Estructura y distribución de un intersticio no reconocido en

tejidos humanos
La endomicroscopía láser confocal (pCLE) proporciona imágenes histológicas en tiempo
real de los tejidos humanos a una profundidad de 60–70 μm durante la endoscopia. El pCLE
del conducto biliar extra hepático después de la inyección de fluoresceína demostró un
patrón reticular dentro de los senos llenos de fluoresceína que no tenían una correlación
anatómica conocida. La congelación del tejido de la biopsia antes de la fijación conservó la
anatomía de esta estructura, lo que demuestra que es parte de la submucosa y un espacio
intersticial lleno de líquido previamente no apreciado, que drena a los ganglios linfáticos y
está respaldado por una compleja red de gruesos haces de colágeno. Estos haces están
revestidos de manera intermitente en un lado por células parecidas a fibroblastos que se
tiñen con marcadores endoteliales y vimentina, aunque existe una interfase no alineada
altamente inusual y extensa entre las proteínas de la matriz de los haces y el fluido
circundante. Observamos estructuras similares en numerosos tejidos que están sujetos a
compresión intermitente o rítmica, incluidas las submucosas de todo el tracto
gastrointestinal y la vejiga urinaria, la dermis, los tejidos blandos peribronquiales y
periarteriales y la fascia. Estas estructuras anatómicas pueden ser importantes en metástasis
de cáncer, edema, fibrosis y funcionamiento mecánico de muchos o todos los tejidos y
órganos. En resumen, describimos la anatomía y la histología de un espacio macroscópico,
lleno de líquido, previamente desconocido, aunque extendido, dentro y entre tejidos, una
nueva expansión y especificación del concepto del intersticio humano.

Introducción
El espacio intersticial es la fuente principal de linfa y es un importante compartimento de
líquidos en el cuerpo. Si bien la anatomía y la composición del espacio intersticial entre las
células se entienden cada vez más, la existencia, la ubicación y la estructura de espacios
inter e intra-tejidos más grandes se describen solo vagamente en la literatura. Esto es
particularmente importante en referencia a la "tercera separación" (acumulación de líquido
intersticial) y cuando se considera el flujo y el volumen general del líquido intersticial, que
no se han estudiado bien.

Los avances en la microscopía in vivo ofrecen el potencial para identificar nuevas

estructuras anatómicas relevantes para la función humana. Los vasos linfáticos en el
cerebro, por ejemplo, se identificaron recientemente por primera vez utilizando imágenes
de microscopía multiphoton in vivo a través de una preparación del cráneo adelgazada. La
endomicroscopía láser confocal basada en sondas (pCLE) es una tecnología de imagen in
vivo que proporciona una evaluación histológica en tiempo real de las estructuras de los
tejidos durante la endoscopia, generalmente después de la inyección intravenosa de
fluoresceína. Nosotros y otros hemos observado que, en los conductos biliares extra
hepáticos y los conductos pancreáticos, pCLE a la longitud focal fija de 60-70 μm muestra
un "patrón reticular" submucoso (Fig. 1A, B) que consiste en bandas de ramificación
oscuras de 20 μm de ancho que rodean grandes espacios poligonales llenos de fluoresceína.
Estos no tienen correlación obvia con las estructuras conocidas. Aunque los endoscopistas
han sugerido que esta red representa capilares o linfangiones. Ninguna estructura puede
explicar el patrón reticular de las bandas oscuras y los espacios brillantes llenos de líquido.

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Figura 1. Identificación del patrón reticular del conducto biliar y demostración del espacio
submucoso. ( A , B ) El pCLE del conducto biliar después de la inyección de fluoresceína muestra
un patrón reticular a una profundidad de 60-70 μm. Barra de escala, 20 μm. ( C – E ) El tejido de
las vías biliares extirpado en el momento de la cirugía de Whipple se congeló y se realizó pCLE ex
vivo , lo que demuestra la persistencia del patrón reticular. Barra de escala, 20 μm. ( F ) Tejido
congelado no teñido de submucosa de un conducto biliar fotografiado por microscopía
fluorescente, que muestra el patrón reticular en esta capa de pared del conducto biliar. Los espacios
"brillantes" ahora están oscuros (el fluido fluoresceinado se drena en el procesamiento y las
estructuras de los tejidos permanecieron teñidas con fluoresceína residual). ( G) El tricromo de
Masson del conducto biliar recién congelado muestra que las bandas oscuras son haces de
colágeno (azul) (izquierda). La parte superior derecha muestra el tricromo de Masson de un
conducto biliar normalmente procesado / fijo del mismo paciente, con colapso de espacios y
aparente adherencia de haces de colágeno entre sí. La parte inferior derecha muestra la muestra fija
teñida con H&E; los espacios delgados entre las capas de colágeno (flechas) reflejan espacios
normalmente llenos de líquido que están casi completamente colapsados. ( H ) Conductos
biliares congelados (arriba) y fijos (abajo) inmunotenñidos con anticuerpos contra CD34
(izquierda, marrón) y D2-40 (derecha, marrón) muestran células que recubren los haces de
colágeno; Tenga en cuenta que los paquetes a menudo parecen tener una célula de revestimiento en
un lado, pero no en el otro (20 ×, DAB, hematoxilina). (I) Esquema del espacio lleno de líquido
apoyado por una red de haces de colágeno alineados en un lado con células.

Presumimos que este patrón refleja una extensión del espacio intersticial intercelular.
Llevamos a cabo un estudio en profundidad utilizando pCLE e histología del conducto
biliar extrahepático humano para identificar los correlatos microanatómicos del patrón
reticular. Presentamos aquí la existencia de una novela intersticial ( i . E . Pre-linfático)
espacio definido por una celosía complejo de haces de colágeno de espesor. Observamos
estructuras similares cuando ampliamos nuestro estudio para incluir la dermis, el estroma
periarterial, la submucosa de las vísceras (tracto gastrointestinal, vejiga urinaria), el árbol
bronquial de los pulmones y los planos fasciales del sistema musculoesquelético y el
tejido adiposo, y Un resultado propone una revisión a gran escala de la macro y
microanatomía del intersticio humano.

Resultados
Se obtuvieron muestras de muestras quirúrgicas de conductos biliares resecados durante
doce cirugías pancreático-biliares. Varios minutos antes de la ligadura vascular y la
resección de la muestra quirúrgica, los pacientes fueron infundidos intravascularmente con
fluoresceína con visualización directa in situ por pCLE del patrón reticular (Fig. 1A,
B ). El sitio se resecó y luego se escaneó de nuevo inmediatamente con pCLE ex vivo ,
confirmando que el patrón reticular y la fluoresceína todavía estaban intactos después de

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la resección (datos no mostrados). Luego, las muestras se incrustaron en un medio de

sección congelado, se congelaron rápidamente usando un aerosol de congelación y se
volvieron a tomar imágenes (Fig. 1C, D, E) Las secciones congeladas en serie se cortaron
perpendicularmente al ángulo de visión del pCLE exactamente en la superficie de la luz,
marcando las secciones cada 5 μm hasta alcanzar una profundidad de 60-70 μm. También
realizamos secciones en serie de tejido en un plano transversal. Estas secciones se
visualizaron bajo microscopía de fluorescencia de rutina (Fig. 1F ), mostrando que el
patrón reticular se correlacionaba con gruesos haces teñidos con fluoresceína (vistos en
pCLE como bandas negras). La ausencia de fluorescencia entre estos haces en los
portaobjetos finales se debe al proceso de preparación del portaobjetos de sección
congelada (secado al aire, fijación y lavado) que hace que el fluido drene del
portaobjetos final.

Las secciones congeladas paralelas se tiñeron con tinción tricrómica de Masson,

confirmando la presencia de bandas de colágeno que separan espacios abiertos,
anteriormente llenos de líquido (Fig. 1G , izquierda). Estas estructuras se localizan
conjuntamente con la submucosa biliar compactada que se observa normalmente en
muestras de biopsia y resección (Fig. 1G, derecha, del mismo paciente que muestra a la
izquierda). Esto sugiere que la estructura densa de la submucosa descrita anteriormente
representa un artefacto debido a la pérdida de líquido durante la escisión y fijación del
tejido, lo que hace que los haces de colágeno normalmente separados se colapsen y se
adhieran entre sí. Observamos que el patrón reticular apareció dentro de los 30 segundos
de la infusión intravascular de fluoresceína, aproximadamente el mismo punto de tiempo
en el que se visualizan los ganglios linfáticos, pero más tarde que cuando se visualizan
las estructuras vasculares. Esto sugiere que es una forma de espacio intersticial en el
que se acumula o forma líquido intersticial o “pre-linfa”. La inmunotinción de la
submucosa del conducto biliar congelado y fijo mostró una tinción positiva de CD34 y
D2-40 en un lado de cada haz de colágeno (Fig. 1H) La inmunotinción fue negativa para
otros marcadores endoteliales linfovasculares (CD31, ERG, LYVE-1), pero
uniformemente positiva para el marcador mesenquimatoso vimentina (datos no
mostrados). Las manchas para el marcador mioepitelial actina del músculo liso, el
marcador de células madre CD117 y la beta-catenina nuclear fueron negativas (datos no
mostrados). La figura 1I es un esquema que resume las observaciones histológicas.

Los estudios ultraestructurales (Fig. 2A, B ) muestran que los haces de colágeno están
alineados asimétricamente en un lado por células delgadas y planas (en forma de huso en
sección transversal) que tienen escaso citoplasma y un núcleo oblongo. Estas células son
similares a los fibroblastos, sin estructuras específicas de tipo celular; en particular,
carecen de características ultraestructurales indicativas de diferenciación endotelial,
incluidas vesículas pinocitóticas y cuerpos de Weibel-Palade . La microscopía
electrónica también muestra que estas células no tienen membrana basal, lo que sugiere
que se adhieren directamente a los haces de colágeno subyacentes, y que, si bien un
lado de un determinado haz de colágeno está revestido por estas células, el lado opuesto
generalmente no está revestido y está directamente expuesto a fluido en el espacio. Los
haces se visualizan bien mediante imágenes de generación de segundos armónicos (Fig.
2C ), lo que confirma que son colágeno fibrilar. También se observan fibras elásticas
autofluorescentes, como lo confirma la apariencia similar de la lámina elástica en las
arterias en el mismo tejido (figura 2C ) y una tinción histoquímica de Van Gieson
(figura 2D ).

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Figure 2. Evaluación estructural del espacio intersticial. ( A ) La microscopía electrónica de

transmisión muestra haces de colágeno (asteriscos) que están compuestos de fibrillas de colágeno
bien organizadas. Algunos paquetes de colágeno tienen una sola célula plana a lo largo de un lado
(puntas de flecha). Barra de escala, 1 μm. ( B ) Un aumento mayor muestra que las células (punta
de flecha) carecen de características de endotelio u otros tipos de células y no tienen membrana
basal. Barra de escala, 1 μm. ( C ) La generación de imágenes de la segunda armónica muestra que
los haces son colágeno fibrilar (azul oscuro). Las fibras de color cian son de autofluorescencia y
probablemente son de elastina, como lo demuestra una autofluorescencia similar en la lámina
elástica de una arteria cercana (inserción) (40 ×). ( D) La tinción elástica de Van Gieson muestra
fibras de elastina (negro) que se extienden a lo largo de los haces de colágeno (rosa) (40 ×).

Las características histológicas características de esta estructura submucosa del conducto

biliar (espacios llenos de líquido y con haces de colágeno revestidos asimétricamente
por células planas) se visualizan fácilmente en otros tejidos. La estructura se reconoció
consistentemente en la dermis en muestras de resección clínica de la piel (Fig. 3A ), y el
pCLE aplicado a regiones delgadas de la piel in vivo después de la inyección de
fluoresceína mostró el mismo patrón reticular en la dermis que en el conducto biliar. Los
espacios llenos de líquido y los haces de colágeno recubiertos por células que tiñen CD34
se ven en la histología en múltiples órganos y tejidos, incluso en la submucosa de todo el
tracto digestivo, la vejiga urinaria, el tejido peribronquial, la fascia y el estroma de
arterias y venas de todos tamaños (Fig. 3By Suplemento Fig. 1 ).

Estas estructuras parecen ser espacios pre-linfáticos, como lo sugiere el examen de

muestras de resección de cáncer colorrectal con tatuajes submucosos (Fig. 4A ) en los
que el pigmento negro está presente en los macrófagos dentro del espacio intersticial

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(Fig. 4B ), así como en los macrófagos asociados, drenaje de ganglios linfáticos

mesentéricos (Fig. 4C ). Estos macrófagos no se ven en espacios intersticiales en el
examen de tejidos normales y se presume que se introducen en el intersticio en
respuesta a la presencia de material extraño. Además, el examen de muestras de
resección del intestino delgado de hernias encarceladas con intestino proximal
obstruido muestra una submucosa con salpicaduras difusas de los haces de colágeno por
líquido proteico (rosa) (Figura complementaria 2) histológicamente similar a la linfa.

Figure 3. Se encuentra un espacio intersticial en la dermis y las submucosas y otros tejidos

fibroconectivos en todo el cuerpo. ( A ) La piel teñida con H&E (superior izquierda 10 ×, superior
derecha 40 ×) muestra las mismas estructuras identificadas en el conducto biliar extrahepático.
Immunostain para CD34 (parte inferior izquierda, DAB marrón, contratinción de hematoxilina azul
claro, 40 ×) resalta que las células del revestimiento son intermitentes y, a menudo, en un lado de
los haces de colágeno, pero no en el otro. El pCLE aplicado a la piel in vivo después de esta
observación histológica confirma que la apariencia histológica predice el patrón reticular in vivo
cuando se aplica pCLE a la piel. ( B) Esquema que muestra la ubicación de estructuras histológicas
idénticas observadas en tejidos fibroconectivos en todo el cuerpo (consulte la Fig. 1
complementaria para obtener imágenes histológicas)

La naturaleza pre-linfática del espacio se enfatiza aún más por el estudio de los tumores
invasivos en el estadio T2 del estómago (Fig. 4D – F , n = 3) y la piel (Fig. 4G – I , n =
2). La invasión del estómago en la etapa T2 se define como la invasión a la submucosa,
pero no más profunda. La invasión de T2 en la piel, asimismo, indica invasión
directamente en la dermis, pero no más profunda. La invasión por carcinoma gástrico
invasivo poco diferenciado (Fig. 4D ) muestra diseminación a través del espacio
intersticial, rodeando haces de colágeno aún intactos (Fig. 4E ); a pesar de que no hay
invasión linfovascular demostrable en este espécimen, hay metástasis en un ganglio
linfático mesentérico drenante (Fig. 4F). En un melanoma maligno que surge en la
parte superior del brazo e invade directamente a la dermis (Fig. 4G ), existe una
diseminación similar a través del espacio intersticial con aislamiento de los haces de
colágeno (Fig. 4H ); de nuevo, a pesar de que no hay invasión linfovascular demostrable,
hay metástasis en un ganglio linfático axilar drenante (Fig. 4I ). En ambos casos, no se
identificaron otras lesiones o vías de diseminación incluso después del examen clínico e
histológico completo de los pacientes.

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Discusión
Proponemos aquí una revisión de los conceptos anatómicos de la submucosa, la dermis, la
fascia y la adventicia vascular, sugiriendo que, en lugar de ser paredes de colágeno
densamente empaquetadas, son espacios intersticiales llenos de líquido. La presencia de
líquido tiene implicaciones importantes para la función y la patología de los tejidos.
Nuestros datos que comparan tejido rápidamente biopsiado y congelado con tejido fijado de
manera estándar sugieren que los espacios que describimos, apoyados y organizados por
una red de colágeno, son compresibles y distensibles y, por lo tanto, pueden servir como
amortiguadores. Todos los órganos en los que hemos detectado esta estructura están
sujetos a ciclos de compresión y distensión, ya sean relativamente constantes (pulmones,
aorta) o intermitentes (tracto digestivo después de una comida, vejiga urinaria durante la
micción, piel bajo compresión mecánica, planos fasciales durante la acción del sistema
musculoesquelético). El intersticio dérmico y el intersticio fascial pueden ser
mecánicamente importantes para explicar el edema (como con el intestino obstruido
previamente en la Fig. Suplementaria. 2 ) El “tercer espacio” en el linfedema
postoperatorio (como cuando se extirpan los ganglios de drenaje) y el anasarca debido a
insuficiencia hepática, renal o cardíaca pueden reflejar distensión de líquidos y estasis en
este espacio intersticial. El espacio intersticial submucoso del árbol biliar, que se extiende
por toda la extensión del estroma portal extra e intrahepático, puede explicar el edema
característico del conducto que se desarrolla rápidamente en la obstrucción aguda del
conducto biliar grande.

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Figure 4. Continuidad entre intersticio y drenaje linfático. ( A – C ) Tejido de colon con tatuaje
submucoso. ( A ) Pigmento negro inyectado endoscópicamente en la submucosa de la pared
del colon antes de la resección de malignidad del colon (H&E, 10 ×). ( B ) El pigmento negro
está presente en los macrófagos en los espacios entre los haces de colágeno (H&E, 40 ×). ( C )
Los macrófagos que contienen pigmento están presentes en los ganglios linfáticos
mesentéricos que drenan el colon tatuado, lo que demuestra que el espacio intersticial se
comunica funcionalmente con el drenaje linfático del colon (H&E, 20 ×). Imágenes típicas de 4
muestras independientes evaluadas. ( D – F ) Etapa T2 carcinoma gástrico, poco diferenciado. (
D) El carcinoma gástrico presente en la superficie de la mucosa (flechas) invade la submucosa
(puntas de flecha); no se observaron invasiones más profundas ni invasiones linfovasculares
(H&E, 4 ×). ( E ) Las células tumorales mal diferenciadas se infiltran, individualmente y en
grupos muy pequeños, a través del espacio intersticial de la submucosa gástrica, aislando haces de
colágeno preexistentes (H&E, 40 ×). ( F ) Carcinoma metastásico en el drenaje de los ganglios
linfáticos mesentéricos de la muestra de resección gástrica; no se identificaron otras metástasis
clínica o histológicamente (H&E, 20 ×). ( G – I ) Melanoma maligno en estadio T2 de la piel del
brazo izquierdo. ( G ) melanoma maligno (azul oscuro) que invade la dermis; invasión
linfovascular no identificada (H&E, 4 ×). ( H) Las células de melanoma maligno se infiltran,
individualmente y en grupos muy pequeños, a través del espacio intersticial de la dermis, aislando
haces de colágeno preexistentes (H&E, 40 ×). ( I ) melanoma maligno metastásico en el drenaje de
los ganglios linfáticos axilares; no se identificaron otras metástasis clínica o histológicamente
(H&E, 10 ×).

El apoyo adicional a la relación entre la histología que observamos y la estructura in vivo

proviene de la ecografía de los tejidos. La ecografía endoscópica del conducto biliar
muestra que consta de tres capas, la mitad de las cuales comprende el 90% del grosor de
la pared y está llena de líquido; corresponde al intersticio submucoso. Los espacios
submucosos de otras vísceras, la dermis y la fascia aparecen heterogéneos por ultrasonido,
típicamente indicativos de líquido o tejido adiposo, mientras que el estroma colagenizado
realmente denso, como en tendones y ligamentos, aparece oscuro por ultrasonido 8, 9 ,
10,11. Se encuentra apoyo adicional para nuestras observaciones en estudios
ultraestructurales publicados de piel, apéndice vermiforme y adventicia periaórtica, que
también parecen haber incluido estas estructuras, aunque no estaban bien caracterizadas
12 , 13 , 14 . En el hígado, el "espacio del centro comercial" previamente identificado
en la región portal puede representar este intersticio. De hecho, los dibujos originales
de Mall, derivados de estudios de inyección, parecen representar las mismas estructuras
que identificamos aquí.

La naturaleza de las células del revestimiento no está clara. Mientras que las células del
conducto biliar extrahepático se tiñeron para CD34 y D2-40, la tinción D2-40 estuvo
ausente en todos los demás tejidos examinados. Las células endoteliales vasculares
también coexpresan CD34 y vimentina, pero la falta de características endoteliales en
la microscopía electrónica excluye esta clasificación para las células de revestimiento
intersticial que observamos, sugiriendo en cambio que son una forma novedosa y
positiva de CD34 de fibroblastos o incluso células madre mesenquimales. Se
desconoce si son las células que depositan los haces de colágeno; de ser así, serían
importantes en la formación de cicatrices en la curación de heridas. En particular, las
cicatrices queloides muestran haces de colágeno y grandes espacios que parecen ser una
exageración de estas estructuras en la dermis subyacente. Los datos recientes que
muestran que las cicatrices queloides aparecen en regiones de la piel bajo alta tensión
plantean preguntas sobre el impacto de las fuerzas mecánicas y el flujo de fluidos en
las estructuras y células de este espacio.

Es probable que el intersticio submucoso que describimos corresponde a los espacios

intersticiales descritos en los estudios de metástasis de grupos de células. La presencia de
una red de canales submucosos en los tractos digestivo y urinario podría explicar la gran

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probabilidad de metástasis por tumores invasivos luminales una vez que llegan a la
submucosa. Como lo ilustran los casos que mostramos de melanoma invasivo y cáncer
gástrico (fig. 4D-I)), la presencia de canales submucosos / dérmicos llenos de líquido
también sugiere la razón por la cual las lesiones T2 tienen un riesgo significativamente
mayor de metástasis sobre las lesiones en estadio T1, porque las submucosas viscerales y
la dermis son espacios abiertos llenos de líquido, en lugar de una pared de densos de
tejido conectivo, pueden ser viajados fácilmente por células tumorales invasivas.
Además, la presión mecánica en tales espacios (peristaltismo en el tracto digestivo,
compresión y / o presión asociada al movimiento en la piel) podría promover aún más
la propagación a través de estos espacios. Si las células del revestimiento intersticial son
los precursores de los miofibroblastos fibrogénicos, también podrían funcionar como
primeros respondedores en la esclerosis peritumoral del árbol pancreatico-biliar, el tubo
digestivo tubular, el árbol bronquial, la vejiga urinaria y la piel. En efecto, estas células
también podrían cumplir funciones importantes en afecciones escleróticas no malignas,
incluida la atresia biliar y la colangitis esclerosante primaria en el árbol biliar, la
esclerodermia en la dermis y el esófago y la enfermedad inflamatoria intestinal en el
tracto digestivo. Los estudios en curso se centran en caracterizar estas células y sus
funciones.

El flujo de líquido intersticial a través del espacio submucoso del tracto gastrointestinal
luminal probablemente esté guiado por peristaltismo, en paralelo con el contenido luminal.
Si hay comunicación entre la luz intestinal y el espacio submucoso, esto aumenta la
posibilidad de que la señalización celular (incluidas las señales hormonales o
inmunológicas) pueda regularse de una manera proximal a distal determinada por la
velocidad de la peristalsis. Las interacciones inmunológicas en este espacio intersticial
también podrían ser importantes en afecciones inflamatorias tales como colangitis
esclerosante primaria, pancreatitis crónica, enfermedad inflamatoria intestinal y
esclerodermia. Curiosamente, aunque no se observaron macrófagos en estos espacios en los
tejidos normales examinados, claramente transitan hacia el espacio para absorber el
pigmento del tatuaje después de la inyección submucosa (Fig. 4A-C ).

Los haces de colágeno en el espacio intersticial están alineados en un solo lado por las
células, lo que implica que la matriz de colágeno en el lado opuesto está en contacto directo
con el líquido intersticial. Existen pocos ejemplos conocidos en el cuerpo humano que no
sean el espacio intersticial entre las células, el glomérulo renal y el espacio de Disse, donde
el líquido está en contacto directo con las proteínas de la matriz sin una barrera celular
interpuesta. Las fibras de colágeno, que son moléculas cargadas, pueden formar una
superficie fisiológicamente activa importante. Si las células del sistema inmune u otras
células que atraviesan el espacio interactúan con los haces de colágeno es una cuestión
altamente fisiológicamente relevante que requiere más investigación.

En resumen, si bien las descripciones típicas del intersticio sugieren espacios entre las
células, describimos los espacios macroscópicamente visibles dentro de los tejidos: senos
dinámicamente compresibles y distensibles a través de los cuales fluye el líquido intersticial
alrededor del cuerpo. Nuestros hallazgos requieren la reconsideración de muchas de las
actividades funcionales normales de diferentes órganos y de la dinámica de fluidos
desordenada en el contexto de la enfermedad, incluida la fibrosis y la metástasis. Una
submucosa sometida a flujo direccional peristáltico no es la pared previamente prevista de
tejido conectivo denso, sino un conducto potencial para el movimiento de agentes nocivos,
moléculas de señalización pro-fibrogénicas y células tumorales. Esto plantea la posibilidad
de que el muestreo directo del líquido intersticial pueda ser una herramienta de diagnóstico.
Finalmente, nuestro estudio demuestra el poder de microscopía in vivo para generar nuevas
ideas sobre la anatomía y la fisiología de los tejidos normales y enfermos.

Métodos
 Pacientes y muestras de tejido.

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Trece pacientes sometidos a resección quirúrgica del árbol biliar en el Monte Sinaí Beth
Israel fueron reclutados para participar en este estudio entre julio de 2012 y diciembre de
2013. El estudio se realizó con la aprobación y de acuerdo con las directrices y regulaciones
pertinentes de la Escuela Icahn de Medicina en el Mount Sinai (Centro Médico Mount Sinai
Beth Israel) Junta de Revisión Institucional (IRB). Se obtuvo el consentimiento informado
por escrito de todos los pacientes para participar en el estudio (incluida la inyección
intraoperatoria con fluoresceína y pCLE) y el examen de la muestra resecada bajo
microscopía para evaluar los márgenes quirúrgicos con endomicroscopía láser confocal
basada en sonda (pCLE). Los criterios de inclusión incluyeron la capacidad de dar el
consentimiento informado y la edad superior a 18 años.

 Evaluación intraoperatoria y perioperatoria

Se infundió a los pacientes 2,5 ml de fluoresceína al 10% justo antes de la ligadura vascular
y la extracción de la muestra (lo que llevó aproximadamente de 5 a 10 minutos en todos los
casos). Luego se estudiaron más a fondo muestras de conducto biliar periférico, conducto
pancreático y pared duodenal de las muestras de resección final.

Se obtuvieron muestras de pacientes a quienes se les inyectó fluoresceína (conducto biliar

común = 10, conducto pancreático = 3, duodeno = 3, ganglio linfático = 1) y de pacientes
control no inyectados (conducto biliar común = 3, conducto pancreático = 1, duodeno = 1,
ganglio linfático = 1). Algunas muestras quirúrgicas fueron lo suficientemente grandes
como para permitirnos estudiar varios tejidos diferentes.

 Procesamiento y evaluación de muestras

Las muestras fueron escaneadas con pCLE (Mauna Kea Technologies, Cellvizio®
Cholangioflex miniprobe) ex vivo inmediatamente después de la extracción, confirmando
que el patrón reticular y la fluoresceína estaban intactos. Luego, las muestras se embebieron
en medio de congelación OCT a base de glicerina y se congelaron rápidamente usando un
aerosol de congelación a base de aerosol (Thomas® Cyto-Freeze) para garantizar la
retención de fluoresceína y la mínima formación de cristales de agua. Las muestras fueron
incrustadas con el lado luminal hacia arriba o en sección transversal. Algunos especímenes
eran lo suficientemente grandes como para ser bisecados y evaluados en ambos planos.
Todas las muestras se almacenaron a -20 ° C. Comenzando en la superficie luminal de la
cara. En los conductos biliares y pancreáticos, las secciones congeladas se cortaron
consecutivamente a un grosor de 5 μm a una profundidad de 60-70 μm. También realizamos
secciones en serie de tejido en un plano transversal al conducto biliar.

Las muestras se montaron en portaobjetos de vidrio sin fijador y se secaron al aire, después
de lo cual se trataron utilizando un protocolo de sección congelada a base de xileno, se
cubrieron con un cubreobjetos y se evaluaron y fotografiaron con un microscopio
fluorescente con un filtro de excitación FITC (475-490 nanómetros).

 Tinción inmunohistoquímica
La inmunotinción se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar 22 . Las muestras
fijas se desparafinizaron primero. Las muestras de la sección congelada se secaron al aire y
se fijaron con calor. Después de la incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpo
primario (Tabla 1 suplementaria ) y lavado con PBS, se sometieron secciones de 4 μm a
anticuerpo secundario biotinilado y después a reactivo de enzima biotinilada con avidina
(peroxidasa de rábano picante biotinilada con avidina). Después de la incubación con 1-3
gotas de sustrato de peroxidasa (DAB-3,30-diaminobencidina; 0,6 mg / ml H2O20,03% en
0,01 M de tampón Tris-HCl pH 7,6) y posterior lavado en H desionizada 2 O, las secciones
se contratiñeron con Gill de hematoxilina y montado bajo montura de cristal a base de
xileno.

 Microscopio de electrones
Las muestras para microscopía electrónica se fijaron en fijador Karnovsky, se fijaron
posteriormente en tetróxido de osmio tamponado con fosfato al 1% y se incorporaron de

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manera estándar. Se cortaron secciones epoxídicas de ~ 80 nm en un Ultracut AO / Reichert,

se tiñeron con uranilo y sales de plomo, y se examinaron en un microscopio electrónico
Zeiss EM 900 a 80 kV.

 Análisis de segunda generación armónica

La microscopía de segunda generación de armónicos de colágeno (SHG) se realizó en
portaobjetos sin teñir usando un microscopio confocal / multifotón Leica TCS-SP5 con un
láser coherente Chameleon Ultra II sintonizado a una longitud de onda de 900 nm. Las
imágenes fueron adquiridas con detectores no desecanados.

 Disponibilidad de datos
No se generaron ni analizaron conjuntos de datos durante el estudio actual.

SCIENtIfIC RePoRTS | (2018) 10:4947 | DOI:10.1038/s41598-018-23062-6 10