Medios de cultivo

EMB
Fundamento

Selectivo

El agar EMB es sutilmente selectivo porque contiene los colorantes anilínicos (eosina y azul de metileno), los cuales actúan como
inhibidores, impidiendo el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas y de algunos bacilos Gram negativos
exigentes.
Sin embargo, este agar tiene el inconveniente de que algunas bacterias Gram positivas pueden resistir la presencia de las
sustancias inhibidoras y crecer como pequeñas colonias puntiformes incoloras, tal como el Enterococcus faecalis y
algunos Staphylococcus.

También pueden crecer ciertas levaduras, como el complejo Candida albicans, que dará colonias rosadas muy pequeñas. Inclusive
se pueden desarrollar clamidosporas a partir de esta levadura si la muestra es sembrada por profundidad.

Diferencial

Por otra parte, el agar EMB también es un medio diferencial, ya que estos colorantes juntos (eosina y azul de metileno) tienen la
propiedad de formar un precipitado en pH ácido, por tanto sirven como indicadores de la producción del mismo.

Por ello, las bacterias débilmente fermentadoras de lactosa o sacarosa producen colonias de color púrpura en 24 a 48 horas. Por
ejemplo los géneros Klebsiella, Enterobacter y Serratia.

Aquellas bacterias que fermentan fuertemente la lactosa, como Escherichia coli, o la sacarosa, como Yersinia
enterocolítica o Proteus penneri, forman un precipitado negro verdoso, dando un aspecto de brillo metálico característico en estas
especies.

Cabe destacar que si se usa el medio EMB levine (sin sacarosa), Yersinia enterocolítica y Proteus penneri producirán colonias
transparentes.

Las bacterias que no fermentan la lactosa ni la sacarosa se nutren por la presencia de peptonas, que proporcionan los
aminoácidos y el nitrógeno necesario para el desarrollo bacteriano, y producen colonias transparentes. Por ejemplo, los géneros
Salmonella y Shigella, entre otros.

Así mismo, es importante destacar que el género Acinetobacter puede presentar colonias de color azul lavanda, aun cuando no es
fermentador de lactosa, ni sacarosa, pero tienen la propiedad de fijar el azul de metileno en su pared celular. Esto también puede
suceder con otras bacterias oxidativas.
EL AGAR MACCONKEY
es un medio de cultivo sólido que permite el aislamiento exclusivo de bacilos Gram negativos. Por esta razón es un medio selectivo
y además permite distinguir entre bacilos fermentadores y no fermentadores de la lactosa, lo que lo hace un medio diferencial. Es
uno de los medios de cultivo más utilizado en un laboratorio de microbiología.

Este medio se usa principalmente para el aislamiento de bacilos Gram negativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,
incluyendo las especies oportunistas y las enteropatógenas.

También se puede usar para aislar a otros bacilos entéricos que habitan en el tracto gastrointestinal, pero que no pertenecen a
Enterobacteriaceae, como Aeromonas sp, Plesiomonas sp, entre otros.

Finalmente, puede aislar otros bacilos Gram negativos no fermentadores de glucosa que se encuentran en ambiente, agua o
suelos, pero que en ocasiones pueden ser patógenos oportunistas como Pseudomonas sp, Acinetobacter sp, Alcalígenes sp,
Chromobacterium violaceum, Stenotrophomonas maltophilia, entre otros.

Fundamento

Agar MacConkey

El fundamento de este medio se puede explicar a través de la descripción de sus componentes, pues cada uno posee una finalidad
que determina una propiedad del mismo.

Sales biliares y cristal violeta

En este sentido, el agar MacConkey tiene una composición compleja. En primer lugar contiene sales biliares y cristal violeta.

Estos elementos se encargan de inhibir el crecimiento de bacterias Gram positivas y algunos bacilos Gram negativos exigentes. A
su vez favorece el desarrollo de los bacilos Gram negativos que no son afectados por estas sustancias. Por ello es un medio
selectivo.

Se dice que es ligeramente selectivo en comparación a otros medios que igualmente inhiben el crecimiento de bacterias Gram
positivas y también de la mayoría de las bacterias Gram negativas.

Es extremadamente selectivo para un determinado género, como por ejemplo el agar TCBS para aislamiento de Vibrio cholerae
y otras especies similares halófilas y alcalófilas.

Peptonas, polipectonas y lactosa

Contiene sustancias que aportan los nutrientes necesarios a los microorganismos que se desarrollan en este medio, como las
peptonas, polipectonas y la lactosa.

La lactosa es el punto clave para que el medio sea un medio diferencial, pues los microorganismos que poseen la capacidad para
fermentar la lactosa desarrollaran colonias rosadas fuertes.

Algunas bacterias pueden fermentar la lactosa lentamente o débilmente, desarrollando colonias color rosado pálido y siguen
siendo lactosa positiva.

Las que no fermentan la lactosa utilizan las peptonas como fuente de energía, produciendo amoníaco, alcalinizando el medio. Por
ello las colonias que se originan son incoloras o transparentes.

Indicador de pH

El cambio de color se logra a través de otro compuesto esencial que posee el agar MacConkey. Este compuesto es el indicador de
pH, que en este caso es el rojo neutro.

La fermentación de la lactosa genera la producción de ácidos mixtos. Los mismos acidifican el medio a un pH por debajo de 6,8.

Esto hace que el indicador de pH vire hacia a una tonalidad rosada intenso. La intensidad del color puede variar dependiendo el
pH final.

Agua destilada, cloruro de sodio y agar

Por otra parte, contiene agua destilada y cloruro de sodio que le dan la hidratación y equilibrio osmótico al medio. Finalmente, el
medio contiene agar, que es la base que proporciona la consistencia de medio sólido.

El medio agar MacConkey preparado debe tener un pH final ajustado a 7,1 ± 0,2.

EL AGAR SULFITO DE BISMUTO

es un medio de cultivo sólido, selectivo y diferencial, especialmente formulado para el aislamiento de Salmonella enterica

subgrupo enterica serotipo Typhi, entre otras especies de Salmonella. Al medio se le conoce como agar BSA por sus siglas

en inglés Bismuth Sulfite Agar. La fórmula original del agar

sulfito de bismuto fue creada en 1927 por Wilson y Blair (Glucose Bismuth Sulphite Iron Medium); este contenía sulfito de

sodio, glucosa, solución de bismuto, citrato de amonio, sulfato ferroso y agar-agar. Hoy en día se cuenta con una

modificación del medio original, compuesto por extracto de carne, peptonas de carne y de caseína, indicador sulfito de

bismuto, glucosa, fosfato disódico, sulfato ferroso, verde brillante y agar-agar. Existen muchos medios para

el aislamiento de especies de Salmonella, pero cuando se trata de recuperar el serotipo Typhi, el agar sulfito de bismuto

presenta una notable ventaja frente a ellos, ya que en la mayoría se obtiene una muy baja o nula recuperación de este

microorganismo. Sin embargo, es necesario usar más de un tipo de medio cuando se trata de aislar

enteropatógenos, debido a que el agar sulfito de bismuto resulta menos eficaz para otras especies de Salmonella y para el

género Shigella, los cuales son inhibidos o se desarrollan muy pobremente en este agar. Cabe destacar, que de

todas las especies de Salmonella, el serotipo Typhi es uno de los enteropatógenos más importantes en el humano, siendo

este su único reservorio. Esta serovariedad produce fiebre tifoidea, gastroenteritis, bacteriemia y septicemia. Por este

motivo es relevante incluir este agar cuando se analicen muestras de agua, heces o alimentos en donde se sospeche su

presencia.

Fundamento

Como la mayoría de los medios de cultivo, el agar sulfito de bismuto contiene sustancias nutritivas para promover el desarrollo

bacteriano, tales como las peptonas y el extracto de carne. Así mismo, la glucosa funciona como una fuente de energía y carbono.

Ahora bien, no todas las bacterias crecerán en este medio, ya que el agar sulfito de bismuto es un medio selectivo. Este contiene

compuestos que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos y de ciertas bacterias Gram negativas. Estos

compuestos son: el indicador sulfito de bismuto y el verde brillante.

Por su parte, el fosfato disódico mantiene la osmolaridad y el pH del medio.

Adicionalmente, el agar sulfito de bismuto es un medio diferencial gracias a la presencia del sulfato ferroso, que evidencia la formación

de H2S. El H2S formado por las bacterias reacciona con el sulfato ferroso y forma un precipitado negro insoluble claramente visible.

Finalmente, el agar-agar proporciona la consistencia sólida al medio.

Modo de acción El Verde brillante y el bismuto-sulfito inhiben considerablemente los gérmenes de acompañamiento. El sulfato de hierro

(III) es un indicador del sulfuro de hidrógeno que producen las colonias de Salmonella H2S-positivas. Habitualmente, esta reacción

produce una precipitación marrón o negra en el medio de cultivo así como colonias de color negro o verde con brillo metálico.
El agar XLD

o agar Xilosa Lisina Desoxicolato es un medio de cultivo sólido selectivo y diferencial para el aislamiento de

enteropatógenos. Taylor diseñó la fórmula del agar XL (Xilosa, Lisina) con el fin de mejorar el aislamiento del

género Shigella.

Observó que este género era inhibido en la mayoría de los medios destinados para el aislamiento de

enteropatógenos. Posteriormente, se le adicionó desoxicolato sódico, tiosulfato de sodio y citrato amónico

férrico para aumentar su selectividad. Esta fórmula ha resultado ser útil tanto para el aislamiento de

Shigella, como de Salmonella.

El agar XLD está compuesto por extracto de levadura, desoxicolato de sodio, xilosa, lisina, lactosa, sacarosa,

tiosulfato sódico, citrato férrico de amonio, cloruro sódico, rojo fenol y agar. En la mayoría de los

laboratorios de bacteriología se usa el dúo agar XLD y agar SS para el estudio de muestras fecales en busca

de Shigella y Salmonella.

Otros laboratorios prefieren la combinación de CHROMagar Salmonella y agar XLD, entre otras opciones

disponibles. Estos dúos se pueden preparar en placas de Petri dobles. En un lado colocan agar XLD y en el

lado opuesto el otro medio elegido.

Fundamento

-Poder nutritivo

El agar XLD cuenta con el extracto de levadura, que sirve como fuente de nutrientes a los microorganismos que se desarrollan en
este agar. Además, la presencia de carbohidratos (xilosa, sacarosa y lactosa) proporcionan energía a las bacterias que pueden
fermentarlas.

-Selectividad del medio

Como sustancia inhibidora presenta desoxicolato sódico; este impide el crecimiento de las bacterias Gram positivas, dándole el
carácter selectivo al medio.

-Poder diferencial

Colonias típicas de Shigella

Como ya se ha mencionado, el agar XLD contiene xilosa; este carbohidrato es fermentado por todas las bacterias que crecen en este
medio a excepción del género Shigella.

Esta es una de las características que le brinda su carácter diferencial, ya que las colonias de Shigella se distinguen del resto por
desarrollar colonias rojas, mientras que las demás bacterias producen colonias de color amarillo.

Colonias típicas de Salmonella

El género Salmonella también fermenta la xilosa, generando inicialmente colonias amarillas. Sin embargo, tras agotar al
carbohidrato xilosa, ataca a la lisina por su enzima lisina descarboxilasa. La descarboxilación de la lisina genera álcalis que hacen
virar el color de la colonia y al medio circundante a rojo original.

Este comportamiento solo es realizado por Salmonella, ya que los coliformes que descarboxilan la lisina no logran alcalinizar el
medio. Esto es debido a que los coliformes también fermentan la lactosa y la sacarosa presente; por tanto, la producción de ácidos
es muy alta, quedando la colonia amarilla en estas bacterias.

Cabe destacar que el género Salmonella no fermenta la sacarosa, ni la lactosa.

Producción de H2S
El agar XLD también permite detectar a las especies de Salmonella productoras de H2S; para ello cuenta con la fuente de sulfuro
representado por el tiosulfato de sodio y un revelador de la reacción que es el citrato férrico de amonio.

Este último reacciona con el H2S (gas incoloro) y forma un precipitado negro visible insoluble de sulfato de hierro. En este sentido, las
características de las colonias de salmonella serán rojas con un centro negro.

Cabe destacar que para que se dé la reacción de formación de H2S, se necesita un pH alcalino. Es por ello que otras enterobacterias
que forman H2S no pueden hacerlo o lo hacen pobremente en este medio, pues la alta acidez que producen al fermentar los
carbohidratos presentes inhiben o dificultan la reacción.

-Cloruro de sodio, agar y rojo de fenol

Finalmente, el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico; el agar es el agente solidificante y el rojo de fenol detecta los
cambios de pH, haciendo virar el color de las colonias y del medio.

Agar T.S.I
El agar TSI o agar hierro triple azúcar es un medio de cultivo sólido que sirve como prueba bioquímica para

orientar la identificación inicial de los bacilos Gram negativos. Se fundamenta en evidenciar

la fermentación de los azúcares presentes, y la producción de sulfuro de hidrógeno y gas.

Su composición y fundamento es muy similar a la prueba de Kligler hierro, con la diferencia que este último

contiene solo glucosa y lactosa. En cambio, -como su nombre lo indica- el agar hierro triple azúcar contiene

tres carbohidratos fermentables: glucosa, lactosa y sacarosa.

Además, el medio TSI posee cuatro derivados proteicos que lo hacen ser un agar muy nutritivo: extracto de

levadura, extracto de carne, peptona y proteosa peptona. También contiene sulfato ferroso de amonio,

tiosulfato de sodio, cloruro de sodio, rojo de fenol y agar.

La incapacidad de un microorganismo en fermentar la glucosa presente en el medio lo excluye

inmediatamente de pertenecer a la Familia Enterobacteriaceae. De allí que esta prueba es esencial para

decidir qué ruta de identificación se debe tomar para determinar el género y la especie.

Cada laboratorio decide si trabaja con agar TSI o con agar Kligler hierro.

Fundamento

Cada uno de los compuestos cumple una función dentro del medio.

Cloruro de sodio y agar

El cloruro de sodio es necesario para mantener el equilibrio osmótico del medio. En tanto que el agar le da la

consistencia sólida.

Indicador de pH (rojo de fenol)

El pH del medio preparado está equilibrado a 7,3 y el indicador de pH (rojo de fenol) vira a amarillo por

debajo de 6,8. Esto quiere decir que pequeñas cantidades de ácidos producidos por la fermentación de los

azúcares harán virar el medio de color rojo-naranja a amarillo.

Si no ocurre fermentación habrá alcalinización del medio por el uso de las peptonas, virando de rojo-naranja

a rojo fuerte.

Derivados proteicos (extracto de levadura, extracto de carne, peptona y proteosa peptona)

Cuando las bacterias metabolizan las proteínas presentes en el agar TSI, se producen aminas que alcalinizan

el medio (principalmente a nivel del bisel), debido a que la reacción necesita oxígeno. Las aminas hacen

virar el bisel a rojo fuerte.

Pero esto dependerá de la capacidad que tengan las bacterias de fermentar o no los carbohidratos.

Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa)

El estudio de la fermentación de azúcares puede dar varias imágenes y cada una se interpreta de manera

diferente. La interpretación de la prueba divide a los microorganismos en 3 categorías: no fermentadores de

glucosa, no fermentadores de lactosa y fermentadores de lactosa/sacarosa.

Cabe destacar que la cantidad de glucosa en el medio es limitada, mientras que la concentración de lactosa y

sacarosa es 10 veces mayor.

Las bacterias de la Familia Enterobacteriaceae y otros microorganismos fermentadores de glucosa

comenzarán a fermentar este azúcar por ser el carbohidrato más simple para obtener energía.

Por otra parte, la lactosa y la sacarosa son carbohidratos complejos que deben ser descompuestos y

convertidos en glucosa para que puedan ingresar al ciclo de Embden-Meyerhof.

-Microorganismos no fermentadores de glucosa

Cuando el microorganismo inoculado no es capaz de fermentar la glucosa, mucho menos podrá fermentar

otros carbohidratos. Por tanto, aquí no se forman ácidos, pero existe formación de aminas en el bisel por la

utilización de las peptonas.

En este caso el bisel vira a un rojo más fuerte y el fondo del tubo puede quedar sin cambio o puede

alcalinizarse también, quedando todo el tubo rojo.

Interpretación: K/K significa bisel alcalino / fondo alcalino o neutro

En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo D.

Este resultado indica que el microorganismo no pertenece a la Familia Enterobacteriaceae.

-Microorganismos no fermentadores de lactosa/sacarosa

Si la bacteria es capaz de fermentar la glucosa pero no la lactosa ni la sacarosa, pasará lo siguiente:

La bacteria consumirá toda la glucosa presente al cabo de 6 a 8 horas aproximadamente, siendo capaz de

acidificar tanto el bisel como el taco; es decir, el agar habrá virado completamente a amarillo. Pero al

agotarse la glucosa y ante la imposibilidad de utilizar la lactosa y la sacarosa, la bacteria comenzará el

metabolismo de las proteínas.

Esta reacción necesita oxígeno, por ello la degradación de las peptonas se da en la superficie (bisel). Las

aminas producidas alcalinizan el bisel virando de color amarillo a rojo. Esta reacción es evidenciada a las 18

a 24 horas de incubación.

Interpretación: K/A significa bisel alcalino y taco ácido.

En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo B.

-Microorganismos fermentadores de lactosa/sacarosa

Los microorganismos capaces de fermentar la lactosa y la sacarosa obviamente pueden fermentar la

glucosa. Después de que la mínima cantidad de glucosa presente en el medio se agota, el piruvato formado

se comienza a metabolizar para formar ácidos a través del ciclo aeróbico de Krebs, y en el período de 8 a 12

horas todo el medio estará amarillo.

Si la bacteria es capaz de desdoblar la lactosa o la sacarosa, se seguirán produciendo ácidos, y al cabo de 18

a 24 horas todo el tubo –bisel y taco- continuarán amarillos.

Cabe destacar que la utilización de la glucosa se realiza de dos maneras: una en forma aerobia en el bisel

del tubo, y la otra de forma anaerobia en el fondo del tubo.

Interpretación: A/A significa bisel ácido/ fondo ácido. Puede presentar gas o no.

En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo A.

Producción de gas

Algunos microorganismos son capaces de producir gas durante la fermentación de los azúcares. El gas se

evidencia en el tubo por la presión que este ejerce dentro del agar. La presión origina la formación de

burbujas o el desplazamiento del agar. En ocasiones la formación de gas puede fracturar al medio.

Es importante que al momento de sembrar el medio TSI, la punción se haga limpiamente por el centro del

agar hasta llegar al fondo. Si la punción se desvía hacia las paredes del tubo, puede causar falsos positivos

en la producción del gas, ya que el mismo escapará por el canal formado erróneamente.

La producción de gas, así como las reacciones que ocurren en el bisel del agar, necesitan oxígeno, por tanto

se recomienda que el tubo sea tapado con tapón de algodón, y si se usa tapa de baquelita, esta no debe

estar ajustada completamente.

La producción de gas se reporta como positiva (+) o negativa (-).

 

Patrones de formación de gas. Fuente: Esquema realizado por MSc. Marielsa Gil. Fuente de las imágenes: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe
[CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

Tiosulfato de sodio y sulfato ferroso de amonio (producción de sulfuro de hidrógeno)

Las bacterias capaces de producir sulfuro de hidrógeno (gas incoloro), toman el azufre del tiosulfato de sodio

presente en el medio. Una vez formado el H2S reacciona con el sulfato ferroso de amonio, produciendo

sulfuro de hierro (precipitado negro claramente visible).

La producción de H2S se reporta como positiva (+) o negativa (-).

En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo C.
Agar citrato de Simmons
El agar Citrato de Simmons es un medio sólido utilizado como prueba bioquímica de identificación de

microorganismos, especialmente de bacilos Gram negativos. El medio original fue creado por Koser en 1923.

El medio Citrato de Koser consistía en un caldo que contenía fosfato de sodio, fosfato de amonio, fosfato

monopotásico, sulfato de magnesio y citrato de sodio.

Como puede verse, la única fuente de carbono del medio es el citrato, y de nitrógeno es el fosfato de

amonio, omitiéndose las proteínas y los carbohidratos como fuente de estos elementos, comúnmente están

presentes en otros medios.

Por tanto, la bacteria inoculada en ese medio solo puede reproducirse si es capaz de tomar el carbono del

citrato. La prueba era positiva si había turbidez en el medio, sin embargo tenía el inconveniente de que

podía ocurrir turbidez no específica.

Este problema fue resuelto por Simmons agregándole agar y azul de bromotimol a la fórmula original de

Koser. Aunque el principio es el mismo, se interpreta de forma diferente.

Fundamento

Algunas bacterias tienen la capacidad de sobrevivir en ausencia de fermentación o producción de ácido

láctico, necesitando conseguir energía a través de la utilización de otros sustratos. En esta prueba la única

fuente de carbono ofrecida es el citrato.

Las bacterias que son capaces de sobrevivir bajo estas condiciones metabolizan el citrato de forma rápida

por una vía alterna a la tradicional, utilizando el ciclo del ácido tricarboxílico o el ciclo de fermentación del

citrato.

El catabolismo del citrato por parte de las bacterias comprende un mecanismo enzimático sin la intervención

de la coenzima A. Esta enzima se conoce con el nombre de citricasa (citrato oxalacetato-liasa) o citrato
desmolasa. La reacción requiere la presencia de un catión bivalente, que en ese caso es suministrado por el

magnesio.

La reacción genera oxaloacetato y piruvato, que luego dan origen a ácidos orgánicos en medio de un pH

alcalino formado por la utilización de la fuente de nitrógeno. Estos ácidos orgánicos son usados como fuente

de carbono generando carbonatos y bicarbonatos, alcalinizando aun más el medio.

Modo de sembrado

El medio citrato de Simmons debe ser ligeramente inoculado en cola de pescado usando ansa recta o aguja,

e incubarse durante 24 horas a 35-37°C. Culminado el tiempo se observan los resultados.

El sembrado se realiza únicamente en la superficie del agar. No hacer punción.

Interpretación

Si el medio queda del color original (verde) y no hay crecimiento visible, la prueba es negativa, pero si el

medio cambia a color azul, indica la presencia de productos alcalinos, que es detectado por el indicador de

pH. En este caso la prueba es positiva.

 

Citrato (+) y (-). Fuente: MSc. Marielsa Gil

Esto sucede porque si la bacteria utiliza el carbono del citrato también es capaz de tomar el nitrógeno del

fosfato de amonio con el cual libera amoníaco, alcalinizando el medio.

Por otra parte, si se observa crecimiento de la bacteria en el medio, pero no hay cambio de color, también la

prueba debe considerarse positiva, ya que si hay crecimiento quiere decir que la bacteria fue capaz de

utilizar el citrato como fuente de carbono, aunque no haya un cambio del pH en el momento (en ocasiones

puede tardar).

Si existe duda en la interpretación del color final, se puede comparar con un tubo de citrato no inoculado.
 El caldo urea

es un medio de cultivo líquido, utilizado para evidenciar la presencia de la enzima ureasa en ciertos

microorganismos. La ureasa es una enzima microbiana que se produce de manera constitutiva, es decir, es

sintetizada independientemente de estar o no presente el sustrato sobre el que actúa.

La función de la ureasa está relacionada con la descomposición de los compuestos orgánicos. No todos los

microorganismos son capaces de sintetizar esta enzima, por tanto su determinación en el laboratorio permite

identificar ciertas cepas bacterianas e inclusive diferenciar entre especies de un mismo género.

Existen dos tipos de prueba de la urea: Stuart y Christensen. Se diferencian en su composición y en la

sensibilidad. La primera es especial para evidenciar gran cantidad de ureasa producida por especies del

género Proteus.

La segunda es más sensible y puede detectar pequeñas cantidades de ureasa generadas tardíamente por

otros géneros bacterianos, tales como Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella,

Bacillus, Micrococcus, Helicobacter y Mycobacterium.

El caldo urea de Stuart está compuesto por urea, cloruro de sodio, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico,

extracto de levaduras, rojo de fenol y agua destilada.

En tanto que, el caldo o agar urea de Christensen está compuesto por peptonas, cloruro de sodio, fosfato

monopotásico, glucosa, urea, rojo de fenol, agua destilada y agar-agar. Este último solo si se trata del medio

sólido.

Fundamento

La enzima ureasa hidroliza la urea para formar anhídrido carbónico, agua y dos moléculas de amoníaco.

Estos compuestos reaccionan para formar el producto final llamado carbonato de amonio.

Caldo urea de Stuart

El caldo urea de Stuart es más tamponado con un pH de 6,8. Por tanto, el microorganismo debe ser capaz

de formar grandes cantidades de amonio para hacer virar al rojo de fenol. El pH debe elevarse por encima

de 8.

Por ello el caldo urea de Stuart es selectivo para especies de Proteus, dando resultados positivos en 24 a 48

horas de incubación, y no es efectivo para bacterias que producen pocas cantidades de ureasa o que

hidrolizan lentamente la urea.

Esto se debe a que las especies de Proteus son capaces de utilizar la urea como fuente de nitrógeno. En

cambio, otras bacterias productoras de ureasa necesitan una fuente adicional.

Sin embargo, Pérez y cols. (2002) determinaron que el caldo urea de Stuart era tan eficiente como el agar

urea de Christensen, para determinar la ureasa en cepas de levaduras de los géneros Candida,

Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon y Saccharomyces.

Los autores del estudio aseguran haber conseguido 100% de coincidencia con ambos medios (Stuart y

Christensen) al incubar durante 24 y 48 horas; haciendo la salvedad que tomaron como positivas las cepas

que lograron virar los medios a un color rosado-fucsia fuerte.

Esta aclaratoria es necesaria, ya que Lodder (1970) afirmó que casi todas las levaduras logran colocar el

bisel del agar urea de Christensen a rosado pálido. Esto es debido a que pueden hidrolizar la urea en

mínimas cantidades, y a la formación de aminas por la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos de la

superficie. Esto no debe ser interpretado como positivo.

Caldo o agar urea de Christensen

El caldo o agar urea de Christensen es menos tamponado, siendo capaz de detectar pequeñas cantidades de

amonio. Además, este medio está enriquecido con peptonas y glucosa. Estos compuestos hacen que se

desarrollen otros microorganismos productores de ureasa que no crecen en el caldo Stuart.

Así mismo, la prueba de urea de Christensen ofrece resultados más rápidos, sobre todo para Proteus,

pudiendo dar fuertemente positiva en tan solo 30 minutos como tiempo mínimo y hasta 6 horas como

tiempo máximo.

El resto de los microorganismos productores de ureasa logran virar el color del medio levemente después de

6 horas, y fuertemente al cabo de 24, 48, 72 horas o más, e incluso algunas cepas pueden dar reacciones

débiles después de 5 o 6 días.

Interpretación de ambos medios (Stuart y Christensen)

El medio originalmente es de color amarillo-anaranjado y una reacción positiva hará virar el color del medio

a rosado-fucsia. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de amonio producido.

Una reacción negativa dejará el medio del color original a excepción de las levaduras, que pueden dar un

rosado pálido con el medio agar urea de Christensen.

E l agar LIA

(Lisina Hierro) es una prueba bioquímica utilizada para la identificación de bacterias de la

familia Enterobacteriaceae. Este medio fue creado por Edwards y Fife, basados en la fórmula de Falkow.

Originalmente esta prueba era un caldo que contenía peptonas, extracto de levadura, glucosa, L-lisina,

púrpura de bromocresol y agua destilada. Edwards y Fife le agregaron agar-agar, citrato férrico de amonio y

tiosulfato sódico.

El agar LIA (Lisina Hierro) es una prueba bioquímica utilizada para la identificación de bacterias de la

familia Enterobacteriaceae. Este medio fue creado por Edwards y Fife, basados en la fórmula de Falkow.

Originalmente esta prueba era un caldo que contenía peptonas, extracto de levadura, glucosa, L-lisina,

púrpura de bromocresol y agua destilada. Edwards y Fife le agregaron agar-agar, citrato férrico de amonio y

tiosulfato sódico.

Fundamento

Peptonas y extracto de levadura

Como la mayoría de los medios de cultivos, el agar hierro lisina contiene componentes que proporcionan la

fuente de nutrientes necesarias para el crecimiento bacteriano. Estos componentes están representados por

las peptonas y el extracto de levadura.

Glucosa

Así mismo, este agar contiene como carbohidrato fermentable la glucosa. Se sabe que todas las bacterias de

la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa.

Este paso es crucial, porque se encargará de acidificar el medio, condición indispensable para que la enzima

lisina descarboxilasa -si está presente- actúe sobre su sustrato.

En algunos géneros bacterianos se puede observar la producción de gas debido a la fermentación de la

glucosa.

El gas se evidencia cuando ocurre un desplazamiento del agar en el tubo, quedando un espacio vacío en el

fondo del mismo, o por fractura del medio en dos o más porciones.

L-lisina

Una vez descarboxilada la lisina, se forma una diamina (cadaverina) y anhídrido carbónico.

La descarboxilación se da en presencia de la coenzima fosfato de piridoxal. Esta reacción es irreversible.

Indicador de pH (púrpura de bromocresol)

Todos los cambios de pH ocurridos en el medio por las diversas reacciones, son detectados por el indicador

de pH púrpura de bromocresol.

En este sentido, cuando hay acidificación el medio se torna amarillo, y cuando hay alcalinización el medio

regresa al color morado o púrpura original.

Cuando ocurre desaminación de la lisina por la presencia de la enzima lisina desaminasa, se forma un color

rojizo en la superficie, típico en los géneros Proteus, Providencia y algunas especies de Morganella.

Esto se debe a que durante el proceso de desaminación se forma el ácido alfa-ceto-carbónico, que reacciona

con el citrato de amonio en presencia de oxígeno, lo que origina el color mencionado.

Citrato férrico de amonio y tiosulfato sódico

Por otra parte, las bacterias que producen sulfuro de hidrógeno quedarán en evidencia por la presencia del

tiosulfato sódico (fuente de sulfuro) y del citrato férrico de amonio, que es el revelador del H 2S.

Las bacterias que posean la enzima tiosulfato reductasa tienen la capacidad de actuar reduciendo el

tiosulfato de sodio presente, formando sulfito y sulfuro de hidrógeno (H2S).

Este último es un gas incoloro, pero al reaccionar con la sal de hierro forma sulfuro ferroso metálico, que es

un compuesto insoluble (precipitado negro visible).

Sin embargo, la capacidad de formación de H2S con este medio no es muy confiable, debido a que algunas

bacterias lisina descarboxilasa negativas capaces de producir H2S no formarán el precipitado negro, pues la

acidez del medio interfiere. Por ello se recomienda corroborar con otros medios que contengan hierro.

Interpretación de la prueba

Descarboxilación de la lisina

Los tubos deben leerse después de culminadas las 24 horas de incubación, de lo contrario se corre el riesgo

de malinterpretar la reacción, reportando falsos negativos.

Hay que recordar que la primera reacción que ocurrirá será la fermentación de la glucosa, por tanto todos

los tubos al cabo de 10 a 12 horas virarán a color amarillo.

Si al finalizar el tiempo de incubación (24 horas) se observa un fondo amarillo con una superficie morada o

púrpura, la reacción es negativa. El color púrpura de la superficie corresponde a la alcalinización del medio

por el uso de las peptonas.

Una reacción positiva es aquella en donde el fondo y la superficie del tubo son completamente púrpuras, es

decir, vuelve al color original.

Por tanto, quien determina la positividad de la prueba es la base o fondo del medio. Si se tiene duda sobre el

color se puede comparar con un tubo de LIA no inoculado.

Desaminación de la lisina

Un tubo que evidencia la desaminación de la lisina tendrá una superficie color rojiza granate y un fondo

amarillo (ácido), o todo el tubo color rojizo granate.

Esta reacción se interpreta como negativa para la descarboxilación de la lisina, pero positiva para

desaminación de la lisina.

Esta reacción se define e interpreta en el bisel.

Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S)

Una reacción positiva se observa por la aparición de un precipitado negro en todo el medio o parte de él.

Generalmente entre el límite del bisel y la base.

Si el precipitado se da en todo el tubo no dejará ver las otras reacciones que ocurren en el medio.

Registro de los resultados

Al interpretar la prueba los resultados se registran de la siguiente manera:

Primero se lee el bisel, luego el fondo o taco, después la producción de H2S, y finalmente la producción de

gas.

Ejemplo: K/A + (-). Esto significa:

 K: Bisel alcalino (color morado)

 A: Fondo ácido (amarillo), es decir, reacción de descarboxilación negativa y desaminación

negativa.

 +: Producción de sulfuro de hidrógeno

 (-): Sin gas.

El test Voges-Proskauer

es una prueba bioquímica que se utiliza para ayudar a la identificación de bacterias pertenecientes a la

familia Enterobacteriaceae. Especialmente es útil para diferenciar cepas de Escherichia coli de Klebsiella y

Enterobacter, entre otras.

La prueba se realiza en el medio de cultivo líquido llamado rojo de metilo–Voges Proskauer, mejor conocido

con las siglas RM/VP. Este medio está compuesto por polipeptona tamponada, glucosa, fosfato dipotásico

y agua destilada.

El medio actual RM/VP es una modificación del medio Clark y Lubs, el cual originalmente contenía menor

concentración de peptonas y glucosa. Por tanto, se producía menos cantidad del ion hidrógeno, requerido

para la reacción positiva de Voges-Proskauer.

El test se fundamenta en la capacidad que tiene el microorganismo de utilizar la glucosa por la vía butilén-

glicólica, y formar un producto final neutro denominado acetoína, en presencia de oxígeno y de un pH

alcalino.

En el medio RM/VP, además de poderse revelar el test de Voges-Proskauer, también se puede revelar la

prueba de rojo de metilo.

Fundamento

Fundamento del test Voges-Proskauer

Las pluripeptonas presentes en el medio proporcionan los requerimientos nutricionales indispensables para el

crecimiento bacteriano. Por su parte, la glucosa es el compuesto principal. Muchas bacterias tienen la

capacidad de metabolizar la glucosa y formar ácido pirúvico.

El ácido pirúvico es un punto medio en el metabolismo de la glucosa y a partir de allí cada microorganismo

puede tomar diferentes vías. Algunos formarán ácidos mixtos, tales como ácido láctico, ácido acético, ácido

fórmico y ácido succínico, y otros formaran productos neutros como el 2,3-butanediol.

El test Voges-Proskauer revela la capacidad del microorganismo de formar acetil metil carbinol (acetoína),

producto intermediario del 2,3-butanediol en condiciones de aerobiosis.

La acetoína se reduce y forma 2,3-butanediol, pero esta reacción es reversible, por tanto si el 2,3-butanediol

se oxida se forma acetoína. Por ello, el oxígeno es indispensable.

El fosfato dipotásico es el buffer que amortigua la mezcla a un pH 6,9 ± 0,2.

Fundamento del revelado de la prueba e interpretación

Para evidenciar la reacción se debe realizar un revelado utilizando dos reactivos (reactivos de Barrit),

conocidos como Voges A y Voges B.

El Voges A es una solución al 5% de α-naftol, y el Voges B es un preparado de hidróxido de potasio al 40%.

Si no se dispone de hidróxido de potasio puede ser sustituido por hidróxido de sodio al 40%.

El α-naftol es un catalizador que aumentará la intensidad del color de la reacción, lo que hace a la prueba

más sensible. El α-naftol debe agregarse siempre primero, agitando el tubo para que el medio entre en

contacto con el oxígeno. De esta manera la acetoína presente se oxida a diacetilo, y el 2,3-butanediol se

oxida para formar acetoína, pasando esta a diacetilo.

Es así como el α-naftol se unirá al diacetilo, que a su vez se ha unido al núcleo guanidina presente en el

aminoácido arginina, esta última proveniente de las pluripeptonas.

Por su parte, el hidróxido de potasio o de sodio se encarga de absorber el CO2 y de reaccionar con las

peptonas. Esta reacción origina la formación de un color rosado-salmón, claramente visible después de

agitar muy bien el tubo.

Para que la coloración se produzca instantáneamente se deben mezclar cantidades correctas de diacetilo,

peptona y α-naftol. Si esto no ocurre se deja reposar el tubo durante 15 minutos antes de interpretar.

Generalmente la prueba da positiva después de 2 a 5 minutos, cuando se puede observar un color rosado

débil. Si se deja en reposo durante 30 min a 1 hora la intensidad del color será máxima (rojo intenso).
Una prueba negativa se pondrá en evidencia cuando el caldo quede de color amarillo. Después de 1 hora, si

la prueba es negativa, se puede formar un color cobrizo producto de la reacción del hidróxido de potasio

sobre el α-naftol.