GUIA DE LABORATORIOS

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MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

ANÁLISIS DE AGUAS POTABLES Y CRUDAS POR FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y

RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
PRÁCTICA #2

1. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: realizar el montaje de las técnicas filtración por

membrana y recuento estándar en placa mediante la determinación de coliformes
(totales y fecales), aerobios mesófilos, Pseudomonas aeruginosa, Enterococos fecales y
Clostriduim perfringes en muestras de aguas crudas y potables.

2. MARCO TEÓRICO: las técnicas de siembra se emplean de acuerdo al microorganismo

a evaluar y se estandarizan en el laboratorio teniendo en cuenta los reactivos, insumos,
materiales, medios de cultivo y condiciones con que se cuenta en el mismo; sembrar o
inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio de
cultivo adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.
Se deben tener en cuenta las siguientes condiciones para efectuar la siembra exigen:
Guardar la esterilidad del ambiente, los medios de cultivo y el instrumental a utilizar,
manipular de manera adecuada; si se trabaja en cabina de flujo, verificar el buen
funcionamiento del equipo y si se trabaja por fuera de ella, evitar las corrientes de aire y
utilizar mecheros.

El agua es el principal e imprescindible componente del cuerpo humano ya que éste no

puede estar sin beberla más de cinco o seis días sin poner en peligro su vida. El cuerpo
humano tiene un 75% de agua al nacer y cerca del 60% en la edad adulta;
aproximadamente el 60% es intracelular y el resto (agua extracelular) circula en la sangre
y baña los tejidos; necesitamos unos tres litros de agua al día como mínimo, de los que la
mitad aproximadamente los obtenemos de los alimentos y la otra mitad debemos
conseguirlos bebiendo.

La salud pública, así como la sostenibilidad ambiental dependen en gran medida de la

cantidad y calidad del agua del planeta. Es por esto que es muy importante el suministro
de agua potable y para esto se debe preservar y mantener la calidad de las fuentes de
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agua naturales por cuanto son varios los microorganismos que pueden alterar su calidad:
bacterias, virus, protozoos, helmintos y cianobacterias.

La calidad del agua es entonces una preocupación para países en desarrollo como el
nuestro; para superar estos inconvenientes se han definido bacterias indicadoras de
contaminación fecal en aguas: Coliformes totales y fecales (Escherichia coli), Enterococos,
fecales, Clostridium perfringes, colifagos, otros patógenos (virus y protozoos); estos
conducen a la propagación de enfermedades transmitidas por agua y alimentos
contaminados (origen hídrico) y a profundizar la pobreza por cuanto el porcentaje más alto
que ocupa los hospitales especialmente en países en vías de desarrollo es debido a
enfermedades de origen hídrico. A esto se le suma los actuales modelos de consumo, los
viajes y la presencia de microorganismos emergentes y reemergentes. Las enfermedades
emergentes son causadas por microorganismos que no eran patógenos y las
enfermedades reemergentes son las que reaparecen después de haberlas controlado casi
en su totalidad como la tuberculosis.
El suministro de agua microbiológicamente segura es uno de los principales propósitos del
saneamiento, así como preservar de la contaminación los manantiales y las aguas
superficiales. Su estudio, se basa en parámetros de calidad de aguas utilizadas para
consumo humano, aguas minerales naturales embotelladas, las regulaciones sanitarias
para las aguas recreacionales y de riego. El agua después de tratada puede contaminarse
por problemas de redes de distribución, conexiones defectuosas, tuberías viejas, grifos y
nuevos tendidos de tuberías; todo lo anterior justifica la realización de análisis
microbiológicos.

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA: son aquellas pruebas de laboratorio que se

efectúan a una muestra para determinar la presencia o ausencia, tipo y cantidad de
microorganismos como la presencia de bacterias patógenas: Coliformes totales y fecales
(Escherichia coli) según nuestra legislación para aguas potables: Decreto 1575 de 2007 y
Resolución 2115 de 2007 por medio de la cual se señalan características, instrumentos
básicos y frecuencias del sistema de control y vigilancia para la calidad del agua para
consumo humano buscando Escherichia coli y coliformes totales por la técnica de filtración
por membrana, sustrato definido, enzima sustrato y presencia ausencia; como prueba
complementaria se recomienda realizar la determinación de microorganismos mesofílicos,
cuyo valor máximo aceptable será de 100 UFC en 100 cm 3. Finalmente, se buscan
patógenos como Cryptosporidiun y Giardia. Para el caso de piscinas está la Resolución
1618 del 7 de mayo de 2010 y el Decreto 554 del 27 de marzo del 2015. En ella se
buscan: Heterótrofos (mesofilos), Coliformes termotolerantes, Escherichia coli,
Pseudomona aerouginosa, Cryptosporidium parvum y Giardia.
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MÉTODOS PARA DETERMINAR MICROORGANISMOS INDICADORES DE

CONTAMINACIÓN EN AGUAS CRUDAS Y POTABLES
Se toman como bacterias indicadoras de contaminación fecal: Coliformes fecales
(Escherichia coli), Enterococos fecales y Clostridium perfringes. Los mesófilos, P. aeruginosa
y coliformes totales tienen usos variados como se muestra a continuación.

TÉCNICA FILTRACIÓN POR MEMBRANA: se emplea para la determinación de

microorganismos en aguas claras, potables, piscina. La técnica se basa en el paso de una
muestra líquida a través de un filtro de membrana de nitrocelulosa con diámetro de poro de
0.45 micras y 47 mm de diámetro.

TÉCNICA DE SIEMBRA EN SUPERFICIE POR DISEMINACIÓN EN PLACA: también

conocida como recuento estándar en placa. Esta técnica es usada en recuentos microbianos
en muestras de aguas, suelos, lodos y alimentos.

3. MATERIALES Y EQUIPOS

Esta guía requiere la realización de 2 laboratorios donde se realiza el montaje y lectura de las
técnicas (filtración por membrana, recuento estándar en placa).

Montaje del laboratorio

Insumo o Equipo Cantidad por grupo*

Frascos Shott de 250 y 500 mL para tomar las muestras 1 unidad
Frasco Shott de 250 mL con Tisulfato de Sodio 3% 1 unidad
Guantes talla S 2 pares
Propipeteadores 2 unidades
Mecheros 4 unidades
Servilletas 10 unidades
Micropipetas de 1000, 100, 10 microlitros 1 unidad de cada una
Puntas estériles de 1000, 100 y 10 microlitros 1 caja de cada una
Agar Plate Count 4 cajas (pequeñas)
Agar Cromocult 4 cajas (pequeñas)
Embudo de filtración estéril 3 unidades
Estereomicroscopio 2 unidades
Bomba de vacío 1 unidad
Incubadora 1 unidad
Probetas estériles de 50 y 100mL 1 unidad de cada una
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Membranas de 0.45 de poro y 47mm de diámetro 6 unidades

Pinzas estériles 2 unidades
Pipetas estériles de 2 y 10mL 2 unidades de cada una
*Los grupos están conformados por cuatro personas; deben traer el kit de limpieza del
microscopio y material de bioseguridad.

Lectura del laboratorio

Insumo o Equipo Cantidad por grupo*

Estereomicroscopio 1 unidad
Lupas 2 unidades
Cocas descarte 1 unidad
Guantes 2 pares talla S
Mecheros 4 unidades
Pipetas Pasteur 3 unidades
Servilletas 10 unidades
*Los grupos están conformados por cuatro personas; deben traer el kit de limpieza del
microscopio y material de bioseguridad.

4. REACTIVOS: 1 spray lcohol de 70 GL.

5. PROCEDIMIENTO Describir cada uno de los pasos para el desarrollo de la práctica

5.1 MUESTREO: debe realizarse con mucho rigor porque de este depende en gran medida
tener buenos resultados. Se deben emplear guantes, es importante tener en cuenta:

• Identificar la muestra
• Fecha y hora de muestreo
• Identificación del sitio de muestreo (fotografías)
• Tomar la muestra de acuerdo al tipo de análisis

Aguas crudas y potables:

· Escoger el punto de muestreo y de ser necesario, la llave de uso más frecuente

· Dejar que fluya el agua por 5 minutos para purgar las tuberías o tomar en contra corriente
· Abrir el frasco o bolsa estéril y llenar el recipiente dejando una cámara de aire, cerrar
inmediatamente
· Enjuagar el frasco o bolsa con agua limpia
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· La muestra debe ser transportada al laboratorio y procesarse dentro de las primeras 8

horas y refrigerada a 4°C (no congelar)

5.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ACUERDO A LAS TÉCNICAS DE

SIEMBRA

TÉCNICA RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA (SIEMBRA EN SUPERFICIE): para que las

colonias puedan contarse de manera confiable, y en especial, en aguas crudas y residuales,
se preparan diluciones consecutivas o alternativas de la muestra empleando agua destilada
estéril o agua peptonada como diluyente, sembrar 2 cajas por dilución y dos diluciones por
muestra para así determinar el número de microorganismos presentes en unidades
formadoras de colonias (UFC) de células viables por gramo o mililitro de muestra; realizar la
siembra de la dilución o directamente de la muestra con una pipeta estéril tomando 0.1 ml de
y depositarlo en la superficie de la en la caja de petri con el medio de cultivo; se emplear
también para la siembra una micropipeta con un volumen de 100 microlitros; sembrar dos.
Esparcir la muestra con la ayuda de la punta de la pipeta o un asa de digraski para distribuir
la muestra de tal manera que en la superficie del agar queden los microorganismos
separados unos de otros y así poderlos contar; al terminar, tape la caja, lleve a incubadora en
posición invertida a la temperatura y tiempo requerido según el microorganismo.

TÉCNICA FILTRACIÓN POR MEMBRANA: en un embudo de filtración se coloca la

membrana y se miden 100 ml de muestra, se filtra al vacío y se coloca asépticamente el filtro
con la ayuda de una pinza en la superficie del medio de cultivo, se incuba a 35ºC ± 2. por 24-
48 horas.

5.3 LECTURA DE LAS MUESTRAS

Recuento estándar en placa: se toman las dos cajas de muestra de la dilución con
crecimiento más homogéneo, contar en un Cuenta colonias, sacar promedio y pasar el
reporte en UFC/ mL de muestra; tener en cuenta el factor de dilución. Para en caso de
mesófilos agua potable se acepta ≤ 100 UFC/ mL / 100 cm 3.

Filtración por membrana: se cuentan las colonias con la ayuda de un estereomicroscopio y

el resultado se informa en UFC/ 100mL. El color de las colonias depende del medio de
cultivo, por ejemplo, el color de las colonias de E. coli en agar cromocult, es azul- violeta y los
coliformes totales un color morado- rosa; P. aeruginosa sembrada en agar Cetrimide
presenta crecimiento abundante y fluorescencia verde- azul.
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6. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS: presentar los resultados en un formato tipo

artículo de acuerdo a la plantilla DC-LI-FR-002; tenga en cuenta los cálculos realizados.

7. PREGUNTAS DE PROFUNDIZACIÓN

¿Reconoce las diferencias entre las técnicas empleadas?

¿Está en capacidad de correlacionar los resultados de la lectura de las técnicas empleadas?

¿Se puede analizar por una sola técnica todo tipo de matrices?

BIBLIOGRAFÍA y CIBERGRAFÍA

Carrillo C, Maurtua D, Zurita S. 2002. Manual de Microbiología Básica y Experimental para

Estudiantes de Medicina. Lima, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

González, Gladys. Microbiología del agua: conceptos y aplicaciones. 1ª ed. Bogotá: Escuela
Colombiana de Ingeniería. 2012.

Koneman, Allen, Dowell. Sommers. (2008). Diagnóstico microbiológico. Texto y atlas en color.
Editorial Médica Panamericana S.A.
Mac Faddin J. 2003. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia
Clínica, 3era Edición. Buenos Aires, Editorial Panamericana.

Montoya O. 1999. Manual de microbiología. Universidad Nacional de Colombia.

Prescolt, L. Harley, J. Klein, D. Microbiología. 7ª ed. Madrid: McGraw Hill. 2009.

Tortora, Gerdad. Funke, Berdell. Case, C. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Editorial
Panamericana. 2007.

Nota: Verifique siempre el estado de agregación de los reactivos y el grado de peligrosidad de

los mismos para prever las medidas de seguridad adicionales que debe cumplir.