcalino) y era
estable durante un amplio intervalo de pH, por lo que puede
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inferir que posiblemente puede tener aplicaciones en la industria de detergentes.
Tabla 1: Caracterización morfológica y bioquímica
de TU-L1 y TU-L2
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3.3 Efecto de la Cultura variable sobre la actividad enzimática
El factor importante para la expresión de la actividad lipasa ha sido siempre de
carbono, ya que las lipasas son enzimas inducibles. Al lado de fuente de carbono, el
tipo de fuente de nitrógeno en el medio también influye en los títulos de la lipasa en
caldo de producción [19]. En general, los microorganismos proporcionan altos
rendimientos de lipasa cuando se utilizan fuentes de nitrógeno orgánicas, tales como
peptona y de extracto de levadura, que se han utilizado para la producción de lipasa
por diversos termófila Bacillus sp. Y varios pseudomonas
[20,21]. Para la selección de fuentes de carbono y nitrógeno óptimo para la actividad
enzimática máxima, diferentes concentraciones de diversas fuentes de carbono y
nitrógeno se complementaron con medios tributirina caldo. TU-L1 mostró que la
actividad enzimática máxima cuando los medios de caldo de tributirina se
complementó con
0,5% de sacarosa como fuente de carbono mientras que TU-L2 mostró que la actividad
enzimática máxima cuando los medios de caldo de tributirina se suplementó con 0,5% de
lactosa como fuente de carbono (Fig 4). Las enzimas de ambos los aislados mostraron
actividad máxima cuando 1% de peptona se añadió como la fuente de nitrógeno (Fig 5).
3.4 Efecto de los iones metálicos sobre la actividad enzimática
TU-L1 mostró que la actividad máxima de la enzima en presencia de Cu 2+
mientras que TU-L2 mostró que la actividad máxima de la enzima en presencia de Cu 2+ así
como Mg 2+. Anteriormente, se ha demostrado que la actividad de estafilocócica lipasas
pueden depender de la presencia de Ca 2+ iones [22] mientras que en nuestro estudio, Ca 2+
se encontró que tenía un efecto menos significativo sobre la actividad enzimática en
comparación con Cu 2+. Otros metales tales como Zn 2+, Co 2+ y Hg 2+
etcétera no tuvo ningún efecto significativo sobre la actividad enzimática en nuestro estudio (Fig 6).
3.5 Efecto del sustrato sobre la actividad enzimática
TU-L1 exhibió actividad enzimática máxima cuando los medios se complementaron
con 1% de tributirina mientras TU-L2 exhibió actividad enzimática máxima cuando los
medios de comunicación se complementó con aceite de oliva al 1%. Aparte de estos,
los otros sustratos también mostraron un efecto positivo sobre la actividad enzimática
pero fue menos significativo y en caso de Tween-20, el efecto era el menos (Fig 7).
Fig 1: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
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Fig 5: Efecto de la fuente de nitrógeno sobre la actividad enzimática

Fig 2: Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Fig 3: Efecto del periodo de incubación sobre la actividad enzimática Fig 6: Efecto del sustrato sobre la actividad enzimática

Fig 4: Efecto de la fuente de carbono sobre la actividad enzimática Fig 7: Efecto de iones metálicos sobre la actividad enzimática

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Conclusión [10] EW Seitz, “La aplicación industrial de las lipasas microbianas: Una
Los resultados experimentales sugieren que diversas composiciones de medios de opinión,“Diario de la Sociedad de American Oil Chemists', vol. 51, 1974
comunicación influenciados enzima de producción (lipasa) por cepas bacterianas aisladas
autóctono TU-L1 y TU-L2. Optimización de los parámetros de crecimiento viz., Temperatura,
pH, agitación (rpm), fuente de carbono y nitrógeno, etc. tuvieron efecto significativo sobre la [11] P. Bajpai, “Aplicación de las enzimas en la industria de pulpa y papel,”
actividad de la lipasa. Sin embargo, Biotechnology Progress, Vol. 15, 1999
el presente estudio requiere una mayor investigación

capacidades (purificación adicional de la enzima en bruto) para

la comparación con la lipasa comercial con respecto a la actividad específica. El [12] H. Noureddini, X. Gao y RS Philkana, “Inmovilizado Pseudomonas
estudio también sugiere que los sitios de desechos contaminados (vertido de los cepacia lipasa de
desechos de cocina, que por lo general están compuestos por numerosos restos de biodiesel combustibleproducción de aceite de soja,”
lípidos a partir de cocción y no cocinar) pueden servir como excelentes caldos de Bioresource Technology, Vol. 96, 2005
cultivo para el aislamiento de bacterias lipolíticas de importancia industrial.
[13] S. Higaki, y M. Morohashi, Propionibacterium acnes lipasa en la dermatitis
seborreica y otras enfermedades de la piel y Unsei-in. Drogas bajo
experimental y la investigación clínica, vol. 29, 2003
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a KS y YB Comisión de Becas Universitarias, la India por beca
de investigación de doctorado. MMP gracias Departamento de Ciencia y Tecnología,
[14] J Cárdenas, E Alvarez, MS De Castro-Álvarez, JM
Gobierno. de India INSPIRAR
Sánchez-Montero, M Valmaseda, SW Elson, y JV Sinisterra, “Screening
compañerismo.
y la actividad catalítica en la síntesis orgánica de nuevos hongos y
levaduras lipasas,” Diario de Molecular Catálisis B: Enzymatic, Vol. 14,
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[dieciséis] RG Jensen, “Detección y determinación de lipasa (acilglicerol
hidrolasa) actividad de diversos
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