Nureña Diaz, Gandy Jhomen PDF

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
N
IÓ
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y
AC
PARASITOLOGÍA
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
“Efecto de diferentes concentraciones de extractos etanólicos de Acnistus

IN
DE
arborescens (Fam. Solanaceae) sobre la viabilidad in vitro de promastigotes de

AS
Leishmania peruviana”
EM
ST
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE:

SI
DE
BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
N
IO
AUTORA: Br. Gandy Jhomeny Nureña Díaz

CC
RE
ASESORA: Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez

DI
TRUJILLO – PERÚ
2015
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
N
IÓ
AC
Dr. Orlando Gonzales Nieves
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RECTOR
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RM
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Dr. Rubén Vera Véliz

IN
VICERRECTOR ACADÉMICO
DE
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DE
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Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas

CC
VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN
RE
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ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
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AC
Dr. José Mostacero León
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DECANO
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Dr. William Zelada Estraver

DE
SECRETARIO
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CC
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Dra. Bertha Soriano Bernilla

DI
DIRECTORA DE LA E.A.P. DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
iii
MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR
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__________________________________
IC
Dra. Manuela Luján Velásquez.
UN
PRESIDENTE
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__________________________________
DE
Dr Judith Enit Roldán Rodríguez.

SECRETARIA
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CC
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__________________________________
DI
Ms. Jaime Agreda Gaitán.

VOCAL
iv
DEL ASESOR
La que suscribe, asesora de la tesis titulada: “Efecto de diferentes
concentraciones de extractos etanólicos de Acnistus arborescens (Fam. Solanaceae)
N
sobre la viabilidad in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana”
IÓ
AC
CERTIFICA:
IC
UN
Que la presente investigación ha sido desarrollada de conformidad con su
M
CO
correspondiente proyecto y teniendo en cuenta las orientaciones pertinentes a la tesista.
Y
A
En cuanto al informe, éste ha sido redactado bajo mi asesoramiento de acuerdo
IC
ÁT
al formato establecido en la Facultad de Ciencias Biológicas y ha acogido las
RM
observaciones y sugerencias alcanzadas.

FO
Por ello, autorizo a la Bachiller Gandy Jhomeny Nureña Díaz, continuar con
IN
DE
los trámites correspondientes según sus fines.

AS
EM
ST
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DE
N
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__________________________________
CC
Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez

RE
ASESORA
DI
APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que
la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentos teóricos, siendo
N
aprobada por UNANIMIDAD.
IÓ
AC
IC
UN
M
__________________________________
CO
Dra. Manuela Luján Velásquez.
Y
PRESIDENTE
A
IC
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RM
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IN
DE
__________________________________
AS
Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez.

EM
SECRETARIO
ST
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DE
N
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CC
RE
DI
__________________________________
Ms.C. Jaime Agreda Gaitán.
VOCAL
vi
PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
N
IÓ
En cumplimiento con las disposiciones vigentes establecidas en el Reglamento
AC
de Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a vuestra
IC
consideración y elevado criterio la presente tesis titulada: “Efecto de diferentes
UN
M
concentraciones de extractos etanólicos de Acnistus arborescens (Fam. Solanaceae)
CO
sobre la viabilidad in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana”, con el propósito
Y
de obtener el Título Profesional de Biólogo-Microbiólogo.
A
IC
ÁT
Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su criterio
RM
establecido, y a que el presente sea merecedor de vuestra aprobación.

FO
IN
DE
Trujillo, Noviembre del 2015.

AS
EM
ST
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DE
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CC
____________________________
RE
Br. Gandy Jhomeny Nureña Díaz

DI
vii
DEDICATORIA
A Dios, por estar siempre conmigo en cada paso que doy,

por fortalecer mi corazón y por haber puesto en mi camino a
N
aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante
IÓ
AC
mi vida…
IC
UN
A mis queridos padres Segundo y Betty, por ser el
M
CO
pilar fundamental en todo lo que soy, su incondicional
Y
apoyo, sus concejos, sus valores, la motivación constante,
A
pero más que nada por su amor… IC
ÁT
RM
FO
A Marcopolo Solano mi esposo, por su amor, por creer en

IN
mí, por su apoyo en todo momento dándome ejemplos dignos

DE
de superación y entrega, porque en gran parte gracias a él,

AS
hoy puedo ver alcanzada mí meta. TE AMO…

EM
ST
SI
A mis hermanos Jhonny, Alexy y Shirley por

DE
los buenos momentos, sus locuras, su compañía y por

N
apoyarme siempre, los quiero mucho…

IO
CC
RE
A mi papá Jacinto y mi abuela Rosa por quererme y

DI
consentirme siempre. A mis abuelos Lorenzo y Obdulia

que desde el cielo me cuidan…
viii
AGRADECIMIENTOS
 A la Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez, docente asociada del Departamento de

Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo por su
asesoramiento, dedicación y orientación durante la ejecución y redacción de
N
IÓ
esta tesis.
AC
IC
 Al Dr. Hermes Escalante, Blgo-Mblgo. Miguel Iglesias del Centro de Análisis e
UN
Investigación ESCALABS e.i.r.l., por el apoyo en la realización de lecturas de
M
microplacas.
CO
 Al Mg. Q.F. Roger Antonio Rengifo Penadillos, docente de la Facultad de
Y
A
Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, por su apoyo y
enseñanza en la obtención de los extractos.
IC
ÁT
RM
 Al Mg. C. Eduardo Muñoz Ganoza docente de la Escuela Académico

FO
Profesional d Microbiología y Parasitología, por su apoyo en la ejecución de

IN
ésta tesis.
DE
 Al Blgo-Mblgo. Richar Joel Morales Rodríguez, a quien siempre agradeceré por

AS
su apoyo incondicional en la realización de ésta tesis, por su amistad y por ser

EM
un gran amigo.
ST
 A mis amigos los panchos: María, Sandra, Richar y Carlos por los años
SI
DE
compartidos en nuestra vida universitaria y por la amistad que perdura toda la

vida.
N
IO

CC
A mis amigos del laboratorio de Artropodología Parasitaria: Miriam, Lourdes

RE
G., Sheila, Lourdes C, Juanito, Jhoao, Roger y a todos los miembros de esta
gran familia gracias por brindarme su apoyo durante la ejecución de esta tesis y
DI
sobre todo por su amistad.
ix
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como finalidad determinar el efecto de los extractos etanólico de
hojas de Acnistus arborescens (Fam. Solanaceae) a las concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y
N
15.0 µg/mL. sobre la viabilidad in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana. Se
IÓ
AC
obtuvieron extractos etanólicos a través de los métodos de extracción por Percolación
IC
(EEP) y Soxhlet (EES); para la ejecución del bioensayo se establecieron cuatro grupos
UN
experimentales (I, II, III y IV) y dos grupos control (V y VI) para cada extracto, por
M
CO
triplicado; la viabilidad de los promastigotes se evaluó mediante el método colorimétrico
Y
MTT (difenil tetrazolio bromuro) y se estableció las densidades ópticas en un Lector de
A
IC
Elisa (492nm), asimismo, se determinó la Concentración Inhibitoria Media (IC50). Se
ÁT
RM
encontró mayor inhibición del crecimiento de promastigotes expuestos a la concentración

FO
de 15 µg/mL tanto en el EEP (71.1%) como en el EES (76.4%); no encontrándose

IN
diferencias estadísticas significativas (p>0.05) entre ambos; con una IC50 de 9.661 µg/mL
DE
en el EES y una IC50 de 10.267 µg/mL en el EEP. Se concluye que los extractos EEP y
AS
EES de Acnistus arborescens disminuyen la viabilidad in vitro de promastigotes de

EM
Leishmania peruviana.
ST
SI
Palabras claves: Acnistus arborescens, Leishmania peruviana y viabilidad

DE
N
IO
CC
RE
DI
ABSTRACT
This paper aims to determine the effect of ethanol extracts of leaves Acnistus arborescens
(Fam. Solanaceae) at concentrations of 7.5, 10.0, 12.5 and 15.0 µg/mL. on in vitro viability
N
of promastigotes of Leishmania peruviana. Ethanolic extracts were obtained by percolation
IÓ
AC
(EEP) and Soxhlet (EES) extraction methods; four experimental groups bioassay (I, II, III,
IC
and IV) and two control groups (V and VI) were established for each extract, for triplicate;
UN
the viability of the promastigotes was assessed by MTT colorimetric method (diphenyl
M
CO
tetrazolium bromide) and optical densities was established in an ELISA reader (492 nm),
Y
also was determined Media Inhibitory Concentration (IC50). Greater inhibition of growth
A
IC
of promastigotes exposed to concentration of 15 µg/mL in both EEP (71.1%) as EES
ÁT
(76.4%) was found; finding no statistically significant differences (p> 0.05); with an IC50
RM
of 9.661 µg/mL in EES and 10.267 µg/mL in EEP. It is concluded that the EEP and ESS
FO
IN
Acnistus arborescens extracts decrease in vitro viability of promastigotes Leishmania

DE
peruviana.
AS
EM
Key words: Acnistus arborescens, Leishmania peruviana and viability

ST
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DE
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IO
CC
RE
DI
xi
ÍNDICE
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………………..…….………....ii
Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas ………………………...…… …...…iii
Miembros del Jurado Dictaminador………………………………………………..…..…iv
N
IÓ
Del Asesor……...……………………………………...……………………………..…...v
AC
Aprobación ...…………………………………………………………………………..…vi
IC
UN
Presentación………… ……………………………………………………………...........vii
M
Dedicatoria……………………………………………….………………………..….…..viii
CO
Agradecimiento.…………………………………………...…………………...………….ix
Y
A
Resumen……..…………………………………………………………...……..….……...x
IC
ÁT
Abstract………….………………………………………..……………………..………..xi
RM
Índice…………………………………………………………………….…………….….xii
FO
Introducción……………………………………………………………………….…….. 17
IN
DE
Materiales y Métodos………...………………………………………………….…..……24
AS
1. Material biológico…………………………………………………………..…….24
EM
2. Procedimiento………………………………………………………………..……24
ST
2.1. Obtención de los extractos etanólico de Acnistus arborescens…………………..24

SI
DE
2.1.1. Colecta y secado de la planta………………………………….…...24

N
IO
2.1.2. Obtención de los extractos etanólicos………………..…….....……25

CC
2.1.2.1. Extracción por el método de Percolación (EEP)……….…..25

RE
2.1.2.2. Extracción por el método de Soxhlet (EES)……..…..……..26

DI
2.2. Evaluación del efecto de los extractos etanólicos de A. arborescens sobre
la viabilidad en promastigotes de L. peruviana…………………...……..…..27

xii
2.2.1. Siembra y determinación de la curva de crecimiento…………......27
2.2.2. Ejecución del bioensayo con el extracto obtenido por el
método de percolación (EEP)……………………………...….....27
2.2.3. Ejecución del bioensayo con el extracto etanólico por el
N
IÓ
método de soxhlet (EES)………………………………………...28
AC
2.2.4. Determinación de la viabilidad mediante el método (MTT)….…28
IC
UN
2.2.5. Determinación del porcentaje de inhibición del crecimiento…...29
M
2.2.6. Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (IC50).....29
CO
2.3. Análisis de datos…………………………………………………………..…29
Y
A
2.4. Consideraciones éticas…………...........................………………….............29
IC
ÁT
Resultados……………………………………………………………….……………......30
RM
Discusión……………………………………………………………….…………….…...35
FO
Conclusión………………………………………………………..…………………..…...38
IN
DE
Referencias Bibliográficas………………………………………..……………………....39
Anexos…..……………………………………………………….……………………......46
AS
EM
Anexo 1. Ejemplar de Acnistus arborescens en el caserío Chual, del Distrito

ST
Simbal, (Trujillo - La Libertad)………………………………………….…….47

SI
DE
Anexo 2. Zona de recolección de Acnistus arborescens en el caserío Chual, del

N
Distrito Simbal, (Trujillo-La Libertad)………………………………………...48

IO
Anexo 3. Acnistus arborescens identificada taxonómicamente en el Herbarium

CC
Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo…………………………….49

RE
DI
Anexo 4a. Esquema de la obtención del extracto etanólico de Acnistus arborescens
mediante el método de percolación con tres extracciones……………………50
xiii
Anexo 4b. Obtención del extracto etanólico de Acnistus arborescens mediante el
método de percolación con tres extracciones…………………………………51
Anexo 5. Obtención del extracto etanólico de Acnistus arborescens mediante el
método de Soxhlet………………………………………………………...........52
N
IÓ
Anexo 6. Preparación del medio de cultivo bifásico BHI modificado…………………....53
AC
Anexo 7. Cultivo, coloración y recuento de promastigotes de Leishmania peruviana…...54
IC
UN
Anexo 8. Curva de crecimiento de promastigotes de Leishmania peruviana en medio
M
de cultivo BHI bifásico modificado……………..………………………….….55
CO
Anexo 9. Esquema de la ejecución del bioensayo in vitro de de promastigotes de
Y
A
Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.0, 10.0. 12.5 y
IC
ÁT
15.0 µg/mL de los extractos etanólicos de Acnistus arborescens……….............56
RM
Anexo 10. Preparación de los reactivos para el ensayo…….………………….…….....…57

FO
Anexo 11. Lectura de las muestras en un lector de ELISA a 492nm………………....….58

IN
DE
Anexo 12. Determinación de la viabilidad in vitro de de promastigotes de

AS
Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.0, 10.0. 12.5 y

EM
15.0 µg/mL del extracto etanólico (Método: Percolación) de Acnistus

ST
arborescens…………………………………………………………...………59
SI
Anexo 13. Absorbancias obtenidas del ensayo in vitro de promastigotes de

DE
Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y

N
IO
15.0 µg/mL del extracto etanólico (Método: Percolación) de Acnistus

CC
arborescens(Lectura a 492 nm)………….……………………………………60

RE
DI
Anexo 14. Determinación de la viabilidad in vitro de de promastigotes de Leishmania
peruviana con las concentraciones de 7.0, 10.0. 12.5 y 15.0 µg/mL
del extracto etanólico (Metodo: Soxhlet) de Acnistus arborescens……….….61
xiv
Anexo 15. Absorbancias obtenidas del ensayo in vitro de promastigotes de
Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y
15.0 µg/mL del extracto etanólico (Método: Soxhlet) de Acnistus
arborescens (Lectura a 492 nm)……………………………………………....62
N
IÓ
Anexo 16. Análisis de varianza (ANOVA) con los datos obtenidos en los ensayos
AC
in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana con las diferentes
IC
UN
concentraciones de los extractos etanólicos: extracción por percolación
M
(Cuadro A) y extracción por Soxhlet (Cuadro B) de Acnistus
CO
arborescens……………………………………………………………………63
Y
A
Anexo 17. Diferencia de medias (Game - Howell) con los datos obtenidos en los
IC
ÁT
ensayos in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana a las
RM
concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del extracto por

FO
percolación de Acnistus arborescens…………………………………………64

IN
DE
Anexo 18. Diferencia de medias (Game - Howell) con los datos obtenidos en los
AS
ensayos in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana a las

EM
concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del extracto por

ST
Soxhlet de Acnistus arborescens……………………………………………..65

SI
Anexo 19. Comparación de medias (Turkey) con los datos obtenidos en los ensayos
DE
in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana con las diferentes

N
IO

CC
(Cuadro A) y extracción por Soxhlet (Cuadro B) de Acnistus

RE
arborescens. …………………………………………………………….……66
DI
Anexo 20. Análisis de regresión lineal de la inhibición del crecimiento de
promastigotes de Leishmania peruviana vs. Logaritmo de las
xv
concentraciones de los extractos etanólicos (Método de Extracción:
Percolación y Soxhlet) de hojas de Acnistus arborescens……………………..67
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
xvi
INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis son un conjunto de manifestaciones clínicas producidas por
diferentes parásitos tripasomatídeos pertenecientes al género Leishmania, los cuales son
N
transmitidos por las hembras infectadas de un grupo de flebotominos del género
IÓ
AC
Phlebotomus (en el Viejo Mundo) y Lutzomyia (en el Nuevo Mundo). Esta
IC
antropozoonósis es endémica en zonas rurales y periurbanas en cerca de 100 países de
UN
zonas subtropicales y tropicales de los cinco continentes; aproximadamente 350
M
CO
millones de personas se encuentran en riesgo, 12 millones sufren por este protozoario
Y
difásico y se estima alrededor de dos millones de nuevos casos por año1-3.
A
IC
ÁT
Los especímenes del género Leishmania, descrita por Leishman y Donovan en
RM
1903, son protozoarios flagelados pertenecientes a la clase Zoomastigophora, orden

FO
Kinetoplastida y familia Trypanosomatidae; el género incluye al menos 29 especies de

IN
Leishmania spp; estos organismos se encuentran clasificados en dos subgéneros, de

DE
acuerdo al sitio de desarrollo del parásito en el insecto transmisor: Leishmania

AS
(Leishmania) y Leishmania (Viannia)2, 4.

EM
ST
En América, se han reportado los dos grupos taxonómicos de Leishmania; dentro

SI
del Subgénero Leishmania Leishmania se han incluido especímenes del complejo

DE
mexicana (L. mexicana, L amazonensis, L. garnhami, L. aristidesi y L. pifanoi), y el

N
IO
complejo donovani (L. chagasi), mientras que en el Subgénero Leishmania Viannia

CC
individuos del complejo braziliensis, el cual incluye a especie como L. brazilensis,

RE
L. peruviana, L. panamensis y L. guyanensis5. En el Perú, se han identificado cinco

DI
especies circulando: L. (L.) amazonensis, L. (V.) guyanensis, y L. (V.) braziliensis que
son agentes etiológicos de la forma cutánea y mucocutánea (espundia) en la región
17
Amazónica; L. (V.) peruviana causa la leishmaniasis cutánea de los Andes (uta); y, en
las provincias situadas al este de los Andes el patógeno es L. (V.) lainsoni6, 7.
La morfología del parásito de Leishmania se concentra básicamente en dos
variantes que cubren todo su ciclo vital: el promastigote –extracelular, fusiforme,
N
IÓ
flagelado y localizado en el tracto digestivo del hospedero invertebrado- y el amastigote
AC
– aflagelar y situado en el interior de los macrófagos de los vertebrados.
IC
UN
El promastigote tiene un núcleo oval central y un kinetoplasto terminal o
M
CO
subterminal en la parte posterior del parásito, de la cual se origina el flagelo y su tamaño
Y
varia de 10-30 μm de largo y 1.5-3 μm de ancho. Esta forma inicia su evolución desde
A
IC
las microvellosidades del tubo digestivo del flebótomo (promastigote nectomona) donde
ÁT
RM
se ancla por el flagelo; cuando migra a las porciones anteriores del estómago, se
FO
redondea y acorta su flagelo rico en lipofosfoglicanos (LPG) facilitando su adhesión a

IN
las lecitinas del tubo digestivo (promastigote haptomona, no infectivo); posteriormente,

DE
pierde adherencia por cambios en LPG, el flagelo se hace muy largo con respecto al
AS
cuerpo fino (promastigote metacíclico, recupera infectividad), luego migra al

EM
hipofaringe, y está listo para ser inoculado8.

ST
SI
Los amastigotes son parásitos inmóviles y se localizan en el interior de las células

DE
del sistema fagocítico mononuclear incluyendo macrófagos, monocitos y células de

N
IO
Langerhans del hospedero vertebrado; su forma es redondeada u ovalada (cuerpos de

CC
Leishman-Donovan) con dimensiones que oscilan entre 3-5 μm de longitud y 1.5-2.5

RE
μm de ancho; posee un núcleo voluminoso generalmente excéntrico y un blefaroplasto

DI
de donde se forma el flagelo que está próximo a una mitocondria modificada llamada
kinetoplasto; el citoplasma es granular y vacuolado8.
18
Los promastigotas inoculados mediante picadura del vector son captados por las
células del sistema fagocítico mononuclear mediante la interacción de distintas
moléculas de superficie (gp63 y LPG) del parásito que actúan como ligando con el
macrófago; como resultado se forma una vacuola parasitófora, en cuyo interior se
N
IÓ
transforma en amastigote que se multiplican activamente mediante sucesivas divisiones
AC
por fisión binaria; la proliferación no controlada propicia el estallido del macrófago
IC
quedando libres los parásitos para invadir otras células, o ser refagocitados,
UN
M
propagándose de esta forma a través de la circulación hacia los tejidos8.
CO
El ciclo epidemiológico de la leishmaniasis se ve complicado por la abundancia
Y
A
de reservorios que pueden presentar; la mayoría de las especies son animales que
IC
ÁT
garantizan la existencia del parasito en una determinada zona y actúan como fuente de
RM
transmisión para los humanos; el principal reservorio implicado en la transmisión es el

FO
perro, aunque también participan roedores, zorros, monos, marsupiales, asnos y otros
IN
mamíferos9. Sin embargo, el incremento de casos de leishmaniasis en el mundo está

DE
AS
principalmente atribuido al incremento de diferentes factores de riesgo que son

EM
claramente hechas por el hombre incluido la migración masiva, deforestación,

ST
urbanización, inmunosupresión, malnutrición, tratamientos fallidos, edad y factores

SI
genéticos10, 11.
DE
N
Las manifestaciones clínicas de las leishmaniasis son extraordinariamente

IO
CC
variadas y dependen de la interacción de factores del parásito como son el tropismo de

RE
la especie y su capacidad infectiva, patogenicidad y virulencia, de factores dependientes

DI
del vector como el número de picaduras o la composición de su saliva y de la situación
inmunitaria innata y adquirida, y susceptibilidad genética del huésped; son una
enfermedad seria y algunas veces fatal, las cuales se encuentran agrupadas en cuatro
categorías clínicas: leishmaniasis cutánea, mucosa, cutánea difusa y visceral12-15.

19
Las principales manifestaciones clínicas de la leishmania cutánea son pápulas
eritematosas en áreas expuestas del cuerpo donde vectores infectados se han
alimentado; el período de incubación puede ser corto como de 1-2 semanas o tan
prolongado como 1-2 meses; la lesión temprana puede presentar prurito pero no dolor,
N
IÓ
la ulcera puede permanecer relativamente seca con una costra seca o puede exudar
AC
material seropurulento; pueden presentarse lesiones múltiples dependiendo del grado de
IC
exposición a insectos infectados, el tiempo y por ende múltiples picaduras;
UN
M
ocasionalmente las ulceras curan de forma espontánea pero pueden persistir por un año
CO
o más sin tratamiento16.
Y
A
L. peruviana causa la leishmaniasis cutánea (LC) humana, conocida localmente
IC
ÁT
como “uta”, y se ha aislado de los perros y pequeños animales peridomésticos tales
RM
como ratones y comadrejas, lo que sugiere que es una zoonosis; la especie es endémica
FO
en el Perú, se encuentra en entre los 800 y 3000 m.s.n.m., en las laderas occidentales de
IN
DE
los Andes, en los valles interandinos bajos (500-1500 m.s.n.m.) y en los bosques
AS
montañosos altos (1500-3500 m.s.n.m.); tiene como límite norte y sur a los
EM
departamentos de Piura y Ayacucho, respectivamente6, 7.

ST
SI
Existen diferentes fármacos disponibles para el tratamiento de las

DE
leishmaniasis, entre los cuales se puede mencionar la acción de los antimoniales

N
pentavalentes como estibogluconato y antimoniato de meglumina que han sido

IO
CC
pilares en el tratamiento, sin embargo su uso puede inducir efectos adversos y

RE
resistencia asimismo su elevado costo dificultan el proceso; la anfotericina B

DI
liposomal es más favorable en las regiones donde la resistencia es común; sin
embargo, aún existen mucho fármacos como la miltefosina, paromicina y
sitamaquine que se encuentran en fase de investigación17, 18.
20
En las últimas décadas, pocas alternativas o nuevas formulaciones de
fármacos están disponibles, pero ninguna es ideal para el tratamiento debido a la alta
toxicidad, problemas de resistencia, los precios, larga duración del tratamiento o el
modo inadecuado de administración no adaptado al campo; además, muchos de los
N
IÓ
pacientes no son capaces de completar todo el tratamiento, lo que aumenta el riesgo
AC
de desarrollar resistencia a los medicamentos19.
IC
UN
Los productos generados por plantas son una fuente natural importante de
M
CO
compuestos biológicamente activos que pueden ser usados contra diferentes
microorganismos infecciosos, asimismo estos selectos agentes podrían servir para el
Y
A
tratamiento de importantes enfermedades tropicales causadas por protozoos y otros
IC
ÁT
parásitos20, 21, particularmente contra la leishmaniasis que ha sido considerada como
RM
una “enfermedad olvidada”. Una amplia gama de estudios demuestran las

FO
propiedades leishmanicidas: Guimarães et al22 demostraron que el extracto de

IN
DE
Physalis angulata (Solanaceae) inhiben el crecimiento de promastigites de L.
amazonensis con valores de IC50 >10µg/mL. Valadeau et al23 reportan que algunas
AS
EM
plantas usadas contra afecciones en la piel por pobladores de Yanesha (Perú) como:
ST
Carica papaya (Caricaceae), Piper dennisii (Piperaceae), Hedychium coronarium

SI
(Zingiberaceae), Cestrum racemosum (Solanaceae), Renealmia alpinia

DE
(Zingiberaceae), Lantana sp. (Verbenaceae), Hyptis lacustris (Lamiaceae) y Calea

N
IO
montana (Asteraceae), presentaban una interesante actividad leishmanicida (IC50

CC
<10µg/mL). Bravo et al24, aislaron diversos withanolidos del extractos etanólicos de

RE
DI
la raíz y hoja de D. brachyacantha, obteniendo withanolidos con propiedades
tripanocida, leishmanicida y bactericida
Dentro de esta gran variedad de plantas leishmanicidas, los miembros de la
Familia Solanaceae son muy importantes. En el Perú se registran 44 géneros y 598

21
especies, que incluyen especies creciendo en todo los tipos de hábitats y variando
desde árboles hasta pequeñas hiervas; las solanáceas presentan predominantemente
compuestos como withanolidos que se caracterizan por ser: antimicrobiana,
antiflamatoria, inmunomoduladora, antitumoral, tripanocida y leishmanicida25, 26

.
N
IÓ
Acnistus arborescens es una especie perteneciente a la familia de las Solanaceas, es
AC
un arbusto de aproximadamente cuatro metros de alto, con flores blancas numerosas
IC
por nudo y frutos globosos anaranjados al madurar de aproximadamente 7 mm de
UN
M
diámetro27. Se distribuye desde México hasta Brasil; en el Perú se encuentra
CO
distribuido principalmente en los valles interandinos entre los 720-1920 m.s.n.m., y
Y
habita en los bordes de carreteras y caminos rocosos en los departamentos de
A
Cajamarca y La Libertad 28, 29.
IC
ÁT
RM
Se ha registrado estudios donde A. arborescens tiene propiedades medicinales

FO
y se ha demostrado que su principal constituyente son los withanolido30. Ruiz et

IN
al31, evaluaron la actividad leishmanicida y tripanocida de algunas plantas

DE
AS
reportadas como medicinales en Colombia, obteniendo que Piper cumanense (hojas)

EM
y A. arborescens (parte aérea) presentan valores de CI50 menores de 12.5 µg/ ml

ST
cercanos a los obtenidos por el control (Anfotericina 10 µg/ml), tanto para

SI
promastigotes de Leishmania como para epimastigotes de T. cruzi. Gómez32

DE
demostró que las concentraciones mayores a 10 y 12,5 µg/mL de extracto etanólico

N
IO
y acuoso de A. arborescens disminuye en más del 50% la viabilidad in vitro de

CC
epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes de Trypanosoma cruzi. Cardona et al33

RE
DI
demostraron que el extracto de diferentes especies de Larnax, Solanum y Acnistus
presentaron una promisoria actividad leishmanicida en amastigotas de Leishmania
panamensis.
22
El desarrollo de resistencia al medicamento y la búsqueda de nuevas
alternativas de tratamiento, hacen muy interesantes a los productos generados por
las plantas, especialmente de aquellas con propiedades medicinales; las cuales han
sido utilizadas ampliamente por pobladores indígenas para tratar los casos de
N
leishmaniasis que se presentan en su comunidad34, 35
IÓ
y cuyo potencial
AC
antiprotozoico está siendo respaldado por informes científicos36, 37. Considerando
IC
que la leishmaniasis es un problema de salud pública y pueden conllevar a generar
UN
M
resistencia cuando no se completa el tratamiento u otra manifestación adversa en el
CO
paciente, surge la necesidad de buscar tratamientos alternativos en los productos
Y
generados por las plantas, debido a su mayor accesibilidad y baja toxicidad, en
A
IC
comparación a los fármacos convencionales. Acnistus arborescens es un arbusto
ÁT
RM
que se distribuye en zonas alto andinas y cuyas propiedades leishmanicidas y

FO
tripanocidas se han demostrado en Perú y Colombia31, 32.

IN
La presente investigación tiene como objetivo determinar el efecto de

DE
diferentes concentraciones de extractos etanólicos obtenidos por método de

AS
EM
percolación y soxhlet de hojas de Acnistus arborescens (Fam. Solanaceae) sobre la

ST
viabilidad in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana.

SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
23
MATERIAL Y MÉTODOS
1. MATERIAL BIOLÓGICO
 Las plantas de Acnistus arborescens (Fam. Solanaceae) “Chira” fueron
N
colectadas en los campos de cultivo del Caserío Chual del Distrito Simbal,
IÓ
AC
Provincia Trujillo, Departamento La Libertad, e identificada taxonómicamente
IC
por el personal del Herbarium Truxillensis de la Universidad Nacional de
UN
Trujillo (Anexo 1).
M
CO
 La cepa de Leishmania peruviana fue proporcionada por el Laboratorio de
Y
Artropodología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la
A
Universidad Nacional de Trujillo.
IC
ÁT
RM
2. PROCEDIMIENTO
FO
2.1. Obtención de los extractos etanólicos de Acnistus arborescens.

IN
DE
2.1.1. Colecta y secado de la planta

AS
Los ejemplares de la planta A. arborescens “Chira” (Anexo 1) se colectaron en

EM
los alrededores de las zonas de cultivo del Caserío Chual del Distrito Simbal,
ST
(Trujillo-La Libertad), a una latitud de 7º 57’ 00.4” N, longitud 78º 45’ 58.2 O
SI
DE
(Anexo 2), y fueron trasladados al laboratorio de Artropodología Parasitaria del

N
Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de

IO
CC
Trujillo; asimismo, un ejemplar fue llevado al Herbarium Truxillense para la

RE
determinación taxonómica y almacenamiento (Anexo 3).

DI
De las plantas colectadas se utilizaron las hojas, las cuales fueron limpiadas con
algodón húmedo, secadas a temperatura ambiente, trituradas y finalmente
pesadas a fin de obtener la cantidad de gramos requeridos para la obtención de
cada extracto32.
24
2.1.2. Obtención de los extractos etanólicos.
2.1.2.1. Extracción por el método de Percolación (EEP)
Se empleó el método de percolación con tres extracciones,
utilizando como disolvente alcohol al 70% (Anexo 4a). Las
N
IÓ
hojas trituradas fueron separadas en tres porciones de 50g,
AC
30g y 20g cada una. La primera porción (50g) fue macerada
IC
UN
en un matraz con etanol al 70% durante cuatro horas; luego
M
la masa vegetal fue vertida en el percolador I, cuyo orificio
CO
de salida fue cubierto con algodón para evitar el pasaje de
Y
A
residuos vegetales durante el proceso, asimismo sobre la
IC
ÁT
masa vegetal se agregó arenilla estéril y sobre éstas se colocó
RM
papel de filtro, para evitar el pasaje rápido del disolvente

FO
dentro de la planta, posteriormente se le agregó etanol al 70%

IN
hasta cubrir totalmente la masa vegetal hasta 3 cm

DE
aproximadamente por encima de ésta; se dejó macerar

AS
EM
durante 24 horas a temperatura ambiente, después se

ST
recolectó gota a gota 170 mL del extracto (por cada gota de

SI
extracto recogido se repuso la misma cantidad con alcohol al

DE
70%), los primeros 20 mL fueron recolectados en un

N
IO
recipiente de vidrio de color ámbar y los 150 mL restantes

CC
fueron añadidos al percolador II para humedecer los

RE
siguientes 30g de planta molida, dejándolo macerar por 24

DI
horas; luego del percolador II se recolectó 130 mL del
extracto del cual los primeros 30 mL fueron añadidos al
recipiente donde se agregó los 20 mL colectados del
25
percolador I; y los 100 mL restantes se agregó al percolador
III para humedecer los últimos 20g de planta dejándola
macerar durante 24 horas; para obtener finalmente 50mL del
extracto, el cual se agregó al recipiente donde se recolectó los
N
IÓ
50 mL (producto del percolador I y II), de esta manera se
AC
obtuvo 100mL; se evaporó el solvente por medio de un rota
IC
evaporador obteniéndose una concentración madre, de la cual
UN
M
se prepararon concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0
CO
µg/mL, utilizando como disolvente dimetil sulfóxido
Y
(DMSO) al 1%.
A
IC
ÁT
2.1.2.2. Extracción por el método de Soxhlet (EES)
RM
El extracto etanólico obtenido mediante el equipo soxhlet se

FO
IN
utilizó como disolvente el etanol 70% (Anexo 5), en una

DE
relación masa/volumen de 1:1 por un tiempo de 5 horas 36

AS
minutos a una temperatura de 78ºC. Se utilizó 100g hojas

EM
trituradas de A. arborescens, ésta se colocó dentro de un

ST
cartucho de papel de filtro junto con 100g de arenilla ésteril,

SI
DE
posteriormente fueron colocados en la cámara al interior del

N
extractor se ensamblo las partes del equipo: balón, extractor

IO
Soxhlet, adaptador y el refrigerante41. De esta manera se

CC
RE
obtuvo 100 mL; se evaporó el solvente por medio de rota

DI
evaporador obteniéndose una concentración madre, de la cual
se prepararon concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0
µg/mL, utilizando como disolvente dimetil sulfóxido
(DMSO) al 1%38.
26
2.2. Evaluación del efecto de los extractos etanólicos de A. arborescens sobre
la viabilidad en promatigotes de L. peruviana
2.2.1. Siembra y determinación de la curva de crecimiento
N
Los amastigotes obtenidos de las lesiones de hámsters infectados, se
IÓ
AC
sembraron en medio bifásico Brain Heart Infusion (BHI) modificado
IC
suplementado con 10% de sangre de conejo desfibrinada y como
UN
antimicrobiano 1 mL de gentamicina (Anexos 6.1 - 6.2), se mantuvo a
M
CO
una temperatura de 22 ± 1°C a fin de producir su transformación a
Y
promastigotas. La fase líquida del medio estaba compuesta por Brain
A
IC
Heart Infusion (BHI) modificado (Anexo 6.3). Así mismo, a partir de
ÁT
un cultivo primario se estableció la curva de crecimiento (Anexo 8),
RM
para lo cual se realizó la resiembra de los parásitos (1x106

FO
IN
promastigotes/mL) en medio bifásico y se procedió a realizar conteos

DE
diarios en cámara de Neubauer42, 43.

AS
2.2.2. Ejecución del bioensayo con el extracto etanólico obtenido por el

EM
método de percolación (EEP)

ST
SI
En una microplaca de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano, se

DE
estableció cuatro grupos experimentales (I, II, III, IV,) y dos grupos
N
IO
control (V y VI), cada uno por triplicado. A todos los grupos se le

CC
agregó 20 µL de promastigotes de Leishmania peruviana en fase de

RE
crecimiento logarítmico (5to día) a una concentración de 1 x 106

DI
promastigotes/mL y 80 µL de medio BHI con gentamicina. Se
prepararon las concentraciones experimentales de 7.5, 10.0, 12.5, 15.0
µg/mL del extracto etanólico por percolación “EEP” de las hojas de A.
27
arborescens, utilizando como disolvente DMSO; de cada
concentración se aplicó 3 µL a los grupos I, II, III y IV
respectivamente, al grupo V 3 µL de DMSO y al grupo VI 3 µL de
BHI, la placa fue incubada a 22° ± 1ºC por 72 horas32.
N
IÓ
Para determinar el porcentaje de inhibición es necesario contar con los
AC
valores de las soluciones de referencia, para ello se establecieron seis
IC
grupos, a los cuales se les agregó 100 µL de BHI con gentamicina,
UN
M
luego se dispenso a los cuatro primeros 3 µL de las concentraciones
CO
7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del EEP y a los pocillos restantes se les
Y
agregó 3 µL de DMSO y BHI, respectivamente32 (Anexo 9).
A
IC
2.2.3. Ejecución del bioensayo con el extracto etanólico obtenido por el
ÁT
RM
método de soxhlet (EES)

FO
Para la aplicación del bioensayo con extracto etanólico por soxhlet

IN
“EES” se procedió de acuerdo al acápite 2.2.2.

DE
AS
2.2.4. Determinación de la viabilidad mediante el método (MTT)

EM
Después de las 72 horas de incubación de la placa, se añadió a cada

ST
SI
pocillo 10 µL de 2,5 mg/mL de difenil tetrazolio bromuro (MTT)

DE
incubándose durante 75 minutos en oscuridad a 22° ± 1º C; luego se

N
agregó 100 µL de la solución dodecil sulfato de sodio (SDS) 10%

IO
CC
manteniéndose a temperatura ambiente y en oscuridad por 30 min.

RE
Para la determinación de las densidades ópticas se utilizó un lector de

DI
ELISA con un filtro de 492 nm 26 (Anexo 11).
28
2.2.5. Determinación del porcentaje de inhibición del crecimiento
El porcentaje de inhibición de crecimiento (% inhibición del
crecimiento), fue determinada mediante la fórmula:
N
(𝐴𝑚 − 𝐴𝑏𝑚)
𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (%) = [1 − ] 𝑥 100
IÓ
(𝐴𝑟 − 𝐴𝑏𝑟)
AC
IC
Donde: Am: es la absorbancia de las muestras; Abm: es la absorbancia
UN
del blanco de muestra; Ar: es la absorbancia de las soluciones de
M
CO
referencias; y, Abr: la absorbancia del blanco de referencia32.
Y
2.2.6. Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (IC50)
A
IC
ÁT
Además, se determinó la IC50 mediante análisis de regresión lineal
RM
del gráfico porcentaje de inhibición vs. Logaritmo de la concentración

FO
del extracto, se determinó los valores de IC50 de los grupos

IN
experimental y control32.
DE
AS
2.3. Análisis de datos

EM
Los resultados obtenidos fueron sometidos al análisis de varianza (ANOVA)

ST
SI
y a una prueba de comparación de medias Tukey con el fin de determinar las

DE
diferencias entre los grupos experimentales y control, mediante el uso de un

N
programa computarizado SPSS vr. 20 con un grado de significancia de 0.0532.

IO
CC
2.4. Consideraciones éticas:

RE
DI
Los Mesocricetus auratus “hámster” utilizados en la investigación fueron
instalados en jaulas de metal en el Bioterio de Artropodología en donde se les
brindo las condiciones adecuadas de alimentación, ventilación y temperatura.
29
RESULTADOS
Al someter a promastigotes de Leishmania peruviana a diferentes
concentraciones (7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL) del extracto etanólico obtenido por
el método de Percolación (EEP) de hojas de Acnistus arborescens “chira”, se
N
IÓ
observó mayor inhibición del crecimiento a la concentración de 15 µg/mL (71.1%),
AC
encontrándose diferencias estadísticas significativas (p<0.05) entre todas las
IC
UN
concentraciones ensayadas (Fig. 1).
M
En la Fig. 2, Al someter a promastigotes de Leishmania peruviana a
CO
diferentes concentraciones (7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL) del extracto etanólico
Y
A
obtenido por el método de soxhlet (EES) de hojas de Acnistus arborescens “chira”,
IC
ÁT
se observó mayor inhibición del crecimiento a la concentración de 15 µg/mL
RM
(76.4%), encontrándose diferencias estadísticas significativas (p<0.05) entre todas

FO
las concentraciones ensayadas.

IN
Al comparar el efecto de los EEP y EES sobre la inhibición del crecimiento

DE
de los promastigotes de L. peruviana se determinó que no existe diferencia

AS
EM
estadística significativa (p>0.05) entre ambos extractos a las concentraciones

ST
ensayadas (Fig. 3)
SI
En la tabla 1, se reportan los valores para la concentración inhibitoria del 50%

DE
(IC50) al exponer promastigotes de L. peruviana a las concentraciones de los

N
IO
extractos, obteniéndose una IC50 de 9.661 µg/mL en el EES y una IC50 de 10,267
CC
µg/mL en el EEP.
RE
DI
30
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
Letras diferentes indican diferencia significativa entre grupos (p<0.05)

N
Fig. 1. Porcentaje de Inhibición del crecimiento in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana expuesto a 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del
I O
CC
extracto etanólico por el método percolación de hojas de Acnistus arborescens y grupo control DMSO.
RE
DI
31
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE

N
O
Fig. 2. Porcentaje de Inhibición del crecimiento in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana expuesto a 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del
I
CC
RE
extracto etanólico por el método soxhlet de hojas de Acnistus arborescens y grupo control DMSO.
DI
32
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI

DE
N
Fig. 3. Comparación del porcentaje de inhibición del crecimiento in vitro de promastigotes Leishmania peruviana expuestos a las
I O
CC
concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL de los extractos etanólicos por el método de percolación y soxhlet de hojas de Acnistus
RE
arborescens.
DI
33
Tabla 1: Concentración inhibitoria del 50% (IC50) al exponer promastigotes de

Leishmania peruviana a las concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL
de los extractos etanólicos por el método de percolación (EEP) y soxhlet
(EES) de hojas de Acnistus arborescens.
N
IÓ
AC
IC50 para promastigotes
IC
UN
Método de extracción Estimación µg/mL
M
CO
Percolación (EEP) 10.267
Y
A
Soxhlet (EES) 9.661
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
34
DISCUSIÓN
Los arbustos de Acnistus arborescens “chira” son utilizados tradicionalmente en
diversas comunidades de diferentes departamentos del Perú, los pobladores la utilizan
N
Ó
principalmente como infusiones o directamente sobre la lesiones atribuyéndoles actividad
I
AC
antiparasitaria y algunas veces son usadas en el tratamiento de contusiones, torceduras o
IC
UN
esguinces25, 28, 44
; a pesar que sus propiedades medicinales son conocidas en las
M
comunidades peruanas, en la actualidad no se dispone de datos confiables sobre su
CO
farmacología, por tal motivo la necesidad de investigar las propiedades que se le atribuyen,
Y
A
por lo que en esta investigación se trató de comprobar si posee efecto leishmanicida.
IC
ÁT
Los resultados obtenidos en la presente investigación sobre el efecto de diferentes
RM
concentraciones de extractos etanólicos de A. arborescens (Fam. Solanaceae) sobre la
FO
viabilidad in vitro de promastigotes de L. peruviana indica que dicha planta presenta

IN
propiedades leishmanicidas (Figura 1 y 2, Tabla 1). En la extracción con el método de

DE
Soxhlet se logró el 76,4% de inhibición de promastigotes a la concentración de 15.0 µg/mL

AS
EM
y el 71.1% por percolación a la concentración de 15.0 µg/mL. Al comparar

ST
estadísticamente los métodos de extracción no se encontraron diferencias significativas

SI
(p> 0.05) entre los tratamientos del ensayo a las concentraciones de 7.0, 10.0, 12.5 y 15
DE
µg/mL de los extractos etanólicos. También se encontró que la concentración inhibitoria del
N
IO
50% (IC50) de ambos métodos es similar encontrándose 9.7 µg/mL con el método de
CC
Soxhlet y 10.3 µg/mL por el método de percolación. Esto se debería a que en ambos
RE
métodos utilizan al etanol como solvente polar permitiendo la extracción de terpenos,

DI
esteroides, flavonoides, alcaloides y withanólidos24, 43, por lo tanto, se puede decir que el
método de extracción con el método de soxhlet o por percolación no tiene influencia sobre
35
la composición del extracto; la utilización de temperatura en el método de soxhlet no
volatilizó ni degrado los metabolitos considerados leshmanicidas ya que el punto de
ebullición de estos son mayores al del etanol44, 45.
N
I Ó
El efecto leishmanicida de ambos extractos se podría atribuir a la presencia de
AC
IC
principios activos con actividad antiparasitaria como esteroides, terpenos, flavonoides y
UN
witanolidos; dichos fitoconstituyentes han sido reportados por Morantes et al45 al realizar el
M
CO
estudio sobre la actividad citotóxica y análisis fitoquímico de fracciones aisladas del
extracto etanólico total de A. arborescens. Asimismo Chandrasekaran et al47, atribuyen a
Y
A
los withanólidos de Withania somnifera como responsables de la actividad leishmanicida
IC
ÁT
contra promastigostes de L. donovani. Es así que los withanólidos actuarían induciendo
RM
apoptosis en los promastigotes a través de la interrupción del potencial de membrana
FO
mitocondrial, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y externalización de

IN
fosfatidilserina44. Los flavonoides y esteroles también actúan inhibiendo la vía de

DE
producción de ATP, esto haría que el efecto de estos principios activos se complemente
AS
EM
para dar un mayor porcentaje de inhibición del parásito32 ,48.

ST
La determinación de la viabilidad de los promastigotes se realizó por método

SI
colorimetrico basado en la reducción metabólica del difenil tetrazolio bromuro (MTT) por
DE
enzimas mitocondriales succinato-deshidrogenasas en cristales de formazan. La viabilidad

N
IO
es directamente proporcional a la densidad óptica puesto que a mayor número de células

CC
vivas, mayor intensidad de color49. Así mismo, se evaluó como control de viabilidad el
RE
DI
dimetil sulfóxido (DMSO) como disolvente para los extractos, no muestra actividad contra
L. peruviana; lo que indicaría que este disolvente no interfiere en la actividad de los
extractos evaluados, esto coincide con el trabajo realizado por Ruiz et al31, quienes
36
evaluaron la actividad leishmanicida y tripanocida de algunas plantas reportadas como
medicinales en Colombia, usando como control de viabilidad el DMSO al 1%, el cual no
presentó actividad contra Leishmania.
N
I Ó
Los compuestos antileishmania en uso clínico es muy pequeño, hay una necesidad
AC
IC
urgente de nuevos compuestos que sean baratos, asequibles, seguros y eficaces, los
UN
compuestos a base de plantas son una alternativa importante. Los resultados obtenidos en el
M
presente trabajo constituyen una alternativa a seguir siendo evaluada, dado que A.
CO
arborescens se presenta como una promisoria posibilidad que debe continuar estudiándose,
Y
A
ya que afecta a los promastigotes de L. peruviana, por lo que estos resultados se constituyen
IC
ÁT
en indicadores de la susceptibilidad del estadio de amastigote que se desarrolla en el
RM
hospedero vertebrado.
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
37
CONCLUSIONES
 Las concentraciones 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL de los extractos etanólicos
N
obtenidos por los métodos de percolación y soxhlet obtenidos de las hojas de
I Ó
Acnistus arborescens (Fam: Solanaceae) disminuyen la viabilidad in vitro de
AC
IC
promastigotes de Leishmania peruviana.
UN
M
 La concentración de 10.3 µg/mL de extracto etanólico por el método de percolación
CO
disminuyen la viabilidad in vitro del 50%.de promastigotes de Leishmania peruviana.
Y
A
 Las concentraciones de 9.7 µg/mL de extracto etanólico por el método de Soxhlet
IC
ÁT
disminuyen la viabilidad in vitro del 50% de promastigotes de Leishmania peruviana.
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
38
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IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
45
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
ANEXOS
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
46
Anexo 1. Ejemplar de Acnistus arborescens en el caserío Chual, del Distrito Simbal,

(Trujillo - La Libertad).
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
47
Anexo 2. Zona de recolección de Acnistus arborescens en el caserío Chual, del Distrito

Simbal, (Trujillo-La Libertad).
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
Chual, Simbal
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
48
Anexo 3. Acnistus arborescens identificada taxonómicamente en el Herbarium Truxillense

de la Universidad Nacional de Trujillo.
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
49
N
Anexo 4a. Esquema de la obtención del extracto etanólico de Acnistus arborescens mediante el método de percolación con tres
Ó
extracciones.
I
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
I O
CC
RE
DI
50
Anexo 4b. Obtención del extracto etanólico de Acnistus arborescens mediante el método
de percolación con tres extracciones.
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
Percolador I Percolador II
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
Percolador III
51
Anexo 5. Obtención del extracto etanólico de Acnistus arborescens mediante el método de

Soxhlet.
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
52
Anexo 6. Preparación del medio de cultivo bifásico BHI modificado.
6.1 Agar BHI modificado
Agar BHI………………………….…. 5.2 g
N
Agar Nutritivo………………………… 2.0 g
I Ó
AC
Caldo Cloruro Sódico-Peptona……….. 1.6 g
Agua Destilada……………………….. 90 mL
IC
UN
Ajustar el pH a 7 y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C
M
CO
6.2 Agar sangre BHI modificado al 10%:
Y
Agar BHI modificado…………………. 90 mL
A
Sangre de conejo desfibrinada………… 10 mL
IC
Gentamicina…………………………… 1.0 mL
ÁT
RM
6.3 Caldo BHI modificado
FO
Caldo BHI…… ………………….….3.7 g

IN
Extracto de carne……………………… 0.3 g

DE
Peptona………………………….…….. 1.0 g
Cloruro de sodio……………….……… 0.5 g
AS
Dextrosa………………………………. 0.2 g
EM
Agua destilada……………………...… 100 mL

ST
Ajustar el pH a 7 y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C

SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
53
Anexo 7. Cultivo, coloración y recuento de promastigotes de Leishmania peruviana.
N
I Ó
AC
IC
UN
A
M
CO
A: Cultivos axénicos de promastigotes de Leishmania peruviana en BHI bifásico modificado.
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
B
IN
DE
B: Coloración giemsa de promastigotes de Leishmania peruviana (40X).

AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
C: Recuento de promastigotes de Leishmania peruviana en cámara de Neubauer (40X).
54
Anexo 8. Curva de crecimiento de promastigotes de Leishmania peruviana en medio de

cultivo BHI bifásico modificado.
N
I Ó
AC
7
IC
6
UN
Número de Parásitos x 106
M
5
CO
Y
4
A
IC
3
ÁT
RM
2
FO
1
IN
DE
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
AS
Tiempo (Días)
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
55
Anexo 9. Esquema de la ejecución del bioensayo in vitro de de promastigotes de

Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.0, 10.0. 12.5 y 15.0 µg/mL
de los extractos etanólicos de Acnistus arborescens.
N
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ó
12
I
AC
A
IC
B
UN
C
M
CO
D
Y
E
A
IC
F
G
ÁT
RM
H
FO
IN
DE
Grupos experimental
2B - 2D - 2F: 20 µL del parásito + 80 µL de BHI + 3 µL del extracto (7.5 µg/mL)
AS

EM

ST
SI
Grupos control
9B - 9D - 9F: 20 µL del parásito + 80 µL de BHI + 3 µL de DMSO
DE
10B - 10D - 10F: 20 µL del parásito + 80 µL de BHI + 3 µL de BHI

N
Blancos de estandarización
IO
2H: 100 µL de BHI + 3 µL del extracto (7.5 µg/mL)

CC

RE

DI
9H: 100 µg de BHI + 3 µL de DMSO

10H: 100 µg de BHI + 3 µL de BHI
56
Anexo 10. Preparación de los reactivos para el ensayo.
10.1 Buffer para MTT:
N
Solución A: 200 mL de agua destilada + 2.396g NaH2PO4.H2O
I Ó
AC
Solución B: 200 mL de agua destilada + 2.839g Na2HPO4
IC
Solución bufferada: 32 mL de la solución A + 172.5 mL de la solución B
UN
M
Ajustar el pH a 7 y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C
CO
10.2 MTT (difeniltetrazodio bromuro)
Y
A
MTT…………………...……… ……… 10mg
IC
ÁT
Solución bufferada………………….…. 4 mL
RM
Mantener en refrigeración a una T° de 4 a 8°C
FO
IN
10.3 Preparación de SDS al 10%

DE
SDS…………………………………… 10g
AS
Agua destilada estéril…………….…… 90 mL

EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
57
Anexo 11. Lectura de las placas en lector de ELISA a 492nm
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
58
N
Ó
peruviana con las concentraciones de 7.0, 10.0. 12.5 y 15.0 µg/mL del
I
AC
extracto etanólicos por percolación de Acnistus arborescens.
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
Interpretación:
ST
SI
DE
Pocillo rojo: Presencia de parásitos vivos

N
IO
Pocillo amarillo: Ausencia de parásitos vivos

CC
RE
DI
59
N
Anexo 13. Absorbancias obtenidas del ensayo in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.5,
Ó
10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del extracto etanólico (Método: Percolación) de Acnistus arborescens (Lectura a 492 nm).
I
AC
IC
UN
M
CO
Grupos experimentales Control
Unidad Sol. Referencia
Y
experimental (BHI)
A
7.5 µg/mL 10.0 µg/mL 12.5 µg/mL 15.0 µg/mL DMSO
IC
ÁT
0.349
RM
1 0.422 0.402 0,334 0.525 0.520
FO
0.339
2 0.408 0.400 0.340 0.542 0.538
IN
DE
0.340
3 0.412 0.409 AS 0.329 0.534 0.530
EM
Promedio 0.414 0.404 0.383 0.367 0.534 0.529

ST
SI
Blanco 0.185 0.205 0.223 0.234 0.188 0.182

DE
N
I O
CC
RE
DI
60

peruviana con las concentraciones de 7.0, 10.0. 12.5 y 15.0 µg/mL del
extracto etanólicos (Método: Soxhlet) de Acnistus arborescens.
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
Interpretación:
DE
N
Pocillo rojo: Presencia de parásitos vivos

IO
CC
Pocillo amarillo: Ausencia de parásitos vivos

RE
DI
61
N
Anexo 15. Absorbancias obtenidas del ensayo in vitro de promastigotes de Leishmania peruviana con las concentraciones de 7.5,
Ó
10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del extracto etanólico (Método: Soxhlet) de Acnistus arborescens (Lectura a 492 nm).
I
AC
IC
UN
M
Grupos experimentales Control
CO
Unidad Sol. Referencia
Y
experimental (BHI)
7.5 µg/mL 10.0 µg/mL 12.5 µg/mL 15.0 µg/mL DMSO
A
IC
ÁT
1 0.4 0.378 0.327 0.312 0.525 0.523
RM
FO
2 0.392 0.37 0.323 0.310 0.532 0.529
IN
3 0.401 0.389 0.329 0.319 0.531 0.528
DE
Promedio 0.398 0.379
AS 0.326 0.314 0.529 0.527
EM
Blanco 0.188 0.201 0.221 0.235 0.198 0.194

ST
SI
DE
N
I O
CC
RE
DI
62
Anexo 16. Análisis de varianza (ANOVA) con los datos obtenidos en los ensayos in vitro
de promastigotes de Leishmania peruviana con las diferentes concentraciones
extractos etanólicos: extracción por percolación (Cuadro A) y extracción por
Soxhlet (Cuadro B) de Acnistus arborescens.
N
I Ó
AC
IC
Cuadro A
UN
Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.
M
CO
Entre grupos 9557,300 4 2389,325 443,114 ,000
Y
Dentro de grupos 53,921 10 5,392
A
IC
Total 9611,222 14
ÁT
RM
FO
Cuadro B
IN
DE
Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

AS
EM
Entre grupos 10741,993 4 2685,498 881,439 ,000

ST
Dentro de grupos 30,467 10 3,047

SI
Total 10772,460 14
DE
N
IO
CC
RE
DI
63
N
Anexo 17. Diferencia de medias (Game - Howell) con los datos obtenidos en los ensayos in vitro de promastigotes de Leishmania
Ó
peruviana a las concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del extracto por percolación de Acnistus arborescens.
I
AC
95% de intervalo de confianza
IC
Diferencia de
(I) Concentración (J) Concentración Error estándar Sig.
UN
medias (I-J) Límite inferior Límite superior
M
10,0 µg/mL -8,7695667* 1,8959832 ,001 -12,994081 -4,545053
CO
7,5 µg/mL 12,5 µg/mL -31,5019114* 1,8959832 ,000 -35,726425 -27,277397
15 µg/mL -37,1096232* 1,8959832 ,000 -41,334137 -32,885109
Y
DMSO 33,5263333*
A
1,8959832 ,000 29,301819 37,750847
IC
7,5 µg/mL 8,7695667* 1,8959832 ,001 4,545053 12,994081
ÁT
10,0 µg/mL 12,5 µg/mL -22,7323447* 1,8959832 ,000 -26,956859 -18,507831
RM
15 µg/mL -28,3400566* 1,8959832 ,000 -32,564570 -24,115543
DMSO 42,2959000* 1,8959832 ,000 38,071386 46,520414
FO
7,5 µg/mL 31,5019114* 1,8959832 ,000 27,277397 35,726425
IN
12,5 µg/mL 10,0 µg/mL 22,7323447* 1,8959832 ,000 18,507831 26,956859
DE
15 µg/mL -5,6077119* 1,8959832 ,014 -9,832226 -1,383198
65,0282447*
DMSO AS 1,8959832 ,000 60,803731 69,252759
7,5 µg/mL 37,1096232* 1,8959832 ,000 32,885109 41,334137
EM
15 µg/mL 10,0 µg/mL 28,3400566* 1,8959832 ,000 24,115543 32,564570

ST
12,5 µg/mL 5,6077119* 1,8959832 ,014 1,383198 9,832226

SI
DMSO 70,6359566* 1,8959832 ,000 66,411443 74,860470

DE
7,5 µg/mL -33,5263333* 1,8959832 ,000 -37,750847 -29,301819

DMSO 10,0 µg/mL -42,2959000* 1,8959832 ,000 -46,520414 -38,071386
N
O
12,5 µg/mL -65,0282447* 1,8959832 ,000 -69,252759 -60,803731

I
-70,6359566*
CC
15 µg/mL 1,8959832 ,000 -74,860470 -66,411443

RE
*La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

DI
64
N
Ó
Anexo 18. Diferencia de medias (Game - Howell) con los datos obtenidos en los ensayos in vitro de promastigotes de Leishmania
I
AC
peruviana a las concentraciones de 7.5, 10.0, 12.5 y 15.0 µg/mL del extracto por Soxhlet de Acnistus arborescens.
IC
UN
Diferencia de 95% de intervalo de confianza
M
(I) concentración (J) concentración medias (I-J) Error estándar Sig. Límite inferior Límite superior
CO
10,0 µg/mL -9,5236963* 1,4251835 ,000 -12,699203 -6,348190
Y
7,5 µg/mL 12,5 µg/mL -31,3679106* 1,4251835 ,000 -34,543417 -28,192404
A
15 µg/mL -39,3878839* 1,4251835 ,000 -42,563391 -36,212377
IC
DMSO 36,5628404* 1,4251835 ,000 33,387334 39,738347
ÁT
7,5 µg/mL 9,5236963* 1,4251835 ,000 6,348190 12,699203
RM
10,0 µg/mL 12,5 µg/mL -21,8442143* 1,4251835 ,000 -25,019721 -18,668708
FO
15 µg/mL -29,8641876* 1,4251835 ,000 -33,039694 -26,688681
DMSO 46,0865367* 1,4251835 ,000 42,911030 49,262043
IN
7,5 µg/mL 31,3679106* 1,4251835 ,000 28,192404 34,543417
DE
12,5 µg/mL 10,0 µg/mL 21,8442143* 1,4251835 ,000 18,668708 25,019721
15 µg/mL AS
-8,0199733* 1,4251835 ,000 -11,195480 -4,844467
DMSO 67,9307510* 1,4251835 ,000 64,755244 71,106258
EM
7,5 µg/mL 39,3878839* 1,4251835 ,000 36,212377 42,563391

ST
15 µg/mL 10,0 µg/mL 29,8641876* 1,4251835 ,000 26,688681 33,039694

SI
12,5 µg/mL 8,0199733* 1,4251835 ,000 4,844467 11,195480

DMSO 75,9507243* 1,4251835 ,000 72,775218 79,126231
DE
7,5 µg/mL -36,5628404* 1,4251835 ,000 -39,738347 -33,387334

N
DMSO 10,0 µg/mL -46,0865367* 1,4251835 ,000 -49,262043 -42,911030

O
12,5 µg/mL -67,9307510* 1,4251835 ,000 -71,106258 -64,755244

I
CC
15 µg/mL -75,9507243* 1,4251835 ,000 -79,126231 -72,775218

RE
*La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

DI
65
Anexo 19. Comparación de medias (Turkey) con los datos obtenidos en los ensayos in
vitro de promastigotes de Leishmania peruviana con las diferentes
(Cuadro A) y extracción por Soxhlet (Cuadro B) de Acnistus arborescens.
N
I Ó
Cuadro A
AC
Grupos Subconjunto para alfa = 0.05
IC
N
UN
Experimentales 1 2 3 4 5
M
DMSO 3 ,477400
CO
7,5 µg/mL 3 34,003733
Y
10,0 µg/mL 3 42,773300
A
12,5 µg/mL 3 65,505645
IC
15 µg/mL 3 71,113357
ÁT
RM
FO
Cuadro B
IN
Grupos Subconjunto para alfa = 0.05

DE
N
Experimentales 1 2 3 4 5
AS
DMSO 3 ,401937
EM
7,5 µg/mL 3 36,964778

ST
10,0 µg/mL 3 46,488474

SI
12,5 µg/mL 3 68,332688

DE
15 3 76,352661
N
IO
CC
RE
DI
66
N
Anexo 20. Análisis de regresión lineal de la inhibición del crecimiento de promastigotes de Leishmania peruviana vs. Logaritmo de las
Ó
concentraciones de los extractos etanólicos (Método de Extracción: Percolación y Soxhlet) de hojas de Acnistus
I
AC
arborescens.
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
I O
CC
RE
DI
67

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

“Efecto de diferentes concentraciones de extractos etanólicos de Acnistus

arborescens (Fam. Solanaceae) sobre la viabilidad in vitro de promastigotes de

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE:

AUTORA: Br. Gandy Jhomeny Nureña Díaz

ASESORA: Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dr. Rubén Vera Véliz

Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Zelada Estraver

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTORA DE LA E.A.P. DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR

Dr Judith Enit Roldán Rodríguez.

Ms. Jaime Agreda Gaitán.

La que suscribe, asesora de la tesis titulada: “Efecto de diferentes

concentraciones de extractos etanólicos de Acnistus arborescens (Fam. Solanaceae)

observaciones y sugerencias alcanzadas.

los trámites correspondientes según sus fines.

Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez

Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez.

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:

establecido, y a que el presente sea merecedor de vuestra aprobación.

Trujillo, Noviembre del 2015.

Br. Gandy Jhomeny Nureña Díaz

A Dios, por estar siempre conmigo en cada paso que doy,

A Marcopolo Solano mi esposo, por su amor, por creer en

mí, por su apoyo en todo momento dándome ejemplos dignos

de superación y entrega, porque en gran parte gracias a él,

hoy puedo ver alcanzada mí meta. TE AMO…

A mis hermanos Jhonny, Alexy y Shirley por

los buenos momentos, sus locuras, su compañía y por

apoyarme siempre, los quiero mucho…

A mi papá Jacinto y mi abuela Rosa por quererme y

consentirme siempre. A mis abuelos Lorenzo y Obdulia

 A la Dra. Judith Enit Roldán Rodríguez, docente asociada del Departamento de

 Al Mg. C. Eduardo Muñoz Ganoza docente de la Escuela Académico

Profesional d Microbiología y Parasitología, por su apoyo en la ejecución de

 Al Blgo-Mblgo. Richar Joel Morales Rodríguez, a quien siempre agradeceré por

su apoyo incondicional en la realización de ésta tesis, por su amistad y por ser

compartidos en nuestra vida universitaria y por la amistad que perdura toda la

A mis amigos del laboratorio de Artropodología Parasitaria: Miriam, Lourdes

sobre todo por su amistad.

encontró mayor inhibición del crecimiento de promastigotes expuestos a la concentración

de 15 µg/mL tanto en el EEP (71.1%) como en el EES (76.4%); no encontrándose

EES de Acnistus arborescens disminuyen la viabilidad in vitro de promastigotes de

Palabras claves: Acnistus arborescens, Leishmania peruviana y viabilidad

Acnistus arborescens extracts decrease in vitro viability of promastigotes Leishmania

Key words: Acnistus arborescens, Leishmania peruviana and viability

Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………………..…….………....ii

Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas ………………………...…… …...…iii

Miembros del Jurado Dictaminador………………………………………………..…..…iv

2.1. Obtención de los extractos etanólico de Acnistus arborescens…………………..24

2.1.1. Colecta y secado de la planta………………………………….…...24

2.1.2. Obtención de los extractos etanólicos………………..…….....……25

2.1.2.1. Extracción por el método de Percolación (EEP)……….…..25

2.1.2.2. Extracción por el método de Soxhlet (EES)……..…..……..26

2.2. Evaluación del efecto de los extractos etanólicos de A. arborescens sobre

la viabilidad en promastigotes de L. peruviana…………………...……..…..27

2.2.1. Siembra y determinación de la curva de crecimiento…………......27

2.2.2. Ejecución del bioensayo con el extracto obtenido por el