UNRSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE

HUAMANGA
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE INGENIERÍA EN

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS II TA-442

PRÁCTICA N° 1: “AISLAMIENTO DE LEVADURA COMO AGENTE

BIOLÓGICO”
Profesor : Ing. Julio Pablo GODENZI VARGAS
Alumna :
- CHAVEZ NUÑEZ, Nataly Danitza
- MITMA ENCISO, Daysi
- NOA MUNGUIA, Yennifer Katherine
Grupo de práctica de laboratorio: : Miércoles de 10:00 am a 01:00 pm.
Fecha de ejecución : Día miércoles 11 de setiembre del 2019.

Ayacucho – Perú

2019
 INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

1. Dar a conocer la importancia de uso y las dosis de los aditivos microbianos y

antioxidantes en la industria alimentaria.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO

1.1. Levaduras
Levaduras son hongos unicelulares de forma esférica alargada u ovalada y con diferentes colores
(blanco, rosado, beige o rojo). Son anaerobios facultativos, siendo las levaduras aeróbicas
productoras de CO2, agua, y biomasa relativamente alta y las levaduras anaerobias,
fermentadoras de azúcar en alcohol, CO2 y menos biomasa, la mayoría son mesófilas con una
temperatura máxima de crecimiento entre 24 y 48 0C, crecen en un rango amplio de pH 2.5 y 8.
No presentan mecanismos de locomoción, por lo que únicamente puede ser transportado a través
de corrientes de aire, fluidos o por insectos.
Las levaduras cuando se desarrollan en medios de cultivo adecuados, sus colonias varían en
aspecto, textura y margen, así algunas son lisas, otras rugosas, algunas son aplanadas, otras
elevadas; tienen bordes bien definidos e irregulares; pueden producir pigmentos. El tipo de
desarrollo de caldo de cultivo, también proporciona información significativa. Algunas colonias
se desarrollan en el fondo del líquido a manera de sedimento, otras crecen uniformemente en el
caldo y otras crecen solo en la superficie. (Rojas, 2011)
Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribuido en la naturaleza;
frecuentemente se encuentran formando una cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas.
(Aquiahuatl, 2004)
Entre las levaduras más comunes en los alimentos y bebidas podemos destacar: Saccharomyces
Cerevisiae, utilizada en la producción de cerveza, Vino, alcohol, pan, etc.(Alcázar 2001)
En general las levaduras crecen con mayor rapidez a pH comprendido entre 4,5 y 6,0. En las
frutas, sin embargo, un pH más bajo impide el crecimiento bacteriano y de aquí que su alteración
sea dominada por levaduras y mohos. (Caballero, 2008)
En Saccharomyces una célula madre da lugar a la formación de yemas en diferentes puntos de
la superficie produciendo en cada uno sólo una célula hija (blastoconidio o blastospora), pero en
Rhodotorula o Cryptococcus todos los brotes surgen desde un solo punto. La célula apiculada de
Saccharomycodes brota repetidamente de cada extremo, extendiéndose un poco con cada
conidio formado. En el caso de Schizosaccharomyces la célula es casi cilíndrica y los conidios
tienen una base muy ancha. Las levaduras hifales, como Trichosporon o Geotrichum producen
artroconidios (o artrosporas) por formación de septos dobles en las hifas, que luego se escinden.
(http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf)
 Fig 1. Esquema de varios géneros de levaduras
Fuente : (http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf)

1.2. Habitad de las levaduras

Las levaduras se encuentran con frecuencia en las hojas y las flores, aunque en número muy
pequeño, siendo los insectos un importante vector de diseminación de las mismas. Están sobre la
epidermis de frutas y pueden penetrar a los tejidos subyacentes como resultado de un daño
mecánico (http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf)

1.3. Medios De Cultivo

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el
laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos
requerimientos de macro y micro nutrientes, Aunque ha quedado claro que la forma en que cada
nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa
de cada nutriente. Un medio de Cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a
un coloide en estado de gel en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el
crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). (Calderón, 2000)

1.4. Técnica aséptica

La técnica usada para evitar contaminantes durante la manipulación de cultivos y de medios de
cultivos estériles se llama técnica aséptica. Es necesaria dominarla para manejarse en un laboratorio
de microbiología, y constituye uno de los primeros métodos que el microbiólogo en ciernes tiene
que aprender. Los contaminantes aéreos constituyen el problema más común ya que el aire siempre
contiene partículas de polvo que generalmente contienen comunidades de microorganismos.
Cuando los recipientes se abren, deben ser manejados de tal modo que el aire cargado de
contaminantes no entre en ellos. La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo a otro, se
realiza normalmente con un aza de cultivo o una aguja que ha sido previamente esterilizado por
calentamiento a la llama. Los cultivos en los que ha habido crecimiento pueden también ser
transferidos a la superficie de placas de medios con agar donde se forman colonias mediante el
crecimiento y división de células aisladas. La selección y extensión de una colonia aislada es un
método muy importante de obtener cultivos puros o axénicos a partir de comunidades microbianas
que contienen muchos organismos diferentes. (Brock et; al 1998)

1.5. Técnicas de siembra

 Método de siembra por estría en placa

 Métodos de vertido en placa y extensión en placa

La siguiente imagen nos muestra la forma correcta de realizar la siembra de los microorganismos en
un medio de cultivo.

Fig. 2: Siembra correcta de microorganismos en placas.

III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
- Vasos de precipitado
- Matraz Erlenmeyer
- Mortero y pilón
- Placas Petri
- Mechero bunsen
- Asa de kolle
3.2 REACTIVOS
- Agar agar
- Peptona
- Glucosa
3.3 MUESTRAS
- Uva negra
- Chicha de jora

IV. PROCEDIMIENTO

a) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

- Pesar 2,5g de peptona, 2,5 g de glucosa y 3,75g de agar-agar, y mezclar agitando en

un matraz de 250 ml.
- Con el potenciómetro medir su pH que debería estar en un rango de 6.0 – 6.4 y de lo
contrario adicionar solución de ácido cítrico de concentración de 5% p/v,
gradualmente hasta el pH indicado.
- Adicionar el antibiótico la 1/8 parte de una cápsula.
- Agitar hasta que el agar haya disuelto, si es necesario calentar levemente con el
mechero de bunsen.
- Enrazar con agua destilada en la fiola hasta 1000ml.
- Trasvasar al matraz de 1000 ml y tapar con una torunda de algodón de manera que
quede cerrada y apretada.
- Cubrir con el papel periódico el matraz toda la boca y hasta la parte media, hacer por
lo menos dos capas de papel asegurarlo con pabilo.
- Todas las placas Petri envolverlos con el papel periódico.
- Llevar al autoclave y colocarlos, el matraz con el medio y las placas Petri.
- Autoclavar a 121°C y a 15 lb/pulg2 de presión por 15 minutos.
 - Después de esto sacar el medio y las placas, dejar enfriar sin sacar el papel que
envuelve los materiales.

b) AISLAMIENTO DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS

- Lavar ligeramente con agua destilada la uva para eliminar contaminantes físicos.
- Machacar ligeramente en el mortero
- Extraer el mosto en una probeta. Reservar.
- Agita la chicha de jora y esperar que decante, el sobrenadante separar en un vaso
precipitado, repetir hasta tener una cantidad de precipitados. Reservar el precipitado.
c) CULTIVO

- Disolver sin sacar la cubierta de papel de matraz con el medio, si aún no gelifica el
agar, no será necesario disolverlo.
- En presencia del mechero de Bunsen encendido abrir uno a uno las placas Petri y
repartirlo en cada uno de ellos hasta una altura de mitad, cerrar y dejar enfriar.
- Rotular cada placa indicando si serán para muestras de uva o chicha de jora.
- Cuando el medio en las placas Petri ya está frio y sólido, empezar el cultivo.
- Al lado del mechero de Busen abrir con cuidado la placa. Quemar la punta del asa de
kolle hasta rojo vivo. Enfriar y extraer la muestra del mosto de uva con la asa de kolle
y sembrar en forma de Z, cerrar.
- Repetir lo mismo para la chicha de jora.
- Siempre hacer los 06 cultivos en presencia cercana del mechero encendido.
- El medio de cultivo del matraz sobrante guardar con la tapa de algodón y la cubierta
de papel.
- Las placas Petri dejar en el secador cerrado y dejar el crecimiento por algunos días en
observación.
- Cuando se note colonias contar y anotar.
V. CÁLCULOS Y RESULTADOS

VI. DISCUSIÓN:

VII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

En esta práctica de laboratorio se logró conocer las técnicas de aislamiento de un agente microbiano
en este caso de levaduras, cuyo uso se da en la ingeniería de bioprocesos.

Además se realizó la preparación de tres medios de cultivos adecuados y selectivos que fueron el de
chicha de jora y uvas, para levaduras, que como sabemos su uso es en las fermentaciones alimentarias,
el crecimiento de este cultivo se pudo ver tal como se muestra en los resultados, cabe mencionar que
hubo contaminación en ciertas placas Petri por el paso del tiempo.

VIII. CUESTIONARIO
8. 1 ¿Cuáles son los criterios de bioseguridad en un laboratorio biotecnológico?

A lo largo de todo este manual, se hace referencia a los peligros relativos que entrañan los
microorganismos infecciosos, clasificados por grupos de riesgo (grupos de riesgo 1, 2, 3 y 4 (OMS)).
Esta clasificación por grupos de riesgo se utilizará exclusivamente para el trabajo de
laboratorio. En el cuadro 1 se describen esos grupos de riesgo (OMS, 2005).

Cuadro 1. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo

Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o
los animales.

Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas
probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado
o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero
existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.

Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de
ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces.
 Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y
que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no
existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.

Los laboratorios se clasifican como sigue: laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1; laboratorio
básico – nivel de bioseguridad 2; laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3, y laboratorio
de contención máxima – nivel de bioseguridad 4. Las designaciones del nivel de bioseguridad se
basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención,
equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de
los distintos grupos de riesgo. En el cuadro 2 se relacionan, no se equiparan, los grupos de riesgo
con el nivel de bioseguridad de los laboratorios destinados al trabajo con microorganismos de cada
uno de esos grupos.

Cuadro 2. Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el equipo

GRUPO DE NIVEL DE TIPO DE PRÁCTICAS DE EQUIPO DE SEGURIDAD

RIESGO BIOSEGURIDAD LABORATORIO LABORATORIO
1 Básica nivel 1 Enseñanza TMA Ninguno; trabajo en
básica, mesa de laboratorio
investigación al descubierto
2 Básica nivel 2 Servicios de TMA y ropa Trabajo en mesa al
atención primaria; protectora; de señal descubierto y CSB
diagnóstico, riesgo biológico para posibles
investigación aerosoles
3 Contención nivel Diagnóstico Prácticas de nivel 2 CSB además de otros
3 especial, más ropa especial, medios de contención
investigación acceso controlado primaria para todas
y flujo direccional las actividades
del aire
4 Contención Unidades de Prácticas de nivel 3 CSB de clase III o
máxima nivel 4 patógenos más cámara de trajes presurizados
peligrosos entrada con cierre junto con CSB de
ducha y eliminación clase II, autoclave de
especial de residuos doble puerta (a través
de la pared), aire
filtrado

TMA: técnicas microbiológicas apropiadas (Véase la parte IV del presente manual). CSB: cámara de
seguridad biológica.
FUENTE: OMS, 2015

8. 2 ¿Por qué se adiciona antibióticos a los medios de cultivo?

La frecuencia de ocurrencia de la incorporación de penicilina y otros antibióticos en el medio de

cultivo mejoran la técnica de cultivo de tejidos (Coriell, 1979, citado por De la Rosa, 1988). Sin
embargo, hay objeciones al uso generalizado de antibióticos para el control de contaminantes.
Los antibióticos no destruyen a todos los microorganismos, algunos sólo son suprimidos o
retardan su metabolismo; se descuidan las técnicas asépticas por el uso de antibióticos; se forma
resistencia a antibióticos en muchos microorganismos, siendo más difícil controlarlos. La
penicilina causa conversión de algunas bacterias a formas L, las cuales crecen rápidamente, pero
no son fácilmente detectadas; por el efecto de los antibióticos se pierden índices obvios de
contaminación como cambios de pH, turbiedad y evidencias microscópicas. Por lo tanto, los
antibióticos no deben ser utilizados rutinariamente, tratando de sustituirlos por técnicas asépticas
(VALENZUELA).

Los antibióticos se usan de forma rutinaria en cultivos celulares para prevenir posibles
contaminaciones. Sin embargo, este uso tiene efectos secundarios: muchos estudios científicos
demuestran que su uso afecta al crecimiento y a la diferenciación celular. Con buenas prácticas
de laboratorio, el uso de antibióticos es innecesario (LABCLINICS, 2018).

8. 3 ¿Haga un resumen de levaduras salvajes con ejemplos y aplicaciones?

Las levaduras comerciales son ampliamente utilizadas en la vinificación para llevar a cabo la
fermentación alcohólica; sin embargo algunas cepas salvajes pueden competir con ellas e incluso
dominar el proceso.

En el medio ambiente existen levaduras salvajes capaces de realizar la fermentación alcohólica,

aunque algunas especies tienden a formar ácido acético usando el oxígeno del mosto; por lo tanto,
no es deseable que actuen desde el principio del proceso, ya que el ácido acético producido no
puede ser eliminado. Al mosto se le añade SO2 a razón de 5 a 7 g/100 kg para anular la actividad
de las levaduras salvajes y ayuda a Saccharomyces a actuar desde el principio de la fermentación.

Algunas de las investigaciones en la aplicación de las levaduras salvajes es en la elaboración de

CERVEZAS.

8. 4 ¿Qué es un cultivo Starter y qué aplicaciones tiene?

Los cultivos estárter han sido objeto de estudio y desarrollo durante los últimos 40 años con el
fin de reducir el tiempo de fermentación, asegurando un contenido residual bajo en nitratos y
nitritos en los productos, y contribuyen con el establecimiento de las características
organolépticas finales (González-Fernández y col., 2006).

Un cultivo estárter consiste en una especie o combinación de especies microbianas que una vez
adicionados a un producto originan un conjunto de transformaciones en los componentes básicos
(glúcidos–proteínas–lípidos) con un resultado final que se manifiesta en el cambio de la textura,
color y flavor del producto final, incrementando su poder de conservación y en ocasiones aportan
efectos benéficos para la salud del consumidor –probióticos- (figura 1). Los microorganismos
empleados como cultivos estárter pueden ser bacterias, levaduras y mohos individualmente o una
mezcla de ellos (bacteria-bacteria; bacteria-levadura; bacteria-moho; moho-moho; moho-
levadura; levadura-levadura).
En la figura 2 puede observarse de forma esquemática el proceso general de elaboración
y propagación de los cultivos estárter empleados a gran escala. El proceso comienza
con la elaboración del cultivo madre (2), este cultivo se prepara a partir del cultivo liofilizado
o comercial (1) suspendiendo la cantidad deseada en la solución adecuada para el fin que se
requiera, por ejemplo, para la elaboración de yogurt el cultivo liofilizado se suspende en
leche estéril. A partir de este cultivo madre se prepara el cultivo intermedio suspendiendo
una cantidad mayor del cultivo 2. Finalmente se elabora el cultivo industrial o de trabajo, el
cuál es el cultivo que se usa para inocular directamente el producto a transformar.
 Algunas aplicaciones de los cultivos estárter son:
1. Producción de alcohol para la industria vinícola y cervecera.
2. Producción de pan ácido
3. Producción de derivados lácteos, como el yogurt (ver resumen bacterias ácido-lácticas
como estárter para industria láctea) y quesos.
4. Producción de embutidos
5. Producción de vinagre
6. Elaboración de vegetales fermentados

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Aquiahuatl Ramos, María de los Ángeles- 2004.- “manual de prácticas del laboratorio
de microbiología general”-Universidad Autónoma Metropolitana. Departamento de
biotecnología. México
2. Brock y otros 1998 “Biología de los Microorganismos”. Octava Edición.
3. Caballero Torres, Ángel E. 2008. “Temas de higiene de los alimentos”. Editorial
Ciencias Médicas. La Habana.
4. Calderón, F.; Colomo, B.; Morata, A.; Suárez Lepe, J.A. (2001) y Sancho, E. D.
Biotecnología de la fermentación. Principios, procesos y productos. Ed. Acribia.
Zaragoza. España.
5. Rojas Alberto-Triviño.-2011- “Conceptos y práctica de microbiología general”.
Universidad Nacional de Colombia. Sede Palmira
6. MADRID, A. (1992) Los aditivos en los alimentos. MUNDI-PRENSA LIBROS S.A .Madrid,
España.
7. OMS. (2005). MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Impreso en
Malta. Tercera edición. Ginebra.
8. Valenzuela, Manuel. USO DE ANTIBIOTICOS EN MEDIOS DE CULTIVO PARA
REDUCIR LA PRESENCIA DE AGENTES CONTAMINANTES EN LA PROPAGACION
in vitro DE PALMA DATILERA (Phoenix dactylifera L).. (encontrado en
file:///C:/Users/EQUIPO/Downloads/rchszaI867.pdf)
9. http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf)