PRUEBAS DE PCR : LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en
teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más
fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas
(cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación
han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, sobre todo en el ámbito de la investigación forense,
con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha técnica.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo
cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas
entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder
duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente
a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las
polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas
polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del
ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables,
extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres
vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus
furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de
polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite
calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.
Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos
simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que
favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi
todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar
la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y
solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de
reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Actualmente existen algunos termocicladores que utilizan o
pueden utilizar aceite mineral en el tubo de PCR como los termocicladores de nueva generación de flujo de aíre.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación
médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para
la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos
hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección
y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Reactivos Para realizar la técnica se necesitan:

 Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
 Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de
las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a
veintidós, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia.
Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la
secuencia que se desea replicar.
 Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o
algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante
 PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan
como cofactores de la polimerasa.
 Iones monovalentes, como el potasio.
 Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
 ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es
la polimerasa Taq).
 ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que
conforman un ciclo.

Optimización de la PCR
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
 La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran
número de copias. Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas
de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a
conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN
extraño. Ejemplos en los que es especialmente importante evitar la amplificación son la detección de
enfermedades (para no diagnosticar erróneamente a los pacientes) o el diagnóstico de identidad y parentesco.
Posibles precauciones son:
o Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida, envío, custodia y procesado de
muestras.
o Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV, psoralenos...) de la superficie de trabajo entre la
realización de una PCR y la siguiente.
o En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de trabajo: un laboratorio para la
preparación de la mezcla madre para la PCR, otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la
maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.
o Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades.
o Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes,
bata, cubrezapatos, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente que se
cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.
o Controles positivos y negativos.
o Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una amplificación no esperada se podrá
comprobar si proviene de uno de los operarios.
 Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en
evitar la formación de productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son:
o Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) Normalmente, se suelen diseñar de 20
nucleótidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en
longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.
o Los primers no deben diferir en más de 3 bases.
o La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y
terminen con 1 o 2 bases púricas.
o Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
o La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5 °C.
o Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán
dímeros entre ellos.
 Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras
necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o
 funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las más
habituales son la taq y la pfu.
 Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.
 El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello,
diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el
desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su
manejo, mantenimiento y ubicación será clave.
Aparte de aspectos como la contaminación y algún fallo en la hibridación de primers, puede haber otras
complejidades que afecten a la PCR, como son:
 Degradación del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subóptimas o cuando
se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de amplificación o resultados parciales. Un caso
particular es el "allele dropout", o bien pérdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con
ser homocigótico para dicho alelo.
 Inhibición de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso de la PCR. Requerirá un
procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio antes de preparar la mezcla de
PCR. Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es necesario una purificación
previa.
 Modificación del ADN: las sustancias como el formol (empleado en conservación de tejidos) o la luz
ultravioleta modifican el ADN, alterando así los resultados de la amplificación.
 Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow", que consisten en que la polimerasa
amplifica una repetición de más de un microsatélite o repetición en tándem.
 Alelo fuera de patrón: un alelo amplificado puede no coincidir con el patrón de picos de la referencia. Esto es
señal de que algo ha ido mal durante la PCR.
 Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma y el resultado sea una combinación del patrón
de picos que cabe esperar tras la amplificación de cada una de ellas por separado. Esto y el caso anterior dificulta
la interpretación de los resultados.

Tipos de PCR
PCR anidada
Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar
una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir,
cuando tenemos el primer, como su amplificación se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una
amplificación dentro de la amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y
especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los
cebadores solo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos
posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La desventaja de esta técnica es que no nos permite
cuantificar la muestra.
PCR de extensión solapada (Mutagénesis)
Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores
(primers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la
mutación. Se usan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa.
PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos
generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en
un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego
detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse
 cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar
específicamente una población de secuencias de menor representación.
PCR múltiple
PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de
cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para
amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: información sobre varios locus en una sola
reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de
datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización
del proceso.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa
inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el
desarrollo inicial de una RT-PCR sería:
 1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
 2.º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
 3.er paso: PCR estándar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)
PCR en tiempo real
Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la
muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de
su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature).
Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas
específicas.
Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona
intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una
transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda
está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN
polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del
gen.
La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-
PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el
momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al
final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando
fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede
automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de
leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con las
diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de
amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.
Variaciones de la PCR básica
PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o utilizar los
polimorfismos de una sola base (SNPs). Utiliza cebadores específicos para las secuencias normal y mutante. El
diseño más habitual es un análisis en dos tubos con dos cebadores: uno normal y otro mutante en reacciones
separadas junto con los cebadores control.
PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un
fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.
PCR asimétrica: usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rápidamente
examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.
Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se
emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de
hibridación-elongación.
PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la PCR: mientras
que la máquina alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95 ℃) puede que ocurra la unión de los
cebadores y se produzca amplificación, ya que en el camino para alcanzar estos 95 ℃ se pasa por la temperatura
de anillamiento (que es más baja).
Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reacción comience cuando la máquina ya esté a 95º, debido a
que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir
mediante varias técnicas:
- Añadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento
- Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reacción. La cera se funde al alcanzar los 95 ℃ y
es entonces cuando los componentes entran en contacto
- Anticuerpos anti-polimerasa que estén bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los 95 ℃ estos anticuerpos se
inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar
PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella genética, que
amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella genética única de longitudes de
fragmento amplificadas.
PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una secuencia interna.
Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos.
PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de interés y múltiples
cebadores hibridando estos linkers.
PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genómico.
Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite
amplificar varias secuencias objetivo con un único par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de
la PCR multiplex.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. En la técnica clásica de PCR, se
cuantifica por aproximación con diluciones y amplificación de concentraciones conocidas de la secuencia diana.
También se puede cuantificar por método competitivo: se trabaja con concentraciones crecientes conocidas de un
fragmento que puede ser amplificado por los mismos oligos que la muestra de estudio, pero de menor tamaño que
esta, de forma que con los resultados obtenidos se puede estimar qué concentración del competidor es
equivalente a la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificación en PCR está optimizada en la técnica de
PCR en tiempo real.
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia desconocida que
flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de
los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en
el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no específico bajando gradualmente la
temperatura de hibridación a lo largo del progreso de la PCR.
PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en células vivas.
Ciclo térmico rápido para PCR:5 La amplificación del DNA puede llevarse a cabo rápidamente, como completar 30
ciclos en menos de 30 minutos: ciclo térmico rápido. Normalmente se ha considerado que las etapas de cada ciclo
son tres reacciones que ocurren en tres periodos separados y a tres temperaturas diferentes. Este paradigma del
equilibrio secuencial no tiene en cuenta que la temperatura de la muestra no cambia instantáneamente, de hecho,
durante una PCR la muestra está la mayoría del tiempo en temperaturas de transición. El ciclo térmico rápido
aprovecha la ventaja de la instantánea desnaturalización e hibridación, cuyas temperaturas necesitan alcanzarse,
pero no mantenerse. Además, para productos cortos, la extensión puede llevarse a cabo durante la transición a la
temperatura de extensión, y por lo tanto, tampoco es necesario mantenerla. Un ciclo rápido podría entonces
describirse como 94 ºC, 0 s; 55 ºC, 0 s y 72 ºC, 0 s. Como vemos, este modelo no ayuda, porque nos lleva solo a
temperaturas extremas y no nos da información sobre lo que pasa entre ellas. En cambio, en el paradigma cinético
para PCR de ciclo rápido se describe completamente el historial de temperaturas de la muestra. Se considera que
desnaturalización, hibridación y elongación ocurren en un rango de temperaturas y además pueden solapar
temporalmente. Hay termocicladores que permiten que un ciclo se complete en 20-60 segundos, por lo que 30
ciclos tardan de 10 a 30 minutos.
Aplicaciones
La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como herramienta de detección y/o
generación de acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí
mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico.

Investigación

La PCR convencional, se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio debido a su robustez y
rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de interés.

Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que contienen una secuencia apta para
la recombinación dirigida con un plásmido.
Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias de ADN en vectores, como
pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia
que permite la interacción posterior con otra complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por
ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos cebadores, de modo que, y si esta no existía
previamente en el fragmento y es única en el vector, pueda efectuarse una ligación mediante la ligasa de T4 tras la
digestión con la enzima de restricción apropiada de ambos elementos.

Medicina
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis

Una de las principales aplicaciones de la PCR es hacer pruebas genéticas para detectar mutaciones en el ADN
que provoquen algún tipo de enfermedad.El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es
un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Así, se pueden hacer
análisis del ADN de los futuros padres para ver si son portadores, o analizar el ADN de sus hijos por si están
afectados por una enfermedad hereditaria. Para el análisis prenatal, las muestras de ADN pueden obtenerse a
partir de la amniocentesis, de la muestra de las vellosidades coriónicas o incluso a partir de algunas células fetales
que circulan por el torrente sanguíneo de la madre. El uso de la PCR también es esencial para el diagnóstico
genético preimplantacional donde se pueden analizar las células del embrión para buscar posibles mutaciones.
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica
una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de
fusión que permitan identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la integración
del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa
posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.
La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre,
para test de rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones en el donante (como VIH o Hepatitis B)
mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar
muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da
positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentre el causante.
También se puede usar la PCR como parte de las pruebas realizadas cuando se hace un trasplante de tejidos. En
2008 se propuso usar esta técnica para reemplazar las pruebas tradicionales con anticuerpos.
A veces, mediante la PCR se pueden hacer terapias personalizadas para pacientes con ciertos tipos de cáncer
que producen mutaciones en los oncogenes a partir de la detección de estas mutaciones.