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Tesis Sobre Leche PDF
Tesis Sobre Leche PDF
1.3.2 Cuajado, 7
1.3.4 Moldeado, 8
1.3.5 Prensado, 8
1.3.6 Salado, 9
1.3.7 Madurado, 9
1.3.8 Acabado, 10
1.10.4.1 Timol, 27
1.12.1 Generalidades, 29
2-OBJETIVOS, 36
3- MATERIALES Y MÉTODOS, 39
3.4 Metodología, 46
untable base), 48
matemático, 51
4- RESULTADOS, 58
4.4.1 S.aureus, 86
4.4.2 E.coli, 96
4.4.3 S.Enteritidis, 105
4.4.4 L.monocytogenes, 113
5-CONCLUSIONES, 132
6-APÉNDICE, 136
7- BIBLIOGRAFÍA, 147
RESUMEN
1
1.1 Origen del queso
2
radicalmente el proceso de elaboración de este producto. Empezó a mezclarse leche
de distinta procedencia y distintos rebaños para obtener un producto homogéneo y de
ese modo disminuyó considerablemente el riesgo de aparición de organismos que
pudieran contaminar el producto.
El queso tiene una producción anual superior a otros productos del mundo
muy importantes tales como café, té, cacao y tabaco. Estados Unidos es el mayor
productor mundial y casi la totalidad de esa producción está dirigida al mercado
local, siendo casi nula su exportación. Alemania es el mayor exportador en cuanto a
cantidad y Francia el mayor exportador en cuanto a valor monetario. Así mismo,
siguen a Estados Unidos en cuanto a producción. Dentro de los países productores
en cuarta posición encontramos a Italia y en décimo lugar a la Argentina. Los países
importadores de quesos por excelencia son: Alemania, Reino Unido e Italia. El
mayor consumo per cápita lo registra Grecia, seguido de Francia y en tercera
posición, Italia. Luego siguen Suiza, Alemania, Países Bajos, Austria, Suecia,
etc.(SAGyP, MINAGRI,2010)
3
La Argentina se encuentra dentro de los países cuyas costumbres dietarias
incluyen el consumo de este producto alimenticio tal como se evidencia en la Figura
1.
4
La producción nacional de quesos según el tipo de pasta se puede observar en
la Figura 3. Si se observan los datos estadísticos de elaboración de quesos de pasta
blanda, se denota un aumento progresivo en los últimos años (2004-2008). Luego de
alcanzar el récord histórico de casi 455.000 toneladas en 1999, la producción
argentina acusó una merma del 27% hasta 2003. En 2004 se produjo un interesante
repunte del 20%, hasta ubicarse en las 398.000 toneladas. Mientras que los quesos
blandos crecieron el 13% en 2004, los quesos semiduros y duros exhibieron ritmos
superiores al promedio general del grupo, con alzas del 28 y 31%, respectivamente.
El crecimiento de la elaboración de quesos verificado en 2004 fue impulsado
principalmente por la demanda interna –alrededor del 80% de la producción
adicional respecto de 2003 fue absorbido por el consumo doméstico- y en menor
medida por las exportaciones, que se llevaron el 20% restante (SAGyP, MINAGRI,
2010).
Son numerosas las recetas queseras tradicionales con las que se cuenta
actualmente y que dan lugar a la gran variedad de quesos artesanales. Pero
independientemente del tipo de leche y del lugar de procedencia, hay un proceso
general (Figura 4) que a continuación se describe (ICMSF, 1980):
5
Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboración de Queso
Leche
↓
Filtrado
↓
Pasteurización
↓
Enfriamiento
↓
Inoculación con fermentos lácticos
↓
Adición de CaCl2 y cuajo
↓
Cuajado
↓
Corte de la cuajada
↓
Moldeado
↓
Prensado
↓
Salado
↓
Maduración, previo oreado, volteado y limpieza de los quesos
↓
Acabado
6
Figura 5: Preparación de la leche
1.3.2 Cuajado
Una vez la leche en la cuba de cuajado (Figura 6), se añaden los fermentos
lácticos, bacterias que contribuirán a la posterior maduración del queso. Es en esta
fase donde se le adiciona el cuajo, que dependiendo del tipo de queso podrá ser
vegetal, animal o microbiano, formándose “la cuajada”. Físicamente, consiste en la
precipitación de las micelas de caseína formando un gel que retiene además los
glóbulos de grasa, agua y sales.
7
elaborar. Luego se trabaja el grano mediante agitación y elevación de la temperatura
favoreciendo todavía más la expulsión del suero.
1.3.4. Moldeado
Figura 8: Moldeado
1.3.5. Prensado
8
Figura 9: Prensado
1.3.6. Salado
1.3.7. Madurado
A esta fase pasan los quesos tiernos, semicurados y curados. Son mantenidos
en cámaras donde se controla la temperatura y la humedad. Durante esta fase los
quesos son volteados frecuentemente para evitar que se deformen y la corteza se
forme de forma uniforme. La maduración comprende una serie de cambios en las
9
propiedades físicas y químicas adquiriendo el queso su aspecto, textura y
consistencia así como aromas y sabores característicos (Figura 11).
Figura 11: Madurado
1.3.8. Acabado
1.4. Producción de queso sin conservante (base) efectuada por Danone para el
presente estudio.
10
iniciadores o fermentos lácticos (fermentación) y cloruro de calcio (por tratarse de
leche pasteurizada) (Johnson,1997).
La función principal de este paso es la de producir ácido, principalmente
ácido láctico, destinado a: a) favorecer la formación de la cuajada por enzimas
coagulantes, como el cuajo; b) favorecer el drenaje del suero de los granos de
cuajada; c) impedir o inhibir el crecimiento de los microorganismos patógenos y de
los causantes de alteraciones, y d) gobernar las actividades de las enzimas que
inducen los cambios organolépticos deseados. Los cultivos lácticos iniciadores
producen ácido láctico a partir de la lactosa propia de la leche rindiendo
componentes del sabor y aroma como diacetilo. Estos cultivos solo son adecuados
para aquellos quesos en los que la temperatura de esta etapa no supera los 40ºC
durante algunos minutos. El cuajo ,con la colaboración del ácido formado, precipita
la caseína (proteína principal de la leche) y forma un gel.
La termización se realizó a 65ºC durante 6 minutos a un pH < 4,6
y tiene tres aspectos tecnológicos:
• Aumentar la tasa de recuperación de proteínas solubles, por
insolubilización de algunas lacto albúminas en medio ácido y mejorar el
rendimiento del proceso.
• Ajustar la temperatura óptima de separación de la masa magra del suero.
• Disminuir la carga microbiológica del fermento presente en la cuajada la
cual pasa aproximadamente de 1 x 107 UFC/mL (unidades formadoras de
colonias por mililitro) a valores del orden de 1 x 103 / 1 x 104 UFC/mL.
Esta disminución es necesaria para reducir la pos-acidificación del
producto.
Cuando la masa misma (luego de la adición del resto de los ingredientes como el
cloruro de sodio cuyo objetivo es potenciar el sabor y ayudar a controlar el
crecimiento de microorganismos alterantes) adquirió la firmeza adecuada se
sometió al proceso de homogenización y envasado. Esta operación puede ir
acompañada por la aplicación de una determinada presión (acondicionamiento). El
enfriamiento se realizó a una temperatura de aproximadamente 40ºC. Finalmente se
almacenó en cámara fría (0-5ºC).
11
Proceso de elaboración del queso untable base utilizado en el presente trabajo.
Recepción, descarga
y pasteurización de la
leche cruda
Pasteurización
Incorporación de
cloruro de calcio,cuajo y
fermento
Fermentación
Fermentación
Termización
Inyección de crema
Inyección de
ingredientes
Homogeneización
Envasado
Acondicionamiento
Enfriamiento
Homogeneización
Almacenamiento en
cámara fría
12
1.5 Variedades de quesos
Aunque es casi imposible realizar una lista única de quesos, sólo en Francia
hay más de 400 variedades de quesos, y en España encontramos, por ejemplo, queso
Burgos, Cabrales, Cebreiro, Mató, Quesaillas, Roncal (por sólo nombras algunos) y
el queso manchego, típico de la región de La Mancha . En Argentina, existen
numerosas variedades de queso (http://www.todoagro.com.ar). Una clasificación
muy general comprende:
Quesos blandos: son los que tienen abundante materia grasa y humedad. La textura
de ellos es muy cremosa, Eso hace que se los pueda extender con facilidad. Son
elásticos al tacto y tienen un aroma similar al de las nueces. Los quesos que
pertenecen a esta variedad son: el Camembert, el Cuartirolo y el Fontina. En esta
categoría entran los semiblandos como el Port Salut y el Mozzarella. Las
características de estos quesos los hacen ideales para ser usados en pizzas, budines,
terrinas, arroces, polentas y fondues.
Quesos duros y semiduros: son muy grasos pero con muy poca humedad. Son de
sabores suaves ó fuertes y texturas flexibles ó desmenuzadas. Algunos quesos de este
tipo tienen agujeros producidos por bacterias lácticas durante la maduración. En esta
categoría están: el Emmenthal, el Parmesano, el Reggianito, el Sardo, el Provolone y
el Pecorino. En esta categoría también se incluyen los quesos semiduros, como el
Cheddar, el Fontina y el Pategrás. Los quesos duros son apropiados para rallar,
preparar salsas y gratinar carnes, y los semiduros para fondue.
Quesos azules: son aquellos a los que se les introduce un cultivo fúngico (p.e.
Penicillium roquefortii) para generar las características vetas azules. Son intensos.
No deben oler a amoníaco ni tener sabor terroso ni muy salado. En esta variedad se
encuentran : el Azul y el Cabrales.
13
Ricota y el Fundido. Estos quesos son muy aptos para ser incorporados en ensaladas
y para elaborar salsas livianas y frías para acompañar carnes.
Los criterios para la clasificación de quesos son múltiples, ya que pueden basarse en
cuestiones documentales, jurídicas o tecnológicas. Sin embargo, los criterios de
clasificación más utilizados son los siguientes:
:
14
seguido de un enfriamiento inmediato ó microfiltrada (leche que ha sufrido una
micro-filtración. Este proceso consiste inicialmente en separar la nata de la leche,
posteriormente se filtra la leche desnatada a través de unas membranas muy
delgadas que retienen las bacterias y finalmente a esta leche filtrada se le
incorpora la nata en proporciones adecuadas).
15
1.7 El queso y la salud
Todos los tipos de queso aportan a nuestra dieta un gran valor nutritivo. El ser
humano puede vivir sin sufrir enfermedades causadas por carencias vitamínicas
consumiendo únicamente queso, pan y fruta, puesto que el conjunto de estas tres
llevan las vitaminas, sales minerales y proteínas necesarias para vivir. Según pasa el
tiempo el queso aumenta el aporte de calorías y mejora su calidad bacteriológica. El
queso también contiene la proporción adecuada de ácidos grasos. Es un alimento
fácilmente digerible a su vez. El conjunto de moho, bacterias que confiere puede
actuar de forma favorable en nuestra flora intestinal.
Los alimentos lácteos a los cuales acudimos como fuente de calcio nos
aportan mucho más a nuestra nutrición y salud. En una dieta, los productos lácteos
contribuyen aproximadamente sólo con el 9% de las calorías disponibles. En cambio
proveen el 73% del calcio, el 31% de la riboflavina, el 33% del fósforo, el 19% de
las proteínas, el 16% del magnesio, el 21% de la vitamina B12, el 17 % de la
vitamina A, el 10% de la vitamina B6, 6% tiamina, apreciables cantidades de
vitamina D y niacina equivalentes. De hecho los productos lácteos se reconocen
como “ricos” o “fuentes de muchos nutrientes” en sí mismos sin tener que ser
modificados (Mahaut y col.,2003).
16
recomendaciones previstas por el MERCOSUR, recogiendo los consejos mundiales,
establecen 1000 mg de calcio como Ingesta Diaria Recomendada o Ingesta Adecuada
para mayores de 18 años. Teniendo en cuenta los hábitos locales, ese requerimiento
es alcanzable sólo consumiendo no menos de 4 porciones/día de leche ó su
equivalente en derivados. Esta cantidad representa la cantidad que al menos el 97%
de la población necesita (Portela, 2007) .
17
Grasas- Aparte de ser fuente de energía (42% de la energía de la leche entera) aporta
a la textura, sabor y al poder de saciedad de este alimento. . Los lácteos son la fuente
natural más rica en ácido linoleico conjugado siendo identificado este producto como
potencial fuente benéfica para la salud, teniendo propiedades antioxidantes habiendo
evidencias de tener propiedades anticarcinogénicas (colon mama)
antiarteroesclerosis, estimular el sistema inmune.
18
Las BAL más comúnmente usadas desde el punto de vista de la tecnología
alimentaria pertenecen a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc , Enterococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Oenococcus,
Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Axelsson, L. 2004). Se
utilizan también cultivos “mixtos” como Lactococcus lactis ssp. cremoris y L. lactis
ssp. lactis (ambos mesófilos), Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus ,
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus,
Lb.delbrueckii ssp. lactis o Lb. helveticus.
Otro de los roles de las BAL es proveer un ambiente óptimo con respecto al
potencial redox, pH y contenido de humedad del queso (Wood, 1995).
19
pudieran haber contaminado inicialmente, aunque de no haberse respetado las
Buenas Prácticas de Elaboración podrían presentar enterotoxina estafilocóccica.
20
La dosis infectiva depende del estado inmunológico del individuo y ha sido
demostrado que alimentos ricos en grasa tienden a dar un ambiente protector al
microorganismo (Eley, 1996). Salmonella spp. se distingue de otros patógenos por su
frecuente presencia en alimentos, su habilidad para crecer en una gran variedad de
alimentos, su fácil diseminación y contagio persona a persona y su prolongado
período de excreción (10 semanas).
L.monocytogenes es un bacilo Gram positivo, asporógeno, anaerobio
facultativo y sobrevive a temperaturas de 0 a 45ºC. Su aw óptima de crecimiento es
de 0,97 con un mínimo de 0,93 y su pH óptimo de crecimiento está en el rango 5,6-
9,6 (Rocourt, 1997). La dosis infecciosa no está bien establecida pero
L.monocytogenes no representa un problema hasta tanto no alcance altos niveles de
contaminación, en personas sanas. Este microorganismo es ubicuo y puede
contaminar diferentes alimentos y bebidas. Aunque la listeriosis humana es
esporádica, se han reportado en algunos casos consecuencias severas a partir del
consumo de productos crudos, inadecuadamente calentados, y recontaminación de
alimentos tratados (Yuste y col., 2002). Ha sido asociada con varios brotes en los
cuales estaban implicados los quesos y consecuentemente su ocurrencia ha sido
muy bien estudiada. L. monocytogenes es un importante microorganismo asociado a
enfermedades transmitidas por alimentos debido a la severidad de la infección
causada y a la mortalidad que produce (30%). La contaminación de muchos
alimentos con L. monocytogenes es casi inevitable debido a su naturaleza ubicua en
el medio ambiente. Mas aún su inusual habilidad por sobre otros patógenos de crecer
a temperaturas de refrigeración la asocia con productos normalmente almacenados
en estas condiciones (Smith-Palmer y col., 2001). Ha sido detectada en numerosos
alimentos incluyendo paté( Mc Lauchlin ,1991), comida lista para consumo y
particularmente en quesos blandos ( Linnan y col., 1999). La supervivencia de este
patógeno a valores de pH muy bajos (3,0 a 4,5) ha recibido poca atención,
probablemente debido a que se asume su rápida muerte bajo estas condiciones, pero
resultados obtenidos por Parish y col. (1989) indican que en productos de bajo pH
puede encontrarse Listeria y se puede producir una masiva contaminación si estos
alimentos son consumidos en un período corto de tiempo. Su crecimiento a pH <4,4
está influenciado por la temperatura y el tipo de ácido (McLauchlin, 1990).
21
1.10 Tecnologías combinadas de preservación
22
(reduciendo aw y pH, añadiendo compuestos activos a nivel de membrana). Para
esporas, la idea es dañar estructuras claves (por ataque químico, enzimático o físico
sobre el cortex) o provocar la germinación de las mismas (con “falsos disparadores”,
por aplicación de altas presiones, etc.) (Gould y col., 1983; Gould, 1995).
23
Cuando la aw del medio externo se reduce, los microorganismos tienden
rápidamente a alcanzar el equilibrio osmótico con el medio que los rodea,
principalmente a través de la pérdida de agua, produciéndose plasmólisis de la
célula con pérdida de la turgencia de membrana. Inmediatamente se pone en
marcha un mecanismo osmoregulador que les permite recuperar el agua pérdida y
mantener la homeostasis con respecto de su contenido de agua. Se produce la
acumulación intracelular de solutos “compatibles” por síntesis y/o por transporte
activo desde el medio extracelular hasta balancear la osmolalidad externa (Gould,
1995).
24
El pH es otro factor básico en la preservación de alimentos, afectando la
conformación de las proteínas, el camino de síntesis enzimática y los productos
finales del metabolismo. El crecimiento y la supervivencia de los
microorganismos están fuertemente influenciados por el pH y el contenido de
ácidos orgánicos del alimento. Éstos determinan, de acuerdo a su valor, floras
contaminantes diferentes y de distinta resistencia a los factores de conservación.
Las bacterias, en general, requieren un rango de pH externo entre 4 y 9 para poder
crecer, mientras que los hongos y las levaduras exhiben mayor tolerancia,
pudiendo desarrollarse en los rangos de pH externo 1,5-11,0 y de 1,5-8,0,
respectivamente (Alzamora, 1997).
25
membranas y actúan como transportadores de protones, ionizándose en el
citoplasma y acidificando el medio interno. El efecto primario es disminuir el
pHi, pero además, el anión del ácido no disociado puede tener efectos inhibitorios
específicos en el metabolismo, incrementando el efecto del pH (ej: ácido acético,
fórmico, sórbico).
26
de los consumidores quienes los perciben como artificiales, ha surgido un creciente
interés en alternativas más naturales. Particular interés se ha planteado en la potencial
aplicación de aceites esenciales de plantas. La propiedades antimicrobianas están
bien establecidas contra un gran espectro de microorganismos incluyendo bacterias
(Smith-Palmer y col., 1998) ,levaduras ( Lachowicz y col.,1998; Mangena y
Muyima, 1999) y hongos (Paster y col., 1990; Mishra y Dubey 1994).
1.10.4.1 Timol
27
El aceite de tomillo es obtenido por destilación por arrastre de vapor de las
hojas de Thymus vulgaris. Sus componentes mas importantes son los alcoholes
fenólicos los que expresados como timol se encuentran en una concentración
superior al 35%. Otros componentes observados lo constituyen el p-cimeno y el
terpineno los que junto al timol le imparten su aroma y sabor característico.
El timol es empleado para aromatizar todo tipo de alimentos. Dentro de la
industria farmacéutica el timol es un conocido antiséptico, su color es amarillo
intenso, olor agradable, densidad 0,91 - 0,94 e índice de refracción 1,492 - 1,499.
El mismo es reconocido también como conservante natural contra
Staphylococcus aureus y Salmonella Enteritidis (Juven y col. 1994; Lambert y col.,
2001). Algunos de los sinónimos con los que se lo puede encontrar en la bibliografía
son: ácido tímico, alcohol timólico, fenol timólico, isopropilmetacresol, etc. Medina
y col. (2004) estudiaron la actividad bactericida “in vitro”, por el método de difusión
en agar, frente a cultivos puros de cinco bacterias patógenas (Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis, Enterococcus sp. y
Escherichia coli) y seis cepas de bacterias lácticas que alteran alimentos. Los
resultados encontrados destacan la efectividad del aceite de tomillo frente a cultivos
puros de bacterias patógenas así como frente a bacterias lácticas (Alzamora y
col.,2003).
28
Los quesos presentan problemas de vida útil en heladera asociados al hábito
de consumo (alimentos de abre y cierre) que provocan un deterioro prematuro por
desarrollo de microorganismos. Estos productos pasteurizados poseen un pH
relativamente elevado (5,1- 6,2) y una actividad de agua (aw) óptima para el
desarrollo microbiano. Numerosos estudios han establecido que el deterioro de los
mismos depende de factores intrínsecos tales como variedad del queso, aw,
contenido de sal, contenido y tipo de emulsificante, pH y de factores extrínsecos, de
los cuales los más importantes resultan la temperatura de almacenamiento y la
contaminación post-pasteurización. Datos de bibliografía muestran que Listeria
monocytogenes, Salmonella spp, y Staphylococcus coagulasa positivo representan a
los patógenos de mayor incidencia en quesos (Ahmed y col.,1988; Abdalla y
col,1992; Altekrus y col.,1998; Larson y col.,1999; Jorgensen y col.,2005). Si se
quieren obtener juicios confiables sobre la calidad de este alimento, su vida útil y su
seguridad, es necesario disponer de datos cuantitativos sobre los efectos de los
factores que afectan el crecimiento, la supervivencia y/o la inactivación.
1.12.1 Generalidades
29
apropiados, la microbiología predictiva permite la selección de los factores de
preservación para alcanzar la vida útil deseada de diversos alimentos.
30
microbiólogos de alimentos comenzaban a aceptar que los métodos microbiológicos
tradicionales para determinar la calidad y seguridad alimenticia, estaban limitados
por el tiempo requerido para obtener los resultados y que los métodos indirectos
basados en cambios químicos, físicos o fisicoquímicos, no proporcionaban una
respuesta hasta que un gran número de células se encontraba presente. Lo mismo
ocurría con varios métodos rápidos que necesitaban, o bien un alto nivel de
contaminación para que la respuesta sea evidente, o dependían del uso de
equipamiento muy sofisticado y oneroso.
Antes del advenimiento de la microbiología predictiva, la mayor parte de la
bibliografía definía las condiciones ambientales limitantes del crecimiento, cuando
los demás factores ambientales se encontraban en los valores óptimos. Además, sólo
ocasionalmente los efectos de dos o más factores de conservación se estudiaban de
tal forma que permitieran cuantificar la interacción de los mismos. A consecuencia
de ello, muchos de estos datos no eran de utilidad o bien no permitían predecir la
respuesta microbiana.
Si bien el modelado no revela comportamientos microbianos extraños o poco
esperados, los modelos se pueden usar para predecir, por interpolación, el
crecimiento bajo una combinación de condiciones que no fueron específicamente
testeadas en el protocolo experimental (Whiting, 1995).
Se han propuesto varios esquemas para categorizar los modelos, uno de ellos
propone dividirlos en modelos de crecimiento y modelos de
inactivación/supervivencia. Dentro de cada categoría se subdividen en modelos
primarios, secundarios y terciarios (Whiting y Buchanan, 1994; Alzamora y col.,
1995; López-Malo, 2000; Alzamora y col.,2010).
Los modelos primarios describen cambios en la respuesta microbiana con el
tiempo en un ambiente específico. El modelo puede cuantificar unidades formadoras
de colonia por mililitro o por gramo (UFC/mL), formación de toxinas, niveles de
sustrato o productos metabólicos (que son medidas directas del crecimiento);
absorbancia e impedancia (medidas indirectas de la respuesta). Una vez generada la
curva de crecimiento o muerte microbiana, se utiliza una función o ecuación
matemática para describir el cambio de la respuesta en función del tiempo. Ejemplos
de modelos primarios son: la función de Gompertz para crecimiento exponencial; el
modelo de Gompertz modificado para describir la inactivación microbiana; modelos
para describir la declinación no lineal de esporas sobrevivientes con el tiempo; el
31
modelo logístico aplicado a destrucción térmica; el modelo de Stannard; el modelo
de Schnute; la ecuación de Fermi; etc. (Mc Meekin y col., 1993). El valor D (tiempo
necesario a una determinada temperatura para reducir en un 90% la población
microbiana ) es también ejemplo de un modelo primario (Whiting y Buchanan,1994).
Los modelos secundarios describen las respuestas de los parámetros de los
modelos primarios frente a cambios en uno o más factores ambientales como
temperatura, pH o aw. Ejemplos de modelos secundarios son el modelo de Arrhenius
y el modelo de la raíz cuadrada (Bělehrádek), que describen la dependencia con la
temperatura, y el modelo polinómico. El valor z (ºC necesarios para disminuir el
valor D un ciclo logarítmico) utilizado en procesos térmicos es también un ejemplo
de modelo secundario (Whiting y Buchanan, 1994). Los mismos no serán objeto de
estudio en el presente trabajo.
Los modelos terciarios son rutinas de software para computadora menos
difundidas que convierten a los modelos primarios y secundarios en programas
amigables. Estos programas pueden calcular las respuestas microbianas frente a
condiciones que no fueron evaluadas inicialmente, comparar el efecto de diferentes
condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos, por lo que
permiten elegir a el o los microorganismos blanco de ataque en situaciones
específicas de formulación-procesamiento de alimentos. Ejemplos de modelos
terciarios son el programa “USDA Pathogen Modeling Program” realizado por el
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, disponible gratuitamente en
Internet (http://www.arserrc.gov) y el “Food Micromodel” avalado por el Ministerio
de Agricultura Pesca y Alimentación del Reino Unido (Wilson y col., 2002).
Es necesario remarcar que llevando a cabo este modelado se puede describir
exitosamente el comportamiento microbiano en la mayoría de los alimentos pero hay
ocasiones en las que se encuentran discrepancias entre el modelo y el crecimiento
observado . Estas discrepancias son descriptas como “fallas”. Un ejemplo sería que
el crecimiento observado es más lento que el predicho por el modelo (Wilson y col.,
2002).
32
Una de las debilidades mayormente encontradas está dada por la severidad
del medio que representa la matriz alimentaria con respecto a los medios de cultivos
que se utilizan en los ensayos de laboratorio. Otra debilidad observada está
relacionada con cuanto de rápido se adapte el microorganismo a su nuevo medio
ambiente. Si en los experimentos se utilizan los mismos microorganismos a los
utilizados en el programa PMP, medios similares y las mismas condiciones de
crecimiento es de esperar que el alimento en estudio provea condiciones más
favorables aún para el crecimiento bacteriano que el medio utilizado en Laboratorio
(Walls y Scott ,1997).
Recientes estudios han indicado que las condiciones bajo las cuales el inóculo
utilizado debe crecer tienen un impacto importante en el crecimiento o inactivación
bacteriana. Los datos utilizados para generar los modelos están basados en el
crecimiento de cepas a su vez crecidas en ambientes favorables antes de ser usadas
en el medio de cultivo. Estas células pueden tener diferencias en sus tiempos de fase
lag , en sus características de crecimiento, etc., con respecto a células que no fueron
pre-adaptadas.
33
• Control de Calidad: Los modelos pueden brindar ayuda en desarrollar
programas HACCP mostrando que condiciones permiten crecer o
sobrevivir y así identificar los puntos críticos de control. Esto es
particularmente importante en alimentos en donde pueden existir
interacciones de diferentes factores que influyen en el crecimiento
microbiano.
34
2. OBJETIVOS
35
2.1 Objetivo general
36
4) Una vez validados los modelos, evaluar la influencia de los factores de
estrés aplicados de uso corriente o potenciales (p.e. uso de antimicrobianos naturales)
a través del análisis de los parámetros obtenidos para los distintos modelos.
37
3. MATERIALES Y MÉTODOS
38
3.1- Matriz utilizada
A los fines prácticos llamaremos queso untable base al queso untable sin
sorbato de potasio y queso untable al que posee sorbato de potasio (1000 ppm) y
que es el que se adquiere para consumo masivo.
39
Crema 15,98%
Gelatina (textura) 0,002%
Citrato de Sodio (estabilizante de proteínas) 0,0008%
Cloruro de Sodio 0,0006%
Cloruro de Calcio 0,004%
Fermento(cultivo iniciador) 0,02%
Cuajo 0,0001%
3.1.2 Medición de pH
40
3.2- Reactivos utilizados
41
Fosfato monopotásico 1,5 gr
42
Agar Levine ( Difco, Detroit, USA), composición:
Peptona 10,0 gr
Lactosa 10,0 gr
Fosfato dipotásico 2,0 gr
Eosina 0,4 gr
Azul de metileno 0,065 gr
Agar-agar 15,0 gr
43
El enriquecimiento de cada colonia pura fue realizado en los caldos o medios
líquidos correspondientes: S. aureus en caldo cerebro-corazón (BHI), L.
monocytogenes en caldo de enriquecimiento FDA (Food and Drug Administration) y,
S. Enteritidis y E. coli en agua peptonada.
Aislamiento de S.aureus ATCC 25923 utilizados en este estudio, medio agar Baird
Parker.
44
Aislamiento de S.Enteritidis aislada de material clínico utilizada en este estudio,
medio agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa.
45
3.4-Metodología
Para cada una de las cepas, se aisló una colonia a partir del agar diferencial y
selectivo correspondientes (Figuras 2a, b, c y d). Dicha colonia se inoculó en 10 ml
de caldo de enriquecimiento (Materiales y Métodos, sección 3.2), el cual se incubó
durante 24 hs a 37ºC.
Para la elaboración de un inóculo madre, se tomó 0,5ml del inóculo de cada
microorganismo y se diluyó en 500 ml de agua peptonada alcanzando en todos los
casos una solución con un recuento aproximado de entre 105 y 107 UFC/ml .
46
minutos a baja velocidad. Las bolsas, conteniendo los 160 gr de queso inoculado y
0,48 gr de timol, se cerraron manualmente sacando todo el oxígeno remanente y se
almacenaron a las distintas temperaturas correspondientes en cada ensayo (5ºC-
25ºC) para su posterior análisis.
47
La experiencia se llevó a cabo tal como se indica en el siguiente cuadro:
48
Volumen de jugo de limón agregado pH final medido
(ml)
0,1 5,0
0,3 4,6
0,5 4,5
0,7 4,4
0,9 4,3
1,1 4,2
1,3 4,1
22ºC/5,0 0,2,5,7,12,16,19,26,28,30,33 y 38
10ºC/ 4,3 0,20,40,50,60 y 65.
15ºC/ 4,3 0,3,7,11,14,17 y 19.
22ºC/ 4,3 0,2,6 y 20
49
3. 5.4 Estudio de reto microbiano
25ºC/ 5,0 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7
50
los fines de poder realizar una comparación del comportamiento del microorganismo
ensayado. Se realizó el siguiente esquema de muestreo:
3. 6. 1 Modelado primario
donde:
51
Log N: Log. decimal del recuento bacteriano a tiempo t
Tiempo (día)
Log10 (2 ) ⋅ exp(1)
TG (día ) = eq(2 )
BC
VCE((Log10 UFC / g ) / día ) = eq(3)
BC
exp(1)
LAG(día ) = M −
1
eq(4)
B
52
Los valores de los parámetros se pueden determinar por el ajuste de la función de
Gompertz a los datos experimentales por un procedimiento de estimación iterativa
que determine el mejor ajuste de acuerdo al criterio de los cuadrados mínimos.
donde
53
3.6.2 Modelo terciario
54
Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano
55
3. 7 Análisis estadístico
56
4. RESULTADOS
57
4.1 Estudios de microbiología predictiva en queso untable. Efecto de la
temperatura de almacenamiento
58
Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5°C (-■- ) y 15°C ( -■- ) en
el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en queso untable (b); (I)
desvío estándar.
59
Este modelo se ha venido aplicando con éxito para caracterizar el
comportamiento de una variada gama de microorganismos y alimentos. Bhaduri y
col. (1991) fueron los primeros en demostrar que la curva descripta por la ecuación
de Gompertz modificada podía describir el comportamiento no lineal de curvas de
supervivencia en el caso de L.monocytogenes en pasta de salchichas.
Posteriormente, Linton y col. (1995) utilizaron exitosamente esta ecuación para
describir el comportamiento no lineal de L.monocytogenes y encontraron que esta
ecuación era efectiva para modelar curvas de supervivencia lineales y curvas de
supervivencia con región de hombro y cola.
Char (2006) estudió la respuesta de L.innocua en jugo de naranja combinando
tratamientos térmicos a diferentes temperaturas (57 a 61ºC) y adicionando diferentes
niveles de vainillina (0 a 1100 ppm). La ecuación de Gompertz modificada explicaba
más del 98% de las variaciones observadas .En general altas concentraciones de
vainillina combinada con tratamientos térmicos se traducían en curvas cercanas a la
linealidad con pequeños o ausentes hombros (con consecuentes bajos valores del
parámetro A) y altas tasa de muerte caracterizadas a través del parámetro B. Un
descenso en el parámetro B refleja una disminución en la resistencia microbiana.
Chhabra y col. (2002) obtuvieron similares respuestas cuando estudiaron la
respuesta de L.monocytogenes en cuanto a resistencia térmica (50, 60 y 65ºC) en
diferentes condiciones de pH y niveles de grasa en leche. Ellos también encontraron
que este modelo era muy versátil describiendo diferentes tipos de curvas de
inactivación (curvas cercanas a la linealidad, curvas con región de hombro y curvas
sigmoideas) con altos niveles de correlación.
Como puede observarse en la Figura 2, en el caso de S.aureus inoculado en
queso untable almacenado a 5ºC, el modelo ajustó correctamente con valores
predichos muy cercanos a los obtenidos experimentalmente. El análisis de la
varianza (Tabla 1) arrojó un coeficiente de determinación ajustado por grados de
libertad elevado, con lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un 73% de las
variaciones observadas en las repuesta con un valor del estadístico F significativo (α
< 0,05%). El análisis de valores observados vs. valores predichos mostró una
distribución homogénea alrededor
60
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable almacenado a 5ºC, () valores experimentales; (—)
predicción .
0
-0,4
LogN/N0
-0,8
-1,2
-1,6
-2
-2,4
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (día)
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 10,12 3 1348*
RESIDUAL 0,005 2
R2 ajustado 99,70
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
61
Este modelo predijo un hombro inicial (A) de ~ 1 día; una velocidad de
muerte (B ) de 0,35 día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes que
cuadriplica al observado (C= 8,6), hecho que probablemente se deba a la ausencia de
una cola marcada en la curva de muerte (Alzamora y col,2010).
Ferrante y col. (2007) utilizó el modelo de Gompertz modificado para
modelar supervivencia de L.monocytogenes en jugo de naranja fresco (pH 3.5)
ultrasonicado (600 W,2 0 KHz, 95.2 µm de amplitud de onda; 45ºC). Este modelo
representó exitosamente las curvas de supervivencia de L.monocytogenes que
resultaron completamente sigmoideas y semi-sigmoideas dependiendo del
tratamiento. Estos autores también describieron la sobreestimación del parámetro C
para las condiciones más severas en donde combinaban 1000 y 1500 ppm de
vainillina mas tratamiento con ultrasonido dado que la población microbiana
disminuía muy rápidamente describiendo una curva sin cola.
(b)
valores observados
0 (a) 0,06
-0,4
0,04
residuales
-0,8
0,02
-1,2
0
-1,6
-0,02
-2
-0,04
-2,4
-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0 -0,06
-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0
valores predichos
valores predichos
62
distribución homogénea alrededor de la diagonal mientras que la distribución de los
residuales no mostró anomalías de conos o herraduras (Figura 5 a y b). Este
modelo predijo para S. aureus inoculado en queso untable base almacenado a 15°C
un hombro inicial (A) de 4,55 días; una velocidad de muerte (B) de 0,39 día-1 y un
cambio global (C) de 1,55 ciclos, el cual es muy cercano al valor observado
experimentalmente.
0
-0,3
LogN/N0
-0,6
-0,9
-1,2
-1,5
-1,8
0 4 8 12 16 20
Tiempo (día)
63
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
almacenado a 15 ºC.
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 6,49 3 432
RESIDUAL 0,03 6
R2 ajustado 98,59
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
0,16
Valores observados
0 (b)
(a) 0,11
Residuales
-0,3
-0,6 0,06
-0,9 0,01
-1,2 -0,04
-1,5 -0,09
-1,8 -0,14
-1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0 -1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0
valores predichos Valores predichos
64
detalla en Materiales y Métodos, sección 3.5.2. Para ello se trabajó con la misma
cepa de S.aureus y una vez inoculado el queso untable base (sin agregado de 1000
ppm de sorbato de potasio) se procedió a incubarlo a 15ºC.
En este caso se observó un leve decaimiento de la población (1 ciclo
logarítmico en ~ 18 días). Este comportamiento fue similar al observado en queso
untable con la presencia de sorbato de potasio a igual temperatura de
almacenamiento (Figura 6).
Estos datos experimentales podrían estar indicando la falta de relación entre
el comportamiento observado de S. aureus en el queso untable y la presencia del
sorbato de potasio ya que en ausencia del mismo el perfil de supervivencia de la
población se mantuvo.
65
las diferentes regiones de la curva de supervivencia: el hombro inicial (A~ 5,9 días),
la máxima velocidad de muerte (B~ 0,5 día-1) y el cambio global en el número de
sobrevivientes (C~ 1,4 ciclos), junto a los estadísticos de ajuste del modelo. Se
obtuvo un R2 ajustado por grados de libertad 99%. El valor de F muy significativo
(α<0,01), demostró que el modelo fue apropiado para describir el comportamiento
observado. La validación interna determinó concordancia entre los valores
observados y predichos y una adecuada distribución de residuales (Figura 8 a y b).
0,1
-0,1
Log N/N0
-0,3
-0,5
-0,7
-0,9
-1,1
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (día)
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 1,95 3 325**
RESIDUAL 0,006 3
R2 ajustado 99,08
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
66
Figura 8 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus
en queso untable base almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción.
(b)
(a) (X 0,001)
55
Valores observados
0,1
-0,1 35
Residuales
-0,3
15
-0,5
-5
-0,7
-25
-0,9
-1,1 -45
-1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1
67
4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento
68
Figura 9 : Comportamiento de S. aureus en el queso untable base almacenado a
10ºC (-♦- ), 15ºC ( -■- ) y 22ºC ( -▲-). (a) pH 5,0; (b) pH 4,3; (I): desvío estándar.
69
establece crecimiento de S. aureus (en un caldo de cultivo) con una fase de latencia
de 10 días, aumento exponencial de la población hasta el día 35 y fase estacionaria a
partir de allí (Figura 10a).
En queso untable base almacenado a 15ºC, la respuesta de S.aureus fue
nuevamente de muerte a lo largo del tiempo de almacenamiento pero con una
reducción de 1 ciclo logarítmico en 22 días contradiciéndose nuevamente con lo
predicho por el programa PMP (Figura 10 b).
La Figura 10c muestra la curva de crecimiento de S. aureus en queso untable
base (pH 5,0) a 22ºC junto a los datos predichos mediante la aplicación del
programa predictivo PMP. En la misma se observa que el comportamiento de S.
aureus a 22°C, predicho por el programa PMP determina que la fase de crecimiento
exponencial comienza inmediatamente (sin período de fase lag) y termina en el día 5,
mientras que experimentalmente se observó que el crecimiento exponencial
comienza a partir del día 12 (tiempo de fase lag) y termina aproximadamente el día
28. Es decir que, si bien hay coincidencia en los valores observados y predichos para
este microorganismo en las condiciones estudiadas, se produce un corrimiento en el
tiempo ya que el comportamiento en la matriz alimentaria presenta un período de
adaptación inicial que retrasa el crecimiento exponencial.
Si bien este software predictivo es de muchísima utilidad en sistemas simples
(como los sistemas modelo y medios de cultivo), en alimentos reales podría fallar
dado que los factores intrínsecos propios del alimento así como también las
interacciones que pudieran derivar entre ellos y los microorganismos (se trate de
sinergismos o antagonismos) alteran la respuesta observada y la alejan de la
predicción. En todo modelo predicho el comportamiento bacteriano está descripto
para un medio de cultivo con los nutrientes óptimos para permitir, si fuera factible, el
crecimiento bacteriano. Esta es posiblemente la causa por la que no se observó
concordancia con la predicción (Whiting, 1997).
70
Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH 5,0 y
diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10º C, (b): 15ºC y (c): 22ºC . ( ▬ )
predicción , ( --- ) limite de confianza superior predicho, ( --- ) limite de confianza
inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales; (I) desvío estándar.
71
Los modelos matemáticos usualmente se realizan con una mezcla de 3 a 5
cepas “típicas” (Whiting, 1997). De esta forma estos modelos predichos se traducen
muchas veces en rápido crecimiento o por decirlo de otra forma en cepas de fácil
desarrollo. Este mecanismo tiene la ventaja de que el modelo se convierta en un
sistema “seguro”. Pero existe una diversidad natural en los tiempos de crecimiento o
supervivencia de cepas de microorganismos patógenos. La otra fuente de variación
no incluída en los modelos existentes es el estado fisiológico de la cepa y su historia
previa. Hudson (1993) ha demostrado que la duración de la fase lag de Aeromonas
hydrofila depende de la temperatura a la cual la cepa estaba sometida o mantenida en
su estadío previo y de la nueva temperatura en la cual la cepa se encuentra en el
alimento que ha contaminado. En cambio la fase de crecimiento exponencial
posterior a la finalización de la fase lag no es afectada por la temperatura previa. Un
patógeno en un determinado alimento adaptado a temperatura de refrigeración en una
planta de procesamiento a 10ºC presentará una fase lag más corta y un comienzo más
temprano del crecimiento exponencial ,si accidentalmente contamina ese mismo
alimento refrigerado, que la que debería observarse en un modelo corriente. Baranyi
y Roberts (1994) consideraron que la fase lag es una consecuencia de dos procesos,
el primero reflejado por el estado previo en el que se encontraba la bacteria (por
ejemplo temperatura) y el segundo dependiente del grado de ajuste de un ambiente
(fisiológica y bioquímicamente) al siguiente ambiente o medio intrínseco.
En el caso en donde se trabajó con queso untable base (pH 5,0) inoculado y
almacenado a una temperatura de almacenamiento de 10ºC se observó que el modelo
ajustó adecuadamente a los datos experimentales (Figura 11) con un coeficiente de
determinación R2 de 99%. La Tabla 4 muestra los parámetros A, B y C que
caracterizan a la curva así como también la significación del modelo (F = 927 muy
significativo, α<0,01). La validación interna (Figura 12a y b) del modelo propuesto
mostró concordancia entre los datos experimentales y predichos así como también
72
una distribución homogénea de los residuales. Como puede analizarse el modelo
predijo la ausencia de hombro inicial (A= - 0,16 días); una velocidad de muerte de
0,05 día-1 y un cambio global (C) de 9,4 ciclos. Al parecer este modelo falló en la
predicción de la caída total observada y esto pudiera deberse a la ausencia de una
cola marcada en los datos experimentales, hecho que ya ha sido comentado.
0,6
-0,4
Log N/N0
-1,4
-2,4
-3,4
-4,4
0 10 20 30 40
Tiempo (día)
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
73
Figura 12 : Validación interna del modelo propuesto para la inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 10 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
(—) predicción.
(b)
(a)
Valores observados
0,6 0,32
-0,4 0,22
Residuales
0,12
-1,4
0,02
-2,4
-0,08
-3,4 -0,18
-4,4 -0,28
-4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6 -4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
74
Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22ºC, () valores
experimentales; (—) predicción
9,1
Log N 8,1
7,1
6,1
5,1
4,1
0 10 20 30 40
Tiempo (dia)
75
Figura 14 : Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción
0,6
9,1 0,4 (b)
Valores observados
(a)
Residuales
8,1 0,2
7,1 0
6,1 -0,2
5,1 -0,4
4,1
-0,6
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 9,1
Valores predichos Valores predichos
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz PMP
TG (día) 1,17 0,10
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
76
El análisis de la Tabla 5 determina que comparando los parámetros
biológicos característicos de la curva de crecimiento de S. aureus en queso base (pH
5,0; 22 °C) adecuadamente estimados por el modelo de Gompertz con la estimación
del programa PMP puede verse que, este programa predice escaso tiempo de latencia
(0,7 días vs. 18 días); triplica la velocidad de crecimiento exponencial respecto de la
observada (1,4 Log UFC/g/día vs 0,3 Log UFC/g/día) y disminuye notoriamente el
tiempo de generación respecto del observado (0,1 día vs 1,2 días). Si bien la
temperatura favorece el crecimiento del microorganismo el alimento real no ofrece
en este caso condiciones tan favorables como el medio de cultivo probablemente
debido a la presencia de flora competitiva y/o posibles inhibidores.
77
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10º C(a), 15ºC (b) y 22ºC (c):
(▬) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite de
confianza inferior predicho ,(-♦- ) datos experimentales.
78
Si bien en las experiencias de reto microbiano realizadas en queso untable
base con pH reducido (pH 4,3) se dispuso de escasos puntos experimentales se
realizó un modelado primario solo con el fin de orientar sobre los parámetros
característicos de las curvas obtenidas a 10, 15 y 22 °C y comparar con la predicción
del programa PMP.
A 10ºC se observó que el modelo de Gompertz modificado para
supervivencia ajustó adecuadamente los datos experimentales (Figura 16). El
análisis de la varianza (Tabla 6) estimó un valor de coeficiente de determinación R2
de 99,99% con un valor de F muy significativo (F = 8,4x108; α<0,001). El modelo
fue validado internamente observando una distribución homogénea en torno a la
línea diagonal de valores experimentales vs. valores predichos y desestimando
anomalías en la distribución de residuales (Figura 17 a y b). En estas condiciones, el
modelo estimó un hombro inicial de 3 días (A); una velocidad de muerte (B) de 0,17
día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes al final del almacenamiento
de 3,6 ciclos logarítmicos (C), siendo este valor algo inferior a la caída predicha por
el PMP (~ 4 ciclos logarítmicos, Figura 15a).
0,5
-0,5
Log N/N0
-1,5
-2,5
-3,5
0 10 20 30 40
Tiempo (día)
79
Tabla 6: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
Figura 17: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ()
valores experimentales; (—) predicción
(X 0,00001)
8
(b)
(a)
Valores observados
0,5
Residuales
-0,5 4
-1,5 0
-2,5 -4
-3,5 -8
-3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5
Valores predichos Valores predichos
80
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 15ºC, () valores
experimentales; (—) predicción .
0
-0,5
Log N/N0
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0 3 6 9 12 15
Tiempo (día)
Este modelo predijo un hombro inicial (A) cercano a los 2 días mientras que
en la práctica éste resulto de aproximadamente 3 días. El parámetro C en ambos
casos rondó los 3 ciclos logarítmicos en 15 días de almacenamiento y no se observó
cola ya que la predicción es que la caída en ciclos logarítmicos continúa conforme
transcurre el tiempo.
81
Tabla 7: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 14,76 3 49**
RESIDUAL 0,20 2
R2 ajustado 94,12
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
Figura 19: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
(—) predicción.
(b)
Valores observados
0 0,34
(a)
-0,5 0,24
Residuales
-1 0,14
-1,5 0,04
-2 -0,06
-2,5 -0,16
-3 -0,26
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos
82
realizada no mostró anomalías (Figuras 21 y 22). El modelo no predijo, tal como se
observó experimentalmente, un hombro inicial (A); predijo una velocidad de muerte
de 0,3 día-1 y un cambio global en el número de sobrevivientes (C) en 18 días de
almacenamiento muy superior al observado experimentalmente (9 vs 4). Ya se ha
comentado la debilidad de este modelo para predecir un salto en el número de
sobrevivientes cuando la curva de supervivencia carece de cola marcada. Otros
autores han observado igual desenvolvimiento del modelo en otros sistemas
alimenticios estudiados.
0
Log (N/N0)
-1
-2
-3
-4
0 4 8 12 16 20
Tiempo (día)
83
Tabla 8: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parámetros característicos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
Figura 21: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC: Valores observados vs valores
predichos;
Valores observados
-1
-2
-3
-4
-4 -3 -2 -1 0
Valores predichos
84
Figura 22: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 ºC:Residuales vs. valores predichos
. () valores experimentales; (—) predicción
(X 0,001)
23
Residuales
13
-7
-17
-4 -3 -2 -1 0
Valores predichos
85
4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas
responsables de ETA.
4.4.1 S.aureus
Una vez evaluado el comportamiento de S.aureus en queso untable base
frente a las diferentes variables estudiadas (temperatura, presencia de conservante y
pH) se procedió a estudiar de manera análoga el comportamiento de cuatro
bacterias distribuidas en el medio ambiente, fuertemente relacionadas con
enfermedades transmitidas por alimentos y frecuentemente encontradas en productos
lácteos: S.aureus, E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes (Araujo y col., 2002). La
experiencia se llevó a cabo tal como se describe en Materiales y Métodos, sección
3.5.4, en primer lugar, inoculando S.aureus en queso untable base y almacenando
dicho producto a 6, 17 y 25°C para su posterior análisis.
Se observó un decrecimiento no lineal de la población de S. aureus a 6ºC y
17ºC (Figura 23). A 25ºC, el comportamiento del mismo fue de neto crecimiento
describiendo una curva algo sigmoidea. Todos estos datos resultaron coincidentes
con los ensayos anteriormente descriptos a temperaturas similares (10°C; 15ºC y
22ºC) (Figura 9a ).
La Figura 24a muestra la predicción por modelado terciario (programa PMP)
del comportamiento de este microorganismo en un medio de cultivo pH 5,0
almacenado a 6°C, junto a los datos experimentales. El programa predice, en
coincidencia con lo observado, un decrecimiento de la población. La muerte de este
microorganismo en el queso untable base fue más rápida que la predicción promedio
en un medio de cultivo a un dado tiempo de almacenamiento, más cercana al límite
inferior predicho.
De la misma manera la Figura 24b muestra que en queso untable base
almacenado a 17ºC y pH 5.0, mientras experimentalmente se observó muerte de este
microorganismo, el programa de modelado de patógenos, PMP predice el
crecimiento del mismo. Las bacterias ácido-lácticas presentes en quesos son
generalmente inhibitorias del crecimiento de S.aureus (Jorgensen y col., 2005). El
pH y la presencia de flora láctica competitiva son factores importantes que
probablemente afecten la presencia del patógeno ensayado (Ercolini y col., 2005).
86
Figura 23: Evaluación del comportamiento de S.aureus en queso untable base, pH
5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ), 17ºC ( -■- ) y 25ºC ( -
▲-); (I) desvío estándar.
87
Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b) y
25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite
de confianza inferior predicho, (-♦-) datos experimentales.
88
Dado que las curvas cinéticas obtenidas exhibieron un comportamiento no
lineal, se realizó una evaluación cuantitativa de las mismas mediante la aplicación
de modelado primario (Materiales y Métodos 3.6.1). Se aplicó los modelos de
Gompertz en el caso en donde se observó crecimiento (25°C) y de Gompertz
modificado en los casos de muerte (6 °C y 17°C).
0,6
Log(N/N0)
-0,4
-1,4
-2,4
-3,4
0 10 20 30 40
Tiempo (día)
89
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 93,00
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad. 2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día) ; B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
(b)
(a) 0,51
Valores observados
0,6
0,31
Residuales
-0,4
0,11
-1,4
-0,09
-2,4
-0,29
-3,4 -0,49
-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
Valores predichos Valores predichos
90
Figura 27: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17ºC, () valores experimentales; (—)
predicción.
0,1
-0,3
Log(N/N0)
-0,7
-1,1
-1,5
-1,9
0 4 8 12 16 20
Tiempo (día)
Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 17 ºC.
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 15,65 3 261**
RESIDUAL 0,07 4
R2 ajustado 96,00%
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
91
Figura 28 : Validación del modelo propuesto para la inactivación de S.aureus en
queso untable base almacenado a 17 ºC: a) Valores observados vs valores predichos;
b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—) predicción.
0,1
0,18
Residuales
-0,3
-0,7 0,08
-1,1 -0,02
-1,5 -0,12
-1,9 -0,22
-1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1 -1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1
Valores predichos Valores predichos
92
encontrándose que la aplicación de este modelo representó adecuadamente su
comportamiento.
Tal como se describió en Materiales y Métodos, sección 3.6.1.1 con los
valores matemáticos de los parámetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parámetros biológicos. Se determinaron por el ajuste de datos a la función de
Gompertz por un procedimiento de estimación iterativa que determinó el mejor
ajuste (Tabla 11). Al observarse una correcta representación del modelo se
asimilaron dichos parámetros biológicos como los característicos de la curva
experimental. El elevado valor de R2 ajustado, indica que el modelo ajustó
adecuadamente a los datos experimentales, pudiendo explicar el 98,5 % de las
variaciones en la respuesta observada. Asimismo, el estadístico F resultó muy
significativo (α≤0,01) lo que confirma que las variaciones de la información
explicada por el modelo es significativamente mayor que la variación debida a
causas no identificables y que el efecto observado no se debió al azar. En el gráfico
de valores observados vs valores predichos (Figura 30a) se observa que hubo una
adecuada correlación .Los distribución de residuales (Figura 30 b) también fue
homogénea entorno a los valores predichos.
Se realizó finalmente el estudio comparativo de los datos biológicos tiempo
de generación (TG), fase de latencia (LAG) y crecimiento exponencial (VCE),
calculados a partir de los parámetros extraídos de la ecuación de Gompertz con los
valores predichos por el programa de modelado terciario, PMP.
En el caso de S.aureus inoculado en queso crema base almacenado a 25ºC, se
observa que el tiempo de generación, predicho por PMP fue 0,07 días mientras que
el predicho por el modelo primario fue 0,54 días. Ambos modelos, en concordancia,
predijeron TG inferiores a 1 día aunque, como es de esperar algo menor en el caso de
la predicción medio de cultivo donde no se considera la presencia de flora
competitiva y/o inhibidores (Tabla 11). Ambos modelos coincidieron en la
predicción de la velocidad de crecimiento. La fase de latencia predicha por el modelo
primario fue superior (5días) a la estimación del programa PMP (0,42 días). La fase
de latencia representa el tiempo de ajuste que necesita el inóculo desde la fase de pre-
incubación en su medio de cultivo
93
Figura 29: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC, () valores
experimentales; (—) predicción
Log N
7
5
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (dia)
Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
94
Figura 30: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. () valores experimentales;
(—) predicción
0,11
Residuales
8
7 0,01
6 -0,09
5 -0,19
5,1 5,6 6,1 6,6 7,1 7,6 8,1 5 6 7 8 9
Valores predichos Valores predichos
95
4.4.2 E. coli
96
aproximadamente), una fase de crecimiento exponencial que va desde el día 3 al día
8 (con una pendiente ó velocidad de crecimiento menos pronunciada que la predicha)
,para finalmente, a partir del día 8, llegar al período de crecimiento estacionario,
perfil que es coincidente con lo comentado en los párrafos anteriores (Figura 32c ).
Figura 31: Evaluación del comportamiento de E.coli en queso untable base, pH 5,0
a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6ºC (-♦- ),17ºC ( -■- ) y 25ºC (-▲- );
(I):desvío estándar.
97
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b) y 25ºC
(c): ( ▬ ) predicción , ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- ) límite de
confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales
98
Figura 33: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
E.coli en queso untable base almacenado a 6ºC, () valores experimentales; (—)
predicción
0,07
-0,03
Log(N/N0)
-0,13
-0,23
-0,33
-0,43
0 4 8 12 16 20
Tiempo (día)
Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 6 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 99,98
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
99
Figura 34: Validación interna del modelo propuesto para la supervivencia de E.coli
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción.
0,07
-0,03
Residuales
28
-0,13
8
-0,23
-12
-0,33
-0,43 -32
-0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07 -0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07
Valores predichos Valores predichos
-0,4
-0,9
-1,4
-1,9
-2,4
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (día)
100
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 17 ºC.
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 8,02 3 133**
RESIDUAL 0,04 2
R2 ajustado 98,12
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (día); B: máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
(a) (b)
Valores observados
0,6 0,2
0,1
Residuales
0,1
-0,4
-0,9 0
-1,4
-0,1
-1,9
-2,4 -0,2
-2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6 -2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6
Valores predichos Valores predichos
101
Esto sugiere la presencia de otros factores influyentes en el comportamiento ó
adaptación de las células bacterianas al alimento.
Roberts y col. (2002) describieron que no hubo diferencias significativas en
el recuento bacteriano de E. coli O157:H7 entre el sistema control (0% sorbato de
potasio) y sistemas con concentraciones crecientes de sorbato de potasio (0.1, 0.15,
0,20 y 0.30 %) en queso cheddar y mozzarella, durante 70 días de almacenamiento a
10°C. Esto podría ser una evidencia de que la muerte observada de E.coli en queso
con humedad media y alta no estaría relacionada al poder inhibitorio de un
conservante químico.
8,4
7,4
Log N
6,4
5,4
4,4
3,4
0 2 4 6 8 10
Tiempo (dia)
102
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 25 ºC
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz PMP
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *: significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
103
Figura 38: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de E.coli en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción.
8,4
Valores observados
0,55 (b)
(a)
7,4
0,35
Residuales
6,4
0,15
5,4
-0,05
4,4
-0,25
3,4
-0,45
3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9
3,4 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4
Valores predichos Valores predichos
104
4.4.3. S. Enteritidis
105
Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6º C (a), 17ºC (b)
, 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior predicho, ( --- )
límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales.
c*
*en este caso no se superpuso la respuesta observada ya que se registró crecimiento (ver figura 39)
106
Datos bibliográficos indican que Salmonella spp. en medios ligeramente ácidos
(pH 5.5) (prechoque) seguida de la exposición de las células adaptadas al valor
de pH menor (choque ácido) desencadenan una compleja respuesta de
ácidotolerancia que potencia la supervivencia del microorganismo en medios
ácidos (pH< 5,4). La respuesta se traduce en una síntesis de de 43 proteínas de
choque ácido en la fase logarítmica de crecimiento y de 15 proteínas de choque
ácido en la fase estacionaria. Probablemente estos sistemas actúan en los medios
ácidos que predominan en los alimentos fermentados y acidificados. El estrés
ácido también puede desencadenar resistencia bacteriana aumentada frente a
otras condiciones ambientales adversas (Daoust, 1997).
Las curvas de supervivencia obtenidas a 6 y 17°C se caracterizaron utilizando
el modelo de Gompertz modificado. Las Figura 41 y 43 muestra un adecuado ajuste
del modelo a los datos experimentales. El análisis de la varianza (Tablas 15 y 16)
arrojó valores de R2 entre 99,2% y 97,3% con F muy significativo (α < 0,01). La
validación interna realizada (Figuras 42 y 44) mostró que en los gráficos de valores
observados vs predichos así como en el gráfico de residuales vs. valores observados
los datos experimentales y los predichos presentaron distribución homogénea.
-0,4
Log(N/N0)
-0,8
-1,2
-1,6
-2
0 10 20 30 40
Tiempo (día)
107
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 15,23 3 1016**
RESIDUAL 0,02 4
2
R ajustado 99,23
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
Figura 42: Validación interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en queso
untable base (pH 5,0) almacenado a 6 ºC: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción
(b)
(a)
Valores observados
0,3 0,1
-0,1
0,06
Residuales
-0,5
0,02
-0,9
-1,3 -0,02
-1,7 -0,06
-2,1
-0,1
-2,1 -1,7 -1,3 -0,9 -0,5 -0,1 0,3
-2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0
Valores predichos
Valores predichos
108
Figura 43: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17ºC, () valores
experimentales; (—) predicción
0,9
Log(N/N0)
-0,1
-1,1
-2,1
-3,1
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (día)
Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 29,90 3 249**
RESIDUAL 0,15 4
R2 ajustado 97,29
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
109
Figura 44: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 ºC: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción
(a) (b)
0,33
Valores observados
0,9
0,23
Residuales
-0,1 0,13
-1,1 0,03
-0,07
-2,1
-0,17
-3,1 -0,27
-3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9 -3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9
Valores predichos Valores predichos
110
Figura 45: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25ºC, () valores
experimentales; (—) predicción
8,7
7,7
Log N
6,7
5,7
4,7
3,7
0 2 4 6 8 10
Tiempo (dia)
111
Tabla 17 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
PARAMETROS BIOLÓGICOS2
Gompertz PMP
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generación; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
Figura 46: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ()
valores experimentales; (—) predicción
8,7 0,06
Valores observados
0,02
6,7
0
5,7
-0,02
4,7
-0,04
3,7 -0,06
4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4
Valores predichos Valores predichos
112
4.4.4. L.monocytogenes
113
Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6º C
(a), 17ºC (b) y 25ºC (c) : ( ▬ ) predicción, ( --- ) límite de confianza superior
predicho, ( --- ) límite de confianza inferior predicho, (-♦- ) datos experimentales.
114
Una de las bacterias lácticas utilizadas en la elaboración del queso es
Lactococcus lactis subsp.lactis, productor de nisina. La nisina, fue la primer
bacteriocina aislada a partir de la bacteria ácido láctica Lactococcus lactis subsp
lactis. Es la bacteriocina mejor caracterizada y es utilizada como conservador de
alimentos .Es la única reconocida por la FDA con categoría GRAS (Generally
Recognized as Safe). Se produce de forma natural en algunos productos lácteos y se
utiliza en la producción de alimentos como un aditivo en dichos productos para
prevenir la descomposición ocasionada por bacterias Gram positivas, especialmente
de los géneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria ( Delves-Broughton,
1990 ; Gonzalez y col.,2003). Esta podría ser la razón de la diferencia observada
entre los datos experimentales y los predichos por el programa de modelado de
patógenos PMP.
Con el propósito de caracterizar las curvas de muerte obtenidas se aplicó el
modelo de Gompertz modificado a las tres temperaturas estudiadas. Las Tablas 18;
19 y 20 exhiben los parámetros estimados que representan las diferentes regiones de
la curva de supervivencia junto a los estadísticos de ajuste del modelo. El ajuste del
modelo resultó altamente satisfactorio a las 3 temperaturas de almacenamiento,
obteniéndose valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 94 y 98%.El mismo
describió a las 3 temperaturas curvas sigmoideas donde la temperatura pareció no
tener influencia en el cambio global de numeró de sobrevivientes. Los valores de F
muy significativos (α<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tal como se observa en la Figura 49. La validación del
modelo fue correcta tal como puede observarse en los gráficos de valores observados
y predichos (Figuras 50).
115
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6ºC (a),17°C (b) y
25°C (c) () valores experimentales; (—) predicción
0,7 0,8
LogNN0
LogNN0
-1,3 -1,2
-2,3 -2,2
-3,3 -3,2
0 10 20 30 40 50 0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (día) Tiempo (día)
0,7
-0,3 (c)
LogNN0
-1,3
-2,3
-3,3
0 10 20 30 40
Tiempo (día)
116
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 6 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
Fuente SS gl FISHER2
MODELO 51,77 3 215**
RESIDUAL 0,41 5
R2 ajustado 94,26
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 17 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 98,14
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -)
117
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 94,23
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
118
Figura 50: Validación interna: Análisis estadístico del modelo propuesto para el
crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0). a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; (—) predicción
- 6°C
(a) (b)
Valores observados
0,7
3
-0,3 2
Residuales
1
-1,3
0
-2,3 -1
-2
-3,3
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7 -3
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos
Valores predichos
- 17°C
Valores observados
0,8
0,4
-0,2
Residuales
0,2
-1,2
0
-2,2
-0,2
-3,2
-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8 -0,4
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos
Valores predichos
- 25°C
Valores observados
0,7 6
4
Residuales
-0,3
2
-1,3 0
-2
-2,3
-4
-3,3
-6
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos Valores predichos
119
Roberts (2002) encontró que este microorganismo no se desarrollaba cuando
se lo inoculaba en queso mozzarella (pH 5,3) y cheddar (pH 5,0) almacenado a 10°C
y sin la presencia de sorbato de potasio siguiendo, en concordancia con este trabajo,
una cinética no lineal. Por otro lado, Urlich y col. (2006) estudiaron el
comportamiento de L.monocytogenes en queso Blanco (queso blanco, semi-blando
elaborado con leche pasteurizada ,sal, enzimas y cultivos lácticos, sin aditivos) y
observaron que a las diferentes temperaturas de almacenamiento (5ºC, 10ºC, 15ºC,
20ºC y 25ºC) el microorganismo describía una marcada curva de crecimiento de
forma típicamente sigmoidea.
La leche y los quesos fueron los alimentos investigados primero y se
encuentran entre los alimentos estudiados más extensamente. Pueden estar
contaminada una gran variedad de quesos, pero son de interés máximo los quesos
blandos con una frecuencia de contaminación con L.monocytogenes del 2 al 10%.
Rocourt (1997) vió que existe una correlación significativa del crecimiento
de L.monocytogenes con los valores de pH (>5.5) y con la ausencia de cultivos
iniciadores durante la fabricación del queso. El yogur (los cultivos lácticos termófilos
inhiben el crecimiento de Listeria) rara vez está contaminado
120
4.5 Uso de antimicrobianos naturales: timol
121
Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (-♦-) y sin
agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres temperaturas: (a)
6ºC, (b) 17ºC, (c) 25ºC ; (I):desvío estándar.
122
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con (-♦-) y sin
agregado de (-♦-) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a 17ºC; (I): desvío estandar.
Juven y col. (1994) sugirieron que los alimentos con cierto tenor de grasa
(Materiales y Métodos, sección 3.1.1) podrían formar una barrera protectora
alrededor de las bacterias protegiéndolas de los agentes antimicrobianos. Estos
estudios sugirieron también que la fracción lipídica del alimento absorbe el agente
antimicrobiano, reduce su concentración en la fase acuosa y por ende su acción
bactericida. El contenido proteico del alimento podría también ser un factor
influyente en la inefectividad del timol ya que la albúmina de suero bovino
neutralizaba la acción antimicrobiana del timol sugiriendo formación de complejos
entre los componentes fenólicos del timol y las proteínas del alimento. Estas
reacciones podrían haber prevenido toda otra formación de complejos similares entre
compuestos fenólicos y proteínas u otros componentes de la membrana celular
bacteriana que es considerada el sitio de acción blanco de los aceites esenciales
(Peter, 2004).
Es necesario evaluar también el comportamiento de la flora láctica frente al
timol. Nuevos estudios serían necesarios para evaluar si el timol tiene algún tipo de
efecto sobre su crecimiento lo que provocaría que el accionar metabólico de las BAL
se vea alterado así como también su capacidad competitiva. Esto, de comprobarse,
podría explicar la causa por la cual la muerte bacteriana observada tanto en S. aureus
123
como en S. Enteritidis a las temperaturas ensayadas es menor con timol que sin la
presencia del mismo. Es decir, el timol en cierta forma altera la capacidad
biopreservativa y competitiva de las BAL permitiendo mayor desarrollo de otra flora
acompañante.
124
timol, la presencia de timol aumentaría levemente su resistencia a esta temperatura o
bien, actuaría indirectamente, inhibiendo la flora competitiva.
A 17°C, se observó que las curvas de supervivencia de S. aureus en queso
untable base con timol presentaron un perfil de curva quebrada similar al observado
para la curva de supervivencia en igual sistema sin agregado de timol, aunque la
inactivación fue mucho menor. Ello queda evidenciado en los parámetros
característicos de ambas curvas. En el caso de la presencia de timol (Tabla 22), la
curva no presentó hombro inicial (A ~ - 4 días) al igual que en ausencia de timol
(Tabla 10). La velocidad de muerte y el cambio global en el numero de
sobrevivientes fueron significativamente mayores (Bc/ timol=1,3 día-1 ; Bs/ timol= 0,5
-1
día ; Cc/ timol= 3,4 ciclos; Cs/ timol =0,07 ciclos). Tal como se comentó anteriormente,
son varios los factores que en combinación podrían estar generando este efecto
protector observado. Estos estudios debieran intensificarse evaluando varias
concentraciones de este antimicrobiano con el propósito de arribar a una conclusión
más definitiva.
125
Figura 53: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivación de
S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 6ºC (a); 17°C (b); y
de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C (c) () valores experimentales;
(—) predicción
(a) (b)
0 0,19
-0,5 -0,01
Log (N/N0)
Log (N/N0)
-1 -0,21
-1,5
-0,41
-2
-0,61
-2,5
-3 -0,81
0 10 20 30 40 0 4 8 12 16 20 24
0 (c)
-0,5
Log (N/N0)
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0 4 8 12 16 20
Tiempo (día)
126
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 ºC.
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
R2 ajustado 99,07
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
R2 ajustado 89,29
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
127
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 ºC.
ANÁLISIS DE LA DESVIACIÓN
FISHER
Fuente SS gl
R2 ajustado 98,27
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; α: nivel de significación; R2 ajustado: coeficiente de
determinación ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (día); B : máxima velocidad de muerte (1/día) y
C : cambio total en el número de sobrevivientes ( -).
128
Figura 54: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6ºC ; 17°C; y de S.
Enteritidis en igual matriz almacenada a 17°C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; (—)
predicción.
S.aureus- 6°C
Valores observados
0,8 0,22
Residuales
-0,2 0,12
-1,2 0,02
-2,2 -0,08
-3,2 -0,18
-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos
S.aureus- 17°C
0,12
Valores observados
0,19
0,08
Residuales
-0,01
0,04
-0,21
0
-0,41
-0,04
-0,61 -0,08
-0,81 -0,12
-0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19 -0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19
Valores predichos Valores predichos
S.Enteritidis- 17°C
0,21
Valores observados
0
-0,5
Residuales
0,11
-1
-1,5 0,01
-2
-0,09
-2,5
-3 -0,19
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos
129
Figura 55: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base con timol almacenado a 25ºC, () valores
experimentales; (—) predicción
8,9
7,9
Log N
6,9
5,9
4,9
3,9
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (dia)
Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parámetros
característicos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 ºC
130
Figura 56: Validación interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25 ºC: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. () valores
experimentales; (—) predicción
(a) (b)
8,9
Valores observados
0,33
7,9 0,23
Residuales
6,9 0,13
5,9 0,03
-0,07
4,9
-0,17
3,9
4 5 6 7 8 9 -0,27
3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9
Valores predichos
Valores predichos
131
5. CONCLUSIONES
132
La microbiología predictiva se ha convertido en los últimos años en una
herramienta muy valorable y necesaria para un correcto diseño de los procesos de
preservación de alimentos. Los modelos matemáticos generales que se utilizan para
describir el crecimiento ó la inactivación microbiana generalmente se derivan de
estudios en sistemas modelo con factores ambientales controlados tales como el pH;
el nivel de sal; la temperatura; etc. La comparación de las predicciones brindadas
por estos modelos con el comportamiento de los microorganismos en un alimento
real puso en evidencia en este estudio las limitaciones de los mismos. En particular,
cuando no todas las condiciones ensayadas quedaron bien descriptas este análisis
permitió determinar qué factores adicionales (ó consideraciones del microambiente)
se necesitan incluir en el modelo o considerar para aumentar su aplicabilidad. En
particular este estudio permitió arribar a las siguientes conclusiones:
133
observada entre el medio de cultivo (crecimiento) y el alimento real (supervivencia
/inactivación)
La reducción del pH del queso untable base (pH 5,0) hasta un valor
organolépticamente aceptable (pH 4,3) generó una alternativa interesante ya que
aumentó notoriamente la inactivación observada del microorganismo de prueba (S.
aureus) sobretodo en situaciones de abuso térmico (15 y 22°C), donde este efecto se
ve incrementado. Es posible que al aumentar la temperatura, la flora acidoláctica, que
no se ve afectada por el descenso de pH, incremente su población por tener una
temperatura más propicia y por lo tanto aumente su poder biopreservante eliminando
al microorganismo de prueba que es más sensible al microambiente imperante.
134
resultado fue relevante pues señala un punto de inicio para futuras investigaciones y
aspectos a tener en cuenta al momento de desarrollar quesos untables saborizados.
135
6. APÉNDICE
136
Este capítulo incluye información con respecto a los métodos estadísticos que se
utilizaron para el análisis de los resultados, definiciones y fórmulas.
6.1.2-Distribución normal
(
f ( x) = 1 / 2πσ ) ∗ exp[ (Y − Y ) 2 / 2σ 2 ] (6.1)
Donde:
exp = función exponencial con base e
Y= medición realizada
Y = media del total de las mediciones
σ = desviación estándar
σ² = varianza
137
6.1.3- Parámetros y estimadores
∑Y i
Y= i=1
(6.2)
N
donde Yi : valor individual del sistema i
N: número total de datos
∑ (Y − Y )
i=1
i
2
σ= (6.3)
(N − 1)
138
N 2
∑ (Y − Y )
i
σ =
2 i =1
(6.4)
N −1
σ2
Y ± t α 2,n−1 ⋅ (6.6)
N
Donde
tα/2,n-1 = el estadístico t de Student de nivel de confianza α/2 y de n-1 grados
gl=n-r (6.7)
donde:
n= el número de sujetos en la muestra
r=el número de sujetos estadisticamente dependientes.
139
en el que se encontraban los datos originales. Los grados de libertad del error los
determina, precisamente, el valor de esta menor dimensión.
140
valor experimental es mayor que el tabulado para P ≥ 0,99 la conclusión es (**) y
para P ≥ 0,999 (***). Cuando :
VE < VT (NS)/(-)
141
Suma de Cuadrados Totales (SST) se obtiene sumando los cuadrados de las
desviaciones del valor observado en cada sistema Yi respecto de la media Y .
( )
N 2
SST = ∑ Yi − Y (6.9)
i =1
∑Y − Y = 0
i =1
i (6.10)
( )
2
SSR
MSR = (6.12)
p −1
142
entre los valores medidos de N elementos de la población y los valores de los
mismos elementos tal como son predichos por el modelo.
( ) = ∑r
N 2 N
SSE = ∑ Yi − Ŷi i
2
(6.13)
i=1 i=1
SSE
MSE = (6.14)
N−p
Los residuales se usan para evaluar el ajuste del modelo a los valores
experimentales. La suma de los residuales de cada corrida teóricamente es siempre
cero, sin embargo, en la práctica puede no serlo exactamente pero debería
aproximarse.
SSR
DEBIDO A p-1 SSR MSR =
LA REGRESION p-1
SSE
RESIDUAL N-p SSE MSE =
N-p
143
la variación de la información explicada por el modelo o relación propuestos es
significativamente mayor que la variación debida a causas no identificables
(residuales) y que el efecto observado no se debió al azar . Es de destacar que los
test t-Student y F son esencialmente los mismos . Para un diseño completamente
aleatorio donde se estudian sólo dos tratamientos y dos test t a dos colas para
muestras independientes se verifica que:
F = t² (6.15)
MSR SSR (p − 1)
F= = (6.16)
MSE SSE (N − p )
SSR
R2 = ⋅ 100 (6.17)
SST
144
También se usa el coeficiente de determinación ajustado por los grados de
libertad del modelo:
SSE (N − p )
Raj2 = 1 − (6.18)
SST (N − 1)
∧
6.2.3.1- Versus valores predichos, Yi
Se grafican los valores de los residuales (ri) versus los valores predichos por
el modelo. Dichos residuales no se grafican en función de los valores observados
(Yi) debido a que ambos grupos de valores están correlacionados. Debe observarse
una distribución uniforme horizontal de los residuales en torno a los valores
∧
predichos, Yi (homocedasticidad). Pueden manifestarse algunos comportamientos
anormales tales como los que se describen a continuación.
145
ri
∧
Yi
ri
∧
Yi
ri
∧
Yi
146
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BIOQ. MIRYAM SICILIANO DRA. SANDRA GUERRERO
TESISTA DIRECTORA
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