PRÁCTICA Nº 2

FORMAS DE EXPRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

La determinación de la actividad de una enzima consiste en averiguar cuanto de enzima

activa hay en una muestra, esta se expresa en Unidades de actividad enzimática "U"
principalmente, en Katales, como numero de recambio o como actividad especifica,
dependiendo de la enzima y de las características del trabajo.

Las Unidades de actividad enzimática (U) vienen a ser los moles de sustrato
transformados por minuto, bajo condiciones adecuadas y estrictamente controladas de pH y
temperatura. Los Katales por su parte, son los moles de sustrato transformados por
segundo, también bajo condiciones adecuadas de pH y temperatura; estas unidades de
expresión de la actividad son utilizadas para enzimas o muestras enzimáticas muy activas.

El número de recambio viene a ser el número de moléculas de sustrato transformadas por

una sola enzima (o un solo centro activo), en un segundo, esta forma de expresión es
también para enzimas de alta actividad. La actividad especifica son las Unidades de
actividad enzimática por miligramo de proteína, esta unidad es utilizada en procesos de
purificación de enzimas.

Algunas veces es imposible utilizar alguna de estas formas de expresar la actividad

enzimática, al hacer la evaluación de una enzima; esto ocurre cuando el sustrato es un
polimero cuyo pero molecular es variable, como en el caso del almidón, el glucógeno, la
quitina, la celulosa, etc., en donde no hay manera de determinar en molaridad el sustrato
transformado, ya que no existe un peso molecular definido del mismo, al inicio de la
reacción. En tal sentido, se puede hacer la medida de una consecuencia de la acción de la
enzima. A continuación presentamos algunos ejemplos:

ENZIMA METODOLOGÍA

Proteasas Capacidad para coagular la leche.

Liberación de algún aminoácido especifico.
Acción sobre películas fotográficas.

 Amilasas Pérdida de la capacidad de formar complejos de color yodo amilasa.

Disminución de la viscosidad inicial.
Incremento del poder reductor.

Pectinasas Capacidad para clarificar jugo de manzana.

Disminución de la viscosidad inicial.
Incremento en el poder reductor.
Disminución del precipitado alcohólico del medio de reacción
Al hacer la determinación de la actividad de una enzima, si no existe especificación sobre
las condiciones de la determinación, muchas veces el trabajo requiere el establecerlas
previamente. En tal sentido, se debe conocer perfectamente la reacción química catalizada
por la enzima en prueba; el sustrato o sustratos que participan, el producto o productos
formados, la necesidad o no de cofactores, participación de moduladores, condiciones de
pH, temperatura y fuerza iónica apropiadas, así como el valor de la KM, el cual nos permite
saber cuanto de sustrato debemos utilizar para garantizar que estamos en una reacción de
orden cero, por lo menos el intervalo de tiempo que dura la medida de la actividad de la
enzima.

El siguiente problema por resolver, es la decisión sobre qué es más conveniente medir, si el
consumo de sustrato, la formación de producto o alguna modificación del cofactor, lo cual
va a depender de 4 factores fundamentalmente, la precisión, la sencillez, la rapidez y el
costo del método de determinación. Está en el investigador en enzimas decidir que es lo
más conveniente para su trabajo.

Para expresar los resultados obtenidos en alguna de las unidades de medida propuestas, es
fundamental realizar una curva de calibración, para cualquiera de los métodos de
determinación de actividad empleado; por esta razón en la presente practica, vamos a
elaborar las curvas de calibración para el método químico de ureasa desarrollado en la
práctica 1 y la curva de amilasas utilizando como sustrato almidón de papa.

OBJETIVOS:

1. Que el alumno aprenda a elaborar una curva de calibración.

2. Que el alumno determine el intervalo de validez del método empleado.
3. Que el alumno sepa calcular y utilizar el factor de calibración.
4. Que el alumno sepa expresar sus resultados en alguna de las unidades de expresión
propuestas.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO 1
DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DEL REACTIVO DE NESSLER
EN LA CUANTIFICACIÓN DEL AMONIO

Procedimiento
En diez tubos de ensayo prepare soluciones acuosas de sulfato de amonio SO4(NH4+)2, las
cuales contengan equitativamente entre 0,1 y 2 micromoles de la sal; a partir de una
solución madre de concentración 5 x 1O-4M.

Complete con agua destilada cada tubo hasta hacer un volumen final de 4,5ml (con la
máxima precisión posible), mezclar bien.

Añadir a cada tubo 0,5 ml de reactivo de Nessler y mezclar.

Esperar diez minutos a temperatura ambiente y luego leer en el espectrofotómetro a una

longitud de onda de 420 o empleando filtro azul.

Nota: no olvide considerar un blanco y asimismo, descarte todo tubo que no sea totalmente
transparente.

Resultados
Coloque en la siguiente tabla los resultados obtenidos:

Título: ________________________________________________________________

ml de
ml de moles de Absorbancia moles moles de
sulfato de
H2O SO4(NH4+) Absorbancia neta de amonio urea
amonio

Blanco: _______________

En el siguiente espacio, pegue el papel milimetrado donde a graficado moles de urea vs

Absorbancia neta:
INTERROGANTES

1. ¿Entre qué concentraciones de amonio la curva cumple con la ley de Lambert y Beer?

2. Calcule el Factor de calibración promedio, para urea:

__
FC = _______________

EXPERIMENTO 2
ELABORACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL FERRICIANURO DE
POTASIO EN LA CUANTIFICACIÓN DE MALTOSA

Fundamento
El ferricianuro en presencia de carbonato de sodio concentrado es muy sensible a la
reducción a ferrocianuro, por pequeñas cantidades de azúcares reductores; por esta razón,
es utilizado como método químico en determinaciones enzimáticas de hidrólisis de
polisacáridos. Su utilidad se debe a que mientras está oxidado es de color amarillo y cuando
se reduce se vuelve transparente.

Procedimiento
Preparar 6 tubos de ensayo que contengan entre 0,01 y 0,18 mg de maltosa (se emplea este
azúcar reductor porque es el principal producto de las amilasas que estudiaremos
posteriormente, sobre el almidón; se debe preparar la curva de calibración con el azúcar
reductor que se forme durante la catálisis, pues cada uno de ellos tiene distinto
comportamiento).
Completar con agua destilada hasta un volumen final de 1,5 ml.
Adicionar a cada tubo, 2 ml de reactivo de color (0,5g de ferricianuro de potasio en un litro
de carbonato de sodio 0,5M).
Cubrir cada uno de los tubos con un trozo de papel aluminio (sin estropearlo), para evitar el
ingreso del oxígeno, el cual puede reoxidar al ferrocianuro cuando este, está a altas
temperaturas
Llevar los tubos a baño maría hirviente por exactamente 15 minutos.
Enfriarlos, luego descubrirlos y leer sus absorbancias a 420 nm (o filtro azul). Considerar
que el color es estable entre 10 a 30 minutos.
Preparar adicionalmente un tubo blanco con 1,5 ml de agua destilada o el buffer que se
empleará en las determinaciones enzimáticas, y 2 ml del reactivo. Una buena lectura para el
blanco es de 0,850; si no es así, es que está fallando el cromógeno o la sensibilidad del
espectrofotómetro.

Resultados
Coloque en la siguiente tabla sus resultados:

Título: ________________________________________________________________

ml de maltosa ml de agua mg de maltosa Absorbancia Absorbancia

_________ destilada neta

Blanco: ____________

A continuación plotee mg de maltosa vs Absorbancia neta en papel milimetrado y péguelo

en el espacio siguiente:

INTERROGANTES

1. ¿Cuál es el rango de utilidad del reactivo para maltosa?

2. Calcular el factor de calibración promedio, para miligramos de maltosa:

 ___
FC = _______________

INTERROGANTES:

1. ¿Cuál de los dos métodos es más conveniente? ¿Por qué?

2. Exprese los resultados del experimento 1 de la práctica 1 en unidades de actividad

enzimática (U)

TUBOS 1 2 3 4 5
Absorbancia
neta
Actividad
enzimática (U)

3. ¿Cuál sería la unidad de expresión de la actividad enzimática en el experimento 2 de

esta práctica?

4. ¿Cómo se usa el factor de calibración promedio? ¿Cuál es su beneficio?

5. ¿Qué importancia tiene la elaboración de un mayor número de estándares en estos

métodos?
6. Escriba las fórmulas del ferricianuro y del ferrocianuro:
 PRÁCTICA Nº 3
MÉTODOS EXPERIMENTALES DE PARÁMETROS CINÉTICOS

INTRODUCCIÓN
Los bioquímicos alemanes Leonor Michaeles y Maud Menten el año 1913 propusieron por
primera vez la ecuación que hoy lleva su nombre:

vo = Vmx [S]
Ks + [S]

Esta es la misma que la ecuación propuesta por Henri el año de 1903, pero sustentada con
más solidez, pues por primera vez se empleó el término “velocidad inicial” (vo). Esta tenía
el inconveniente de considerar a la constante de velocidad K2 , con un valor mucho menor
que K-1, lo cual es solo válido para algunas enzimas.

Posteriormente en 1925 Briggs y Haldane mejoraron el concepto, considerando a la

constante K2 de un valor igual o mayor que K-1, con lo cual aparece el principio del estado
estacionario, propio de la mayoría de enzimas.

El trabajo de Michaelis y Menten fue tan importante para entender el comportamiento de

las enzimas, que la ecuación en su actual concepción lleva su nombre y la constante que
considera, toma esa abreviación en honor a ellos:

vo = Vmx [S]
KM + [S]

El gran inconveniente de esta ecuación es que la velocidad máxima no es un valor real,

pues por definición de hipérbola rectangular, que es la gráfica de ésta expresión
matemática, se entiende que Vmx solo se alcanzará en el infinito. Por esta razón algunos
años después, empezaron a aparecer en los trabajos de investigación sobre enzimas, un gran
número de ecuaciones que resolvían este problema. Dentro de ellas cabe destacar las
siguientes:

 Ecuación de Lineweaver-Burk o ploteo de los inversos:

1 = KM 1 + 1
vo Vmax [S] Vmax

 Ecuación de Eadie-Hoffstee:

vo = -KM vo + Vmax
[S]

 Ecuación de Hanes:

[S] = 1 [S] + KM
vo Vmax Vmax
 Ecuación de Eisenthal y Cornish-Bowden:

Vmax = KM + 1
vo [S]

A pesar que estos métodos son difundidos por los especialistas en cinética enzimática, el
método de Lineweaver-Burk es el más ampliamente empleado; lo importante es obtener
buenos resultados experimentales que cubran un amplio rango de concentraciones de
sustrato, seleccionadas de modo que se encuentren homogéneamente distribuidas en el
gráfico.

Selección de las concentraciones de sustrato:

Se piensa siempre que los ensayos enzimáticos se deben ejecutar a altas concentraciones de
sustrato (mayores que la KM), porque se obtienen velocidades constantes por mas tiempo de
incubación; pero también hay desventajas como la que, sólo una pequeña cantidad del total
del sustrato, se está utilizando en ese instante; esto es derrochador y costoso cuando el
sustrato usado es caro. Asimismo, el sustrato a altas concentraciones puede actuar como
inhibidor de la enzima.

Por esta razón es recomendable hacer las determinaciones a concentraciones de sustrato en

las inmediaciones de la KM; por esta razón, se emplea como criterio de selección la
siguiente fórmula: vo2 / [S]; y se toman en cuenta los valores más altos de esta relación.

PARTE EXPERIMENTAL
En la presente práctica se exponen resultados experimentales de una enzima pero en
condiciones ideales:

[S] (mM) vo (μmol/min) vo2 / [S]

1000 10
100 9,9
10 9,1
5 8,3
2 6,7
1 5,0
0,5 3,3
0,2 1,67
0,1 0,91
0,01 0,099
0,001 0,010
Seleccione de estos datos solo 7, luego de calcular para cada uno el valor de vo2/[S]
Los siete datos seleccionados colóquelos en la siguiente tabla y haga los cálculos que la
misma le exige:
 [S] (mM) vo 1/[S] 1 vo [S]
(μmol/min ) vo [S] vo

Una vez completada la tabla, en hojas de papel milimetrado, haga las gráficas de Michaelis-
Menten, Lineweaver-Burk, Eadie-Hoffstee, Hanes y Eishental-Cornish y adjúntelas al
informe.

Calcule los valores de KM y Vmax en cada una de ellas, tanto usando las respectivas
fórmulas, como gráficamente.
INTERROGANTES

1. ¿Cuál de los métodos permite graficar más fácilmente los resultados? ¿Por qué?

2. ¿Con cuál de los métodos se calcula más fácilmente Vmax y KM? Explique

3. ¿Cuál de los métodos manifiesta mejor los errores experimentales? ¿Por qué?