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Artículo de Revisión: La calidad espermática en peces y

los métodos de evaluación


Review article: Fish sperm quality and assessment
methods
Juan C. López-Hernández1, Adriana Osorio-Pérez1, Salvador A. Jiménez-Félix1,
Salomón Páramo-Delgadillo1, Gabriel Márquez-Couturier1, George S. Yasui2 y
Lenin Arias-Rodriguez1*

RESUMEN
El efecto antrópico, la pérdida de biodiversidad, el desplazamiento de especies, la introducción
de especies exóticas y el incremento demográfico, han promovido aumentar el rendimiento de
los cultivos, la recuperación de sitios impactados, la reintroducción de especies y la búsqueda de
alternativas para comprender, y evaluar la reproducción de las especies ícticas nativas. En ello,
el conocimiento y el empleo de los gametos de hembras y machos de los peces, para la produc-
ción masiva de larvas hacen necesario el uso de metodologías que permitan seleccionar todos
aquellos reproductores que muestren cualidades genéticas y fisiológicas que den pauta a mejorar
e incrementar la cantidad y la calidad de las larvas que serán empleadas para cultivo masivo,
repoblación, producción de reproductores y para su empleo en experimentos de ciencia básica
y aplicada. En esta revisión bibliográfica, se hace mención de las particularidades de las células
espermáticas de los peces y de las alternativas metodológicas para evaluar su calidad, mediante
la comprensión de la fisiología de la activación (porcentajes y tiempo de motilidad, tipo de mo-
vimiento y número de espermatozoides) y hasta el análisis estructural en el nivel extracelular e
intracelular (morfología espermática, daño a la membrana, ensayo cometa, células vivas/muer-
tas/apoptóticas, mismas que están en función de los objetivos de los programas de reproducción
o experimentación). Con el desarrollo de equipos de citometría automática y de genómica uni-
celular, se ha logrado mayor comprensión del funcionamiento de las células espermáticas, de la
expresión genética ligada a las cualidades celulares y del significado biológico.

Palabras clave: Calidad espermática, evaluación, métodos, peces, reproducción.

ABSTRACT
Aspects such as anthropic effects, loss of biodiversity, species displacement, introduction of exotic
species, and demographic growth have caused an increase in crop yield, recovery of impacted sites,

1 División Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco (UJAT), Villahermosa, C. P.
86150, Tabasco, México. leninariasrodriguez@hotmail.com*
2 Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.

Recibido: 13 septiembre 2017


Corregido: 23 abril 2018
Aceptado: 04 mayo 2018
DOI: http://dx.doi.org/10.15359/revmar.10-1.5 Licencia Creative Commons
Atribución-No-Comercial 67
Compartir Igual 4.0 Costa Rica
Rev. Mar. Cost. ESSN 1659-407X. Vol. 10 (1): 67-96, Enero-Junio 2018.
Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

reintroduction of species and the search for alternatives to understand and evaluate reproduction
of native fish species. In such context, knowing and using both female and male gametes for
massive larvae production creates the need to use methodologies that would allow sorting the
brood stock with genetic and physiological traits that would improve the quantity and quality of
larvae to be used for massive culture, restocking, breeding production, and experiments on basic
and applied sciences. This bibliographic review mentions the particularities of fish sperm cells
and methodological alternatives to assess their quality, by understanding activation physiology
(motility percentages and time of activity, type of movement and sperm number), including the
structural analysis at extracellular and intracellular levels (spermatic morphology, damage to
the membrane, comet assay, live/dead/apoptotic cells, which depend on the main objectives of
reproduction or experimental programs). The development of equipment to automated cytometry
and unicellular genomics has allowed for a better understanding of the functioning of spermatic
cells, genetic expression linked to cellular qualities and their biological implication.

Keywords: Sperm quality, assessment, methods, fish, reproduction.

INTRODUCCIÓN & Carl, 2014; Wootton & Smith, 2014a;


Schulz et al. 2010). En los peces las es-
Tras el curso de miles de años de trategias reproductivas son variadas y
evolución biológica, los peces como complejas y la reproducción sexual es
organismos típicamente acuáticos han el modo típico y más común (Coward
desarrollado estrategias reproductivas et al. 2002). En dicho sentido, se pre-
que han favorecido la creación y el sentan dos tipos de reproducción, la
cobijo de necesidades bioquímicas y externa que está presente en el 94% de
fisiológicas que los gametos necesitan las especies de peces y la interna en tan
para unirse y desencadenar el apropia- solo el 6% (Patzner, 2008) de las espe-
do desarrollo del embrión (Wootton & cies registradas. En la primera, los óvu-
Smith, 2014a, b; Wootton & Carl 2014; los y los espermatozoides son liberados
Mylonas et al. 2010; Schulz et al. 2010; al medio acuático en un acto sincroni-
Patzner, 2008; Schreck & Moyle, 1990; zado, donde los gametos se activan por
Zohar & Mylonas, 2001). En las formas el agua y los espermatozoides fertili-
de diferenciación gonadal reconocidas zan los óvulos (Dumorné et al. 2017;
para los peces, es bien distinguido el Mylonas et al. 2010; Zohar & Mylonas,
gonocorismo o separación de sexos en 2001). En la fertilización externa se re-
hembras y machos, con capacidad go- quiere gran número de gametos, en ella
nádica individual para producir óvulos el encuentro entre el óvulo y el esper-
o espermatozoides respectivamente; matozoide es al azar, al ser ello también
en el hermafroditismo, las gónadas del congruente con las oportunidades de
mismo espécimen tienen capacidad fertilización y sobrevivencia de los em-
para producir ambos gametos (Wootton briones (Herráez et al. 2017; Rurangwa

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et al. 2004; Mylonas et al. 2017; Woot- ción está regulada por la vía cerebral,
ton & Smith, 2014a, b). En el caso de la mediante la liberación de hormonas
fertilización interna, los espermatozoi- folículo estimulantes y luteinizantes,
des son depositados en el receptáculo las cuales son clave para el control
espermático de la hembra, mediante un reproductivo endocrino (Wootton &
órgano accesorio denominado gonopo- Smith, 2014b; Mylonas et al. 2017;
dio que está presente en ciertas especies Zohar & Mylonas, 2001).
de la familia poeciliidae, o mixopteri- El ciclo reproductivo típico de
gios en elasmobranquios, lo que garan- un pez, se divide en dos fases princi-
tiza la fecundación cuando los óvulos pales: la proliferación, el crecimiento
de la hembra están maduros (Herráez et y la diferenciación de los gametos,
al. 2017; Rurangwa et al. 2004; Woot- constituyen la primera fase (vitelogé-
ton & Smith, 2014a, b). Generalmente, nesis y espermatogénesis); mientras
la fertilización interna es exclusiva de que la maduración de los óvulos, los
cuidado parental vivíparo, donde el em- espermatozoides y la preparación para
brión se desarrolla dentro de la madre y la liberación, constituyen la segunda
las larvas son liberadas como juveniles (espermiación y ovulación) (Patzner,
de nado libre, lo que no requiere de un 2008; Schulz et al. 2010, Zohar &
gran número de gametos fertilizados, Mylonas, 2001). El control de la re-
pues la oportunidad de fertilización producción es un tópico importante
y de sobrevivencia de los embrio- en acuicultura y es uno de los factores
nes de pasar a estado juvenil es ase- limitantes del éxito reproductivo, en
gurada (Herráez et al. 2017; Patzner, ello la calidad de los gametos es cru-
2008; Rurangwa et al. 2004; Wootton cial (Zohar & Mylonas, 2001), pues de
& Smith, 2014a, b). En la mayoría de esta dependen también los porcentajes
peces teleósteos, como son las carpas, de fertilización.
las mojarras, los robalos, los bagres, Los métodos para el control y
etc., la fertilización es externa y en el manejo de la reproducción en pe-
otras especies interna, como es el caso ces son muy diversos, estos incluyen,
del pez cebra Oryzias setnai, donde los tratamiento hormonal, control de los
espermatozoides se mantienen viables parámetros físicos, almacenamiento
por largo tiempo en los espermatofitos de gametos, reversión sexual, manipu-
que se atan a la piel que reviste el go- lación del tiempo de reproducción, es-
noporo de la hembra durante la copula, terilización, y separación de reproduc-
permitiendo así la fertilización sin co- tores, entre otros (Mylonas et al. 2017;
pulas posteriores (Wootton & Smith, Zohar & Mylonas, 2001).
2014a). En ambos casos, la reproduc-

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Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

El control de la función repro- de la bibliografía especializada, se ha


ductiva de los peces en cautiverio por hecho una amplia descripción de los
medios artificiales como son tempe- conceptos, términos necesarios que
ratura, fotoperiodo y tratamientos permitirán a cualquier lector especia-
hormonales, son esenciales para la lista o no en el tema, comprender las
sustentabilidad de la producción acuí- bases biológicas, fisiológicas y meto-
cola comercial, pues gracias a ellos dológicas necesarias para evaluar la
es posible que los gametos alcancen calidad espermática de los peces.
la maduración final y puedan ser re- Espermatogénesis en los peces
colectados o removidos directamente Los espermatozoides son el pro-
de las gónadas con fines de fertili- ducto final derivado de un proceso al-
zación artificial (Zohar & Mylonas, tamente organizado y complejo de ma-
2001). Por ello, es necesario el co- duración gonádica de los machos, que
nocimiento y el desarrollo de tecno- es llamado espermatogénesis (Schulz
logías reproductivas, para el manejo et al. 2010), el cual implica la forma-
sustentable de los gametos de peces ción de cuatro células haploides, todas
de importancia económica, biológica ellas especializadas y capacitadas para
y de todas aquellas especies en riesgo fertilizar y entregar los genes (material
crítico, pues se requiere del estudio genético) del núcleo espermático a un
y del conocimiento de los factores óvulo (Ciereszko et al. 2017; Herráez
que afectan la calidad de los game- et al. 2017; Schulz et al. 2010, Ruran-
tos, como es el caso de los esperma- gwa et al. 2004; Zohar & Mylonas,
tozoides y sus modos de activación 2001). La espermatogénesis está suje-
y fecundación (Dumorné et al. 2017; ta a múltiples estímulos del ambiente
Herráez et al. 2017; Murakami et al. (fotoperiodo, temperatura, disponibili-
2014; Rurangwa et al. 2004; Zohar & dad de alimento), de la fisiología y del
Mylonas, 2001). Así como de todas control hormonal del organismo (Zo-
aquellas metodologías, que son re- har & Mylonas, 2001).
queridas para evaluar apropiadamen- En los peces teleósteos, se ha
te la calidad de los espermatozoides podido observar dos tipos de esper-
empleados, para la fertilización arti- matogénesis: el cístico, en el cual el
ficial con fines acuícolas, de ciencia proceso se lleva a cabo dentro del ló-
experimental básica, aplicada; tam- bulo gonádico y el semicístico en el
bién para la comprensión y la expan- cual el desarrollo se realiza fuera del
sión de las fronteras de la biología lóbulo gonádico, como es el caso de
espermática de los peces tropicales. Ophidion sp. (Mattei et al. 1993). En
En esta revisión detallada y selectiva ambos tipos el proceso es metamórfico

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y está dividido en tres diferentes fases: quieren transitar por varios cambios
(I) mitótica con espermatogonias; (II) fisiológicos durante la maduración,
meiótica con espermatocitos primarios con el fin de responder al choque os-
y secundarios; y (III) espermiogéne- mótico que activará la capacidad fer-
sis con espermátidas que darán origen tilizante (Alavi et al. 2009; Dumorné
a espermatozoides haploides (Billard, et al. 2017). Durante la espermiación,
1986; Herráez et al. 2017; Schulz et los espermatozoides se dirigen de los
al. 2010) bajo desarrollo normal, ya testículos hacia la papila genital a tra-
que en algunas ocasiones hay irregu- vés del ducto espermático, cuyo fluido
laridades de interés evolutivo, genéti- seminal es de pH básico, rico en di-
co y biológico, que pueden dar origen versas sales como sodio, potasio, cal-
a endomitosis con presencia de esper- cio, magnesio, entre otras (Alavi et al.
matozoides con niveles diferentes de 2009; Dumorné et al. 2017; Mylonas
contenido genético como son los di- et al. 2017) que condicionan para cada
ploides, tetraploides, etc. (Arias-Ro- especie por osmolaridad del líquido
driguez et al. 2010; López-Hernán- seminal única (Dumorné et al. 2017),
dez, 2017, Herráez et al. 2017; Zohar siendo ello un atributo esencial para la
& Mylonas, 2001). activación de los espermatozoides que
Las espermatogonias son células depende del hábitat particular de cada
que se clasifican en primarias y secun- especie de pez.
darias, la primera de ellas tiene la ca- Generalidades de la morfología
pacidad de proliferar y autorenovarse espermática en peces
por mitosis, dando nuevas espermato- A través de los procesos de se-
gonias primarias o bien, diferenciarse lección natural, los arreglos microes-
a las secundarias, que desarrollan a es- tructurales de las células espermáticas
permatocitos. Los cuales se dividen en han optimizado las estrategias de ferti-
dos fases, primarios y secundarios; que lización de acuerdo con las particula-
se transformaran en espermátidas que ridades reproductivas de cada especie
sobrellevarán cambios estructurales (Birkhead et al. 2009; Herráez et al.
y funcionales como son la formación 2017; Rurangwa et al. 2004). Nume-
del flagelo, la pieza media y la cabeza, rosos trabajos, enfocados al conoci-
todo ello dará origen a espermatozoi- miento de la morfología de las células
des maduros, que tendrán la capacidad espermáticas de peces, han mostrado
de fertilizar un óvulo (Dzyuba & Cos- la diversidad de formas y la compo-
son, 2014; Herráez et al. 2017). sición estructural y ultraestructural de
Los espermatozoides haploides los espermatozoides (Herráez et al.
(1n), contenidos en los testículos, re- 2017; Rurangwa et al. 2004). Estos

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han sido útiles, para comprender algu- confiere forma de cinta o de remo (ale-
nos aspectos taxonómicos y relaciones tas flagelares) (Jamieson, 1991), que de
evolutivas de cada familia (Islam & acuerdo a Tabares et al. (2005), posi-
Akhter, 2011). blemente es una ventaja evolutiva para
En casi todas las especies, la ana- favorecer el movimiento del esperma-
tomía de los espermatozoides consiste tozoide en el medio acuoso. Por otra
de tres segmentos: cabeza, pieza media parte, en algunas especies de la familia
y flagelo. La cabeza de acuerdo a la es- Mormyridae o peces elefantes de ferti-
pecie varia en forma y tamaño, trans- lización externa, el flagelo está ausente
porta los genes del macho (Ciereszko y su única forma de locomoción es de
et al. 2017) en condición haploide en tipo ameboideo (Jamieson, 1991).
un núcleo de formas variables y en la Tales estructuras y componentes
mayoría de los teleósteos es ausente que integran la célula espermática, son
de acrosoma, debido a la presencia del crucialmente importantes para deter-
micrópilo en el óvulo (Islam & Akh- minar la calidad del desempeño esper-
ter, 2011; Jamieson, 1991; Zohar & mático (Linhart et al. 2003; Saudrais
Mylonas, 2001). La pieza media está et al. 1998). Mediante la tinción de un
sujetada a la cabeza de los espermato- frotis espermático con giemsa al 20%
zoides, constituida principalmente por y con el empleo de un microscopio
mitocondrias que contribuyen con la óptico, provisto de una cámara con un
energía mediada por el ATP (Dzyuba et programa para la visualización de imá-
al. 2017; Saudrais et al. 1998 Ruran- genes, es posible observar los atributos
gwa et al. 2004), para el movimiento básicos de la anatomía extracelular de
flagelar hay dos centriolos, el proximal los espermatozoides, como son la ca-
y distal que durante la espermiogéne- beza y el flageló, tal y a como puede
sis utilizarán uno o los dos centriolos observarse en las imágenes mostradas
como cuerpo basal para originar uno o de la Figura 1, que dan como ejemplo
dos flagelos respectivamente (Jamie- las variaciones en tamaño y formas de
son, 1991). El flagelo, es el aparato los espermatozoides del bagre tropical
motil para alcanzar y penetrar el óvu- Rhamdia laticauda (Fig. 1A, 1B), los
lo por el canal micropilar (Dzyuba & del pejelagarto tropical Atractosteus
Cosson, 2014; Jamieson, 1991), en su tropicus (Fig. 1C, 1D) y los de la mo-
mayoría esta constituido por el axone- jarra del Nilo Oreochromis niloticus
ma en arreglo de nueve pares de mi- (Fig. 1E, 1F).
crotúbulos periféricos y un par central
llamado complejo 9+2 que está recu-
bierto por la membrana plasmática, y

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Fig. 1. Paisaje característico de los espermatozoides a 12.5X y 50X del bagre


tropical Rhamdia laticauda (A, B), el pejelagarto tropical Atractosteus tropicus
(C, D) y la mojarra del Nilo Oreochromis niloticus (E, F), mostrando con un
triángulo sólido (▼) la cabeza espermática y la trayectoria flagelar con una
flecha en línea discontinua. Imágenes originales de los autores.
Fig. 1. Typical sperm landscape at 12.5X and 50X from the tropical catfish
Rhamdia laticauda (A, B), the tropical gar Atractosteus tropicus (C, D) and the
Nile cichlid Oreochromis niloticus (E, F), pointing with a solid triangle (▼)
the sperm’s head and the flagellar trajectory with an arrow on interrupted line.
Original pictures from authors.

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La calidad espermática en peces se relacione directamente con la ha-


La calidad espermática es la ha- bilidad fecundante del espermatozoi-
bilidad y la capacidad de un esperma- de, entre ellos se puede mencionar: el
tozoide para fertilizar exitosamente tiempo de movimiento o periodo por
un óvulo y activar el desarrollo de un el cual los espermatozoides están ac-
embrión viable (Bobe & Labbé, 2010, tivos, tipo de movimiento o caracte-
Dumorné et al. 2017; Fauvel et al. rísticas del movimiento espermático,
2010; Rurangwa et al. 2004). La via- porcentaje de células motiles o nú-
bilidad del embrión, es la suma de la mero de células que se observan en
calidad del óvulo y del espermatozoi- movimiento, número de espermato-
de (Dzyuba & Cosson, 2014). Desde el zoides o cantidad de células espermá-
punto de vista biológico, en condicio- ticas por volumen de muestra (Bobe
nes naturales, los espermatozoides de & Labbé, 2010; Fauvel et al. 2010;
dos o más machos de una misma espe- Rurangwa et al. 2004) e integridad (o
cie compiten por fertilizar los óvulos, estado de deterioró) de las estructuras
en dependencia del desempeño esper- de la célula espermática (Herráez et
mático, con el fin de asegurar mayor al. 2017).
número de progenie (López-Hernán- La recolección de semen
dez, 2013; López-Hernández, 2017; Un factor importante a consi-
Osorio-Pérez, 2017). derar en la evaluación de la calidad
En acuacultura, la importancia del semen, es el método de recolecta
del diagnóstico del semen predice la empleado. Generalmente, cuando los
capacidad fecúndate del eyaculado y reproductores machos están maduros,
contribuye a mejorar las técnicas de se reconocen porque liberan el líqui-
fertilización in vitro y el desarrollo do seminal ante suave presión del
de metodologías de crioconservación abdomen (Aas et al. 1991; Billard et
o biotecnologías aplicadas al mejo- al. 1995a; Dreanno et al. 1998). Los
ramiento genético (Bobe & Labbé, organismos deben (de preferencia),
2010; Fauvel et al. 2010). Para con- anestesiarse y secarse con una tela
siderar competentes los espermato- para evitar el contacto con el agua (y
zoides de un pez, estos deben cumplir heces fecales), ya que esta activa la
con los requerimientos básicos de motilidad de los espermatozoides al
calidad espermática (Herráez et al. mezclarse durante el manejo de los
2017; López-Hernández, 2013; 2017; animales y las muestras de semen
Osorio-Pérez, 2017; Rurangwa et al. (Arias-Rodriguez, 2001; López-Her-
2004). En la evaluación de la calidad nández, 2013; 2017; Osorio-Pérez,
espermática, es válido cualquier pa- 2017). El semen extraído puede ser
rámetro cuantitativo o cualitativo que recolectado mediante el empleo de

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un tubo graduado, una jeringa o una lizar exitosamente un óvulo (Herráez


cánula (Dreanno et al. 1998). Con el et al. 2017; Rurangwa et al. 2004)
empleo de un tubo de ensayo, jeringa pueden permitir el desarrollo de un
y tubo capilar, no hay riesgo de daño espécimen normal (Álvarez et al.
a los testículos (Rodríguez-Gutiérrez, 2009; Herráez et al. 2017; Muraka-
1992). Sin embargo, su empleo oca- mi et al. 2014). En el apareamiento
siona contaminación por excremento o desove, la presencia en abundancia
y orina, se evita con, no alimentar y de gametos con buena calidad son li-
purgando los peces a lo largo de un berados por las especies de fertiliza-
día (Dreanno et al. 1998). Cuando ción externa en hábitats específicos
la canulación es empleada, se evita como son cuerpos de agua dulcea-
la contaminación del líquido semi- cuícolas, salobres y marinos donde el
nal por heces y orina, pero existe la desbalance entre la osmolaridad del
posibilidad de daño testicular, si no hábitat acuático y la del líquido se-
se tiene un buen conocimiento de minal, son en conjunto los detonantes
la anatomía del pez (Dreanno et al. de la actividad espermática, que es
1998; Glogowski et al. 2000; Rodrí- uno de las parámetros que dan pauta
guez-Gutiérrez, 1992). Cuando se tra- al éxito de la fertilización (Rurangwa
ta de peces pequeños, como los locha et al. 2004).
(Arias-Rodriguez et al. 2010) u otros Tradicionalmente, las caracte-
de uso ornamental, el empleo de tu- rísticas apropiadas de las muestras de
bos capilares es de mucha utilidad semen, han sido evaluadas mediante
para la recolección de semen. el análisis de diferentes parámetros
Técnicas tradicionales y avanzadas como la concentración de células es-
para la evaluación de la calidad es- permáticas, la motilidad o la actividad
permática que es considerada como el tiempo de
El control de la calidad esper- actividad celular, los porcentajes de
mática es un tema relevante en la in- células activas (Cabrita et al. 2014;
dustria acuícola o de interés creciente Rurangwa et al. 2004) y los porcenta-
para estudios de biología reproducti- jes de fertilización (Arias-Rodriguez
va, ya sea para la producción de espe- et al. 2004; Rurangwa et al. 2004).
cies comerciales establecidas o para En años recientes, en las prácticas de
la introducción de nuevas especies evaluación de los espermatozoides, se
con alto interés comercial (Cabrita et inició con el uso de la morfología de
al. 2014; Herráez et al. 2017; Ruran- las células espermáticas, la integridad
gwa et al. 2004). Por ello, las particu- de la membrana celular y nuclear, el
laridades genéticas y fisiológicas de contenido energético y las pruebas
un espermatozoide viable, para ferti- complejas, que incluyen herramientas

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moleculares para identificar células vi- vechamiento acuícola (Cabrita et al.


vas, muertas y en apoptosis (Cabrita et 2014; Herráez et al. 2017), con la
al. 2014; Herráez et al. 2017; Ruran- desventaja de los altos costos de su
gwa et al. 2004). empleo.
La evaluación de la motilidad El desarrollo de nuevas téc-
espermática y los porcentajes de fer- nicas y métodos alternativos para
tilización, han sido los parámetros de evaluar objetivamente la calidad es-
mayor uso para determinar la calidad permática en peces, ha dado pauta a
del semen en mamíferos y en algunas mejorar los criterios de evaluación y
especies acuáticas. Es sabido que la los resultados durante su aplicación
integridad espermática se encuentra en programas de producción masi-
asociada con los porcentajes de ferti- va de larvas de peces (Herráez et al.
lización, al ser óptimos cuando la ca- 2017). Métodos alternativos como es
lidad espermática es buena y pobres el empleo de Microscopia Electró-
cuando la calidad es baja (Ciereszko nica de Transmisión y Microscopia
et al. 2005; Costache et al. 2012; He- Electrónica Barrido, sistemas com-
rráez et al. 2017). Afortunadamente, putarizados (Sperm Class Analyzer®
métodos analíticos con mayor obje- CASA System), prueba de dispersión
tividad han surgido, y tales exáme- de ADN (ensayo cometa), citometría
nes incluyen el Análisis Espermático fluorescente para determinar la viabi-
Asistido por Computadora (AEAC o lidad celular por tinción con Ioduro
CASA), la electroforesis de células de propidio y Anexina V (Invitro-
individuales (ensayo cometa o de dis- gen®), han permitido el análisis de-
persión de componentes celulares), tallado del efecto de diversos agentes
la viabilidad espermática y apopto- como la luz ultravioleta, críoprotec-
sis por citometría fluorescente auto- tores, diluyentes espermáticos, me-
mática. Así mismo, la Microscopia tales pesados, contaminantes, etc.,
Electrónica de Barrido, la Micros- empleados en algunas ocasiones con
copia Electrónica de Transmisión, el propósitos biotecnológicos y de con-
ensayo túnel y del metabolismo de servación temporal y a largo plazo
ATP; entre otros (Cabrita et al. 2014; (Cabrita et al. 2014; Herráez et al.
Herráez et al. 2017; Rurangwa et al. 2017; Rurangwa et al. 2004).
2004) han sido empleados reciente- El tiempo de motilidad o actividad
mente como nuevas herramientas, espermática
para la evaluación rápida y confiable El tiempo de motilidad o pe-
de la calidad espermática de especies riodo de actividad de los espermato-
emergentes de peces para su apro- zoides posterior a su activación con

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Artículo de Revisión: La calidad espermática en peces y los métodos de evaluación

un medio acuso, se ha venido expre- mero de mitocondrias de cada espe-


sando en términos de tiempo que es cie las que proveen la energía (ATP
medido particularmente en segundos, o Adenosin Trifosfato) necesaria para
este parámetro inicia desde el mo- el movimiento flagelar (Dziewulska
mento en que los espermatozoides et al. 2012; Tabares et al. 2005), por
son activados con agua o fluido ovári- lo que el tiempo de vida motil del es-
co, hasta la disminución o cese total permatozoide no solo depende de las
del movimiento flagelar (Arias-Ro- condiciones extrínsecas (cantidad de
driguez, 2001). Para la evaluación de agua, temperatura y osmolaridad),
la motilidad, es recomendable em- sino también, de la cantidad de ATP
plear una dilución alta o volumen ma- emitida por las mitocondrias al flage-
yor de agua (o activador) en relación lo (Dziewulska et al. 2012; Rurangwa
con el volumen inicial de la muestra et al. 2004).
de semen, hecho que sincroniza la ac- El contenido de ATP intracelu-
tivación de los espermatozoides de lo lar, está relacionado con la capacidad
contrario, se puede presentar incerti- de movimiento del espermatozoide
dumbre en la motilidad observada ya y con el tiempo total de motilidad
que la activación podría ser heterogé- (Dziewulska et al. 2012), al declinar-
nea (Arias-Rodriguez, 2001; Ruran- se este después de la activación has-
gwa et al. 2004). ta en un 50%, lo que sugiere que una
La duración de la motilidad en muestra con reducido tiempo de movi-
el ambiente natural, varía entre es- miento pudo haber sido activada ini-
pecies y coincide con el tiempo de cialmente por agua u orina durante su
fertilización del espermatozoide. Ge- extracción, al declinar el contenido de
neralmente, este tiempo de motili- ATP y en consecuencia el movimien-
dad es influenciado por el hábitat del to (Billard et al. 1995a; Perchec et al.
cual se origina el reproductor macho, 1995; Rurangwa et al. 2004).
por ejemplo: marino o dulceacuícola Los espermatozoides típicamen-
(Wootton & Carl, 2014; Wootton & te, están inmóviles en el lumen de la
Smith, 2014a, b). En la mayoría de red de túbulos seminíferos de los testí-
los peces que desovan en agua marina culos y son activos después de ser di-
(medio hipertónico), los espermato- luidos en un medio externo, como es
zoides mantienen periodos de motili- el caso del agua originaria del pez sea
dad más prolongados que en especies marino o dulce acuícola (Billard et al.
que desovan en ambientes dulceacuí- 1995b), dicha condición es importante
colas (medio hipotónico) (Tabares et cuando se evalúa la motilidad (Billard
al. 2005). Sin embargo, son el nú- et al. 1995a). Las concentraciones

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Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

altas de cationes K+ en el líquido El semen resulta difícil de mez-


seminal, inhiben la motilidad de los clar debido a su viscosidad, por lo que
espermatozoides en algunas especies deben hacerse diluciones altas o agitar
(Billard et al. 1995a). El pH de la so- adecuadamente las muestras, aunque
lución activadora (p. e. marina o dul- esto puede dañar las células espermá-
ce) también afecta la motilidad, al ser ticas (Billard et al. 1995a). Un proce-
necesario (en ocasiones) ajustar el dimiento adecuado consiste en realizar
pH de la solución a valores ácidos o primero una dilución en una solución
alcalinos, esto depende de la especie extendedora de la motilidad (solución
en estudio (Arias-Rodriguez, 2001). que no activa a los espermatozoides,
La osmolaridad de la solución sino que los mantiene en latencia) como
activadora, afecta los porcentajes de las empleadas por Lahnsteiner & Patz-
células activas, como ha sido observa- ner (1998), en Boops boops, Diplodus
do en experimentos con el bagre tro- sargus, Mullus barbatus y Trachurus
pical R. laticauda (Jiménez-Trinidad, mediterraneus, que generalmente debe
2016). En el caso de los peces de agua tener la misma presión osmótica (mis-
dulce esta debe ser hipotónica y para ma osmolaridad) que el fluido seminal
los peces marinos hipertónica (Billard (lo que puede lograrse al adicionar K+
et al. 1995a). a una concentración adecuada).
Durante la evaluación de la mo- La activación de los espermato-
tilidad es necesario hacer una dilución zoides es realizada en el segundo paso,
alta (p. e. 1:1000) con el fin de iniciar bajo el microscopio, al poder emplear
una activación sincrónica de los es- 1 µl de semen en 19 microlitros (1:20)
permatozoides. En diluciones bajas no de solución activadora que tenga una
todos los espermatozoides se activan presión osmótica apropiada (Cosson et
(activación heterogénea), al ser esta al. 2008).
progresiva durante varios minutos des- Diferentes métodos son emplea-
pués de realizada la activación. Dicha dos con el fin de medir la motilidad.
característica genera imprecisiones de El de más uso se refiere a la duración
la intensidad y la duración de la moti- total en segundos, asociado al tipo de
lidad. Por consiguiente, es importante movimiento del flagelo, al seguir co-
establecer que niveles de dilución insu- múnmente una escala gradual basada
ficientes e irregulares, pueden ser la ex- en los atributos del movimiento esper-
plicación de muchas de las discrepan- mático como la descripción tradicional
cias señaladas en la literatura para una que ha sido señalada por Menkveld &
misma especie (Billard et al. 1995a; Kruger (1996).
Rurangwa et al. 2004).

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En la estimación de la motilidad, matozoide (Arias-Rodriguez, 2001;


se considera también el porcentaje de Rurangwa et al. 2004). El tipo de
células activas al poder emplearse el movimiento, se puede estimar cua-
criterio (subjetivo) sugerido por Aas et litativamente por microscopia óptica
al. (1991), en el cual el porcentaje de y para ello se emplean escalas pre-
células motiles se define en una escala establecidas como la propuesta por
del 0 al 100%, con intervalos de 10 (p. Menkveld & Kruger (1996), donde
e. 10, 20, 30, 40%, etc.). se describen detalladamente los pa-
Métodos modernos que permiten trones de movimiento de los esper-
evaluar la motilidad de los espermato- matozoides activados y a como se
zoides, consisten en medir la frecuen- describe a continuación:
cia con la cual el flagelo es agitado, Grado 4. Máximo movimiento pro-
análisis que se realiza mediante estro- gresivo de los espermatozoides (ópti-
boscopía (Cosson et al. 2008). Con el mo para la fertilización).
análisis de fotografías y/o videos del Grado 3 Disminución del movimien-
movimiento de la cabeza y/o del fla- to progresivo de los espermatozoi-
gelo, es posible medir la velocidad de des, junto con el incremento de los
desplazamiento del espermatozoide en movimientos laterales que prome-
un periodo de tiempo (Cosson et al. dian aproximadamente de dos a tres
2008; Herráez et al. 2017). Reciente- anchos el cuerpo del espermatozoide
mente, la motilidad se está estudiando (apropiado para la fertilización).
mediante procedimientos que permiten Grado 2. Poco o ningún movimiento
la desmembranación y la reactivación progresivo y movimientos laterales
in vitro (Linhart et al. 2003; Saudrais circulares de una o dos veces el ancho
et al. 1998). del cuerpo del espermatozoide (no
Tipo o grado de movimiento apropiado para la fertilización).
Otra variable importante es el Grado 1. Muy poco movimiento de
tipo o grado de movimiento que es la cabeza de los espermatozoides,
expresado como la dirección que la junto con el decremento del movi-
célula toma en su trayectoria motil, miento del flagelo (sin capacidad de
esto indica si el espermatozoide está fertilización).
en su máxima capacidad progresiva Grado 0. Sin motilidad, ni movimiento
para fecundar el óvulo desde el mo- progresivo (movimiento frontal) de los
mento de la activación, es decir, que espermatozoides (sin capacidad absolu-
el flagelo está en constante movi- ta para la fertilización).
miento vigoroso por tiempo prolon-
gado durante la vida motil del esper-

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Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

Porcentajes de células motiles tradicionalmente con el empleo de un


Al relacionar el tiempo y el tipo hematocitómetro o cámara neubauer
de movimiento, es fácil estimar qué (Arias-Rodriguez, 2001), un ejem-
porcentaje o porcentajes de la alícuo- plo de ello es lo indicado en la Figura
ta espermática activada es viable, tal 2A. El número de espermatozoides se
parámetro es evaluado al determinar puede estimar también por densidad
el número subjetivo de células activas óptica, mediante espectrofotometría
en un campo visual bajo el microsco- o por la técnica del microhemátocri-
pio óptico, normalmente al emplear el to (Rakitin et al. 1999; Rurangwa et
objetivo de 40X, pues permite estimar al. 2004), la primera es la más pre-
las posibilidades del espécimen ma- cisa y rápida, pero con un alto costo
cho para competir por la fertilización del equipo. Últimamente, se utilizan
(Arias-Rodriguez, 2001; Rurangwa et los citómetros automáticos, con fá-
al. 2004). En la fertilización in vitro, cil operación y con altos estándares
los porcentajes de células funcionales de precisión en los resultados que se
deben ser óptimos (>80%), porque los obtienen, pero los costos del equipo,
valores menores (<70%), reducen sig- los reactivos y los consumibles hacen
nificativamente la obtención de por- esta herramienta poco accesible para
centajes aceptables de óvulos fecun- las prácticas acuícolas, al ser más co-
dados. Para ello, se puede emplear el mún su empleo en experimentación
criterio sugerido por Aas et al. (1991), (Fig. 2B, C, D) (Jiménez-Trinidad,
en el cual el porcentaje de células mo- 2016; López-Hernández, 2017; Oso-
tiles está definido en escala del 0% al rio-Pérez, 2017).
100% con intervalos de 10, donde el El número de espermatozoides,
90% y 100% son óptimos para garan- también está relacionado con la esta-
tizar mayores porcentajes de óvulos ción reproductiva, el tratamiento hor-
fertilizados o de su empleo para expe- monal, los porcentajes de fecundación
rimentos de biología y biotecnología. y de la especie, la disponibilidad del
Concentración o número de esper- alimento, las propiedades nutriciona-
matozoides les del alimento y la calidad del agua
La concentración de esper- (Murakami et al. 2014).
matozoides en el líquido seminal es La cantidad de células espermá-
con frecuencia empleado en la ca- ticas varía además entre individuos de
racterización de la calidad del se- la misma especie y entre las diferentes
men (Arias-Rodriguez, 2001; Billard especies; por ello, es recomendable que
et al. 1995a). El conteo del número dicho parámetro se determine en las
de espermatozoides por mililitro de muestras de semen, de cada uno de los
muestra espermática, se determina reproductores machos seleccionados

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Fig. 2. Cuantificación del total de células espermáticas del bagre tropical


Rhamdia laticauda mediante la cámara de Neubauer a 12.5X (A) y el citómetro
automático a 16X en campo claro (B), y cuantificación de la viabilidad
espermática por citometría automática en campo fluorescente, al emplear ioduro
de propidio para células muertas (C) y anexina V para células en apoptosis (D).
Imágenes originales de los autores.
Fig. 2. Total sperm cell count of the tropical catfish Rhamdia laticauda using the
Neubauer chamber at 12.5X (A) and the automatic cytometer at 16X with bright
field (B); and quantification of sperm viability by the automatic cytometer at
fluorescent field, marked with propidium iodide for dead cells (C) and annexin
V to detect apoptotic cells (D). Original pictures by authors.

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Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

para los programas de producción ma- La capacidad de fertilización


siva de larvas o bien para los experi- La capacidad de fertilización es
mentos que requieran de porcentajes un estimador que permite evaluar la
altos de fertilización (Murakami et calidad del semen. Este procedimiento
al. 2014). Es obvio que el número de se emplea en estudios referidos a la in-
espermatozoides, necesarios para fer- seminación artificial y preservación de
tilizar un óvulo es equivalente a una espermatozoides (Billard et al. 1995a;
célula espermática por cada óvulo del Lahnsteiner et al. 1998; Rurangwa et
pez, esto es en los casos muy preci- al. 2004). De acuerdo con Billard et
sos del programa de fertilización. Sin al. (1995a), la capacidad de fertiliza-
embargo, realmente no existe un valor ción integra un factor independiente
o número preciso o recomendable de como es la calidad de los óvulos, la
células espermáticas viables, debido interacción entre gametos y fluidos
a que los valores están en función del seminales/ováricos. La inseminación
número de óvulos a fertilizar, un mí- se realiza a diferentes porcentajes de
nimo de 1 000 espermatozoides puede dilución espermática, con el propósi-
garantizar la fertilización exitosa de to de establecer un número mínimo de
100 óvulos viables (Satterfield & Flic- espermatozoides que puedan fertilizar
kinger, 1995). al 100% ciertos gramos de óvulos (Bi-
Lo recomendable es emplear en llard et al. 1995a).
los casos de bajo presupuesto, el ín- La densidad del líquido seminal
dice de motilidad (I. M.) mínimo de La densidad del líquido seminal
50, el cual se obtiene al multiplicar la es otro factor importante en su cali-
graduación del movimiento espermáti- dad, pues durante la toma de muestras
co anteriormente señalado, por el por- se observa con frecuencia que algunos
centaje de células activas (Satterfield reproductores manifiestan abundante
& Flickinger, 1995). Dicho parámetro fluidez seminal, muy posiblemente
se ha empleado con éxito en la perca tengan densidad baja de espermato-
Stizostedion vitreum (Satterfield & zoides (Rurangwa et al. 2004), mien-
Flickinger, 1995), en el botete diana tras que en caso contrario, el semen
Sphoeroides annulatus (Arias-Rodri- con densidad alta, mantiene mayor
guez et al. 2004) y en el bagre tropical número de células espermáticas por
R. laticauda (López-Hernández, 2013, mililitro de muestra (Arias-Rodriguez
2017) con índices de motilidad de 400, et al. 2004). La densidad, se puede
mismo que se obtuvo al multiplicar el determinar en el laboratorio húmedo
tipo de movimiento equivalente a 4 o en campo cuando no se cuenta con
por el 100% de células activas. un espectrofotómetro, mediante la

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Artículo de Revisión: La calidad espermática en peces y los métodos de evaluación

fórmula: D=P/V; donde D = densidad, La prueba tradicional para la de-


P = peso en gramos de la muestra y V terminación de la morfología consiste
corresponde al volumen en mililitros en teñir un frotis delgado de semen
de la muestra (Rodríguez-Gutiérrez, con azul de metileno y con fucsina
1992). fenólica de Ziehl-Nielsen (Rodrí-
Morfología y viabilidad por tinción guez-Gutiérrez, 1992), en el que es
La determinación de la morfo- posible detectar (a 100X) anormali-
logía y la viabilidad de una muestra dades morfológicas como esperma-
de semen es un requisito importante, tozoides con doble flagelo, gotas de
aunque de poco uso, debido a lo labo- citoplasma en el flagelo próximas a la
rioso e impráctico del método, cuan- cabeza, flagelos curvados o doblados
do los resultados son requeridos de y cabezas sin flagelo (Miliorini et al.
inmediato (López-Hernández, 2017; 2011; López-Hernández, 2017). Por
Osorio-Pérez, 2017; Rurangwa et al. otro lado, los métodos de tinción con
2004). Sin embargo, cuando se trata colorantes fluorescentes, ofrecen ma-
de procedimientos encaminados a la yor precisión debido a la particulari-
criopreservación de semen o al apoyo dad bioquímica de los fluorocromos
de metodologías en las cuales no se que se emplean para determinar esta-
requiere información inmediata (p. e. dos fisiológicos específicos de la cé-
motilidad), este es un procedimiento lula (p. e. vivos, muertos y en apopto-
que proporciona información adicio- sis) (Chan et al. 2012). Actualmente,
nal respecto a los porcentajes de ferti- los colorantes fluorescentes más utili-
lización y sobrevivencia. zados son azul de tripano, SYBR 14
La prueba de viabilidad consiste (Chalah & Billard, 1998) Rhodamina
en determinar el número de esperma- 123, Hoechst 33258, diacetato de car-
tozoides vivos y muertos, al emplear la boxifluoresceina, ioduro de propidio
tinción (de un frotis delgado de semen) (Brana et al. 2002) y bromuro de eti-
con eosina-nigrosina (Álvarez et al. dio, Anexina V (Schutte et al. 1998;
2009; Fribourgh, 1966), los esperma- Vermes et al. 2000; Koopman et al.
tozoides muertos se tiñen de rojo y los 1994; Zhang et al. 1997), que facilitan
vivos no. El empleo del procedimiento un análisis más objetivo y cuantitativo
anterior aunque es económico, se debe con equipos alimentados con luz ultra-
realizar y valorar, porque su aplicación violeta que excitan a los fluorocromos
no resulta en un procedimiento prác- al emitir un color específico, tales equi-
tico para cualquier especie (Arias-Ro- pos pueden ser los microscopio de fluo-
driguez, 2001). rescencia y citómetros de flujo. Méto-
dos con mayor resolución son los que

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Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

emplean observación directa de las cé- la reproducción para la evaluación de


lulas espermáticas y están basados en las características e integridad de la
las herramientas de microscopia elec- membrana de células espermáticas. El
trónica (Osorio-Pérez, 2017; Psenicka método de doble tinción permite medir
et al. 2007; López-Hernández, 2017), con precisión la viabilidad de diferen-
las cuales se estarán comentando en tes poblaciones de células (Chan et al.
los apartados siguientes. 2012; López-Hernández, 2017; Oso-
Citometría automática y la viabili- rio-Pérez, 2017). La capacidad de la
dad espermática citometría de fluorescencia, para cam-
El citómetro es un instrumento biar fácilmente su módulo óptico, per-
que puede medir ciertas propiedades mite la excitación y la emisión de estos
físicas como son tamaño, forma y den- tipos de colores, lo que da la posibili-
sidad, y otras particularidades celula- dad de experimentar con varios tintes
res después de que estas son incubadas y discriminar células en diferentes es-
con componentes orgánicos especiales tadios o condiciones fisiológicas, por
(Chapman, 2000; Jiménez-Trinidad, ejemplo: vivas, muertas y en apoptosis
2016; López-Hernández, 2017; Oso- (Chan et al. 2012; López-Hernández,
rio-Pérez, 2017). Los avances en los 2017; Osorio-Pérez, 2017).
fluidos, en electrónica, ordenadores y Las características dependen de
software, laser de alta potencia como las diferencias en la permeabilidad de
el diodo emisor de luz (LED), y tecno- la membrana plasmática de las células
logías de lentes ópticos como detector espermáticas vivas, muertas y apoptó-
de imágenes, han permitido el desa- ticas en los tintes empleados para teñir
rrollo de una nueva generación de sis- el ADN, como el ioduro de propidio,
temas accesibles, como la citometría bromuro de etidio y Hoechst-33342,
basada en imágenes automatizadas. uno puede discriminar a las células vi-
También, el desarrollo y la disponibi- vas, muertas y apoptóticas. El ioduro
lidad de nuevos colorantes fluorescen- de propidio penetra en las células ne-
tes, han hecho de esto una herramien- cróticas o muertas, intercalándose con
ta muy flexible y en la que es posible el ADN, y causa fluorescencia roja. La
correlacionar hasta diez parámetros en Anexina V, muestra una interacción
una sola lectura (Chapman, 2000; Ver- fuerte y específica con la fosfatidilse-
mes et al. 2000). En contraste con las rina en presencia de Ca+ que se da por
técnicas tradicionales que aportan me- pérdida de simetría de la membrana
nor cantidad de datos y requieren de plasmática (Vermes et al. 2000), la cual
mayor tiempo para su desarrollo. es visualizada por fluorescencia verde
La citometría de flujo, ha sido o azul tenue, con la que es posible de-
empleada en estudios de biología de tectar las células en apoptosis. En el

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Artículo de Revisión: La calidad espermática en peces y los métodos de evaluación

caso particular de las células espermá- gonucleosomas o de un único nucleo-


ticas vivas, estas no se tiñen y son ob- soma, y la viabilidad por tinción me-
servadas como objetos transparentes diante marcadores como: Anexina V,
durante los análisis. ioduro de propidio, eosina-nigrosina,
La homeóstasis es mantenida en azul de tripano, etc. Además, métodos
organismos multicelulares por el ba- como perdida de la viabilidad celular o
lance entre la proliferación celular y la condensación de ADN, han sido tam-
muerte celular. El término apoptosis o bién empleados en el monitoreo de la
muerte celular programada, se define apoptosis. Sin embargo, los cambios
como un programa de muerte celular morfológicos y la degradación de la
genéticamente codificado, el cual es cromatina son la base de tales ensa-
morfológicamente y bioquímicamente yos y ocurren después de la apoptosis
distinto de la necrosis o muerte acci- (Zhang et al. 1997).
dental (Vermes et al. 2000). En los primeros estadios de la
Tipos diferentes de muerte celu- apoptosis un cambio en la superficie
lar: Apoptosis (tipo I), muerte celular de la célula es observado, esta es la
asociada con autofagia y pérdida de la translocación de la fosfatidilserina del
integridad de la membrana plasmática interior de la membrana plasmática al
(tipo II) y fuga del contenido intracelu- exterior, que queda expuesta en la su-
lar (necrosis o tipo III) (Koopman et al. perficie de la célula. La Anexina “V” es
1994). La apoptosis es un mecanismo una proteína de unión-fosfolipidica de-
de renovación de células no deseadas pendiente de Ca+, con alta afinidad por
por el sistema inmune, esta es caracte- la fosfatidilserina y es una de las más
rizada por la condensación de croma- usadas para detectar apoptosis median-
tina, reducción del volumen celular y te el análisis citométrico fluorescente,
división del ADN por endonucleasas al marcar la pérdida de simetría de la
en fragmentos grandes de oligonucleo- membrana, durante el inicio del proce-
somas, además es acompañada por la so apoptótico (Zhang et al. 1997).
pérdida de asimetría fosfolípidica de El análisis por citometría fluo-
la membrana (Koopman et al. 1994). rescente de células (Fig. 2C, D), es
Existen diversas técnicas para deter- objetivo, ya que mide la cantidad de
minar y cuantificar el fenómeno apop- tinción asociada o hibridizada con las
tótico, dentro de las metodologías más células de una manera más completa,
comunes para la detección de apopto- este puede analizar millones de células
sis se encuentran: el electroforesis en en segundos y puede evaluar múlti-
gel, en la cual el ADN fragmentado ples tinciones fluorescentes, asociadas
puede ser observado como bandas de con espermas individuales (Graham,
tamaño equivalente a múltiples oli- 2001). La citometría de flujo, es una

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técnica atractiva, debido a que per- 100X con contraste de fases negativo,
mite la caracterización de cada es- al ajustar correctamente el brillo del
permatozoide en términos de función campo (Fig. 1), seguido por el análi-
celular e integridad de sus diferentes sis de las imágenes capturadas.
compartimentos, así como, también Técnicas de tinción diferentes
la identificación de subgrupos sobre han sido desarrolladas para el análisis
un gran número de células. Por medio espermático por microscopia óptica
del análisis de citometría de flujo, la como: Hematoxilina-eosina, azul de
detección de moléculas involucradas toluidina, giemsa, Wright, naranja G,
en la muerte apoptótica, el análisis tinción con azul de eosina-anilina, mé-
del ciclo celular y la determinación de todo de Shorr, Papanicolaou, método
la actividad de las caspasas han sido de Berg, tinción verde claro, naranja
también evaluadas con éxito en célu- de acridina y tinción verde de Janus
las espermáticas. (Aksoy et al. 2012; Serafini et al.
Evaluación de las microestructuras 2014). Sin embargo, el desarrollo del
espermáticas por Microscopia Ópti- Análisis Automatizado para la Morfo-
ca (MOP) logía Espermática (AAME) o el Siste-
El análisis de la morfología es- ma de Análisis Espermático Integrado
permática típica es el criterio directo (SAEI), ha llevado al incremento en el
más importante para evaluar la calidad número de estudios sobre la morfolo-
de una muestra de semen. La correcta gía en espermatozoides de animales,
evaluación depende del modo de pre- principalmente en mamíferos median-
paración, fijación y del método de tin- te el empleo de tinciones que da un
ción de las células gaméticas (van der mejor contraste de fondo.
Horst & Maree, 2010). El empleo combinado por sis-
Una técnica de tinción debe temas computarizados y métodos de
causar el menor cambio en las dimen- tinción como Diff-Quick, Hemacolor,
siones y las formas como sea posible, Spermac, SpermBlue, actualmente
con el fin de evaluar de manera con- permite el análisis automático de ruti-
fiable las características morfométri- na de la forma de los espermatozoides
cas de cada componente celular. Las y fomenta el desarrollo del análisis de
diferentes morfologías espermáticas imágenes para caracterizarlos de ma-
por microscopia óptica, son usual- nera rápida (van der Horst & Maree,
mente establecidas por la tinción de 2010) en otros grupos taxonómicos
las muestras de semen y al exami- como es el caso de varias especies de
nar la laminilla bajo un microscopio mamíferos, lo que incluye a nuestra
óptico, con los objetivos de 40X o especie Homo sapiens. En el caso de

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Artículo de Revisión: La calidad espermática en peces y los métodos de evaluación

los peces, la adaptación de tales mé- El conocimiento sobre los esper-


todos en el futuro, requerirán de su matozoides en peces, ha incrementa-
validación. Sin embargo, la morfolo- do considerablemente desde décadas
gía de los espermatozoides en peces, pasadas. Dichos estudios se han en-
es tan variada que requiere de la es- focado en las diferencias morfoló-
tandarización de la forma celular para gicas y estructurales entre especies,
cada especie previa a procesos de me- las cuales sirven como criterio para
dición. Por ello, los métodos subjeti- estudios evolutivos y taxonómicos
vos por microscopia óptica y el em- (López-Hernández, 2017; Osorio-Pé-
pleo de las nuevas tinciones, permiten rez, 2017; Psenicka et al. 2007; Yasui
la evaluación de espermatozoides en et al. 2009). Además, el análisis por
tiempo real, al ser este un método Microscopia Electrónica de Barrido
barato y de fácil acceso (Aksoy et al. provee información detallada sobre la
2012; Esteso et al. 2015). ultraestructura subcelular espermáti-
Evaluación de las microestructuras ca, y esto permite entender la morfo-
espermáticas por Microscopia Elec- logía normal de los espermatozoides,
trónica de Barrido (MEB) la cual es valiosa en el desarrollo de
La MEB es una herramienta po- métodos de criopreservación y la eva-
derosa, que permite la observación y la luación de posible daño celular, por la
caracterización de materiales orgánicos exposición hacia algún agente conta-
e inorgánicos heterogéneos y superfi- minante previo a procesos de fertili-
cies a escala local. El área examinada zación artificial (Xin et al. 2014). El
o el microvolumen analizado es irra- surgimiento de análisis por computa-
diado con un fino haz de electrones doras (AAME y CASA) en combina-
focalizados, el cual puede ser estático ción con el análisis espermático por
o mediante un barrido a través de la su- MEB, proveen de una opción ver-
perficie del espécimen. Con la ayuda de sátil para el reemplazamiento de las
esta herramienta, gran número de estu- técnicas de microscopia tradicional,
dios sobre la fisiología espermática, han por su fácil operación y objetividad
sido desarrollados en peces (Xin et al. durante el análisis de la velocidad de
2014). En general, los espermatozoides desplazamiento espermático, del tipo
de los peces, se han diferenciado en tres de movimiento y del tiempo de moti-
partes mayores por medio de la MEB: lidad. Sin embargo, la adquisición de
cabeza, pieza media y flagelo (Alavi et tales programas y equipos son alta-
al. 2009; López-Hernández, 2017; Oso- mente costosos.
rio-Pérez, 2017; Rurangwa et al. 2004).

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Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

Evaluación de las microestructuras gio-Grassiotto & Oliveira, 2008). En


espermáticas por Microscopia Elec- algunas familias como Pimelodidae,
trónica de Transmisión (MET) Doradidae y Heptapteridae por ejem-
El estudio de la ultraestructura plo, un tipo especial de espermatogé-
espermática por MET de los diferen- nesis ha sido caracterizado por MET,
tes grupos de peces, ha sido un tema lo cual no es compartido con ningún
popular desde décadas pasadas, debi- otro orden (Quagio-Grassiotto & Oli-
do principalmente a sus diferencias veira, 2008). El análisis de la morfo-
morfológicas específicas que refle- logía y ultraestructura espermática por
jan variación en capacidades funcio- MET, ha sido también empleado para
nales y filogenéticas entre especies la evaluación de la fertilidad en peces,
(López-Hernández, 2017; Psenicka cuando son expuestos a algún agente
et al. 2008). El estudio ultraestruc- químico o manipulados para bancos de
tural de los espermatozoides de mu- genoma mediante criopreservación.
chas especies de peces, ha mostrado Parámetros químicos, bioquímicos y
que la organización de los orgánulos lipídicos del plasma seminal
espermáticos es muy conservativa en En la mayoría de los peces la
miembros de la misma familia o subfa- espermatogénesis es de tipo quística
milia (Quagio-Grassiotto & Oliveira, y los espermatozoides son liberados
2008). Sin embargo, en los teleósteos dentro del sistema de ductos eferentes
es muy difícil correlacionar filogenéti- en el testículo, donde son sujetos
camente la ultraestructura espermática a la fase de maduración al final de
con modelos taxonómicos, ya que los la espermatogénesis, o llamada
espermatozoides de este grupo mues- espermiogénesis o espermiación
tran gran variedad de tipos y formas (Schulz et al. 2010). Durante esta fase,
incluso dentro de la misma familia el epitelio testicular produce el plasma
sistemática. Los análisis por MET, han seminal, como un fluido de componentes
permitido describir de manera más de- bioquímicos múltiples que rodean a
tallada el proceso de espermatogéne- los espermatozoides (Linhart et al.
sis en un gran número de peces, y en 2003). El papel principal del plasma
las que características únicas han sido seminal, es crear un medio óptimo
observadas, entre especies, así como para almacenar los espermatozoides,
correlaciones filogenéticas con otros y también evitar la activación que
grupos taxonómicos. En Siluriformes, mantiene el metabolismo que preserva
las características morfológicas esper- la viabilidad y la energía para activar la
máticas son exclusivas del orden en motilidad (Linhart et al. 2003). Además
comparación a otros grupos de teleós- de la morfología celular, la densidad,
teos (López-Hernández, 2017; Qua- el volumen, la motilidad, la capacidad

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de fertilización, la osmolaridad y la servación (Duan et al. 2016; Linhart et


composición del plasma seminal, han al. 2003; Psenicka et al. 2008). En la
sido los parámetros más empleados para acuicultura, el adecuado conocimien-
medir la calidad espermática en peces to de las características químicas y fí-
(Duan et al. 2016). En la mayoría de los sicas del semen, permite el control y
peces teleósteos, los espermatozoides la producción exitosa de larvas en los
están inactivos en el plasma seminal sistemas de cultivo (Duan et al. 2016;
en los testículos. Factores como la Murakami et al. 2014).
osmolaridad en ciprínidos, la presión
osmótica, la concentración de K+, la CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
concentración de glucosa y el pH del
plasma seminal ≥ a 7.0 en Salmónidos En peces, como en la mayoría
(Linhart et al. 2003; Tabares et al. 2005; de los organismos con reproducción
Taati et al. 2010) y proteínas específicas sexual, los espermatozoides tienen dos
del plasma seminal (Dumorné et al. funciones importantes: activar la ma-
2017) con 120 kDa en cíclidos, son yoría de los procesos moleculares del
factores que inhiben la motilidad óvulo fertilizado y transmitir el mate-
espermática en peces dulceacuícolas rial genético. En los machos, el éxito
(Linhart et al. 2003; Tabares et al. reproductivo depende de varios facto-
2005; Taati et al. 2010). res, entre ellos, la calidad del agua, la
En los peces, variaciones de alimentación, la condición genética y
parámetros químicos, bioquímicos y la fisiología/capacidad reproductiva de
lipídicos se presentan en la misma fa- las células espermáticas, para fertilizar
milia y especies (Duan et al. 2016). el óvulo. La activación de las células
Tales variaciones se encuentran aso- espermáticas se lleva a cabo desde el
ciadas principalmente, a los procesos momento en que el espermatozoide
de reproducción anual, o en ciclos re- entra en contacto con el medio acuoso
productivos a lo largo del año (Linhart y los receptores de la membrana plas-
et al. 2003; López-Hernández, 2017; mática activan el movimiento flagelar.
Osorio-Pérez, 2017). El conocimiento Los factores principales que intervie-
de los componentes del plasma semi- nen durante la motilidad espermática
nal en peces, ha sido empleado para el son la presión osmótica, la composi-
desarrollo de Soluciones Reguladoras ción iónica, el contenido de ATP y el
de la Vitalidad Espermática (SRVE) pH en relación con el medio en el que
(Arias-Rodriguez, 2001), las cuales habita el pez. Los espermatozoides ma-
permiten la manipulación de los game- duros y funcionales son células haploi-
tos con fines de reproducción artificial, des constituidas por una cabeza, una
manipulación cromosómica o criopre- pieza media y un flagelo, todas ellas

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Juan C. López-Hernández, Adriana Osorio-Pérez, Salvador A. Jiménez-Félix,
Salomón Páramo-Delgadillo, Gabriel Márquez-Couturier, George S. Yasui y
Lenin Arias-Rodriguez

con morfología regular y acorde con con miras al empleo y a la manipula-


las particularidades de cada especie que ción de los gametos con amplios están-
muestran variabilidad en forma, tama- dares de calidad fisiológica y genética,
ño, número, localización de organelos permitirán en el futuro, el aislamiento y
y estructuras para la fertilización, como la transferencia de núcleos apropiados
el flagelo y acrosoma en algunas espe- para la creación selectiva de variedades
cies; la observación de tales estructuras híbridas con fines acuícolas, biológi-
con herramientas de microscopia ópti- cos y experimentales. Aunado a que las
ca, electrónica y por citometría automá- herramientas genómicas, consentirán
tica, son necesarias para incrementar y relacionar la calidad y el desempeño fi-
optimizar los porcentajes de fertiliza- siológico con la expresión genética de
ción, sobre todo de especies en riesgo células espermáticas individuales, que
crítico de extinción y con importancia darán cabida a una mayor comprensión
económica. Las estructuras que com- de la segregación y la herencia ligada
ponen al espermatozoide deben tener a la eclosión, la sobrevivencia, la re-
buenas condiciones de simetría y fun- sistencia a enfermedades, el arribo a la
cionalidad, pues regulan el tiempo que primera alimentación, el desempeño de
una célula espermática se mueve (ge- larvas, juveniles y adultos en los culti-
neralmente expresado en segundos), el vos y el medio natural.
tipo de motilidad de los espermatozoi-
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