INTRODUCCIÓN

Para la observación microscópica de microrganismos se puede realizar por

montaje húmedo o coloraciones, estos facilitan la observación de diversas
estructuras. Los procedimientos de coloración requieren la preparación de un
tendido frotis de cultivo en bacterias o levaduras, se deja secar al aire y se realiza
su fijación por medio de calor, para evitar que la muestra sea retirada al momento
de aplicar los colorantes y otros líquidos.1Esto nos permite el reconocimiento y
observación más nítida de constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

En la práctica realizada empleamos diferentes métodos y reactivos para la fijación

de color en las bacterias, identificando que existen diferencias tanto estructurales
como cromáticas en diferentes especies microbianas observadas.
II.OBJETIVOS

GENERAL:
 Identificar las principales estructuras microbianas mediante coloraciones especiales.

ESPECÍFICO:
 Realizar montajes para observación microscópica de bacterias.
 Aplicar diferentes técnicas de tinción.
 Identificar esporas en el método de Wirtz- Conklin.
 Identificar capsulas en el método de tinción negativa.
 Hallar corpúsculos meta cromáticos en la saliva.
 Observar la pared celular en el Método de Robinow.
 Observar la membrana celular en el Método de Knaysi.
 Observar el núcleo en las levaduras.

III. MARCO TEÓRICO

COLORACIÓN GENERALIDADES

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes, su propiedad
ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y estructuras (capsulas, esporas,
flagelos, etc.) que ayudan a la identificación de una especie o grupo en partículas. Los colorantes de mayor
aplicación son: cristal violeta, violeta de genciana, fucsina básica, safranina, azul de metileno y verde de
malaquita. Actúan mejor mediante la adición de mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la
pared celular y membrana citoplasmática.

Tinción de Gram o coloración Gram:

Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la
visualización de bacterias, que desarrolló la técnica para poder referirse a la
morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa.

¿Qué es una coloración Gram, y para qué sirve?:

Se usa para diferencias característica de la bacteria el colorante (es un color
violeta casi azul), entonces esas son GRAM +. Hay otras bacterias que no
tienen casi pared celular (es muy pobre), y en virtud de eso, no retienen el colorante (y son de color
rosadito), entonces esas son GRAM.
 (1)
Libro Ecología Microbiana Pj 58- 70

fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gran negativo:

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y
se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior

Bacteria Gram negativa:

Las bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de
Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también
"gramnegativos”.
Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio periplasmático, 3-
membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-
porinas.

Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Otro sistema de clasificación de las bacterias utiliza las diferencias en la composición de su

pared celular. El empleo de una técnica llamada tinción de Gram pone de relieve estas
diferencias identificando las bacterias como Gram positivas y Gram negativas. Tras la tinción,
las bacterias Gram positivas retienen el tinte y se colorean de violeta, mientras que las
bacterias Gram negativas liberan el tinte y se tiñen de color rosado. Las especies

Enterobacter (Enterobacterias)
Enterobacterias, nombre común de una familia de bacterias Gram negativas que reciben este
nombre porque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseen flagelos son
móviles; el resto, inmóviles.
2.8 Estreptococo
Bacteria Gram positiva de forma esférica. Los estreptococos aparecen en pares o cadenas, y algunas
especies son patógenas en los seres humanos. Las infecciones estreptocócicas comprenden la faringitis, la
escarlatina, erisipelas, fiebre puerperal y algunas neumonías.
 TINCIÓN DE GRAM

Esta tinción desarrollada por el doctor Cristian Gram en 1884, es hoy la más utilizada en los laboratorios de
bacteriología y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana, agrupar las bacterias
en gran positivas y en gran negativa. La gran positiva poseen una capa gruesa de peptidoglican y carecen de
membrana externa, mientras que la gran negativa tienen una capa más delgada de peptidoglican y poseen
una membrana externa.

Algunas bacterias se clasifican como gran variables, pues simultáneamente presentan tinción se gran
positivas y de gran negativas, aun bajo condiciones óptimas de cultivo. Sin embargo, en su estructura estas
bacterias poseen una pared de gran positivas, aunque la capa de peptidoglican es más delgada que la
mayoría de las bacterias gran positivas.

Esta tinción además, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a antibióticos,
sensibilidades resistencia a sales biliares, punto isoeléctrico y tención superficial.

La tinción de gran involucra varios pasos:

1. Tinción inicial: Las células con cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso todas las
células se tiñen de morado.
2. Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un complejo
cristal violeta – yoduro. En este punto toda la célula continúan de color morado.
3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal violeta –
yoduro de las células gran negativas. De manera las bacterias gran positivas continúan moradas y
las negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta tinción, pues si se exagera, decolora
las gran positivas y si se hace muy débil no decolora a las gram negativas.
4. Contratincion: Se vuelve a teñir con safarina o fucsina, de manera que las bacterias gram negativas,
que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a fucsia según el colorante empleado; en tanto, las
bacterias gran positivas no se afectan con la contratincion y permanecen moradas debido a lo
intenso de esta coloración.

Además de una excesiva decoloración, otro factor que puede influir en que las bacterias gran positivas se
observen parcial o completamente rosadas, es la edad del cultivo; las células viejas tienden a perder su
capacidad de retener el complejo cristal violeta – yoduro y por lo tanto las bacterias se verán rosadas. Otro
factor de variabilidad podría ser condiciones de estrés durante el cultivo, que genera formas gran negativas
no viables, dentro de un cultivo de células gran positivas. (2)

)
Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio / Evelyn Rodríguez Cavallini
 CULTIVOS DE BACTERIAS: Descripción de cada una de las bacterias
utilizadas en el laboratorio.

ESCHERICHIA COLI: Es huésped constan te del intestino del hombre y de los

animales de sangre c aliente .por su especificidad está considerado como buen
índice de contaminación fecal .tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el
ambiente extraenterico, por lo que su presencia en los alimentos indica
contaminación reciente. (3)
(
Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas /

María del Rosario Pascual Anderson,Vicente Calderón y Pascual

SACCHAROMYCES : Es un género en el reino de los hongos

que incluye muchas especies de levadura.

BACILLUS: Es un género de bacterias en forma de bastón y

gram - negativas. Son aeróbico estrictos o anaeróbicos
facultativos.

ESTAFILOCOCOS: Es un tipo de bacteria que vive o está presente en la

mucosa especialmente alrededor de la nariz, boca en muchas
superficies de la piel de los humanos y otros sin ocasionar ningún
daño.
 IV. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:

Son un tipo de sujeción ajustable,

generalmente de madera, que
forma parte del equipamiento de
PINZA
laboratorio,

Es un utensilio metálico que

permite calentar sustancias,
MECHERO DE proporciona una llama caliente de
BUNSEN hasta 1500 grados centígrados.

Los alcoholes pueden ser

primarios, secundarios o
terciarios, en función del número
ALCOHOL de átomos de hidrógeno.

Nos sirve para hacer las torundas,

es decir, para cubrir y proteger las
ALGODÓN
muestras que hagamos en el
laboratorio.

Pieza o lámina rectangular de

cristal en que se coloca el objeto o
PORTA OBJETOS preparación que va a ser
observado en el microscopio.

Se aplica a la muestra para poder

observar la dicha muestra,
ACEITE DE
reflecta a la luz y se logra enfocar
INMERSIÓN
a una gran ampliación.
 Es un instrumento que permite
observar objetos que son
MICROSCOPIO demasiados pequeños para ser
vistos a simple vista.

Es un material que nos ayuda para

poder realizar las siembras
adecuadamente, tiene una punta
de alambre que cuando lo
ASA DE SIEMBRA
calentamos estamos
descontaminando.

REACTIVOS:

Solución de
toluidina 0.1%en
etanol 10%

ETANOL DE 40% Y Es un alcohol que se presenta en

DE 10% condiciones normales de presión y
temperatura como un líquido
incoloro e inflamable con un punto
de ebullición de 78 °C

KOH Es higroscópico absorbiendo agua

de la atmósfera, por lo que termina
en el aire libre
 Es el halógeno menos reactivo y
YODO
electronegativo.

V. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS

1. TINCION SIMPLE

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectar nuestra área de trabajo.

2. Encender el mechero y esterilizar el asa de siembra.

3. Dejar enfriar el asa de siembra para tomar la muestra de microorganismos, después

acercar el tubo hacia la muestra quitarle el tapón y flamear rápidamente la
boca del tubo, introducir el asa en el tubo y tomar cuidadosamente la
muestra.

4. Hacer el frotis y secarlo y fijarlo.

5. Cubrir con colorante /azul de metileno/ la
preparación y dejarlo actuar durante 1 minuto.

6. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

 7. Secar al aire y echar 2 gotas de aceite de inmersión.

8. Observar en el microscopio con el objetivo de 100X.

RESULTADOS:

 Lugo del montaje al microscopio óptimo.

Observamos flagelos finos filamentos de color rojo. Cuerpo bacteriano de color azul.

Bacillus subtilis

VII. CONCLUSIONES

COLORACION GRAM
Concluimos que en la práctica de laboratorio pudimos identificar que la morfología de las bacterias
(escherichia coli, saccharomyces, bacillus, estafilococos) y el tipo de tinción que presenta. Las gram
positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano la cual impide que escape el complejo cristal
violeta – lugol. Es por ello que tiñen un color azul (escherichia coli, saccharomyces), mientras que
la capa peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada y se encuentra a una
membrana externa lipidica susceptible a la decoloración con alcohol acetona; estas bacterias
teñirán de color rosa debido a la safarina (colorante de contraste)( bacillus, estafilococos).

TINCION SIMPLE
 Con esta práctica aprendimos a realizar adecuadamente la preparación correcta de un
frotis para poder realizar posteriormente las tensiones más utilizadas para el laboratorio
de microbiología que son indispensables para el correcto estudio de los
microorganismos.

 Así mismo mediante la realización de las tinciones logramos observar la forma y

agrupación y características de las bacterias.
  La tinción simple es una herramienta muy útil en el laboratorio de microbiología así como
análisis clínicos siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder
tener una correcta interpretación de los datos que nos otorga la diferenciación de Gram
positiva y negativas concluimos que debido a la estructura de sus paredes celulares
tendrán o no propiedades patológicas diferentes .

COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.

 En conclusión diríamos que la practica en el laboratorio sobre el corpúsculos metacromaticos nos

ayudarían a ver sobre la alcalinidad de nuestra saliva y así tendríamos que saber sobre cada uno
de nosotros pienso que es muy interesante realizarnos ese tipo de prácticas en el laboratorio.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

Para realizar las coloraciones especiales se puede emplear diferentes métodos e instrumentos, lo
importante es que logremos el objetivo que se tiene en cada práctica, en este caso es ver las
diferentes estructuras microbianas a través de las coloraciones especiales que se puede emplear
en cada método.

Además se quiere identificar si cada muestra pertenece al grupo del Gram positivos o negativos.

TINCIÓN DE NÚCLEO EN LEVADURAS

Se observó la levadura en forma de cocos, con color azul claro.

Gram positivo

VIII. RECOMENDACIONES

COLORACION GRAM

TINCION SIMPLE
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.
1. Se recomienda verter los líquidos reguladores de pH, NaOH (básico) y el HCl (ácido), gota a
gota para regular de manera exacta el agar y evitar accidentes con exceso de los mismos.
2. Utilizar los materiales de laboratorio con cuidado, por ser frágiles.
3. Leer la práctica y pedir orientación al docente antes de ingresar al laboratorio, para el
desarrollo correcto de la actividad

BIBLIOGRAFÍA:
 PRESCOTT MICROBIOLOGÍA QUINTA EDICIÓN PÁG. 70
 http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf
 Beishir, L. “Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course”.5ª Ed. Harper
Collins Pub. Inc., 1991.
 Case, C.L. y T.R. Johnson. “Laboratory experiments in Microbiology”. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.
 Claus, GW. “Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology”. 1ª Ed.
W.H. Freeman and Co. New York, 1989.
 Collins, C.H. y P.M. Lyne. “Microbiological methods”. Butterworth & Co. (Pub) Ltd., 1985.